RS60577B1

RS60577B1 - Izolacija i prečišćavanje anti-il-13 antitela upotrebom protein a afinitetne hromatografije

Info

Publication number: RS60577B1
Application number: RS20200864A
Authority: RS
Inventors: Robert Hickman
Original assignee: Abbvie Inc
Priority date: 2009-10-20
Filing date: 2010-10-20
Publication date: 2020-08-31
Also published as: MX341136B; IL218897A0; CN102711828B; IL218897A; BR112012009289B8; BR112012009289A8; JP5914342B2; BR112012009289A2; AU2010310748B2; CN102711828A; WO2011050071A2; KR101830596B1; SMT202000470T1; NZ599100A; HUE053489T2; CN104744560A; US20180230210A1; BR112012009289B1; KR20120101002A; US20110206687A1

Description

Opis

UNAKRSNA REFERENCA SA SRODNOM PRIJAVOM

[0001] Ova prijava ima prioritet U.S. privremene prijave serijski br. 61/253,411, koja je podneta 20.10.2009.

STANJE TEHNIKE PRONALASKA

[0002] Humani IL-13 je glikoprotein od 17 kDa kloniran iz aktiviranih T ćelija i proizvode ga aktivirane T ćelije Th2 linije, ThO i ThI CD4 T ćelije, CD8+ T ćelije i nekoliko ne-T ćelijskih populacija, poput mastocita. (Zuravski and de Vries, 1994. Immunol Today, 15, 19-26). IL-13 stimuliše promenu izotipa imunoglobulina u IgE u humanim B ćelijama (Punnonen, Aversa et al., 1993 Proc Natl Acad Sci USA 903730-4) i suzbija inflamatornu proizvodnju citokina kod ljudi i kod miša (de Waal Malefyt et al., 1993, J Immunol, 151, 6370-81; Doherti at al., 1993, J Immunol, 151, 7151-60). IL-13 se vezuje za receptore ćelijske površine, IL-13Rα1 i IL-13Rα2. IL-13Rα1 interaguje sa IL-13 sa niskim afinitetom (KD ~ 10nM), nakon čega sledi regrutovanje IL-4R da bi se formirao heterodimerni receptorski kompleks visokog afiniteta (KD ~ 0,4 nM) (Aman et al., 1996, J Biol Chem, 271, 29265-70; Hilton et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA, 93, 497-501). IL-4R / IL-13Rα1 kompleks se eksprimira na mnogim ćelijskim tipovima kao što su B ćelije, monociti / makrofage, dendritske ćelije, eozinofili, bazofili, fibroblasti, endotelne ćelije, epitelne ćelije disajnih puteva i ćelije glatkih mišića disajnih puteva (Graber et al., 1998, Eur J Immunol, 28, 4286-98; Murata et al., 1998, Int Immunol, 10, 1103-10; Akaiwa et al., 2001, Cytokine, 13, 75-84). Ligacija kompleksa receptora IL-13Rα1 / IL-4R rezultira u aktiviranju različitih puteva prenosa signala, uključujući transduktor signala i aktivator transkripcije (ST AT6) i puteve supstrata-2 (IRS-2) insulinskih receptora (Wang et al., 1995, Blood, 864218-27; Takeda et al., 1996, J Immunol, 157,3220-2). Sam IL-13Rα2 lanac ima visoki afinitet (KD ~ 0,25-0,4 nM) za IL-13 i deluje kao receptor mamac koji negativno reguliše vezivanje IL-13 (Donaldson et al., 1998, J Immunol, 161, 2317 -24), i signalni receptor koji indukuje sintezu TGF-β i fibrozu preko AP-I puta u makrofagima i moguće drugim tipovima ćelija (Fichtner-Feigl, Strober et al., Nat Med 1299-106).

[0003] Nekoliko studija sprovedenih na prekliničkim životinjskim modelima astme ukazuje da IL-13 igra važnu ulogu kod astme. Ovi podaci uključuju otpornost na astmu kod IL-13 nokaut miševa, kao i inhibiciju fenotipa astme sa antagonistima IL-13 (rastvorljivi IL-13 receptori, anti-IL-13 mAbs, itd.) u različitim mišjim modelima (Wills-Karp and Chiaramonte, 2003, Curr Opin Pulm Med, 9 21-7; Wills-Karp, 2004, Immunol Rev, 202 175-90). Višestruka ispitivanja pokazala su da farmakološka primena rekombinantnog IL-13 na pluća miševa, kao i zamorca, indukuje hiper-sekreciju sluzi u disajnim putevima, eozinofiliju i hiper-reaktivnost disajnih puteva ("AHR"; Grunig et al., 1998, Science, 282, 2261 -3; Wills-Karp et al., 1998, Science, 282, 2258-61; Kibe et al., 2003, Am J Respir Crit Care Med, 167,50-6; Vargaftig and Singer, 2003, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 284, L260-9; Vargaftig and Singer, 2003, Am J Respir Cell Mol Biol, 28, 410-9). Ovi efekti IL-13 reprodukuju se u transgenim mišjim sistemima sa konstitutivnom ili inducibilnom ekspresijom IL-13 (Zhu et al., 1999, J Clin Invest, 103, 779-88; Zhu et al., 2001, Am J Respir Crit Care Med, 164, S67-70; Lanone et al., 2002, J Clin Invest, 110463-74). Hronična transgena prekomerna ekspresija IL-13 takođe izaziva subepitelnu fibrozu i emfizem. Miševi koji imaju nedostatak IL-13 (i IL-4) signalnog molekula STAT6 ne uspevaju da razvijaju AHR izazvane alergenom i prekomernu produkciju sluzi (Kuperman et al., 2002, Nat Med, 8, 885-9). Studije koje koriste rastvorljivi fuzioni protein IL-13 receptora (sIL-13Rα2Fc) pokazale su glavnu ulogu ovog citokina kod eksperimentalne bolesti disajnih puteva izazvanih ovalbuminom (OVA) (Grunig et al., 1998, Science, 282, 2261-3; Wills -Karp et al., 1998, Science, 282,2258-61; Taube et al., 2002, J Immunol, 169, 6482-9). Efikasnost anti-IL-13 tretmana takođe je dokazana u hroničnom modelu mišje astme. Pored ispoljavanja karakteristika hiper-sekrecije sluzi i AHR-a, ovaj model hronične astme pokazuje i nekoliko karakteristika humane bolesti koje nedostaju u akutnijim modelima. Oni uključuju eozinofiliju plućnog tkiva koja se nalazi u interepitelijskim prostorima, kao i fibrozu glatkih mišića mereno povećanjem taloženja kolagena. Model hronične astme indukuje se ponavljanim izlaganjima aerosolu sa OVA kod OVA-senzitizovanih miševa 1x / nedeljno, ukupno 4 nedelje. Antitelo anti-IL-13 primenjivano u poslednje 2 nedelje izlaganja OVA (od 36. dana sa očitavanjem efikasnosti procenjenim 53. dana studije) značajno je inhibiralo AHR, plućnu upalu, hiperplaziju peharastih ćelija, hipersekreciju sluzi i fibrozu disajnih puteva (Yang et al ., 2005, J Pharmacol Exp Ther, 313, 8-15). IL-13 je uključen u patogenezu humane astme jer su u plućima astmatičnih pacijenata otkriveni povišeni nivoi iRNK IL-13 i proteina, koji su u korelaciji sa težinom bolesti (Huang et al., 1995, J Immunol, 155, 2688-94). Pored toga, identifikovani su humani genetski polimorfizmi IL-3, koji dovode do povišenog nivoa IL-13, koji su povezani sa astmom i atopijom (Heinzmann et al., 2000, Hum Mol Genet, 9, 549-59; Hoerauf et al. , 2002, Microbes Infect, 4, 37-42; Vercelli, 2002, Curr Opin Allergi Clin Immunol, 2, 389-93; Heinzmann et al., 2003, J Allergy Clin Immunol, 112, 735-9; Chen et al., 2004, J Allergy Clin Immunol, 114, 553-60; Vladich et al., 2005, J Clin Invest, 115, 747-54), i povišeni nivoi IL-13 otkriveni su u plućima pacijenata sa astmom (Huang et al., 1995, J Immunol, 155, 2688-94; Arima i sur., 2002, J Allergy Clin Immunol, 109, 980-7; Berry et al., 2004, J Allergy Clin Immunol, 114, 1106-9). Takođe je pokazana genetska veza između IL-13 i astme kod osoba koje imaju polimorfizam gena IL-13 koji izaziva viši nivo IL-13 u plazmi i povećani rizik za atopiju i astmu (Wills-Karp, 2000, Respir Res, 1, 19-23).

[0004] Zbog uloge humanog IL-13 u raznim ljudskim poremećajima, dizajnirane su terapijske strategije za inhibiciju ili suprotstavljanje aktivnosti IL-13. Konkretno, antitela koja se vezuju za i neutrališu IL-13 su tražena kao sredstvo za inhibiciju aktivnosti IL-13.

[0005] Na primer, Yang et al., 2005., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 313, 8-15 koristi neutralizujuće monoklonsko antitelo protiv IL-13 u hroničnom mišjem modelu perzistentne astme. Međutim, u nauci postoji potreba za poboljšanim postupcima proizvodnje i prečišćavanja takvih antitela za farmaceutsku upotrebu. Ovaj pronalazak se bavi ovom potrebom.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0006] Na osnovu otkrića koje je ovde sadržano, pronalazak daje postupak za proizvodnju preparata anti-IL-13 antitela sa redukovanim proteinom ćelije domaćina (redukovan HCP) iz smeše uzorka koji sadrži anti-IL-13 antitelo i najmanje jedan HCP, pri čemu navedeni postupak sadrži:

(a) filtriranje navedene smeše uzorka sa filterom za dubinsku filtraciju i sakupljanje dubinski filtrirane smeše uzorka;

(b) dovođenje u kontakt dubinski filtrirane smeše uzorka sa Protein A afinitetnom hromatografskom smolom, ispiranje navedene afinitetne hromatografske smole puferom koji sadrži 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.2, zatim ispiranje puferom koji sadrži 20 mM natrijum citrat/limunsku kiselinu, 0.5 M NaCl, pH 6, i zatim puferom koji sadrži 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.2 i sakupljanje afinitetnog hromatografskog uzorka;

(c) podvrgavanje navedenog afinitetnog hromatografskog uzorka redukciji u pH na taj način formirajući uzorak sa redukovanim pH, pri čemu navedeni uzorak sa redukovanim pH ima pH od oko 3 do oko 4;

(d) podešavanje pH navedenog uzorka sa redukovanim pH do pH od oko 4.5 do oko 8.5 i dovođenje u kontakt navedenog uzorka sa podešenim pH sa anjonskom izmenjivačkom smolom koja sadrži kvaternarni aminoetil (QAE) anjonski supstituent i sakupljanje jonskog izmenjivačkog uzorka; i

(e) dovođenje u kontakt navedenog jonskog izmenjivačkog uzorka sa materijalom za hromatografiju sa hidrofobnom interakcijom (HIC) i sakupljanje HIC uzorka, pri čemu navedeni HIC uzorak sadrži navedeni preparat antitela sa redukovanim HCP, pri čemu oko označava do 20% veće od ili manje od referentne vrednosti, i pri čemu navedeno anti-IL-13 antitelo je humanizovano IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG4, ili IgM antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca od EVTLRESGPGLVKPTQTLTLTCTLYGFSLSTSDMGVDWIRQPPGKGLEWLAHIWWDD VKRYNPALKSRLTISKDTSKNQVVLKLTSVDPVDTATYYCARTVSSGYIYYAMDYW GQGTLVTVSS i varijabilni region lakog lanca od

[0007] Predmetni pronalazak i njegovi primeri izvođenja su navedeni u priloženim patentnim zahtevima.

[0008] U određenim slučajevima, ovo otkriće je usmereno na prečišćena, izolovana antitela i fragmente antitela koja se vezuju za IL-13 kao i farmaceutske kompozicije koje sadrže takva antitela i fragmente. U određenim slučajevima, otkriće se odnosi na izolovana antitela ili njihove delove koji se vezuju za antigen, koji se vezuju za humani IL-13. Izolovana anti-IL-13 antitela ovog otkrića mogu se koristiti u kliničkim okruženjima kao i u istraživanju i razvoju. U određenim slučajevima, ovo otkriće je usmereno na anti-IL-13 antitelo koje sadrži sekvence teškog i lakog lanca identifikovane na slici 1.

[0009] Određeni slučajevi otkrivanja usmereni su na postupke prečišćavanja anti-IL-13 antitela ili njihovih delova koji vezuju antigen iz matrice uzorka kako bi se antitela učinila takvim da su bez proteina ćelija domaćina ("HCP") i nakvašenog proteina A. U određenim slučajevima, matrica uzorka (ili jednostavno „uzorak“) sadrži ćelijsku liniju koja se koristi za proizvodnju anti-IL-13 antitela ovog otkrića. U posebnim slučajevima, uzorak sadrži ćelijsku liniju koja se koristi za proizvodnju humanih anti-IL-13 antitela.

[0010] U određenim slučajevima, ovo otkriće obezbeđuje postupak prečišćavanja IL-13 antitela koji sadrži primarni korak izolacije da bi se, između ostalog, uklonile ćelije i ćelijski ostaci. U određenim slučajevima postupka, primarni korak izolacije uključuje jedan ili više koraka centrifugiranja ili dubinske filtracije. Na primer, a ne kao ograničenje, takvi koraci centrifugiranja se mogu izvesti na približno 7000 x g do otprilike 11000 x g. Pored toga, određeni slučajevi gore opisanog postupka obuhvataće korak dubinske filtracije, kao što je korak delipidne dubinske filtracije.

[0011] U određenim slučajevima, primarni uzorak za izolaciju podvrgnut je koraku afinitetne hromatografije. Korak afinitetne hromatografije obuhvata podvrgavanje primarnog uzorka za izolaciju koloni koja sadrži pogodan afinitetni hromatografski nosač. Neograničavajući primeri takvih hromatografskih nosača uključuju, ali nisu ograničeni na, protein A smolu, protein G smolu, afinitetne nosače koji sadrže antigen protiv koga je pripremljeno antitelo od interesa i afinitetne nosače koji sadrže Fc vezujući protein. Protein A smola je korisna za afinitetno prečišćavanje i izolovanje antitela (IgG). U jednom aspektu, Protein A kolona je ekvilibrisana sa pogodnim puferom pre nanošenja uzorka. Primer pogodnog pufera je Tris / NaCl pufer, pH oko 7,2. Nakon ove ekvilibracije, uzorak se može sipati na kolonu. Nakon punjenja kolone, kolona se može isprati jednom ili više puta koristeći npr. ekvilibracioni pufer. Ostala ispiranja uključujući ispiranja koja koriste različite pufere mogu se koristiti pre eluiranja kolone. Protein A kolona se zatim može eluirati korišćenjem odgovarajućeg pufera za eluiranje. Primer pogodnog pufera za eluiranje je sirćetna kiselina / NaCl pufer, pH oko 3,5. Eluat se može pratiti koristeći tehnike dobro poznate stručnjacima iz date oblasti tehnike. Na primer, može se pratiti apsorbanca na OD280. Eluirana frakcija (frakcije) koje su od interesa mogu se zatim pripremiti za dalju obradu.

[0012] Posle Protein A afinitetne hromatografije sledi korak podešavanja niskog pH. U takvim slučajevima, Protein A eluat koji sadrži predviđeno anti-IL-13 antitelo, ili njegov deo koji se vezuje za antigen, podvrgava se podešavanju pH na pH od oko 3 do oko 4. U određenim aspektima, pH se podešava do oko 3,5. Nizak pH između ostalog stimuliše smanjenje i / ili inaktivaciju virusa osetljivih na pH koji mogu kontaminirati uzorak. Nakon pogodnog vremenskog perioda, pH se podešava na između 4,5 i oko 6,0, uključujući, ali ne ograničavajući se na, oko 5,0, a uzorak se podvrgava daljim koracima prečišćavanja.

[0013] U određenim slučajevima, korak izmene jona sledi nakon afinitetne hromatografije proteina A ili koraka prilagođavanja niskog pH. Ovaj korak jonske razmene može biti ili katjonska ili anjonska razmena ili sekvencijalna kombinacija oba. Ovaj korak može da bude jedan postupak razmene jona ili može da uključi više koraka jonske razmene, kao što je korak razmene katjona, posle čega sledi korak anjonske razmene ili obratno. U jednom aspektu, korak jonske razmene je postupak od jednog koraka. U drugom aspektu, korak jonske razmene uključuje postupak jonske razmene od dva koraka. Pogodna kolona za razmenu katjona je kolona čija stacionarna faza sadrži anjonske grupe. Primer takve kolone je Fractogel™ SO3-. Ovaj korak hromatografije hvatanja za izmenu jona olakšava izolaciju antitela iz uzorka. Pogodna kolona za izmenu anjona je kolona čija stacionarna faza sadrži katjonske grupe. Primer takve kolone je Q Sepharose™ kolona. Alternativa je Pall Mustang Q membranski kertridž. Jedan ili više koraka razmene jona dalje izoluje antitela smanjujući nečistoće kao što su pretini i DNK ćelije domaćina, i gde je to moguće, afinitetna matrica proteina. Ovaj postupak anjonske razmene je protok kroz režim hromatografije, pri čemu antitela od interesa ne interaguju ili se ne vezuju za anjonsku izmenjivačku smolu (ili čvrstu fazu). Međutim, mnoge nečistoće interaguju sa i vezuju se za anjonsku izmenjivačku smolu. U određenom aspektu, korak jonske razmene je anjonska izmenjivačka hromatografija.

[0014] Eluat afinitetne hromatografije je pripremljen za jonsku izmenjivačku hromatografiju podešavanjem pH i jonske snage pufera za uzorke. Na primer, afinitetni eluat može da se podesi na pH od oko 4,5 do oko 8,5 u 1 M Tris puferu. Pre ubacivanja uzorka (afinitetni eluat) na kolonu za izmenu jona, kolona se može ekvilibrisati upotrebom pogodnog pufera. Primer pogodnog pufera je Tris / NaCl pufer sa pH od oko 4,5 do oko 8. Nakon ekvilibracije, kolona se može puniti afinitetnim eluatom. Posle punjenja, kolona se može isprati jednom ili više puta pogodnim puferom. Primer pogodnog pufera je sam ekvilibracioni pufer. Sakupljanje protoka može započeti, npr., kada se apsorbanca (OD280) poveća iznad oko 0,2 AU.

[0015] U određenim slučajevima, prvi i drugi korak izmene jona se izvodi nakon primarne izolacije ili na drugi način u nedostatku koraka afinitetne hromatografije. U nekim od takvih slučajeva, uzorak jonske izmene podvrgnut je prelaznom koraku filtracije, bilo pre prvog koraka jonske izmene, između dva koraka jonske izmene, ili oba. U određenim aspektima, ovaj korak filtracije obuhvata „capture“ ultrafiltraciju / diafiltraciju ("UF / DF"). Između ostalog, takva filtracija olakšava koncentrovanje i pufersku izmenu anti-IL-13 antitela i njihovih delova koji vezuju antigen.

[0016] Postupak sadrži jedan ili više koraka hidrofobne interaktivne hromatografije ("HIC"). Pogodna HIC kolona je ona čija stacionarna faza sadrži hidrofobne grupe. Neograničavajući primer takve kolone je Phenyl HP Sepharose™ kolona. U određenim okolnostima, anti-IL-13 antitela će formirati agregate tokom postupka izolacije / prečišćavanja. Uključivanje jednog ili više koraka HIC-a olakšava smanjenje ili eliminaciju takvih agregacija. HIC takođe pomaže u uklanjanju nečistoća. U određenim primerima izvođenja, HIC korak koristi pufer sa visokim sadržajem soli da bi se stimulisala interakcija anti-IL-13 antitela (ili njihovih agregacija) sa hidrofobnom kolonom. Anti-IL-13 antitela mogu se zatim eluirati korišćenjem nižih koncentracija soli.

[0017] U nekim primerima izvođenja, HIC eluat se filtrira upotrebom filtera za uklanjanje virusa, kao što je, ali nije ograničeno na, Ultipor DV50™ filter (Pall Corporation, East Hills, N.Y.). Alternativni filteri, poput Viresolve™ filtera (Millipore, Billerica, Mass.); Zeta Plus VR™ filteri (CUNO; Meriden, Conn.); i Planova™ filteri (Asahi Kasei Pharma, Planova Division, Buffalo Grove, Ill.) se takođe mogu koristiti u takvim primerima izvođenja.

[0018] U određenim slučajevima, otkriće je usmereno na jedan ili više farmaceutskih kompozicija koje sadrže izolovano anti-IL-13 antitelo ili njegov deo koji veže antigen i prihvatljiv nosač. U jednom aspektu, kompozicija dalje sadrži jedno ili više antitela ili njegovog dela koji veže antigen pored anti-IL-13 antitela. U drugom aspektu, kompozicije dalje sadrže jedno ili više farmaceutskih sredstava.

[0019] Čistoća antitela koja su od interesa za rezultirajući proizvod uzorka može se analizirati koristeći metode dobro poznate stručnjacima, npr. ekskluziona hromatografija, Poros™ A HPLC test, HCP ELISA, protein A ELISA i „Western blot“ analiza.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0020]

Slika 1 otkriva sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca neograničavajućeg primera anti-IL-13 antitela.

Slika 2 prikazuje primer dijagrama procesa ćelijske kulture, uključujući postavljene vrednosti, u kontrolnim testovima procesa i ograničenjima aktivnosti.

Slika 3 otkriva poređenje strategija protoka alternativnih postupaka ćelijskih kultura.

Slika 4 prikazuje dijagram toka primarne hromatografije hvatanja za izolaciju, uključujući postavljene vrednosti, u kontrolnim testovima procesa i ograničenjima aktivnosti.

Slika 5 prikazuje poređenje alternativnih strategija primarne izolacije i strategija protoka hvatanja.

Slika 6 prikazuje dijagram toka finog prečišćavanja, uključujući postavljene tačke, u kontrolnim testovima procesa i ograničenjima aktivnosti.

Slika 7 otkriva poređenje alternativnih strategija protoka finog prečišćavanja.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0021] Ovo otkriće je usmereno na antitela koja se vezuju za IL-13. U jednom aspektu, otkriće se odnosi na izolovana antitela ili njihove delove koji vežu antigen koji se vezuju za humani IL-13. Izolovano anti-IL-13 antitelo ovog otkrića može se koristiti u kliničkim okruženjima kao i u istraživanju i razvoju. Ovo otkriće se takođe odnosi na postupke za prečišćavanje anti-IL-13 antitela, ili njihovih delova koji vezuju antigen. Pogodna anti-IL-13 antitela koja se mogu prečistiti u kontekstu ovog otkrića otkrivena su u PCT prijavi br.

PCT/US2007/019660, uključujući antitelo koje je kasnije identifikovano kao ABT-308. Primeri sekvenci teških i lakih lanaca anti-IL-13 antitela prikazani su na slici 1. Ovo otkriće se takođe odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže anti-IL-13 antitela ili njihove delove koji vežu antigen koji su opisani ovde.

[0022] Radi jasnoće, a ne radi ograničenja, ovaj detaljan opis je podeljen na sledeće poddelove:

1. Definicije;

2. Generisanje antitela;

3. Proizvodnja antitela;

4. Prečišćavanje antitela;

5. Metode ispitivanja čistoće uzorka;

6. Dodatne izmene;

7. Farmaceutske kompozicije; i

8. Upotreba antitela.

1. Definicije

[0023] Da bi se ovaj pronalazak mogao lakše razumeti, prvo su definisani određeni termini.

[0024] Termin "antitelo" uključuje molekul imunoglobulina koji se sastoji od četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezanih disulfidnim vezama. Svaki težak lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (skraćeno ovde HCVR ili VH) i konstantnog regiona teškog lanca (CH). Konstantni region teškog lanca sastoji se od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (skraćeno ovde LCVR ili VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca sastoji se od jednog domena, CL. VH i VL regioni mogu se dalje podeliti u regione hipervarijabilnosti, označene terminom regioni koji određuju komplementarnost (CDRs), isprepleteni regionima koji su konzervativniji, a nazivaju se okvirni regioni (FR). Svaki VH i VL se sastoji od tri CDR-a i četiri FR, raspoređenih od amino-kraja do karboksikraja u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

[0025] Termin "deo koji veže antigen" antitela (ili "deo antitela") uključuje fragmente antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju za antigen (npr., hIL-13). Pokazano je da funkciju antitela da vezuje antigen mogu obavljati fragmenti antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćeni terminom "deo koji veže antigen" antitela uključuju (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji sadrži domene VL, VH, CL i CH1; (ii) fragment F(ab')2, bivalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u regionu šarke; (iii) Fd fragment koji sadrži VH i CH1 domene; (iv) Fv fragment koji sadrži VL i VH domene jednog kraka antitela, (v) dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), koji sadrži VH domen; i (vi) izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR). Nadalje, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirana odvojenim genima, oni se mogu spojiti, rekombinantnim metodama, sintetičkim linkerom koji omogućava njihovo stvaranje kao jedinstveni proteinski lanac u kome se VL i VH regioni udružuju kako bi formirali monovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv); vidi, npr., Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Takva jednolančana antitela su takođe predviđena da budu obuhvaćena terminom "deo koji veže antigen" antitela. Takođe su obuhvaćeni i drugi oblici jednolančanih antitela, poput diatela. Diatela su bivalentna, bispecifična antitela u kojima su VH i VL domeni eksprimirani na jednom polipeptidnom lancu, ali koristeći linker koji je prekratak da bi omogućio uparivanje dva domena na istom lancu, i na taj način primorava domene da se uparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i stvaranje dva mesta vezivanja antigena (videti npr. Holliger, P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J. et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Nadalje, antitelo ili njegov deo koji veže antigen može biti deo većeg imunoadhezijskog molekula, formiranog kovalentnom ili nekovalentnom vezom antitela ili dela antitela sa jednim ili više drugih proteina ili peptida. Primeri takvih imunoadhezivnih molekula uključuju upotrebu jezgra streptavidina za pripremu tetramernog scFv molekula (Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6: 93-101) i upotrebu cisteinskog ostatka, marker peptida i C-terminalnog polihistidinskog obeleživača za pripremu bivalentnih i biotinilovanih scfv molekula (Kipriyanov, S. M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Delovi antitela, kao što su Fab i F(ab')2 fragmenti, mogu se pripremiti iz celih antitela koristeći uobičajene tehnike, kao što su digestija celih antitela papainom ili pepsinom. Pored toga, antitela, delovi antitela i imunoadhezijski molekuli mogu se dobiti korišćenjem standardnih tehnika rekombinantne DNK, kao što je ovde opisano. U jednom aspektu, delovi koji vezuju antigen su kompletni domeni ili parovi kompletnih domena.

[0026] Izraz "humani interleukin 13" (skraćeno ovde kao hIL-13, ili IL-13), kako se ovde koristi, odnosi se na 17-kDa glikoprotein kloniran iz aktiviranih T ćelija (Zurawski and de Vries, 1994. Immunol Today 1519-26 ) i koja se proizvodi aktiviranim T ćelijama Th2 linije. ThO i ThI CD4+ T ćelije, CD8+ T ćelije i nekoliko ne-T ćelijskih populacija kao što su mastociti takođe proizvode IL-13 (Zurawski and de Vries, 1994, Immunol Today 15, 19-26). Funkcija IL-13 funkcija uključuje stimulaciju promene izotipa imunoglobulina u IgE u

1

humanim B ćelijama (Punnonen, Aversa et al., 1993 Proc Natl Acad Sci USA 903730-4) i supresiju inflamatorne proizvodnje citokina i kod ljudi i kod miša (de Waal et al., 1993 J Immunol 151 6370-81; Doherty et al., 1993 J Immunol 151 7151-60). IL-13 se vezuje za receptore ćelijske površine identifikovane kao IL-13Rα1 i IL-13Rα2. Receptor IL-13Rα1 interaguje sa IL-13 sa niskim afinitetom (KD ~ 10 nM), nakon čega sledi regrutovanje IL-4R da bi se formirao heterodimerni receptorski kompleks visokog afiniteta (KD~0,4 nM) (Aman et al., 1996 J Biol Chem 27129265-70; Hilton et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93497-501). IL-4R / IL-13Rα1 kompleks se eksprimira na mnogim ćelijskim tipovima kao što su B ćelije, monociti / makrofage, dendritske ćelije, eozinofili, bazofili, fibroblasti, endotelne ćelije, epitelne ćelije disajnih puteva i ćelije glatkih mišića disajnih puteva (Graber et al., 1998 Eur J Immunol 284286-98; Murata et al., 1998 Int Immunol 101103-10; Akaiwa et al., 2001, Cytokine 13 75-84). Ligacija kompleksa receptora IL-13Rα1/IL-4R rezultuje u aktivaciji različitih puteva prenosa signala, uključujući transduktor signala i aktivator transkripcije (ST AT6) i puteve supstrata-2 (IRS-2) receptora za insulinske receptore (Wang et al., 1995. Blood 864218-27; Takeda et al., 1996 J Immunol 157 3220-2). Sam IL-13Rα2 lanac ima visoki afinitet (KD~0,25-0,4 nM) za IL-13 i deluje kao receptor mamac koji negativno reguliše vezivanje IL-13 (Donaldson, Whitters et al. 1998. J Immunol 1612317-24 ), i kao signalni receptor koji indukuje sintezu TGF-b i fibrozu putem AP-I puta u makrofagima i moguće drugim tipovima ćelija (Fichtner-Feigl et al., 2006, Nat Med 1299-106). Nukleinska kiselina koja kodira IL-13 dostupna je kao GenBank pristupni br. NM_002188, a polipeptidna sekvenca je dostupna kao GenBank pristupni br. NP_002179. Izraz humani IL-13 treba da obuhvati rekombinantni humani IL-13 (rh IL-13), koji se može pripremiti standardnim rekombinantnim metodama ekspresije.

[0027] Termini "Kabat numeracija", "Kabat definicije" i "Kabat označavanje" ovde su korišćeni naizmenično. Ovi izrazi, koji su prepoznati u struci, odnose se na sistem numeracije aminokiselinskih ostataka koji su promenljiviji (tj. hipervarijabilni) od ostalih aminokiselinskih ostataka u varijabilnim regionima teškog i lakog lanca antitela, ili njegovog dela koji se vezuje za antigen (Kabat et al. (1971) Ann NY Acad, Sci. 190: 382-391 i, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Za varijabilni region teškog lanca, hipervarijabilni region se kreće od aminokiselinskih položaja 31 do 35 za CDR1, aminokiselinskih položaja 50 do 65 za CDR2 i aminokiselinskih položaja 95 do 102 za CDR3. Za varijabilnom region lakog lanca, hipervarijabilni region se kreće od aminokiselinskih položaja 24 do 34 za CDR1, aminokiselinskih položaja 50 do 56 za CDR2 i aminokiselinskih položaja 89 do 97 za CDR3.

[0028] Termin "humano antitelo" uključuje antitela koja imaju promenljive i konstantne regione koji odgovaraju sekvencama imunoglobulina humane klicine linije kao što su opisali Kabat et al. (vidi Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Humana antitela ovog otkrića mogu da sadrže aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sekvencom imunoglobulina humane klicine linije (npr. mutacije uvedene slučajnom ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), npr., u CDR-ima i naročito CDR3. Mutacije se mogu uvesti korišćenjem "pristupa selektivne mutageneze". Humano antitelo može imati najmanje jedan položaj zamenjen aminokiselinskim ostatkom, npr., aminokiselinski ostatak koji pojačava aktivnost koji nije kodiran sekvencom imunoglobulina humane klicine linije. Humano antitelo može imati do dvadeset položaja zamenjenih aminokiselinskim ostacima koji nisu deo sekvence imunoglobulina humane klicine linije. U drugim slučajevima zamenjuju se do deset, do pet, do tri ili najviše do dva položaja. U jednom slučaju, ove zamene su unutar CDR regiona. Međutim, termin "humano antitelo", kako se ovde koristi, nije namenjen da obuhvati antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz klicine linije druge vrste sisara, poput miša, ugrađene u humane okvirne sekvence.

[0029] Izraz "selektivni pristup mutagenezi" uključuje metod poboljšanja aktivnosti antitela selekcijom i individualnim mutiranjem CDR aminokiselina na najmanje jednom pogodnom položaju selektivne mutageneze, hipermutacijom i/ili kontaktnom položaju. "Selektivno mutirano" humano antitelo je antitelo koje sadrži mutaciju na položaju koji je odabran upotrebom pristupa selektivne mutageneze. U drugom aspektu, pristup selektivne mutageneze je da obezbedi metod preferencijalnog mutiranja odabranih pojedinačnih aminokiselinskih ostataka u CDR1, CDR2 ili CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca (u daljem tekstu: H1, H2, i H3, respektivno) ili CDR1, CDR2 ili CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca (u daljem tekstu L1, L2 i L3, respektivno) antitela. Aminokiselinski ostaci mogu se izabrati od položaja selektivne mutageneze, kontaktnih položaja ili položaja hipermutacije. Pojedinačne aminokiseline biraju se na osnovu njihovog položaja u varijabilnom regionu lakog ili teškog lanca. Treba shvatiti da hipermutacijski položaj takođe može biti kontaktni položaj. U jednom aspektu, selektivni pristup mutageneze je „ciljani pristup“. Formulacija "ciljani pristup" treba da uključi postupak mutiranja odabranih pojedinačnih aminokiselinskih ostataka u CDR1, CDR2 ili CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca ili CDR1, CDR2 ili CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca antitela u ciljani način, npr. „grupno ciljani pristup“ ili „ciljani pristup usmeren na CDR“. U "grupno ciljanom pristupu", pojedinačni aminokiselinski ostaci u određenim grupama ciljno deluju na selektivne mutacije uključujući grupe I (uključujući L3 i H3), II (uključujući H2 i L1) i III (uključujući L2 i H1), grupe koje su navedene po redosledu ciljnog delovanja. U "ciljani pristup usmeren na CDR", ciljno je delovano na pojedinačne aminokiselinske ostatke, posebno na CDR regione za selektivne mutacije sa redosledom preferencije za ciljno delovanje kao što sledi: H3, L3, H2, L1, H1 i L2. Odabrani aminokiselinski ostatak se mutira, npr., na najmanje dva ostala aminokiselinska ostatka i određuje se efekat mutacije na aktivnost antitela. Aktivnost se meri kao promena u specifičnosti/afinitetu vezivanja antitela i/ili potencijala neutralizacije antitela. Treba da se razume da se pristup selektivne mutageneze može koristiti za optimizaciju bilo kog antitela dobijenog iz bilo kog izvora, uključujući fagni prikaz, transgenih životinja sa genima humane klicine linije IgG, humanih antitela izolovanih iz humanih B-ćelija. Pristup selektivne mutageneze može se primeniti na antitela koja se ne mogu dalje optimizovati upotrebom tehnologije fagnog prikaza. Treba da se razume da antitela iz bilo kog izvora, uključujući fagni prikaz, transgene životinje sa genima humane klicine linije IgG, humana antitela izolovana iz humanih B-ćelija mogu da budu podvrgnuta povratnoj mutaciji pre ili posle pristupa selektivne mutageneze.

[0030] Izraz "rekombinantno ljudsko antitelo" uključuje ljudska antitela koja su pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana rekombinantnim sredstvima, kao što su antitela eksprimirana upotrebom rekombinantnog ekspresionog vektora transfektovanog u ćeliju domaćina, antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke humanog antitela, antitela izolovana iz životinje (npr. miša) koja je transgena za humane imunoglobulinske gene (videti npr. Taylor, L.D. et al. ( 1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295) ili antitela koja su pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana na bilo koji drugi način koji uključuje splajsing sekvenci gena humanog imunoglobulina sa drugim DNK sekvencama. Takva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne i konstantne regione poreklom od sekvenci imunoglobulina humane klicine linije (videti, Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). U određenim slučajevima, međutim, takva rekombinantna humana antitela su podvrgnuta in vitro mutagenezi (ili, kada se koristi životinjska transgena za humane Ig sekvence, in vivo somatska mutageneza), a time i aminokiselinske sekvence VH i VL regiona rekombinantnih antitela su sekvence koje, iako su izvedene iz i povezane sa sekvencama VH i VL humane klicine linije, ne moraju prirodno postojati unutar repertoara antitela humane klicine linije in vivo. U određenim slučajevima, međutim, takva rekombinantna antitela su rezultat selektivnog pristupa mutageneze ili povratne mutacije ili oba.

[0031] "Izolovano antitelo" uključuje antitelo koje je u suštini bez drugih antitela koja imaju različite antigene specifičnosti (npr., izolovano antitelo koje se specifično vezuje za hIL-13 je

1

u suštini bez antitela koja se specifično vezuju za antigene koji nisu hIL-13). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za hIL-13 može da vezuje molekule IL-13 drugih vrsta. Pored toga, izolovano antitelo može biti u suštini bez drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija.

[0032] "Neutralizujuće antitelo" (ili "antitelo koje je neutralizovalo aktivnost hIL-13") uključuje antitelo čije vezivanje za hIL-13 rezultira u inhibiciji biološke aktivnosti hIL-13. Ova inhibicija biološke aktivnosti hIL-13 može se proceniti merenjem jednog ili više pokazatelja biološke aktivnosti hIL-13. Ovi pokazatelji biološke aktivnosti hIL-13 mogu se proceniti jednim ili više standardnih testova in vitro ili in vivo poznatih u stanju tehnike.

[0033] Izraz "aktivnost" uključuje aktivnosti kao što su specifičnost/afinitet vezivanja antitela za antigen, npr., anti-hIL-13 antitelo koje se vezuje za IL-13 antigen i/ili neutralizujuća potencija antitela, npr. anti-hIL-13 antitelo čije vezivanje za hIL-13 inhibira biološku aktivnost hIL-13.

[0034] Izraz "površinska plazmon rezonanca" uključuje optički fenomen koji omogućava analizu biospecifičnih interakcija u realnom vremenu detekcijom promena u koncentraciji proteina unutar matrice biosenzora, npr., korišćenjem BIAcore sistema (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.). Za dalje opise, videti Jonsson, U., et al. (1993) Ann Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., i dr. (1991) Biotechniques 11: 620-627; Johnsson, B., al. (1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131; i Johnnson, B., et al. ( 1991) Anal. Biochem.

198:268-277.

[0035] Izraz "Koff", kao što je ovde korišćen, odnosi se na konstantu brzine disocijacije antitela iz kompleksa antitelo/antigen.

[0036] Izraz "Kd", kako se ovde koristi, odnosi se na konstantu disocijacije u određenoj interakciji antitelo-antigen.

[0037] Izraz "molekul nukleinske kiseline" obuhvata molekule DNK i molekule RNK. Molekul nukleinske kiseline može biti jednolančani ili dvolančani, ali u bilo kom aspektu je dvolančani DNK.

[0038] Izraz "izolovani molekul nukleinske kiseline", kako se ovde koristi u vezi sa nukleinskim kiselinama koje kodiraju antitela ili delove antitela (npr. VH, VL, CDR3), npr. oni koji vezuju hIL-13 i uključuju molekul nukleinske kiseline u kome su nukleotidne sekvence koje kodiraju antitelo ili deo antitela bez drugih nukleotidnih sekvenci koje kodiraju antitela ili delove antitela koji vezuju antigene osim hIL-13, pri čemu te druge sekvence mogu prirodno a se preklapaju sa nukleinskim kiselinama u humanoj genomskoj DNK. Tako, npr., izolovana nukleinska kiselina iz otkrića koja kodira VH region anti-hIL-13 antitela ne sadrži druge sekvence koje kodiraju druge VH regione koji vezuju antigene osim, na primer, hIL-13.

Izraz "izolovani molekul nukleinske kiseline" takođe podrazumeva da uključuje sekvence koje kodiraju dvovalentna, bispecifična antitela, poput diatela u kojima VH i VL regioni ne sadrže druge sekvence osim sekvenci diatela.

[0039] Izraz "rekombinantna ćelija domaćina" (ili jednostavno "ćelija domaćin") uključuje ćeliju u koju je uveden rekombinantni ekspresioni vektor. Treba shvatiti da su takvi pojmovi namenjeni da se ne odnose samo na određenu predmetnu ćeliju već i na potomstvo takve ćelije. Budući da se u sledećim generacijama mogu dogoditi određene modifikacije kao posledica mutacije ili uticaja sredine, takvo potomstvo ne mora, zaista, biti identično matičnoj ćeliji, ali je još uvek uključeno unutar obima termina "ćelija domaćin" kako se ovde koristi.

[0040] Izraz "modifikovanje", kako se ovde koristi, odnosi se na promenu jedne ili više aminokiselina u antitelima ili njihovim delovima koji vezuju antigen. Promena se može proizvesti adicijom, supstitucijom ili delecijom aminokiseline na jednom ili više položaja. Promena se može proizvesti pomoću poznatih tehnika, kao što je PCR mutageneza.

[0041] Izraz "oko", kako se ovde koristi, odnosi se na opsege od približno 10-20% veće od ili manje od referentne vrednosti. U određenim okolnostima, stručnjak iz date oblasti tehnike će prepoznati da, zbog prirode referentne vrednosti, izraz „oko“ može značiti više ili manje od 10-20% odstupanja od te vrednosti.

[0042] Izraz "redukcija/inaktivacija virusa", kako se ovde koristi, odnosi se na smanjenje broja virusnih čestica u određenom uzorku ("smanjenje"), kao i na smanjenje aktivnosti, na primer, ali bez ograničenja na infektivnost ili sposobnost repliciranja virusnih čestica u određenom uzorku ("inaktivacija"). Takva smanjenja broja i/ili aktivnosti virusnih čestica mogu biti reda veličine oko 1% do oko 99%, uključujući oko 20% do oko 99%, uključujući oko 30% do oko 99%, uključujući oko 40% do oko 99%, uključujući oko 50% do 99%, uključujući oko 60% do 99%, uključujući oko 70% do 99%, uključujući oko 80% do 99%, uključujući oko 90% do oko 99%. U određenim neograničavajućim primerima izvođenja, količina virusa, ako postoji, u pročišćenom proizvodu antitela je manja od ID50 (količina virusa koja će inficirati 50 procenata ciljne populacije) za taj virus, najmanje 10-struko manja od ID50 za taj virus, ili najmanje 100 puta manja od ID50 za taj virus, ili najmanje 1000 puta manja od ID50 za taj virus.

[0043] Izraz "kontaktni položaj" uključuje aminokiselinski položaj u CDR1, CDR2 ili CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca ili varijabilnog regiona lakog lanca antitela koje je zauzeto aminokiselinom koja kontaktira antigen u jednom od dvadeset šest poznatih struktura antitelaantigena. Ako CDR aminokiselina u bilo kojoj od dvadeset šest poznatih rešenih struktura kompleksa antitelo-antigen kontaktira sa antigenom, tada se može smatrati da ta aminokiselina zauzima kontaktni položaj. Kontaktni položaji imaju veću verovatnoću da budu

1

zauzeti aminokiselinom koja je u kontaktu sa antigenima nego u nekontaktnom položaju. U jednom aspektu, kontaktni položaj je položaj CDR koji sadrži aminokiselinu koja je u kontaktu sa antigenom u više od 3 od 26 struktura (> 1,5%). U drugom aspektu, kontaktni položaj je položaj CDR koji sadrži aminokiselinu koja je u kontaktu sa antigenom u više od 8 od 25 struktura (> 32%).

2. Generisanje antitela

[0044] Izraz "antitelo" kako se koristi u ovom delu odnosi se na intaktno antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen.

[0045] Antitela ovog otkrića mogu se generisati različitim tehnikama, uključujući imunizaciju životinje sa antigenom koji od interesa, što je praćeno uobičajenim metodologijama monoklonskih antitela, npr., standardnom tehnikom hibridizacije somatskih ćelija od Kohler i Milstein (1975) Nature 256: 495. Iako su poželjni postupci hibridizacije somatske ćelije, u principu se mogu koristiti i druge tehnike za proizvodnju monoklonskog antitela, npr., virusna ili onkogena transformacija B-limfocita.

[0046] Jedan životinjski sistem za pripremu hibridoma je mišji sistem. Proizvodnja hibridoma je veoma dobro ustanovljen postupak. Protokoli imunizacije i tehnike za izolaciju imunizovanih splenocita za fuziju su poznati u stanju tehnike. Takođe su poznati i fuzioni partneri (npr. ćelije mišjeg mijeloma) i postupci fuzije.

[0047] Antitelo može biti humano, himerno ili humanizovano antitelo. Himerna ili humanizovana antitela ovog otkrića mogu se pripremiti na osnovu sekvence ne-humanog monoklonskog antitela pripremljenog kao što je opisano u prethodnom tekstu. DNK koja kodira imunoglobuline teškog i lakog lanca može se dobiti od nehumanog hibridoma koji su od interesa i konstruisan tako da sadrži ne-mišje (npr. humane) imunoglobulinske sekvence koristeći standardne tehnike molekularne biologije. Na primer, da bi se stvorilo himerno antitelo, mišji varijabilni regioni mogu se vezati za humane konstantne regione upotrebom postupaka poznatih u stanju tehnike (videti npr., SAD patent br. 4,816,567 od Cabilly et al.). Da bi se stvorilo humanizovano antitelo, mišji CDR regioni mogu biti inserirani u humani okvir korišćenjem postupaka poznatih u stanju tehnike (videti npr., SAD patent br.5,225,539 ta Winter, i SAD patente br.5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 i 6,180,370 za Queen et al.).

[0048] U jednom neograničavajućem slučaju, antitela ovog otkrića su humana monoklonska antitela. Takva humana monoklonska antitela usmerena protiv IL-13 mogu biti generisana korišćenjem transgenih ili transhromozomskih miševa koji nose delove humanog imunog sistema, pre nego mišjeg sistema. Ovi transgeni i transhromozomski miševi uključuju miševe

1

koji su ovde označeni kao HuMAb Mouse® (Medarex, Inc.), KM Mouse® (Medarex, Inc.) i XenoMouse® (Amgen).

[0049] Pored toga, alternativni transhromozomski životinjski sistemi koji eksprimiraju humane imunoglobulinske gene dostupni su u stanju tehnike i mogu se koristiti za pripremu antitela iz otkrića, kao što su anti-IL-13 antitela. Na primer, mogu se koristiti miševi koji nose transhromozom humanog teškog lanca i trahromozom humanog lakog lanca, koji su označeni kao "TC miševi"; takvi miševi su opisani u Tomizuka et al. ( 2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 722-727. Pored toga, krave koje nose transhromozome ljudskog teškog i lakog lanca su opisane u struci (npr., Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20: 889-894 i PCT prijava br. WO 2002/092812) i mogu se koristiti za pripremu anti-IL-13 antitela ovog otkrića.

[0050] Rekombinantna humana antitela iz otkrića koja uključuju, ali nisu ograničena na, anti-IL-13 antitela, njegov deo za vezivanje antigena ili ovde opisana antitela povezana sa anti-IL-13 mogu biti izolovana skriningom rekombinantne kombinatorne biblioteke antitela, npr., biblioteke scFv fagnog prikaza, pripremljene korišćenjem humanih cDNK VL i VH pripremljenih iz iRNK dobijenih iz humanih limfocita. Metodologije za pripremu i skrining takvih biblioteka su poznate u stanju tehnike. Pored komercijalno dostupnih kompleta za generisanje fagnih biblioteka (npr., the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, kataloški br. 27-9400-01; i Stratagene SurfZAPTM komplet za fagni prikaz, kataloški br.

240612), primeri postupaka i reagenasa naročito podložnih za upotrebu u generisanju i skriningu biblioteke prikaza antitela mogu se naći u, npr., Ladner et al. SAD patent br.

5,223,409; Kang et al. PCT objavi br. WO 92/18619; Dower et al. PCT objavi br. WO 91/17271; Winter et al. PCT objavi br. WO 92/20791; Markland et al. PCT objavi br. WO 92/15679; Breitling et al. PCT objavi br. WO 93/01288; McCafferty et al. PCT objavi br. WO 92/01047; Garrard et al. PCT objavi br. WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; i Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982.

[0051] Humana monoklonska antitela ovog otkrića mogu se takođe pripremiti korišćenjem SCID miševa u koje su rekonstituisane humane ćelije imunog sistema tako da se nakon imunizacije može generisati odgovor humanog antitela. Takvi miševi su opisani u, na primer, američkim patentima br.5,476,996 i 5,698,767 od Wilson et al.

1

[0052] U određenim slučajevima, postupci otkrića uključuju anti-IL-13 antitela i delove antitela, antitela povezana sa anti-IL-13 i delove antitela i humana antitela i delove antitela sa svojstvima ekvivalentnim anti-IL-13 antitelima, kao što je visoko afinitetno vezivanje za hIL-13 sa niskom kinetikom disocijacije i visokim kapacitetom neutralizacije. U jednom aspektu, otkriće obezbeđuje lečenje izolovanim humanim antitelom ili njegovim delom koji vezuje antigen koji disocira od hIL-13 sa Kd od oko 1 k 10<-8>M ili manjom i Koff konstantom od 1 x 10<-3>s<-1>ili manje, oba određena površinskom plazmon rezonancom. U specifičnim neograničavajućim slučajevima, anti-IL-13 antitelo prečišćeno prema otkriću kompetitivno inhibira vezivanje ABT-308 za IL-13 pod fiziološkim uslovima.

[0053] U još jednom primeru otkrića, antitela ili njihovi fragmenti, kao što su, ali bez ograničenja na anti-IL-13 antitela ili njihove fragmente, mogu biti izmenjeni pri čemu je konstantni region antitela modifikovan tako da smanji najmanje jednu biološku efektornu funkciju posredovanu preko konstantnog regiona u odnosu na nemodifikovano antitelo. Da bi se modifikovalo antitelo iz otkrića tako da ono pokazuje smanjeno vezivanje za Fc receptor, segment imunoglobulinskog konstantnog regiona antitela može biti mutiran u određenim regionima neophodnim za interakcije Fc receptora (FcR) (videti, na primer, Canfield and Morrison (1991) J. Exp. Med.173: 1483-1491; i Lund et al. ( 1991) J. of Immunol. 147:2657-2662). Smanjenje sposobnosti vezivanja FcR antitela može takođe da smanji druge efektorske funkcije koje se oslanjaju na FcR interakcije, kao što su opsonizacija i fagocitoza i ćelijska citotoksičnost zavisna od antigena.

3. Proizvodnja antitela

3.1 Opšte proizvodne strategije

[0054] Da bi se antitelo prema otkriću eksprimiralo, DNK koji kodiraju delimične ili pune dužine lake i teške lance, inseriraju se u jedan ili više vektora ekspresije tako da su geni operativno vezani sa transkripcijskim i translacijskim kontrolnim sekvencama. (videti, npr. američki patent br.6,914,128). U tom kontekstu, termin "operativno vezan" treba da znači da je gen antitela vezan u vektor tako da transkripcione i translacione kontrolne sekvence u vektoru služe svojoj predviđenoj funkciji regulisanja transkripcije i translacije gena antitela. Ekspresioni vektor i ekspresione kontrolne sekvence su izabrani tako da budu kompatibilni sa korišćenom ekspresionom ćelijom domaćinom. Gen lakog lanca antitela i gen teškog lanca antitela mogu biti inserirani u poseban vektor ili, što je češće, oba gena su inserirana u isti ekspresioni vektor. Geni antitela se ubacuju u ekspresioni vektor standardnim metodama (npr.

1

ligacijom komplementarnih restrikcionih mesta na fragmentu i vektoru gena antitela ili ligacijom tupog kraja ako nema restrikcionih mesta). Pre insercije antitela ili sekvence lakog ili teškog lanca vezanog za antitelo, ekspresioni vektor može već da sadrži sekvence konstantnog regiona antitela. Na primer, jedan pristup prevođenju anti-IL-13 antitela ili VH i VL sekvenci vezanih za anti-IL-13 antitelo u gene antitela pune dužine je njihovo inseriranje u ekspresione vektore koji već kodiraju konstantne regione teškog lanca i konstantne regione lakog lanca, respektivno, tako da je VH segment operativno vezan sa CH segmentom (segmentima) unutar vektora, a VL segment je operativno vezan sa CL segmentom unutar vektora. Dodatno ili alternativno, rekombinantni ekspresioni vektor može kodirati signalni peptid koji olakšava izlučivanje lanca antitela iz ćelije domaćina. Geni lanca antitela mogu se klonirati u vektor tako da je signalni peptid vezan u okviru sa amino terminusom gena lanca antitela. Signalni peptid može biti signalni peptid imunoglobulina ili heterologni signalni peptid (tj. signalni peptid iz proteina koji nije imunoglobulin).

[0055] Pored gena lanca antitela, rekombinantni ekspresioni vektor otkrića može da nosi jednu ili više regulatornih sekvenci koje kontrolišu ekspresiju gena lanca antitela u ćeliji domaćinu. Izraz "regulatorna sekvenca" je određen tako da obuhvata promotore, pojačivače i druge ekspresione kontrolne elemente (npr. poliadenilacione signale) koji kontrolišu transkripciju ili translaciju gena lanca antitela. Takve regulatorne sekvence su opisane, npr., u Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Stručnjaci iz date oblasti tehnike će razumeti da dizajn ekspresionog vektora, uključujući izbor regulatornih sekvenci može da zavisi od takvih faktora kao što je izbor ćelije domaćina koja će se transformisati, nivo ekspresije željenog proteina, itd. Pogodne regulatorne sekvence za ekspresiju ćelija domaćina sisara uključuju virusne elemente koji usmeravaju visoke nivoe ekspresije proteina u ćelijama sisara, kao što su promotori i/ili pojačivači poreklom iz citomegalovirusa (CMV) (poput CMV promotora/pojačivača), Simian Virus 40 (SV40) ) (kao što je SV40 promotor/pojačivač), adenovirus (npr. glavni adenovirusni kasni promotor (AdMLP)) i polioma. Za dodatni opis virusnih regulatornih elemenata i njihovih sekvenci, videti, na primer, američki patent br.

5,168,062 od Stinski, američki patent br. 4,510,245, od Bell et al. i američki patent br.

4,968,615 od Schaffner et al.

[0056] Pored gena lanca antitela i regulatornih sekvenci, rekombinantni ekspresioni vektor otkrića može da nosi jednu ili više dodatnih sekvenci, kao što je sekvenca koja reguliše replikaciju vektora u ćelijama domaćinima (npr. oridžini replikacije) i/ili selektabilni marker gen. Selektabilni marker gen olakšava selekciju ćelija domaćina u koje je vektor uveden (videti npr. američke patente br. 4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017, svi od Axel et al.). Na

1

primer, tipično selektabilni marker gen daje otpornost na lekove, poput G418, higromicina ili metotreksata, ćeliji domaćinu u koju je vektor uveden. Pogodni selektabilni marker geni koji se uključuju gen dihidrofolat reduktaze (DHFR) (za upotrebu u dhfr- ćelijama domaćinima sa selekcijom/amplifikacijom metotreksata) i neo gen (za selekciju G418).

[0057] Antitelo ili deo antitela iz otkrića može se pripremiti rekombinantnom ekspresijom gena lakog i teškog lanca imunoglobulina u ćeliji domaćinu. Da bi se antitelo rekombinantno eksprimiralo, ćelija domaćin je transficirana jednim ili više rekombinantnih ekspresionih vektora koji nose fragmente DNK koji kodiraju imunoglobulinske lake i teške lance antitela tako da se laki i teški lanci eksprimiraju u ćeliji domaćinu i izlučuju u medijum u kome su ćelije domaćini kultivisane, pri čemu se iz medijuma antitela mogu izolovati. Standardne rekombinantne DNK metodologije koriste se za dobijanje gena teških i lakih lanaca antitela, ugrađuju te gene u rekombinantne ekspresione vektore i uvode vektore u ćelije domaćine, kao što su oni opisani u Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) i u američkim patentima br.4,816,397 & 6,914,128.

[0058] Za ekspresiju lakih i teških lanaca, ekspresioni vektor(i) koji kodiraju teški i laki lanac se transficira/transficiraju u ćeliju domaćina standardnim tehnikama. Različiti oblici termina "transfekcija" treba da obuhvate širok niz različitih tehnika koje se obično koriste za uvođenje egzogene DNK u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina, npr. elektroporaciju, taloženje kalcijum-fosfatom, transfekciju DEAE-dekstranom i slično. Iako je teoretski moguće eksprimirati antitela otkrića bilo u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama domaćinima, ekspresija antitela u eukariotskim ćelijama, poput ćelija domaćina sisara, je pogodna jer će takve eukariotske ćelije, a naročito ćelije sisara, verovatnije od prokariotskih ćelija da sastavljaju i izlučuju pravilno savijena i imunološki aktivna antitela. Objavljeno je da je prokariotska ekspresija gena za antitela neefikasna za proizvodnju visokih prinosa aktivnog antitela (Boss and Wood (1985) Immunology Today 6: 12-13).

[0059] Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju DNK u ovde navedenim vektorima su prokariotske, od kvasca ili više eukariotske ćelije opisane gore. Pogodni prokarioti za tu svrhu uključuju eubakterije, kao što su gram-negativni ili gram-pozitivni organizmi, npr. Enterobacteriaceae poput Escherichia, npr. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, npr. Salmonella typhimurium, Serratia, npr. , Serratia marcescans i Shigella, kao i bacili kao B. subtilis i B. licheniformis (npr. B. licheniformis 41P otkriven u DD 266,710 objavljen 12.4.1989.), Pseudomonas kao što su P. aeruginosa i Streptomices. Jedan pogodan domaćin za kloniranje E. coli je E. coli 294 (ATCC 31,446),

2

mada su pogodni i drugi sojevi poput E. coli B, E. coli Ks1776 (ATCC 31,537) i E. coli W3110 (ATCC 27,325). Ovi primeri su ilustrativni, a ne ograničavajući.

[0060] Pored prokariota, eukariotski mikrobi poput filamentoznih gljiva ili kvasca su pogodni domaćini za kloniranje ili ekspresiju za vektore koji kodiraju polipeptide. Saccharomices cerevisiae, ili obični pekarski kvas, najčešće se koristi među nižim eukariotskim mikroorganizmima domaćinima. Međutim, mnogi drugi rodovi, vrste i sojevi su uobičajeno dostupni i korisni ovde, kao što je Schizosaccharomices pombe; Domaćini Kluyveromyces kao što su, na primer, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906) , K. thermotolerans i K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces kao što je Schwanniomyces occidentalis; i filamentozne gljive, kao što su, na primer, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium i Aspergillus domaćini, kao što su A. nidulans i A. niger.

[0061] Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikoziliranih antitela potiču iz višećelijskih organizama. Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni bakulovirusni sojevi i varijante i odgovarajuće permisivne ćelije domaćina insekata iz domaćina poput Spodoptera frugiperda (gusenica), Aedes aegypti (komarac), Aedes albopictus (komarac), Drosophila melanogaster (voćna mušica) i Bombyx mori. Različiti virusni sojevi za transfekciju su javno dostupni, npr., L-1 varijanta Autographa californica NPV i Bm-5 soja Bombyx mori NPV, a takvi se virusi mogu koristiti kao virus ovde prema predmetnom otkriću, posebno za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda. Biljne ćelijske kulture pamuka, kukuruza, krompira, soje, petunije, paradajza i duvana mogu se takođe koristiti kao domaćini.

[0062] Pogodne ćelije domaćini sisara za ekspresiju rekombinantnih antitela ovog otkrića uključuju jajnik kineskog hrčka (CHO ćelije) (uključujući dhfr- CHO ćelije, opisane u Urlaub and Chasin, (1980) PNAS USA 77: 4216-4220, korišćene sa selektivnim markerom DHFR, npr., kako je opisano u Kaufman and Sharp (1982), Mol. Biol. 159:601-621), NS0 ćelije mijeloma, COS ćelije i SP2 ćelije. Kada se rekombinantni ekspresioni vektori koji kodiraju gene antitela uvode u ćelije domaćine sisara, antitela se proizvode kultivacijom ćelija domaćina tokom vremenskog perioda dovoljnog da omogući ekspresiju antitela u ćelijama domaćinima ili izlučivanje antitela u medijum za kulturu u kome su domaćinske ćelije gajene. Ostali primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara su CV1 linija majmunskog bubrega transformisana sa SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); humana embrionalna linija bubrega (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u suspenzionoj kulturi, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); ćelije bubrega mladunčeta hrčka (BHK, ATCC CCL 10); ćelije jajnika kineskog hrčka / -DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); mišje Sertolijeve ćelije (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1 ATCC CCL 70); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587); ćelije karcinoma grlića materice (HELA, ATCC CCL 2); bubrežne ćelije pasa (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre bizamskog pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane ćelije pluća (V138, ATCC CCL 75); humane ćelije jetre (Hep G2, HB 8065); mišji tumor mlečne žlezde (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI ćelije (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci.383:44-68 (1982); MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i humana linija hepatoma (Hep G2).

[0063] Ćelije domaćini transformišu se sa gore opisanom ekspresijom ili klonirajućim vektorima za proizvodnju antitela i uzgajaju se u konvencionalnim hranljivim medijumima modifikovanim kako je pogodno za indukciju promotora, selekciju transformanata ili amplifikaciju gena koji kodiraju željene sekvence.

[0064] Ćelije domaćini koji se koriste za proizvodnju antitela mogu se uzgajati u različitim medijumima. Komercijalno dostupni mediji kao što su Ham-ov F10™ (Sigma), minimalni esencijalni medijum ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) i Dulbecco-ov modifikovani Eagle-ov medijum ((DMEM), Sigma) pogodni su za kultivisanje ćelije domaćina. Pored toga, bilo koji od medijuma opisan u Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), američki patent br.4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; ili 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; ili američki patent Re.30,985 mogu se koristiti kao medijum za kulturu za ćelije domaćina. Bilo koji od ovih medija može se po potrebi dopuniti hormonima i/ili drugim faktorima rasta (kao što su insulin, transferin ili epidermalni faktor rasta), solima (kao što su natrijum hlorid, kalcijum, magnezijum i fosfat), puferima (kao što je HEPES), nukleotidima (kao što su adenozin i timidin), antibioticima (kao što je lek gentamicin), elementi u tragovima (definisani kao neorganska jedinjenja koja su obično prisutna u krajnjim koncentracijama u mikromolarnom opsegu) i glukoza ili ekvivalentni izvor energije. Bilo koji drugi potrebni dodaci mogu se takođe uključiti u odgovarajućim koncentracijama koje bi bile poznate stručnjacima ove oblasti tehnike. Uslovi kulture, kao što su temperatura, pH i slično, su oni koji su prethodno korišćeni sa ćelijom domaćinom odabranom za ekspresiju i biće očigledno uobičajenom stručnjaku.

[0065] Ćelije domaćina takođe se mogu koristiti za proizvodnju delova intaktnih antitela, kao što su Fab fragmenti ili scFv molekuli. Podrazumeva se da su varijacije gornjeg postupka unutar obima ovog otkrića. Na primer, u određenim slučajevima može biti poželjno transficirati ćeliju domaćina sa DNK koja kodira laki lanac ili težak lanac (ali ne oba) antitela ovog otkrića. Tehnologija rekombinantne DNK može se takođe koristiti za uklanjanje nekog dela ili cele DNK koja kodira jedan od ili oba laki i težak lanac koji nisu potrebni za vezivanje za IL-13, naročito hIL-13. Molekuli eksprimirani iz takvih skraćenih molekula DNK takođe su obuhvaćeni antitelima iz otkrića. Pored toga, mogu se proizvesti bifunkcionalna antitela u kojima jedan težak i jedan laki lanac su antitelo iz otkrića, a drugi težak i laki lanac su specifični za antigen koji nije IL-13 unakrsnim vezivanjem antitela iz otkrića za drugo antitelo standardnim hemijskim metodama unakrsnog vezivanja.

[0066] U pogodnom sistemu za rekombinantnu ekspresiju antitela ili njegovog antigenvezujućeg dela prema otkriću, rekombinantni ekspresioni vektor koji kodira težak lanac antitela i laki lanac antitela uvodi se u dhfr-CHO ćelije pomoću transfekcije posredovane kalcijum fosfatom. Unutar rekombinantnog ekspresionog vektora, geni teškog i lakog lanca antitela su operativno vezani sa CMV pojačivačem/AdMLP promotorskim regulatornim elementima kako bi se pokrenuli visoki nivoi transkripcije gena. Rekombinantni ekspresioni vektor takođe nosi DHFR gen, koji omogućava selekciju CHO ćelija koje su transficirane vektorom korišćenjem selekcije metotreksata/amplifikacije. Selektovane ćelije transformanta domaćina su kultivisane da bi se omogućila ekspresija teških i lakih lanaca antitela, a intaktno antitelo se izoluje iz medijuma kulture. Standardne tehnike molekularne biologije koriste se za pripremu rekombinantnog ekspresionog vektora, transfekciju ćelija domaćina, selekciju za transformante, kultivisanje ćelija domaćina i izolaciju antitela iz medijuma kulture.

[0067] Kada se koriste rekombinantne tehnike, antitelo se može proizvesti unutar ćelije, u periplazmatskom prostoru ili direktno izlučiti u medijum. U jednom aspektu, ako se antitelo proizvodi intracelularno, kao prvi korak, ostaci čestica, ćelije domaćini ili lizirane ćelije (npr., rezultat homogenizacije), mogu se ukloniti, npr., centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Kada se antitelo izlučuje u medijum, supernatanti iz takvih ekspresionih sistema se mogu prvo koncentrovati upotrebom komercijalno dostupnog filtera za koncentrovanje proteina, npr., Amicon™ ili Millipore Pellicon™ ultrafiltraciona jedinica.

[0068] Pre postupka pronalaska, postupci za prečišćavanje antitela iz ćelijskih krhotina u početku zavise od mesta ekspresije antitela. Neka antitela se mogu izlučiti direktno iz ćelije u okolni medijum za rast; druga su pripremljena unutarćelijski. Za poslednja navedena antitela, prvi korak postupka prečišćavanja obično uključuje: lizu ćelije, koja se može izvesti različitim metodama, uključujući mehaničko smicanje, osmotski šok ili enzimske tretmane. Takav poremećaj oslobađa celokupni sadržaj ćelije u homogenat, a osim toga proizvodi podćelijske fragmente koje je teško ukloniti zbog njihove male veličine. Oni se obično uklanjaju diferencijalnom centrifugiranjem ili filtracijom. Kada se antitelo izlučuje, supernatanti iz takvih sistema ekspresije se obično prvo koncentrišu upotrebom komercijalno dostupnog filtera za koncentrovanje proteina, npr., Amicon™ ili Millipore Pellicon™ ultrafiltracione jedinice. Kada se antitelo izlučuje u medijum, rekombinantne ćelije domaćini se takođe mogu

2

odvojiti iz medijuma ćelijske kulture, npr. tangencijalnom filtracijom protoka. Antitela se mogu dodatno obnoviti iz medijuma kulture korišćenjem metoda prečišćavanja antitela iz ovog pronalaska.

3.2. Primer strategije proizvodnje

[0069] U određenim primerima izvođenja, početni korak proizvodnje anti-IL-13 antitela uključuje upotrebu pokretne boce i Biowave kese za širenje CHO ćelija koje eksprimiraju anti-IL-13 antitelo iz jedne zamrznute bočice u željenu biomasu za inokulaciju bioreaktora za zasejavanje od 110 L. Zamrznuta bočica CHO ćelija Master Cell Bank je odmrznuta i postavljena u medijum za rast (SR-512) i centrifugirana. Ćelije su resuspendovane u mediju za rast i proširene na 37° C i 5% CO2 u pokretnim bocama za jednokratnu upotrebu, bočicama za mućkanje i/ili Biowave kesama rastuće zapremine. Duplikati „wave“ kesa od 20 L koriste se za maksimiziranje konačne ekspanzije ćelijske mase pre inokulacije u bioreaktoru za zasejavanje. Kada ćelija gustina dostigne ≥2.0 x 10<6>vijabilnih ćelija / mL iz obe „wave“ kese od 20 L za otprilike 15 - 17 dana, kultura se prebacuje u 110 L bioreaktor za zasejavanje napunjen medijumom za rast SR-520 radi daljeg širenja. Nakon inokulacije, ciljna temperatura je 37°C, a pH je postavljen na ciljnu vrednost od 7,1 i kontrolisana je dodavanjem NaOH i prskanjem CO2. Rastvoreni kiseonik (DO) u bioreaktoru je kontrolisan na ciljnoj vrednosti od 40% prskanjem vazduha i kiseonika. Pošto ćelijska gustina dostigne ≥ 2,6 x 10<6>vijabilnih ćelija/mL nakon otprilike 2 do 4 dana, kultura je prebačena u proizvodni bioreaktor od 3000 L.

[0070] U nekim primerima izvođenja, delimično punjenje proizvodnog bioreaktora od 3000 L koristi se za dalje širenje ćelijske kulture. U početku se reaktor napuni medijumom za rast (SR-520) i inokuliše šaržom iz bioreaktora za zasejavanje od 110 L. Tokom ove faze kratkog punjenja, temperatura, rastvoreni kiseonik i pH su kontrolisani na 37°C, 40% i 7.1, respektivno. pH kulture se kontroliše prskanjem sa CO2i dodavanjem NaOH. Tipično, ćelije rastu 2 do 4 dana pre nego što dostignu gustinu proizvodne faze od ≥ 1,6 x 10<6>vijabilnih ćelija/mL.

[0071] Proizvodni medijum SR-521 (1950 L) se dodaje ćelijskoj kulturi u bioreaktoru od 3000 L da bi se inicirao stadijum proizvodnje. Dodaje se sredstvo protiv penušanja C da bi se smanjilo penušanje. pH kulture se kontroliše na ciljnoj vrednosti od 6,9 isprekidanim rasprskavanjem CO2i dodavanjem NaOH. Temperatura i rastvoreni kiseonik su kontrolisani na ciljnim vrednostima od 35°C i 40%, respektivno. DO u bioreaktoru u početku se kontroliše na željenoj vrednosti prskanjem vazduha i po potrebi se dopunjuje čistim kiseonikom. U određenim primerima izvođenja temperatura je snižena do ciljne vrednosti od 33°C kada gustina vijabilnih ćelija dostigne ≥ 3,0 x 10<6>ćelija/mL, a pH i DO su održavani na ciljnim vrednostima od 6,9 i 40%, respektivno, dok je u ostalim primerima izvođenja održavana ciljna vrednost od 35°C. Prema potrebo se dodaje glukoza (SR-334). Kulture se sakupljaju i prečišćavaju kao što je navedeno niže, kada ćelijska vijabilnost padne na ≤ 50%.

4. Prečišćavanje antitela

4.1 Uopšteno prečišćavanje antitela

[0072] Pronalazak obezbeđuje postupke za proizvodnju prečišćenog (ili "HCP-redukovanog") antitela iz smeše koja sadrži antitelo i najmanje jedan HCP. Predmetni pronalazak takođe pruža postupke u kojima je konačni prečišćeni preparat redukovan u isceđenom proteinu A. Postupak prečišćavanja ovog pronalaska započinje u koraku razdvajanja kada se antitelo proizvede korišćenjem gore opisanih metoda i konvencionalnih postupaka iz date oblasti tehnike. Tabela 1 rezimira jedan slučaj šeme prečišćavanja. Varijacije ove šeme, uključujući, ali ne ograničavajući se na, varijacije u kojima je izostavljen korak afinitetne hromatografije proteina A ili je redosled koraka jonske izmene obrnut, su predviđene i unutar su obima ovog otkrića.

Tabela 1

2

[0073] Pošto je dobijen razbistreni rastvor ili smeša koja sadrži antitelo, odvajanje antitela od ostalih proteina proizvedenih u ćeliji, kao što su HCP, vrši se upotrebom kombinacije različitih tehnika prečišćavanja, uključujući korak(e) jonske izmene i korak(e) odvajanje hidrofobne interakcije. Koraci razdvajanja razdvajaju smeše proteina na osnovu njihovog naelektrisanja, stepena hidrofobnosti ili veličine. U jednom aspektu otkrića, razdvajanje se vrši upotrebom hromatografije, uključujući katjonsku, anjonsku i hidrofobnu interakciju. Dostupno je nekoliko različitih hromatografskih smola za svaku od ovih tehnika, što omogućava precizno prilagođavanje šema prečišćavanja određenom proteinu koji je uključen. Suština svake od metoda razdvajanja je da se može izazvati da proteini kreću različitim brzinama niz kolonu, postižući fizičko razdvajanje koje se povećava kako prolaze dalje niz kolonu, ili da se selektivno lepe za medijum za razdvajanje, a zatim difrencijalno eluiraju različitim rastvaračima. U nekim slučajevima, antitelo se odvaja od nečistoća kada se nečistoće specifično lepe na kolonu, a antitelo ne, tj., antitelo je prisutno u protoku.

[0074] Kao što je gore pomenuto, precizno prilagođavanje šema prečišćavanja zavisi od razmatranja proteina koji se prečišćava. U određenim slučajevima, koraci razdvajanja ovog otkrića koriste se za odvajanje antitela od jedne ili više HCP. Antitela koja se mogu uspešno prečistiti upotrebom ovde opisanih metoda uključuju, ali nisu ograničena na, humana IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 i IgM antitela. U određenim slučajevima, strategije prečišćavanja ovog otkrića isključuju upotrebu afinitetne hromatografije proteina A, na primer u kontekstu prečišćavanja IgG3 antitela, pošto se IgG3 antitela neefikasno vezuju za protein A. Ostali faktori koji omogućavaju specifično prilagođavanje šeme prečišćavanja uključuju, ali nisu ograničeni na: prisustvo ili odsustvo Fc regiona (npr., u kontekstu antitela pune dužine u poređenju sa njegovim Fab fragmentom), jer se protein A vezuje za region Fc; posebne sekvence klicine linije korišćene za generisanje antitela od interesa; i aminokiselinski sastav antitela (npr. primarna sekvenca antitela kao i ukupno naelektrisanje/hidrofobnost molekula). Antitela koja dele jednu ili više karakteristika mogu se prečistiti korišćenjem strategija prečišćavanja prilagođenih da iskoriste tu karakteristiku.

4.2 Primarna izolacija

[0075] Početni koraci metoda prečišćavanja predmetnog pronalaska uključuju prvu fazu razbistrenja i primarnu izolaciju antitela iz uzorka matrice. Pored toga, primarni postupak izolacije takođe može biti tačka na kojoj treba smanjiti ili inaktivirati viruse koji mogu biti prisutni u uzorku matrice. Na primer, bilo koja ili više različitih metoda redukcije/inaktivacije virusa mogu se koristiti tokom primarne faze prečišćavanja, uključujući inaktivaciju toplotom

2

(pasterizaciju), inaktivaciju sa pH, tretman rastvaračem/deterdžentom, zračenje UV i γ zracima i dodavanje određenih hemijskih inaktivirajućih sredstava kao što je β-propiolakton ili npr. bakar fenantrolin kao u US Pat. 4,534,972. U određenim primerima izvođenja ovog pronalaska, matrica uzorka je izložena smanjenju/inaktivaciji virusa sa pH tokom primarne faze izolacije.

[0076] Postupci redukcije/inaktivacije virusa sa pH uključuju, ali nisu ograničeni na, inkubaciju smeše tokom vremenskog perioda na niskoj pH, a zatim neutralizaciju pH i uklanjanje čestica filtracijom. U određenim slučajevima smeša će se inkubirati na pH između oko 2 i 5, na pH između oko 3 i 4, uključujući, ali ne ograničavajući se na, pH od oko 3,5. pH smeše uzorka može biti snižena bilo kojom pogodnom kiselinom, uključujući, ali ne ograničavajući se na, limunsku kiselinu, sirćetnu kiselinu, kaprilnu kiselinu ili druge pogodne kiseline. Izbor nivoa pH u velikoj meri zavisi od profila stabilnosti proizvoda antitela i puferskih komponenti. Poznato je da na kvalitet ciljnog antitela tokom smanjenja/inaktivacije virusa niskim pH utiče pH i trajanje inkubacije na niskoj pH. U određenim primerima izvođenja trajanje inkubacije sa niskoj pH biće od 0,5 do 2 sata, uključujući, ali ne ograničavajući se na, 0,5 h do 1,5 sata, uključujući, ali ne ograničavajući se na, trajanje od oko 1 sata. Smanjenje/inaktivacija virusa zavisi od ovih istih parametara pored koncentracije proteina, što može ograničiti smanjenje/inaktivaciju u visokim koncentracijama. Stoga se mogu odabrati odgovarajući parametri koncentracije proteina, pH i trajanja redukcije/inaktivacije da bi se postigao željeni nivo redukcije/ inaktivacije virusa.

[0077] U određenim primerima izvođenja redukcija/inaktivacija virusa može se postići upotrebom pogodnih filtera. Neograničavajući primer pogodnog filtera je Ultipor DV50™ filter iz Pall Corporation. Iako određeni primeri izvođenja ovog pronalaska koriste takvu filtraciju tokom primarne faze izolacije, u drugim primerima izvođenja ona se koristi u drugim fazama postupka prečišćavanja, uključujući pretposlednji ili završni korak prečišćavanja. U određenim primerima izvođenja, alternativni filteri se koriste za redukciju/inaktivaciju virusa, kao što su, ali ne ograničavajući se na, Viresolve™ filtere (Millipore, Billerica, Mass.); Zeta Plus VR™ filtri (CUNO; Meriden, Conn.); i Planova™ filteri (Asahi Kasei Pharma, Planova Division, Buffalo Grove, Ill.).

[0078] U onim primerima izvođenja gde se koristi smanjenje/inaktivacija virusa, smeša uzorka se može prilagoditi, prema potrebi, za dalje korake prečišćavanja. Na primer, posle smanjenja/inaktivacije virusa sa niskim pH, pH smeše uzorka se obično podešava na neutralniju pH, npr., od oko 4,5 do oko 8,5, i uključujući, ali ne ograničavajući se na, oko 4,9, pre nastavka postupka prečišćavanja. Pored toga, smeša se može isprati vodom za injektiranje (VFI) da bi se dobila željena provodljivost.

2

[0079] U određenim primerima izvođenja, primarna izolacija će uključivati jedan ili više koraka centrifugiranja kako bi se dalje razbistrila matrica uzorka i na taj način pomoglo u prečišćavanju anti-IL-13 antitela. Centrifugiranje uzorka se, na primer, može izvesti, ali ne ograničavajući se, na 7000 x g do približno 12,750 x g. U kontekstu prečišćavanja velikih razmera, takvo centrifugiranje može da se odvija zajedno sa protokom podešenim da postigne, na primer, ali ne ograničavanjem, nivo zamućenosti od 150 NTU u rezultujućem supernatantu. Takav supernatant može se zatim sakupiti za dalje prečišćavanje.

[0080] U određenim primerima izvođenja, primarna izolacija će uključivati upotrebu jednog ili više koraka dubinske filtracije da bi se dodatno razbistrila matrica uzorka i na taj način pomoglo u prečišćavanju antitela ovog otkrića. Dubinski filteri sadrže medijume za filtriranje sa profilisanom gustinom. Takva profilisana gustina omogućava da se veće čestice zakače blizu površine filtera, dok manje čestice prodiru u veće otvorene površine na površini filtera, samo da budu zarobljene u manjim otvorima bliže centru filtera. U nekim primerima izvođenja, korak dubinske filtracije može biti korak delipidne dubinske filtracije. Iako određeni primeri izvođenja koriste korake dubinskog filtriranja samo tokom primarne faze izolacije, drugi primeri izvođenja koriste dubinske filtere, uključujući delipidne dubinske filtere, tokom jedne ili više dodatnih faza prečišćavanja. Neograničavajući primeri dubinskih filtera koji se mogu koristiti u kontekstu ovog pronalaska uključuju Cuno™ model 30/60ZA dubinske filtere (3M Corp.) i dvoslojne filter kertridže od 0,45 / 0,2 µm Sartopore ™.

4.3 Afinitetna hromatografija

[0081] U određenim slučajevima, primarni uzorak za izolaciju podvrgnut je afinitetnoj hromatografiji radi daljeg prečišćavanja antitela od interesa od HCP-a. U određenim slučajevima, hromatografski materijal je sposoban da se selektivno ili specifično vezuje za antitelo od interesa. Neograničavajući primeri takvog hromatografskog materijala uključuju: protein A, protein G, hromatografski materijal koji sadrži antigen vezan antitelom od interesa i hromatografski materijal koji sadrži protein koji vezuje Fc. U specifičnim primerima izvođenja, korak afinitetne hromatografije uključuje podvrgavanje primarnog uzorka za izolaciju koloni koja sadrži pogodnu smolu proteina A. Smola proteina A je korisna za afinitetno prečišćavanje i izolovanje različitih izotipova antitela, naročito IgG1, IgG2 i IgG4. Protein A je protein ćelijskog zida bakterije koji se vezuje za IgG sisara prvenstveno preko njegovih Fc regiona. Protein A u svom nativnom stanju ima pet domena vezivanja IgG kao i ostale domene nepoznate funkcije.

2

[0082] Postoji nekoliko komercijalnih izvora za smolu proteina A. Pogodne smole uključuju, ali nisu ograničene na, Mab Select™ iz GE Healthcare i ProSep Ultra Plus™ iz Millipore. Neograničavajući primer pogodne kolone koja je upakovana sa MabSelect™ je kolona prečnika oko 1,0 cm x oko 21,6 cm dužine (~17 mL zapremina sloja). Kolona ove veličine se može koristiti za prečišćavanje manjih razmera i može se uporediti sa drugim kolonama koje se koriste za povećanje razmere prečišćavanja. Na primer, kolona 20 cm x 21 cm čija je zapremina sloja oko 6,6 L može se koristiti za veća prečišćavanja. Bez obzira na kolonu, kolona se može upakovati pomoću pogodne smole, poput MabSelect™ ili ProSep Ultra Plus™.

[0083] U određenim primerima izvođenja biće korisno identifikovati dinamički kapacitet vezivanja (DBC) smole proteina A kako bi se prečišćavanje prilagodilo konkretnom antitelu od interesa. Na primer, ali ne preko ograničenja, DBC MabSelect™ ili ProSept Ultra Plus™ kolona može se odrediti bilo strategijom opterećenja jedne stope protoka ili strategijom opterećenja dvostrukog protoka. Opterećenje stope pojedinačnog protoka može se proceniti na brzini od oko 300 cm/h tokom celog perioda punjenja Strategija opterećenja dvostrukim protokom može se odrediti punjenjem kolone do oko 35 mg proteina/mL smole linearnom brzinom od oko 300 cm/h, zatim smanjujući linearnu brzinu za polovinu kako bi se omogućilo duže vreme zadržavanja za poslednji deo punjenja.

[0084] U nekim primerima izvođenja, kolona Proteina A se može ekvilibrisati sa pogodnim puferom pre nanošenja uzorka. Neograničavajući primer pogodnog pufera je Tris/NaCl pufer, pH oko 7,2. Neograničavajući primer pogodnih ekvilibracionih uslova je 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH oko 7,2. Nakon ove ekvilibracije, uzorak se može naneti na kolonu. Nakon punjenja kolone, kolona se može isprati jednom ili više puta koristeći npr., ekvilibracioni pufer. Pre ispiranja kolone mogu se koristiti i druga ispiranja, uključujući ispiranja gde se koriste različiti puferi. Na primer, kolona se može isprati korišćenjem jedne ili više zapremina kolone od 20 mM limunske kiseline/natrijum-citrata, 0,5 M NaCl na pH od oko 6,0. Ovo ispiranje može opciono da prati jedno ili više ispiranja upotrebom ekvilibracionog pufera. Kolona Proteina A se zatim može eluirati upotrebom odgovarajućeg pufera za eluiranje. Neograničavajući primer pogodnog pufera za eluiranje je pufer sirćetne kiseline/NaCl, pH oko 3,5. Pogodni uslovi su, npr., 0,1 M sirćetna kiselina, pH oko 3,5. Eluat se može pratiti koristeći tehnike dobro poznate stručnjacima iz date oblasti. Na primer, može se pratiti apsorbanca na OD280. Eluat kolone se može sakupiti počevši od početnog skretanja od oko 0,5 AU do očitavanja od oko 0,5 AU na zadnjoj ivici elucionog pika. Eluciona frakcija(e) koje od interesa mogu se zatim pripremiti za dalju obradu. Na primer, sakupljeni uzorak se može

2

titrirati do pH od oko 5,0 upotrebom Tris (npr., 1,0 M) na pH od oko 10. Izborno, ovaj titrirani uzorak može se filtrirati i dalje obrađivati.

4.4 Jono-izmenjivačka hromatografija

[0085] U određenim slučajevima, ovaj pronalazak pruža metode za proizvodnju preparata antitela sa smanjenim HCP iz smeše koja sadrži antitelo i najmanje jedan HCP podvrgavanjem smeše najmanje jednom koraku jono-izmenjivačkog razdvajanja tako da se dobije eluat koji sadrži antitelo. Jono-izmenjivačko razdvajanje uključuje bilo koju metodu kojom se dve supstance razdvajaju na osnovu razlike u njihovim odgovarajućim jonskim naelektrisanjima, i može se upotrebljavati katjonski-izmenjivački materijal ili anjonskiizmenjivački materijal.

[0086] Upotreba katjonskog izmenjivačkog materijala nasuprot anjonskog izmenjivačkog materijala zasniva se na ukupnom naelektrisanju proteina. Stoga je u okviru obima ovog pronalaska upotreba koraka anjonske izmene pre upotrebe koraka katjonske izmene ili koraka katjonske izmene pre upotrebe koraka anjonske izmene. Pored toga, unutar obima ovog otkrića je da se koristi samo korak katjonske izmene, samo korak anjonske izmene ili bilo koja serijska kombinacija ova dva.

[0087] U izvođenju razdvajanja, početna smeša antitela može da se dovede u kontakt sa jonoizmenjivačkim materijalom upotrebom bilo koje od različitih tehnika, npr., upotrebom tehnike šaržnog prečišćavanja ili hromatografske tehnike.

[0088] Na primer, u kontekstu šaržnog prečišćavanja, jono-izmenjivački materijal se priprema u, ili ekvilibriše prema, željenom početnom puferu. Nakon pripreme ili ekvilibracije, dobija se suspenzija jono-izmenjivačkog materijala. Rastvor antitela je doveden u kontakt sa suspenzijom da bi se antitelo koje se razdvaja adsorbovalo za jono-izmenjivački materijal. Rastvor koji sadrži HCP(i) koji se ne vezuju za jono-izmenjivački materijal razdvojen je iz suspenzije, npr., omogućavanjem sa se suspenzija istaloži i uklanjanjem supernatanta. Suspenzija se može podvrgnuti jednom ili više koraka ispiranja. Po želji, suspenzija se može dovesti u kontakt sa rastvorom veće provodljivosti da bi se desorbovali HCP-a koji su se vezali za jono-izmenjivački materijal. Da bi se eluirali vezani polipeptidi, koncentracija soli pufera može se povećati.

[0089] Jono-izmenjivačka hromatografija takođe se može koristiti kao jono-izmenjivačka tehnika razdvajanja. "Jono-izmenjivačka hromatografija razdvaja molekule na osnovu razlika između ukupnog naelektrisanja molekula. Za prečišćavanje antitela, antitelo mora da ima naelektrisanje suprotno onome kod funkcionalne grupe vezane za jono-izmenjivački materijal, npr. smolu, da bi se mogao vezati. Na primer, antitela, koja generalno imaju ukupan pozitivan naboj u pH pufera ispod njegovog pI, dobro će se vezati za katjonski-izmenjivački materijal, koji sadrži negativno naelektrisane funkcionalne grupe.

[0090] U jono-izmenjivačkoj hromatografiji, naelektrisane delove na površini supstance koja se rastvara privlače suprotna naelektrisanja pričvršćeni za hromatografsku matricu, pod uslovom da je jonska snaga okolnog pufera niska. Eluiranje se generalno postiže povećanjem jonske snage (tj. provodljivosti) pufera kako bi on bio u kompeticiji sa supstancom koja se rastvara za naelektrisana mesta jono-izmenjivačke matrice. Promena pH i na taj način promena naelektrisanja supstance koja se rastvara je drugi način da se postigne eluiranje rastvora. Promena provodljivosti ili pH može biti postepena (postepeno ispiranje) ili stepenasta (stepenasto eluiranje).

[0091] Anjonski ili katjonski supstituenti mogu se pričvrstiti za matrice kako bi se formirale anjonske ili katjonske podloge za hromatografiju. Neograničavajući primeri anjonskoizmenjivačkih supstituenata uključuju dietilaminoetil (DEAE), kvaternarnih aminoetil (QAE) i grupe kvaternarnih amina (Q). Katjonski supstituenti uključuju karboksimetil (CM), sulfoetil (SE), sulfopropil (SP), fosfat (P) i sulfonat (S). Celulozne jono-izmenjivačke smole poput DE23™, DE32™, DE52™, CM-23™, CM-32™ i CM-52™ dostupne su iz Whatman Ltd. Poznati su i jonski izmenjivači na bazi Maidstone, Kent, U.K. SEPHADEX® i unakrsno vezani jonski izmenjivači. Na primer, DEAE-, QAE-, CM- i SP-SEPHADEX® i DEAE-, Q-, CM- i S-SLPHAROSE® i SEPHAROSE® Fast FloW su svi dostupni iz Pharmacia AB. Dalje, DEAE i CM su derivatizovali kopolimer etilen glikol-metakrilata, kao što je TOYOPEARL™ DEAE-650S ili M i TOYOPEARL™ CM-650S ili Mare, dostupnih iz Toso Haas Co., Philadelphia, Pa. U određenim primerima izvođenja, anjonsko-izmenjivački korak je postignut upotrebom Pall Mustang Q membranskog kertridža.

[0092] Smeša koja sadrži antitelo i nečistoće, npr. HCP(i), nanosi se na jono-izmenjivačku kolonu, kao što je katjonsko-izmenjivačka kolona. Na primer, ali ne ograničavajući se, smeša se može puniti sa opterećenjem od oko 80 g proteina/L smole, u zavisnosti od korišćene kolone. Primer pogodne katjonsko-izmenjivačke kolone je kolona prečnika 80 cm x 23 cm dužine čija je zapremina sloja oko 116 L. Smeša naneta na ovu katjonsku kolonu može se naknadno isprati puferom za ispiranje (ekvilibracioni pufer). Antitelo se zatim eluira iz kolone i dobija se prvi eluat.

[0093] Ovaj korak jonske izmene olakšava hvatanje antitela od interesa uz smanjivanje nečistoća kao što su HCP. U određenim aspektima, jono-izmenjivačka kolona je katjonskoizmenjivačka kolona. Na primer, ali ne ograničavajući se, pogodna smola za takvu katjonskoizmenjivačku kolonu je CM HyperDF™ smola. Ove smole su dostupne iz komercijalnih

1

izvora, kao što je Pall Corporation. Ovaj postupak izmene katjona može se izvesti na ili oko sobne temperature.

4.5 Ultrafiltracija/Diafiltracija

[0094] Izvesni primeri izvođenja ovog pronalaska koriste korake ultrafiltracije i/ili diafiltracije za dodatno prečišćavanje i koncentrovanje uzorka antitela. Ultrafiltracija je detaljno opisana u: Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications, L. Zeman i A. Zydney (Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1996); i u: Ultrafiltration Handbook, Munir Cheryan (Technomic Publishing, 1986; ISBN br. 87762-456-9). Jedan postupak filtracije je filtracija sa tangencijalnim protokom, kako je opisano u Millipore katalogu pod nazivom „Pharmaceutical Process Filtration Catalogue“ str. 177-202 (Bedford, Mass, 1995/96). Ultrafiltracija se obično smatra filtracijom upotrebom filtera sa veličinom pora manjom od 0,1 µm. Upotrebom filtera sa tako malom veličinom pora, zapremina uzorka se može smanjiti prodiranjem pufera uzorka kroz filter, dok se antitela zadržavaju iza filtera.

[0095] Diafiltracija je metoda upotrebe ultrafiltera za uklanjanje i izmenu soli, šećera i nevodenih rastvarača, za razdvajanje slobodnih od vezanih vrsta, za uklanjanje materijala niske molekulske težine i/ili za izazivanje brze promene jonskih i/ili pH okruženja. Mikrosupstance koje se rastvaraju se uklanjaju najefikasnije dodavanjem rastvarača u rastvor koji se ultrafiltrira brzinom približno jednakoj brzini ultrafiltracije. Ovo ispira mikro-vrste iz rastvora pri konstantnoj zapremini, efikasno prečišćavajući zadržana antitela. U određenim primerima izvođenja ovog pronalaska, korak diafiltracije se koristi za izmenu različitih pufera korišćenih u vezi sa ovim pronalaskom, izborno pre dodatne hromatografije ili drugih koraka prečišćavanja, kao i za uklanjanje nečistoća iz preparata antitela.

4.6 Hromatografije hidrofobne interakcije

[0096] Predmetno otkriće takođe sadrži metode za proizvodnju preparata antitela sa smanjenim HCP iz smeše koja sadrži antitelo i najmanje jedan HCP koji dalje obuhvata korak razdvajanja hidrofobnom interakcijom. Na primer, prvi eluat dobijen iz jono-izmenjivačke kolone može se podvrgnuti materijalu hidrofobne interakcije tako da se dobije drugi eluat sa smanjenim nivoom HCP. Koraci hromatografije hidrofobne interakcije, poput onih ovde opisanih, uglavnom se izvode da bi se uklonili proteinski agregati, kao što su agregati antitela i nečistoće povezane sa postupkom.

2

[0097] Prilikom razdvajanja, smeša uzorka je dovedena u kontakt sa HIC materijalom, npr., korišćenjem tehnike čišćenja šarže ili korišćenjem kolone. Pre HIC prečišćavanja može biti poželjno da se uklone haotropni agensi ili veoma hidrofobne supstance, npr., propuštanjem smeše kroz pred-kolonu.

[0098] Na primer, u kontekstu šaržnog prečišćavanja, HIC materijal je pripremljen u ili ekvilibrisan prema željenom ravnotežnom puferu. Dobija se suspenzija HIC materijala. Rastvor antitela je doveden u kontakt sa suspenzijom da bi se antitelo koje se odvaja adsorbovalo za HIC materijal. Rastvor koji sadrži HCP koji se ne vezuju za HIC materijal odvojen je od suspenzije, npr., omogućavanjem taloženja suspenzije i uklanjanjem supernatanta. Suspenzija se može podvrgnuti jednom ili više koraka ispiranja. Po želji, suspenzija se može dovesti u kontakt sa rastvorom niže provodljivosti da bi se desorbovala antitela koja su se vezala za HIC materijal. Da bi se eluirala vezana antitela, koncentracija soli može biti smanjena.

[0099] Dok se jono-izmenljiva hromatografija oslanja na naelektrisanja antitela radi njihove izolacije, hidrofobna interakciona hromatografija koristi hidrofobna svojstva antitela. Hidrofobne grupe na antitelu interaguju sa hidrofobnim grupama na koloni. Što je hidrofobniji protein je jači i interagovaće sa kolonom. Tako HIC korak uklanja nečistoće poreklom od ćelija domaćina (npr. DNK i druge vrste sa visokim i niskim molekulskim težinama).

[0100] Hidrofobne interakcije su najjače na visokoj jonskoj snazi, pa je ovaj oblik razdvajanja pogodno izveden posle taloženja soli ili jono-izmenjivačkih postupaka. Adsorpciji antitela na HIC kolonu pogoduju visoke koncentracije soli, ali stvarne koncentracije mogu varirati u širokom rasponu u zavisnosti od prirode antitela i posebnog odabranog HIC liganda. Različiti joni mogu biti raspoređeni u takozvanim solufobnim serijama, zavisno od toga da li stimulišu hidrofobne interakcije (efekti isoljavanja) ili narušavaju strukturu vode (haotropni efekat) i dovode do slabljenja hidrofobne interakcije. Katjoni su rangirani prema povećanju efekta isoljavanja kao Ba +; Ca +; Mg +; Li ; Cs ; Na ; K ; Rb ; NH4 , dok anjoni mogu biti rangirani prema povećanju haotropnog efekta kao P0 ---; S04--; CH3CO3 -; Cl-; Br-; NO3-; ClO4-; I-; SCN-.

[0101] Uopšteno, Na, K ili NH4 sulfati efikasno stimulišu interakciju ligand-protein u HIC. Mogu se formirati soli koje utiču na snagu interakcije kako je dato sledećim odnosom: (NH4)2SO4> Na2SO4> NaCl> NH4Cl> NaBr> NaSCN. Generalno, korisne su koncentracije soli između oko 0,75 i oko 2 M amonijum sulfata ili između oko 1 i 4 M NaCl.

[0102] HIC kolone normalno sadrže baznu matricu (npr. unakrsno vezani agarozni ili sintetički kopolimerni materijal) za koju su vezani hidrofobni ligandi (npr. alkil ili aril grupe).

Pogodna kolona HIC sadrži agaroznu smolu supstituisanu fenil grupama (npr., Phenyl Sepharose™ kolona). Mnoge HIC kolone su dostupne na tržištu. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, kolonu brzog toka Phenyl Sepharose™ 6 sa niskom ili visokom supstitucijom (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Švedska); Phenyl Sepharose™ kolona visokog učinka (Pharmacia LKB Biotechnologi, AB, Švedska); Octil Sepharose ™ kolona visokih performansi (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Švedska); Fractogel™ EMD propil ili Fractogel™ EMD fenil kolone (E. Merck, Nemačka); Macro-Prep™ Mehil ili Macro-Prep™ t-Butil nosači (Bio-Rad, Kalifornija); VP HI-Propyl (C3)™ kolona (J. T. Baker, New Jersey); i Toyopearl™ etar, fenil ili butil kolone (TosoHaas, PA).

4.7 Primeri strategija prečišćavanja

[0103] U nekim primerima izvođenja, primarna izolacija se odvija početnom upotrebom centrifugiranja i koraka filtracije radi uklanjanja ćelija i ćelijskih krhotina (uključujući HCP) iz proizvodnog bioreaktora. Na primer, ali bez ograničavanja, kultura koja sadrži antitela, medijum i ćelije mogu biti podvrgnuti centrifugiranju na približno 7000 x g do približno 11000 y g. U određenim primerima izvođenja, rezultirajući supernatant uzorka je zatim propušten kroz filter koji sadrži višestruke dubinske filtere. U određenim primerima izvođenja, filter sadrži oko dvanaest 16-inčnih Cuno™ modela 30/60ZA dubinskih filtera (3M Corp.) i oko tri okrugla kućišta filtera opremljena sa tri 30-inčna 0,45/0,2 µm Sartopore™ 2 filtarska kertridža (Sartorius). Razbistreni supernatant je sakupljen u posudi kao što je prethodno sterilizovana posuda za sakupljanje i održavan na približno 8°C. Ova temperatura je zatim podešena do približno 20°C pre koraka hvatanja hromatografije ili koraka prikazanih dole. Treba napomenuti da stručnjak iz date oblasti tehnike može varirati gore navedene uslove i dalje biti unutar obima predmetnog pronalaska.

[0104] Nakon primarne izolacije će uslediti afinitetna hromatografija uz upotrebu smole proteina A. Postoji nekoliko komercijalnih izvora za smolu proteina A. Jedna pogodna smola je MabSelect™ iz GE Healthcare. Primer pogodne kolone pakovane sa MabSelect™ je kolona prečnika oko 1,0 cm x 21,6 cm dužine (zapremina sloja ~17 ml). Kolona ove veličine se može koristiti kao merna skala. Ovo se može uporediti sa drugim kolonama koje se koriste za povećanje razmere. Na primer, kolona 20 cm x 21 cm čija je zapremina sloja oko 6,6 L može se koristiti za komercijalnu proizvodnju. Bez obzira na kolonu, kolona se može pakovati upotrebom pogodne smole, kao što je MabSelect ™.

[0105] U određenim aspektima, kolona Protein A se može ekvilibrisati pogodnim puferom pre nanošenja uzorka. Primer pogodnog pufera je Tris/NaCl pufer, pH od oko 6 do 8,

4

uključujući, ali ne ograničavajući se na, oko 7,2. Specifičan primer pogodnih uslova je 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,2. Nakon ove ekvilibracije, uzorak se može naneti na kolonu. Nakon punjenja kolone, kolona se može isprati jednom ili više puta upotrebom npr. ekvilibracionog pufera. Pre eluiranja kolone mogu se koristiti i druga ispiranja, uključujući ispiranje koje koristi različite pufere. Na primer, kolona se može isprati upotrebom jedne ili više zapremina kolone od 20 mM limunske kiseline/natrijum-citrata, 0,5 M NaCl na pH od oko 6,0. Ovo ispiranje može izborno da prati jedno ili više ispiranja upotrebom ekvilibracionog pufera. Kolona Proteina A se zatim može eluirati upotrebom odgovarajućeg pufera za eluiranje. Primer pogodnog pufera za eluiranje je pufer sirćetne kiseline/NaCl, pH oko 3,5. Pogodni uslovi su, na primer, 0,1 M sirćetna kiselina, pH 3,5. Eluat se može pratiti koristeći tehnike dobro poznate stručnjacima iz date oblasti tehnike. Na primer, može se pratiti apsorbanca na OD280. Eluat u koloni se može prikupiti počevši od početnog skretanja od oko 0,5 AU do očitavanja od oko 0,5 AU na zadnjem kraju elucionog pika. Eluciona frakcija(e) od interesa može zatim biti pripremljena za dalju obradu. Na primer, sakupljeni uzorak se može titrirati do pH od oko 5,0 koristeći Tris (npr. 1,0 M) na pH od oko 10. Izborno, ovaj titrirani uzorak se može filtrirati i dodatno obrađivati.

[0106] Dinamički kapacitet vezivanja (DBC) MabSelect™ kolone može se odrediti bilo opterećenjem jedne stope protoka ili strategijom opterećenja dvostrukog protoka. Opterećenje jedne stope protoka može se proceniti na brzini od oko 300 cm/sat tokom čitavog perioda punjenja. Strategija opterećenja stopom dvostrukog protoka može se odrediti punjenjem kolone do oko 35 mg proteina/mL smole na linearnoj brzini od oko 300 cm/h, zatim smanjenjem linearne brzine za polovinu kako bi se omogućilo duže vreme zadržavanja za poslednju porciju opterećenja.

[0107] Eluat proteina A eluat se zatim može dalje prečišćavati korišćenjem koraka redukcije/inaktivacije virusa posredovanog preko pH. U određenim slučajevima ovaj korak će uključivati podešavanje pH eluata na između oko 3 i oko 5, uključujući, ali ne ograničavajući se na, oko 3,5, tokom približno 1 sata. Snižavanje pH se može olakšati korišćenjem poznatih kiselih preparata, poput limunske kiseline, npr. 3M limunske kiseline. Izlaganje kiseloj pH smanjuje, ako ne i potpuno eliminiše, virusne kontaminante osetljive na pH i taloži neke medijum/ćelijske kontaminante. Posle ovog koraka redukcije/inaktivacije virusa, pH se podešava na oko 4,9 ili 5,0 koristeći bazu kao što je natrijum hidroksid, npr. 3M natrijum hidroksid, tokom oko dvadeset do četrdeset minuta. Ovo podešavanje se može dogoditi na oko 20°C.

[0108] U određenim primerima izvođenja kultura sa podešenom pH se dalje prečišćava korišćenjem anjonsko-izmenjivačke kolone. Neograničavajući primer pogodne kolone za ovaj korak je kolona prečnika 60 cm x 30 cm dužine čija je zapremina sloja oko 85 L. Kolona je pakovana sa anjonsko-izmenjivačkom smolom, kao što je Q Sepharose™ Fast Flow iz GE Healthcare. Kolona se može ekvilibrisati korišćenjem oko sedam zapremina kolone odgovarajućeg pufera kao što je Tris/natrijum hlorid. Primer pogodnih uslova je 25 mM Tris, 50 mM natrijum hlorid na pH 8.0. Iskusan stručnjak može da varira uslove, ali još uvek je unutar obima predmetnog pronalaska. Kolona je napunjena sakupljenim uzorkom iz koraka pročišćavanja Proteina A iz navedenog u prethodnom tekstu. U sledećem aspektu, kolona se puni iz eluata sakupljenog tokom katjonske izmene. Nakon punjenja kolone, kolona se ispira ekvilibracionim puferom (npr. Tris/natrijum-hloridni pufer). Protok koji sadrži antitela može se pratiti korišćenjem UV spektrofotometra na OD280nm. Ovaj korak anjonske izmene smanjuje nečistoće povezane sa postupcima kao što su nukleinske kiseline poput DNK i proteini ćelija domaćina. Razdvajanje se dešava zbog činjenice da antitela od interesa ne interaguju sa niti se vezuju za čvrstu fazu kolone, npr. za Q Sepharose™, ali mnoge nečistoće interaguju sa i vezuju se za čvrstu fazu kolone. Anjonska izmena se može izvesti na oko 12°C.

[0109] U određenim slučajevima, kultura sa podešenom pH zatim je dodatno prečišćena korišćenjem katjonsko izmenjivačke kolone. U određenim slučajevima, ekvilibracioni pufer korišćen u katjonsko izmenjivačkoj koloni je pufer koji ima pH od oko 5,0. Primer pogodnog pufera je oko 210 mM natrijum acetata, pH 5,0. Nakon ekvilibracije, kolona se puni uzorkom pripremljenim iz gornjeg koraka primarne izolacije. Kolona je pakovana sa katjonsko izmenjivačkom smolom, kao što je CM Sepharose™ Fast Flow iz GE Healthcare. Kolona se zatim ispira upotrebom ekvilibracionog pufera. Zatim se kolona podvrgava koraku eluiranja koristeći pufer sa većom jonskom snagom u poređenju sa puferom za ekvilibraciju ili ispiranje. Na primer, pogodan pufer za eluiranje može biti oko 790 mM natrijum acetata, pH 5,0. Antitela će se eluirati i mogu se pratiti korišćenjem UV spektrofotometra postavljenog na OD280nm. U posebnom primeru, sakupljanje tokom eluiranja može biti od 3 OD280nm do 8 OD280nm. Treba da se razume da stručnjak u ovoj oblasti može da menja uslove i da ipak ostaje unutar obima otkrića.

[0110] U određenim slučajevima, kultura sa podešenim pH, katjonsko izmenjivački eluat ili anjonsko izmenjivački eluat se filtrira koristeći npr. 16-inčni Cuno™ delipidni filter. Ova filtracija, upotrebom delipidnog filtera, može pratiti pomoću, na primer, 30-inčnog 0,45 / 0,2 µm Sartopore ™ dvoslojnog filter kertridža. Jono-izmenjivački elucioni pufer može se koristiti za ispiranje preostale zapremine preostale u filterima i pripremljen je za ultrafiltraciju/diafiltraciju.

[0111] Da bi se postigao korak ultratfiltracije/diafiltracije, filtracioni medijum se priprema u pogodnom puferu, npr., 20 mM natrijum-fosfatu, pH 7,0. So kao što je natrijum-hlorid se može dodati da ni se povećala jonska snaga, npr., 100 mM natrijum hlorid. Ovaj korak ultrafiltracije/diafiltracije služi za koncentrovanje anti-IL-13 antitela, uklanjanje natrijum acetata i podešavanje pH. Dostupni su komercijalni filteri koji omogućuju ovaj korak. Na primer, Millipore proizvodi celuloznu ultrafiltracionu membransku kasetu sa pragom molekulske težine od 30 kD (MVCO). Ovaj postupak filtracije može se izvesti na ili oko sobne temperature.

[0112] U određenim primerima izvođenja, uzorak iz gornjeg koraka „capture“ filtracije podvrgnut je drugom koraku jono-izmenjivačkog razdvajanja. Ovo drugo jono-izmenjivačko razdvajanje će, u određenim primerima izvođenja, uključivati razdvajanje zasnovano na suprotnom naelektrisanju od prvog jono-izmenjivačkog razdvajanja. Na primer, ako se primenjuje korak anjonske izmene posle primarne izolacije, drugi korak jono-izmenjivačke hromatografije razmene jona može biti korak katjonske izmene. Suprotno tome, ako je primarni korak izolacije praćen korakom katjonske izmene, nakon tog koraka usledio bi korak anjonske izmene. U određenim primerima izvođenja, prvi jono-izmenjivački eluat se može podvrgnuti direktno drugom koraku jono-izmenjivačke hromatografije gde je prvi jonoizmenjivački eluat podešen prema odgovarajućim uslovima pufera. Pogodni anjonski i katjonski materijali i uslovi za razdvajanje opisani su gore.

[0113] Uzorak koji sadrži antitela biće dalje obrađen korišćenjem koraka razdvajanja hidrofobne interakcije. Neograničavajući primer pogodne kolone za takav korak je kolona prečnika 80 cm x 15 cm dužine, čija je zapremina sloja oko 75 L, koja je pakovana sa odgovarajućom smolom koja se koristi za HIC, kao što je, ali nije ograničeno na, Phenyl HP Sepharose™ iz Amersham Biosciences, Upsala, Švedska. Protočni preparat koji je dobijen iz prethodnog koraka anjonske izmenjivačke hromatografije koji sadrži antitela koja su od interesa može se razblažiti jednakom zapreminom od oko 1,7 M amonijum sulfata, 50 mM natrijum fosfata, pH 7,0. Zatim se može podvrgnuti filtraciji korišćenjem dvoslojnog filtera od 0,45/0,2 µM Sartopore™ 2, ili njegovog ekvivalenta. U određenim primerima izvođenja, postupak hidrofobne hromatografije uključuje dva ili više ciklusa.

[0114] U određenim primerima izvođenja, HIC kolona se prvo ekvilibriše korišćenjem pogodnog pufera. Neograničavajući primer pogodnog pufera je 0,85 M amonijum sulfat, 50 mM natrijum fosfat, pH 7,0. Stručnjak u ovoj oblasti može da varira ekvilibracioni pufer i da i dalje bude unutar obima predmetnog pronalaska promenom koncentracija puferujućih sredstava i/ili supstitucijom ekvivalentnih pufera. U određenim primerima izvođenja kolona je zatim napunjena anjonsko-izmenjivačkim uzorkom protoka i isprana više puta, npr. tri puta, odgovarajućim puferskim sistemom, kao što je amonijum sulfat/natrijum fosfat. Primer pogodnog puferujućeg sistema uključuje 1,1 M amonijum sulfat, 50 mM natrijum fosfatni pufer sa pH oko 7,0. Po izboru, kolona se može podvrgnuti dodatnim ciklusima ispiranja. Na primer, drugi ciklus ispiranja može obuhvatati višestruko ispiranje kolone, npr. jedan do sedam puta, upotrebom odgovarajućeg puferskog sistema. Neograničavajući primer pogodnog puferskog sistema uključuje 0,85 M amonijum sulfat, 50 mM natrijum fosfat, pH 7,0. U jednom aspektu, napunjena kolona se podvrgava trećem ispiranju koristeći odgovarajući puferski sistem. Kolona se može isprati više puta, npr., jedan do tri puta, korišćenjem puferskog sistema kao što je 1,1 M amonijum sulfat, 50 mM natrijum fosfat na pH oko 7,0. Opet, stručnjak iz date oblasti tehnike može da varira puferujuće uslove i dalje bude unutar obima ovog pronalaska.

[0115] Kolona se eluira upotrebom odgovarajućeg pufera za eluiranje. Pogodan primer takvog pufera za eluiranje je 0,5 M amonijum sulfat, 15 mM natrijum fosfat na pH oko 7,0. Antitela od interesa se mogu detektovati i sakupiti korišćenjem konvencionalnog spektrofotometra od gornje strane na 3 OD280nm do donjeg dela pika na 3 OD280nm.

[0116] U određenim aspektima pronalaska, eluat iz koraka hidrofobne hromatografije podvrgnut je filtraciji radi uklanjanja virusnih čestica, uključujući intaktne viruse, ako su prisutni. Neograničavajući primer pogodnog filtera je Ultipor DV50™ filter iz Pall Corporation. Ostali virusni filteri se mogu koristiti u ovom koraku filtracije i dobro su poznati stručnjacima iz ove oblasti tehnike. HIC eluat je propušten kroz prethodno ovlaženi filter od oko 0,1 µm i 2 x 30-inčni Ultipor DV50™ filter na oko 34 psig. U određenim primerima izvođenja, nakon postupka filtracije, filter je ispran upotrebom, npr., HIC pufer za eluiranje kako bi se uklonila sva antitela zadržana u kućištu filtera. Filtrat se može čuvati u prethodno sterilizovanom spremniku na oko 12°C.

[0117] U određenim primerima izvođenja, filtrat iz gornjeg teksta se ponovo podvrgava ultrafiltraciji/diafiltraciji; Ovaj korak je važan ako je krajnja tačka praktičara upotreba antitela u, npr., farmaceutskoj formulaciji. Ovaj postupak, ako se koristi, može olakšati koncentrovanje antitela, uklanjanje prethodno korišćenih puferskih soli i zameniti ga posebnim puferom za formulaciju. U određenim primerima izvođenja, vrši se kontinuirana diafiltracija sa višestrukim zapreminama, npr., dve zapremine pufera za formulaciju. Neograničavajući primer pogodnog pufera za formulaciju je 5 mM metionin, 2% manitol, 0,5% saharoze, pufer sa pH 5,9 (bez Tween). Po završetku ove izmene diazapremina, antitela se koncentruju. Kada je postignuta unapred određena koncentracija antitela, lekar može izračunati količinu 10% Tween koju treba dodati da bi se dostigla konačna koncentracija Tween od oko 0,005% (zapr./zapr.).

[0118] Određeni primeri izvođenja ovog pronalaska će uključivati dodatne korake prečišćavanja. Primeri dodatnih postupaka prečišćavanja koji se mogu izvesti pre, tokom ili posle metode jono-izmenjivačke hromatografije, uključuju taloženje etanolom, izoelektrično fokusiranje, reverzno-faznu HPLC, hromatografiju na silicijum dioksidu, hromatografiju na heparinu Sepharose™, dodatnu anjonsko-izmenjivačku hromatografiju i/ili dodatnu katjonsko-izmenjivačku hromatografiju, hromatofokusiranje, SDS-PAGE, taloženje amonijum sulfatom, hidroksilapatitnu hromatografiju, gel elektroforezu, dijalizu i afinitetnu hromatografiju (npr. korišćenjem proteina G, antitela, specifičnog supstrata, liganda ili antigena kao reagensa za hvatanje).

[0119] U određenim slučajevima ovog otkrića, anti-IL-13 antitelo je antitelo IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ili IgM izotipa koje sadrži sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca navedene na slici1. U određenim slučajevima, anti-IL-13 antitelo je antitelo IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 izotipa koje sadrži sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca navedene na slici 1.

5. Metode analize čistoće uzorka

5.1 Analiza proteina ćelije domaćina

[0120] Ovo otkriće takođe pruža metode za određivanje zaostalih nivoa koncentracije proteina ćelije domaćina (HCP) u kompoziciji izolovanog/prečišćenog antitela. Kao što je gore opisano, HCP su poželjno isključeni iz krajnjeg proizvoda ciljne supstance, npr., anti-IL-13 antitelo. Primeri HCP uključuju proteine koji potiču iz izvora proizvodnje antitela. Neuspeh u identifikaciji i dovoljnom uklanjanju HCP iz ciljnog antitela, može dovesti do smanjene efikasnosti i/ili neželjenih reakcija subjekta.

[0121] Kao što je ovde korišćen, termin "HCP ELISA" odnosi se na ELISA gde je drugo antitelo korišćeno u analizi specifično za HCP proizvedene iz ćelija, npr. CHO ćelija, korišćenih za generisanje antitela (npr., anti-IL-13 antitelo). Drugo antitelo se može proizvesti u skladu sa konvencionalnim postupcima poznatim stručnjacima iz date oblasti tehnike. Na primer, drugo antitelo se može proizvesti korišćenjem HCP dobijenih lažnom proizvodnjom i prečišćavanjem, tj. koristi se ista ćelijska linija koja se koristi za proizvodnju antitela od interesa, ali ćelijska linija nije transficirana sa DNK antitela. U ilustrativnom primeru, drugo antitelo se proizvodi pomoću HPC sličnih onima eksprimiranim u sistemu ćelijske ekspresije po izboru, tj. sistemu ćelijske ekspresije koji se koristi za proizvodnju ciljnog antitela.

[0122] Generalno, HCP ELISA sadrži postavljanje u „sendvič“ tečnog uzorka koji sadrži HCP između dva sloja antitela, tj. prvo antitelo i drugo antitelo. Uzorak je inkubiran tokom kog vremena, HCP u uzorku je uhvaćen prvim antitelom, na primer, ali nije ograničeno na kozje anti-CHO, afinitetno prečišćeno (Cygnus). Dodato je obeleženo drugo antitelo ili mešavina antitela, specifičnih za HCP proizvedenih iz ćelija korišćenih za generisanje antitela, npr., biotinilovano anti-CHO HCP, i vezuje se za HCP unutar uzorka. U određenim slučajevima, prvo i drugo antitelo su poliklonska antitela. U određenim aspektima, prvo i drugo antitelo su mešavine poliklonskih antitela pripremljena protiv HCP, na primer, ali ne ograničavajući se na smešu biotinilovanog kozjeg antitela protiv proteina ćelije domaćina 599/626/748. Količina HCP sadržana u uzorku određuje se korišćenjem odgovarajućeg testa baziranog na obeleživaču drugog antitela.

[0123] HCP ELISA se može koristiti za određivanje nivoa HCP u kompoziciji antitela, kao što je eluat ili protok dobijen korišćenjem gore opisanog postupka. Predmetno otkriće takođe pruža kompoziciju koja sadrži antitelo, pri čemu kompozicija nema detektabilni nivo HCP kao što je utvrđeno enzimskog HCP testa ("ELISA").

5.2 Analiza afinitetnog hromatografskog materijala

[0124] U određenim slučajevima, ovo otkriće takođe pruža metode za određivanje preostalih nivoa afinitetnog hromatografskog materijala u kompoziciji izolovanog/prečišćenog antitela. U određenim kontekstima, takav materijal curi u kompoziciju antitela tokom postupka prečišćavanja. U određenim slučajevima koristi se analiza za identifikaciju koncentracije proteina A u kompoziciji izolovanog/prečišćenog antitela. Kao što je ovde korišćen, termin "protein A ELISA" označava ELISA gde je drugo antitelo korišćeno u analizi specifično za protein A koji se koristi za prečišćavanje antitela od interesa, npr., anti-IL-13 antitelo. Drugo antitelo se može proizvesti u skladu sa konvencionalnim postupcima poznatim stručnjacima iz date oblasti tehnike. Na primer, drugo antitelo se može proizvesti upotrebom prirodnog ili rekombinantnog proteina A u kontekstu konvencionalnih metoda za generisanje i proizvodnju antitela.

[0125] Generalno, protein A ELISA obuhvata postavljanje u „sendvič“ tečnog uzorka koji sadrži protein A (ili moguće sadrži protein A) između dva sloja antitela protiv proteina A, tj. prvo antitelo protiv proteina A i drugo antitelo protiv proteina A. Uzorak je izložen prvom sloju antitela protiv proteina A, na primer, ali nije ograničeno na poliklonska antitela ili mešavine poliklonskih antitela, i inkubira se dovoljno vremena da protein A u uzorku bude zarobljen prvim antitelom. Zatim je dodato obeleženo drugo antitelo, na primer, ali bez ograničenja na poliklonska antitela ili mešavine poliklonskih antitela, specifično za protein A i vezuje se za zarobljeni protein A u uzorku. Dodatni neograničavajući primeri antitela protiv proteina A korisni u kontekstu ovog otkrića uključuju pileći anti-protein A i biotinilovana

4

antitela protiv proteina A. Količina proteina A sadržana u uzorku određuje se korišćenjem odgovarajućeg testa na bazi obeleživača drugog antitela. Slične analize se mogu koristiti za identifikaciju koncentracije alternativnih afinitetnih hromatografskih materijala.

[0126] Protein A ELISA se može koristiti za određivanje nivoa proteina A u kompoziciji antitela, kao što je eluat ili protok dobijen dobijenim korišćenjem gore opisanog postupka. Predmetno otkriće takođe obezbeđuje kompoziciju koja sadrži antitelo, pri čemu kompozicija nema detektabilan nivo proteina A kao što je određeno pomoću enzimskog testa proteina A ("ELISA").

6. Dodatne modifikacije

[0127] Antitela ovog otkrića mogu da se modifikuju. U nekim slučajevima, antitela ili njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen hemijski su modifikovani da bi se dobio željeni efekat. Na primer, pegilacija antitela ili fragmenata antitela iz otkrića može se izvesti bilo kojom od reakcija pegilacije poznatih u struci, kao što je opisano, npr., u sledećim referencama: Focus on Growth Factors 3: 4-10 (1992); EP 0 154316; i EP 0 401 384. U jednom aspektu, pegilacija se izvodi reakcijom acilacije ili reakcijom alkilacije sa reaktivnim molekulom polietilen glikola (ili analognim reaktivnim polimerom rastvorljivim u vodi). Pogodan polimer rastvorljiv u vodi za pegilacija antitela i fragmenata antitela iz otkrića je polietilen glikol (PEG). Kao što se ovde koristi, „polietilen glikol“ podrazumeva da obuhvata bilo koji oblik PEG-a koji je korišćen za derivatizaciju drugih proteina, kao što je mono (Cl-ClO) alkoksi- ili ariloksi-polietilen glikol.

[0128] Postupci za pripremu pegilovanih antitela i fragmenata antitela iz otkrića će obično sadržati korake (a) reakcije antitela ili fragmenta antitela sa polietilen glikolom, kao što je reaktivni estar ili derivat aldehida PEG, pod pogodnim uslovima pri čemu antitelo ili fragment antitela se vezuje za jednu ili više PEG grupa i (b) dobijanja proizvoda reakcije. Stručnjaku iz date oblasti tehnike će biti očigledno da odabere optimalne reakcione uslove ili reakcije acilacije na osnovu poznatih parametara i željenog rezultata.

[0129] Pegilovana antitela i fragmenti antitela specifični za IL-13 mogu se generalno koristiti za lečenje poremećaja povezanih sa IL-13 prema otkriću primenom anti-IL-13 antitela i fragmenata antitela opisanih ovde. Generalno, pegilovana antitela i fragmenti antitela su povećali poluživot u poređenju sa nepegilovanim antitelima i fragmentima antitela. Pegilovana antitela i fragmenti antitela mogu se koristiti pojedinačno, zajedno ili u kombinaciji sa drugim farmaceutskim kompozicijama.

[0130] Antitelo ili deo antitela iz otkrića može se derivatizovati ili povezati sa drugim funkcionalnim molekulom (npr., drugim peptidom ili proteinom). Shodno tome, antitela i delovi antitela iz otkrića obuhvataju derivatizovane i na drugi način modifikovane oblike humanih anti-hIL-13 antitela koja su ovde opisana, uključujući imunoadhezione molekule. Na primer, antitelo ili deo antitela iz otkrića može biti funkcionalno vezano (hemijskim povezivanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnom vezom ili na neki drugi način) sa jednim ili više drugih molekularnih entiteta, kao što je drugo antitelo (npr., bispecifično antitelo ili diatelo), detektabilni agens, citotoksično sredstvo, farmaceutsko sredstvo i/ili protein ili peptid koji mogu da posreduju u vezivanju antitela ili dela antitela sa drugim molekulom (kao što je region jezgra streptavidina ili polihistidinski obeleživač).

[0131] Jedan tip derivatizovanog antitela se proizvodi unakrsnim vezivanjem dva ili više antitela (istog tipa ili različitih tipova, npr., radi stvaranja bispecifičnih antitela). Pogodna unakrsno vezujuća sredstva obuhvataju ona koja su heterobifunkcionalna, koja su dve izrazito reaktivne grupe razdvojene odgovarajućim spejserom (npr. M-maleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimidni estar) ili homobifunkcionalnim (npr. disukcinimidil suberat). Takva vezujuća sredstva su dostupna iz Pierce Chemical Company, Rockford, IL.

[0132] Korisni detektabilni agensi sa kojima se mogu derivatizovati antitelo ili deo antitela iz otkrića uključuju fluorescentna jedinjenja. Primeri fluorescentnih detektabilnih sredstava uključuju fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, 5-dimetilamin-1-naftalensulfonil hlorid, fikoetrinin i slično. Antitelo se takođe može derivatizovati sa detektabilnim enzimima, kao što su alkalna fosfataza, peroksidaza rena, glukoza oksidaza i slično. Kada se antitelo derivatizuje sa detektabilnim enzimom, ono se detektuje dodavanjem dodatnih reagensa koje enzim koristi za proizvodnju detektabilnog reakcionog proizvoda. Na primer, kada je prisutno detektabilno sredstvo renova peroksidaza, dodavanje vodonik peroksida i diaminobenzidina dovodi do obojenog proizvoda reakcije, koji je detektabilan. Antitelo se takođe može derivatizovati biotinom i detektovati indirektnim merenjem vezivanja avidina ili streptavidina.

7. Farmaceutske kompozicije

[0133] Antitela i delovi antitela iz otkrića mogu se ugraditi u farmaceutske kompozicije pogodne za primenu na subjekta. Tipično, farmaceutska kompozicija sadrži deo antitela ili deo antitela iz otkrića i farmaceutski prihvatljiv nosač. Kao što je ovde korišćen, "farmaceutski prihvatljiv nosač" uključuje bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, omotače, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonične agense i sredstva za odlaganje apsorpcije i slično, koji su fiziološki kompatibilni. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača uključuju jedan ili više od vode, fiziološkog rastvora, fosfatno puferisanog fiziološkog rastvora, dekstroze, glicerola, etanola i slično, kao i njihove kombinacije. U mnogim slučajevima je poželjno da se u kompoziciju uključe izotonična sredstva, npr. šećeri, polialkoholi poput manitola, sorbitola ili natrijum hlorida. Farmaceutski prihvatljivi nosači mogu dalje da sadrže manje količine pomoćnih supstanci kao što su ovlaživači ili emulgatori, konzervansi ili puferi koji povećavaju rok trajanja ili efikasnost dela antitela ili dela antitela.

[0134] Antitela i delovi antitela iz otkrića mogu se ugraditi u farmaceutsku kompoziciju pogodnu za parenteralnu primenu. Antitelo ili delovi antitela mogu se pripremiti kao rastvor za injektiranje koji sadrži, na primer, 0,1-250 mg/mL antitela. Rastvor za injektiranje može biti sastavljen od tečnog ili liofilizovanog oblika doze u bočici od kremena ili ćilibara, ampuli ili prethodno napunjenom špricu. Pufer može biti L-histidin približno 1-50 mM, (optimalno 5-10 mM), na pH 5,0 do 7,0 (optimalno pH 6,0). Ostali pogodni puferi uključuju, ali nisu ograničeni na natrijum sukcinat, natrijum citrat, natrijum fosfat ili kalijum fosfat. Natrijum hlorid se može koristiti za modifikovanje toksičnosti rastvora u koncentraciji od 0-300 mM (optimalno 150 mM za tečni oblik doze). Krioprotektanti se mogu uključiti za liofilizovani oblik doze, uglavnom 0-10% saharoze (optimalno 0,5-1,0%). Ostali pogodni krioprotektanti uključuju trehalozu i laktozu. Sredstva za povećanje mase mogu da se uključe za liofilizovani oblik doze, uglavnom 1-10% manitola (optimalno 24%). Stabilizatori se mogu koristiti u tečnim i liofilizovanim oblicima doze, uglavnom 1-50 mM L-metionin (optimalno 5-10 mM). Ostala pogodna sredstva za povećanje mase uključuju glicin, arginin, i mogu biti uključena kao 0-0.05% polisorbat-80 (optimalno 0.005-0.01%). Dodatni surfaktanti uključuju, ali nisu ograničeni na polisorbat 20 i BRIJ surfaktante.

[0135] U jednom aspektu, farmaceutska kompozicija uključuje antitelo u dozi od oko 0,01 mg/kg-10 mg/kg. U drugom aspektu, doze antitela obuhvataju oko 1 mg/kg primenjene svake druge nedelje ili približno 0,3 mg/kg primenjeno nedeljno. Kvalifikovan lekar može utvrditi odgovarajuću dozu i režim primene na subjekta.

[0136] Kompozicije ovog otkrića mogu biti u različitim oblicima. Oni uključuju, na primer, tečne, polučvrste i čvrste oblike doze, kao što su tečni rastvori (npr., rastvori za injektiranje i infuziju), disperzije ili suspenzije, tablete, pilule, praškovi, lipozomi i supozitorije. Oblik zavisi od, npr., planiranog načina primene i terapijske primene. Tipične kompozicije su u obliku injekcionih ili infuzijskih rastvora, kao što su kompozicije slične onima koje se koriste za pasivnu imunizaciju ljudi drugim antitelima. Jedan način primene je parenteralni (npr. intravenski, subkutani, intraperitonealni, intramuskularni). U jednom aspektu, antitelo se primenjuje intravenskom infuzijom ili injekcijom. U drugom aspektu, antitelo se primenjuje intramuskularnom ili subkutanom injekcijom.

4

[0137] Terapeutske kompozicije obično moraju biti sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija se može formulisati kao rastvor, mikroemulzija, disperzija, lipozom ili druga naručena struktura pogodna visokoj koncentraciji leka. Sterilni rastvori za injektiranje mogu se pripremiti ugradnjom aktivnog jedinjenja (tj. antitela ili dela antitela) u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvaraču sa jednim ili kombinacijom prethodno nabrojanih sastojaka, prema potrebi, a zatim filtriranom sterilizacijom. Uopšteno, disperzije se pripremaju ugradnjom aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži osnovni disperzni medijum i ostale potrebne sastojke od gore nabrojanih. U slučaju sterilnih, liofilizovanih prahova za pripremu sterilnih rastvora za injektiranje, postupci pripreme su vakuumsko sušenje i sušenje raspršivanjem, što proizvodi prašak aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilnog filtriranog rastvora. Odgovarajuća fluidnost rastvora može se održavati, npr., upotrebom omotača kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija može se postići uključivanjem u kompoziciju sredstva koja odlaže apsorpciju, npr., monostearatnih soli i želatina.

[0138] Antitela i delovi antitela ovog otkrića mogu se primeniti različitim postupcima poznatim u struci, jedan put/način primene je potkožna injekcija, intravenska injekcija ili infuzija. Kao što će znati stručnjak, put i/ili način primene će varirati u zavisnosti od željenih rezultata. U određenim slučajevima, aktivno jedinjenje može da se pripremi sa nosačem koji će štititi jedinjenje od brzog oslobađanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante, transdermalne flastere i mikrokapsulirane sisteme za isporuku. Biorazgradivi, biokompatibilni polimeri se mogu koristiti, kao što su etilen vinil acetat, polihidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoesteri i polimlečna kiselina. Mnogi postupci za pripremu takvih formulacija su patentirani ili su opšte poznati stručnjacima iz ove oblasti tehnike. Videti, npr., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[0139] U određenim aspektima, antitelo ili deo antitela iz otkrića može se oralno primenjivati, npr., sa inertnim razblaživačem ili asimilirajućim jestivim nosačem. Jedinjenje (i drugi sastojci, po želji) takođe se može zatvoriti u tvrdu ili mekanu želatinsku kapsulu, presovati u tablete ili direktno ugraditi u hranu subjekta. Za oralnu terapijsku primenu, jedinjenja se mogu ugraditi sa ekscipijensima i koristiti u obliku tableta za gutanje, bukalnih tableta, pastila, kapsula, eliksira, suspenzija, sirupa, vafli i slično. Za primenu jedinjenja iz otkrića drugačijom primenom od parenteralne, možda će biti neophodno da se jedinjenje obloži sa ili da se jedinjenje ko-primenjuje sa materijalom za sprečavanje njegove inaktivacije da bi se sprečila njegova inaktivacija.

[0140] Dopunska aktivna jedinjenja se takođe mogu ugraditi u kompozicije. U određenim aspektima, antitelo ili deo antitela iz ovog otkrića je ko-formulisano sa i/ili ko-primenjuje sa jednim ili više dodatnih terapeutskih sredstava koja su korisna za lečenje poremećaja u kojima je aktivnost IL-13 štetna. Na primer, anti-hIL-13 antitelo ili deo antitela iz otkrića može biti ko-formulisan i/ili ko-primenjivan sa jednim ili više dodatnih antitela koja vezuju druga ciljna mesta (npr., antitela koja vezuju druge citokine ili koja vezuju molekule na ćelijskoj površini). Pored toga, jedno ili više antitela iz otkrića mogu se koristiti u kombinaciji sa dva ili više prethodno navedenih terapeutskih sredstava. Takve kombinovane terapije mogu pogodno koristiti niže doze primenjenih terapijskih sredstava, čime se izbegavaju moguće toksičnosti ili komplikacije povezane sa različitim monoterapijama. Iskusni stručnjak iz date oblasti će razumeti da kada se antitela iz otkrića koriste kao deo kombinovane terapije, može da bude poželjna niža doza antitela nego kada se antitelo pojedinačno primenjuje na subjekta (npr., sinergistički terapeutski efekat može se postići korišćenjem kombinovane terapije koja zauzvrat dozvoljava upotrebu niže doze antitela da bi se postigao željeni terapeutski efekat).

[0141] Treba da se razume da antitela ovog otkrića ili njihov deo koji se veže za antigen mogu da se koriste pojedinačno ili u kombinaciji sa dodatnim sredstvom, npr., terapeutskim sredstvom, pri čemu je navedeno dodatno sredstvo izabrao stručnjak iz date oblasti tehnike zbog njegove namene. Na primer, dodatno sredstvo može biti terapeutsko sredstvo poznato kao korisno u lečenju bolesti ili stanja koje se leči antitelom ovog otkrića. Dodatno sredstvo takođe može biti sredstvo koje daje korisnu osobinu terapeutskoj kompoziciji, npr., sredstvo koje utiče na viskozitet kompozicije.

[0142] Dalje bi trebalo razumeti da su kombinacije koje će se uključiti u ovo otkriće kombinacije korisne za njihovu nameravanu svrhu. Sredstva navedena u daljem tekstu su ilustrativna i nisu namenjena da budu ograničavajuća. Kombinacije koje su deo ovog otkrića mogu biti antitela ovog otkrića i najmanje jedno dodatno sredstvo izabrano iz donjih lista. Kombinacija takođe može da sadrži više od jednog dodatnog sredstva, npr. dva ili tri dodatna sredstva ako je kombinacija takva da formirana kompozicija može obavljati predviđenu funkciju.

[0143] Neke kombinacije su nesteroidni anti-inflamatorni lek(ovi) koji se takođe označeni kao NSAIDS i uključuju lekove poput ibuprofena. Ostale kombinacije su kortikosteroidi uključujući prednizolon; dobro poznati sporedni efekti upotrebe steroida mogu se smanjiti ili čak eliminisati smanjenjem doze steroida koja je potrebna prilikom lečenja pacijenata u kombinaciji sa antitelima ovog otkrića. Neograničavajući primeri terapeutskih sredstava za reumatoidni artritis sa kojima se antitelo ili deo antitela iz otkrića može kombinovati tako da obuhvata sledeće: citokinske supresivne anti-inflamatorne lek(ove) (CSAID); antitela za ili

4

antagoniste drugih humanih citokina ili faktora rasta, na primer, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18 , EMAP-II, GM-CSF, FGF i PDGF. Antitela iz otkrića, ili njihovi delovi koji se vezuju za antigen, mogu se kombinovati sa antitelima za molekule na ćelijskoj površini kao što su CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90 ili njihove ligande, uključujući CD 154 (gp39 ili CD40L).

[0144] Neke kombinacije terapeutskih sredstava mogu da interferirati na različitim tačkama u autoimunoj i kasnijoj inflamatornoj kaskadi; primeri uključuju antagoniste TNF poput himernih, humanizovanih ili humanih TNF antitela, D2E7, (američka prijava Ser. br.

08/599,226, podneta 9.2.1996., cA2 (Remicade™), CDP 571, fragmenti anti-TNF antitela (npr., CDP870) i rastvorljivi p55 ili p75 TNF receptori, njihovi derivati, (p75TNFRIgG (Enbrel™) ili p55TNFR1gG (Lenercept), rastvorljivi IL-13 receptor (sIL-13), a takođe i inhibitori TNFα konvertujućeg enzima (TACE); slično inhibitori IL-1 (npr., inhibitori enzima koji konvertuju interleukin-1, kao što je Vx740 ili IL-1RA itd.) mogu biti efikasni iz istog razloga. Ostale kombinacije uključuju Interleukin 11, anti-P7s i p-selektinski glikoprotein ligand (PSGL). Ipak, druge kombinacije obuhvataju druge ključne igrače autoimunog odgovora koji mogu da deluju paralelno sa, u zavisnosti od ili u skladu sa funkcijom IL-13. Još jedna kombinacija uključuje ne-depletirajuće inhibitore anti-CD4. Dodatne kombinacije uključuju antagoniste ko-stimulatornog puta CD80 (B7.1) ili CD86 (B7.2) uključujući antitela, rastvorljive receptore ili antagonističke ligande.

[0145] Antitela ovog otkrića ili njihovi delovi koji vezuju antigen mogu se takođe kombinovati sa sredstvima, kao što su metotreksat, 6-MP, azatioprin sulfazalazin, mesalazin, olsalazin hlorokinin/hidroksihlorokin, pencilalamin, aurotiomalat (intramuskularni i oralni), azatioprin, kohicin, kortikosteroidi (oralni, inhalirani i lokalna injekcija), agonisti adrenoreceptora β-2 (salbutamol, terbutalin, salmeteral), ksantini (teofilin, aminofilin), kromoglikat, nedokromil, ketotifen, ipratropijum i oksitropijum, cikloporin, FK506, rapamicin, mikofenolat mofetil, leflunomid, NSAID, na primer, ibuprofen, kortikosteroidi kao što je prednizolon, inhibitori fosfodiesteraze, agonisti adenozina, antitrombotička sredstva, inhibitori komplementa, adrenergička sredstva, sredstva koja ometaju prenos signala preko proinflamatornih citokina kao što je TNFα ili IL-1 (npr., IRAK, NIK, IKK, p38 ili inhibitori MAP kinaze), inhibitor IL-1β konvertujućeg enzima (npr., Vx740), anti-P7s, p-selektin glikoprotein ligand (PSGL), inhibitori TNFα konvertujućeg enzima (TACE), inhibitori prenosa signala T ćelija kao što su inhibitori kinaze, inhibitori metaloproteinaze, sulfasalazin, azatioprin, 6-merkaptopurini, inhibitori angiotenzin konvertujućeg enzima, rastvorljivi citokinski receptori i njihovi derivati (npr., rastvorljivi p55 ili p75 TNF receptori i derivati

4

p75TNFRIgG (Enbrel.TM.) i p55TNFRIgG (Lenercept), sIL-1 RI, sIL- 1RII, sIL-6R, rastvorljivi IL-13 receptor (sIL-13)) i anti-inflamatorni citokini (npr., IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 i TGFβ). Neke kombinacije obuhvataju metotreksat ili leflunomid i kod srednjih ili teških slučajeva reumatoidnog artritisa, ciklosporin.

[0146] Farmaceutske kompozicije ovog otkrića mogu da sadrže "terapeutski efikasnu količinu" ili "profilaktički efikasnu količinu" antitela ili dela antitela iz otkrića. "Terapeutski efikasna količina" odnosi se na količinu koja je efikasna, u dozama i tokom neophodnog perioda, za postizanje željenog terapijskog rezultata. Terapeutski efikasna količina antitela ili dela antitela može da varira u zavisnosti od faktora kao što su stanje bolesti, starost, pol i telesna težina individue i sposobnost antitela ili dela antitela da kod individue izazove željeni odgovor. Terapeutski efikasna količina je takođe ona u kojoj bilo koji toksični ili štetni efekti antitela ili dela antitela premašuju terapeutski korisne efekte. "Profilaktički efikasna količina" odnosi se na količinu koja je efikasna, u dozama i tokom neophodnih perioda, za postizanje željenog profilaktičkog rezultata. Tipično, pošto se profilaktička doza koristi kod subjekata pre ili u ranijem stadijumu bolesti, profilaktički efikasna količina biće manja od terapeutski efikasne količine.

[0147] Režimi doziranja se mogu prilagoditi tako da pruži optimalni željeni odgovor (npr. terapeutski ili profilaktički odgovor). Na primer, može se primeniti jedan bolus, može se primeniti više podeljenih doza tokom vremena ili se doza može srazmerno smanjiti ili povećati kao što je pokazano potrebama terapijske situacije. U određenim slučajevima je naročito korisno da se formulišu parenteralne kompozicije u obliku jedinice doze za lakšu primenu i ujednačenost doziranja. Oblik jedinične doze kao što je ovde korišten odnosi se na fizički diskretne jedinice pogodne kao jedinične doze za sisarske subjekte koji se leče; pri čemu svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu tako da proizvede željeni terapeutski efekat u vezi sa traženim farmaceutskim nosačem. Specifikacija oblika jedinične doze otkrića je diktirana i direktno zavisi od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i određenog terapeutskog ili profilaktičkog efekta koji se treba postići i (b) ograničenja svojstvenih za stanje tehnike pripreme takvog jedinjenja za lečenje senzitivnosti kod individua.

[0148] Primer neograničavajućeg raspona za terapeutski ili profilaktički efikasnu količinu antitela ili dela antitela iz otkrića je 0.01-20 mg/kg, ili 1-10 mg/kg, ili 0,3-1 mg/kg. Trebalo bi napomenuti da vrednosti doze mogu da variraju u zavisnosti od tipa i težine stanja koje se mora ublažiti. Nadalje treba razumeti da za svakog određenog subjekta, specifični režimi bi doziranja trebalo da se prilagode u vremenu u skladu sa individualnim potrebama i profesionalnom procenom osobe koja primenjuje ili nadzire primenu kompozicija, i da su

4

ovde navedeni opsezi doziranja samo ilustrativni i nisu namenjeni ograničavanju obima ili izvođenja kompozicije za koju se traži zaštita.

8. Upotrebe antitela iz otkrića

8.1 Generalne upotrebe anti-IL-13 antitela

[0149] S obzirom na njihovu sposobnost da se vezuju za IL-13, anti-IL-13 antitela ili njihovi delovi koji vezuju antigen, iz otkrića se mogu koristiti za detekciju IL-13, u jednom aspektu, hIL-13 (npr., u uzorku matrice, u jednom aspektu, biološkom uzorku, kao što je serum ili plazma), koristeći konvencionalni imunološki test, kao što je enzimska analiza (ELISA), radioimunoanaliza (RIA) ili imunohistohemija tkiva. Otkriće pruža metod za detekciju IL-13 u biološkom uzorku koji sadrži dovođenje u kontakt uzorka sa antitelom ili delom antitela iz otkrića i detekciju antitela vezanog za IL-13 ili nevezanog antitela, da bi se na taj način detektovao IL-13 u uzorku. Antitelo je direktno ili indirektno obeleženo detektabilnom supstancom da bi se olakšala detekcija vezanog ili nevezanog antitela. Pogodne detektabilne supstance uključuju različite enzime, prostetične grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale i radioaktivne materijale. Primeri pogodnih enzima uključuju renovu peroksidazu, alkalnu fosfatazu, β-galaktozidazu ili acetilholinesterazu; primeri pogodnih kompleksa prostetičkih grupa uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primeri pogodnih fluorescentnih materijala uključuju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, danzil hlorid ili fikoeritrin; primer luminiscentnog materijala uključuje luminol; i primeri pogodnog radioaktivnog materijala uključuju<125>I,<131>I,<35>S ili<3>H. Detekcija IL-13 u uzorku može biti korisna u dijagnostičkom kontekstu, na primer u dijagnozi stanja povezanog sa povećanim IL-13, i/ili može biti korisna u identifikovanju subjekta koji može imati koristi od lečenja anti-IL-13 antitelom.

[0150] Kao alternativa testovima detekcije koji uključuju obeleženo anti-IL-13 antitelo, IL-13 se može detektovati u uzorku pomoću kompetitivne imunološke analize koristeći, npr., rhIL-13 standarde obeležene detektabilnom supstancom i neobeleženog anti-IL-13 antitela, kao što je anti-hIL-13 antitelo. U ovom testu, uzorak, obeleženi rhIL-13 standardi i anti-hIL-13 antitelo se kombinuju i određuje se količina obeleženog rhIL-13 standarda vezanog za neobeleženo antitelo. Količina hIL-13 u uzorku je obrnuto proporcionalna količini obeleženog rhIL-13 standarda vezanog za anti-hIL-13 antitelo.

[0151] Antitela i delovi antitela iz otkrića mogu da neutrališu aktivnost IL-13 in vitro i in vivo, u jednom aspektu, hIL-13 aktivnost. Prema tome, antitela i delovi antitela iz ovog

4

otkrića mogu se koristiti za inhibiranje aktivnosti IL-13, npr., u ćelijskoj kulturi koja sadrži IL-13, kod humanih subjekata ili kod drugih sisarskih subjekata koji imaju IL-13 sa kojima antitelo ovog otkrića unakrsno reaguje (npr. primati, kao što je babun, makaki i rezus). U jednom aspektu, otkriće obezbeđuje izolovano humano antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen, koji neutrališe aktivnost humanog IL-13, i najmanje jednog dodatnog IL-13 primata, izabranog iz grupe koja se sastoji od IL-13 babuna, IL-13 marmozeta, IL-13 šimpanze, IL-13 makaki majmuna i IL-13 rezusa, ali koji ne neutrališe aktivnost mišjeg IL-13. U jednom aspektu, IL-13 je humani IL-13. Na primer, u ćelijskoj kulturi koja sadrži ili za koju se sumnja da sadrži hIL-13, antitelo ili deo antitela iz otkrića može se dodati u medijum za kulturu da bi inhibiralo aktivnost hIL-13 u kulturi.

[0152] U sledećem aspektu, otkriće pruža metod za inhibiciju aktivnosti IL-13 kod subjekta koji pati od poremećaja u kome je aktivnost IL-13 štetna. Kao što je ovde korišćen, izraz "poremećaj u kome je aktivnost IL-13 štetna" trebalo bi da obuhvati bolesti i druge poremećaje u kojima je prisustvo IL-13 kod subjekta koji pati od poremećaja pokazano da je ili se sumnja da je odgovorno za patofiziologiju poremećaja ili faktor koji doprinosi pogoršanju poremećaja. Prema tome, poremećaj u kome je aktivnost IL-13 štetna je poremećaj u kojem se očekuje da inhibicija aktivnosti IL-13 ublaži simptome i/ili napredovanje poremećaja. Takvi poremećaji mogu biti dokazani, npr. povećanjem koncentracije IL-13 u biološkoj tečnosti subjekta koji pati od poremećaja (npr. povećanje koncentracije IL-13 u serumu, plazmi, sinovijalnoj tečnosti itd. subjekta), koji se može detektovati, npr., upotrebom anti-IL-13 antitela kako je gore opisano. U jednom aspektu, antitela ili njihovi delovi koji vezuju antigen mogu se koristiti u terapiji za lečenje bolesti ili poremećaja koji su ovde opisani. U sledećem aspektu, antitela ili njihovi delovi koji vezuju antigen mogu se koristiti za proizvodnju leka za lečenje bolesti ili poremećaja koji su ovde opisani. Postoje brojni primeri poremećaja kod kojih je aktivnost IL-13 štetna. Na primer, IL-13 igra kritičnu ulogu u patologiji koja je povezana sa različitim bolestima koje uključuju imunološke i inflamatorne elemente, uključujući, ali ne ograničavajući se na respirativne poremećaje, kao što su astma i hronična opstruktivna bolest pluća. Dodatni poremećaji povezani sa IL-13 uključuju, ali nisu ograničeni na: atopijske poremećaje (npr., atopijski dermatitis i alergijski rinitis); inflamatorna i/ili autoimuna stanja kože, gastrointestinalnih organa (npr., inflamatorne bolesti creva (IBD), kao što su ulcerozni kolitis i/ili Kronova bolest), i jetre (npr. ciroza, fibroza); skleroderma; tumori ili kanceri, na primer, Hodgkin-ov limfom.

[0153] Shodno tome, anti-IL-13 antitela ili njihovi delovi koji se vezuju za antigen ili vektori koji ih eksprimiraju in vivo su indikovani za lečenje bolesti, kao što su astma ili druga

4

inflamatorna i/ili autoimuna stanja u kojima postoji aberantna ekspresija IL-13, što dovodi do viška IL-13 ili u slučajevima komplikacija usled egzogeno primenjenog IL-13.

8.2 Upotreba anti-IL-13 antitela kod respiratornih poremećaja

[0154] U određenim slučajevima ovog otkrića, anti-IL-13 antitelo, ili njegov deo koji se vezuje za antigen, se koristi u lečenju jednog ili više poremećaja povezanih sa IL-13, uključujući, ali ne ograničavajući se na respiratorne poremećaje (npr. astmu (npr. alergijsku i nealergijsku astmu (npr. astmu usled infekcije npr. respiratornim sincicijalnim virusom (RSV), npr. kod mlađe dece)), hroničnu opstruktivnu bolest pluća (COPD) i druga stanja koja uključuju inflamaciju disajnih puteva, eozinofiliju, fibrozu i prekomernu proizvodnju sluzi, npr., cističnu fibrozu i plućnu fibrozu.

[0155] U određenim slučajevima, ova prijava pruža metode lečenja (npr. smanjenje, ublažavanje) ili sprečavanje jednog ili više simptoma povezanih sa respiratornim poremećajem, npr. astmom (npr. alergijskom i nealergijskom astmom); alergije; hronične opstruktivne bolesti pluća (COPD); stanjem koje uključuje inflamacije disajnih puteva, eozinofilijom, fibrozom i proizvodnjom viška sluzi, npr. cističnom fibrozom i plućnom fibrozom. Na primer, simptomi astme uključuju, ali nisu ograničeni na, šištanjem prilikom disanja, kratak dah, bronhokonstrikciju, hiper-reaktivnost disajnih puteva, smanjeni kapacitet pluća, fibrozu, inflamaciju disajnih puteva i stvaranje sluzi. Postupak sadrži primenu na subjekta IL-13 antitela ili njegovog fragmenta u količini dovoljnoj za lečenje (npr. smanjenje, ublažavanje) ili sprečavanje jednog ili više simptoma. IL-13 antitelo se može primeniti terapeutski ili profilaktički, ili oboje. Antagonist IL-13, na primer, anti-IL-13 antitelo ili njegov fragment, može se primeniti na subjekta, pojedinačno ili u kombinaciji sa drugim terapeutskim modalitetima kao što je ovde opisano. U određenim slučajevima, subjekat je sisar, npr., čovek koji pati od poremećaja povezanog sa IL-13 kao što je ovde opisano.

[0156] Kao što je gore navedeno, IL-13 implicirano je da ima ključnu ulogu u izazivanju patoloških odgovora povezanih sa astmom. Međutim, ostali posrednici različitih imunoloških puteva su takođe uključeni u patogenezu astme, a blokiranje ovih medijatora, pored IL-13, može ponuditi dodatnu terapijsku korist. Stoga, vezujući proteini ovog otkrića mogu biti ugrađeni u bispecifično antitelo gde je bispecifično antitelo sposobno da vezuje ciljne parove uključujući, ali bez ograničenja na, IL-13 i pro-inflamatorni citokin, kao što je faktor nekroze tumora-α (TNF-α). TNF-α može pojačati inflamatorni odgovor kod astme i može biti povezan sa težinom bolesti (McDonnell i dr., Progress in Respiratory Research (2001), 31(New Drugs for Asthma, Allergy and COPD), 247-250.). Ovo sugeriše da blokiranje IL-13 i TNF-α može imati korisne efekte, posebno kod teških bolesti disajnih puteva. U neograničavajućem slučaju, bispecfično antitelo ovog otkrića vezuje ciljna mesta IL-13 i TNF-α i koristi se za lečenje astme.

[0157] U sledećem slučaju vezujući proteini otkrića mogu biti korišćeni za generisanje molekula bispecifičnog antitela koji se vezuju za IL-13 i IL-1beta, IL-13 i IL-9; IL-13 i IL-4; IL-13 i IL-5; IL-13 i DL-25; IL-13 i ARC; EL-13 i MDC; IL-13 i M1F; IL-13 i TGF-β; EL-13 i LHR agonist; DL-13 i CL25; IL-13 i SPRR2a; EL-13 i SPRR2b; i DL-13 i ADAM8. Predmetno otkriće takođe daje bispecifična antitela sposobna da vezuju IL-13 i jedno ili više ciljnih mesta uključenih u astmu izabranih iz grupe koja se sastoji od CSF1 (MCSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), FGF2, IFNA1, IFNB1; IFNG, histamina i histaminskih receptora, EL1A, DL1B, BL2, IL3, EL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, ELI 1, IL12A, IL12B, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, EL19, IL- 20, IL-21, IL-22, EL-23, EL-24, EL-25, IL- 26, IL-27, EL-28, IL-30, EL-31, EL-32, IL-33, KtTLG, PDGFB, IL2RA, EL4R, IL5RA, IL8RA, DL8RB, IL12RB1, IL12RB2, EL13RA1, IL13RA2, IL18R1, TSLP, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL13, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL22, CCL24,CX3CL1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, XCL1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CX3CR1, GPR2, XCR1, FOS, GATA3, JAK1, JAK3, STAT6, TBX21, TGFB1, TNFSF6, YY1, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, LTB4R, TB4R2, LTBR i hitinaze.

PRIMERI

1. Proizvodnja anti-IL-13 antitela

[0158] Proizvodna šarža lekovite supstance je rastvor monoklonskog antitela ABT-308 dobijenog iz zasejavanja, proizvodnje, primarne izolacije i hvatanja i finog prečišćavanja lekovite supstance poreklom iz jednog ciklusa proizvodnog reaktora.

1.1 Priprema medijuma

[0159] Rastvori se pripremaju u skladu sa GMP Solution Records sa prečišćenom vodom koja ispunjava USP/EP/JP standarde. Formulisani rastvor medijuma je filtriran kroz 0,1 μm u prethodno sterilisani spremnik odgovarajuće veličine, kesu ili bioreaktor. 0,1 µm filter je testiran na celovitost nakon upotrebe. Sastav medijuma za rast i proizvodnju su dati u tabeli 2.

Tabela 2. Sastav medijuma ćelijske kulture

1

1.2 Širenje inokuluma

[0160] Operacije sa pokretnom bocom i Biowave kesom služe za širenje CHO ćelija iz jedne zamrznute bočice MCB do željene biomase za inokulaciju 110 L bioreaktora za zasejavanje. Zamrznuta bočica Master Cell Bank se odmrzne i stavi u medijum za rast (SR-512) i centrifugira. Ćelije se re-suspenduju u medijumu za rast i proširuju na 37°C i 5% CO2u pokretnim bocama za jednokratnu upotrebu ili Biowave kesama rastuće zapremine. Duplikati kesa od 20 L koriste se za maksimiziranje konačnog širenja ćelijske mase pre inokulacije u bioreaktor za zasejavanje. Kada ćelijska gustina dostigne ≥ 2.0 x 10<6>vijabilnih ćelija/mL iz obe „wave“ kese od 20 L talasa za otprilike 15 - 17 dana, kultura se prebacuje u 110 L bioreaktor za zasejavanje napunjen medijumom za rast SR-520 radi daljeg širenja. Nakon inokulacije, ciljna temperatura je 37°C, a pH je postavljen na ciljnu vrednost od 7,1 i

2

kontrolisan je dodavanjem NaOH i prskanjem CO2. Rastvoreni kiseonik (DO) u bioreaktoru je kontrolisan na ciljnoj vrednosti od 40%. prskanjem vazduha i kiseonika. Pošto ćelijska gustina dostigne ≥ 2,6 x 10<6>vijabilnih ćelija/mL nakon otprilike 2-4 dana, kultura se prenosi u proizvodni bioreaktor od 3000 L.

1.3 Bioreaktor sa kratkim punjenjem

[0161] Delimično punjenje bioreaktora od 3000 L koristi se za dalje širenje ćelijske kulture. U početku se reaktor puni medijumom za rast (SR-520) i inokuliše šaržom iz 110 L bioreaktora za zasejavanje.

[0162] Tokom ovog stadijuma kratkog punjenja, temperatura, rastvoreni kiseonik i pH su kontrolisani na 37°C, 40%, i 7.1, respektivno. pH kulture kontroliše se prskanjem CO2i dodavanjem NaOH. Tipično, ćelije rastu 2 - 4 dana pre nego što dostignu potrebnu gustinu od ≥ 1,6 x 10<6>vijabilnih ćelija/mL.

1.4 Proizvodni bioreaktor

[0163] Proizvodni medijum SR-521 (1950 L) se dodaje u ćelijsku kulturu u bioreaktoru od 3000 L da bi se inicirao stadijum proizvodnje. Dodaje se sredstvo protiv penušanja C da bi se smanjilo formiranje pene. pH kulture se kontroliše na ciljnoj vrednosti od 6,9 prskanjem CO2i dodavanjem NaOH. Temperatura i rastvoreni kiseonik su kontrolisani na ciljnim vrednostima od 35°C i 40%, respektivno. DO u bioreaktoru u početku se kontroliše na željenoj vrednosti prskanjem vazduha i po potrebi dopunjuje čistim kiseonikom. Temperatura se snižava do ciljne vrednosti od 33°C kada gustina vijabilnih ćelija dostigne ≥ 3,0 x 10<6>ćelija/mL, a pH i DO se održavaju na ciljnim vrednostima od 6,9 i 40%, respektivno. Prema potrebi se dodaje glukoza (SR-334). Kulture se sakupljaju kada vijabilnost ćelija padne na ≤ 50%.

1.5 Učinak postupka

[0164] Učinak postupka i rezultati testa u postupku su dati u Tabeli 3 i Tabeli 4, respektivno.

Tabela 3. Izvođenje postupka ćelijske kulture za proizvodnju ABT-308

Tabela 4. Rezultati testa postupka ćelijske kulture

2. Izolacija i prečišćavanje anti-IL-13 antitela

[0165] Primarne operacije izolacije i hvatanja uključuju razbistrenje materijala sakupljenog filtracijom, hvatanje antitela afinitetnom hromatografijom proteina A i inaktivaciju virusa niskom pH, praćenu dubinskom filtracijom. Operacije finog prečišćavanja uključuju anjonsku-izmenjivačku hromatografiju, hromatografiju hidrofobne interakcije, virusnu filtraciju, ultrafiltraciju/diafiltraciju i završnu filtraciju, flaširanje i zamrzavanje.

2.1 Priprema rastvora

4

[0166] Rastvori se pripremaju u skladu sa GMP Solution Records sa USP prečišćenom vodom USP (USP-PW) ili vodom za injekciju (WFI). Većina rastvora se filtrira u kroz 0.2 µm filter u zračene kese, autoklavirane ili uparene-na-mestu spremnike.

2.2 Primarna izolacija i razbistravanje

[0167] Svrha primarne izolacije filtracijom je uklanjanje ćelija i ćelijskih krhotina iz materijala sakupljenog iz proizvodnog bioreaktora. Neobrađeni sakupljeni materijal je propušten kroz filter koji se sastoji od dubinskih filtera, delipidnog dubinskog filtera i membranskih filtera. Razbistreni supernatant je sakupljen u rezervoaru za sakupljanje i održavan na 2-8°C. Kontrole za razbistreni sakupljeni u postupku obuhvataju testiranje koncentracije ABT-308 pomoću Poros A hromatografije, testiranja biološkog opterećenja i endotoksina.

2.3 Protein A afinitetna hromatografija

[0168] Cilj protein A afinitetne hromatografije je hvatanje ABT-308 iz razbistrenog sakupljenog materijala i smanjenje nečistoća povezanih sa postupkom. Za obradu celog sakupljenog materijala obično se rade tri ciklusa hromatografije. Proizvod sakupljen iz tri ciklusa se kombinuje za daljnju obradu.

[0169] Kolona prečnika 45 cm x 22 cm dužine (35 L) je pakovana sa MabSelect® protein A smolom (GE Healthcare) ili ProSep Ultra Plus™ (Millipore) i kvalifikovana je za upotrebu. Pufer za skladištenje se uklanja iz kolone USP-prečišćenom vodom (USP-PV), zatim 0,2 M sirćetnom kiselinom i na kraju ispiranjem sa USP PV. Kolona je ekvilibrisana sa 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,2, zatim je napunjena razbistrenim sakupljenim materijalom do maksimalno 32 g smole proteina/L za MabSelect® Protein A smolu (GE Healthcare) ili 45 g proteina/L smole za ProSep Ultra Plus™ smolu (Millipore). Kolona je isprana sa 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,2, zatim sa 20 mM natrijum citratom, 0,5 M NaCl, pH 6,0, i na kraju isprana ponovo sa 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,2. Antitelo se eluira iz kolone sa 0,1 M sirćetnom kiselinom, pH 3,5. Nakon svakog ciklusa pH sakupljenog eluata se podešava do ciljne vrednosti od 4,1, ako je potrebno. Kontrole tokom postupka uključuju određivanje koncentracije proteina pomoću testiranja A280, SE-HPLC, biološkog opterećenja i endotoksina.

[0170] Posle prvog ciklusa kolona se regeneriše sa 0,2 M sirćetnom kiselinom i ispere sa USP-PV. Nakon drugog ciklusa kolona se regeneriše sa 0,2 M sirćetnom kiselinom, ispira sa USP-PV, zatim se dezinfikuje sa 0,1 M sirćetnom kiselinom, 20% etanolom, nakon čega sledi ispiranje i kratkotrajno skladištenje u 50 mM natrijum acetatu, 20% etanolu, pH 5. Posle trećeg ciklusa, kolona se regeneriše sa 0,2 M sirćetnom kiselinom i ispire sa USP-PV. Zatim se očisti sa 0,4 M sirćetnom kiselinom, 0,5 M NaCl, 0,1% Tween 80, zatim sa USP-PV, a zatim sa 50 mM NaOH 1,0 M NaCl, zatim sa USP-PV. Konačno se dezinfikuje sa 0,1 M sirćetnom kiselinom, 20% etanolom nakon čega sledi ispiranje i skladištenje u 50 mM sirćetne kiseline, 20% etanola, pH 5,0.

2.4 Inkubacija na niskoj pH i filtracija

[0171] Inkubacija na niskoj pH je namenski korak smanjenja virusa koji pruža dodatno osiguranje bezbednosti od virusa inaktivacijom sporednih virusa sa omotačem koji mogu biti prisutni u eluatu Proteina A. Svrha filtracije nakon inkubacije sa niskoj pH je uklanjanje svog taloga koji se može formirati tokom tretmana niskom pH.

[0172] pH kombinovanih eluata protein A hromatografije se podešava na ciljnu vrednost od 3,5 sa 0,5 M fosfornom kiselinom i održava se na 18-25°C tokom 60 - 70 minuta. Smeša se zatim podešava na pH 5 pomoću 1 M Tris, pH 10, razbistrava kombinacijom dubinskih filtera i membranskih filtera, a zatim se ohladi do 10 - 14°C. Kontrole u postupku za tretman niskom pH i korak filtracije uključuju određivanje koncentracije proteina pomoću testa A280, SE-HPLC, biološkog opterećenja i endotoksina.

2.5 Učinak primarne izolacije i postupka hvatanja

[0173] Učinak postupka za primarnu izolaciju i operacije hvatanja je dat u Tabeli 5, i rezultati kontrola u postupku su dati u Tabeli 6.

Tabela 5. Učinak postupka primarne izolacije i hvatanja

Tabela 6. Rezultati testa primarne izolacije i hvatanja

2.6 Snažna anjonsko-izmenjivačka hromatografija

[0174] Svrha koraka jake anjonsko-izmenjivačke hromatografije je smanjenje nečistoća povezanih sa postupkom, kao što su proteini ćelije domaćina, DNK i endotoksini. Ona takođe može poslužiti kao korak uklanjanja virusa. U određenim primerima izvođenja, kolona Q Sepharose™ FF smole deluje u režimu protoka u kome antitelo teče kroz kolonu i nečistoće ostaju vezane za smolu, u alternativnim primerima izvođenja, Mustang Q™ membrana (Pall Corp.) je korišćen umesto kolone Q Sepharose™ FF smole. Operacije se izvode na 10-14°C.

[0175] Kolona prečnika 45 cm x 22 cm dužine (35 L) je pakovana sa Q Sepharose™ FF smolom (GE Healthcare) i kvalifikovana je za upotrebu. Kolona je ekvilibrisana sa 25 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 8,0. pH neutralizovanog i filtriranog rastvora za inaktivaciju je podešena na 8,0 sa 1 M Tris, pH 10, provodljivost se podesi na 5,0 - 6,5, a rastvor se filtrira kroz delipidne i membranske filtere. Punjenje Q Sepharose™ se pumpa kroz kolonu pri maksimalnom opterećenju od 80 g proteina/L smole. Nakon punjenja, kolona je isprana sa 25 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 8,0 i protok i ispiranje su kombinovani. Ovo je Q Sepharose™ sakupljen protok i ispiranje. Kontrole u postupku za korak Q Sepharose™ uključuju koncentraciju pomoću testiranja A280, SE-HPLC, biološkog opterećenja i endotoksina.

[0176] Kolona se regeneriše sa 25 mM natrijum-fosfatom, 1,0 M NaCl, pH 7,0, posle čega sledi ispiranje WFI-om, i dezinficira se sa 1,0 M NaOH nakon čega sledi ispiranje sa WFI. Kolona se zatim neutrališe sa 25 mM natrijum-fosfatom, 1,0 M NaCl, pH 7,0 i skladišti u 25 mM natrijum fosfatu, 20% izopropanolu, pH 7,0.

2.7 Hromatografija hidrofobne interakcije

[0177] Svrha koraka Phenyl Sepharose™ je uklanjanje ABT-308 agregata, fragmenata i nečistoća povezanih sa postupkom. Operacije se izvode na 10-14°C.

[0178] Stupac prečnika 60 cm x 15 cm dužine (42 L) je pakovan sa Phenyl Sepharose™ HP smolom (GE Healthcare) i kvalifikovan je za upotrebu. Kolona je ekvilibrisan sa WFI, a zatim sa 20 mM natrijum fosfatom, 1,1 M amonijum sulfatom, pH 7,0.

[0179] Protok i ispiranje Q Sepharose™ je razblažen 1:1 (zapr./zapr.) sa 40 mM natrijumfosfatom, 2,2 M amonijum sulfatom, pH 7,0. Ovaj rastvor, opterećenje Phenyl Sepharose™, filtrira se kroz filter od 0,2 µM i sipan na kolonu na maksimalnom opterećenju od 64 g proteina/L smole. Kolona je isprana sa 25 mM natrijum fosfatom, 1,4 M amonijum sulfatom, pH 7,0 i ABT-308 je eluiran iz kolone sa 11 mM natrijum fosfatom, 0,625 M amonijum sulfatom, pH 7,0. Kontrole u postupku za korak Phenyl Sepharose™ uključuju koncentraciju pomoću testiranja A280, SE-HPLC, biološkog opterećenja i endotoksina.

[0180] Kolona se regeneriše sa WFI, zatim se dezinfikuje sa 1 M NaOH, ispira sa WFI i skladišti u 25 mM natrijum fosfata, 20% izopropanola, pH 7.

2.8 Nanofiltracija

[0181] Nanofiltracija je namenski korak uklanjanja virusa koji pruža dodatno osiguranje bezbednosti od virusa fizičkim uklanjanjem sporednih virusa prečnika ≥ 20 nm koji mogu biti prisutni u eluatu kolone Phenyl Sepharose™ HP. Operacije se izvode na 10-14°C.

[0182] Eluat kolone Phenyl Sepharose™ HP je propušten kroz 0,1 µm filter i Ultipor DV20 filter prethodno navlažen sa 15 mM histidina, pH 5,6. Posle filtriranja, filter je ispran sa 15 mM histidinom, pH 5.6, da bi se izolovao sav zadržani ABT-308. Nakon upotrebe, test celovitosti je izveden na DV20 filteru i filter se odbacuje. Ako filter ne prođe test celovitosti, rastvor se može ponovo filtrirati kao što je gore opisano. Kontrole u postupku za korak nanofiltracije uključuju koncentraciju proteina preko testiranja A280, SE-HPLC, biološkog opterećenja i endotoksina.

2.9 Formulacija supstance leka ABT-308 ultrafiltracijom/diafiltracijom

[0183] Svrha koraka UF/DF je diafiltracija lekovite supstance u pufer konačne formulacije, 15 mM histidina, pH 5,6, i koncentracija ABT-308. Ove operacije se izvode na 10-14°C.

[0184] Nanofiltrat se koncentruje na približno 50 g/L korišćenjem 30 kDa MWCO polietarskih sulfonskih membrana, diafiltriran sa puferom za formulaciju, a zatim je koncentrovan do približno 180 g/L. UF sistem se isprazni od proizvoda i ispira diafiltracionim puferom da bi se izolovao sav proizvod koji ostaje u sistemu. Koncentrat i ispiranje su kombinovani da se dobije diafiltrirani ABT-308 u koncentraciji od približno 120 - 160 g/L. Koncentrovani ABT-308 je filtriran kroz membranske filtere. Kontrole u postupku za korak ultrafiltracije/diafiltracije uključuju koncentraciju pomoću testiranja A280, SE-HPLC, biološkog opterećenja i endotoksina.

[0185] Nakon svakog ciklusa, sistem za ultrafiltraciju je ispran sa WFI i očišćen sa 250 ppm rastvora natrijum hipohlorita, zatim je dezinfikovan i uskladišten u 0,1 M natrijum hidroksidu.

2.10 Završna filtracija, flaširanje i zamrzavanje

[0186] Operacije filtracije i flaširanja se izvode u oblasti klase 100 na 2-8°C u Laminar Flow Hood klase 100. Formulisani ABT-308 se filtrira kroz 0,2 µm filter u prethodno sterilisane PETG boce bez pirogena. Označene boce postavljene su u prazan zamrzivač na -80°C (nominalno) do zamrzavanja, a zatim prebačene u zamrzivače za čuvanje na -80°C (nominalno). Kontrole u postupku za završni korak filtracije i flaširanja uključuju testiranje A280, biološkog opterećenja i endotoksina (rezultati ispitivanja supstance leka).

2.11 Učinak postupka finog pročišćavanja

[0187] Učinak postupka za operacije primarne izolacije i hvatanja dat je u Tabeli 7, a rezultati kontrola u postupku su dati u Tabeli 8.

Tabela 7. Učinak postupka finog prečišćavanja

Tabela 8. Rezultati testa postupka finog prečišćavanja

Jedinična operacija Test postupka<a>Granica 56003BF 57001BF 57002BF

3. Određivanje koncentracije proteina ćelije domaćina u kompozicijama antitela

[0188] Ovaj postupak opisuje metodologiju ispitivanja za određivanje zaostale koncentracije proteina ćelije domaćina u uzorcima antitela. Enzimski test (ELISA) koristi se za postavljanje u „sendvič“ proteina ćelije domaćina (antigena) između dva sloja specifičnih antitela. Nakon toga sledi blokiranje nespecifičnih mesta sa kazeinom. Proteini ćelije domaćina se zatim inkubiraju tokom kog vremena se molekuli antigena hvataju pomoću prvog antitela (antitelo omotač). Zatim se dodaje drugo antitelo (biotinilovano antitelo protiv proteina ćelije domaćina) koje se fiksira za antigen (proteini ćelije domaćina). Dodaje se neutravidin HRP-konjugovani koji se vezuje za biotinilovano antitelo protiv proteina ćelije domaćina. Nakon toga sledi dodavanje K plave podloge. Hromogeni supstrat se hidrolizuje antitelom konjugovanim sa vezanim enzimom, stvarajući plavu boju. Reakcija je zaustavljena sa 2M H3PO4, menjajući boju u žutu. Intenzitet boje je direktno proporcionalan količini antigena vezanog u bunarčiću.

[0189] Priprema 50 mM natrijum bikarbonata (pufer za oblaganje), pH 9.4. U čašu od 1 L dodati: 900 ml Milli-Q vode; 4,20 g ± 0,01 g natrijum bikarbonata. Mešati dok se potpuno ne rastvori. Podesiti pH na 9.4 sa 1 N NaOH. Prebaciti u volumetrijsku bocu od 1 L i dobiti traženu zapreminu sa Milli-Q vodom. Mešati inverzijom dok nije homogen. Filtrirati kroz sterilnu filtracionu jedinicu od 0,22 µm. Čuvati na nominalnoj temperaturi od 4°C do 7 dana od datuma pripreme.

[0190] Priprema 0.104 M Na2HPO4*7H2O, 1,37 M NaCl, 0,027 M KCl, 0,0176 M KH2PO4, pH = 6,8 - 6,9 (10Ks PBS). U staklenu čašu dodati oko 400 ml vode Milli-Q. Dodati 13,94 g ± 0,01 g Na2HPO4x 7H2O. Dodati 40,0 g ± 0,1 g NaCl. Dodati 1,00 g ± 0,01 g KCl. Dodati 1,20 g ± 0,01 g KH2PO4. Mešati dok ne postane homogen. Prebaciti u volumetrijsku bocu od 500 ml. QS do 500 ml zapremine sa Milli-Q vodom. Mešati inverzijom. Filtrirati kroz sterilnu filtersku jedinicu od 0,2 µm. Čuvati na sobnoj temperaturi do 7 dana. ;[0191] Priprema 1X PBS 0,1% Triton X-100, pH 7,40: (pufer za ispiranje ploča). U 4-litarskom graduisanom cilindru pomešati 400 mL 10 X PBS (korak 5.2) sa 3500 mL Milli-Q vode. Proveriti pH, a po potrebi prilagoditi do 7,40 ± 0,05 sa 1 N HCl ili 1 N NaOH. Zapreminu dopuniti do tražene vrednosti sa Milli-Q vodom. Čvrsto postaviti parafilm i mešati inverzijom dok ne postane homogen. Prebaciti u bocu od 4 L. Ukloniti 4 ml 1 X PBS-a i odbaciti. Dodati 4 mL tritona X-100 u 3996 mL 1 X PBS. Staviti na ploču za mešanje i mešati dok se potpuno ne rastvori. Filtrirati količinu pufera za ispiranje ploče potrebnu za pripremu pufera za razblaživanje kroz sterilnu filtracionu jedinicu od 0,22 µm. Čuvati na sobnoj temperaturi do 7 dana. ;[0192] Priprema smeše antitela za oblaganje: kozje anti CHO 599/626/748 (serija # G11201 @ 1.534 mg/mL), afinitetno prečišćen: NAPOMENA: Zalihe se čuvaju na nominalnoj temperaturi od 80°C u bočicama. Pripremiti alikvote. Izvaditi jednu alikvotu po ploči u vreme upotrebe. Neposredno pre upotrebe: Razblažiti smešu antitela do krajnje koncentracije od 4 µg/mL u hladnom 50 mM natrijum bikarbonatu na sledeći način. Na primer: dodati 31 µL smeše antitela za oblaganje u 11969 µl hladnog pufera za oblaganje. Pažljivo mešati inverzijom. ;[0193] Pripremiti smešu biotinilovanog kozjeg antitela protiv proteina ćelije domaćina, 599/626/748 (serija # G11202 @ 0,822 mg/mL): NAPOMENA: Zalihe se čuvaju na nominalnoj temperaturi -80°C u bočicama. Pripremiti alikvote. Izvaditi jednu alikvotu po ploči u vreme upotrebe. Neposredno pre upotrebe: razblažiti smešu biotinilovanog antitela da bi se dobila krajnja koncentracija od 1 µg/mL u 37°C ± 2° C kazeinu, kako sledi. Na primer: dodati 14,6 µL smeše biotinilovanog antitela u 11985 µL 37°C ± 2°C kazeina. Pažljivo mešati inverzijom. ;[0194] Priprema Neutravidina-HRP. Rekonstituisati nove serije (2 mg/bočici) do 1 mg/ml kako sledi: Dodati 400 µL Milli-Q vode u bočicu, a zatim dodati 1600 µL 1X PBS, za ukupno 2 mL. Lagano vorteksovati radi mešanja. Čuvati na nominalnoj temperaturi -20°C. Pripremiti ;;;1 ;alikvote sa željenom zapreminom tako da se koristi 1 alikvota po ploči. Pripremiti u polipropilensku epruvetu. Kvalifikovati nove serije da bi se odredila radna koncentracija. Dodeliti rok isteka od 6 meseci od datuma pripreme. Na primer, ako se utvrdi da je radna koncentracija 0,2 µg/mL, tada pripremiti na sledeći način. Neposredno pre upotrebe: odmrznuti alikvotu neutravidina-HRP na sobnoj temperaturi. Razblažiti 1 mg/mL neutravindinskog rastvora do 0,1 mg/mL (100 µg/mL) sa 37°C ± 2°C kazeina. Na primer: Razblažiti X10, dodati 50 µL neutravidina u 450 µL kazeina. Lagano vorteksovati radi mešanja. Dalje razblažiti 100 µg/mL rastvor do 0,2 µg/mL sa 37°C ± 2°C kazeina. Na primer: Razblažiti X500, dodati 24 µL neutravidina (100 µg/mL) u 11976 µL kazeina. Lagano vorteksovati radi mešanja. ;[0195] Priprema 5,7 2M fosforne kiseline (Stop rastvor). Pripremiti 2M rastvor fosforne kiseline od koncentrovane fosforne kiseline na sledeći način. Iz % fosforne kiseline navedenog na etiketi, gustine (1.685 g/mL) i težine formule (98 g/mol), izračunati zapreminu koncentrovane fosforne kiseline koja je potrebna za pripremu 500 mL 2M fosforne kiseline. U bocu dodati zapreminu koncentrovane fosforne kiseline izračunatu gore. Dopuniti zapreminu do tražene vrednosti sa Milli-Q vodom i mešati inverzijom sve dok ne postane homogen. Čuvati na temperaturi sredine do 6 meseci od datuma pripreme. ;[0196] Priprema pufera za razblaživanje (kazein je razblažen X100 u 1X PBS 0,1% triton X100, pH 7,4). Razblažiti sa 37°C ± 2°C kazein X100 u sterilno filtriranom 1X PBS 0,1% Triton X100, pH 7,4 (iz prethodnog teksta). Na primer: Dodati 1 mL 37°C ± 2°C kazeina u 99 ml 0,22 µm sterilno filtriranog 1X PBS 0,1% Triton X100, pH 7,4. Dobro promešati. Pripremiti sveže za svaku upotrebu. ;[0197] Priprema standarda. Standardi proteina ćelija domaćina (standardi antigena) (serija # G11203 @ 1.218 mg/mL): NAPOMENA: Zalihe se čuvaju na nominalnom -80°C u alikvotama od 70 µL. Odmrznuti alikvotu na sobnoj temperaturi. Izvesti serijska razblaženja u epruvetama od polipropilena koristeći pufer za razblaživanje. ;[0198] Priprema uzoraka. U polipropilenskim epruvetama razblažiti krajnje uzorke do 24 mg/mL u puferu za razređivanje. Zabeležiti koncentraciju. NAPOMENA: koristite rastvore iz daljeg teksta za pripremu spajkovanih uzoraka i za pripremu 12 mg/mL rastvora navedenih u nastavku. U polipropilenskim mikroepruvetama dalje razblažiti rastvore od 24 mg/mL do 12 mg/mL u puferu za razređivanje. Puniti trostruke bunarčiće za svaki od 12 mg/mL rastvora na ploči za ukupno 6 bunarčića. ;[0199] Priprema spajka. U polipropilenskoj mikro-epruveti, pripremiti 10 ng/mL proteina ćelije domaćina od 20 ng/mL standarda pripremljenog prethodno razblaživanjem 2 X puferom ;;;2 ;za razblaživanje. Sipati u tri bunarčića ploče 10 ng/mL spajk rastvora. Upotrebiti 20 ng/mL standardnog rastvora iz koraka 6.1 spajkovanje uzoraka. ;[0200] Priprema spajkovanih uzoraka. U mikro-epruvetama od polipropilena, sipati 300 µl svakog 24 mg/mL finalnog rastvora sa 300 µL 20 ng/mL spajk rastvora (6.1). Napuniti trostruke bunarčiće za svaki rastvor spajkovanog uzorka sa ukupno 6 bunarčića. ;[0201] Priprema kontrole. Pre upotrebe u rutinskom testiranju, mora se postaviti kontrolni raspon za svaki novi kontrolni stok rastvor. Kontrolna zaliha: Pripremiti 150 µl alikvote iz šarže ABT-308 koncentrata supstance leka i čuvati zamrznute na nominalnoj temperaturi -80°C do tri godine. ;[0202] Priprema radne kontrole. Odmrznuti alikvotu kontrole na sobnoj temperaturi. U polipropilenskim epruvetama razblažiti kontrolu do 24 mg/mL sa puferom za razblaživanje. U polipropilenskim mikroepruvetama dalje razblažiti kontrolni rastvor od 24 mg/mL sa puferom za razblaživanje do 12 mg/mL. Pripremiti jedno razblaženje i kontrolu punjenja u 3 bunarčića na ploči. ;[0203] Postupci ELISA. Napuniti bocu za ispiranje ploče puferom za ispiranje ploče (videti korak 5.3, 1X PBS 0,1% Triton X-100). Puniti uređaj za ispiranje ploče. Proveriti sledeće parametre: Parametre bi trebalo podesiti na: Tip ploče: 1 za svaki ciklus (ukupno 5 ciklusa): Zapremina: 400 µl; Vreme natapanja: 10 sekundi; Vreme asp.: 4 sekunde. ;[0204] Postupak ispitivanja. Obložiti ploču sa 100 µL/bunarčiću 4 µg/mL smeše kozjeg oblagajućeg antitela u hladnom 50 mM natrijum bikarbonatu. Tapkati bok ploče sve dok rastvor za oblaganje ne prekrije dno bunarčića ravnomerno, prekriti zaptivnom trakom i inkubirati na nominalnoj temperaturi od 4°C, uz mućkanje na uređaju za mućkanje ploče (ili ekvivalentu) na brzini 3 tokom 18 sati ± 1 sat. Nakon inkubacije preko noći izvaditi ploču iz frižidera i ostaviti da se ekvilibriše do sobne temperature. Mućkati oblogu. Obrisati ploču papirnim ubrusom. Blokirati sa 300 µL/bunarčiću 37°C ± 2°C kazeina, prekriti zaptivnom trakom i inkubirati na 37°C ± 2°C uz mućkanje na Lab-line Environ uređaju za mućkanje ploče (ili ekvivalentu) na 80 rpm/min ± 5 rpm/min tokom 1 sata. Pripremiti standard, uzorak, kontrolu, spajk i spajkovane uzorke tokom blokirajuće inkubacije. Isprati ploču 5 puta puferom za ispiranje. Obrisati ploču paprinim ubrusima. Upotrebom 8-kanalne pipete, pipetirati 100 µL/bunarčiću standarda, uzoraka, spajka, spajkovanih uzoraka i kontrole u trostruke bunarčiće na ploči. Pipetirati 100 µL/bunarčiću pufera za razblaživanje u sve prazne bunarčiće ploče koji će služiti kao blanko. Prekriti zaptivnom trakom i inkubirati na 37°C ± 2°C, uz mućkanje na Lab-line Environ uređaju za mućkanje ploče (ili ekvivalentu) 1 sat na 80 rpm/min ± 5 rpm/min. Popuniti obrazac koji će se koristiti kao vodič prilikom punjenja ploče. ;[0205] Podešavanje čitača ploča. Podesiti obrazac, uneti koncentracije za standarde. Ne unositi faktore razblaženja za uzorke, kontrolu, spajk, ili spajkovane uzorke. Dodeliti bunarčiće koji sadrže razblaživač kao blankove, koji se oduzimaju od svih bunarčića. Isprati ploču 5 puta puferom za ispiranje. Obrisati ploču papirnim ubrusom. Dodati 100 µL/bunarčiću dobro biotinilovanog kozjeg antitela. Prekriti trakom za skaliranje i inkubirati na 37°C ± 2°C, istovremeno mućkajući na Lab-line Environ uređaju za mućkanje ploče (ili ekvivalentu) na 80 rpm/min ± 5 rpm/min tokom 1 sata. Isprati ploču 5 puta puferom za ispiranje. Obrisati ploču papirnim ubrusom. Dodati 100 µL/bunarčiću neutravidin-HRP konjugatnog rastvora. Prekriti zaptivnom trakom i inkubirati na 37°C ± 2°C, istovremeno mućkajući na Lab-line Environ uređaju za mućkanje (ili ekvivalentu) 1 sat na 80 rpm/min ± 5 rpm/min. Isprati ploču 5 puta puferom za ispiranje. Obrisati ploču papirnim ubrusom. Dodati 100 µL/bunarčiću hladnog K-Blue supstrata, pokriti trakom za zaptivanje i inkubirati na sobnoj temperaturi 10 minuta (startovati tajmer čim se supstrat doda u prvi red), uz brzinu mućkanja 3 na Lab-line uređaju za mućkanje titarske ploče (ili ekvivalentu). Zaustaviti reakciju dodavanjem 100 mL/bunarčiću 2 µL fosforne kiseline (Korak 5.7). Postaviti ploču na uređaj za mućkanje ploče na brzinu 3 tokom 3-5 minuta. Očitati ploču na 450 nm. ;[0206] Analiza podataka i izračunavanja. NAPOMENA: prihvataju se samo uzorci, spajk, spajkovani uzorci i kontrola, sa optičkim gustinama koje su unutar praktične granice kvantitativnog određivanja (2,5 ng/mL standarda) standardne krive i ispunjavaju kriterijume % CV ili % razlike navedene u nastavku. Ako optička gustina uzorka padne ispod standarda od 2,5 ng/mL, rezultat bi trebalo biti prikazan kao manje od 2,5 ng/mL. Ova vrednost bi trebalo da podeli koncentracijom razblaženog uzorka (12 mg/mL) da bi se vrednost prikazala u ng/mg. Ako uzorak ima visoku koncentraciju ćelija domaćina, što uzrokuje da nespajkovani i/ili spajkovani uzorak bude iznad standardne krive, prikazati vrednost kao> 100 ng/mL. Ovu vrednost bi trebalo zatim podeliti koncentracijom razblaženog uzorka (12 mg/mL) da bi se vrednost prikazala u ng/mg. Uzeti u obzir nultu vrednost uzorka za izračunavanja izolacije spajka kada je uzorak ispod standarda od 2,5 ng/mL. ;[0207] Standardna kriva. Standardne koncentracije treba uneti u obrazac protokola. Koristi se kvadratna kriva. Koeficijent određivanja mora biti = 0,99, a % CV između trostrukih bunarčića mora biti = 20%. Ako ovaj kriterijum nije ispunjen: Jedan standard (1 nivo, 3 bunarčića) može biti izostavljen. Ako je izostavljen 1,25 ng/mL, prihvatljivi su samo uzorci i uzorci sa dodatkom optičke gustine unutar od 2,5 ng/mL i 100 ng/mL (preostale tačke standardne krive). Pored toga, za tri ponavljanja svakog standardnog nivoa, ako je jedan bunarčić jasno kontaminiran ili pokazuje slabo vezivanje, on se može izostaviti. Ako je izostavljen bunarčić sa standardnog nivoa, preostala ponavljanja moraju imati % razlike = ;;;4 ;20%. % CV za najniži standard, koji pokazuje vrednosti optičke gustine blizu osnove (blankovi) ploče, trebalo bi da bude = 30%. Ako se izostavi jedan bunarčić, % razlike za preostala ponavljanja mora biti = 35%. Ako se izostavi najniži standard, prihvatljivi su samo uzorci i uzorci sa dodatkom koji imaju optičke gustine unutar optičkih gustina preostalog nivoa optičke gustine. ;[0208] % CV uzoraka trebalo bi da bude = 20% između trostrukih bunarčića. Zabeležiti % CV između trostrukih bunarčića. Iz svakog razblaživanja uzorka može biti izostavljen jedan bunarčić. Preostala ponavljanja moraju imati % razlike od = 20%. Napomena: ako je optička gustina uzorka bez dodatka ispod 2,5 ng/ml standardne optičke gustine, kriterijumi % razlike ne važe za rezultate bez dodatka. Pogledajte izračunavanje u prethodnom tekstu. ;[0209] Izračunati stvarnu koncentraciju ćelija domaćina u ng/mg od srednje (ng/ml) vrednosti na sledeći način: protein ćelije domaćina CHO (ng/mg) = srednja vrednost "rezultat uzorka bez dodatka (ng/mL)" _ koncentracija razblaženog uzorka (12 mg/mL). ;[0210] % CV dodataka bi trebalo da bude = 20% između trostrukih bunarčića. Zabeležiti % CV. Jedan bunarčić sa dodatkom može biti izostavljen. Preostale tačke moraju imati % razlike = 20%. Videti izračunavanje u prethodnom tekstu. Zabeležiti koncentraciju ćelije domaćina u ng/mL. Ovaj rezultat će se koristiti u izračunavanjima izolacije dodatka. Rezultujuća koncentracija za dodatak (ng/mL) mora biti ± 20% od teorijske koncentracije dodatka. Zabeležiti rezultat i navedite prolaz ili neuspeh. Ako rezultat dodatka nije unutar 20% od teorijskog, ispitivanje se mora ponoviti. Srednja koncentracija dodatka (ng/mL) x 100 = mora biti 100% ± 20% 10 ng/mL. ;[0211] % CV uzoraka sa dodatkom trebalo bi da bude = 20% između trostrukih bunarčića. Zabeležiti % CV između trostrukih bunarčića. Jedan bunarčić iz svakog razblaženja uzorka sa dodatkom se može izostaviti. Preostala ponavljanja moraju imati % razlike od = 20%. Videti izračunavanje u prethodnom tekstu. Zabeležiti „rezultat uzorka sa dodatkom“ za svako razblaženje u ng/mL. Zabeležiti % razlike između dvostrukih razblaženja. % razlike između razblaženja trebalo bi da bude = 25%. Ovi rezultati će se koristiti u izračunavanjima izolacije dodatka. ;[0212] Izračunati % izolacije dodatka za svaki set razblaženja upotrebom formule ispod: % izolacije dodatka = vrednost uzorka sa dodatkom – vrednost uzorka bez dodatka X 100 vrednost dodatka. NAPOMENA: (1) Ako vrednost optičke gustine uzorka sa dodatkom padne ispod 2,5 ng/ml standarda u izračunavanju uzeti u obzir uzeti u obzir vrednost nula u % izračunavanja izolacije dodatka. % izolacije dodatka mora biti 100% ± 50% (50% - 150%) za svako razblaženje za svaki uzorak. Zabeležiti rezultate i prošao/nije prošao. ;[0213] % CV kontrole trebalo bi da bude = 20% između trostrukih bunarčića. Zabeležiti % CV rezultat. Jedan bunarčić iz kontrole može biti izostavljen. Preostala ponavljanja moraju imati % razlike od = 20%. Videti izračunavanje u prethodnom tekstu. Zabeležiti koncentraciju ćelije domaćina u kontroli u ng/mL. Izračunajte koncentraciju ćelije domaćina u ng/mg na sledeći način: Protein ćelije domaćina (ng/mg) = rezultat kontrolnog proteina ćelije domaćina u ng/mL. ;;4. Određivanje koncentracije proteina A u kompozicijama antitela ;;[0214] U ovoj ELISA, ploče su obložene pilećim anti-proteinom A i inkubirane. Nespecifična mesta su blokirana kazeinom u PBS-u. Ploče se ispiraju u 1X PBS 0,1% Triton X-100 da bi se uklonio nevezani materijal. Uzorci i Cisrprotein A standardi su razblaženi u 1X PBS 4,1% Triton X 10% kazeina. Rastvori se denaturišu zagrevanjem na 95°C ± 2°C, odvajajući Protein A od antitela. U određenim primerima izvođenja, na primer, ako se (GE Healthcare) rastvori zatim dodaju u ploču i inkubiraju. U alternativnim primerima izvođenja, na primer, ako korak afiniteta proteina A uključuje upotrebu ProSep Ultra Plus™ (Milipore), rastvori se hlade i dodaje se 0,85% NaCl 12,5% 1 N sirćetna kiselina 0,1% Tween 20 u svaku epruvetu (1:1) da bi se dodatno pomoglo u odvajanju proteina A od uzorka proteina. Epruvete su snažno vorteksovane, inkubirane i centrifugirane. Supernatanti su uklonjeni i dalje obrađeni. Nevezani materijal se ispira sa 1X PBS 0,1% Triton X-100. Biotinilovani pileći anti-protein A dodaje se u mikrotitarsku ploču i inkubira. Ploča se ispira radi uklanjanja nevezanog materijala i dodaje se konjugat Neutravidina - Peroksidaze. ;[0215] Neutravidin će se vezati za biotinilovani pileći anti-protein A koji se vezao za bunarčiće. Ploča se ponovo ispira da bi se uklonio nevezani Neutravidin i K-Blue (tetrametilbenzidin (TMB)) supstrat se dodaje u ploču. Supstrat se hidrolizuje vezanim Neutravidinom proizvodeći plavu boju. Reakcija je zaustavljena fosfornom kiselinom, menjajući boju u žutu. Intenzitet žute boje u bunarčićima direktno je proporcionalan koncentraciji proteina A koji je prisutan u bunarčićima. ;[0216] Boce reagenasa i rastvora kazeina moraju biti zagrejane do 37°C ± 2°C; ultrazvučno obrađivane 2 minuta i podeljeni u alikvote. Alikvote se moraju čuvati na nominalnoj temperaturi od 4°C. Kada se izvodi ispitivanje, broj potrebnih alikvota kazeina trebalo bi da se postavi na 37°C ± 2°C. Pufer za oblaganje i supstrat se koriste hladni (uzimaju se sa nominalnih 4°C neposredno pre upotrebe). ;[0217] 50 mM Natrijum bikarbonat (pufer za oblaganje), pH 9,4. U čašu od 1 L dodati: 900 ml Milli-Q vode, 4,20 g ± 0,01 g natrijum bikarbonata. Mešati do potpunog rastvaranja. ;Podesiti pH do 9.4 sa 1 N NaOH. Prebaciti u volumetrijsku bocu od 1 L i dopuniti zapreminu sa Milli-Q vodom. Mešati inverzijom dok ne postane homogen. Filtrirati kroz sterilnu filtracionu jedinicu 0,22 CA µm. Čuvati na nominalnoj temperaturi od 4°C do 7 dana od datuma pripreme. ;[0218] 104 M Na2HPO4* 7H20, 1.37 M NaCl, 0.027 M KCl, 0.0176 M KH2PO4, pH = 6.8 -6.9. (10 X PBS): Dodati približno 400 mL Milli-Q vode u staklenu čašu. Dodati 13.94 g 6 0.01 g Na2HPO4x 7H20. Dodati 40.0 g 60.1 g NaCl. Dodati 1.00 g 60.01 g KCl. Dodati 1.20 g 60.01 g KH2PO4. Mešati do homogenizacije. Preneti u 500 mL volumetrijsku bocu. QS do 500 mL zapremine sa Milli-Q vodom. Mešati inverzijom. Filtrirati kroz 0.2 CA µm sterilni filter. Uskladištiti na sobnoj temperaturi do 7 dana.

[0219] 1X PBS 0.1% Triton X-100, pH 7.40: (Plate Wash Buffer). U 4 L graduisanom cilindru, pomešati 400 mL 10 X PBS (videti prethodno) sa 3500 mL Milli-Q vodom. Proveriti pH, i podesiti ukoliko je neophodno do 7.40 ± 0.05 sa 1 N HCl ili 1 N NaOH. Dovesti do zapremine sa Milli-Q vodom. Pokriti cilindar sa parafilmom i mešati inverzijom do homogenizacije. Preneti u bocu od 4 L. Ukloniti 4 mL 1 X PBS i odbaciti. Dodati 4 mL triton X-100 u 3996 mL 1 X PBS. Postaviti na ploču za mešanje i mešati do kompletnog rastvaranja. Uskladištiti na sobnoj temperaturi do 7 dana.

[0220] Kokošije anti-protein A antitelo za oblaganje. Izvaditi jedan alikvot antitela po ploči u vreme upotrebe. Da bi se kvalifikovali novi lotovi kokošijeg anti-Proteina A, može biti neophodno da se koristi i kvalifikuje zajedno kokošiji anti-Protein A-biotin konjugovan (pripremljen iz istog lota oblaganja). Neposredno pre upotrebe: Razblažiti smešu antitela u hladnom 50 mM natrijum bikarbonatu do koncentracije određene tokom kvalifikacije za oblaganje. Na primer: Ukoliko je tokom kvalifikacije koncentracija obloge koja se stavlja na ploču određena kao 6 µg/mL i ako je koncentracija stoka 3000 µg/mL, onda dodati 24 µL antitela za oblaganje 11976 µL hladnog pufera za oblaganje. Nežno mešati inverzijom.

[0221] Biotinilovani kokošiji anti Protein A. Uzeti jedan alikvot antitelo po ploči u vreme upotrebe. Da bi se kvalifikovali novi lotovi kokošijeg anti-Proteina A konjugovanog sa biotinom, može biti neophodno da se koristi i kvalifikuje zajedno sa istim lotom kokošijeg anti-Protein A iz koga je pripremljen. Neposredno pre upotrebe: Razblažiti biotinilovano antitelo u kazeinu na 37°C ± 2°C do koncentracije određene tokom kvalifikacije biotinilovanog antitela. Na primer: Ukoliko je tokom kvalifikacije koncentracija biotinilovanog antitela koja se stavlja na ploču određena kao 4 µg/mL i koliko je koncentracija stoka 1000 µg/mL, onda treba dodati 48 µL biotinilovanog antitela u 11952 µL kazeina na 37°C ± 2°C. Mešati nežno inverzijom.

[0222] Neutravidin-HRP. Rekonstituisati nove lotove (2 mg/vijalici) do 1 mg/mL kao što sledi: Dodati 400 µL Milli-Q vode u vijalicu, zatim dodati 1600 µL 1X PBS, za ukupno 2 mL. Nežno vorteksovati da se promeša. Uskladištiti na nominalnih -80°C. Pripremiti alikvote sa željenom zapreminom tako da se koristi 1 alikvot po ploči. Pripremiti u polipropilenskoj epruveti. Dodeliti rok trajanja od 6 meseci od datuma pripreme. Na primer, ukoliko je određeno da je radna koncentracija 0.1 µg/mL onda pripremiti kao što sledi. Neposredno pre upotrebe, odmrznuti alikvot Neutravidin-HRP na sobnoj temperaturi. Razblažiti 1 mg/mL Neutravidin rastvora do 0.01 mg/mL (10 µg/mL) sa kazeinom na 37°C ± 2°C. Na primer: Razblažiti X10, dodati 50 µL neutravidina u 450 µL kazeina. Nežno vorteksovati da se promeša, ponovo dodati XIO, dodati 100 µL X10 neutravidina u 900 µL kazeina. Nežno vorteksovati da se promeša. Dodatno razblažiti 10 µg/mL rastvor do 0.1 µg/mL sa kazeinom na 37°C ± 2°C. Na primer: Razblažiti X100, dodati 120 µL neutravidina (10 µg/mL) u 11880 µL kazeina. Nekoliko puta invertovati da se promeša.

[0223] Stop rastvor (korišćena je kupljena 1 N fosforna kiselina.) Uskladištiti na ambijentalnoj temperaturi do 1 godine od datuma prijema. Pufer za razblaživanje (IX PBS 4.1% Triton X100 10% kazein, pH 7.4). Dodati 86 mL 1X PBS 0.1% Triton X100, pH 7.4 (iz Koraka 5.3) u čašu ili bocu, dodati 4 mL Triton X-100, i 10 mL kazeinskog blokatora u PBS, i mešati da se razblaži/promeša. Može biti potrebno od 20 do 30 minuta da se rastvori triton. Ovo je jednako 1X PBS 4.1% Triton X100 10% kazein, pH 7.4 rastvoru. Filtrirati kroz 0.22 CA µm sterilni filter. Pripremiti sveže za svaku upotrebu. Ovo je dovoljno za jednu ploču.

[0224] Protein A Standardi (Antigen Standardi). Napomena: Stokovi uskladišteni na nominalnih -20°C u 70 µmL alikvotima. Odmrznuti alikvot na ledu. Izvesti serijska razblaženja prema primerima u tabeli u nastavku polipropilenske epruvete sa puferom za razblaživanje (videti prethodno) korišćenjem koncentracije naznačene na COA proizvođača: Na primer ukoliko COA navodi da je koncentracija stoka 2.1 mg/mL (2100000 ng/mL) onda: Odmrznuti uzorke na ledu. U polipropilenskim epruvetama za mikrocentrifugu, razblažiti finalne uzorke u masi do 20 mg/mL u puferu za razblaživanje (prethodno). Izvesti 2 zasebna razblaživanja. Zabeležiti koncentraciju. Koristiti rastvore u nastavku za pripremu spajkovanih uzoraka i za pripremu 10 mg/mL rastvora. Na primer: Cone. (mg/mL) zapr. µL X mg/mL rastvora zapr. razblaživača (µL) Serijsko razblaženje od 120 stok uzoraka. U polipropilenskim epruvetama za mikrocentrifugu, dodatno razblažiti 20 mg/mL rastvore do 10 mg/mL u puferu za razblaživanje.

[0225] Pripremanje spajka. U polipropilenskoj epruveti za mikrocentrifugu, pripremiti 0.296 ng/mL Protein A spajka iz 0.593 ng/mL standarda prethodno pripremljenog u Koraku 6.1 njegovim razblaživanjem 2 X sa puferom za razblaživanje. Izvesti jedno razblaživanje. Triplikati bunarčića za 0.296 ng/mL spajk rastvor biće stavljeni na ploču. Koristiti 0.593 ng/mL standardni rastvor iz Koraka 6.1 za spajkovanje uzoraka.

[0226] Priprema spajkovanih uzoraka. U polipropilenskim epruvetama za mikrocentrifugu, spajkovati 500 µL od svakog 20 mg/mL finalne mase rastvora sa 500 µL 0.593 ng/mL spajk rastvora. Zadržati za denaturaciju. Triplikati bunarčića za svaki spajkovani uzorak biće stavljeni na ploču sa ukupno 6 bunarčića.

[0227] Priprema kontrole. Uzeti lot ABT-308 supstance leka. Pripremiti 150 µL alikvote i uskladištiti zamrznute na nominalnih - 80 °C tri godine od datuma pravljenja alikvota.

[0228] Radna kontrola: Odmrznuti alikvot kontrole na ledu. U polipropilenskoj epruveti za centrifugu, razblažiti kontrolu do 10 mg/mL sa puferom za razblaživanje do finalne zapremine od 1000 µL. Pripremiti jedno razblaženje. Zadržati za denaturaciju. Triplikati bunarčića biće stavljeni na ploču.

[0229] Denaturacija. Za blankove ploča, dodati 1000 µL pufera za razblaživanje u epruvete za mikrocentrifugu jednako broju blankova koji će biti pušteni na ploči. Čepovi epruveta se mogu obložiti parafilmom da bi se sprečilo da se otvore rokom zagrevanja ili se drugi red može staviti iznad njih da bi čepovi ostali zatvoreni. Zagrejati standarde, ne-spajkovane uzorke, spajkovane uzorke, spajk, blankove, i kontrolu, na 95°C ± 2°C 15 minuta. Ukloniti parafilm, ukoliko je korišćen, sa epruveta tokom hlađenja. Dozvoliti da se ohladi 15 minuta, i centrifugirati 5 minut na približno 10000 rpm. Preneti 700 µL supernatanta u mikroepruvete za stavljanje na ploču. Paziti da se uskomeša talog triton/proteina.

[0230] Uputstva za postavku ispirača ploča i vodeno kupatilo. Napuniti bocu ispirača ploča sa puferom za ispiranje ploča (pogledati Korak 5.3, 1X PBS 0.1% Triton X-100). Prajmovati ispirač ploča. Proveriti sledeće parametre: Parametri treba da budu postavljeni na: Tip ploče: 1 za svaki ciklus (ukupno 4 ciklusa): Asp brzina: 10 mm/s; Zapremina: 400 µl; Vreme natapanja: 5 sekundi; Asp. vreme: 6 sekundi. Uključiti vodeno kupatilo i podesiti na 95°C. Dozvoliti ekvilibraciju temperature vodenog kupatila do 95°C ± 2°C najmanje 30 minuta.

[0231] Postupak analize: kontrolna lista se može koristiti kao uputstvo za štikliranje završenih koraka. Dodatno, zabeležiti svu opremu korišćenu tokom analize. Količina alikvota kazeina koja će se koristiti za svaki dan analize mora se držati na 37°C ± 2°C. Pufer za oblaganje i supstrat se koriste hladni. Pripremiti standard, uzorak, kontrolu, spajka, i spajkovane uzorke pre i tokom blokirajuće inkubacije. Može trebati duže od 1 časa da se blokira inkubacija da se pripreme razblaženja, prenesu u ependorf epruvete, denaturiše 15 minuta, ohladi 15 minuta, centrifugira 5 minuta, i prenese u mikroepruvete. Dozvoliti najmanje 40 minuta pre blokiranja ploča. Uzorci, spajkovani uzorci, standardi, kontrola, analitički spajk, i blankovi, su stavljeni na ploču horizontalno od redova B do G korišćenjem 12 kanalne pipete. Standardi su napunjeni od visoke do niske koncentracije. Oblaganje ploče, dodavanje biotina, dodavanje neutravidina, dodavanje supstrata, i dodavanje stop rastvora su urađeni vertikalno od kolona 2 do 11.

[0232] Oblaganje ploče sa 100 µL/bunarčiću antitela za oblaganje u hladnom 50 mM natrijum bikarbonatu. Lupkati bočnu stranu ploče do uniformnog pokrivanja dna bunarčića sa rastvorom za oblaganje, pokriti sa trakom za zatvaranje i inkubirati na nominalnih 4°C uz šejkiranje na šejkeru za ploče (ili ekvivalentu) na brzini 3.

[0233] Nakon inkubacije preko noći, ukloniti ploču iz frižidera i omogućiti ekvilibrisanje na sobnu temperaturu. Istresti oblogu. Blotovati ploču na papirnom ubrusu. Blokirati sa 300 µL/bunarčiću kazeina na 37°C ± 2°C, pokriti sa trakom za zatvaranje i inkubirati na 37°C ± 2°C uz šejkiranje na Lab-line Environ šejkeru za ploče (ili ekvivalentnom) na 80 rpm ± 5 rpm 1 čas ± 10 minuta.

[0234] Pripremiti standard, uzorak, kontrolu, spajk, i spajkovane uzorke pre i tokom blokirajuće inkubacije. Isprati ploču 4 puta sa puferom za ispiranje. Blotovati ploču na papirnom ubrusu. Korišćenjem 8-kanalne pipete, pipetirati 100 µL/bunarčiću denaturisanih standarda, uzoraka, spajkova, spajkovanih uzoraka, blankova, i kontrole u triplikatu bunarčića ploče. Spoljni bunarčići ploče se ne koriste, dodati netretirani bufer za razblaživanje ovim bunarčićima. Pokriti sa trakom za zatvaranje i inkubirati na 37°C ± 2 C uz šejkiranje na Labline Environ šejkeru ploča (ili ekvivalentu) na 80 rpm ± 5 rpm 2 časa. Ispuniti obrazac za korišćenje kao instrukcije za punjenje ploče.

[0235] Podešavanje čitača ploča. Isprati ploču 4 puta sa puferom za ispiranje. Blotovati ploču na papirnom ubrusu. Dodati 100 µL/bunarčiću biotinilovanog antitela. Pokriti sa trakom za zatvaranje i inkubirati na 37°C ± 2°C uz šejkiranje na Lab-line Environ šejkeru za ploče (ili ekvivalentu) na 80 rpm ± 5 rpm 1 čas.

[0236] Isprati ploču 4 puta sa puferom za ispiranje. Blotovati ploču na papir. Dodati 100 µL/bunarčiću rastvora eutravidin-HRP konjugata. Pokrenuti tajmer odmah po dodavanju neutravidina u poslednji red. Pokriti sa trakom za zatvaranje i inkubirati na 37°C ± 2°C uz šejkiranje na Lab-line Environ šejkeru za ploče (ili ekvivalentu) na 80 rpm ± 5 rpm 30 minuta. Isprati ploču 4 puta sa puferom za ispiranje. Blotovati ploču na papirnom ubrusu. Dodati 100 µL/bunarčiću hladnog K-Blue supstrata, pokriti sa trakom za zatvaranje i inkubirati na sobnoj temperaturi 10 minuta (pokrenuti tajmer odmah po dodavanju supstrata u prvi red), uz brzinu šejkiranja od 3 na Lab-line šejkera za titrovanje ploče (ili ekvivalentu). Zaustaviti reakciju dodavanjem 100 µL/bunarčiću 1 N fosforne kiseline. Postaviti ploču na šejker ploče na brzini 3 tokom 3 minuta. Očitati ploču na 450 nm.

[0237] Analiza podataka i izračunavanja Napomena: Prihvaćeni su samo uzorci, spajkovi, spajkovani uzorci, i kontrola, sa optičkim gustinama koje su unutar granica praktične kvantifikacije standardne krive i koji ispunjavaju u nastavku navedene kriterijume za % CV ili % razlike. Ukoliko su OD uzoraka ispod standardne krive, rezultat treba da se zabeleži kao manji od 0.18 ng/mL (LOQ analiza). Ovu vrednost zatim treba podeliti sa koncentracijom razblaženog uzorka (10 mg/mL) da bi se zabeležila vrednost u ng/mg. Ukoliko uzorak ima visoku koncentraciju Proteina A koja dovodi do toga da ne-spajkovani i/ili spajkovani uzorak bude iznad standardne krive (2 ng/mL), onda razblažiti dodatno da bi bilo unutar standardne krive. Ovu vrednost treba zatim podeliti sa koncentracijom razblaženog uzorka da bi se zabeležila vrednost u ng/mg. Za izračunavanje rekuperacije spajka, oduzeti vrednost nespajkovanog uzorka (ng/mL) od vrednosti spajkovanog uzorka (ng/mL) čak i kada je vrednost ne-spajkovanog uzorka (ng/mL) ispod krive. Ukoliko je vrednost negativna ili je dobijen ’opseg’ onda smatrati ne-spajkovani uzorak kao nulu za izračunavanja rekuperacije spajka.

[0238] Standardna kriva. Standardne koncentracije treba uneti u obrazac protokola. Korišćeno je kvadratno fitovanje krive. Koeficijent determinacije mora biti = 0.99 i % CV između triplikata bunarčića mora biti = 20%. Ukoliko ovi kriterijumi nisu ispunjeni: Jedan standard (1 nivo, 3 bunarčića) može se izostaviti. Ukoliko je izostavljeno 0.18 ng/mL, prihvatljivi su samo uzorci i spajkovani uzorci sa optičkim gustinama koje potpadaju unutar 0.26 ng/mL i 2 ng/mL (preostale tačke standardne krive) optičkih gustina. Dodatno, za triplikate svakog standardnog nivoa, ukoliko je jedan bunarčić jasno kontaminiran ili pokazuje nisko vezivanje, može se izostaviti. Ukoliko je bunarčić izostavljen iz standardnog nivoa, preostale replike moraju imati % razlike = 20%. % CV za najniži standard, koji pokazuje vrednosti OD blizu bazalnih (blankovi) ploče, treba da bude = 30%. Ukoliko je izostavljen jedan bunarčić, % razlike za preostale replike mora biti = 35%. Ukoliko je izostavljen najniži standard, prihvatljivi su samo uzorci i spajkovani uzorci sa optičkim gustinama koje potpadaju unutar preostalih nivoa optičkih gustina standardne krive.

[0239] Izračunati % razlike kao što sledi: % razlike = (Aps. (rezultat razblaženje 1 – rezultat razblaženje 2)/srednja vrednost) X 100%. Analiza se mora ponoviti ukoliko standardi ne ispunjavaju prethodne kriterijume. Zabeležiti rezultat vrednosti % CV i/ili % razlike i koeficijent determinacije standardne krive.

[0240] Uzorci. % CV treba da bude = 20% između triplikata bunarčića. Zabeležiti % CV između triplikata bunarčića. Može se izostaviti jedan bunarčić iz svakog razblaženja uzorka. Preostala ponavljanja moraju imati % razlike od = 20%. Napomena: Ukoliko je OD nespajkovanog uzorka ispod najniže standardne OD kriterijum za % razlike nije primenjiv na ne-spajkovanje rezultate: Videti izračunavanje u prethodnom tekstu.

1

[0241] Zabeležiti "rezultat za ne-spajkovani uzorak" za svako razblaženje u ng/mL. Ove vrednosti će se koristiti u izračunavanjima rekuperacije spajka. Izračunati srednju vrednost " rezultata za ne-spajkovani uzorak (ng/mL)" i % razlike između razblaženje. Zabeležiti rezultate. % Razlike između razblaženja mora biti = 25%. Izračunati stvarnu koncentraciju Proteina A u ng/mg iz srednje vrednosti (ng/mL) kao što sledi: Protein A (ng/mg) = Srednja vrednost "rezultata za ne-spajkovani uzorak (ng/mL)" koncentracija razblaženog uzorka (10 mg/mL). Zabeležiti rezultat.

[0242] Spajkovi. % CV treba da bude = 20% između triplikata bunarčića. Zabeležiti % CV. Jedan bunarčić iz spajka može da se izostavi. Preostale tačke moraju imati % razlike = 20%. Videti izračunavanje u prethodnom tekstu. Zabeležiti koncentraciju proteina A u ng/mL. Ovaj rezultat će se koristiti u izračunavanjima rekuperacije spajka. Rezultujuća koncentracija za spajk (ng/mL) mora biti ± 20% teoretske koncentracije spajka. Zabeležiti rezultat i naznačiti prošao ili nije prošao. Ukoliko rezultat spajka nije unutar 20% teoretskog, analiza se mora ponoviti. Srednja vrednost koncentracije spajka (ng/mL) x 100 = mora biti 100% ± 20% 0.296 ng/mL

[0243] Spajkovani uzorci. % CV treba da bude = 20% između triplikata bunarčića. Zabeležiti % CV između triplikata bunarčića. Jedan bunarčić iz svakog razblaženja spajkovanog uzorka može se izostaviti. Preostala ponavljanja moraju imati % razlike od = 20%. Videti izračunavanje u prethodnom tekstu. Zabeležiti "rezultat za spajkovani uzorak" za svako razblaženje u ng/mL. Zabeležiti % razlike između duplikata razblaženja. % razlike između razblaženja treba da bude = 25%. Ovi rezultati će se koristiti u izračunavanjima rekuperacije spajka. Izračunati % rekuperaciju spajka za svaki set razblaženja korišćenjem formule u nastavku: % rekuperacije spajka = vrednost spajkovanog uzorka – vrednost ne-spajkovanog uzorka X 100. Vrednost spajka Napomena: Za izračunavanja rekuperacije spajka, oduzeti vrednost ne-spajkovanog uzorka (ng/mL) od vrednosti spajkovanog uzorka (ng/mL) čak i kada je vrednost ne-spajkovanog uzorka (ng/mL) ispod krive. Ukoliko je dobijena negativna vrednost ili ’opseg’ onda smatrati ne-spajkovani uzorak kao nulu za izračunavanja rekuperacije spajka. % Rekuperacije spajka mora biti 100% ± 50% (50% - 150%) za svako razblaženje za svaki uzorak. Zabeležiti rezultate i prošao/nije prošao.

[0244] % kontrole CV trebalo bi da bude = 20% između trostrukih bunarčića. Zabeležiti rezultat % CV. Jedan bunarčić iz kontrole može biti izostavljen. Preostala ponavljanja moraju imati % razlike od = 20%.

Tabela 9. Rezultati analize rezidualnog proteina ćelije domaćina i proteina A Šarža# Protein A (ng/mg) Protein ćelije domaćina

(ng/mg)

2

Tabela 10. Rezultati analize rezidualnog proteina ćelije domaćina i proteina A: Uzorci postupka

Claims

Patentni zahtevi 1. Postupak za proizvodnju preparata anti-IL-13 antitela sa redukovanim proteinom ćelije domaćina (redukovan HCP) iz smeše uzorka koji sadrži anti-IL-13 antitelo i najmanje jedan HCP, pri čemu navedeni postupak sadrži: (a) filtriranje navedene smeše uzorka sa filterom za dubinsku filtraciju i sakupljanje dubinski filtrirane smeše uzorka; (b) dovođenje u kontakt dubinski filtrirane smeše uzorka sa Protein A afinitetnom hromatografskom smolom, ispiranje navedene afinitetne hromatografske smole puferom koji sadrži 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.2, zatim ispiranje puferom koji sadrži 20 mM natrijum citrat/limunsku kiselinu, 0.5 M NaCl, pH 6, i zatim puferom koji sadrži 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.2 i sakupljanje afinitetnog hromatografskog uzorka; (c) podvrgavanje navedenog afinitetnog hromatografskog uzorka redukciji u pH na taj način formirajući uzorak sa redukovanim pH, pri čemu navedeni uzorak sa redukovanim pH ima pH od oko 3 do oko 4; (d) podešavanje pH navedenog uzorka sa redukovanim pH do pH od oko 4.5 do oko 8.5 i dovođenje u kontakt navedenog uzorka sa podešenim pH sa anjonskom izmenjivačkom smolom koja sadrži kvaternarni aminoetil (QAE) anjonski supstituent i sakupljanje jonskog izmenjivačkog uzorka; i (e) dovođenje u kontakt navedenog jonskog izmenjivačkog uzorka sa materijalom za hromatografiju sa hidrofobnom interakcijom (HIC) i sakupljanje HIC uzorka, pri čemu navedeni HIC uzorak sadrži navedeni preparat antitela sa redukovanim HCP, pri čemu oko označava do 20% veće od ili manje od referentne vrednosti, i pri čemu navedeno anti-IL-13 antitelo je humanizovano IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG4, ili IgM antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca od EVTLRESGPGLVKPTQTLTLTCTLYGFSLSTSDMGVDWIRQPPGKGLEWLAHIWWDD VKRYNPALKSRLTISKDTSKNQVVLKLTSVDPVDTATYYCARTVSSGYIYYAMDYW GQGTLVTVSS i varijabilni region lakog lanca od
2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što navedena redukcija u pH u koraku (c) je postignuta mešanjem pogodne kiseline sa navedenom smešom uzorka, izborno pri čemu 4 navedena pogodna kiselina je izabrana iz grupe koja se sastoji od limunske kiseline, sirćetne kiseline i kaprilne kiseline.
3. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što navedeni HIC materijal je: (i) HIC kolona čija stacionarna faza sadrži hidrofobne grupe, ili (ii) HIC kolona čija stacionarna faza sadrži hidrofobne grupe izabrane iz grupe koja se sastoji od alkil-grupa, aril-grupa i njihove kombinacije; ili (iii) agarozna smola supstituisana sa fenil grupom.
4. Postupak prema patentnom zahtevu 1 koji dodatno sadrži korak filtracije, pri čemu navedeni uzorak HIC je podvrgnut filtraciji da bi se uklonile virusne čestice i da bi se olakšala razmena pufera.
5. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačen time što navedeni uzorak sa redukovanim pH u koraku (c) ima pH od oko 3.5.