RS57196B1 - Peptidi - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak odnosi se na peptide, bar na onaj deo koji su izvedeni iz receptora tiroid-stimulišućeg hormona (TSHR). Ovi peptidi mogu biti od koristi pri sprečavanju i/ili lečenju Grejvzove bolesti (GD).

POZADINA PRONALASKA

[0002] Grejvzova bolest je karakteristična po prekomernom reagovanju tiroidne žlezde, što se ispoljava u proizvodnji prekomerne količine tiroidnog hormona i povećanja štitne žlezde (gušavost). Posledično stanje hipertiroidizma može izazvati širok opseg neuropsiholoških i fizičkih simptoma. GD je najčešći uzrok hipertiroidizma (60-90% od svih slučajeva) i obično se ispoljava u toku sredine života, ali takođe pojavljuje se kod dece, adolescenata i starijih osoba. Pogađa do 2% ženske populacije, dok je između pet i deset puta učestalije kod žena u odnosu na muškarce. Pedijatrijska GD pogađa oko 6.000 dece u SAD i 6.000 dece u EU. GD je takođe najčešći uzrok teških hipertiroidizama, koji su praćeni sa više kliničkih znakova i simptoma i laboratorijskih abnormalnosti u poređenju sa blažim oblicima hipertiroidizama.

[0003] Postoji jaka nasledna komponenta povezana sa GD. Ne postoje skorašnja populaciona istraživanja za GD, međutim, nekoliko kvazi-populacionih istraživanja hipertiroidizma postoje i sva procenjuju učestalost i rasprostranjenost GD i stoga su približna. Učestalost hipertiroidizma je u opsegu od 26:100.000 do 93:100.000 i uopštena rasprostranjenost procenjena je da iznosi 1,3%, gde je 42% od svih slučajeva očigledno a 62% subkliničko.

[0004] Oko 30-50% svih ljudi sa GD takođe će imati Grejvzovu oftalmopatiju (GO), isturenje jednog ili oba oka. Mnogi slučajevi GO su blagi i samostalno ograničavajući, međutim 20% slučajeva ima znatnu/umerenu do ozbiljnu bolest, gde bar polovina ima potrebu za steroidima i 3-5% GO pacijenata imaju bolnu, bolesti koja može ugroziti vid sa distiroidnom optičkom neuropatijom (DON). Pomeranje očiju takođe može izazvati ozbiljno sušenje rožnjače kako kapci nisu u stanju da se zatvore u toku noći. Povišeni pritisak u optičkom nervu može dovesti do defekata vidnog polja i gubitka vida. GO može takođe biti povezana sa pretibijalnim miksedemom.

[0005] Simptomi i znaci GD praktično svi se ispoljavaju u direktnim i indirektnim efektima hipertiroidizma, gde su glavni izuzeci GO, gušavost i prebijalni miskedem. Simptomi hipertiroidizma mogu obuhvatati insomniju, drhtanje ruku, hiperaktivnost, gubitak kose, prekomerno znojenje, netoleranciju toplote i gubitak težine uprkos povećanom apetitu. Dalji znaci su najčešće difuzno uvećana (obično simetrično) tiroidna žlezda koja nije blaga, kašnjenje treptanja, prekomerna lakrimacija usled Grejvzove oftalmopatije, aritmije srca i hipertenzija. Tirotoksični pacijenti mogu iskusiti promene u ponašanju i ličnosti, kao što su psihoza, agitacija i depresija. Kod blažih hipertiroidizama, pacijenti mogu iskusiti manje uočljive manifestacije, na primer, anksioznost, umor, razdražljivost i emocionalnu labilnost.

[0006] Trenutno ne postoji lek dostupan za GD i stoga trenutno lečenje usmereno je prema pronalaženju simptoma koji se ispoljavaju. Postoje tri modaliteta lečenja za GD, oralni antitiroidni lekovi (ATD), radioaktivni jod (RAI) i tirodetektomija. Druga dva ispoljavaju se u životnoj suplementaciji tiroidnih hormona. Terapija sa radiojodom je najčešće lečenje u Sjedinjenim Američkim Državama, dok su ATD prvi vid lečenja u Evropi, Japanu i većini ostatka sveta.

[0007] ATD lečenje povezano je sa nekim retkim neželjenim dejstvima i ima stopu remisije od 50-60%. Postoji prepoznavanje u porastu da RAI može ubrzati i pogoršati GO i broj pacijenata koji se leče sa ATD u Sjedinjenim Američkim Državama se povećava.

[0008] Usled promenljivog uspeha takvih opcija lečenja, pacijenti se često izlažu jednom ili više pristupa ukoliko se prvo pokušano lečenje nije pokazalo kao potpuno uspešno. Rizik povraćaja ili naknadnog hipotiroidizma je značajan i generalna delotvornost dostupnih lečenja GD je manja nego što je poželjno. Stoga postoji potreba za alternativnim terapijama za GD koje su delotvorne pri lečenju GD i pri ublažavanju ili umanjenju simptoma bolesti.

OPIS SLIKA

[0009]

Slika 1: Imunogenicitet RNB-5 kod DR3 miševa. Dati su miševi (N=2 mužjaka; N=2 ženki) sa RNB-5 i nakon 10 dana, LN ćelije (objedinjene po polu) i splenociti su kultivisani sa različitim koncentracijama peptida i proliferacija ćelija je izmerena. Indeksi stimulacije (SI) predstavljaju odnos inkorporacije timidina peptidomstimulisane kulture za ne-stimulisane kulture. F, ženke; M, mužjaci; LN, limfni čvorovi.

Slika 2: Identifikacija apitopa u RNB-5. DR3 miševi su imunizirani sa RNB-5/CFA i stvoreni su hibridomi.5x10<4>TSHR-specifičnih ćelija hibridoma je kultivisano sa 5x10<4>svežih (crne kolone) ili fiksiranih (bele kolone) VAVY ćelija i 25 µg/mL antigena (RNB-5 ili RNB-5 grupisanog peptida). Reprezentativni klonovi su prikazani. Nakon 48h, antigen-indukovana IL-2 proizvodnja je izmerena. Grafikon prikazuje srednju vrednost duplikata merenja i rezultati predstavljaju 2 nezavisna eksperimenta. APC, antigen predstavljajuća ćelija.

Slika 3: Identifikacija apitopa u RNB-5. DR4 miševi su imunizirani sa TSHR/CFA i stvoreni su hibridomi.5x10<4>TSHR-specifičnih ćelija hibridoma je kultivisano sa 5x10<4>svežih (crne kolone) ili fiksiranih (bele kolone) BM14 ćelija i 25 µg/mL antigena (RNB-5 ili RNB-5 grupisanog peptida). Reprezentativni klonovi su prikazani. Nakon 48h, antigen-indukovana IL-2 proizvodnja je izmerena. Grafikon prikazuje srednju vrednost duplikata merenja i rezultati predstavljaju 2 nezavisna eksperimenta. APC, antigen predstavljajuća ćelija.

Slika 4A: Identifikacija apitopa u RNB-4. DR4 miševi su imunizirani sa TSHR-CFA i stvoreni su hibridomi.5x10<4>TSHR-specifičnih ćelija hibridoma je kultivisano sa 5x10<4>svežih (crne kolone) ili fiksiranih (bele kolone) BM14 ćelija i 25 µg/mL antigena (TSHR, RNB-5 ili RNB-4 grupisanog peptida). Reprezentativni klonovi su prikazani. Nakon 48h, antigen-indukovana IL-2 proizvodnja je izmerena i prikazana kao OD vrednosti. Grafikon prikazuje srednju vrednost duplikata merenja i rezultati predstavljaju 3 nezavisna eksperimenta. APC, antigen predstavljajuća ćelija.

Slika 4B: Identifikacija apitopa u RNB-4. DR4 miševi su imunizirani sa TSHR/CFA i stvoreni su hibridomi.5x10<4>TSHR-specifičnih ćelija hibridoma je kultivisano sa 5x10<4>svežih (crne kolone) ili fiksiranih (bele kolone) BM14 ćelija i antigenom (25 µg/mL TSHR od RNB-4; 100 µg/mL RNB-4 grupisanog peptida). Nakon 48h, antigen-indukovana IL-2 proizvodnja je izmerena i prikazana kao OD vrednosti. Slika 5: Ex vivo protokol tolerizacije. A, Miševi su subkutano ubrizgani na kraju vrata sa 100 µg peptida na dane -8, -6 i -4 (raspored velike doze). Na dan 0, miševi su subkutano ubrizgani na početku repa sa RNB-5/CFA. B, Miševi su subkutano ubrizgani na kraju vrata sa 0,1 µg, 1 µg i 10 µg na dane -15, -13 i -11, što je praćeno sa 3 injekcije od 100 µg na dane -8, -6 i -4 (raspored povećanja doze). Na dan 0, miševi su subkutano ubrizgani na početku repa sa TSHR/CFA ili peptid/CFA. Za oba rasporeda, miševi su žrtvovani 10 dana nakon imunizacije u svrhu merenja proliferacije LN ćelija i splenocita nakon ponovnog TSHR stimulisanja.

Slika 6: Ex vivo indukcija tolerancije pomoću RNB-5 apitopa. Miševi su penetrirani sa RNB-5 apitopima u skladu sa rasporedom velike doze (A-B) ili rasporedom povećanja doze (C-F). Podaci predstavljaju srednju vrednost ± SEM SI vrednosti za PBS-tretirane miševe (crne linije) i peptidom-tretirane miševe (crvene linije).

Grafikoni A, B, C, E i F predstavljaju eksperimente izvršene na DR3 miševima, grafikon D predstavlja eksperiment izvršen na DR4 miševima. 2-člana ANOVA je korišćena za merenje ukupnog dejstva lečenja na proliferaciju T ćelija i p-vrednosti su ispisane u grafikonima. Bonferroni post-hoc testiranje je korišćeno i značajne razlike su ukazane na grafikonima (* p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001). SI, indeks stimulacije; LN, limfni čvorovi.

Slika 7: Ex vivo indukcija tolerancije pomoću RNB-9 apitopa. DR3 miševi su penetrirani sa RNB-9B u skladu sa rasporedom povećanja doze (A, C) ili RNB-9C (B,D). Podaci predstavljaju srednju vrednost ± SEM SI vrednosti za PBS-tretirane miševe (crne linije) i peptidom-tretirane miševe (crvene linije).2-člana ANOVA je korišćena za merenje ukupnog dejstva lečenja na proliferaciju T ćelija i p-vrednosti su ispisane u grafikonima. Bonferroni post-hoc testiranje je korišćeno i značajne razlike su ukazane na grafikonima (* p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001). SI, indeks stimulacije; LN, limfni čvorovi.

Slika 8: Nivoi TSHR antitela (ukupna IgG) mereni pomoću ELISA. Miševi su imunizirani jednom (grupa A+B) ili dva puta (grupa C) sa 50 µg TSHR u adjuvansu. OD vrednosti su prikazane za svaku grupu kao srednja vrednost ± SEM.

Slika 9: T4 nivoi seruma u LacZ-Ad i Ad-TSHR-Ad imuniziranim miševima.

Prikazani podaci su pojedinačne vrednosti za miševe iz različitih grupa pre (A), 4 nedelje nakon (B) i 10 nedelja nakon (C) prvog imuniziranja. Broj hipertiroida u odnosu na ukupan broj za svaku grupu je ukazan. Miševi se smatraju da su hipertiroidni kada njihovi T4 nivoi prelaze srednju vrednost 2SD za T4 vrednosti u serumu u LacZ-Ad imuniziranim miševima. Srednji T4 nivoi nizu značajno različiti između TSHR-Ad i LacZ-Ad ubrizganih miševa u 4. ili 10. nedelji. Jednočlana ANVA, Bonferroni post-hoc testiranje, p<0,05 se smatraju značajno različitim.

Slika 10: Nivoi anti-TSHR antitela (ukupno IgG, ELISA) u LacZ-Ad i TSHR-Ad imunizovanim miševima. Prikazani podaci su pojedinačne vrednosti za miševe iz različitih grupa pre (A), 4 nedelje nakon (B) i 10 nedelja nakon (C) prve imunizacije. Statistička analiza izvršena je sa jednočlanom ANOVA i Bonferroni post-hoc testiranjem. Značajne razlike ukazane su na grafikonima (* p<0,05; ** p<0,01). Slika 11: Odgovor TSHR- i RNB-5-specifičnih hibridom klonova, izolovanih iz HLA-DR3 ili HLA-DR4 miševa imuniziranih sa TSHR/CFA, na RNB-5D modifikovane peptide. Hibridom klonovi (prikazani u različitim bojama) su kultivisani sa svežim APC i 25 µg/mL antigena 48 sati pre određivanja IL-2 proizvodnje. Zamenjivanje aminokiselina u centralnom regionu RNB-5D-GKK ili RNB-5D-KKK ometa prepoznavanje od strane hibridom klonova, ukazujući da su te aminokiseline značajne u regionu epitopa.

Slika 12: Odgovor TSHR- i RNB-5-specifičnih hibridom klonova, izolovanih iz HLA-DR3 ili HLA-DR4 miševa imuniziranih sa TSHR/CFA, na RNB-5D modifikovane peptide. Hibridom klonovi (prikazani u različitim bojama) su kultivisani sa svežim (pune kolone) ili fiksiranim (prazne kolone) APC i 25 µg/mL antigena 48 sati pre određivanja IL-2 proizvodnje.

Slika 13: Odgovor TSHR- i RNB-5-specifičnih hibridom klonova, izolovanih iz HLA-DR3 ili HLA-DR4 miševa imuniziranih sa TSHR/CFA, na RNB-5D modifikovane peptide. Hibridom klonovi (predstavljeni u različitim bojama) su kultivisani sa svežim APC i 25 µg/mL antigena 48 sati pre određivanja IL-2 proizvodnje.

Slika 14: Odgovor TSHR- i RNB-5-specifičnih hibridom klonova, izolovanih iz HLA-DR3 ili HLA-DR4 miševa imuniziranih sa TSHR/CFA, na RNB-4D modifikovane peptide. Hibridom klonovi (predstavljeni u različitim bojama) kultivisani su sa fiksiranim APC i 25 µg/mL antigena 48 sati pre određivanja IL-2 proizvodnje.

Slika 15: Odgovor TSHR- i RNB-5-specifičnih hibridom klonova, izolovanih iz HLA-DR3 ili HLA-DR4 miševa imuniziranih sa TSHR/CFA, na RNB-5D modifikovane peptide. Hibridom klonovi (predstavljeni u različitim bojama) su kultivisani sa svežim i fiksiranim APC i 25 µg/mL antigena 48 sati pre određivanja IL-2 proizvodnje.

Slika 16: Ex vivo indukcija tolerancije sa RNB 4K-GKK u DR4 miševima u skladu sa rasporedom povećanja doze.2-člana ANOVA je korišćena za merenje ukupnog dejstva lečenja na proliferaciju T ćelija i p-vrednosti su zapisane na grafikonima. Bonferroni post-hoc testiranje je korišćeno i značajne razlike su ukazane na grafikonima (* p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001) Podaci predstavljaju srednju vrednost ± SEM za PBS-tretirane (crne linije) i peptidom tretirane miševe (crvene linije). SI indeks stimulacije; LN limfni čvorovi

Slika 17: Identifikacija RNB12 regiona pomoću reaktivnosti linije T ćelija dobijene od pacijenata sa Grejvzovom bolešću. Linija T ćelija stvorena je stimulisanjem izolovanih PBMC iz pacijenta sa Grejvzovom bolešću sa RNB 12 tokom 12 dana. Nakon dodatnog ponovnog stimulišućeg ciklusa od 12 dana, RNB12 specifične T ćelije testirane su na prepoznavanje pojedinačnih grupisanih peptida u RNB12 regionu. SI, indeks stimulacije

Slika 18: Identifikacija apitopa u RNB12 regionu upotrebom RNB12 specifičnih TLC dobijenih iz zdravog donora. RNB12 specifične T ćelije su kultivisane sa BM14, ljudska linija ćelija koja vrši ekspresiju ljudskih MHC klase II molekula u prisustvu peptida. Crne kolone predstavljaju stimulisanje u prisustvu svežih ali ozračenih BM14 ćelija i bele kolone prisustvo fiksiranih APC. (Videti materijale i metode). Pre dodavanja 3H-timidina kulturama, supernatant kulture je ohlađen i zamrznut.

Supernatant je analiziran za IFN gama (A) kako bi se potvrdio odgovor (B) na proliferaciju T ćelija. TCL, T ćelijska linija; APC, antigen predstavljajuća ćelija; MHC klasa II, glavni histokompatibilni kompleks klase II; SI, indeks stimulacije; OD, optička gustina.

Slika 19: Primeri Ex vivo tolerancije indukovane modifikovanim RNB5D modifikovanih peptida u DR3 miševima na osnovu rasporeda povećanja doze.2-člana ANOVA je korišćena za merenje ukupnog dejstva lečenja na proliferaciju T ćelija i pvrednosti su zapisane na grafikonima. (* p<0,05; ** p<0.01; *** p<0.001; **** p<0.0001) Podaci predstavljaju srednju vrednost ± SEM za PBS-tretirane (crne linije) i peptidom tretirane miševe (crvene linije). SI indeks stimulacije. A: RNB5D-K1; B: RNB5D-K3; C: RNB5D-K16

Slika 20: Grafikon koji prikazuje status apitopa za RNB5D modifikovanih peptida. Primer odgovora TSHR- i RNB-5-specifičnog hibridom klona, izolovanog iz HLA-DR3 i HLA-DR4 miševa imuniziranih sa TSHR/CFA, na RNB-5D modifikovane peptide. Hibridom klon je kultivisan sa svežim (crne kolone) i fiksiranim (bele kolone) APC i 25 µg/ml antigena 48 sati pre određivanje IL-2 proizvodnje.

REZIME ASPEKATA PRONALASKA

[0010] Predmetni pronalazači identifikovali su broj peptida izvedenih iz TSHR koji su od koristi pri sprečavanju i/ili lečenju GD.

[0011] U prvom aspektu predmetni pronalazak daje peptid koji je sposoban da se veže za MHC molekul in vitro i da bude prezentovan T ćeliji bez antigen procesiranja, koji je izabran iz sledećeg:

[0012] Peptid može biti izabran iz sledećih TSHR peptida i njihovih derivata:

[0013] Peptid može sadržati RNB 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 4J, 4K, 9A, 9B, 9C, 9D, 12A ili 12B sekvencu, ili njihove varijante u kojima je jedna ili više aminokiselina bila zamenjena sa drugom aminokiselinom, kao što je K, koja je bila modifikovana na jednom ili oba kraja, na primer, uvođenjem „GKK“ ili „KKK“ sekvenci.

[0014] Peptid može sadržati RNB-5D sekvencu, ili njenu varijantu u kojoj jedna ili više aminokiselina bilo zamenjeno sa drugom aminokiselinom, kao što je K, koja je bila modifikovana na jednom ili oba kraja, na primer, uvođenjem „GKK“ ili „KKK“ sekvenci.

[0015] Ovde je opisan peptid koji sadrži sekvencu:

KK-(G/K)-aa1-(RNB-5D peptide)-aa2-aa3-Z-(G/K)-KK

gde aa1 je br amino kiselina, I, K ili T;

RNB-5D peptid je YVSIDVTLQQLE, ili njegova varijanta u kojoj je jedna ili više aminokiselina bilo zamenjeno sa K,

aa2 je br amino kiselina, S ili K;

aa3 je br amino kiselina, H ili K

koji je sposoban da se veže za MHC molekul in vitro i da bude prezentovan T ćeliji bez antigen procesiranja.

[0016] U ovom otelotvorenju, RNB-5D peptid može biti YVSIDVTLQQLE, ili njegova varijanta u kojoj su jedna, dve ili tri aminokiseline zamenjene sa K.

[0017] Peptid prema pronalasku

može biti izabran iz sledeće grupe, gde su svi identifikovani da su apitopi (Tabela 1) :

KKGIYVSIDVTLQQLESHGKK (SEQ ID No 12), KKGKYVSIDVTLQQLESHGKK (SEQ ID No 22), IGCGIKVSIDVTLQQLESHGKK (SEQ ID No 23), KKGIYKSIDVTLQQLESHGKK (SEQ ID No 24), KKGIYVSIDVKLQQLESHGKK (SEQ ID No 25), KKGIYVSIDVTLQKLESHGKK(SEQ ID No 26), KKGIYVSIDVTLQQKESHGKK (SEQ ID No 27), KKGIYVSIDVTLQQLKSHGKK (SEQ ID No 28), KKGIYVSIDVTLQQLEKHGKK (SEQ ID No 29), KKGIYVSIDVTLQQLESKGKK (SEQ ID No 30), KKGYVSIDVTLQQLEGKK (SEQ ID No 31), KKGYVSIDVKLQQLEGKK (SEQ ID No 32), KKGYVSIDVTLQKLEGKK (SEQ ID No 33), KKGYVSIDVTLQQKEGKK (SEQ ID No 34), KKGYVSIDVKLQKKEGKK (SEQ ID No 35), KKGIYVSIDVTLQQLEGKK (SEQ ID No 36), KKGIYVSIDVKLQQLEGKK (SEQ ID No 37), KKGIYVSIDVTLQKLEGKK (SEQ ID No 38), KKGIYVSIDVTLQQKEGKK (SEQ ID No 39), KKGIYVSIDVKLQKKEGKK (SEQ ID No 40), KKGTYVSIDVTLQQLEGKK (SEQ ID No 41), KKGTYVSIDVELQQLEGKK (SEQ ID No 42), KKGTYVSIDVTLQKLEGKK (SEQ ID No 43), KKGTYVSIDVTLQQKEGKK (SEQ ID No 44), KKGTYVSIDVKLQKKEGKK (SEQ ID No 45), KKKIYVSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No 21), KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No 46), KKKIKVSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No 47), KKKIYKSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No 48), KKKIYVKIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No 49), KKKIYVSIDVKLQQLESHKKK (SEQ ID No 50), KKKIYVSIDVTLKQLESHKKK (SEQ ID No 51), KKKIYVSIDVTLQKLESHKKK (SEQ ID No 52), KKKIYVSIDVTLQQKESHKKK (SEQ ID No 53), KKKTYVSIDVTLQQLKSHKKK (SEQ ID No 54), KKKIYVSIDVTLQQLEKHKKK (SEQ ID No 55), KKKIYVSIDVTLQQLESKKKK (SEQ ID No 56), KKKYVSIDVTLQQLEKKK (SEQ ID No 57), KKKYVSIDVKLQQLEKKK (SEQ ID No 58), KKKYVSIDVTLQKLEKKK (SEQ ID No 59), KKKYVSIDVTLQQKEKKK (SEQ ID No 60), KKKYVSIDVKLQKKEKKK (SEQ ID No.

61).

[0018] Peptid može biti izabran iz sledeće grupe, gde su svi identifikovani kao apitopi i imaju poboljšanu rastvorljivost: KKGKYVSIDVTLQQLESHGKK (SEQ ID No.22), KKGIYKSIDVTLQQLESHGKK (SEQ ID No.24), KKGYVSIDVTLQQLEGKK (SEQ ID No. 31), KKGYVSIDVKLQQLEGKK (SEQ ID No.32), KKGYVSIDVTLQKLEGKK (SEQ ID No.33), KKGYVSIDVTLQQKEGKK (SEQ ID No.34),

1

KKGYVSIDVKLQKKEGKK (SEQ ID No.35), KKGIYVSIDVKLQKKEGKK (SEQ ID No. 40), KKGTYVSIDVKLQQLEGKK (SEQ ID No.42), KKGTYVSIDVKLQKKEGKK (SEQ ID No.45), KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No.46), KKKIYKSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No.48), KKKIYVKIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No.49), KKKYVSIDVTLQQLEKKK (SEQ ID No.57), KKKYVSIDVKLQQLEKKK (SEQ ID No.58), KKKYVSIDVTLQQKEKKK (SEQ ID No.60), KKKYVSIDVKLQKKEKKK (SEQ ID No.61).

[0019] Peptid može biti izabran iz sledeće grupe, gde su svi identifikovani kao apitopi i imaju najbolju rastvorljivost: KKGIYKSIDVTLQQLESHGKK (SEQ ID No.24), KKGYVSIDVKLQQLEGKK (SEQ ID No 32), KKGYVSIDVTLQKLEGKK (SEQ ID No.

33), KKGYVSIDVTLQQKEGKK (SEQ ID No.34), KKGYVSIDVKLQKKEGKK (SEQ ID No. 35), KKGTYVSIDVKLQQLEGKK (SEQ Id No.42), KKGTYVSIDVKLQKKEGKK (SEQ ID No.45), KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No.46), KKKIYKSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No.48), KKKYVSIDVTLQQLEKKK (SEQ ID No. 57), KKKYVSIDVTLQQKEKKK (SEQ ID No.60).

[0020] Sledeći peptidi naročito su od interesa: KKGYVSIDVTLQKLEGKK (SEQ ID No.

32), KKGYVSIDVKLQKKEGKK (SEQ ID No.34), KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No.46), KKKIYKSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No.48), KKKYVSIDVTLQQLEKKK (SEQ ID No.57), KKKYVSIDVTLQQKEKKK (SEQ ID No.

60).

[0021] U drugom aspektu predmetni pronalazak daje sastav koji sadrži više peptida, uključujući jedan ili više peptid(a) u skladu sa prvi aspektom pronalaska.

[0022] U trećem aspektu, predmetni pronalazak daje peptid u skladu sa prvim aspektom pronalaska, ili sastav u skladu sa drugim aspektom pronalaska, za upotrebu u suzbijanju ili sprečavanju proizvodnje TSHR autoantitela in vivo.

[0023] U četvrtom aspektu, predmetni pronalazak daje peptid u skladu sa prvim aspektom pronalaska, ili sastav u skladu sa drugim aspektom pronalaska, za upotrebu pri lečenju i/ili sprečavanju Grejvzove bolesti kod pacijenta.

[0024] U petom aspektu, predmetni pronalazak daje upotrebu peptida u skladu sa prvim aspektom pronalaska, ili sastav u skladu sa drugim aspektom pronalaska, u proizvodnji medikamenta za suzbijanje ili sprečavanje proizvodnje TSHR autoantitela in vivo.

[0025] U šestom aspektu, predmetni pronalazak daje upotrebu peptida u skladu sa prvim aspektom pronalaska, ili sastav u skladu sa drugim aspektom pronalaska, u proizvodnji medikamenta za lečenje i/ili sprečavanja Grejvzove bolesti.

[0026] Ovde je opisana metoda za suzbijanje ili sprečavanje proizvodnje TSHR autoantitela kod pacijenta, koja obuhvata korak davanja peptida u skladu sa prvi aspektom pronalaska, ili sastava u skladu sa drugim aspektom pronalaska, pacijentu.

[0027] Ovde je opisana metoda za lečenje Grejvzove bolesti kod pacijenta koja obuhvata korak davanja peptida u skladu sa prvim aspektom pronalaska, ili sastava u skladu sa drugim aspektom pronalaska, pacijentu.

[0028] Pacijent može biti HLA-DR3 ili HLA-DR4,

DETALJNI OPIS

PEPTIDI

[0029] U prvom aspektu, predmetni pronalazak odnosi se na peptid.

[0030] Termin „peptid“ koristi se u normalnom smislu za označavanje niza ostataka, obično L-aminokiselina, povezanih jedan za drugi, obično pomoću peptidnih veza između α-amino i karboksilnih grupa susednih aminokiselina. Termin obuhvata modifikovane peptide i analoge sintetičkih peptida.

[0031] Peptid prema predmetnom pronalasku može biti napravljen primenom hemijskih metoda (Peptide Chemistry, A practical Textbook. Mikos Bodansky, Springer-Verlag, Berlin). Na primer, peptidi mogu biti sintetisani tehnikama čvrste faze (Roberge JY et al (1995) Science 269: 202-204), cepanjem sa smole, i prečišćavanjem pomoću tečne hromatografije visokih performansi (npr., Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY). Automatizovana sinteza može biti ostvarena, na primer, upotrebom ABI 341 A peptidnog sintetizatora (Perkin Elmer) u skladu sa uputstvima datim od strane proizvođača.

[0032] Peptidi mogu alternativno biti napravljeni rekombinantnim merama, ili cepanjem sa dužeg polipeptida. Na primer, peptid se može dobiti cepanjem sa proteina tirotropin receptora, što može biti praćeno modifikovanjem jednog ili oba kraja- Sastav peptida može biti potvrđen analizom aminokiselina ili sekvenciranjem (npr., Edmanova procedura degradacije).

[0033] Za praktične svrhe, postoje različite druge karakteristike koje peptid može pokazati, na primer, značajno je da peptid bude dovoljno stabilan in vivo da bi bio terapeutski upotrebljiv. Polu raspad peptida in vivo može biti bar 10 minuta, 30 minuta, 4 sata ili 24 sata.

[0034] Peptid takođe može pokazati dobru biodostupnost in vivo. Peptid može održavati konformaciju in vivo što mu omogućava da se veže za MHC molekul na površini ćelije bez prepreke.

APITOPI

[0035] U adaptivnom imunom odgovoru, T limfociti su sposobni da prepoznaju unutrašnje epitope protein antigena. Antigen predstavljajuće ćelije (APC) uzimaju protein antigene i degradiraju ih u kratke peptidne fragmente. Peptid može biti vezan za glavni histokompatibilni kompleks (MHC) klase I ili II molekula u ćeliji i može biti prenet do površine ćelije. Kada je doveden na površinu ćelije u konjunkciji sa MHC molekulom, peptid može biti prepoznat pomoću T ćelije (preko receptora T ćelije (TCR)), u kom slučaju peptid je epitop T ćelije.

[0036] Epitop je stoga peptid koji se može izvesti iz antigena koji je sposoban da se veže za peptid-vezujući žleb MHC klase I ili II molekula i da bude prepoznat od strane T ćelije.

[0037] Minimalni epitop je najkraći fragment koji se može izvesti iz epitopa, koji je sposoban da se veže za peptid-vezujući žleb MHC klase I ili II molekula i da bude prepoznat od strane T ćelije. Za dati imunogeni region, obično je moguće stvoriti „grupisani set“ preklapajućih peptida koji se ponašaju kao epitopi, gde svi sadrže minimalni epitop ali se razlikuju u njihovim bočnim regionima.

1

[0038] Pomoću istog znaka, moguće je identifikovati minimalni epitop za određeni MHC molekul: T ćelijskom kombinacijom merenjem odgovora na skraćene peptide. Na primer, ukoliko je odgovor dobijen na peptid koji sadrži ostatke 1-15 u biblioteci preklapanja, setovi koji su skraćeni na oba kraja (tj., 1-14, 1-13, 1-12 itd., i 2-15, 3-15, 4-15 itd.) mogu biti korišćeni za identifikovanje minimalnog epitopa.

[0039] Ovde pronalazači su prethodno odredili da postoji veza između kapaciteta peptida da se veže za MHC klase I ili II molekul i da bude prezentovan T ćeliji bez daljeg procesiranja, i kapaciteta peptida da indukuje toleranciju in vivo (WO 02/16410). Ukoliko je peptid predugačak da bi se vezao za peptid vezujući žleb MHC molekula bez daljeg procesiranja (npr., skraćivanja), ili se vezuje u neodgovarajuću konformaciju onda neće biti tolerogen in vivo. Ukoliko, u drugu ruku, peptid nije odgovarajuće veličine i konformacije da se direktno veže za MHC peptid vezujući žleb i da bude prezentovan T ćeliji, onda ovaj peptid može biti predviđen da bude koristan za indukovanje tolerancije.

[0040] Stoga je moguće ispitati tolerogeni kapacitet peptida ispitivanjem toga da li se može vezati za MHC klase I ili II molekul i može biti prezentovan T ćeliji bez daljeg antigen procesiranja in vitro.

[0041] Peptidi prema predmetnom pronalasku su apitopi (Antigen procesirajući-nezavisni epiTOPI) tako da su sposobni da se vežu za MHC molekul i da stimulišu odgovor od TSHR specifičnih T ćelija bez daljeg antigen procesiranja. Takvi apitopi mogu biti predviđeni da izazovu toleranciju na TSHR, prateći metod zasnovan na pravilima opisan u WO 02/16410.

[0042] Peptid prema predmetnom pronalasku može biti bilo koje dužine koji je sposoban da se veže za MHC klase I ili II molekula bez daljeg procesiranja. Obično, peptid prema predmetnom pronalasku sposoban je da veže MHC klase II.

[0043] Peptidi koji se vezuju za MHC klase I molekule obično su od 7 do 13, a češće 8 do 10 aminokiseline u dužini. Vezivanje peptida stabilizovano je na njegova dva kraja preko kontakta između atoma u glavnom lancu peptida i invarijantnih mesta u peptid-vezujućem žlebu svih MHC klase I molekula. Postoje invarijantna mesta na oba kraja žleba koja vezuju amino i karboksi termini peptida. Varijacije u dužini peptida prilagođene su izvijanjem u kičmi peptida, često na prolin ili glicin ostacima koji dozvoljavaju fleksibilnost.

[0044] Peptidi koji se vezuju na MHC klase II molekula obično između 8 i 20 aminokiselina u dužini, a češće između 10 i 17 aminokiselina u dužini, i mogu biti duži (na primer do 40 aminokiselina). Ovi peptidi su u produženoj konformaciji duž MHC II peptid-vezujućeg žleba koji (na primer do 40 amino kiselina) je otvoren na oba kraja. Peptid se drži na mestu najvećim delom pomoću veze glavnog lanca atoma sa konzerviranim ostacima koji su duž peptid-vezujućeg žleba.

[0045] Peptid prema predmetnom pronalasku može sadržati između 8 i 30 aminokiselina, na primer 8 do 25 aminokiselina, 8 do 20 aminokiselina, 8 do 15 aminokiselina ili 8 do 12 amino kiselina.

DEO

[0046] Peptid prema predmetnom pronalasku može sadržati sve ili deo TSHR-izvedenih peptida prikazanih kao SEQ ID NO 1-3.

[0047] Termin „deo“ odnosi se na peptid koji je izveden iz SEQ ID NO 1-3 i sadrži bar minimalni epitop peptida.

[0048] Takav peptid može sadržati jednu ili više mutacija, obično supstitucije aminokiselina u okviru TSHR-izvedene sekvence. Aminokiseline mogu biti supstituisane sa aminokiselinama kao što su glicin, lizin ili glutaminska kiselina. Peptid može sadržati do tri, do dve ili jednu supstituciju aminokiseline iz TSHR-izvedene sekvence.

[0049] Takav peptid može sadržati aminokiseline na jednom ili obra kraja koji se ne mogu izvesti iz TSHR sekvence. Na primer, peptid može imati jedan ili više glicin i/ili lizin i/ili ostataka glutaminske kiseline na jednom ili oba kraja. Na primer, dodatne aminokiseline mogu sadržati razdvajač glicina ili lizina, što je praćeno sa parom aminokiselina KK, KE, EK ili EE na jednom ili oba kraja.

[0050] Na primer, peptid može imati sledeću formulu:

KKG-TSHR-izvedeni deo-GKK.

[0051] Peptid, uključujući aminokiseline koje nisu izvedene iz TSHR, mora biti apitop, tj., da bude sposoban da se veže za MHC molekul in vitro i da bude prezentovan T ćeliji bez antigen procesiranja.

1

RECEPTOR TIROID-STIMULIŠUĆEG HORMONA (TSHR)

[0052] GD je autoimuna bolest izazvana auto-reaktivnim T i B limfocitima koji ciljaju primarni auto-antigen, receptor tiroid-stimulišućeg hormona (TSHR).

[0053] TSHR je G-protein spojeni receptor na tiroidnim folikularnim ćelijama u štitnoj žlezdi koji stimuliše proizvodnju tiroksina (T4) i trijodotironina (T3) preko cAMP signalne kaskade nakon vezivanja svojeg liganda, tiroid-stimulišućeg hormona (TSH). Nakon internalizacije, degradacije i prezentacije TSHR sa APC, T ćelije postaju aktivirane i interaguju sa auto-reaktivnim B ćelijama, koje zauzvrat proizvode stimulišuća agonistička autoantitela usmerena protiv TSHR. Tiroid-stimulišući imunoglobulini vezuju se za isti džep receptora kao TSH, aktivirajući TSHR posredovano prenošenje signala i dovode do proizvodnje prekomernog tiroidnog hormona u štitnoj žlezdi i do porasta štitne žlezde.

[0054] TSHR, takođe poznat kao tirotropin receptor, prvenstveno vrši ekspresiju na tiroidnim epitelnim ćelijama.

[0055] TSHR holoreceptor ima 764 ostataka i sadrži N-terminalni vanćelijski domen, za koji se TSH vezuje, serpentin (ili transmembranski domen) i C-terminalni međućelijski domen.

[0056] TSHR sadrži veliki vanćelijski domen (418 aminokiselina) sa visoko konzerviranim Cys ostacima, koji olakšavaju formiranje tercijarne strukture vanćelijskog domena koja može biti od značaja kod oba, vezivanja liganda i konformacije neaktivnog receptora. Vanćelijski domen sadrži preko polovine ukupne dužine proteina i dovoljan je za vezivanje liganda visokog afiniteta. Nakon što se transportuje do ćelijske površine, molekul receptora se izlaže među-molekulskom cepanju, što dovodi do uklanjanja 50 sekvenci aminokiselina između ostataka 316 i 366. Kao rezultat receptor sadrži dve podjedinice, α podjedinicu koja sadrži vanćelijski domen koji vezuje ligand i β podjedinicu koja sadrži transmembranski domen i kratku C-terminalnu sekvencu, povezanu zajedno sa disulfidnim vezama. U sledećim koracima, α podjedinica se ukida, što dovodi do prekomernog oduzimanja β podjedinica domena koji vezuje ligand na ćelijskoj membrani.

[0057] Nakon vezivanja cirkulišućeg TSH do TSHR, G-protein signalna kaskada aktivira adenilil ciklazu i međućelijske nivoe cAMP porasta. cAMP aktivira sve funkcionalne aspekte

1

tiroidne ćelije, uključujući pumpanje joda, sintezu tiroglobulina, jodinaciju, endocitozu i proteolizu, aktivnost tiroid peroksidaze i oslobađanje hormona.

[0058] Sekvenca aminokiseline zrelog TSHR data je ispod (SEQ ID No.21).

[0059] Peptid prema pronalasku se bar delimično može izvesti iz TSHR. Peptid ili njegov deo mogu se izvesti iz regiona 64-92, 78-106, 107-135, 136-164 ili 201-229 TSHR. Peptid ili njegov deo mogu se izvesti iz fragmenta ili antigena koji se povećava prirodnim procesiranjem antigena pomoću antigen prezentujuće ćelije.

[0060] Region 64-92 TSHR (RNB_4) ima sledeću sekvencu:

[0061] Peptid može sadržati minimalni epitop iz sledećeg peptida:

TSHR 73-87 (RNB_4J): SNLPNISRIYVSIDV (SEQ ID No 15)

TSHR 73-87 (RNB_4J-GKK): KKGSNLPNISRIYVSIDVGKK (SEQ ID No 16)

[0062] Peptid može sadržati minimalni epitop iz sledećeg peptida:

TSHR 74-88 (RNB_4K): NLPNISRIYVSIDVT (SEQ ID No.62)

TSHR 74-88 (RNB_4K-GKK): KKGNLPNISRIYVSIDVTGKK (SEQ ID No.63)

[0063] Region 78-106 TSHR (RNB_5) ima sledeću sekvencu:

[0064] Peptid može sadržati minimalni epitop iz sledećih peptida: TSHR 78-92 (RNB_5A), 79-93 (RNB_5B), 80-94 (RNB_5C), 81-95 (RNB_5D), 82-96 (RNB_5E) i 83-97 (RNB_5F).

[0065] Sekvence TSHR 78-92, 79-93, 80-94, 81-95, 82-96 i 83-97 su:

1

[0066] Region 136-164 (RNB_9) TSHR ima sledeću sekvencu:

[0067] Peptid može sadržati minimalni epitop iz sledećih peptida: TSHR 136-150 (RNB_9A), 137-151 (RNB_9B), 138-152 (RNB_9C) i 139-153 (RNB_9D).

[0068] Sekvence TSHR 136-150, 137-151, 138-152 i 139-153 su:

[0069] Region 180-207 TSHR (RNB_12) ima sledeću sekvencu:

1

[0070] Peptid može sadržati minimalni epitop iz jednog od peptida prikazanih u sledećoj tabeli:

[0071] Peptid može sadržati minimalni epitop iz jednog od sledećih peptida:

TSHR 180-194 (RKB_12A): LTLKLYNNGFTSVQG (SEQ ID No.65)

TSHR 180-194 (RNB_12B); TLKLYNNGFTSVQGY (SEQ ID No.66)

TSHR 180-194 (RNB_12B-KKK): KKKTLKLYNNGFTSVQGYKKK (SEQ ID No.

67).

[0072] Peptid takođe može sadržati sekvencu:

KK-(G/K)-aa1-(RNB-5D peptid)-aa2-aa3-Z-(G/K)-KK

gde aa1 je br aminokiselina, I, K ili T;

RNB-5D peptid je YVSIDVTLQQLE, ili njegova varijanta u kojoj je jedna ili više aminokiselina bila zamenjena sa K,

aa2 je br aminokiselina, S ili K;

aa3 je br aminokiselina, H ili K

1

koji je sposoban da se veže za MHC molekul in vitro i da bude prezentovan T ćeliji bez antigen procesiranja.

[0073] RNB-5D peptid može biti YVSIDVTLQQLE, ili njegova varijanta u kojoj su jedna, dve ili tri aminokiseline zamenjene sa K.

[0074] Peptid prema pronalasku

može biti izabran iz sledeće grupe, gde su svi identifikovani da su apitopi (Tabela 1) :

KKGIYVSIDVTLQQLESHGKK (SEQ ID No 12), KKGKYVSIDVTLQQLESHGKK (SEQ ID No 22), KKGIKVSIDVTLQQLESHGKK (SEQ ID No 23), KKGIYKSIDVTLQQLESHGKK (SEQ ID No 24), KKGIYVSIDVKLQQLESHGKK (SEQ ID No 25), KKGIYVSIDVTLQKLESHGKK(SEQ ID No 26), KKGIYVSIDVTLQQKESHGKK (SEQ ID No 27), KKGIYVSIDVTLQQLKSITGKK (SEQ ID No 28), KKGIYVSIDVILQQLEKHGKK (SEQ ID No 29), KKGIYVSIDVTLQQLESKGKK (SEQ ID No 30), KKGYVSIDVTLQQLEGKK (SEQ ID No 31), KKGYVSIDVKLQQLEGKK (SEQ ID No 32), KKGYVSIDVTLQKLEGKK (SEQ ID No 33), KKGYVSIDVTLQQKEGKK (SEQ ID No 34), KKGYVSIDVKLQKKEGKK (SEQ ID No 35), KKGIYVSIDVTLQQLEGKK (SEQ ID No 36), KKGIYVSIDVKLQQLEGKK (SEQ ID No 37), KKGIYVSIDVTLQKLEGKK (SEQ ID No 38), KKGIYVSIDVTLQQKEGKK (SEQ ID No 39), KKGIYVSIDVKLQKKEGKK (SEQ ID No 40), KKGTYVSIDVTLQQLEGKK (SEQ ID No 41), KKGTYVSIDVKLQQLEGKK (SEQ ID No 42), KKGTYVSIDVTLQTCLEGKK (SEQ ID No 43), KKGTYVSIDVTLQQKEGKK (SEQ ID No 44), KKGTYVSIDVKLQKKEGKK (SEQ ID No 45), KKKTYVSTDVTLQQLESTIKKK (SEQ ID No 21), KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No 46), KKKIKVSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No 47), KKKIYKSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No 48), KKKIYVK1DVTLQQLESHKKK (SEQ ID No 49), KKKIYVSIDVKLQQLESHKKK (SEQ ID No 50), KKKIYVSIDVTLKQLESHKKK (SEQ ID No 51), KKKIYVSIDVTLQKLESHKKK (SEQ ID No 52), KKKIYVSIDVTLQQKESHKKK (SEQ ID No 53), KKKIYVSIDVTLQQLKSHKKK (SEQ ID No 54), KKKIYVSIDVTLQQLEKHKKK (SEQ ID No 55), KKKIYVSIDVTLQQLESKKKK (SEQ ID No 56), KKKYVSIDVTLQQLEKKK (SEQ ID No 57), KKKYVSIDVKLQQLEKKK (SEQ ID No 58), KKKYVSIDVTLQKLEKKK (SEQ ID No 59),

2

KKKYVSIDVTLQQKEKKK (SEQ ID No 60), KKKYVSIDVKLQKKEKKK (SEQ ID No.

61).

[0075] Peptid može biti izabran iz sledeće grupe, gde su svi identifikovani kao apitopi i imaju poboljšanu rastvorljivost:

KKGKYVSIDVTLQQLESHGKK (SEQ ID No.22), KKGIYKSIDVTLQQLESHGKK (SEQ ID No.24), KKGYVSIDVTLQQLEGKK (SEQ ID No.31), KKGYVSIDVKLQQLEGKK (SEQ ID No.32), KKGYVSIDVTLQKLEGKK (SEQ ID No.

33), KKGYVSIDVTLQQKEGKK (SEQ ID No.34), KKGYVSIDVKLQKKEGKK (SEQ ID No. 35), KKGIYVSIDVKLQKKEGKK (SEQ ID No.40), KKGTYVSIDVKLQQLEGKK (SEQ ID No.42), KKGTYVSIDVKLQKKEGKK (SEQ ID No.45), KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No.46), KKKIYKSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No.48), KKKIYVKIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No.49), KKKYVSIDVTLQQLEKKK (SEQ ID No.57), KKKYVSIDVKLQQLEKKK (SEQ ID No.

58), KKKYVSIDVTLQQKEKKK (SEQ ID No.60), KKKYVSIDVKLQKKEKKK (SEQ ID No. 61).

[0076] Peptid može biti izabran iz sledeće grupe, gde su svi identifikovani kao apitopi i imaju najbolju rastvorljivost: KKGIYKSIDVTLQQLESHGKK (SEQ ID No.24), KKGYVSIDVKLQQLEGKK (SEQ ID No 32), KKGYVSIDVTLQKLEGKK (SEQ ID No.

33), KKGYVSIDVTLQQKEGKK (SEQ ID No.34), KKGYVSIDVKLQKKEGKK (SEQ ID No. 35), KKGTYVSIDVKLQQLEGKK (SEQ Id No.42), KKGTYVSIDVKLQKKEGKK (SEQ ID No.45), KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No.46), KKKIYKSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No.48), KKKYVSIDVTLQQLEKKK (SEQ ID No. 57), KKKYVSIDVTLQQKEKKK (SEQ ID No.60).

[0077] Sledeći peptidi su od naročitog interesa: KKGYVSIDVTLQKLEGKK (SEQ ID No.

32), KKGYVSIDVKLQKKEGKK (SEQ ID No.34), KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No.46), KKKIYKSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No.48), KKKYVSIDVTLQQLEKKK (SEQ ID No.57), KKKYVSIDVTLQQKEKKK (SEQ ID No.

60).

TOLERANCIJA

[0078] Epitopi T ćelija imaju centralnu ulogu u adaptivnom imunom odgovoru na antigen, bilo na sopstveni ili spoljašnji. Centralna uloga koju imaju epitopi T ćelija kod hipersenzitivnih bolesti (što obuhvata alergiju, autoimune bolesti i odbijanje transplanata) bili su demonstrirani upotrebom eksperimentalnih modela. Moguće je uzrokovati inflamatorne ili alergijske bolesti ubrizgavanjem sintetičkih peptida (na osnovu strukture epitopa T ćelija) u kombinaciji sa adjuvansom.

[0079] Za razliku od toga, pokazano je da je moguće uzrokovati imunogenu toleranciju prema određenim antigenima davanjem peptid epitopa u rastvorljivom obliku. Davanje rastvorljivih peptid antigena je bilo demonstrirano kao delotvorna mera inhibiranja bolesti kod eksperimentalnog autoimunog encefalomijelitisa (EAE – model za multiplu sklerozu (MS)) (Metzler and Wraith (1993) Int. Immunol. 5:1159-1165; Liu and Wraith (1995) Int. Immunol. 7:1255-1263; Anderton and Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28:1251-1261); i eksperimentalnih modela artritisa, dijabetesa i uveoretinitisa (razmatrano u Anderton and Wraith (1998) kao iznad). Ovo je takođe demonstrirano kao mera lečenja trenutne bolesti u EAE (Anderton and Wraith (1998) kao iznad).

[0080] Tolerancija je neuspeh odgovora na antigen. Tolerancija na sopstvene antigene je suštinsko svojstvo imunog sistema, kada se izgubi, može se ispoljiti u autoimunoj bolesti. Adaptivni imuni sistem mora održavati kapacitet da odgovara na ogromnu količinu različitih infektivnih agenasa dok zaobilazi autoimune napade sopstveni antigena sadržanih unutar svoga tkiva. Ovo se u velikoj meri održava pomoću osetljivosti nezrelih T limfocita na smrt apoptopskih ćelija u timusu (centralna tolerancija). Međutim, nisu svi sopstveni antigeni detektovani u timusu, tako da smrt samostalno-reaktivnih timocita preostaje nezavršena. Postoje stoga takođe mehanizmi pomoću kojih se tolerancija može ostvariti sa zrelim samostalno-reaktivnim T limfocitima u perifernom tkivu (periferna tolerancija). Razmatranje mehanizama centralne i periferne tolerancije dato je u Anderton et al (1999) (Immunological Reviews 169:123-137).

[0081] Trenutno se veruje je GD izazvana TSHR stimulišućim autoantitelima koja se vezuju za i aktiviraju TSHR, time stimulišući sintezu i lučenje tiroid hormona, i rast štitne žlezde. Peptidi prema predmetnom pronalasku sposoban su da uzrokuju toleranciju na TSHR, tako da kada se daju pacijentu, mogu povratiti toleranciju na TSHR sopstveni protein i skratiti patogeni imuni odgovor.

[0082] Tolerancija može biti posledica od ili biti okarakterisana uzrokovanjem anergije u poslednjem delu CD4+ T ćelija. Kako bi se aktivirala T ćelija, peptid mora biti povezan sa „profesionalnom“ APC koja je sposobna da isporuči dva signala do T ćelija. Prvi signal (signal 1) isporučuje se MHC-peptid kompleksom na površini ćelije APC i prima se od strane T ćelije preko TCR. Drugi signal (signal 2) isporučuje se kostimulatornim molekulima na površini APC, kao što su CD80 i CD86, i primaju se sa CD28 na površini T ćelije. Smatra se da kada T ćelija primi signal 1 u odsustvu signala 2, da nije aktivirana i, zapravo, postaje anergična. Anergične T ćelije su refraktorne na uzastopni antigeni izazov, i mogu biti sposobne da suzbiju druge imune odgovore. Anergične T ćelije se smatraju da su uključene u posredovanju tolerancije T ćelija.

[0083] Peptidi koji zahtevaju procesiranje pre nego što mogu biti prezentovani u konjunkciji sa MHC molekulima ne uzrokuju toleranciju zato što moraju biti rukovođeni zrelim antigen prezentujućim ćelijama. Zrele antigen prezentujuće ćelije (kao što su makrofagi, B ćelije i dendritične ćelije) sposobne su da procesiraju antigen, ali takođe da isporuče oba signala 1 i 2 do T ćelije, što dovodi do aktiviranja T ćelije. Apitopi, na drugu ruku, će moći da vežu klase II MHC na nezreloj APC. Stoga, biće prezentovani do T ćelije bez ko-stimulacije, što dovodi do anergije i tolerancije T ćelije.

[0084] Naravno, apitopi su takođe sposobni da vežu MHC molekule na ćelijskoj površini zrelog APC. Međutim, imuni sistem sadrži veću zastupljenost nezrelih nego zrelih APC (predloženo je da je manje od 10% dendritičnih ćelija aktivirano, Summers et al. (2001) Am. J. Pathol.159: 285-295). Početni položaj za apitop će stoga biti anergija/tolerancije pre nego aktiviranje.

[0085] Pokazano je da, kada je tolerancija uzrokovana inhalacijom peptida, da se kapacitet antigen-specifičnih CD4+ T ćelija za proliferaciju smanjuje. Takođe, proizvodnja IL-2, INF-γ i IL-4 proizvodnja ovih ćelija se smanjuje, ali proizvodnja IL-10 se povećava. Neutralizacija IL-10 kod miševa u stanju peptid-uzrokovane tolerancije pokazala je da povraća potpunu podložnost na bolest. Predloženo je da populacija regulatornih ćelija opstaje u stanju tolerancije koje proizvodi IL-10 i posreduje imunu regulaciju (Burkhart et al (1999) Int. Immunol. 11:1625-1634).

2

[0086] Uzrokovanje tolerancije na TSHR može biti praćeno in vivo traženjem smanjenja u nivou:

i) TSHR autoantitela;

ii) CD4+ T ćelija specifičnih za TSHR; i/ili

iii) B ćelija koje su sposobne da luče TSHR autoantitela

tehnikama poznatim u struci.

[0087] Uzrokovanje tolerancije stoga takođe može biti praćeno različitim tehnikama uključujući:

(a) uzrokovanje anergije u CD4+ T ćelijama (koja može biti uočena uzastopnim izazivanjem sa antigenom in vitro);

(b) promene u CD4+ T ćelijskoj populaciji, uključujući

1. (i) smanjenje u proliferaciji;

2. (ii) smanjenje u proizvodnji IL-2, IFN-γ i IL-4; i

3. (iii) povećanje u proizvodnji IL-10.

[0088] Kao što se ovde koristi, termin „tolerogeni“ označava sposobnost uzrokovanja tolerancije.

SASTAV

[0089] Predmetni pronalazak takođe se odnosi na sastav, kao što je farmaceutski sastav koji sadrži jedan ili više peptida u skladu sa prvom aspektom pronalaska.

[0090] Peptid može sadržati više peptida, na primer dva, tri, četiri, pet ili šest peptida.

[0091] Sastav prema predmetnom pronalasku može biti za profilaktičku ili terapeutsku upotrebu.

[0092] Kada se daje za profilaktičku upotrebu, sastav može smanjiti ili sprečiti stvaranje imunog odgovora na TSHR. Nivo imunog odgovora je manji nego što bi bio ostvaren ukoliko pacijent ne bi bio lečen sastavom. Termin „smanjiti“ označava da je delimično smanjivanje imunog odgovora uočeno, kao 50%, 70%, 80% ili 90% smanjenja u odnosu na smanjenje koje bi bilo uočeno ukoliko pacijent ne bi bio lečen sa sastavom (ili u odgovoru uočenom kod pacijenta koji nije lečen u istom vremenskom periodu). Termin „sprečavanje“ označava da nikakav značajniji imuni odgovor na TSHR nije uočen.

[0093] Kada se daje za terapeutsku upotrebu, sastav može suzbiti već postojeći imuni odgovor na TSHR. Termin „suzbijati“ označava smanjenje nivoa postojećeg imunog odgovora, u poređenju sa nivoom pre lečenja sa peptidom, ili nivoima koji bi bilo uočeni u istoj vremenskoj tački ukoliko lečenje ne bi bilo primenjeno.

[0094] Lečenje sa sastavom prema predmetnom pronalasku može izazvati smanjenje u nivoa bilo čega od sledećeg:

i) TSHR autoantitela

ii) CD4+ T ćelija specifičnih za TSHR

iii) B ćelija koje luče TSHR autoantitela.

[0095] Detekcija svih faktora može biti izvršeno tehnikama poznatim u struci, kao što su ELISA, protočna citometrija, itd.

[0096] Lečenje sa sastavom prema predmetnom pronalasku može takođe ili alternativno izazvati anergiju u CD4+ T ćelijama specifičnim za TSHR. Anergija može biti detektovana, na primer, uzastopnim izazivanjem sa TSHR in vitro.

[0097] Kada postoje dva ili više apitopa, farmaceutski sastav može biti u obliku kompleta, u kome su neki ili svaki od apitopa dati odvojeno za zajedničko, odvojeno ili uzastopno davanje.

[0098] Alternativno (ili dodatno) ukoliko se farmaceutski sastav (ili bilo koji njegov deo) daje u više doza, svaka doza može biti zapakovana odvojeno.

[0099] Takođe, u farmaceutskom sastavu prema predmetnom pronalasku, jedan ili svi apitopi mogu biti pomešani sa pogodnim veznicima, mazivima, agensima za suspenziju, agensima za oblaganje, ili agensima za rastvaranje.

FORMULACIJA

[0100] Sastav može biti pripremljen za ubrizgavanje, ili kao tečni rastvor ili suspenzija; čvrsti oblik za rastvaranje u, ili suspendovanje u, tečnosti pre ubrizgavanja takođe može biti pripremljen. Pripremanje takođe može biti emulzirano, ili peptidi mogu biti inkapsulirani u lipozomima. Aktivni sastojci mogu biti pomešani sa ekscipijensima koji su farmaceutski prihvatljivi i podesni sa aktivnim sastojcima. Pogodni ekscipijensi su, na primer, voda, slani

2

rastvor (na primer, fosfatni puferski slani rastvor), dekstroza, glicerol, etanol ili slično i njihove kombinacije.

[0101] Dodatno, ukoliko je poželjno, sastav može sadržati male količine pomoćnih supstanci kao što su agensi za vlaženje ili emulgatori i/ili agensi za puferisanje pH. Puferske soli obuhvataju fosfatnu, limunsku, sirćetnu, hidrohlornu kiselinu i/ili natrijum hidroksid se može koristiti za podešavanje pH. Za stabilizaciju disaharidi se mogu koristiti kao što su sukroza i trehaloza.

[0102] Ukoliko sastav sadrži više peptida, relativni odnos peptida može biti približno jednak. Alternativno relativni odnos svakog peptida može biti izmenjen, na primer, kako bi se usmerio tolerogeni odgovor na određeni pod-set autoreaktivnih T-ćelija ili ukoliko je pronađeno da jedan peptid deluje bolje od drugog peptida u određenim HLA tipovima.

[0103] Nakon formulacije, sastav može biti smešten u sterilni kontejner koji se zatim zatvara i skladišti na niskoj temperaturi, na primer 4°C, ili može biti osušen zamrzavanjem.

[0104] Konvencionalno sastav se priprema kao liofilizovan (osušen zamrzavanje) prah. Liofilizacija dozvoljava dugotrajno skladištenje u stabilnom obliku. Postupci liofilizacije dobro su poznati u struci, videti na primer http://www.devicelink.com/ivdt/archive/97/01/006.html. Agensi za ispunu obično se koriste pre sušenja zamrzavanje, kao što su manitol, dekstran ili glicin.

[0105] Sastav može biti dat na pogodan način kao što je oralnim, intravenoznim (gde je rastvorljiv u vodi), intramuskularnim, subkutanim, sublingvalnim, intranazalnim, intradermalnim ili putem supozitorije ili implantom (npr., upotrebom molekula sa sporim oslobađanjem).

[0106] Sastav se povoljno može dati intranazalnim, subkutanim ili intradermalnim putevima.

[0107] Peptid i sastav prema pronalasku mogu se koristiti za lečenje ljudskog pacijenta. Pacijent može imati GD. Pacijent može imati TSHR autoantitela.

2

[0108] Pacijent može biti HLA-haplotip koji je povezan sa predispozicijom za razvijanje naslednih THSR autoantitela. Pacijent može pokazivati HLA-DR3 ili HLA-DR4. Metode za određivanje HLA haplotipa pojedinca poznate su u struci.

[0109] Obično, lekar će odrediti stvarnu dozu koja će biti najpogodnija za pojedinog pacijenta i zavisiće od starosti, težine i odgovora pojedinačnog pacijenta.

[0110] U poželjnom otelotvorenju protokol „povećanja doze“ može biti praćen, gde se više doza daje pacijentu u povećanim koncentracijama. Takav pristup je bio korišćen, na primer, za peptide fosfolipaze A2 u imunoterapeutskim primenama protiv alergije na otrov pčele (Müller et al (1998) J. Allergy Clin Immunol. 101:747-754 and Akdis et al (1998) J. Clin. Invest. 102:98-106).

KOMPLETI

[0111] Konvencionalno, ukoliko sastav sadrži više peptida, oni mogu biti dati zajedno, u obliku pomešanog sastava ili koktela. Međutim, mogu postojati okolnosti u kojima je poželjno peptide dati odvojeno u formi kompleta, za zajedničko, odvojeno, uzastopno ili kombinovano davanje.

[0112] Komplet takođe može obuhvatati mere za mešanje i/ili davanje (na primer vaporizator za intranazalno davanje; ili špric i iglu za subkutano/intradermalno doziranje). Komplet takođe može obuhvatati uputstvo za upotrebu.

[0113] Farmaceutski sastav ili komplet prema pronalasku mogu biti korišćeni za lečenje i/ili sprečavanje bolesti.

[0114] Posebno, sastav/komplet mogu biti korišćeni za lečenje i/ili sprečavanje GD.

PIMERI

Primer 1 - Odabir HLA-DR3 TSHR peptida

[0115] Za identifikovane značajnih regiona epitopa u TSHR, ECD od TSHR (AA20-418) podeljen je na 28 preklapajuća peptida od 28-30 aminokiselina (28-30-meri) preklopljenih sa 15 aminokiselina, kao što pre prikazano ispod.

2

2

[0116] Imunogenicitet svih peptida zatim je procenjen imuniziranjem HLA-DRB1*0301 transgenih miševa (DR3 miševi) sa 200 µg grupe od 3 peptida emulgovanih u CFA. Nakon 10 dana, LN ćelije i splenociti izolovani su i stimulisani in vitro sa 10-25 µg/mL odgovarajućih pojedinačnih peptida. Na osnovu indeksa stimulacije (SI; 3H-timidin inkorporacija (broj po minutu) peptid stimulisanih ćelija podeljen sa onim od nestimulisanih ćelija), peptidi RNB-5 i RNB-9 su uočeni da su visoko imunogeni (SI>10).

[0117] Slika 1 prikazuje da LN i splenociti, izolovani iz RNB-5 imuniziranih miševa, jako reaguju na RNB-5 stimulaciju in vitro.

[0118] Svi ovde opisani primeri će se fokusirati na peptid RNB-5.

Primer 2 – Identifikovanje apitopa u RNB-5

[0119] Za određivanje tačnog položaja epitopa u RNB-5, panel opsega od 15-mer preklapajućih peptida RNB-5 je sintetisan upotrebom standardne F-moc hemije. Svaki peptid je zamenjen sa 1 aminokiselinom, kao što je prikazano ispod:

2

1

[0120] Prvo, peptidi su analizirani upotrebom hibridoma dobijenih od DR3 miševa.

Hibridomi specifični za TSHR i RNB-5 su pokazali da reaguju na RNB-5 A-F prezentovan sa oba, svežim i fiksiranim VAVY ćelijama. Antigen-uzrokovana IL-2 proizvodnja reprezentativnih klonova prikazana je na Slici 2.

[0121] Za određivanje sposobnosti ovih 15-mer peptida da se vežu za HLA-DR molekul, 2 softverska alata su korišćena: NetMHCII (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII) i Immune Epitope DataBase (http://tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_II_binding.html). Korišćenjem obe

2

metode, grupisani peptidi RNB-5A do RNB-5F su identifikovani kao jaka veziva za oba HLA-DRB1*0301 i HLA-DRB1*0401 molekule.

[0122] Iako je GD kod ljudi visoko povezana sa HLA-DRB1*0301 haplotipom, HLA-DRB1*0401 haplotip često se pojavljuje kod GD pacijenata takođe. Kako su RNB-5a do 5F peptidi predviđeni da se vezuju za HLA-DRB1*0401 molekule, RNB-5 je testiran za svoju sposobnost da stvori imuni odgovor kod DR4 miševa in vivo. LN ćelije i splenociti izolovani iz RNB-5/CFA-imuniziranih DR4 miševa pokazali su jake imune odgovore kada su stimulisani sa RNB-5 grupisanim peptidima. Dodatno, RNB-5 specifični hibridomi, stvoreni kod DR3 miševa, odgovaraju na RNB-5 grupisane peptide kada su prezentovani preko BM14-čelija (HLA-DRB1*0401). Stoga, novi hibridomi stvoreni su imuniziranjem DR4 miševa sa TSHR/CFA. Hibridomi specifični za oba, TSHR protein i RNB-5 peptid izabrani su da identifikuju apitope unutar RNB-5. Peptidi RNB-5A do 5F su identifikovani kao apitopi opet (Slika 3). RNB-5 DEF grupisani peptidi su modifikovani dodavanjem aminokiselina ’GKK’ na oba, C- i N-terminusu. TSHR- i RNB-5 specifični hibridomi takođe reaguju na ove modifikovane peptide kada su prezentovani sa oba, svežim i fiksiranim APC. Kada se uzmu zajedno, ovi podaci naglašavaju da je ovaj region interesantan za GD pacijenti sa ili HLA-DRB1*0301 ili HLA-DRB1*0401 haplotipom.

[0123] Deo TSHR-specifičnih hibridoma stvorenih imuniziranjem DR4 miševa sa TSHR/CFA pokazao je da se vezuje za RNB-4 umesto za RNB-5, što ukazuje na prisustvo drugih imunogenih regiona unutar TSHR. RNB-4 specifični hibridomi izabrani su da identifikuju apitope unutar RNB-4. Peptid RNB-4J identifikovan je kao apitop (Slika 4). RNB-4 grupisane peptidne sekvence prikazane su u tabeli ispod.

[0124] Status apitopa RNB-5D modifikovanih peptida takođe je ispitivan (Slika 20).

[0125] Dodatno RNB-4 i RNB-5 apitopima, softverski alat za predviđanje in silico takođe je identifikovao peptide RNB-9A do 9D kao jake veznike za HLA-DRB1*0301 molekule. Peptidne sekvence su prikazane na tabeli ispod.

4

[0126] Odgovor TSHR- i RNB-5-specifičnih klonova hibridoma, izolovanih iz HLA-DR3 ili HLA-DR4 miševa imuniziranih sa TSHR/CFA, na RNB-5D modifikovane peptide je testiran. Rezultati su prikazani na Slikama od 11 do 15.

Primer 3 - Ex vivo test tolerancije

[0127] Za procenjivanje sposobnosti RNB-5 apitopa da uzrokuju toleranciju, sposobnost ovih apitopa da inhibiraju imuno odgovor prvo je ispitivan kod zdravih HLA-DRB1*0301 ili HLA-DRB1*0401 miševa ex vivo. Miševi su prethodno tretirani sa različitim RNB-5 apitopima u skladu sa rasporedom velike doze ili povećanja doze, kao što je opisano u delu za metode. Ispitivanja su pokazala da prethodno tretiranje sa RNB-5 apitopima značajno smanjuje TSHR-uzrokovanu proliferaciju T ćelija, kod oba, DR3 i DR4 miševa (Slika 6A-D). RNB-5 DEF grupisani peptidi modifikovani su dodavanjem aminokiselina ’GKK’ na oba, C-i N-terminusu. Prethodno tretiranje sa ovim modifikovanim apitopima takođe je značajno smanjilo TSHR-uzrokovanu proliferaciju T ćelija (Slika 6E-F).

[0128] Peptidi RNB-9A do 9D predviđeni su da se jako vežu za HLA-DRB1*0301 molekule i njihova sposobnost da uzrokuju specifičnu imunu toleranciju takođe je ispitivana. DR3 miševi su penetrirani sa RNB-9A do 9D u skladu sa rasporedom povećanja doze. RNB-9B i 9C prethodno tretiranje izazvalo je značajno smanjenje u TSHR-uzrokovanoj proliferaciji T ćelija kod oba, LN i splenocitnih ćelijama (Slika).

[0129] Peptid RNB 4K-GKK takođe je pokazao da značajno smanjuje TSHR-uzrokovanu proliferaciju T ćelija kod DR4 miševa (Slika 16).

[0130] RNB-5D modifikovani peptidi takođe značajno smanjuju TSHR-uzrokovanu proliferaciju T ćelija. Reprezentativni eksperimenti sa RNB5D-K1 i RNB5D-K16 prikazani su na Slici 19.

Primer 4 – Životinjski model za GD

[0131] Za izučavanje sposobnosti RNB-5 apitopa da smanje GD-nalik simptome kod miševa, dva različita životinjska modela za GD su razvijena.

[0132] Prvo, C57/B16 miševi su imunizirani sa TSHR/CFA kako bi se uzrokovala anti-TSHR proizvodnja antitela. Za ispitivanje da li bi povećano imuniziranje dalje povećalo nivoe anti-TSHR antitela, jedna grupa miševa primila je drugu imunizaciju 4 nedelje nakon TSHR/IFA. Nivoi anti-TSHR antitela u serumu miševa koji su jednom imunizirani dostižu ravan nivo 2 nedelje nakon imunizacije. Druga imunizacija uzrokuje veliko povećanje nivoa anti-TSHR antitela (Slika 8).

[0133] Drugo, Balb/c miševi ubrizgani su sa LacZ-Ad ili TSHR-Ad virusnim česticama kako bi se uzrokovao hipertiroidizam, usled delovanja anti-TSHR antitela na štitnu žlezdu. Nivoi T4 hormona i ukupni titri IgG anti-TSHR antitela su izmereni u serumu svih miševa pre, 4 nedelje nakon i 10 nedelja nakon prvog ubrizgavanja sa adenovirusnim vektorima (Slika 9). Imuniziranje miševa sa 10<10>TSHR-Ad virusnim česticama izazvalo je hipertiroidizam kod 3/7 miševa i 1/7 miševa kada je mereno 4 nedelje i 10 nedelja nakon prve imunizacije, redom. Ovo ukazuje da su nivoi T4 kod 2 miša normalizovana za vreme trajanja eksperimenta.

Imunizirani miševi sa 10<11>TSHR-Ad virusnim česticama izazvali su hipertiroidizam kod 1/6 miševa, oba, pri 4 i 10 nedelja nakon prvog imuniziranja. Ovde, jedan miš koji je hipertiroidan pri 4 nedelje imao je normalne T4 nivoe pri 10 nedelja, dok su T4 nivoi drugog miša značajno povećani između 4 i 10 nedelja. Nivoi anti-TSHR antitela izmereni su kao ukupne IgG vrednosti, bez određivanja njihovog stimulišućeg ili blokirajućeg dejstva na TSHR (Slika 10). Imuniziranje miševa sa TSHR-Ad virusnim česticama jasno je uzrokovalo proizvodnju anti-TSHR antitela. Miševi imunizirani sa od 10<10>do 10<11>TSHR-Ad virusnih čestica značajno su proizveli više antitela nego LacZ-Ad imunizirani miševi. Nivoi anti-TSHR antitela nisu se razlikovali između 10<10>-TSHR-Ad i 10<11>-TSHR-Ad imuniziranih miševa. Nije pronađena veza između ukupnih nivoa IgG anti-TSHR antitela i T4 nivoa.

[0134] Ovi životinjski modeli korišćeni su za ispitivanje da li RNB-5 apitopi mogu smanjiti GD-nalik simptome in vivo.

Primer 5 – Identifikacija apitopa u RNB12 regionu

[0135] RNB12 kao i grupisani peptidi nisu imunogeni kod miševa. Stoga, region je identifikovan reaktivnošću linije T ćelija dobijene od pacijenata sa Grejvzovom bolešću. Slika 17 prikazuje rezultate dobijene iz takve linije T ćelija.

[0136] RNB12 i modifikovani peptidi RNB12-KKK potvrđeni su da su apitopi (Slika 18). Materijali i metode

Miševi

[0137] HLA-DRB1*0301 transgeni miševi (DR3) miševi su odgojeni i održavani u imunogenetskog koloniji miševa Mayo Klinike. HLA DR3-tg izvorni miš dobijen je od Gunter Hammerling (German Cancer Research Center, Heidelberg, Germany). Ukratko, 6-kb NdeI fragment HLA DRA genomskog klona u pUC i 24-kb ClaIxSalI fragment cos 4.1 koji sadrži B gen su međusobno spojeni u oplođena jaja od (C57BL/6xDBA/2)-F1 donora uparenih sa C57BL/6 mužjacima. Transgeni miševi odgojeni su do I-Ab knockout miševa. DR3 miševi su odgojeni do

C57BL/10 osnove 10 generacija. Ovi DR3 miševi izrazili su HLA-DRB1*0301 molekul ali ne i MHC-II molekul miševa.

[0138] DR4 soj miševa originalno je stvoren od strane Lars Fugger et al (PNAS 1994; volume 91:6151-6155) tako da su HLA-DRA*0101/ HLA-DRB1*0101 i mCD3-huCD4c/g konstrukti ko-mikroubrizgani u embrione od (DBA/1xA.CA)F1 parnjaka i održivi embrioni su preneti u pseudo-trudnu ženku (Balb/c x 129)F1 za razvijanje do termina. Potomstvo je zatim odgojeno do IA-b nokaut bez C57BL/6 genetske osnove (AB0 miševi) miševa sa ekspresijom MHC klase II molekula. Jedini MHC klase II molekul čija je izvršena ekspresija u ovim DR4 miševima je stoga ljudski HLA DR4 molekul.

[0139] Ispitivanja životinja odobrena su od strane ’Etičkog komiteta za životinjske eksperimente’ (ECD) na Hasselt Univerzitetu i izvršeni su uz najviše standarde nege u instituciji bez patogena.

Peptidi

[0140] Peptidi su sintetisani sa GL Biochem Ltd (Shangai, China) i smešteni u dimetil sulfoksid (DMSO; Sigma-Aldrich, Bornem, Belgium) na -80°C.

Ispitivanje vezivanja peptida za HLA-DRB1*0301

NetMHCII 2.2 Server

[0141] NetMHCII 2.2 server predviđa vezivanje peptida za HLA-DRB1*0301 upotrebom mreže veštačkih neurona. Vrednosti predviđanja dati su u nM IC50 vrednostima. Jako i slabo vezujući peptidi ukazani su u uzlazu. Peptidi sa visokim afinitetom za vezivanje imaju IC50 vrednost ispod 50 nM, a slabo vezujući peptidi IC50 vrednosti ispod 500 nM. Rezultat je prikazan kao rezultat koji se računa kao što sledi: 1-log50000(aff). Adresa veb stranice: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII.

Baza podataka imunih epitopa (IEDB): konsenzus metoda

[0142] Za svaki peptid, procentualni rang za svaku od četiri metoda (ARB, kombinatorna biblioteka, SMM_align i Sturniolo) je stvoren upoređivanjem rezultata peptida sa rezultatom pet miliona nasumičnih 15-mera izabranih iz SWISSPROT baze podataka. Procentualni rang sa malim brojem ukazuje na visoki afinitet. Procentualni rang sa srednjom vrednošću za četiri metode zatim je korišćen za stvaranje ranga za konsenzusnu metodu. Adresa veb stranice: http://tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_II_binding.html.

Određivanje imunogeniciteta dugačkih peptida

Pripremanje

[0143] DR3 miševi su subkutano ubrizgani na početku repa sa 100 µg antigena u PBS (Lonza, Verviers, Belgium) emulgovanog sa omplete Freund Adjuvant ((CFA; BD Benelux, Erembodegem, Belgium) koji je sadržao 4 mg/ml Mycobacterium tuberculosis (MTb, BD Benelux)) (100µl/injekciji). U zavisnosti od eksperimenta, RNB peptidi ili TSHR-289 protein ukupne dužine korišćeni su kao antigen. Kontrolne životinje su ubrizgane u isto vreme samo sa PBS/CFA.

Ćelijska kultura

[0144] Deset dana nakon imunizacije, oceđeni limfni čvorovi (LN) i slezina su sakupljeni. LN ćelije i splenociti izolovani su i kultivisani in X-vivo 15 medijumu (dopunjen sa glutaminom, penicilinom i streptomicinom; Lonza) u ploči sa 96 otvora i ravnim dnom. Za ispitivanje proliferacije ćelija uzrokovane antigenom, 0,5x10<6>ćelija/otvoru kultivisano je (200 µl/otvoru) 72 sata sa različitim koncentracijama antigena (0-25 µg/ml) ili sa 12,5 µg/ml prečišćenog derivata proteina (PPD; pripremna kontrola; Statens serum institut, Copenhagen, Denmark).

Test proliferacije i analiza citokina

[0145] Nakon 72 sata, 60 µL ćelijskog supernatanta sakupljeno je i zamrznuto.20 µL/otvoru titrisanog timidina (PerkinElmer, Zaventem, Belgium) je zatim dodato ćelijama kako bi se dostigla krajnja koncentracija od 1 µCi/otvoru. Ćelije su inkubirane pri 37°C, i nakon 16h, ploče su zamrznute. Odmrznute ploče sakupljene su i pročitane sa β-brojačem (Wallac 1450 Microbeta Trilux Liquid Scintillation Counter) kako bi se procenila proliferacija ćelija.

Odmrznuti supernatant analiziran je sa mišijim Th1/Th2 10plex FlowCytomix Multiplex (Bender MedSystems, Vienna, Austria) kako bi se izmerila proizvodnja citokina uzrokovana antigenom.

Stvaranje RNB-5 specifičnih hibridoma

Pripremanje i uspostavljanje linije T ćelija

[0146] Na dan 0, miševi su subkutano ubrizgani na početku repa sa 100 µg antigen/CFA (RNB-5 za DR3 miševe; TSHR za DR4 miševe). Kontrolni miševi imunizirani su sa PBS/CFA. Na dan 10, oceđeni LN i slezine su uklonjeni i jednoćelijske suspenzije su stvorene. Neke od ćelija korišćene su za merenje ćelijske proliferacije uzrokovane antigenom, kao što je opisano iznad. Preostali splenociti i LN ćelije pomešane su i CD4<+>T ćelije su izolovane upotrebom kompleta za negativno prečišćavanje (nepromenjene CD4<+>T-ćelije; Miltenyi, Leiden, The Netherlands). CD4<+>T-ćelije su zatim kultivisane zajedno sa antigenom (25µg/ml RNB-5 ili 0,5 µg/ml TSHR-289 protein) i ozračenim splenocitima (3000 rad) od DR3 miševa (APC:CD4<+>T-ćelija odnos 1:1; 5x10<6>cells/ml). Ćelije su kultivisane u X-vivo 15 medijumu za izbegavanje aktiviranje ćelija uzrokovano fetalnim telećim serumom (FCS). Na dan 4, 20 U/ml rekombinantnog ljudskog IL-2 (R&D, Abingdon, United Kingdom) dodato je ćelijama. Na dan 7, žive ćelije su sakupljene eliminisanjem mrtvih ćelija upotrebom Ficoll separacije gradijenta gustine (Histopaque 1083, Sigma-Aldrich). Ćelije su zatim ponovo stimulisane kao što je opisano iznad, menjanjem APC: CD4<+>T-ćelija odnosa na 2:1. Na dan 9, žive ćelije su sakupljene i neke od njih su korišćene za fuziju. Preostale CD4<+>T-ćelije ostavljene su u kulturi i IL-2 su dodate na dan 10. Na dan 14, žive ćelije su sakupljene ponovo stimulisane sa antigenom u prisustvu APC (odnos APC:CD4<+>T-ćelije pri 3:1), i korišćene za drugu fuziju na dan 16.

Fuzija

[0147] 1x10<7>BW5147 ćelije (Health Protection Agency Culture Collections, Salisbury, UK) i 5x10<6>CD4<+>T-ćelije pomešane su u cevi od 50 ml i isprane u 37°C medijumu bez seruma. Nakon centrifugiranja, ćelijski talog blago je ponovo suspendovan. 1 ml 37°C medijuma bez seruma dodat je u trajanju od 30 sekundi uz mešanje, što je praćeno sa 2, 3, 4, 10 i 30 ml uzastopno. Cev je invertovana veoma polako i inkubirana na 37°C 4 minuta. Ćelije su centrifugirane 5 minuta pri 1300 rpm na sobnoj temperaturi (RT) bez prekidanja. Supernatant je uklonjen i 50 ml RT medijuma bez seruma je polako dodato kako bi se izbeglo ispadanje ćelijskog taloga. Korak ispiranja zatim je ponovljen sa potpunim medijumom. Na kraju, ćelije su ponovo suspendovane u RT potpunom medijumu sa 10%-FCS i postavljene pri različitim ćelijskim koncentracijama u ploče sa 96 otvora i ravnim dnom (100 µl/otvoru). Nakon 48 sati, ćelije su kultivisane u 1x hipoksantin-aminopterin-timidin (HAT, Sigma-Aldrich) medijumu i rast ćelija hibridoma uočen je nakon približno 6 dana. Klonovi su održavani u HAT medijumu dok nisu bili stabilni, zatim su odbijeni preko Hipoksantin-timidin (HT, Sigma-Aldrich) medijuma kako bi se završio RPMI medijum. Na regularnoj bazi, klonovi su zamrznuti u medijumu za zamrzavanje (90% FCS+10%DMSO).

Procenjivanje antigen-specifičnosti klonova

[0148] Ćelije hibridoma kultivisane su sa 5x10<4>VAVY ili BM14 ćelijama (ljudska ćelijska linija koja vrši ekspresiju HLA-DRB1*0301 ili HLA-DRB1*0401, redom; International Histocompatibility Working group, Seattle, USA) i antigenom (10-25 µg/ml). Nakon 48h, antigen-uzrokovana IL-2 proizvodnja izmerena je testom enzimom-povezanog imunosorbenta (ELISA).

IL-2 ELISA

[0149] Ploče sa 96 otvora (Immunosorb 96 well, Fisher Scientific, Erembodegem, Belgium) obložene su preko noći na 4°C sa 50 µl/otvoru prečišćenog anti-miš IL-2 zahvaćenog Ab od pacova (BD Biosciences, Oxford, UK), razblažene 1:250 u karbonatnom puferu. Nakon 2 ispiranja sa PBS-0.05% Tween, otvori su blokirani sa 10% FCS/PBS 1 sat pri RT. Zatim su otvori inkubirani sa 50 µl supernatanta ćelijske kulture ili IL-2 standarda (BD Biosciences, Belgium, Erembodegem) 2h na RT. Otvori su inkubirani sa 50µl/otvoru biotin anti-miš IL-2 od pacova (

BD Biosciences) razblažene 1:1000 u 10% FCS/PBS 1 h na RT, što je praćeno inkubacijom sa 50µl/otvoru ekstravidin peroksidaze (Sigma-Aldrich) razblaženo 1:1000 u PBS 30 min na RT. Za uočavanje vezivanja antitela, 50µl/otvora rastvora TMB supstrata (Perbio Science, Erembodegem, Belgium) je dodato. Nakon 11 minuta, obojena reakcija je zaustavljena upotrebom 50µl/otvoru 2M H2SO4. Optička gustina (OD) merena je pri 450 nm (630 nm ref) (Tecan Benelux, Mechelen, Belgium).

Nezavisni sistem prezentovanja procesiranja antigena

[0150] Antigen-specifični klonovi testirani su za svoju reaktivnost na 15-mer peptide (RNB-5A do 5O), prezentovane fiksiranim ili nefiksiranim VAVY ili MB14 ćelijama (=APC). 5x10<4>ćelija od pojedinačnih klonova kultivisano je sa 25 µg/ml peptida i 5x10<4>fiksiranih ili svežim APC. Za fiksiranje APC, ćelije su inkubirane sa 0,5% paraformaldehida (Merck, Darmstadt, Germany) (pH7) 5 min na RT. Reakcija fiksiranja zaustavljena je dodavanjem 0,4M glicina (Sigma-Aldrich) i ispiranjem ćelija u RPMI-10%FCS. Dodatno, reaktivnost prema ljudskom TSHR-289 proteinu (Chesapeake-PERL, Savage, Maryland, USA) merena je za identifikovanje kriptičnih epitopa. Nakon 48h, antigen uzrokovana IL-2 proizvodnja izmerena je sa ELISA.

Procenjivanje rastvorljivosti RNB-5 apitopa

[0151] Rastvorljivost peptida analizirana je sa Anabiotec (Zwijnaarde, Belgium). Ukratko, uzorci peptida rastvoreni su pri dve različite ciljane koncentracije (1mg/ml i 4 mg/ml) dodavanjem PBS pH 7.0 ± 0.1. Peptidni rastvori inkubirani su na RT bar 16 sati. Zamućenost

4

je merena pri 320 i 360 nm, pre i nakon centrifugiranja. Koncentracija peptida određena je upotrebom apsorbancije pri 280 i 205 nm i pomoću HPLC-UV.

[0152] Peptidi su rastvoreni pri koncentraciji od 20 mg/mL u DMSO. Niz za razblaživanje ciljanih koncentracija 4, 2 i 1 mg/mL je pripremljen u PBS. peptidni rastvori inkubirani su na RT 16-17 sati kako bi se omogućilo stvaranje precipitata. Zamućenost je zabeležena vizuelnim posmatranjem i adsorbancija je merena pri 205 nm, 280 nm i 320 nm upotrebom Nanodrop uređaja. Peptidni rastvori su centrifugirani pri 14800 rpm 10 minuta i vizuelna posmatranja i merenja adsorbancije su ponovljena. Koncentracija peptida računata je upotrebom sledeće formule:

Uzrokovanje tolerancije tretiranjem sa RNB-5 apitopima

[0153] DR3 miševi su subkutano ubrizgani u kraj vrata sa RNB-515-mer peptidima (100µg/injekciji) ili PBS na dan -8, -6, -4 (raspored velike doze) (Slika 5). Alternativno, miševi su ubrizgani sa 0,1µg, 1µg i 10 µg peptida na dane -15, -13 i -11 redom, što je praćeno sa 3 injekcije od 100µg peptida na dane -8, -6 i -4 (raspored povećanja doze). Na dan 0, miševi su subkutano ubrizgani u vrh repa sa 100 µg antigena/CFA (RNB-5 peptid ili TSHR-289 protein). Deset dana nakon imunizacije, oceđeni LN i slezine su sakupljene. Test proliferacije i merenje citokina izvršeno je kao što je opisano iznad.

Životinjski model za GD

Imunizacija miševa sa TSHR A-podjedinicom adenovirusa

[0154] Adenovirus koji vrši ekspresiju ljudske TSHR A-podjedinice (ostaci aminokiselina 1-289, A-podjedinica Ad) i kontrolni adenovirus (LacZ-Ad) koji vrši ekspresiju β-galaktosidaze kupljeni su od Viraquest (North Liberty, IA, USA). Ženke Balb/cJOlaHsd miševa stare šest nedelja (Harlan Laboratories, Venray, The Netherlands) intramuskularno ubrizgane su u mišić butine sa TSHR-Ad (10<10>ili 10<11>čestica) ili LacZ-Ad (10<10>čestica). Svi miševi su simultano imunizirani upotrebom iste serije adenovirusa. Miševi su ubrizgani tri puta u intervalu od tri nedelja (dan 0,21 i 42) i uzeta je krv pre prve imunizacije i jednu nedelju nakon druge imunizacije. Svi miševi su eutanazirani 4 nedelje nakon treće injekcije (nedelja 10) kako bi se dobila krv i štitne žlezde.

Imunizacija miševa sa TSHR/CFA

[0155] Ženke C57/B16JOlaHsd miševa stare šest nedelja (Harlan Laboratories) (8 miševa po grupi) subkutano su izazvani na početku repa sa 50 µg TSHR-289 proteina emulgovanog u CFA sa 4 mg/ml MTb (50µl). Miševi su krvarili na repu na dane 0 (preimuno), 7, 21, 35, 49, 63 (Grupa A), dane 0, 14, 28, 42, 56 (Grupa B) ili dane 0, 21, 28, 42, 56 (Grupa C). Miševi grupe C primili su povećanu imunizaciju u nedelji 4 sa 50 µg TSHR-289 proteina emulgovanog u nezavršenom Freundsovom adjuvansu (IFA). Deset nedelja nakon prve imunizacije, svi miševu su eutanazirani i krv je sakupljena srčanom punkcijom.

TSHR antitela

[0156] Anti-TSHR antitela (IgG klasa) protiv prečišćenih TSHR-289 proteina (Chesapeake-Perl) izmerena su upotrebom ELISA. Ploče sa 96 otvora (polovina površine 96-otvora, Fisher Scientific) obložene su preko noći na RT sa 50 µl/otvoru TSHR-289 proteina u PBS (0.5µg/ml). Nakon ispiranja sa PBS-0.05% Tween, otvori su blokirani sa 1% BSA (w/v) u PBS 1h na RT i inkubirani sa test serumom (duplirane alikvote, 1:50 rastvor). Mišija anti-TSHR antitela (A9, Abcam, Cambridge, UK) korišćena su kao pozitivna kontrola. Vezivanje antitela zatim je uočeno sa peroksidaza konjugovanim kozjim anti-mišijim IgG repe (Abcam) i signal je razvijen sa TMB. Optička gustina (OD) je izmerena u čitaču ploča pri 450 nm (Tecan Benelux).

Serum tiroksin i tiroid histologija

[0157] Ukupni tiroksin (T4) meren je u nerastvorenom mišijem serumu (10µl) upotrebom CBI miša/pacova tiroksin ELISA kit (Calbiotech, Spring Valley, CA, USA) u skladu sa uputstvima proizvođača. T4 vrednosti izračunate su iz standarda u kompletu i izražene su kao µg/dl. Štitne žlezde su fiksirane u 10% neutralnom puferskom formalinu (pH 7.5), procesirane do sekcija i obeležene sa hematoksilinom i eozinom. Sekcije su posmatrane za patološke promene (hipertrofija, hipercelularnost epitelnih ćelija i infiltracija limfocita) i poređane po rezultatima (KWS Biotest, Bristol, UK).

Tabela 1

4

Linije T ćelije ljudi PBMC (Primer 5)

[0158] Periferni monociti iz krvi (PBMC) od zdravih donora ili pacijenata Grejvzove bolesti su izolovani (Histopaque-1077, Sigma-Aldrich), i zamrznuti u alikvotama. Na dan 0, ćelije su odmrznute i 106 PBMC/ml kultivisanih sa 20 ug/ml peptida u dopunjenom (10mM HEPES, 50U/ml Penicillin/Streptomycin i 4mM L-Glutamine (Lonza)) RPMI 1640 (Lonza) sa 5% AB serumom (Sigma Aldrich) je dodato u ploču sa 6 otvora (Greiner Bio-one) i inkubirano u 37C i 5% CO2. Nakon 7 dana rhIL-2 (R&D Systems) je dodat krajnjoj koncentraciji od 20U/ml. Na dan 12, ćelije su sakupljene, isprane i vraćene u kulturu pri koncentraciji od 106 2x106 novo odmrznutih autolognih PBMC/ml u ploči sa 6 otvora stimulisanih sa 5-10ug/ml peptida i 20U/ml rhIL-2. Na dane 15, 18 i 21 dodatni rhIL-2 dodat je krajnjoj koncentraciji od 20u/ml.

[0159] Na dan 24 ćelije su sakupljene, isprane i 2x104 ih je kultivisano u ploči sa 96 otvora i okruglim dnom (Cellstar, Greiner Bio One) sa 105 ozračenih autolognih PBMC i VAVY/BM14/MGAR linijama ćelija koje vrše ekspresiju ljudskih MHC kl II molekula (International Histocompatibility Working group, Seattle, US) u dopunjenom RPMI 5% AB serumu u prisustvu različitih antigena (peptidi, proteini) u koncentraciji od 5- 50ug/ml. Kulture su inkubirane 48h sa 0.5 uCI/otvoru 3H-timidina (Perkin Elmer) dodatih krajnjih

4

18h. Nakon što su ploče bile zamrznute ćelije su sakupljene i očitane sa β brojačem (Wallac 1450 Microbeta Trilux) kako bi se procenila proliferacija. Pre dodavanja 3H-thymidine, 60ul/ćeliji supernatanta ćelijske kulture uklonjeno je za analizu citokina.

IFN gama ELISA

[0160] Supernatanti iz TCL kultura procenjeni su za IFN gama sadržaj korišćenjem ljudskog IFN-gamma Duoset kompleta, R&D Systems praćenjem uputstava proizvođača. Optička gustina izmerena je pri 450 nm (Tecan Benelux)

[0161] Različite izmene i varijacije opisanih metoda i sistema prema pronalasku biće očigledne onima koji su stručni u ovoj oblasti

Iako je pronalazak bio opisan odnoseći se na specifična poželjna otelotvorenja, treba prihvatiti da pronalazak kako se zahteva ne bi trebalo da se nepotrebno ograničava na takva specifična otelotvorenja. Štaviše, različite izmene opisanih režima za izvršenje pronalaska koje su očigledne stručnima u molekularnoj biologiji, imunologiji ili povezanim oblastima namenjene su da budu u okviru pratećih patentnih zahteva.

4

Claims (10)

1. Patentni zahtevi 1. Peptid koji je sposoban da se veže za MHC molekul in vitro i da bude prezentovan T ćeliji bez antigen procesiranja, koji je izabran iz sledećeg:
2. 2. Peptid koji je sposoban da se veže za MHC molekul in vitro i da bude prezentovan T ćeliji bez antigen procesiranja, gde je peptid izabran iz sledeće grupe: KKGIYVSIDVTLQQLESHGKK (SEQ ID No 12), KKGKYVSIDVTLQQLESHGKK (SEQ ID No 22), KKGIKVSIDVTLQQLESHGKK (SEQ ID No 23), KKGIYKSIDVTLQQLESHGKK (SEQ ID No 24), KKGIYVSIDVKLQQLESHGKK (SEQ ID No 25), KKGIYVSIDVTLQKLESHGKK(SEQ ID No 26), KKGIYVSIDVTLQQKESHGKK (SEQ ID No 27), KKGIYVSIDVTLQQLKSHGKK (SEQ ID No 28), KKGIYVSIDVTLQQLEKHGKK (SEQ ID No 29), KKGIYVSIDVTLQQLESKGKK (SEQ ID No 30), KKGYVSIDVTLQQLEGKK (SEQ ID No 31), KKGYVSIDVKLQQLEGKK (SEQ ID No 32), KKGYVSIDVTLQKLEGKK (SEQ ID No 33), KKGYVSIDVTLQQKEGKK (SEQ ID No 34), KKGYVSIDVKLQKKEGKK (SEQ ID No 35), KKGIYVSIDVTLQQLEGKK (SEQ ID No 36), KKGIYVSIDVKLQQLEGKK (SEQ ID No 37), KKGIYVSIDVTLQKLEGKK (SEQ ID No 38), KKGIYVSIDVTLQQKEGKK (SEQ ID No 39), KKGIYVSIDVKLQKKEGKK (SEQ ID No 40), KKGTYVSIDVTLQQLEGKK (SEQ ID No 41), KKGTYVSIDVKLQQLEGKK (SEQ ID No 42), KKGTYVSIDVTLQKLEGKK (SEQ ID No 43), KKGTYVSIDVTLQQKEGKK (SEQ ID No 44), KKGTYVSIDVKLQKKEGKK (SEQ ID No 45), KKKIYVSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No 21), KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No 46), KKKIKVSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No 47), KKKIYKSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No 48), KKKIYVKIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No 49), KKKIYVSIDVKLQQLESHKKK (SEQ ID No 50), KKKIYVSIDVTLKQLESHKKK (SEQ ID No 51), KKKIYVSIDVTLQKLESHKKK 4 (SEQ ID No 52), KKKIYVSIDVTLQQKESHKKK (SEQ ID No 53), KKKIYVSIDVTLQQLKSHKKK (SEQ ID No 54), KKKIYVSIDVTLQQLEKHKKK (SEQ ID No 55), KKKIYVSIDVTLQQLESKKKK (SEQ ID No 56), KKKYVSIDVTLQQLEKKK (SEQ ID No 57), KKKYVSIDVKLQQLEKKK (SEQ ID No 58), KKKYVSIDVTLQKLEKKK (SEQ ID No 59), KKKYVSIDVTLQQKEKKK (SEQ ID No 60), KKKYVSIDVKLQKKEKKK (SEQ ID No.61).
3. 3. Peptid prema patentnom zahtevu 2, gde je peptid izabran iz grupe koja se sastoji iz: KKGKYVSIDVTLQQLESHGKK (SEQ ID No.22), KKGIYKSIDVTLQQLESHGKK (SEQ ID No.24), KKGYVSIDVTLQQLEGKK (SEQ ID No.31), KKGYVSIDVKLQQLEGKK (SEQ ID No.32), KKGYVSIDVTLQKLEGKK (SEQ ID No.33), KKGYVSIDVTLQQKEGKK (SEQ ID No.34), KKGYVSIDVKLQKKEGKK (SEQ ID No.35), KKGIYVSIDVKLQKKEGKK (SEQ ID No.40), KKGTYVSIDVKLQQLEGKK (SEQ ID No.42), KKGTYVSIDVKLQKKEGKK (SEQ ID No.45), KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No.46), KKKIYKSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No.48), KKKIYVKIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No.49), KKKYVSIDVTLQQLEKKK (SEQ ID No.57), KKKYVSIDVKLQQLEKKK (SEQ ID No.58), KKKYVSIDVTLQQKEKKK (SEQ ID No.60), KKKYVSIDVKLQKKEKKK (SEQ ID No.61).
4. 4. Peptid prema patentnom zahtevu 3, gde je peptid izabran iz grupe koja se sastoji iz: KKGIYKSIDVTLQQLESHGKK (SEQ ID No.24), KKGYVSIDVKLQQLEGKK (SEQ ID No 32), KKGYVSIDVTLQKLEGKK (SEQ ID No.33), KKGYVSIDVTLQQKEGKK (SEQ ID No.34), KKGYVSIDVKLQKKEGKK (SEQ ID No.35), KKGTYVSIDVKLQQLEGKK (SEQ Id No.42), KKGTYVSIDVKLQKKEGKK (SEQ ID No.45), KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No.46), KKKIYKSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No.48), KKKYVSIDVTLQQLEKKK (SEQ ID No.57), KKKYVSIDVTLQQKEKKK (SEQ ID No.60). 4
5. 5. Peptid prema patentnom zahtevu 3, gde je peptid izabran iz grupe koja se sastoji iz: KKGYVSIDVTLQKLEGKK (SEQ ID No.32), KKGYVSIDVKLQKKEGKK (SEQ ID No.34), KKKKYVSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No.46), KKKIYKSIDVTLQQLESHKKK (SEQ ID No.48), KKKYVSIDVTLQQLEKKK (SEQ ID No.57), KKKYVSIDVTLQQKEKKK (SEQ ID No.60).
6. 6. Sastav koji sadrži više peptida, koji uključuje jedan ili više peptida prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu.
7. 7. Peptid prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 5, ili sastav prema patentnom zahtevu 6, za upotrebu pri suzbijanju ili sprečavanju proizvodnje TSHR autoantitela in vivo.
8. 8. Peptid prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 5, ili sastav prema patentnom zahtevu 6, za upotrebu pri lečenju i/ili sprečavanju Grejvzove bolesti kod pacijenta.
9. 9. Peptid ili sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 7 ili 8, gde je pacijent HLA-DR3.
10. 10. Peptid ili sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 7 ili 8, gde je pacijent HLA-DR4. 4