PT98236A

PT98236A - Processo para a preparacao de enantiomeros de acidos 2-aril-alcanoicos

Info

Publication number: PT98236A
Application number: PT9823691A
Authority: PT
Inventors: Barry Stieglitz; William J Linn; Wolfram Jobst; Karen M Fried; Robert D Fallon; Kjeld Ingvorsen; Birgitte Yde
Original assignee: Novo Nordisk As; Du Pont
Priority date: 1990-07-05
Filing date: 1991-07-05
Publication date: 1992-05-29
Also published as: DK161690D0; CA2086236A1; IE912338A1; WO1992001062A1; JPH05507625A; AU8204091A; EP0537259A1

Description

Γ-Λ.- .··' τ V" Μ. 1 t.Jt ... ;?ν *Γ;?ϊ ί; C\V Ρλ-*ν ..1. :. - ·. :ίτ-τ1“:-Γ-τχ -tVt "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ENANTIÓMEROS DE ÃCIDOS 2-ARIL-ALCANÕICOS"

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a um processo para a pre paração de enantiómeros de um ácido por hidrólise enantioselec tiva de uma mistura de amida R e S correspondente na presença de uma amidase enantioselectiva.

Também se refere a um microrganismo que produz a amidase e a amidase imobilizada para a aplicação no referido processo.

Antecedentes

Muitos intermédios agroquímicos e produtos farmacêuticos de fórmula geral I descritos em seguida são correntemente comercializados e utilizados sob a forma de misturas racémicas ou diastereoméricas. Em muitos casos, o efeito fisiológico de riva especificamente apenas de um enantiõmero/diastereómero , enquanto que outros enantiómero/diastereómeros são inactivos ou até prejudiciais. As técnicas químicas ou enzimáticas para a diferenciação de enantiómeros estão a tomar uma importância cres? cente para a produção de químicos de grande pureza õptica. A produção enzimãtica de ácidos opticamente activos como os ácidos 2-arilalcanõicos por hidrólise enantioselectiva de ami das racémicas correspondentes na presença de um microrganismo ou de uma enzima é conhecida a partir do pedido de patente de invenção Europeu com o número de publicação 326.482. Os micror ganismos utilizados pertencem aos géneros Corynebacterium e Brevibacterium. 0 processo foi realizado sem intervenção de dissolventes orgânicos e o material com actividade enzimática foi inutilizado após a sua utilização única. Os dados dos exem pios deste pedido de patente de invenção Europeu com o número de publicação 326.482 indicam que a conversão da amida S no áci do varia entre 40 e 65%, isto i 35 e 60% da amida S permanece sem se converter. 0 excesso de enantiómero da forma S no ácido produzido foi de 92 a 97%. Os microrganismos foram cultivados num substrato de fermentação que incluía N-metilacetamida. 0 pedido de patente de invenção Europeu com o número de publicação 356.912 descreve microrganismos dos géneros Pseu-domonas, Fusarium, Rhodococcus, Brevibacterium, Micrococcus , Bacteridium e Bacillus capazes de converterem nitrilos 2-subs-tituídos alifáticos racémicos no ácido carboxílico 2-substitu_í dos alifático com actividade óptica. Está aceite que os micror ganismos são também activos sobre os nitrilos 2-substituídos aromáticos, mas os dados depois não são fornecidos. O excesso do enantiómero do ácido S que resulta do nitrilo correspondente após terminar a reacção teve um valor máximo de 84%. No ca so da utilização de Rhodococcus para a conversão do nitrilo num ácido, o excesso de enantiómero foi de 35%. O substrato de fer mentação incluiu nitrilo. O pedido de patente de invenção Europeu com o número de publicação 348.901 refere um processo para a produção de um áci do orgânico o( -substituído com actividade óptica mediante o tra tamento de um nitrilo ^(-substituído racémico ou de uma amida,

com um .microrganismo escolhido entre os..géneros.Alcaligenes, -

- I

Pseudomonas, Rhodop-seudomonas, Coryhebacterium, Acihefcohacter'' \ /

Bacillus, Mycobacterium, Rhodococcus e Candida. 'Esta publica \ ção n° 348.901 não descreve o microrganismo utilizado no pro ( . cesso da presente invenção. - · É objectivo desta invenção -proporcionar um processo pa ra melhorar a conversão enantioselectiva de amidas, por exemplo amidas 2-arilalcanóicas.

Uití trabalho que descreve um exame de 809 estirpes isola das de 330 amostras de diferentes solos para produzir um ácido S a partir do nitrilo correspondente ou da amida descreve-se em Appl. Environ. Microbiol. 56 (1990), páginas 3125 e seguintes, o qual foi publicado após a data de prioridade do presente pedido de patente de invenção.

Constitui também objectivo desta invenção proporcionar um processo através do qual uma mistura de amidas R e S que conss tituem enantiómeros é convertida no ácido que corresponde a um dos dois enantiómeros da amida com bom rendimento e grande pure za. É também um objectivo da presente invenção proporcionar um método para a.produção de amidase enantioselectiva sem necessidade da presença de nitrilo ou de amida como indutores.

Descrição da presente invenção A presente invenção proporciona um processo para a produ ção do enantiómero de um ácido, por hidrólise de enantioselectiva de uma mistura da amida S e R correspondente, na presença de material biológico com actividade enzimãtica com acção de amida s se enantioselectiva. Por este processo, os dois tipos de rendimento são por um lado o grau de conversão e, por outro lado a pureza do ácido resultante. 0 grau de conversão é o grau com que um dos dois enantiómeros das amidas é convertido no ácido. .· . A pureza dos ácidos resultantes tem-se designado aqui como excesso de enantiómero e é definida em seguida. Como mencionado anteriormente, a presente invenção é superior pelo menos no que se refere a um destes dois tipos de rendimento.

Verificou-se que, surpreendentemente , ê possível obter-se um grande rendimento de conversão pelo processo da presente in venção. Sob certas condições reaccionais, i ainda possível obter-se um grau de conversão próximo de 100%.

Em adição e, inesperadamente, obtim-se um excesso muito elevado de enantiómero, aplicando-se o processo desta invenção. Sob certas condições reaccionais é mesmo possível obter-se um excesso de enantiómero próximo de 100%.

Por isso, após se completar o proceso da presente invenção e remoção da amida (s), o ácido R ou S resultante apresenta grande pureza, em alguns casos uma pureza próxima de 100%. Deste modo, a partir de uma mistura inicial de uma amida R e S, correspondente a enantiómeros, eventualmente uma mistura racémica de amidas R e S, é possível, através do process so desta invenção, a produção directa de uma mistura de ácido S e amida R não convertida essencialmente isenta de ácido R e amida S ou a produção de uma mistura de ácido R e de amida S não convertida essencialmente isenta de ácido S e amida R. Isto permite a separação simplificada e rendimento maior.

Exemplos de ácidos apropriados que podem ser preparados

Ot.

pelo processo desta invenção são os compostos de fórmula geral I

% X - CR^ - COOH (I) na qual X representa um grupo fenilo ou naftilo contendo, even tualmente, como substituintes átomos de halogéneo ou grupos alquilo, alcoxi ou benzoílo, representa um grupo hidroxi , amino ou alquilo, e R2 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo.

Exemplos de amidas que se podem utilizar como material inicial no processo desta invenção são os compostos de fórmula geral II x - cr1r2 - CONH2 (II) na qual , R2 e X têm, cada um, os significados definidos an tes.

Obviamente, os grupos fenil e naftilo citados anterior mente podem comportar, eventualmente substituintes. 0 grupo naftilo pode ser um grupo o( ou β naftilo. 0 átomo de halogéneo ê de preferência o cloro ou o flúor. Os grupos alquil e alcoxi são de preferência grupos alquil inferior ou alcoxi inferior. Pósteriormente, a designação de inferior indica que o grupo em questão contém não máis que 10 átomos de carbono, de preferência não mais que 4 átomos de carbono. A amida utilizada pelo processo desta invenção pode, eventualmente, produzir-se in situ.

Como o material biológico com actividade enzimática utjL lizado no processo desta invenção tem actividade de amidase enantioselectiva, este material pode ser aqui designado por uma amidase. -6

Em um aspecto desta invenção, o processo é caracteri-zado porque o material biológico se encontra imobilizado. Em um segundo aspecto, o processo é caracterizado pela realização da hidrólise na presença de um dissolvente orgânico. A enantioselectividade da amidase utilizada no processo desta invenção pode ser determinada por hidrólise de uma ami da racémica, por exemplo, um ácido de fórmula geral II, como por exemplo, 2-(4-clorofenil)-3-metilbutiramida racémica. 0 grau de conversão obtido pelo processo desta invenção situa-se de preferência entre cerca de 65%, com mais preferência superior a 90%, aproximadamente, ainda mais preferencialmente a proximidade dos 95% ou mesmo acima dos 99%. Os graus de conversão preferidos são obtidos utilizando-se em especial condições reaccionais preferidas que são posteriormente ilustradas nos exemplos seguintes. O excesso de enantiómero do ácido enantiómérico resultan te é de preferência de 85% aproximadamente, com maior preferência cerca de 90% e ainda com maior preferência cerca de 95%. UtjL lizando-se condições reaccionais especialmente preferidas que são posteriormente ilustradas nos exemplos seguintes, o excesso enatiómero do ácido enantiomérico resultante pode situar-se aci^ ma de 99%, com maior preferência cerca de 99,5%, e ainda com maior preferência cerca de 99,9%. O excesso de enantiómero é calculado a partir da concentração das formas R e S utilizando--se a equação seguinte: ( [S] - [R] ) / < [S] -h [R] xl00% em que [R] e [S] representam as concentrações das formas R e S, respectivamente. -7

Esta invenção também proporciona uma cultura biologica mente pura de microrganismo com actividade enzimãtica com acção de amidase enantioselectiva. De facto, a presente invenção descreve uma estirpe de Rhodococcus que produz constitutivamen te actividade amidase, isto é sem necessidade de apelo a um indutor como por exemplo uma amida.

Além disso, a presente invenção proporciona material biológico com actividade enzimãtica, imobilizada, com activida de de amidase enantioselectiva para se aplicar no processo citado anteriormente. Também, a presente invenção, proporciona ma terial biológico com actividade enantioselectiva de amidase, caracterizado por ser derivado de uma estirpe de Rhodococcus e um método para a preparação de material biológico contendo actividade de amidase enantioselectiva, caracterizado pelo facto de se cultivar uma estirpe de Bhodococcus produtora de amidase num meio que não inclui nitrilo ou amida (insubstituldos ou N-substituídos).

Além disso, a presente invenção também proporciona cu]L turas biologicamente puras de microrganismos com actividade en zimática com acção de amidase enantioselectiva e um método para a preparação deste material biológico. Estes microrganismos podem obter-se a partir de estirpes de Serratia, Moraxella ou Pseudomonas.

Descrição detalhada da presente invenção 0 processo desta invenção é realizado de uma forma conhecida per se submetendo a mistura da amida R e S, que são enantiómeros à acção do material biológico em questão num meio reaccional adequado. Os técnicos desta área estão aptos a determinar as condições convenientes para realizar o processo des ta invenção, tendo em atenção esta memória descritiva, que inclui os exemplos seguintes. 0 material biológico utilizado no processo da presente invenção é preparado de uma maneira convencional. 0 material biológico contendo actividade de amidase obtêm-se de preferência de forma convencional a partir de uma amidase constitutiva produzida pelas estirpes de Rhodococcus , especialmente de Rhodococcus erytropolis DP-10. Esta estirpe nã crobiológica foi depositada de acordo com os termos do tratado de Budapeste em DSM (Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmBH, Braunschweig, Germany) em 23 de Março de 1990 sob o número de aceitação DSM 5910. Outras estirpes de Rhodococcus erythropolis depositadas em 21 de Fevereiro de 1991, como descrito anteriormente, incluem DSM 6374, DSM 6375 e DSM 6378 (correspondendo aos números DP-11, DP-26 e DP-25, de Rhodococcus erythropolis, respectivamente). A estirpe DSM 5910 é capaz de hidrolisar uma grande variedade de amidas alifáticas e aromáticas com a formação dos seus ácidos correspondentes. Contudo, a estirpe, hidrolisa a forma D e L das amidas do aminoácido tais como a fenilglicina e diversas amidas alifáticas de aminoãcidos. É muito surpreen dente que esta estirpe (e outras estirpes pertencendo aos géne ros Rhodococcus), possuem a capacidade de realizar a hidrólise enantioselectiva de amidas racémicas de acordo com a presente invenção. A estirpe DSM 5910 tem a vantagem de ser constitutiva para a produção de amidase, isto é não necessitar a presença de indutores para a expressão maximizada de actividade de amida -9- -9-

A amidase de Rhodococcus tem normalmente uma enantio-selectividade como citada anteriormente de 85%, de forma conveniente será de 90%, e de uma forma ainda mais conveniente de 95%, sendo a forma mais preferida a de 99%. O material biológico apresentando actividade de amida se também se obtém de uma maneira convencional a partir de ess tirpes produtoras de amidase de Serratia, Moraxella e Pseudo-monas . Estas estirpes estão depositadas de acordo com os ter mos do tratado de Budapeste em NRRL (Northern Regional Research Laboratories, Peoria, II, USA) com os números de aceitação designados em seguida. Pseudomonas putida NRRL-B-18669 e Moraxel la sp. NRRL-B-18671 depositadas ambas em 8 de Julho de 1990 e ainda Pseudomonas putida NRRL-B-18820. A Pseudomonas sp. NRRL--B-18819 e Serratia liquefaciens NRRL-B-18821 foram, depositadas em 9 de Maió: de 1991.

De acordo com esta invenção, o processo é realizado ge ralmente em meio aquoso ou aquoso orgânico homogéneo ou hetero géneo a condições de temperatura e pH determinadas em função das células imobilizadas, das células totais ou do extracto celular a partir de microrganismo e da mistura da amida do'ácido resultante. A reacção enzimática pode realizar-se utilizando--se células imobilizadas num lote sob condições contínuas. 0 material inicial para o processo desta invenção pode ser uma amida preparada previamente; esta pode preparar-se, por exemplo, por hidrólise química ou enzimática do nitrilo correspondente. Alternativamente, a amida pode ser produzida in situ, por exemplo, por hidrólise enzimática do nitrilo correspondente.

Após completada a reacção, o ácido enantiomérico pode ser recuperado da mistura reaccional e purificado por meios con-

vencionais. Se uma mistura de amida R e S, (por exemplo uma mistura racémica) , ê utilizada como material inicial, o procejs so resulta numa mistura de ácido S e amida R ou numa mistura de acido R e amida S. Após a separação da amida do ácido, a amida pode ser racemizada de acordo com métodos convencionais na amida racémica que pode ser reciclada e hidrolizada como descrito anteriormente.. A racemização pode realizar-se por refluxo da amida com uma resina permutadora de anião que contém um grupo de amónio quaternário funcional, por exemplo, Amberlite IRA-400 sob a forma OH em tolueno ou em outro dissolvente não aquoso. 0 material biológico com actividade enzimática a ser uti_ lizado de acordo com esta invenção pode, por exemplo, ser células completas, pasta celular, células homogeneizadas ou uma solução de enzima eventualmente purificada. A imobilização pode realizar-se por métodos convencionais, como por exemplo, a liga ção cruzada, por exemplo, com glutaraldeído ou poliazetidina de acordo com a memória descritiva da patente de invenção Norte Americana nQ 4.892.825.

De preferência, o material imobilizado, utilizado é sub metido a um processo contínuo, quer numa coluna de leito fixo ou por agitação num reactor. Se se utiliza um dissolvente orgânico é particularmente adequada a utilização de um reactor em tanque, com agitação, onde o material imobilizado e a fase constituída pelo dissolvente orgânico são retidos por uma membrana hidrofílica (ver exemplo 8, figura 1). 0 dissolvente orgânico a utilizar no processo desta in venção pode ser um dissolvente miscível com água (como por exem pio, o dimetil sulfóxido) ou um dissolvente não miscível com água (como por exemplo, o tolueno ou o octano). A quantidade

% de dissolvente situa-se de um modo geral entre 2 e 20% em peso do sistema reaccional. O processo desta invenção pode ser utilizado para produzir ácidos 2-arilalcanóicos de fórmula geral I. 0 processo da presente invenção ê particularmente adequado à produção de ácidos em que o grupo aril representado por X é um grupo fenil, £-clorofenil·, £-isobutilfenil, 3-ben-zoílfenil, β -naftilo ou 6-metoxi-2naftilo e em que o grupo re presentado pelo símbolo R é um grupo hidroxi, metil, etil ou isopropil.

Alguns dos exemplos específicos dos ácidos que podem ser preparados .-•de'’ acordo com o método da presente invenção são os seguintes: ácido 2-(4-clorofenil)-3-metilbutírico (designado posteriormente por CPIA), ácido (6-metoxi-2-naftil)-hi droxipropiónico, ácido 2-(6-metoxi-2-naftil)-propiónico, ácido 2-(4-isobutilfenil)-propiónico, ácido 2-fenil-2-hidroxipropió-nico e ácido 2-(3-benzoílfenil)-propiónico.

Abreviaturas CPIAm representa ácido 2-(4-clorofenil)-3-metilbutira-mida, CPIA representa ácido 2-(4-clorofenil)-3-metilbutírico , IBAm representa ácido 2-(4-isobutilfenil)-propionamida, IBAC representa ácido 2-(4-isobutilfenil)-propiónico (ibuprofen), NPAm representa ácido 2-(6-metoxi-2-naftil)-propionamida, KPAC representa ácido 2-(6-metoxi-2-naftil)-propiónico (naproxen) , ATAm representa ácido 2-fenil-2-hidroxi-propionamida, ATAC re presenta ácido 2-fenil-2-hidroxipropiónico e HPLC refere-se a cromatografia líquida de alta resolução.

Processo analítico

Nos exemplos que seguem, a amida e os produtos ácidos citados anteriormente foram avaliados por cromatografia de al_ ta resolução de fase inversa. Aplicou-se uma coluna Zorbax C18 com fases móveis de metanol entre 70 e 75% e água entre 25 e 30% acidificada com ácido fosfórico a 0,1% ou acetonitri, lo a 67% e 33% de água acidificada com ácido fosfórico a 0,1%. A identificação cromatográfica e doseamento dos produtos ácidos foram determinados por comparação com padrões autênticos. Realizou-se HPLC quiral para a separação de CPIAm/CPIA, NPAm/NPAC e IBAm/IBAC, enantiómeros, com uma coluna θ( ^-AGP obtida de Chromtech (Suécia). As fases móveis para a separação dos vários enantiómeros estão resumidas em seguida.

Separação por HPLC quiral de enantiómeros de amida e de ácido

Enantiómeros

Fase móvel

CPIAm, CPIA

Tampão de fosfato 0,01M 95% (pH 6,0): etanol a 5%

NPAm, NPAC

Tampão de fosfato 0,04M 95% (pH 5,6): etanol a 5%

IBAm, IBAC

Tampão de fosfato 0,02M 96% (pH 5,2): etanol a 4% A HPLC quiral para a separação dos enantiõmeros de ATAm e ATAC realizou-se com uma coluna Resolvosil BSA-s-7 (Alltech , Inc.)· A fase móvel utilizada para a composição do enantiómero ATAm/ATAC foi tampão de fosfato 0,01M (pH 6,0). A composição enantiomérica, identificação e pureza cromatográficas das ami-das e ácidos citados anteriormente foram determinados por compa ração com padrões enantioméricos autênticos ou com misturas ra-cémicas.

Exemplos de produção

Hidrólise química de R,S-CPIN para R,S-CPIAm

Uma suspensão contendo 9,69 g de 2-(4-clorofenil)-3-me-tilbutironitrilo racémico (50 mmoles), 75 ml de dioxano, 75 ml de agua e 25,2 g de resina Amberlite IRA-400 (OH) foi agitada e submetida a refluxo durante 64 horas. Após a filtração da resina, evaporou-se o filtrado até à secura e secou-se sob vácuo em estufa a uma temperatura entre 50 e 55°C obtendo-se 9,8 g de CPIAm racémico não purificado. A composição do material recolhido foi determinada por HPLC. O material recolhido continha 3,6 mmoles de 2-(4-clorofe nil)-3-metilbutironitrilo racémico e 46,4 mmoles de CPIAm racémico.

Exemplo 1

Preparação do material biológico com actividade de amidase enan-tioselectiva -14-

Utilizaram-se como microrganismos Rhodococcus erythropo-lis DSM 5910 (DP-10), Rhodococcus erythropolis DMS 6374 (DP—11), Rhodococcus erythropolis DSM 6378 (DP-25), Rhodococcus erythropolis DSM 6375 (DP—26), Pseudomonas putida NRRL-B-18669 (13-5S--ACN-2a), Moraxella sp. NRRL-B-18671 (3L-A-l-5-la-l), Pseudomonas sp. NRLL-B-18819 (2D-ll-5-lc) e Serratia liquefaciens NRRL-B-18821 (ΜΟΒ IM/N3). O meio de desenvolvimento utilizado para a cultura de Pseudomonas, Serratia e Moraxella foi preparado com os componen tes seguintes. g/ι kh2po4 8,85 Citrato de sódio 2,25 MgS04.7H20 0,5 FeS04.7H20 0,05 Glucosea 10,0 Solução de oligo elementos 1,0 ml Solução de vitaminas 1,0 ml Nitrilo 2,1 g a Adicionou-se após autoclavagem. b A solução de oligo elementos: 10 ml de 25% HCL, 1,5 g de FeCl2.4H20, 0,019 g de CoCl2.6H20, 0,1 MnCl2.4H20, 0,07 g de ZnCl2, 0,062 g de H.jB03, 0,036 g de NaMo04.2H20, 0,024 g de 6H>0 e 0,017 g de CuCl2.2H20, dissolvidos em acido clo- níci2. rídrico e água destilada que se adicionou até completar 1 litro. -1 -1 c

Solução de vitaminas: 0,01 g de biotina, 0,01 g de ácido fõlico, 0,05 g de cloridrato de piridoxina, 0,025 g de riboflanina, 0,025 g de cloridrato de tiamina, 0,025 g de ácido nicotínico, 0,025 g de ácido pantoténico, 0,0065 g de vitamina B12, 0,025 g de ácido p-aminobenzóico e 0,025 g de ácido tioacitico. d 1,4-dicianobutano (Pseudomonas putida 13-5S-ACN-2a), 2-me- tilglutaronitrilo (Pseudomonas sp. 2D-11-5-1C, Pseudomonas putida 2D-ll-5-lb, serratia liquefaciens ΜΟΒ IM/N3, Mora-xella sp. SL-A-l-S-lá1!).

Inocularam-se 10 ml de volume do meio citado anteriormen te (PR/glucose) com 0,1 ml de cultura de stock. liofilizada. Após desenvolvimento durante a noite a uma temperatura ambiente (22-25°C) com uma agitação de 250 rotações por minuto, adicionou--se o inoculo de 10 ml a 990 ml de meio recente num recipiente de 2 litros. As células desenvolveram durante 18 a 24 horas, â temperatura ambiente com agitação magnética com uma velocidade suficientemente elevada para provocar a formação de bolhas no meio. Recolheram-se as células por centrifugação, lavaram-se uma vez com solução saturada de cloreto de sódio a 0,85% e colocou-se imediatamente a pasta concentrada num liofilizador â tem peratura de -70°C para armazenagem.

Exemplo 2

Preparação de material biológico com actividade amidase enantio-selectiva O meio de desenvolvimento utilizado para a cultura de -16-

Rhodococcus erythropolis DP-10 foi preparado com os seguintes componentes: a/i KH2P04 9,00 Na2HP04.2H20 21,00 NaCl 0,50 CaCl2.2H20 0 0 t-o MgS04.7H20 0,30 (^4)28()4 3,50 Extracto de levedura 0,50 Glucose* 3,75 Solução de oligo elementos ** 10,00 Valor de pH h5 * adicionado após autoclivagem ** solução de oligo elementos SL-7 (cf. DSM, do catálogo de estirpes de 1983, pãg. 296).

Estes componentes dissolveram-se em 900 ml de água e ajustou-se o valor do pH para 7,5 mediante a adição de ácido fosfõrico/hidrõxido de sódio e completou-se a solução para 1 litro por adição de água.

Adicionaram-se 100 ml do meio de desenvolvimento descri to anteriormente em um Erlenmeyer de 500 ml e autoclavou-se. Adicionou-se a glucose ao meio arrefecido partindo de uma solu ção de stock estéril (peso/volume 20%). Os recipientes Erlenmeyer inoculados com Rhodococcus erythropolis DSM 5910 foram in cubados ã temperatura de 30°C num agitador por um período de 28 horas.

Recolheram-se as células por centrifugação (com uma ve'% locidade de 20.000 rotações por minuto por um período de 15 ird (r) nutos numa centrífuga Sorvall ^ , lavaram-se duas vezes com tampão de fosfato 0,1 M com valor de pH7. 0 aglomerado celular lavado (pasta celular) foi conservado à temperatura de 4°C ou liofilizado (-25°C).

Exemplo 3

Imobilização do material biológico com actividade amidase enan-tioselectiva A pasta de células recente obtida de acordo com o método descrito no exemplo 2 foi imobilizada também como descrito anteriormente na memória descritiva (da patente de invenção Nor te Americana n° 4.892.825, exemplo 11).

Exemplo 4

Hidrólise de S-CPIAm para S-CPIA por meio de Rhodococcus erythro-polis DP-10

Adicionaram-se 75.mg de uma amostra seca de Rhodococcus erythropolis DP-10 imobilizado a 3 ml de tampão de fosfato (100 mM, valor de pH 7,0) e incubaram-se durante 1 hora à tempe ratura de 4°C. A suspensão das células imobilizadas foi retoma da para a temperatura ambiente e adicionada a 6,3 mg (29,8 jumo-les) de S-CPIAm em 120 jal de dimetilsulfóxido (designado poste-riormente por DMSO). Após incubação sob agitação à temperatura de 50°c, durante 48 horas, acidificou-se a reacção com ãcido -1 sulfúrico 3 M para um valor de pH de 3,0. Adicionaram-se 4 vo lumes de cloreto de metileno e agitou-se a suspensão durante um período entre 15 e 30 minutos. Retirou-se a camada de cloreto de metileno e evaporou-se ã secura sob uma corrente de azoto gasoso suspendendo-se o resíduo em 3 ml de metanol. Definiu-se a composição da solução de metanol por HPLC. 0 sobrenadante extraído continha 0,5 ^ímole de CPIAm e 28,3 jamoles de CPIA. A avaliação da composição enantiomérica foi feita por HPLC quiral mostrando que o excesso de enantiõmero de S-CPIA era de 99%.

Exemplo comparativo

Hidrólise de R-CPIAm por Rhodococcus erythropolis DP-10

Adicionou-se uma amostra de 75 mg de Rhodococcus erythropolis DP-10 imobilizados a 3 ml de tampão de fosfato (100 mM, valor de pH 7,0) e incubou-se durante 1 hora à temperatura de 4°C. A suspensão de células imobilizada retomou a temperatura ambiente e foi adicionada a 6,3 mg (29,8 jumoles) de R-CPIAm em 120 jxl de DMSO. Após incubação sob agitação à temperatura de 50°C por um período de 48 horas, acidificou-se a reacção com ácido sulfúrico 3M para um valor de pH 3,0. Adicionaram-se 4 volumes de cloreto de metileno e agitou-se a suspensão por um período entre 15 e 30 minutos. Retirou-se a camada de cloreto de metileno e evaporou-se à secura sob uma corrente de azoto ga soso. Determinou-se a composição da solução de metanol por HPLC. >r 0 sobrenadante extraído continha 22,7 jimoles de CPIAm e menos de 0,5 pmoles de CPIA. A quantidade de ácido correspondeu à quantidade presente de uma impureza no material inicial. A recuperação incompleta de R-CPIAm foi muito provável, mente devida a erros experimentais e/ou absorção do substrato às células e/ou ao suporte material.

Exemplo 5

Hidrólise de R,S-CPIAm para S-CPIA por Rhodococcus erythropolis DP-10

Uma amostra de 75 mg de Rhodococcus erythropolis DP-10 imobilizada e seca foi adicionada a 3 ml de tampão de fosfato (100 mM, valor de pH 7,0) e incubada por 1 hora ã temperatura de 4°C. A suspensão celular imobilizada, â temperatura ambiente foi adicionada a 6,3 mg (29,8 jamoles) de R,S-CPIAm em 120 p.1 de dimetilsulfóxido. Após incubação sob agitação à temperatura de 50°C por um período de 48 horas, acidificou-se a reacção com ácido sulfúrico 3 M para um valor de pH de 3,0. Adicionaram-se 4 volumes de cloreto de metileno e agitou-se a suspensão por um período entre 15 e 30 minutos. Retirou-se a fase de cio reto de metileno e evaporou-se à secura sob uma corrente de azo to gasoso. Determinou-se a composição da solução de metanol por HPLC. 0 sobrenadante extraído continha 12,5 jimoles de CPIAm e 11,8 pnoles de CPIA. A avaliação da composição enantiomérica por HPLC quiral demonstrou que o excesso de enantioméro de R-CPIAm era de 100% -20- e que o excesso de enantiómero de S-CPIA era de 100%.

Exemplo 6

Hidrólise de R,S-CPIAm para CPIA por Rhodococcus erythropolis DP-10

Repetiu-se o processo descrito no exemplo 5 com 59,8 pnoles de R,S-CPIAm e uma incubação de 72 horas. Determinou--se a composição da solução de metanol por HPLC. O sobrenadante extraído continha 3ít,9 jumoles de CPlAm e 21,8 pnoles de CPIA. A avaliação da composição enantiomêrica do sobrenadan te extraído, por HPLC quiral demonstrou a presença de 4,8 pno - les de S-CPIAm, 27,1 pmoles de R-CPIAm e 21,8 pnoles de S-CPIA. 0 excesso de enantiómero de S-CPIA foi de 100%.

Exemplo 7

Hidrólise de S-CPIAm para CPIA em tolueno por Rhodococcus erythropolis DP-10

Uma amostra de 300 mg de Rhodococcus erythropolis DP-10 seca e imobilizada foi adicionada a 12 ml de tampão de fosfato (100 mM, valor de pH 7,0) e a mistura incubada durante 1 hora à temperatura de 4°C. A suspensão celular imobilizada foi aquecida para a temperatura ambiente e o tampão de fosfato foi retirado por decantação. Adiconaram-se 12 ml de tolueno saturado com tampão de fosfato (100 mM, valor de pH 7,0). 0 tolueno sa turado de tampão preparou-se por mistura de volumes iguais de -21-

tolueno e tampão de fosfato (100 mM, valor de pH 7,0), agitação e repouso para separação de fase retirando-se a fase aquo sa. Após adição de 118 junoles de S-CPIAm, (19,7 jamoles/2 ml) incubou-se a suspensão de tolueno sob agitação à temperatura de 30°C. Retirou-se uma amostra de 2 ml âs 48 horas e às 120 horas e cada uma das amostras evaporou-se à secura sob uma cor rente de azoto gasoso. Cada amostra foi ressuspensa em 2 ml de metanol e a composição da solução de metanol foi analisada por HPLC.

Após 48 horas, as amostras de sobrenadante de tolueno continham 11,4 pmoles de CPIAm e 5,7 pmoles de CPIA e após 120 horas continham 1,9 umoles de CPIAm e 9,4 umoles de CPIA.

Exemplo 8

Hidrólise de S-CPIAm para S-CPIA em tampão/octano por Rhodococ-cus erythropolis DP-10 A uma amostra de 500 mg de Rhodococcus erythropolis DP-10 imobilizada e seca, adicionou-se uma solução bifásica constituída por 16 ml de tampão de fosfato (100 mM, valor de pH 7,0) e 4 ml de n-octano. A suspensão de células imobiliza das incubou-se durante 3 horas à temperatura de 50°C. Após a adição de 10 ml, (47,4 pmoles) de S-CPIAm e incubação durante _ Π ~ 6 horas a temperatura de 50 C e agitaçao a 600 rotaçoes por mi nuto, retiraram-se alíquotas de 0,5 ml de cada fase. Corrigiu--se o pH de cada porção para um valor de 2,0 com ácido clorídrjL co 10 N, adicionaram-se 4 volumes de cloreto de metileno a cada porção e agitaram-se as suspensões durante 15 minutos. Retirou- -22

-se a camada de cloreto de metileno e evaporou-se à secura sob uma corrente de ar ressuspendendo-se cada resíduo em 0f5 ml de metanol. A composição de soluções de metanol determinou-se por HPLC.

Os sobrenadantes extraídos continham;

Fase de Fase de Composto tampão Octana CPIAm 0,5 pmoles 0 CPIA 19,8 pmoles 1,9 pmoles

Exemplo 9

Hidrólise de S-CPIAm contínua para S-CPIA em tampão/octano por Rhodococcus erythropolis DP-1Q

Uma amostra de 3,74 g de Rhodococcus erythropolis DP-10, imobilizada e seca foi adicionada a um reactor constituído por uma célula de ultrafiltração Millipore com uma membrana hidro-fllica (PTGC 043 10) situada no fundo. As células imobilizadas incubaram-se em 50 ml de tampão de fosfato, (100 mM, valor de pH 7,0) mais 20 ml de n-octano à temperatura de 50°C durante 2 horas. Após a adição de 64 mg de S-CPIAm (303,3 pmoles), fechou-se o reactor e por meio de uma bomba peristãltica, ini^ ciou-se a distribuição de tampão de fosfato (100 mM, valor de pH 7,0) previamente saturada com S-CPIAm. A velocidade do liqui^ do de alimentação foi ajustada em 20 ml/hora para fornecer um tempo de retenção hidráulico horário de 3,5 no sistema de reac-ção. A membrana hidrofílica passa selectivamente a fase de tam -2

pão e retém o n-octano e Rhodococcus erythropolis DP-10.· imobilizado. A configuração do reactor está representada esque maticamente na figura 1. 0 efluente do reactor foi recolhido em vários interva los, extraído como descrito no exemplo 7 e analisado por HPLC para determinação de CPIAm e CPIA. A análise da amostra indicou os valores de saída seguintes :

Minutos jumoles de pnoles de Lecorridos CPIAm/hora CPIA/hora 40 12,5 : 14,5 115 9,1 24,1 180 4,4 32,7

Exemplo 10

Racemização de S-CPIAm por resina

Uma suspensão contendo 1,0 g.de S-CPIAm (4,7 jumoles) , 1,0 g de resina Amberlite IRA-400 (OH) e 25 ml de tolueno foi agitada e aquecida a refluxo durante 40 horas. Após remoção da resina por filtração, evaporou-se o filtrado para seeobter 0,94 g de um sólido cristalino. A composição enantiomérica do material recuperado foi avaliada por HPLC quiral, evidenciando 54% de S-CPIAm e 46% de R-CPIAm.

Exemplo 11

Hidrólise de S-CPIAm, R-CPIAm e R,s-CPIAm por Rhodococcus ery-

thropolis DP-10

Uma amostra de 50 mg de pasta de células liofilizada de Rhodococcus erythipopolis DP-10 foi adicionada a 1 ml de tampão de fosfato (100 mM, valor de pH 7,0) , ã temperatura _ ambiente. Em seguida adicionaram-se 9,4 jamoles de S-CPIAm ou R,S-CPIAm em 40 P1 de dimetilsulfóxido. Apôs incubação â tem peratura de 50°C durante 48 horas, acidificou-se o meio reac-cional com ácido sulfúrico 3M para um valor de pH de 3. Adicionaram-se 4 volumes de cloreto de metileno e agitou-se a sus pensão por um período entre 15 e 30 minutos. Retirou-se a fase de cloreto de metileno e evaporou-se à secura sob uma atmo£ fera de azoto e suspendeu-se o resíduo em 1 ml de metanol. A composição da solução de metanol determinou-se por HPLC de fase inversa e HPLC quiral como se representa no quadro 1. QUADRO 1

Hidrólise de S-CPIAm, R-CPIAm e R,S-CPIAm por Rhodococcus ery-thropolis DP-10

Análise HPLC tyimoles recuperados)

Substracto Fase inversa _Quiral '_ (fómoles

adicionadas) CPIAm CPIA S-CPIAm R-CPIAm S-CPIA R-CPIA

S-CPIAm (9.4) NDa 9,1 NDa NDa 9,1 ND R-CPIAm (9.4) 00 to NDa'b NT NT NT NT R, S-CPIAm 4,7 4,6 TRd 4,7 4,6 ND (9,4) -2 \ a ND = Não detectado. b

Dados corrigidos para as impurezas de R-CPIA no material inicial de R-CPIAm. <s NT = Não testado, d TR = Vestígios detectados. 0 excesso do enantiómero recuperado de S-CPIA foi de 100%.

Exemplo 12

Hidrólise de R,S-ATAm para R-ATAC por Rhodococcus erythropolis DP-10

Uma amostra de 50 mg de pasta de células congelada de Rhodococcus erythropolis DSM 5910 (DP-10) foi adicionada a 1 ml de tampão de fosfato (100 mM, valor de pH 7,0) à temperatura ambiente. Em seguida adicionaram-se 12,1 pmoles de R,S--ATAm em 40 p1 de dimetilsulfóxido. Após incubação ã tempera tura de 28°C sob agitação durante 48 horas, a suspensão reac-cional foi centrifugada para se retirarem as células fragmenta das e o sobrenadante passou através de uma membrana filtrante 0,2 u. A composição do sobrenadante clarificado foi determina do por HPLC de fase inversa e HPLC quiral como se representa no quadro 2. 6- QUADRO 2

Hidrólise R,S-ATAm por Rhodococcus erythropolis DP-10

Substrato

Análise HPLC tyimoles recuperados) Fase inversa _ Quiral (jimoles

fos) ATAm ATAC

S-ATAm R-ATAm S-ATAC R-ATAC R,S-ATAm 3,3 4,2 3,3 TRa 0,3 3,9 (12,1) a TR= Vestígios detectados. A recolha incompleta de R,S-ATAm foi muito provavelmen te devido a erros experimentais e/ou absorção do substrato pelas células. 0 excesso do enantiómero R-ATAC recolhido foi de 86%.

Exemplo 13

Hidrólise de S-CPlAm, R-CPIAm e R,S-CPlAm por Rhodococcus erythropolis DP-11

Uma amostra de 50 mg de pasta de células congelada de Rhodococcus erythropolis DP-11 foi adicionada a 1 ml de tampão de fosfato (100 mM, valor de pH 7,0) ã temperatura ambiente .

Do mesmo modo como descrito no exemplo 11, adicionaram-se 9,4 pmoles de S-CPIAm ou R-CPIAm ou R,S-CPIAm. Seguindo-se a incubação e extracção de acordo com os protocolos descritos nos -2 exemplo 11, a composição do sobrenadante extraído foi determinada por HPLC de fase inversa e HPLC quiral. Os resultados apresentam-se no quadro 3. QUADRO 3

Hidrólise de S-CPIAm, R-CPIAm e R,S-CPIAm por Rhodococcus ery-thropolis DP-11

Análise HPLC tyimoles recuperados)

Quiral

Substrato Fase inversa (jimoles adicionados) CPIAm CP IA S-CPIAm R-CPIAm S-CPIA R-CPIA S-CPIAm (9,4) 4,7 4,7 TRa NDb 4,7 NDb R-CPIAm (9,4) 8,3 NDb,C NTd NTd NTd NTd R,S-CPIAm 6,3 2,8 1,8 4,5 2,8 NDb (9,4) a tr = Vestígios detectados. b ND = Não detectados. c

Dados corrigidos para impurezas de R-CPIA no material inicial de R-CPIAm. d NT = Não testado. 0 excesso do enantiómero S-CPIA recuperado foi de 100%.

Exemplo 14

Hidrólise de R,S-ATAm para R-ATAC por Rhodococcus erythropolis DP-11 -2¾

Uma amostra de 50 mg de pasta de células congelada de Rhodococcus erythropolis DP-11 foi adicionada a 1 ml de tampão de fosfato (100 mM, valor de pH 7,0) ã temperatura ambiente. Do mesmo modo como descrito no exemplo 12, adicionaram-se 12,1 pmoles de R,S-ATAm. Após a incubação, centrifugação e filtração de acordo com os protocolos descritos no exemplo 12, a composição do sobrenadante extraído foi determinada por HPLC de fase inversa e HPLC quiral. Os resultados apresentam-se no Quadro 4. QUADRO 4 ·

Hidrélise de R, S-ATAm por Rhodococcus erythropolis DP-11

Análise HPLC (pmoles recuperados) Substrato Fase inversa / Quiral (pmoles adicionados) ATAM ATAC • S-ATAm R-ATAm S-ATAC R-ATAc R,S-ATAm 4,8 1,2 (12,1) 3,4' 1,4 NDa 1,2 a ND = Não detectado. A recuperação incompleta de R,S-ATAm foi muito provavelmente devida a erros experimentais e/ou de absorção do subjs trato às células. O excesso do enantiómero de R-ATAC recolhido foi de 100%.

Exemplo 15

Hidrólise de S-CPIAm, R-CPIAm e R,S-CPIAm por Rhodococcus ery-thropolis DP-25

Uma amostra de 50 mg de pasta de células congelada de Rhodococcus erythropolis DP-25 foi adicionada a 1 ml de tampão de fosfato (100 mM, valor de pH 7,0), ã temperatura ambien te. Do mesmo modo, como descrito no exemplo 11, adicionaram--se 9,4 pnoles de S-CPIAm ou R-CPIAm ou R,S-CPIAm. Após uma incubação e extracção de acordo com os protocolos descritos no exemplo 11, a composição do sobrenadante extraído foi determinada por HPLC de fase inversa e HPLC quiral. Os resultados apre sentam-se no Quadro 5. QUADRO 5

Hidrólise de S-CPIAm, R-CPIAm e R,S-CPIAm por Rhodococcus erythropolis DP-25

Análise HPLC (jamoles recuperados)

Quiral

Substrato Fase inversa (jimoles adicionados) CPIAm CPIA S-CPIAm R-CPIAm S-CPIA R-CPIA S-CPIAm (9,4) 6,0 3,2 1,7 4,3 3,2 NDa R-CPIAm (9,4) 00 NDa'b NTC NTC NTC NT° R, S-CPIAm 6,2 3,1 1,8 4,4 3,1 NDa (9,4) a ND = Não detectado. b

Corrigido para impurezas de R-CPIA no material inicial de R-CPIAm. c NT = Não testado. 0 excesso do enantiómero de .S-CPIA recolhido foi de 100% . EXEMPLO 16

Hidrólise de R,S-ATAm para R-ATAC por Rhodococcus erythropolis DP-25

Uma amostra de 50 mg de pasta de células congelada de Rhodococcus erythropolis 24 foi adicionada a 1 ml de tampão de fosfato (100 mMf valor de pH 7,0), à temperatura ambiente. Do mesmo modo, como descrito no exemplo 5, adicionaram-se 12,1 pmo les de R,S-ATAm. Após uma incubação, centrifugação e filtração de acordo com os protocolos descritos no exemplo 12, a composição do sobrenadante extraído foi determinada por HPLC de fase inversa e HPLC quiral. Os resultados apresentam-se no Quadro 6. QUADRO 6

Hidrólise de R,S-ATAm por Rhodococcus erythropolis DP-25

Análise HPLC (pmoles recuperados) Substrato Fase inversa / Quiral (jumoles adicionados) ATAm ATAC S-ATAm R-ATAm S-ATAC R-ATAC R,S-ATAm 9,7 1,8 6,2 3,5 NDa 1,8 (12,1) a ND= Não detectado -3i 0 excesso do enantiómero de R-ATAC recolhido foi de 100%.

Exemplo 17

Hidrólise de S-CPIAm, R-CPIAm e R,S-CPIAm por Rhodococcus ery-thropolis DP-26

Uma amostra de 50 mg de pasta de células congelada de

Rhodococcus erythropolis DP-26 foi adicionada a 1 ml de tampão de fosfato (100 mM, valor de pH 7,0), â temperatura ambiente.

Do mesmo modo, como descrito no exemplo 11, adicionaram-se 9,4 umoles de S-CPIAm ou R-CRIAm ou R,S-CPIAm. Após incubação e extracção de » acordo com os protocolos descritos no exemplo 11, a composição do sobrenadante extraído foi determinada por HPLC de fase inver sa e HPLC quiral. Os resultados apresentam-se no Quadro 7. QUADRO 7

Hidrólise de S-CPIAm, R-CPIAm e R,S-CPIAm por Rhodòcoccus erythropolis DP-26 _Análise HPLC (pmoles recuperados)

Substrato Fase inversa _Quiral_ (pnoles adicionados) CPIAm CPIA S-CPIAm R-CPIAm S-CPIA R-CPIA S-CPIAm (9,4) 4,6 4,7 TRa 4,6 4,7 NDb R-CPIAm (9,4) 8,4 NDb'C NTd NTd NTd NTd R,S-CPIAm 5,7 3,2 1,5 4,2 3,2 NDb (9,4) -32 a TR = Vestígios detectados. b ND = Não detectados. c

Dados corrigidos para as impurezas de R-CPIA no material injl ciai de R-CPIAm. 0 excesso de enantiómero de S-CPIA recuperado foi de 100%.

Exemplo 18

Hidrólise de R,S-ATAm para R-ATAC por Rhodococcus erythropolis DP-26

Uma amostra de 50 mg de pasta de células congelada de Rhodococcus erythropolis DP-26 foi adicionada a lml de tampão de fosfato (100 mM, valor de pH 7,0), à temperatura ambiente . Do mesmo modo, como descrito no exemplo 12, adicionaram-se 12,1 ^imoles de R,S-ATAm. Após incubação, centrifugação e filtração de acordo com os protocolos descritos no exemplo 12, a composição do sobrenadante extraído foi determinada por HPLC de fase inversa e HPLC quiral. Os resultados apresentam-se no Quadro 8 QUADRO 8

Hidrólise de R,S-ATAm por Rhodococcus erythropolis DP-26

Análise HPLC (pmoles recuperados)

Análise HPLC (pmoles recuperados) Quiral

Substrato Fase inversa (jpmoles adicionados) ATAm

ATAC

S-ATAm R-ATAm S-ATAC R-ATAC R,S-ATAm 8,5 3,0 6,2 2,3 NDa 3,0 (12,1) a ND = Não detectado. O excesso do enantiómero de R-ATAC recuperado foi de 100%.

Exemplo 19

Hidrólise de R,S-NPAm para S-NPAC por Pseudomonas putida 13-5S--ACN-2a

Uma amostra de 25 mg de pasta de células congelada de Pseudomonas putida 13-5S-ACN-2a foi adicionada a 1 ml de tampão de fosfato (100 mM, valor de pH 7,2), ã temperatura ambien te. Em seguida adicionaram-se 1 jimole de R,S-NPAm em 40 pl de dimetilsulfóxido. Após incubação ã temperatura de 28°C, sob agi tação, durante 48 horas, acidificou-se a reacção para um valor de pH de 3 com ácido sulfúrico 3M. Adicionaram-se 4 volumes de cloreto de metileno e agitou-se a suspensão durante 30 minutos. A fase de cloreto de metileno foi removida e evaporada à secura sob atmosfera de azoto. Redissolveu-se o resíduo em 1 ml de -34-, f\ * .% metanol. A composição do sobrenadante extraído foi determinada por HPLC de fase inversa e HPLC quiral que se apresentam no Quadro 9. QUADRO 9

Hidrólise de R, S-NPAm por Pseudoitionas putida 13-5S-ACN-2a

Análise HPLC (pmoles recuperados) Substrato Fase inversa Quiral (jimoles adicionados) NPAm NPAC S-NPAm R-NPAm S-NPAC R-NPAC R, S-NPAm (1,0) 0,42 0,44 NDa 0,42 0,44 NDa a ND = Não detectado. 0 excesso de enantiómero S-NPAC recuperado foi de 100%.

Exemplo 20

Hidrólise de R,S-IBAm para S-IBAC por Pseudomonas putida 13-5S--ACN-2a

Uma amostra de 50 mg de pasta de células congelada de Pseudomonas putida 13-5S-ACN-2a foi adicionada a 1 ml de tampão de fosfato (100 mM, valor de pH 7,0), â temperatura ambien -35

te. Era seguida, adicionaram-se 9,8 jimoles de R,S-IBAm em 40 jjlI de dimetilsulfóxido. Após incubação à temperatura de 28°C, sob agitação, durante 48 horas, acidificou-se a reacção com ác_i do sulfúrico 3 M para um valor de pH de 3. Adicionaram-se 4 volumes de cloreto de metileno e agitou-se a suspensão por um período entre 15 e 30 minutos. A fase de cloreto de metileno foi retirada e evaporada à secura sob uma atmosfera de azoto e o resíduo suspenso em 1 ml de acetonitrilo. A composição da solução de acetonitrilo foi determinada por HPLC de fase inversa e HPLC quiral que se apresentam no quadro 10.

Quadro 10

Hidrólise R,S-IBAm por Pseudomonas putida 13-5S-ACN-2a.

Análise HPLC (umoles recuperados) Substrato Fase inversa / Quiral (pmoles adicionados) IBAm IBAC S-IBAm R-IBAm S-IBAC R-IBAC R,S-IBAm (9,8) 4,8 1,3 1,4 3,4 1,3 NDa a ND = Não detectado. A recuperação incompleta de R,S-IBAm foi muito provavej. mente devida a erros experimentais e/ou absorção do substrato ãs células. 0 excesso do enantiómero de S-IBAC recuperado foi de 100%. -36-

Exemplo 21

Hidrólise de R,S-NPAm para S-NPAC por Pseudomonas putida 2D-11--5-lb

Uma amostra de 20 mg de pasta de células congelada de Pseudomonas putida 2D-ll-5-lb foi adicionada a 1 ml de tampão de fosfato (100 mM, valor de pH 7,2) à temperatura ambiente .

Do mesmo modo, como descrito no exemplo 29, adicionaram-se 1 pmole de R,S-NPAm em 40 pl de dimetilsulfóxido. Apôs incuba ção por um período de 24 horas, a extracção de acordo com o pro tocolo descrito no exemplo 19, a composição do sobrenadante extraído foi determinado por HPLC de fase inversa e HPLC quiral que se apresentam no Quadro 11. QUADRO 11

Hidrólise de R,S-NPAm por Pseudomonas putida 2D-ll-5-lb _Análise HPLC (pmoles recuperado)

Substrato Fase inversa _Quiral_ (pmoles

adicionados) NPAm NP AC S-NPAm R-NPAm S-NPAC R-NPAC R,S-NPAm 0,60 0,40 0,05 0,55 0,39 0,01 (1,0) 0 excesso de enantiômero de S-NPAC recuperado foi de 95%.

Exemplo 22

Hidrólise de R, S-IBAm para S-IBAC por Pseudomonas putida 2D-11--5-lb

Uma amostra de 50 mg de pasta de células congelada de Pseudomonas putida 2D-ll-5-lb foi adicionada a 1 ml de tampão de fosfato (100 mM, valor de pH 7,0), ã temperatura ambiente. Do mesmo modo, como descrito no exemplo 20, adicionaram-se 9,8 jumoles de R, S-IBAm em 40 p.1 de dimetilsulfóxido. Após incubação e extracção de acordo com o protocolo descrito no exemplo 20, a composição do sobrenadante extraído foi determinado por HPLC de fase inversa e HPLC quiral que se apresentam no Quadro 12. QUADRO 12

Hidrólise de R,S-NPAm por Pseudomonas putida 2d-ll-5-lb __Análise HPLCC (pmoles recuperados)_

Substrato Fase inversa _Quiral_ (jimoles

adicionados) IBAm IBAC S-IBAm R-IBAm S-IBAC R-IBAC R,S-IBAm 3,8 2,1 0,6 3,2 2,0 0,1 (9,8) A recuperação incompleta de R, S-IBAm foi muito provável, mente devida a erros experimentais e/ou absorção do substrato às

* células. 0 excesso do enantiómero de S-IBAC recuperado foi de 90%. EXEMPLO 23

Hidrólise de R,S-NPAm para S-NPAC por Pseudomonas sp. 2D-11-5 -lc.

Uma amostra de 20 mg de pástã de 'células congelada de Pseudomonas sp. 2D-ll-5-lc, foi adicionada a 1 ml de tampão de fosfato (100 mM, valor de pH 7,2) à temperatura ambiente. Do mesmo modo, como descrito no exemplo 19, adicionaram-se 1 pnole de R,S-NPAm em 40 μΐ de dimetilsulfóxido. Após incubação e ex-tracção de acordo com o protocolo descrito no exemplo 19, a composição do sobrenandante extraído foi determinado por HPLC de fase inversa e HPLC quiral como se apresenta no Quadro 13. QUADRO 13

Hidrólise de R,S-NPAm por Pseudomonas sp. 2D-ll-5-lc _Análise HPLC (pnoles recuperados)

Substrato Fase inversa _Quiral_ (pnoles

adicionados) NPAm NPAC S-NPAm R-NPAm S-NPAC R-NPAC R,S-NPAm 0,54 0,48 NDa 0,54 0,47 0,01 (1/0) -<L. 0 excesso do enantiómero de S-NPAC recuperado foi de 96%.

Exemplo 24

Hidrólise de R,S-NPAm para NPAC por Serratia liquefaciens MOB IM/N3

Uma amostra de 20 mg de pasta de células congelada de Serratia liquefaciens ΜΟΒ IM/N3 foi adicionada a 1 ml de tam pão de fosfato (100 mM, valor de pH 1,2), à temperatura ambien te. Do mesmo modo, como descrito no exemplo 19, adicionou-se 1 jumole de R,S-NPAm em 40 jul de dimetilsulfóxido. Após incuba ção e extracção de acordo com o protocolo descrito no exemplo 19, por HPLC de fase inversa e HPLC quiral como se apresenta no Quadro 14. QUADRO 14

Hidrólise de R,S-NPÃm por Serratia liquefaciens mob IM/N3

Análise HPLC (jnmoles recuperados)

Substrato (pmole adicionados)

Fase inversa

Quiral

NPAm NPAC

S-NPAm R-NPAm S-NPAC R-NPAC R,S-NPAm (1,0) 0,64 0,26 0,20 0,44 0,25 0,01 92

V 0 excesso do enantiõmero de S-NPAC recuperado foi de

Exemplo 25

Hidrólise de R,S-IBAm para· S-IBAC por Serratia liquefaciens MOB IM/N3

Uma amostra de 50 mg de pasta de células congelada de Serratia liquefaciens ΜΟΒ IM/N3 foi adicionada a 1 ml de tampão de fosfato (100 mMf valor de pH 7,0), ã temperatura ambiente.

Do mesmo modo, como descrito no exemplo 20, , adicionaram-se 9,8 pmoles de R,S~IBAm em 40 pl de dimetilsulfóxido. Após incu bação e extracção de acordo com o protocolo descrito no exemplo 20, a composição do sobrenadante extraído foi determinada por HPLC de fase inversa e HPLC quiral como se apresenta no Quadro 15. QUADRO 15

Hidrólise de R,S-IBAm por Serratia liquefaciens, ΜΟΒ IM/N3

Análise HPLC (pmoles recuperados)

Quiral

Substrato Fase inversa (pmoles

adicionados) IBAm IBAC S-IBAm R-IBAm S-IBAC R-IBAC R,S-IBAm (9,8) 4,9 0,7 2,0 2,9 0,7

ND -41 a ND = Não detectado. A recuperação incompleta de R,S-IBAm foi muito provável, mente devida a erros experimentais e/ou absorção de substrato às células. 0 excesso do enantiémero de S-IBAs recuperado foi de 100%.

Exemplo 26

Hidrólise de R,s-ATAm para R-ATAC por Moraxella sp. 3L-A-1-5--la-1

Uma amostra de 50 mg de pasta de células congelada de Moraxella sp. 3L-A-l-5-la-l foi adicionada a 1 ml de tampão de fosfato (100 mM, valor de pH 7,0) â temperatura ambiente. Em seguida adicionaram-se 12,1 pmoles de R,S-ATAm em 40 jil de di_ metilsulfóxido. Após incubação â temperatura de 28°C sob ag_i tagão, durante 48 horas, a suspensão reaccional foi centrifu-gada para remover os fragmentos de células e o sobrenandante foi filtrado por uma membrana de 0,2 μ. A composição de sobre nadante foi determinada por HPLC de fase inversa e HPLC quiral apresentando-se no Quadro 16. QUADRO 16

Hidrólise de R,S-ATAm por Moraxella sp. 3L-A-l-5-la-l -4

Análise HPLC (pmoles: recuperados)

Quiral

Substrato Fase inversa (pnole

adicionados) ATAm ATAC S-ATAm R-ATAm S-ATAC R-ATAC R,S-ATAm 7,6 1,5 4,9 2,7 NDa 1,5 (12,1) a ND = Não detectado. A recuperação incompleta de R,S-ATAm foi muito provavelmente devida a erros experimentais e/ou absorção do substra to âs células. 0 excesso do enantiómero de S-ATAC recuperado foi de 100%. EXEMPLO 27

Comparação da bioconversão de CPIAm por Rhodococcus erythropo-lis DP-10 e Brevibacterium sp. R312

Quinze amostras de pasta de células congelada de Rhodococcus erythropolis DP-10 e Brevibacterium sp. R312 foram adicionadas a volumes de 1 ml de tampão de fosfato, (100 mM, valor de pH 7,0), ã temperatura ambiente. Em seguida adiciona-ram-se 9,4 paoles de S-CPIAm de R,S-CPIAm em 40 jul de dimetil-sulfóxido. Após incubação ã temperatura de 50°C por períodos de 2,5,8,16 e 24 horas, acidificaram-se as reacções com ácido sulfúrico 3M para um valor de pH de 3,0. Adicionaram-se 4 vo- lumes de cloreto de metileno e suspenderam-se os resíduos em 1 ml de metanol. A composição das soluções metanõlicas foi determinada por HPLC de fase inversa. Os resultados expressos sob a forma de actividade específica, estão apresentados no Qua dro 17. QUADRO 17

Hidrólise de S-CPIAm e R,S-CPAm por Rhodococcus erythropolis DP-10 e Brevibacterium sp. R312

Tempo de Biocon- Actividade específica (pmoles

Estirpe w a 2 versão em horas CPIA/mg Cells /hr x 10 ) S-CPIAm R, S-CPIAm R. erythropolis 2 5,2 6,5 DP-10 5 5,6 6,5 8 5,2 4,4 16 4,1 2,1 24 2,9 1,6 Brevibacterium sp. 2 2,4 3,3 R312 5 3,0 3,6 8 3,0 3,1 16 2,8 2,2 24 2,8 1,7 JÍ4-

% a

Peso das células secas.

As actividades específicas mais altas obtiveram-se para S-CPIAm e R,S-CPIAm hidrolisados para S-CPIA com Rhodococcus erythropolis DP-10.

Claims

% REIVINDICAÇÕES 1.- Processo para a preparação de enantiõmeros de ácidos por hidrólise enantioselectiva de· uma mistura da amida R e S correspondente na presença de um material biológico enzimatica-mente activo que actua como uma amidase enantioselectiva, caracte rizado pelo facto de se obter esse material biológico a partir de uma estirpe de Rhodococcus, Serratia, Moraxella ou Pseudomonas com a condição de não se utilizarem as estirpes Rhodococcus sp. AK 32 (FERM BP-1046) ou Pseudomonas fluorescens NRRL B 981 ou IFO 3081.
2,- Processo de acordo com a reivindicação 1, carac- % terizado pelo facto de se utilizarem ácidos de fórmula geral X-CR^-COOH (I) na qual X representa um grupo fenilo ou naftilo comportando, eventualmente, como substituinte um átomo de halogéneo ou um grupo alquilo, alcoxi ou benzoilo; representa um grupo hidroxi, amino ou alquilo; e representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo.
3. - Processo de acordo com a reivindicação 2, carac-terizado pelo facto de se utilizarem ácidos de fórmula geral I na qual R^ representa um grupo hidroxi ou alquilo.
4. - Processo de acordo com as reivindicações 2 ou 3, caracterizado pelo facto de se utilizarem ãc ides de fórmula geral I na qual R2 representa um átomo de hidrogénio.
5. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo facto de se utilizarem ácidos de fórmula geral I na qual os grupos alquilo e os grupos alcoxi comportam não mais do que 10 átomos de carbono, de preferência não mais do que 4 átomos de carbono.
6. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindi -4/- c cações anteriores, caracterizado pelo facto de se obter o material biológico a partir de uma estirpe de Rhodococcus.
7. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de se utilizar uma estirpe de Rhodococcus erythropolis, de preferência a estirpe DSM 5910, 6374, 6375 ou 6378 ou uma sua variante ou um seu mutante.
8. - Processo de‘acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de se obter o material biológico a partir de uma estirpe de Serratia.
9. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se utilizar uma estirpe.de Serratia liquefaciens, de preferência a estirpe ΜΟΒ IM/N3 ou uma sua variante ou um seu mutante.
10. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de se obter o material biológico a partir de uma estirpe de Moraxella.
11. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de se utilizar uma estirpe de Moraxella sp. 3L-A-l-5-la-l ou uma sua variante ou um seu mutante.
12. - Processo de acordo cora uma qualquer das reivin-dica.ções 1 a 5, caracterizado pelo facto de se obter o material biológico a partir de uma estirpe de Pseudomonas putida, de pref£ rência a estirpe 13-5S-ACN-2a ou 2D-ll-5-5-lb, ou de Pseudoraonas sp. 2D-ll-5-lc ou uma sua variante ou um seu mutante.
13. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo facto de se obter um ácido enantiómérico na forma S.
14. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo facto de se obter um ácido enantiomético na forma R.
15. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo facto de se utilizar como. ami-da inicial a 2-(4-clorofenil)-3-metilbutiramida (CPIAm) e de se obter o material biológico a partir de uma estirpe de Rhodococcus.
16. - Processo de acordo com a reivindicação 15, carac terizado pelo facto de se obter um ácido enantiomérico na forma S.
17. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, 10 e 11, caracterizado pelo facto de se utilizar >- % como amida inicial a 2-fenil-2-hidroxipropionamida (ATAm) e de se obter o material biológico a partir de uma estirpe de Rhodococcus ou de Moraxella.
18. - Processo de acordo com a reivindicação 17, carac terizado pelo facto de se obter um ácido enantiomérico na forma R.
19. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, 8, 9 e 12, caracterizado pelo facto de se utilizar como amida inicial a 2-(6-metoxi-2-naftil)propionamida (NPAm) e de se obter o material biológico a partir de uma estirpe de Serratia ou de Pseudomonas.
20. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de se obter um ácido enantiomérico na forma S.
21.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, 8, 9 e 12, caracterizado pelo facto de se utilizar como amida inicial a 2-(4-isobutilfenil)propionamida (IBAm) e de se obter o material biológico a partir de uma estirpe de Serratia ou de Pseudomonas.
22.- Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de se obter um ácido enantiomérico na forma S.
23. - Processo de acordo com uma qualquer das reivin dicações anteriores, caracterizado pelo facto de se obter um excesso de enantiõmero de, pelo menos, 85%, de preferência de pelo menos, 90%, preferivelmente de, pelo menos, 95% aproximadamente, e ainda mais preferivelmente de, pelo menos, próximo de 99%, sen do a preferência máxima de, pelo menos, 99,5%.
24. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se obter um. grau de conversão superior a, aproximadamente, 65%, de preferência superior a, aproximadamente, 90%, preferivelmente superior a, aproximadamente, 95%, sendo a preferência máxima superior a, apro ximadamente, 99%.
25. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se utilizarem material biológico imobilizado.
26. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se utilizar um material biológico imobilizado por ligação cruzada com glutara ldeí do.
27.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se fazer passar m A a solução ou a suspensão que contem a mistura da amida reagente através de um reactor no qual se retem o material biológico imo bilizado.
28. - Processo de acordo com uma qualquer das reivin dicações anteriores, caracterizado pelo facto de se realizar a hidrólise na presença de um dissolvente orgânico.
29. - Processo de acordo com a reivindicação 28, ca racterizado pelo facto de se utilizar um dissolvente orgânico em uma quantidade compreendida entre 2 e 20%, em peso, do sistema reaccional total.
30. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 28 e 29, caracterizado pelo facto de se utilizar como dissolvente um dissolvente orgânico miscível com a água, de preferencia o dimetilsulfóxido.
31. - Processo de acordo com. as reivindicações 28 ou 29, caracterizado pelo facto de se utilizar como dissolvente um dissolvente orgânico imiscível com a água, de preferência um hi-drocarboneto aromático ou alifático com 6 a 9 átomos de carbono, de preferência o tolueno ou o octano.
32. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 28 a 31, caracterizado pelo facto de se utilizar um ma-

% terial biológico imobilizado.
33. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se utilizar um sistema reaccional que comporta uma fase aquosa e uma fase de um dissolvente, encontrando-se a fase do dissolvente e o material imobilizado retidos por uma membrana hidrofílica.
34. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 a 33, caracterizado pelo facto de se utilizarem· ácidos de fórmula geral I na qual X representa um grupo fenilo, p-cloro-fenilo, p-isobutilfenil, 3-benzoilfenilo, p~naftilo ou 6-metoxi--2-naftilo.
35,- Processo de acordo com as reivindicações 2 a 34, caracterizado pelo facto de se utilizarem ácidos de fórmula geral I na qual R-^ representa um grupo hidroxi, metilo ou isopropilo.
36,- Processo de acordo com a reivindicação 35, carac terizado pelo facto de se utilizar como ácido de fórmula geral I o ácido 2-(4-clorofenil)butírico, o ácido. 2-(4-clorofenil)-3--metilbutírico, o ácido (6-metoxi-2-naftil)hidroxipropiõnico, o ácido 2-(4-isobutilfenil)propiónico, o ácido 2-fenil-2-hidro-xipropiõnico ou o ácido 2-(3-benzoilfenil)propiónico. -53- %
37. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se submeter a hi drõlise enantioselectiva a amida racemica.
38. - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo facto de se proceder apõs hidrólise ã racemiza-ção da amida não convertida e à reciclização da amida racemiza-da.
39.- Processo de acordo com. uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto do material biolõgi co incluir células microbianas enzimáticamente activas íntegras ou fragmentadas.
40.- Processo para a racemização da amida R ou S, caracterizado pelo facto de se fazer contactar a amida com uma resina troca-iõnica fortemente alcalina essencialmente na ausência da água.
41.- Processo de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo facto de se utilizar uma resina do tipo gel for temente alcalina.
42,- Processo de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo facto de se utilizar uma resina que comporta uma função amõnio quaternário. -5/r-
43.- Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de se utilizar uma cultura biologicamente pura de um material obtido a partir de uma estirpe de Rhodococcus, Serratia, Moraxella ou Pseudomonas com a condição de não se utili zar material biológico proveniente de Rhodococcus sp. AK32 (FERM BP-1046) ou de Pseudomonas fluorescens NRRL B 981 ou IFO 3081.
44. - Processo de acordo com a reivindicação 43, ca-racterizado pelo facto de se utilizar uma cultura biologicamente pura de Rhodococcus. que produz araidase enantioselectiva.
45. - Processo de acordo com a reivindicação 44, ca-racterizado pelo facto de se utilizar uma estirpe, de Rhodococcus erythropolis, de preferência uma estirpe DSM 5910, 6374, 6375 ou 6378 ou uma sua variante ou um seu mutante.
46. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de se utilizar material biológico enzimaticamente activo imobilizado.
47. - Processo de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo facto de se proceder à imobilização do material biológico por ligação cruzada com glutaraldeído. -55- %
48-- Processo de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo facto de se utilizar material biológico que ac tua como uma amidase enatioselectiva.
49.- Processo de acordo com a reivindicação 48, ca-racterizado pelo facto de se utilizar material biológico obtido a partir de Rhodococcus erythropolis, de preferência a partir das estirpes DSM 5910, 6374, 6375 ou 6378 ou uma sua variante ou um seu mutante.
50.- Processo para a preparação de material biológico que actua como uma amidase enantioselectiva,. caracterizado pelo facto de se cultivar uma estirpe produtora de amidase de Rhodococcus em um meio què não contenha nitrilo ou amida. Lisboa, 5 de Julho de 1991 O Agente Oficial da Propriedade Industriai