PT958046E - Composição, conjunto e processo de separação celular - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

Composição, conjunto e processo de separação celular Campo do invento 0 presente invento refere-se a composições, conjuntos e métodos de separação celular.

Enquadramento do invento A separação celular e de componentes celulares, desde há muito um papel importante na investigação básica e aplicações de diagnóstico, é cada vez mais importante num ambiente clinico. A utilização de métodos de transplante celular, tal como transplante de medula óssea, em terapêutica humana, precisou de procedimentos de separação celulares que, não só são rápidos e reprodutíveis, como também produzem uma composição celular viável, segura e não tóxica. É igualmente desejável que estes procedimentos de isolamento sejam adequados para o isolamento de células pouco abundantes. Por exemplo, a seguir à quimioterapia para determinados tipos de cancro, muitos doentes recebem agora "transplantes de células estaminais", que consistem numa fracção enriquecia de células progenitoras hematopoiéticas isoladas de vários tecidos, tais como medula óssea, sangue periférico ou sangue do cordão umbilical. Estas células progenitoras constituem apenas cerca de 1% do número total de células presentes nestes tecidos. A centrifugação em gradiente de densidade é uma técnica popular para a separação e isolamento de células e de componentes celulares. Este processo explora o fenómeno da 1 divisão celular num meio com densidade definida, de acordo com as suas densidades de flutuação. Um tal meio pode ser uma solução ou uma suspensão de micropartícuias. Exemplos de meios usados vulgarmente na separação em gradiente de densidade incluem a sucrose, o dextrano, a seroalbumina bovina (BSA), diatrizoato FICOLL (Pharmacia), metrizoato FICOLL (Nycomed) , Percoll® (Pharmacia), metrizamida e sais pesados, tais como o cloreto de césio. A exposição das células a muitos destes meios produz uma função biológica enfraquecida das células e / ou contaminação de preparação por componentes tóxicos. Por exemplo, sabe-se que a BSA e o FICOLL provocam uma agregação de células indesejada com um pH fisiológico. Para além disso, estes meios não são geralmente fáceis de esterilização por autoclave ou irradiação na "forma final" - isto é, numa concentração, a solução iónica e recipiente que está pronto a ser usado no isolamento de um tipo especifico de células.

Um meio de separação celular que tem sido usado vulgarmente na preparação de fracções de células sanguíneas é o Percoll® (uma marca registada da Pharmacia Fine Chemicals). 0 Percoll® é uma partícula de sílica coloidal tratada por um processo de cura para formar um revestimento de polivinilpirrolidona em cada partícula. Enquanto o Percoll® é bastante estável com um pH fisiológico, há limitações à sua utilidade geral no isolamento de células para efeitos terapêuticos. Por exemplo o meio é difícil de esterilizar, uma vez que não é estável para autoclavagem ou radiação ionizante depois de ter sido diluído numa solução salina fisiológica. Estas propriedades limitam a utilidade do produto para aplicações clínicas envolvendo a reintrodução de células separadas em seres humanos, ou noutro local qualquer que exija material esterilizado. 2 A patente US 4,927,749 proporciona uma preparação de partícula (OCSP) de sílica coloidal organosilanizada (OCS) para a separação em gradiente de densidade que ultrapassa alguns dos problemas referidos acima. Embora seja estável na esterilização por calor e irradiação ionizante quando diluído numa solução salina fisiológica, quando esterilizado por radiação ionizante, as preparações de partículas OCS são tóxicas para determinados tipos de célula raras, tais como células dendríticas, células exterminadoras naturais, células supressoras naturais, células T citotóxicas e, em particular, células progenitoras hematopoiéticas (CD34 + ) . Uma vez que a esterilização final por radiação ionizante pode ser preferida para determinadas aplicações, em particular as que envolvem a contenção de material em recipientes consumíveis plásticos, a utilização deste material para aplicações clínicas pode ser limitada. Além disso, descobriu-se que o material provoca aglutinação de glóbulos ou agregação de células, resultando em rendimentos significativamente menores destas células raras em forma funcional. 0 presente invento proporciona composições e processos que são particularmente adequados para o isolamento de fracções de células "raras" - por exemplo, tipos de células que constituem menos de cerca de 1% do total de células numa população de células. Em particular, o invento inclui um meio de separação celular de sílica coloidal que melhora o rendimento e potencial funcional de células, através da redução da agregação de células e toxicidade das células. A descoberta do presente invento passa pela inclusão de uma polilactama, tal como o gama polilactama polivinilpirrolidona (PVP), na solução na qual o material de gradiente de densidade de sílica coloidal está suspenso reduz marcadamente a agregação de células sanguíneas 3 raras, resultando em melhores rendimentos. Uma outra descoberta do presente invento passa pelo facto da adição de polilactama ao meio evitar a perda de potencial clonogénico durante o isolamento em gradiente de densidade de determinadas células progenitoras hematopoiéticas, através da redução da toxicidade provocada por irradiação de soluções OCS. 0 invento também proporciona processos para o isolamento de determinados tipos de célula que são importantes em métodos de diagnóstico e terapêuticos - incluindo, por exemplo, células progenitoras hematopoiéticas (CD34+) isoladas da medula óssea, células tumorais escolhidas, células dendríticas, células supressoras naturais, (NK), linfócitos T citotóxicos (CTL) e células supressoras naturais. 0 invento também proporciona a deplecção de tipos de células que podem interferir com um resultado clínico específico, tal como CTL.

Resumo do invento

Num aspecto, o invento inclui composições para utilização na separação celular consistindo num meio de separação celular à base de partículas de sílica coloidal silanizada, contendo pelo menos cerca de 0,05% de polilactama, tal como o polivinilpirrolidona (PVP), presente numa concentração entre cerca de 0,1 e cerca de 10%. Numa forma de realização preferida, o meio de separação é constituído por uma suspensão de partículas de sílica coloidal organosilanizada. Uma vantagem desta composição é o facto de poder ser esterilizada, quer por autoclavagem quer por radiação ionizante, sem conferir efeitos tóxicos às células aí separadas subsequentemente.

Embora as partículas compreendendo o meio do invento possam estar compreendidas entre cerca de 0,003 e 50 4 micrómetros, as partículas de sílica coloidal estão compreendidas normalmente num diâmetro médio de 10 - 50 nm.

As composições do invento são particularmente adequadas para utilização no isolamento de uma célula de sangue raro, escolhida de uma mistura celular. De acordo com métodos aqui descritos, nesses casos, é preparado um meio para que a suspensão de partículas tenha uma densidade específica compreendida entre cerca de 0,0005 g/ml da dita célula escolhida. Tipos de células raras do exemplo incluem células progenitoras hematopoiéticas CD34+, células dendriticas, células exterminadoras naturais, células supressoras naturais, células T citotóxicas, células tumorais, e células nucleadas de origem fetal.

As células progenitoras hematopoiéticas CD34+ podem ser isoladas de células mononucleares do sangue periférico, em cujo caso a suspensão preferida de partículas de sílica coloidal organosilanizada tem uma densidade específica de 1,0605 g/ml. Quando as células progenitoras hematopoiéticas CD34+ são isoladas das células de medula óssea, a suspensão de partículas de sílica coloidal organosilanizada tem, de preferência, uma densidade específica de 1,0685 g/ml.

As células dendriticas também são isoladas, utilizando as composições descritas acima. Neste caso, podem ser utilizadas as suspensões tendo densidades de 1,0770 g/ml, 1,0720 g/ml, 1,0650 g/ml, 1,0610 g/ml e 1,0565 g/ml. O invento também inclui um conjunto para separação celular. O conjunto consiste num recipiente que pode ser centrifugado, e numa suspensão de separação celular à base de partículas de sílica coloidal silanizada, tal como está descrito acima. 5

Um processo de esterilização de um meio de separação celular à base de partículas de sílica silanizada também está incluído no presente invento, em que o meio de separação é sujeito a autoclavagem ou radiação ionizante na presença de cerca de 0,05%, e de preferência entre cerca de 0,1 e 10%, de polilactama.

Mais na generalidade, o invento inclui um método de isolamento de uma célula sanguínea rara escolhida de uma mistura celular, em que a mistura é, em primeiro lugar, deposta em camadas num meio de separação celular à base de partículas de sílica coloidal silanizada tendo uma densidade específica de cerca de 0, 0005 g/ml da célula escolhida. A mistura é então centrifugada. De acordo com uma forma de realização preferida, a centrifugação é executada num chamado tubo "armadilha de células" que contém: (i) paredes laterais e um fundo fechado, e (ii) um elemento de constrição colocado dentro do tubo, o tubo de constrição sendo colocado e construído para reter fluido na parte inferior do tubo por baixo do elemento de constrição, quando o tubo é invertido. De igual modo, nesta configuração, antes da centrifugação o tubo é cheio com o meio de separação até um nível estendendo-se por cima do dito elemento de constrição, até um nível por cima de uma abertura formada pelo dito elemento de constrição, para que as células que são capturadas numa interface entre o meio de separação celular e um meio com menor densidade, sejam descarregados, após centrifugação, com o meio de densidade inferior quando o tubo é invertido. O tubo pode também incluir um topo fechado, uma primeira porta no topo através da qual o material fluido pode ser introduzido no tubo, uma segunda porta no topo, e um canal de fluido fechado estabelecendo a comunicação entre a segunda porta e o fundo do tubo por baixo do elemento de constrição. 6

Esta configuração pode ser usada para células progenitoras hematopoiéticas funcionais isoladas em concentrações do meio de separação de 1,0605 g/ml (de misturas de células do sangue periférico) e 1,0685 g/ml (da medula óssea). As células tumorais também são isoladas por este método, usando um meio de separação celular com uma densidade específica escolhida no intervalo entre 1,0490 - 1,0580 g/ml. De igual forma, as células dendríticas podem ser isoladas usando meios de separação tendo densidades específicas de 1,0770 g/ml, 1,0720 g/ml, 1,0650 g/ml, e 1,0565 g/ml.

Os linfócitos T citotóxicos podem ser isolados usando uma densidade específica de 1,0720 g/ml, 1,0610 g/ml ou 1,0565 g/ml.

Os meios de separação antecedentes podem ser realçados adicionando uma suspensão que inclui uma partícula de sílica silanizada ao qual é fixa uma molécula de ligação específica do antigénio celular. Esta adição pode ser usada para a deplecção de tipos de célula indesejadas de uma preparação, tal como linfócitos T.

Breve descrição das figuras A figura 1 mostra a recuperação de células progenitoras hematopoiéticas funcionais (unidades formadora de colónias, CFU) após incubação com 0,5% de PVP sujeitos a radiação gama em PBS, material de gradiente de densidade (OCSP) à base de partículas de OCS sujeito a radiação gama, ou material de gradiente de densidade à base de partículas de OCS sujeitas a radiação gama complementadas com 0,5% de PVP (OCSP + 0,5% PVP); 7 A figura 2 ilustra o efeito de várias concentrações de PVP presentes durante a esterilização de partículas OCS (OCSP), numa restrição induzida por radiação gama da função de célula progenitora hematopoiética (CFU); A figura 3 mostra a distribuição de células progenitoras do sangue periférico (PBPC) em interface e fracções de pastilhas em gradientes de densidade formados a partir de partículas de sílica coloidal na ausência (OCSP) e presença de 0,5% de PVP (OCSP + PVP); A figura 4 mostra a distribuição de células progenitoras hematopoiéticas (CD34+) em interface e fracções de pastilhas de gradientes de densidade formados a partir de partículas de sílica coloidal (OCSP) na ausência e presença de 0,5% de PVP (OCSP + PVP); A figura 5 mostra uma comparação da deplecção não específico de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) associadas a microesferas com classificação de células com ajuste de densidade (DACS) revestidas com dois tipos de preparação de GAM-IgG; A figura 6 mostra uma perda não específica de células CD34+ com microesferas DACS revestidas com cabra anti-IgG de rato (GAM) ou F(ab) 2 GAM - IgG; A figura 7 mostra uma perda não específica de células CD34+ com microesferas DACS revestidas com GAM-IgG intacto, numa orientação quer aleatória quer especifica do local; A figura 8 ilustra a recuperação, em percentagem, de células totais, células CD34+, CTL's e glóbulos vermelhos (RBC) da combinação de interface + partículas após centrifugação de células da medula óssea num gradiente OCS; 8 A figura 9 ilustra a recuperação, em percentagem, de células totais, células CD34+, CTL e células de glóbulos vermelhos (RBC) da interface do gradiente, a seguir à centrifugação; A figura 10 ilustra a distribuição da actividade de células supressoras naturais em fracções com diferentes densidades; A figura 11 ilustra a distribuição de células exterminadoras naturais em fracções com densidade diferente; A figura 12 ilustra os resultados de experiências nas quais as amostrais camada leucocitária de sangue periférico foram esvaziadas de células B do linfoma de ser humano por DACS; A figura 13 ilustra a recuperação de células CD34+ em amostras esvaziadas de sangue periférico da camada leucocitária, da figura 12; A figura 14 ilustra um conjunto de centrifugação esterilizado montado de acordo com o invento; e A figura 15 ilustra um dispositivo de centrifugação em sistema fechado adequado para inclusão num conjunto do invento.

Descrição detalhada do invento O invento engloba meios de separação por densidade da célula adequados para a separação celular, e particularmente para a separação ou isolamento a serem transplantadas para seres humanos. O invento também inclui processos para isolar tipos específicos de células, de preferência usando a nova composição do meio. 9

Tal como está descrito nas secções seguintes, os meios do invento foram desenvolvidos à luz da descoberta que os requerentes fizeram que a toxicidade celular reduz significativamente quando uma solução de uma polilactama gama, tal como a polivinilpirrolidona, é adicionada a uma suspensão de partículas de sílica coloidal organosilanizadas (OCS) usadas na separação celular em gradiente de densidade.

Em particular, a inclusão da polilactama evita a perda de potencial clonogénico em populações raras de células progenitoras hematopoiéticas que ocorre quando estas células são suspensas numa suspensão de partículas de sílica silanizada esterilizada. Para além disso, o presente invento inclui a descoberta de que a inclusão de polilactamas, tal como a polivinilpirrolidona, no meio de gradiente de densidade também reduz a agregação e perda de potencial clonogénico de células progenitoras hematopoiéticas que ocorre sem radiação ionizante. I. Definições "Sílica coloidal" refere-se a uma suspensão aquosa de partículas coloidais formadas pela polimerização de ácido monosilícico de S1O2 dissolvido em água. "Partículas de sílica silanizada" refere-se a uma composição de sílica em partículas ao qual é ligado de forma covalente um revestimento silano. "Partículas de sílica coloidal organosilanizada (OCS)" refere-se a uma composição de sílica coloidal ao qual é fixo de forma covalente um revestimento organosilano. A patente US 4,927, 749 descreve a preparação de uma tal composição. "Populações de células raras" refere-se a células que constituem menos de 1% do total de glóbulos brancos do sangue 10 (WBC) contados no sangue de um indivíduo saudável. Exemplos de células sanguíneas raras incluem células progenitoras hematopoiéticas CD34 + , que constituem cerca de 1% de glóbulos brancos do sangue (WBC), células exterminadoras naturais, células supressoras naturais, células dendríticas e células T citotóxicas. Também incluída nesta definição estão as células de fontes exógenas, incluindo células fetais circulatórias no sangue materno. "Toxicidade celular", "tóxico para células" e frases semelhantes referem-se aqui a qualquer diminuição na viabilidade celular ou função biológica que é mensurável numa população de células. Com referência às células progenitoras hematopoiéticas aqui descritas, o termo mais vulgar refere-se à diminuição do potencial clonogénico, tal como é evidenciado pelo rendimento reduzido de células capazes de formar colónias hematopoiéticas (CFU).

Uma "polilactama" é um polímero contendo grupos lactama pendente (amido cíclico) grupos ligados à estrutura do polímero. 0 polímero pode ser um homopolímero ou um copolímero. Os grupos lactama pendente terão normalmente dimensões de anel contendo entre 3-6 átomos de carbono. Um tipo preferido de polilactama para utilização no presente invento é a lactama polivinílica, tal como a polivinilpirrolidona, que tem um anel de quatro átomos de carbono.

As "células dendríticas", ou DC, são células imunes que são negativas para a expressão de CD3, CD4, CD8, CD14, CD16 e CD20, e positivas para a expressão de HLA-DR (isto é, MHC classe II). As células dendríticas apresentam uma morfologia distinta, isto é, são grandes células veladas que estendem dendrites quando cultivadas in vitro. 11

Um "antigénio de célula tumoral" é uma molécula, normalmente uma proteína, que está exposta na superfície de uma célula tumoral específica. Os exemplos de antigénio de células tumorais incluem o CD9, CD10, CD19 e CD20 presentes em células de linfoma de célula B; antigénios de célula tumoral que são específicas para determinados tumores mamários incluem Her2/Neu e receptores de estrogénio.

No contexto do presente invento, o termo "isotónico" significa ter uma osmolalidade que está dentro do intervalo tolerado pela célula, normalmente cerca de 280 - 340 mOsm/kg de H20 e, de preferência, para células humanas, cerca de 280 mOsm/kg de H20, dependendo do tipo e fonte da célula. II. Meio de separação celular

Esta secção descreve vários meios de separação celular que podem ser usados para isolar células da mistura celular. Os processos preferidos de separação celular descritos nas secções que seguem incluem a utilização de um material de separação celular, tal como um material de gradiente de densidade, tendo uma gravidade especifica entre 1,0000 g/ml e 2,000 g/ml, de preferência entre 1,0300 g/ml e 1,2000 g/ml, que é exacta dentro de ± 0,00005 g/ml, de preferência ± 0,00002 g/ml da gravidade específica da célula desejada. A. Meio de gradiente de densidade

Os meios preferidos de gradiente de densidade são suspensões de sílica coloidal tendo partículas compreendidas no intervalo entre 0,002 a 50 micrómetros. Um meio útil é o PERCOLL®, uma suspensão de partículas de sílica coloidal que 12 não é silanizado e que está disponível na Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, N.J). Mais preferida é uma suspensão de partículas de sílica coloidal organosilanizada, tal como está descrito na patente US 4, 927, 749 e tratada com PVP, tal como está descrito abaixo.

De acordo com uma características importante do invento, as soluções de gradiente de densidade deveriam ser preparadas e ajustadas para uma densidade pré-determinada. Para além disso, a osmolalidade deveria ser ajustada no intervalo de 280 a 320 mOsm/kg de H2O para preservar a integridade da célula, e o pH deveria estar compreendido no intervalo entre 6,8 a 7,8 e, mais preferencialmente, um pH de 7,4, para manter um gradiente de densidade fisiologicamente isotónico antes da utilização. A osmolalidade e o pH podem variar em função das condições específicas sob as quais o processo de separação em gradiente de densidade é executado. Por exemplo, a temperatura à qual as amostras são mantidas ou centrifugadas podem precisar de modificações na osmolalidade e / ou pH do material de gradiente de densidade, para manter a densidade adequada. Estas modificações da osmolalidade e pH serão evidentes para que tem competência na técnica.

Um material de gradiente de densidade preferido para utilização na separação celular de acordo com o presente invento é uma suspensão de partículas de sílica coloidal organosilanizada (OCS) , tal como está revelado na patente US 4,927,749 para Dorn.

Numa forma de realização preferida, o material de gradiente de densidade é diluído até uma densidade específica adequada numa solução salina fisiológica complementada com polivinilpirrolidona (PVP), tal como o PVP-10 disponível na Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) . De acordo com uma 13 característica importante, como revelado abaixo, descobriu-se que a inclusão de pelo menos 0,5% de PVP melhora o rendimento de tipos de célula sanguíneas raras funcionais. Descobriu-se que a inclusão de pelo menos 0,5% de PVP melhora o rendimento dos tipos de célula de sangue raro funcionais. Para além disso, uma tal concentração de PVP facilita a esterilização do material de gradiente de densidade OCS por radiação ionizante, tal como uma radiação gama ou de feixe de electrões. Na ausência de PVP, as células expostas ao meio sentem perda de capacidade funcional no caso de células CD34+, evidenciada pela perda de capacidade para formar colónias (redução de CFU) . Geralmente, a quantidade de PVP a ser adicionada a uma suspensão de separação celular OCS dependerá do objectivo e tratamento subsequentes da preparação. Para preservar a actividade funcional das células expostas à preparação OCS durante períodos de tempo relativamente curtos, basta, normalmente, uma concentração de 0,5%, em peso, de PVP. Para maiores exposições e exposições a radiação ionizante podem ser necessárias maiores concentrações de PVP, cerca de 3 - 8% em peso. B. Partículas de sílica silanizadas

Os processos e composições aqui descritas são aplicáveis a um conjunto de utilizações de partículas de sílica silanizada em conjunto com uma separação celular. As partículas podem ser silanizadas através de qualquer um dos processos conhecidos na técnica. A patente US 4,927,749 descreve a preparação de partículas OCS que são particularmente úteis na preparação de composições usadas no presente invento. Numa forma de realização, as partículas OCS com uma dimensão compreendida 14 18 nm, formam uma entre 3-22 nm, e em particular entre 13 -suspensão estável que actua como um meio de gradiente de densidade para separar misturas heterogéneas de células com base na densidade de flutuação.

Para além de formar materiais com gradiente de densidade, as partículas de sílica silanizada podem também ser usadas noutros aspectos da separação celular. Por exemplo, as partículas usadas em determinados passos de selecção positiva ou negativa podem ser tratadas com os processos aqui descritos. Estas partículas são normalmente microesferas de sílica silanizada ou microesferas tendo diâmetros compreendidos até cerca de 50 micrómetros e, convencionalmente, compreendidas no intervalo até cerca de 1 - 5 micrómetros. Estas partículas são silanizadas de acordo com processos bem conhecidos na técnica, por exemplo usando 3-aminopropiltrietoxisilano, (3-iodopropil)trimetoxisilano, [ l-9trimetoxilsilil)-2(m-(ou p)clorometil)-fenil]etano, ou 3-glicidil- oxipropiltrimetoxisilano (GPMS). Normalmente, estas partículas têm como moléculas fixações ligação antigénio específicas com fixações covalentes, tais como anticorpos, lectinas ou outros ligandos celulares. Quando adicionadas a uma mistura de células, as micro-células ligam a células tendo um antigénio ou antigénios alvo específicos e modificam (aumentam ou diminuem) a densidade das células. O polivinilpirrolidona (PVP) foi adicionado a suspensões de partículas de sílica coloidal não silanizada (Pertoft et al. , Exp. Cell Res. 46:621-623 (1966); Pertoft et al . , Exp. Cell Res. 50:355 - 368 (1968); Wolff et al. , J. Cell Biol. , 55:579 - 585 (1972); Pertoft et al., Exp. Cell Res. 110: 449 -457 (1977)) . No entanto, o PVP livre em solução foi reportado como tendo efeitos indesejáveis nalguns tipos de células 15 (Pertoft et al., Exp. Cell Res. 50:355 - 368 (1968)). Isto conduz a um desenvolvimento de um processo de cura térmica que produz um revestimento de PVP absorvido nas partículas de sílica coloidal, e que está substancialmente livre de PVP livre (Pertoft et al., Anal. Biochem. 88: 271 - 282 (1978)). Esta composição está comercialmente disponível como PERCOLL®.

No entanto, o PERCOLL não pode ser esterilizado por meios convencionais (autoclavagem ou radiação ionizante) quando diluído numa solução salina fisiológica com uma concentração final adequada para a separação celular. Isto limita a sua utilidade em aplicações que exigem um material gradiente de densidade finalmente esterilizado num meio fisiológico.

Como foi referido acima, verificou-se que uma preparação à base de partículas de sílica coloidal tendo um revestimento de organosilano covalente tem utilidade na separação de várias células sanguíneas (Patente US 4,927,749). O revestimento de organosilano reduz a toxicidade celular e elimina a agregação das próprias partículas de sílica coloidal na presença de um sal fisiológico e de uma proteína. No entanto, as partículas de sílica coloidal (OCS) revestidas com organosilano têm determinadas desvantagens quando usadas para separar ou purificar células sanguíneas rara específicas do sangue e de outras fontes. A utilização destas partículas pode resultar numa menor recuperação destas células raras. Isto está exemplificado abaixo em conjunto com o isolamento de uma célula progenitora hematopoiética importante, caracterizado antigenicamente como uma célula CD34+, que pode ser isolada do sangue ou da medula óssea. Especificamente, estas células sanguíneas progenitoras raras agregam-se ou de outra forma aumentam de densidade, quando suspensas num material de densidade à base de partículas OCS. Além disso, a esterilização 16 de uma suspensão à base de partículas OCS por radiação ionizante resulta numa composição que é tóxica para estas células. Os testes demonstraram que estes resultados, e as melhorias proporcionadas pelas descobertas do presente invento estão presentes nas secções seguintes. C. Protecção por polilactamas contra a toxicidade provocada por radiação de partículas de sílica silanizada Há um conjunto de processos para esterilizar materiais de gradiente de densidade. Os materiais de gradiente de densidade à base de partículas de sílica podem ser esterilizados por autoclavagem ou filtragem, de acordo com processos conhecidos na técnica. Um processo que é particularmente útil é a esterilização por radiação ionizante. Este processo pode ser preferido quando o material de densidade preparado vai ser distribuído em recipientes consumíveis em plástico, tal como nos tubos, sacos ou seringas pré-cheios de centrifugadora, e semelhante para separações clínicas, ou quando irá ser distribuído em quaisquer recipientes sensíveis ao calor, tais como garrafas de plástico. Ao contrário de outros processos de esterilização, os processos de esterilização à base de radiação podem ser executados no recipiente do produto final como um processo de um único passo. Isto é, quando é necessário esterilizar, quer um recipiente, quer um líquido ou suspensão no recipiente, não há necessidade de esterilizar separadamente o próprio recipiente, como é exigido quando são usados métodos de filtragem, e não há necessidade de transferir o material de uma cuba de esterilização para recipiente individuais, o que ocorreria normalmente com a esterilização por calor (autoclavagem). 17

As técnicas para a esterilização de dispositivos médicos através de radiação ionizante são conhecidas na técnica. Os métodos usados mais vulgarmente e aplicáveis ao presente invento incluem radiação gama e radiação por feixe de electrões. Embora cada um dos processo envolva um tipo diferente de fonte de energia, ambos os métodos envolvem a passagem do dispositivo por um campo de radiação para se conseguir uma dose de radiação específica para o dispositivo. Normalmente, a esterilização de um instrumento médico exige uma dose entre 10 e 30 kiloGray (kGy) . No entanto, tal como está descrito abaixo, quando é usado qualquer um destes métodos para esterilizar sílica coloidal organosilanizada, o material torna-se tóxico para células hematopoiéticas, a menos que uma polilactama, tal como o PVP, esteja presente na suspensão de partículas durante a radiação.

As polilactamas usadas no presente invento são, de preferência, polímeros solúveis tais como a série KOLLIDON® de polivinilpirrolidonas (BASF, Ludwigshafen, Alemanha). Estes polímeros estão normalmente disponíveis em pesos moleculares de polímero compreendidos entre 2000 e 350.000, e são classificados pelas suas viscosidades intrínsecas ou "valores K". Em testes executados para suporte do presente invento, foram usadas preparações tendo pesos moleculares médios de cerca de 10.000.

Sabe-se que a polivinilpirrolidona (PVP) é sensível a radiação gama. Normalmente, observa-se um aumento no peso molecular médio do polímero quando uma solução de PVP é exposta a 10 - 30 kGy de radiação gama. Assim, o fabricante não recomenda que o material seja exposto a radiação ionizante para efeitos de esterilização (KOLLIDON: polivinilpirrolidona para a 18 indústria farmacêutica, BASF Aktiengesselschaft, Feinchemie, D67056 Ludwigshafen).

Em testes executados para suporte do presente invento, descobriu-se que a incubação de células mononucleares de sangue periférico (PBPC) num material de gradiente de densidade à base de partículas OCS esterilizado por filtragem (0,2 pm) ou por esterilização por calor (autoclave, 15 minutos a 120°) não afecta significativamente a recuperação de células progenitoras hematopoiéticas viáveis, tal como avaliado por um ensaio de células funcional, o ensaio de unidade formadora de colónias (CFU), que mede o potencial destas células para formar colónias hematopoiéticas. No entanto, quando um material gradiente de densidade à base de partículas OCS foi esterilizado por exposição a radiação gama (2,5 - 3,5 MegaRad) de acordo com processos Standard, as células incubadas neste meio, de acordo com o protocolo descrito como Método 2 no exemplo 4 (incubação com OCS + 0,5% de PVP durante 30 minutos mais 10 minutos de tempo de centrifugação) apresentaram uma menor actividade funcional (para aproximadamente 25% da actividade CFU acrescentada). O resultado foi ainda mais surpreendente para células tratadas de acordo com o protocolo descrito como Método 4 no exemplo 4, no qual não foi incluído o passo de cultura. Aqui, as células foram incubadas durante 30 minutos num material gradiente de densidade à base de partículas OCS, partículas OCS + 0,5% de PVP ou solução tampão + 0,5% de PVP, seguido de centrifugação durante 10 minutos seguido de 24 horas de incubação num meio ISCOVES complementado com 10% de soro de células fetais. A inclusão de 0,5% de PVP na suspensão de partículas OCS durante a esterilização preparatória resultou numa recuperação de cerca de 65% do CFU acrescentado (figura 1), enquanto as células incubadas num material de gradiente de 19 densidade à base de partículas OCS apresentavam, por si só, apenas cerca de 1% da actividade funcional original. Embora este teste usasse células derivadas de PBMC, as células derivadas de medula óssea e do cordão umbilical apresentavam as mesmas susceptibilidades. A quantidade de polilactama necessária para proporcionar protecção às células foi investigada noutros testes efectuados para suporte do presente invento. A figura 2 mostra como os resultados do material de gradiente de densidade à base de partículas OCS foi complementado com várias concentrações de PVP antes da radiação gama (11,5 - 3,5 megaRad). Neste estudo, as células PBPC foram processadas de acordo com o protocolo identificado como Método 6 no exemplo 4 (incubação na presença de suspensão de gradiente de densidade e 10% de soro de vitelo-fetal durante 24 horas à temperatura ambiente). A PVP para além dos 3% de concentração final no meio gradiente de densidade proporcionou protecção significativa contra a toxicidade provocada por radiação na dose (2,5 - 3,5 megaRad) de radiação aplicada. A adição de PVP após esterilização do meio não proporcionou um efeito protector semelhante.

Do que foi referido acima será evidente que o presente invento inclui uma melhor composição de gradiente de densidade celular para utilização na separação de células sanguíneas raras. A composição do produto é uma partícula de sílica silanizada tratada pelo processo de radiação ionizante na presença de pelo menos cerca de 0,05% de polilactama e, mais especif icamente, entre cerca de 0,1 e 10% de polivinilpirrolidona. Uma tal composição é particularmente bem adequada para isolar células sanguíneas progenitoras raras, tal como células progenitoras hematopoiéticas (CD34+) que são 20 sensíveis à exposição a sílica coloidal organosilanizada irradiada. D. Melhoria na polilactama da recuperação de células sanguíneas raras a partir de gradientes de densidade

De acordo com outro aspecto do invento, descobriu-se que a suplementação de uma suspensão de partículas de sílica organosilanizada com 0,05% (peso/volume) de polilactama resulta em melhores rendimentos de células sanguíneas raras em forma funcional. Mais especificamente, a inclusão da polilactama evita a agregação ou aglutinação de glóbulos das células para proporcionar uma composição celular tendo um perfil de densidade mais uniforme e melhores propriedades funcionais. Em comparação com células isoladas em material de gradiente de densidade OCS na ausência de uma polilactama, estas composições são caracterizadas por uma melhor recuperação de células raras em fracções enriquecidas, e melhor recuperação de células raras tendo um potencial clonogénico.

As figuras 3 e 4 mostram o resultado de experiência nas quais PBPC isoladas de acordo com métodos padrão foram carregadas num gradiente de densidade de sílica coloidal organosilanizada (material de gradiente de densidade à base de partículas OCS, 1,0605 g/ml, 280 mOsm/kg de H20, pH 7,4) e centrifugadas de acordo com o protocolo detalhado no exemplo 3. A figura 3 mostra que, na ausência de PVP, a maior parte das células presentes no material de arranque foram recuperadas da pastilha. A inspecção visual revelou que esta peletização das células parecia ser o resultado da agregação ou aglutinação de glóbulos das células. Em contraste, quando o material de densidade de OCS era suplementado com 0,5% de PVP, uma maior 21 percentagem de células permanecia na interface, como seria previsível com base na densidade pré-determinada destas células.

Esta observação era mais pronunciada quando as mesmas preparações celulares foram analisadas para a presença de células progenitoras hematopoiéticas (células CD34+) de acordo com os processos detalhados nos exemplos 5 e 6 (análise FACS e CFU) . Os resultados ilustrados na figura 4 mostram que, na ausência de PVP, cerca de 90% das células CD34+ migravam para a pastilha. A presença de 0,5% de PVP na suspensão de gradiente de densidade invertia este padrão. Aqui, a maior parte das células CD34+ permanecia na interface, tal como é desejável para efeitos de isolamento e enriquecimento destas células para transplante e outros objectivos clínicos. III. Métodos de isolamento de tipos específicos de célula

Tendo em vista o referido acima, pode ser tomado em consideração que o presente invento inclui, não só uma composição de gradiente de densidade que melhora a recuperação de células sanguíneas raras, mas também um processo de isolamento de células sanguíneas funcionais raras, e particularmente células tais como células progenitoras hematopoiéticas (por exemplo células CD34+) células dendríticas, células exterminadoras naturais, células supressoras naturais, e semelhantes de uma mistura celular.

Na generalidade, as células progenitoras hematopoiéticas podem ser isoladas da medula óssea, sangue do cordão umbilical ou de amostras de sangue periférico derivados de um sujeito, em particular um ser humano. É desejável, em primeiro lugar, 22 mobilizar as células no sujeito administrando agentes tais como factor estimulante de colónia granulocítica (G-CSF), VP16 ou uma combinação dos dois factores, de acordo com protocolos bem conhecidos na técnica. A seguir a este tratamento, o doente é sujeito a aférese para recolher PBPC ou para aspiração da medula óssea para recolher medula óssea.

De acordo com o presente processo, as células recolhidas são depostas em camadas num material gradiente de densidade e, de preferência, numa suspensão de gradiente de densidade de separação celular à base de partículas de sílica coloidal organosilanizada que tem uma densidade específica que é aproximadamente igual à das células a serem isoladas. 0 meio inclui, de preferência, pelo menos 0,05% de PVP e, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 0,5% de PVP. A suspensão é então centrifugada para células peletizadas tendo uma densidade específica que é superior à densidade específica da célula hematopoiética seleccionada. Uma tal composição de gradiente de densidade tem também a vantagem de poder ser esterilizada através de métodos descritos acima. O processo acima pode também ser melhorado adicionando à mistura celular inicial uma suspensão que inclui uma partícula de sílica organosilanizada à qual é fixo uma molécula de ligação específica do antigénio para selecção negativa ou positiva. Como exemplo da selecção negativa, a molécula de ligação específica do antigénio liga um tipo de célula indesejado na mistura celular para obrigar a célula a migrar para a pastilha. Como exemplo, é por vezes desejável esvaziar os linfócitos T de uma mistura celular, tal como uma mistura de célula estaminal hematopoiética, antes de reintroduzir as células escolhidas no corpo. Estes linfócitos T podem ser esvaziados, por exemplo, tratando a mistura celular com 23 microesferas às quais é ligado um antigénio especifico do linfócito T. As microesferas são então separadas da mistura celular desejada por centrifugação. Os exemplos dos reagentes de ligação do antigénio especifico do linfócito T que podem ser ligados às microesferas incluem anticorpos monoclonais de rato anti-CD3, anti-CD4 e anti-CD8.

Quaisquer tubos adequados para utilização na centrifugação podem ser usados na execução prática do invento. Numa forma de realização preferida do presente invento, o dispositivo de centrifugação "armadilha" descrito na WO 96/07097 será usada para a separação por densidade das células CD34+. A. Isolamento de célula progenitoras hematopoiéticas CD34+ O pedido PCT/95/11169 da publicação WO 96/07097 descreve estudos nos quais foi usado o PERCOLL® com uma osmolalidade fisiológica de 280 ± 10 mOsm/kg de H20 e pH de 7,4 como um material de gradiente de densidade para isolar células CD34+ do sangue separado (aférese). De acordo com o invento aqui descrito, nesta osmolalidade, a recuperação de células CD34+ foi óptima com uma densidade especifica de 1,0605 g/ml.

Em estudos executados para suporte do presente invento, células da medula óssea foram recolhidas por aspiração, de acordo com procedimentos clínicos Standard, de dadores saudáveis obtidos no Bone Marrow Transplantation Laboratory da School of Medicine da Universidade de Stanford, Paio Alto, CA. As células CD34+ foram enriquecidas a partir da fracção de célula da medula óssea por centrifugação por cima de um gradiente OCS tendo uma densidade específica de 1,0685 g/ml com 280 mOsm/kg de H20, pH 7,4, preparado e formado de acordo com 24 os processos do presente invento, tal como descrito no exemplo 10 .

As figuras 8 e 9 resumem os resultados dos estudos de isolamento em células da medula óssea processadas na suspensão OCS de 1,0685 g/ml. A figura 8 mostra a recuperação em percentagem de células totais, células CD34+, linfócitos T e glóbulos vermelhos (RBC) de todo o gradiente (interface + pastilha). A figura 18 mostra a recuperação em percentagem das mesmas fracções celulares a partir da interface do gradiente a seguir à centrifugação. Os dados apresentados em ambas as figuras foram calculados dividindo cada fracção pelo número total de células carregadas inicialmente no gradiente.

Da figura 8 pode ver-se que mais de 90% das células carregadas inicialmente no gradiente foram recuperadas da interface e pastilha. Uma vez que a perda de células CD34+ era comparável à perda aproximada de células totais (10%), não havia perda preferencial destas células. A figura 9 mostra que, enquanto apenas 26 ± 10% das células totais foram recuperadas da interface, esta fracção continha 91 ± 9% das células CD34 + , 10% de linfócitos T e essencialmente nenhuns glóbulos vermelhos. Estes estudos demonstram um enriquecimento substantivo de células CD34+, acopladas com a deplecção de linfócitos T, através do procedimento de gradiente de densidade do presente invento. Tal como será referido na secção seguintes, estas caracteristicas recomendam a preparação para utilização em transplante de células estaminais alogeneicas. B. Células supressoras naturais 25

Estudos in vitro mostram que a medula óssea humana contém células com baixa densidade que bloqueiam in vitro todas as respostas na reacção linfocitária mista (MLR). Com base no facto desta actividade supressora ser não restrita a HLA, foi referida na literatura como actividade supressora natural (NS) . Um gradiente de densidade PERCOLL® foi ajustado para uma densidade 1,0605 ± 0,0005 g/ml para testar a sua capacidade para enriquecer células com actividade NS. As amostras de sangue separado (aférese) de doentes com linfoma e de indivíduos normais que receberam o tratamento G-CSF foram centrifugadas num gradiente descontínuo de cinco camadas, e as interfaces e pastilha foram avaliadas para o seu potencial de supressão da cultura linfocitária mista. A figura 10 mostra que as células com actividade NS tinham uma densidade igual ou inferior a 1,0605 g/ml. Consequentemente, mais de 90% da actividade NS estava presente na preparação celular final após centrifugação num gradiente de 1,0605 g/ml. C. Células exterminadoras naturais

As células exterminadoras naturais (NK) têm sido mostradas como exterminando células de tumor autólogo. De uma perspectiva clínica, pode ser benéfico ter um número maior de células NK no transplante para reduzir o relapso do tumor. Em experiências para suporte do presente invento, a densidade das células NK foi determinada num gradiente descontínuo PERCOLL® de cinco camadas. As células NK também revelaram uma densidade igual ou inferior a 1,0605 g/ml. Consequentemente, mais de 90% das células NK estava presente na preparação celular final após centrifugação num gradiente de 1,0605 g/ml, tal como está ilustrado na figura 11. 26 D. Enriquecimento de células dendríticas e linfócitos T citotóxicos

As células dendríticas (células apresentando antigénios) são células derivadas de fracções de sangue. Estas células actuam in vivo para apresentar o antigénio aos linfócitos T para provocar uma resposta principal de linfócito T citotóxico (CTL). Estas células têm utilidade clínica para utilização na indução ou melhoria de respostas celulares imunes.

De acordo com outro aspecto do presente invento, as células dendríticas e linfócitos citotóxicos são isolados usando gradientes de densidade definidos, num processo em três fases. Este processo inclui a centrifugação através de três soluções diferentes de gradiente de densidade, tal como está detalhado no exemplo 12. De acordo com o presente invento, o material de gradiente de densidade OCS tendo densidades de 1,0770, 1,0720 e 1,0610 ou 1,0720, 1,0610 e 1,0565 g/ml, cada um com um pH de 7, 4 e uma osmolalidade de 2 80 mOsm/kg de H20 são usados em três fases, que são executadas de forma conveniente, mas não necessariamente, num tubo "armadilha". Os técnicos reconhecerão que também podem ser usadas densidades equivalentes de outros meios. Por exemplo, o passo 1 pode ser executado num Lymphoprep (Nycomed Laboratories, Oslo, Noruega) ou num PERCOLL® equivalente a Ficoll (densidade 1,0770, 310 mOsm/kg de H20, pH 7,4); o passo 2 pode ser executado numa solução PERCOLL® (densidade 1,0650, pH 7,4, 300 mOsm/kg de H20; e o passo 3 pode ser executado numa solução PERCOLL® tendo uma densidade de 1,0800 g/ml, pH 7,4, mOsm/kg de H20, ou numa solução PERCOLL® tendo uma densidade de 1,0550 g/ml, 290 mOsm/kg de H20, pH 7,4). No entanto, as densidades referidas 27 acima e determinadas usando uma separação celular à base de partículas OCS e métodos de enriquecimento do presente invento são vantajosas por serem executados com osmolalidades fisiológicas, mais do que sob condições hiperosmóticas reportadas anteriormente. E. Classificação de células com ajuste de densidade (DACS) 0 presente invento também proporciona a depuração de células da medula óssea ou de outras células tumorais contaminando a fonte de células progenitoras ou outras células indesejáveis. Para efeitos de depuração, a densidade de uma determinada célula tumoral é determinada por centrifugação de uma amostra contendo um tumor num gradiente de densidade descontínuo compreendido no intervalo entre 1,0490 a 1,0640 g/ml. A maior parte das células indesejáveis, não tumorais, representa células do sistema imune e hematopoiéticas e têm uma densidade compreendida no intervalo entre 1,0610 a 1,0770. A densidade das células tumorais cai normalmente dentro de um intervalo de densidade de 1,0490 a 1,0580 g/ml. A densidade do meio de separação celular é determinado para uma precisão compreendida entre ± 0,0005 g/ml, de preferência ± 0,0002 g/ml da gravidade específica das células pretendidas. Assim, a depuração tumoral pode ser conseguida num processo de dois passos, no qual as células pretendidas são peletizadas, em primeiro lugar, através de um meio de separação celular capaz de reter células tumorais. Em alternativa, a técnica de depuração pode ser usada para remover células tumorais num processo de um passo, de acordo com os métodos descritos abaixo. 28

As experiências executadas para suporte do presente invento demonstraram que as células CD34+ foram enriquecidas usando o procedimento DACS em conjunto com o método de densidade do invento, removendo células contaminadoras com um anti-CD45 mAb acoplado a um portador pesado (tal como microesferas magnéticas ou microesferas de vidro aminopropil). 0 número total de células foi reduzido em 82% e o rendimento CD34 de cerca de 40%. A pureza do CD34 foi aumentada de 2% para aproximadamente 20%. Uma vez que o anticorpo anti-CD45 também removeu algumas das células CD34+, é de tomar em consideração que este processo poderia ser melhorado usando uma mistura de outros anticorpos para a deplecção de células não estaminais.

Para examinar perdas celulares não especificas durante a DACS foram executadas experiências usando células mononucleares de sangue periférico (PBM) da camada leucocitária e microesferas DACS na ausência de anticorpos monoclonais. Tal como está detalhado no exemplo 10, as microesferas DACS foram feitas usando quer GAM-IgG intacto ou F(ab)2 GAM-IgG para testar a teoria que a ligação de células mediada pelo receptor Fc a microesferas DACS revestidas com IgG contribuiu para uma deplecção não específica. Os resultados na figura 5 demonstram que não havia deplecção não específica de células quando foram usadas as microesferas DACS revestidas com GAM-IgG F(ab)2r quando comparadas com microesferas DACS com GAM-IgG intacto. As microesferas DACS revestidas com GAM-IgG ligaram-se através do sítio glicosilado na zona Fc, também demonstraram uma menor deplecção não específica de células, quando comparada com microesferas DACS com GAM-IgG numa orientação aleatória. Estes resultados demonstraram que a remoção ou bloqueamento da zona Fc da GAM-IgG leva a uma redução na deplecção não específico de células. 29

Os resultados acima mostram que a ligação mediada pelo receptor FC (FcR) de células a microesferas DACS pode ser responsável por alguma da deplecção não específica de células CD34+ observadas durante o tratamento DACS. Isto é ainda ilustrado pelo acoplamento específico do sítio que resulta numa redução de perda não específica de células devido ao bloqueamento das áreas glicosiladas da porção Fc da molécula de imunoglobulina, tal como descrito acima. No entanto, a utilização de microesferas DACS revestidas com BSA demonstrou que a ligação mediada com FcR não é normalmente responsável por toda a deplecção não específico de células. É provável que também sejam envolvidas as interações iónicas entre a célula e a superfície da microesfera. Para investigar esta possibilidade, foram feitas microesferas DACS revestidas com PEG ensanduichadas entre a superfície de microesfera e a GAM-IgG. Isto foi feito para explorar a capacidade do PEG para reduzir as interacções iónicas entre proteínas e superfícies carregadas. Numa experiência comparando microesferas DACS revestidas com PEG-GAM-IgG com microesferas DACS com GAM-IgG na ausência de PEG, descobriu-se que a utilização do PEG está associado a uma redução na deplecção não específica das células. A redução na deplecção não específica por modificação de microesferas DACS é particularmente importante no contexto do enriquecimento de células raras tais como células CD34+, células NK, células supressoras naturais, células dendríticas, células nucleadas de origem fetal, e semelhantes, nas quais é importante maximizar o rendimento das células. Por exemplo, as experiência para definir a perda não específica de células CD34+ demonstram que a utilização de microesferas DACS revestidas com F(ab)2 leva a uma redução na perda não 30 específica de células CD34+ (figura 6). De igual forma, usando microesferas DACS revestidas com GAM-IgGl ligadas através do sítio de glicosilação da zona Fc também reduziu a deplecção não específica de células CD34+ quando comparadas com microesferas DACS com GAM-IgG numa orientação aleatória (figura 7).

E. Deplecção de linfócitos T A doença Graft vs Host (GvHD) é provocada pelos linfócitos T que estão presentes em aloenxertos de dadores, embora a remoção total destas células também resulte na falha do enxerto e relapso do tumor. Assim, pode ser exigida a presença de um número limitado de linfócitos T para transplante alogeneico com sucesso. Em experiências executadas para suporte do presente invento, foram usadas microesferas DACS para esvaziar os linfócitos T de preparações PBSC separadas (aférese) de dadores mobilizados com G-CSF. Os linfócitos T foram esvaziados de uma preparação PBSC mobilizada adicionando à preparação da mistura de anticorpos monoclonais do rato anti-CD3, anti-CD4, e anti-CD8, seguida por microesferas DACS de cabra anti- IgG de rato, e centrifugação através de um gradiente OCS tendo uma densidade de 1,0605 g/ml a 280 mOsm, pH 7,4. Os linfócitos T foram monitorizados por reacção com anticorpos monoclonais anti-CD2, para evitar possíveis artefactos associados com a utilização de anticorpos que reconhecem os mesmos epitopos nos antigénios de diferenciação. O método de deplecção de linfócito T DACS referido acima resultou numa redução de 97% dos linfócitos T, com apenas uma redução de 70% no rendimento de células CD34+. 60% das células CD34+ foram retidas na interface após tratamento DACS. Os resultados demonstraram que o enriquecimento celular combinado 31 com o método DACS reduzem especificamente o teor de linfócitos T de material de aloenxertos em 97%, com uma perda inferior a 40% de células CD34+. Esta preparação é adequada para evitar o GVHD num material de transplante. F. Enriquecimento e depuração de células tumorais 1. Enriquecimento de células tumorais para diagnóstico

As células de tumores mamários são usadas para exemplificar os métodos de enriquecimento do presente invento. Para enriquecer estas células, um gradiente deveria ser ajustado para uma densidade de 1,0490 a 1,0580 g/ml, dependendo do tipo específico de células de tumores mamários, uma osmolalidade fisiológica de 270 - 290 mOsm/kg de H20 e pH fisiológico de 6,8 - 7,8. Numa forma de realização específica, como exemplo, as células de tumores mamários são carregadas directamente num tubo armadilha de centrifugação contendo um meio de separação celular adequado, tal como um meio de separação celular à base de partículas OCS, ou solução PERCOLL® cheia até um nível acima da constrição.

Nos exemplos específicos aqui descritos, o enriquecimento com sucesso de células tumorais foi executado num material de gradiente de densidade PERCOLL que foi ajustado à densidade específica entre 1,0490 a 1,0580 ± 0,0002 g/ml, dependendo do tipo específico de célula do tumor mamário, osmolalidade de 280 mOsm/kg de H20 e pH 7,4. A densidade da solução PERCOLL pode ser ajustada num densitómetro para definir exactamente a sua precisão.

As células enriquecidas pelos métodos descritos acima podem ser examinadas subsequentemente para a presença de 32 células do tumor mamário. 0 rendimento resultante de células isoladas ou enriquecidas dos métodos de separação celular do presente invento pode ser usado para efeitos de diagnóstico, por exemplo ensaios morfológicos, moleculares, bioquímicos ou imunofenotípicos. Por exemplo, o DNA pode ser preparado a partir das células recolhidas e sujeitas a reacção em cadeia da polimerase (PCR), tal como está descrito na secção de depuração de células tumorais abaixo, ou as células recolhidas podem ser avaliadas morfologicamente, evitando desta forma a utilização do procedimentos cirúrgicos invasivos e dispendiosos nos quais se baseia uma tal determinação. Vários antigénios do tumor mamário e marcadores de tumor mamário são conhecidos de quem tem conhecimento na técnica ou estão disponíveis comercialmente, incluindo, mas não lhe estando limitado, a catepsina D, EGF-R, receptor de estrogénio, Ki-67, receptor de progesterona e TGF-α. Os anticorpos dirigidos para estes antigénios ou marcadores podem ser utilizados para avaliar o tipo de tumor das células recolhidas.

Uma vantagem principal dos métodos aqui descritos é o facto de um volume grande de sangue completo poder ser colocado directamente no gradiente de densidade. Os sangue periférico pode ser recolhido em tubos contendo anticoagulante ou por aférese ou leucoferese. 0 sangue completo não precisa de ser processado ou diluído antes da centrifugação. No entanto, uma vez que os métodos enriquecem as células do tumor mamário com base na sua densidade de flutuação específica, é importante que as células seja sujeitos a separação ao fim de um período de tempo relativamente curto após a sua recolha de uma fonte in vivo, porque a densidade das células muda de acordo com a sua cultura ou condições de armazenamento. Assim, para se obter um enriquecimento óptimo das células de tumor mamário a partir do 33 sangue, é preferível que as amostras de sangue sejam usadas ao fim de 48 horas depois da sua recolha. Mais preferencialmente, as amostras de sangue deveriam ser sujeitas a uma centrifugação em gradiente de densidade até algumas horas após a recolha. 2. Depuração de células tumorais A depuração de células tumorais é executada de forma conveniente usando os métodos de enriquecimento de células tumorais referidos acima, ou mais preferencialmente, os métodos de separação celular aumentada DACS descritos acima. Como exemplo, quando as células do tumor mamário marcadas radioactivamente foram misturadas com uma camada leucocitária de sangue periférico, até 80% foram retidas por centrifugação da mistura num gradiente tendo uma densidade específica de 1,0580 g/ml e uma osmolalidade de 280 mOsm/kg de H2O. Para além disso, apenas uma pequena fracção (< 10% do número inicial de células) de células não tumorais foi descoberta na fracção tumoral recolhida. O pedido de patente PCT/95/11169 da publicação WO 96/07097 descreve o enriquecimento de células do tumor mamário de acordo com os processos do invento. Este processo pode também ser usado em conjunto com o procedimento DACS aqui descrito. Por exemplo, o sangue completo pode ser incubado directamente com anticorpos de anti-CD45 revestidos com partículas portadoras que reage com a maioria dos leucócitos. Uma vez que as células do tumor mamário não reagem significativamente com anti-CD45, a grande maioria dos glóbulos não vermelhos, leucócitos e outras células são tornados mais pesadas do que o material de densidade e pastilhas durante a centrifugação, enquanto as 34 células do tumor mamário permanecem no compartimento superior. Podem ser usada uma variedade de outros agentes de ligação específicos do tipo de células para assinalar tipos específicos de células no sangue, tal como referido nas secções anteriores.

Em alternativa, de acordo com um procedimento de depuração preferido, pode ser usado o procedimento de selecção positiva DACS para levar as células tumorais a ficarem mais pesadas do que as suas densidades normais, para que sejam peletizadas durante a centrifugação. Os agentes de ligação específicos do tipo de células úteis no procedimento de selecção positiva incluem, mas não lhe estão limitados, a anticorpos aos antigénios do tumor mamário e anticorpos para marcadores de tumor mamário, por exemplo HER2/Neu, CA 15-3, CA 549, catepsina D, EGF-R, receptor de estrogénio, Ki-67, receptor de progesterona, e TGF-α. Muitos destes anticorpos estão disponíveis comercialmente.

As células enriquecidas pelos processos descritos acima podem ser subsequentemente examinadas quanto à presença de células do tumor mamário. 0 rendimento resultante de células isoladas ou enriquecidas dos métodos de separação celular do presente invento pode ser usado para efeitos de diagnóstico, por exemplo ensaios morfológico, molecular, bioquímico ou imunofenotípico. Por exemplo, o DNA pode ser preparado a partir de células recolhidas e sujeitas a reacção em cadeia da polimerase (PCR) ou as células recolhidas podem ser avaliadas morfologicamente, evitando, desta forma, procedimentos cirúrgicos invasivos e dispendiosos, usados até agora para uma tal determinação. Em alternativa, as células tumorais podem ser identificadas pela presença de marcadores de células tumorais, conhecidos de quem tem competência na técnica, tal como está descrito acima. Os anticorpos dirigidos para estes antigénios 35 ou marcadores podem ser usados para avaliar o tipo de tumor de células recolhidas. 3. Depuração do tumor de amostras de sangue periférico A presença de células tumorais em enxertos de células estaminais e a incapacidade para esvaziar especificamente células tumorais da medula óssea de doentes com linfoma não Hodgkin pode ser um indicador importante na previsão do relapso da doença após um transplante autólogo. 0 processos de separação celular de acordo com o presente invento podem ser aplicados para remover células tumorais dos produtos de sangue periférico antes da reintrodução destes produtos no doente.

Em estudos executados para suporte do presente invento, a linha celular SU-DHL4 do linfoma de célula B foi usada para modelar a contaminação de célula tumoral do sangue periférico. Esta linha celular contém uma translocação recíproca entre os braços compridos dos cromossomas humanos 14 e 18, resultando numa justaposição do proto-oncogene bcl-2 à zona contígua do gene da cadeia pesada da imunoglobulina (Ig). Esta translocação, que conduz a níveis elevados do produto de gene bcl-2, encontra-se em 85% de linfomas foliculares de células pequenas clivadas e 25% de linfomas difusos de células grandes. 0 ponto de ruptura da translocação no gene bcl-2 está localizado, quer na major breakpoint region (MBR) espalhando-se aproximadamente 150 bp na zona na traduzida 3' (UTR) do gene bcl-2 ou na minor cluster region (MCR) de 500 bp localizada aproximadamente 20 kb a jusante do gene bcl-2. Usando pares de iniciadores específicos da translocação e PCR quantitativo limitando as técnica de análise por diluição conhecidas na 36 técnica, foi monitorizada a deplecção de células SU-DHL4 nas experiência de depuração de DACS.

De igual forma, a linha celular do adenocarcinoma humano SK-BR3 é usada para modelar a infiltração de células do cancro da mama do sangue periférico. Esta linha celular reage com o anticorpo monoclonal anti-humano de rato HR2/Neu. Antes de ser transformado em camadas leucocitárias normais, as células SK-BR3 foram pré-carregadas com calceina AM, um substrato fluorogénico, para poderem ser enumeradas por análise de citometria de fluxo (FACS - fluorescence activated cell sorting). Os detalhes dos métodos experimentais usados na execução das experiência de depuração tumoral estão proporcionados no exemplo.

Um ensaio PCR foi usado para monitorizar níveis de células tumorais nas misturas de células sanguíneas. Inicialmente, as misturas do DNA genómico da SU-DHL4 e uma linha celular humana (K562) de translocação negativa (14; 18) foram usadas como modelos de arranque para avaliar o nível de sensibilidade do ensaio PCR. Foi usada a electroforese em gel de agarose para separar produtos PCR, de quer uma volta quer de duas voltas de amplificação, tal como está ilustrado. Os produtos PCR derivados especificamente do DNA da SU-DHL foram identificados no gel. Os resultados destes testes preliminares mostraram que um ensaio PCR com indicadores internos pode detectar aproximadamente uma célula SU-DHL4 por 150.000 células.

Para além disso, o DNA genómico foi preparado a partir de alíquotas congeladas de sangue separado (aférese) de 24 doentes com um linfoma não Hodgkin (NHL) que receberam quimioterapia e G-CSF de acordo com métodos Standard conhecidos na técnica. Os produtos PCR com indicadores internos usando pares iniciadores específicos para a translocação da major breakpoint region 37 (MBR) foram encontrados em quatro doentes, demonstrando que este ensaio pode detectar células transportando a translocação de amostras clinicas autênticas.

Foram executados outras experiências para validar a utilização de análise PCR sob condições de diluição limitada para quantificação de frequência de células tumorais numa amostra. Foram executadas réplicas de reacções PCR usando quantidades conhecidas de DNA genómico da SU-DHL4 de entrada. Foram usados pares iniciadores PCR com indicadores internos para t (14; 18) (uma sequência alvo presente uma vez por célula SU-DHL4) e p53 (uma sequência alvo presente duas vezes por cada células SU-DHL4). A frequência observada de reacções PCR positivas demonstrou que as frequências experimentais são semelhantes a frequências esperadas com base nas estatísticas de Poisson. Assim, ficou demonstrado que o PCR usando análise com diluição limitada proporciona um método preciso e quantitativo para monitorizar células tumorais.

Para modelar a contaminação de células tumorais PBPC, amostras de sangue separado (aférese) de doentes mobilizados com G-SCF foram alimentadas com um número conhecido de células SU-DHL4. Este material foi usado para avaliar a remoção de células tumorais por DACS. Este processo envolve a incubação do sangue com anticorpos monoclonais de rato específicos de antigénios de superfície expressos na célula alvo (CD9, CD10, CD19, CD20). Este passo foi então seguido por incubação com cabra anti-Ig de rato revestido com microesferas de elevada densidade (microesferas DACS). A subpopulação de células ligadas a estas micropartícuias foi então separada de células não ligadas por centrifugação através de uma suspensão OCS suplementada com 0,5% de PVP a uma densidade específica de 1,0605 g/ml e esterilizada através de radiação gama. As células 38 foram recuperadas da interface (IF) e da pastilha (PT) após centrifugação em gradiente e foram quantificadas por electroforese em gel, tal como está detalhado no exemplo 5. Os resultados de uma experiência de depuração representativa estão ilustrados na figura 12 e na figura 13. A figura 12 mostra o número de células SU-DHL4 em: A) amostra não fraccionada (determinada por contagem visual), B) amostra não fraccionada, C) interface sem DACS, D) interface após utilização de microesferas DACS GAM-IgG, e E) Interface após utilização de microesferas DACS GAM-IgG e um cocktail de anticorpos monoclonais (mAbS) em células anti-B. 0 número de células SU-DHL4 em B, C, D e E foi determinada através de PCR quantitativa. A figura 13 representa a recuperação de células CD34+ na interface (IF) e pastilha (PT) de C, D e E. A deplecção de célula tumoral foi quantificado por análise PCR com diluição limitada para as amostras B - E, tal como está ilustrado. A recuperação de células hematopoiéticas CD34+ foi monitorizada por citometria de fluxo tricolor. A recuperação de células totais e células estaminais estão ilustradas relativamente à recuperação de células da interface. Um único ciclo de depuração usando um cocktail de anticorpos resultou numa deplecção especifica do log 2-3 de células SU-DHL4. A recuperação de células CD3 4+ após DACS foi superior a 70% e comparável com o número de células CD34 + recuperadas da interface na ausência de DACS As células mononucleares do sangue periférico são reduzidas em 70 - 80% através da centrifugação de densidade com ou sem DACS.

Noutro modelo para contaminação de células tumorais, as células SK-BR3 foram semeadas em camadas leucocitárias normais a uma frequência de 2%. As células tumorais das células 39 marcadas com calceína AM foram removidas da suspensão celular por centrifugação numa suspensão de densidade OCS tendo uma densidade especifica de 1,0605 g/ml com DACS usando um mAbs anti-humano HER-2/Neu. A deplecção foi determinada por análise FACS. As células marcadas com calceína AM foi controlada e a sua percentagem determinada usando o programa LYSYS II. Enquanto as células SK-BR3 não tinham sido esvaziadas da camada leucocitária após processamento numa suspensão OCS na presença ou ausência de microesferas DACS, estavam quase completamente removidas da mistura celular quando se usaram microesferas DACS em combinação com o mAb anti-Her2/Neu específico do cancro da mama. Estes dados mostram que o tratamento DACS reduz a contaminação de células tumorais em 1 ou 2 logs (10 - 100 vezes) quando a percentagem FACS é calculada de volta para o número inicial de células tumorais na amostra.

Em resumo, as experiência do modelo do exemplo acima referido usando células do linfoma humano da célula B e PCR quantitativo demonstram que uma redução de 2-3 log em células tumorais pode ser conseguido numa volta de DACS, retendo a maioria de células estaminais hematopoiéticas CD34+. Usando uma linha celular do adenocarcinoma humano e análise FACS conseguiu-se uma redução de 1 - 2 log nas células tumorais. Na generalidade, com o presente invento descobriu-se que este processo pode ser usado para depurar sangue ou populações de células enriquecidas terapeuticamente de células tumorais indesejados. IV. Conjunto de separação celular esterilizado

Uma aplicação importante da descoberta do presente invento é o conjunto esterilizado para separação celular. Um tal 40 conjunto é particularmente útil para separações celulares clinicas. Um tal conjunto incluirá, normalmente, um recipiente que pode ser centrifugado e um material de gradiente de densidade para separar células, que foi esterilizado como uma unidade cheia por exposição a radiação ionizante. 0 recipiente que pode ser centrifugado será normalmente uma unidade consumível e descartável, feita em plástico, tal como polipropileno, policarbonato, polisulfona, polimetilpenteno, polietileno, polialómero, poliestireno e semelhante. No entanto, tal como será referido abaixo, as vantagens de esterilização do conjunto como uma unidade pré-cheia também tornam este procedimento desejável para conjuntos que incluem tubos feitos noutros materiais. Numa forma de realização preferida, o recipiente estará fechado, tal como está ilustrado abaixo, para facilitar a recolha asséptica de material de arranque e a preservação e manipulação do material numa condição esterilizada. A figura 14 ilustra um conjunto 10 formado de acordo com o presente invento. Tal como está ilustrado, o conjunto 10 inclui um tubo de centrifugadora 12, aqui ilustrado cheio com material gradiente de densidade 14. O material gradiente de densidade é formado por uma suspensão de partículas de sílica organosilanizada, tal como partículas 16. O material gradiente de densidade também inclui pelo menos 0,05% de PVP e, de preferência, entre 0,1% e 10% de PVP, para reduzir a toxicidade para células sanguíneas raras isoladas no conjunto, melhorando assim o rendimento destas células no conjunto. O recipiente e o gradiente de densidade contido lá dentro são esterilizados por radiação ionizante, tal como uma radiação gama ou feixe de electrões. O conjunto resultante pode também incluir uma capa protectora, tal como uma tampa 18, para 41 proteger os conteúdos de tubo da contaminação após esterilização. O conjunto pode também incluir um suporte, tal com um suporte de tubo 20, para evitar o deslocamento do conteúdo do tubo durante a expedição e armazenamento. O conjunto, tal como está descrito acima, pode ser preparado de acordo com as especificações exigidas para separação de um conjunto de tipos de células. A dimensão do tubo usado, assim como a sua resiliência estrutural e química, podem ser alteradas dentro dos limites do presente invento, para utilização em ultracentrifugação, assim como em aplicações de centrifugação com velocidade relativamente baixa, tal como está aqui descrito. Estas modificações serão evidentes para quem tem competência na técnica.

De forma semelhante, o conjunto pode ser concebido para diferentes tipos de células, alterando a composição do material gradiente de densidade. O exemplo 9 descreve um conjunto que é particularmente formulado para isolamento de células progenitoras hematopoiéticas CD34+ da PBPC. Na forma de realização descrita, a suspensão de gradiente de densidade em partículas OCS é ajustada para uma densidade específica de 1, 0605 g/ml e uma osmolalidade de 280 mOsm/kg de H2O. Esta densidade é aproximadamente igual à densidade das células CD34+ desejadas, pelo que, após a centrifugação, estas células irão "flutuar" na interface entre o material de carga e o material de densidade presente no tubo.

De tomar em consideração que o enriquecimento de outros tipos de células sanguíneas raras, tal como células dendríticas, células citotóxicas T, células exterminadoras naturais, células supressoras naturais e células nucleadas de origem fetal pode conseguir-se ajustando a densidade específica e a osmolalidade do material de gradiente de densidade. Este 42 ajuste pode ser feito para que as células desejadas flutuem então ou peletizem, de acordo com a densidade das células desejadas e a densidade relativa de células indesejadas presentes na mistura celular de onde as células serão isoladas.

Uma configuração preferida de tubo de centrifugadora para utilização no conjunto e processo do invento é uma que tem um elemento de constrição colocado dentro do tubo, formando uma "armadilha". Um tal tubo está descrito no pedido de patente PCT/95/11169 (n° de publicação WO 96/07097). Uma forma modificada deste tubo está ilustrada como parte de um sistema fechado na figura 14, descrita abaixo.

No tubo armadilha, o elemento de constrição está posicionado e construído para reter fluido na parte inferior do tubo abaixo do elemento de constrição, quando o tubo é invertido. O tubo também inclui meio de separação celular que está contido na parte inferior do tubo e que se estende por cima do elemento de constrição para um nível acima da abertura formada pelo elemento de constrição. As células que são capturadas numa interface entre o meio de separação celular e um meio de menor densidade, após centrifugação, são descarregados com o meio de menor densidade quando o tubo é invertido. Estes meios fáceis de recolha de células são particularmente convenientes no contexto do presente invento, em que é desejável uma manipulação mínima das células.

De considerar também que, para aplicações clínicas, o conjunto pode ser configurado como um "sistema fechado" para restringir o acesso a patogénios externos aos materiais biológicos tal como está aqui descrito. A figura 14 mostra um recipiente que pode ser centrifugado tendo um elemento de constrição incorporado num sistema fechado. Tal como está ilustrado, o sistema fechado 70 inclui 43 um reservatório 71, ilustrado como um saco esterilizado, contendo sangue 72 recolhido previamente por meio de técnicas conhecidas, estando ligado por uma tubagem de ligação esterilizada 74 ao recipiente da centrifugadora 76, ilustrado como um tubo de centrifugadora tendo um topo fechado 77. 0 topo fechado terá pelo menos 1, e de preferência pelo menos duas portas de entrada, úteis para introdução e remoção da amostra, e para ventilação, tal como está descrito abaixo. Na forma de realização ilustrada, uma nervura sólida 79 ressaltando para cima a partir do topo fechado 77 é incluído para formar uma barreira protectora para as portas de entrada, e como um ponto de fixação para uma tampa protectora amovível para o aparelho, que serve para reduzir a contaminação potencial durante a expedição e armazenamento.

Ainda com referência à figura 14, a tubagem 74 é fixa ao recipiente 76 através da porta de entrada 78, adaptada com um encaixe 80, que pode ser qualquer tipo de ponta de travamento adaptada para ligação esterilizada, por exemplo um elemento de ligação de seringa Luer-Lock™. Em alternativa, o encaixe 80 pode ser um septo esterilizado adaptado para ligação com sacos e tubos de fluido esterilizados, por exemplo um conjunto de extensão de fio pequeno SAFSITE™ com válvula de refluxo e adaptador Spin-Lock disponíveis na Burron Medicai Inc., Bethlehem, Pensilvânia. Para facilitar o fluxo de fluido para o tubo de centrifugadora 76, o cesto contém uma porta de entrada de ventilação 82. Tal como está ilustrado, o filtro de ar 84 é fixo à porta de entrada 82 para evitar a contaminação.

De acordo com uma forma de realização preferida do invento, o recipiente 76 inclui um elemento de constrição 88. Embora seja possível um conjunto de configurações, tal como está ilustrado, o elemento de constrição 88 tem a forma de um 44 funil na sua superfície superior. Tal como está ilustrado, o elemento de constrição 88 é formado integralmente com o recipiente 76 formando um recorte dentado 89 na superfície exterior do tubo. 0 elemento de constrição é apoiado por suportes 90 para evitar a compressão durante a centrifugação. O recipiente também contém um material 91 de gradiente de densidade de partículas OCS disposto no tubo, quer por cima quer por baixo do elemento de constrição 88. Todo o sistema, tal como está ilustrado, é esterilizado por radiação gama ou feixe de electrões de acordo com métodos Standard.

Uma outras características do recipiente 76 é a porta de entrada 92. Esta porta de entrada comunica através do canal fechado de fluido 94 com a parte inferior 95 do recipiente 76. A porta de entrada e canal são usados para encher a parte inferior do tubo 95, por exemplo, com um meio de separação celular em gradiente de densidade antes da esterilização. Em alternativa, a porta e canal podem ser usados para remover materiais, incluindo materiais de peletização celular, do fundo do tubo a seguir à centrifugação. Esta característica do tubo não é exigida por, nem está restringida ao contexto do sistema fechado no qual está ilustrada. O fluxo de fluido do reservatório 70 para o recipiente 76 pode iniciar-se aplicando sucção na porta de entrada de ventilação 82, ou pode iniciar-se através de outros meios conhecidos na técnica, incluindo a acção da gravidade. O caudal é ajustado, quer alterando a pressão entre os dois recipientes, quer regulando uma válvula colocada no tubo ou na porta de entrada num ponto entre o reservatório 70 e a porta de entrada 78. O caudal é regulado optimamente para encher, ou encher parcialmente, a parte superior do recipiente 76, por cima do nível da solução de gradiente de densidade. Quando uma amostra 45 suficiente de fluido tiver entrado no tubo, o fluxo pode ser interrompido através de qualquer um do conjunto de meios conhecidos na técnica, tal como a regulação por uma válvula ou baixando a pressão. 0 tubo é então removido do cesto, a porta 78 é selada, e o recipiente fechado é sujeito a centrifugação, tal como está descrito acima.

Noutra forma de realização preferida que é particularmente útil na execução do método do presente invento, o tubo com constrição pode ter a forma de uma seringa que pode ser centrifugada, tal como a seringa da centrifugadora descrita no pedido de patente PCT/US 95/1162 (WO 96/06679) . Estas formas de realização são bem adequadas para utilização num sistema fechado, tal como está descrito acima.

Outra configuração do dispositivo que é adequado para utilização no invento é um saco que pode ser centrifugado. Uma tal configuração é particularmente adequada para utilização no processamento de amostras sanguíneas clínicas que podem ser recolhidas directamente para o saco.

Os exemplos seguintes ilustram, mas não se destinam de forma alguma a limitar o presente invento.

EXEMPLOS

Materiais A. Materiais de gradiente de densidade

As partículas de sílica coloidal organosilanizada (gama de tamanho 15 - 30 nm) usadas nos exemplos abaixo foram preparadas de acordo com os processos descritos na patente US 4,927,749 usando gama glicidoxipropiltrimetoxisilano (GPMS). A 46 polivinilpirrolidona (PVP-10) foi adquirida na Sigma (St. Louis, MO). B. Anticorpos monoclonais

Os anticorpos monoclonais (mAb) dirigidos contra antigénios de superfície específicos de células progenitoras hematopoiéticas (anti-CD34; anti-HPCA-2) e leucócitos (anti-CD45; anti-HLE-1) foram adquiridos na Becton Dickinson, Inc (San Jose, CA). Os diferentes anticorpos monoclonais foram marcados directamente com isoticianato de fluoresceína (FITC) ou ficoeritrina (PE) . Os anticorpos de controlo policlonais IgGl do isótopo marcado com PE foram adquiridos na Becton Dickinson, Inc. (San Jose).

Exemplo 1

Preparação da solução de gradiente de densidade 0 material gradiente de densidade à base de partículas OCS, preparado tal como está descrito em "Materiais" acima, foi diluído num fosfato salino tamponado (PBS) para proporcionar uma suspensão tendo uma osmolalidade definida e uma densidade específica com um pH de 7,4, tal como está indicado. 0 material gradiente de densidade à base de partículas OCS foi diluído em água até ter aproximadamente a densidade específica necessária. Foram adicionados sais sólidos para proporcionar uma solução salina fisiológica final (uma solução salina fisiológica ou fosfato salino tamponado da Dulbecco, Gibco). A suspensão foi suplementada com concentrações finais diferentes (0% - 10% peso/peso) de polivinilpirrolidona (PVP- 47 10) adicionando o pó sólido ajustado para a densidade da suspensão final. A suspensão diluída foi finalmente esterilizada através de radiação ionizante (radiação gama e feixe de electrões, 2,5 - 3,5 megaRad, Isomedix, Morton Grove, IL), autoclavagem (15 minutos a 120°) ou filtragem através de um filtro de 0,2 micrómetros de acordo com métodos Standard conhecidos na técnica e usados à temperatura ambiente.

Exemplo 2

Preparação de células progenitoras hematopoiéticas A. Misturas de células sanguíneas

As células mononucleares do sangue periférico (PBPC) foram recolhidas por aférese de doentes com um linfoma não Hodgkins (NHL) , com linfoma de Hodgkins (HL) e com cancro da mama, no Bone Marrow Transplantation Laboratory na Stanford University School of Medicine, Paio Alto, Califórnia, EUA. As PBPC foram mobilizadas em doentes NHL através de tratamento com ciclofosfamida (4 g/m2, intravenoso), seguido de um factor estimulante de colónia de granulócitos (G-CSF) (10 g/kg, intravenoso, diariamente). As PBPC foram mobilizados em doentes com cancro da mama através de tratamento com XXX (VP-16; 2 g/m2, intravenoso) seguido de G-CSF (10 pg/kg, intravenoso, diário). As PBPC foram mobilizados em doentes com cancro da mama através de tratamento com etoposido (VP-16; 2 g/m2, intravenoso) seguido de G-CSF (10 pg/kg, intravenoso, diário). As PBPC foram mobilizados em doentes com HL através de tratamento apenas com G-CSF. Os protocolos de mobilização são protocolos padrão conhecidos na técnica. 48 24 horas após a injecção final, cada doente foi submetido a aférese. As PBPC foram recolhidas do sangue separado (aférese) de acordo com métodos Standard. B. Misturas celulares da medula óssea

As células aspiradas da medula óssea foram depostas lentamente em camadas numa suspensão OCS preparada de acordo com o descrito acima, para uma densidade de 1, 0685 g/ml e uma osmolalidade de 280 mOsm/kg de H2O. Um máximo de 2xl09 células foi deposto em camadas e processado através de tubo da centrifugadora. O tubo foi centrifugado durante 30 minutos a 850 x g, à temperatura ambiente. As células da interface e pastilha foram recolhidas separadamente de um tubo armadilha, de acordo com o presente invento. As fracções celulares foram caracterizadas por análise FACS usando anti-CD34 (anti HPCA-2), anti-CD45 (anti-Hle-1), anti-CD3 (Leu-4) conjugados com FITC e PE, e anticorpos IG-GI, obtidos na Becton Dickinson, Inc. (San Jose, CA). Para análise, as células foram marcadas com o corante nuclear LDS 751 (Exciton, Inc., Dayton, OH) . As análises estatísticas foram executadas em eventos do tipo fluxo 104 usando um sistema FACSCAN equipado com um programa LYSYS II (Becton Dickinson, Inc. (San Jose, CA)).

Exemplo 3

Separação em gradiente de densidade de PBPC

As células PBPC (0,25 ml) recolhidas de acordo com o exemplo 2 e PBS diluído com uma concentração de aproximadamente 5xl07 células/ml foram depostas em camadas numa suspensão de 49 gradiente de densidade à base de partículas OCS (15 ml num tubo de centrifugadora de 50 ml). A suspensão tinha uma densidade específica de 1,0605 g/ml uma osmolalidade de 280 mOsm/kg de H2O e um pH de 7,4. A deposição em camadas foi executada lentamente para evitar misturas da amostra com a solução. Um máximo de 2xl09 células foi deposto em camadas por tubo. A centrifugação foi executada durante 30 min a 850 x g à temperatura ambiente. Para evitar a mistura das células e da solução de gradiente de densidade, a centrifugadora foi parada sem esforço de travagem. A seguir à centrifugação, as células foram divididas numa fracção de baixa densidade localizada na interface e numa fracção de elevada densidade formando a pastilha. Cada fracção celular foi recolhida e transferida para outro tubo de centrifugadora, em polipropileno, de 50 ml. As células foram lavadas uma vez e guardadas num fosfato salino tamponado da Dulbecco isento de CA++ e MG++ (D-PBS) à temperatura ambiente até manipulação adicional. O número e funcionalidade das células progenitoras hematopoiéticas (células CD34+) foram determinados quer nas fracções celulares por análise FACS, quer em ensaios clonogénicos (CFU), tal como está detalhada nos exemplos 5 e 6 abaixo.

Exemplo 4

Efeito nas células da mistura com partículas de sílica coloidal silanizada A avaliação do efeito de mistura e subsequente incubação de sangue periférico humano em soluções de gradiente de 50 densidade à base de partículas de sílica coloidal silanizada foi executada por um ou mais dos processos descritos abaixo.

Após as incubações respectivas, tal como detalhada baixo, as células foram recolhidas e lavadas uma vez com PBS. A sua capacidade para formar eritróides formadoras de colónias hematopoiéticas (CFU-E, BFU-E), granulócitos/macrófagos (CFU-6M) e colónias misturadas (CFU-GEMM) de acordo com processos conhecidos na técnica, e tal como está descritos nos exemplos 6 abaixo, foram filtrados no f im de cada método. Na execução destas experiências, os métodos 1, 3 e 5 são condições de controlo de incubação para os métodos 2 , 4 e 6, respectivamente. Método 1: uma alíquota contendo 107 - 108 células em 5 ml de lxD-PBS (isenta de CA++, MG++) foi adicionada a um tubo de centrifugadora em polipropileno de 15 ml. 0 número inicial de células foi anotado. As células foram incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente com uma mistura suave em 15 minutos de intervalo. Método 2: uma alíquota contendo 107 - 108 células em 5 ml de suspensão de gradiente de densidade OCS foi adicionada a um tubo de centrifugadora em polipropileno de 15 ml. O número inicial de células foi anotado. As células foram incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente com uma mistura suave em 15 minutos de intervalo. Método 3: uma alíquota contendo 107 - 108 células em 5 ml de lxD-PBS (isenta de CA++, MG++) foi adicionada a um tubo de centrifugadora em polipropileno de 15 ml. O número inicial de células foi anotado. As células foram incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente com uma mistura suave em 15 minutos de intervalo. A seguir à centrifugação, o sobrenadante foi descartado e a pastilha celular voltou a ser suspensa em 5 51 ml de um meio Iscove suplementado com 10% de vitelo-fetal. A mistura celular foi então incubada durante 24h à temperatura ambiente. Método 4: uma aliquota contendo 107 - 108 células em 5 ml de suspensão de gradiente de densidade OCS foi adicionada a um tubo de centrifugadora em polipropileno de 15 ml. O número inicial de células foi anotado. As células foram incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente com uma mistura suave em 15 minutos de intervalo. A seguir à centrifugação, o sobrenadante foi descartado e a pastilha celular voltou a ser suspensa em 5 ml de um meio Iscove suplementado com 10% de vitelo-fetal. A mistura celular foi então incubada durante 24h à temperatura ambiente. Método 5: uma aliquota contendo 107 - 108 células em 5 ml de lxD-PBS (isenta de CA++, MG++) suplementada com 10% de vitelo-fetal foi adicionada a um tubo de centrifugadora em polipropileno de 15 ml. O número inicial de células foi anotado. A mistura celular foi então incubada durante 24h à temperatura ambiente. Método 6: uma aliquota contendo 107 - 108 células em 5 ml de suspensão de gradiente de densidade OCS suplementada com 10% de vitelo-fetal foi adicionada a um tubo de centrifugadora em polipropileno de 15 ml. O número inicial de células foi anotado. A mistura celular foi então incubada durante 24h à temperatura ambiente.

Exemplo 5

Manchamento e quantificação de células CD34+ por FACS 52 A quantidade de células CD34+ foi determinada por citometria de fluxo (FACS - fluorescence activated cell sorting) após as células serem marcadas com um corante nuclear e mAbs dirigido a CD34 e CD45. A percentagem de células CD34 presentes foi determinada na porta de células nucleadas. Esta aproximação foi escolhida para evitar a interferência de material em partículas não nucleado com a precisão da análise de células CD34 na FACS.

Foi feita uma suspensão de 2xl07 células/ml usando D-PBS sem CA++ e MG++ como diluente. 50 ml desta suspensão celular contendo lxlO6 células foi adicionado a cada cavidade de uma placa de micro-titulação 96. 50 microlitros de uma solução a 20% de soro de coelho inactivado por calor/D-PBS e 10 microlitros de 10 pg/ml de LDS 751 (corante nuclear) numa solução D-DPS foram também adicionados a cada cavidade, seguido de mistura. A placa foi coberta com película e incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente. Para cada cavidade de controlo foram adicionados 10 microlitros de IgGI-DPE. Para cada cavidade de teste, foram adicionados 10 microlitros de anti-CD34-PE, seguido de mistura. A placa foi coberta com película e incubada durante 15 minutos a 4°C. A placa foi então centrifugada a 850 x g durante 5 minutos a 4°C. 0 sobrenadante foi então removido por agitação.

Cada pastilha de células voltou a ser suspensa em 200 μΐ de lxDPS (isenta de CA++ e MG++ 100) frios (4°C) . A placa foi então centrifugada a 850 x g durante 5 minutos a 4°C, e o sobrenadante resultante foi removido por agitação rápida da placa. Cada pastilha voltou a ser suspensa em 50 ml de uma solução a 20% de soro de coelho inactivado por calor. Anti-CD45-FITC (10 μΐ) foi adicionado a cada cavidade de controlo e de teste e misturado. A placa foi coberta com película e 53 incubada durante 30 minutos a 4°C. 100 μΐ de lxDPS (isentos de CA++ e MG++ 100) frios (4°C) foram então adicionados a todas as cavidades de controlo e de teste, e a placa foi centrifugada a 850 x g durante 5 minutos a 4°C. A placa foi agitada rapidamente para remover os sobrenadantes, e cada pastilha de células voltou a ser suspensa em 200 μΐ de lxDPS (isentos de CA++ e MG++ 100) frios (4°C). A placa foi centrifugada a 850 x g durante 5 minutos a 4°C, e então agitada rapidamente para remover o sobrenadante. Cada pastilha de células voltou a ser suspensa em 200 ml de paraformaldeído a 1% (4°C) . A placa foi então coberta com película e guardada a 4°C até análise FACS das amostras.

As análises FACS foram executadas em 104 eventos de fluxo usando um sistema FACSStar Plus, equipado com um programa de análise estatística LYSYS II (Becton Dickinson, Inc.). Para efeitos de análise, uma porta (Região 1) foi colocada em torno das células nucleadas determinadas por manchamento LDS 751 em FL3 para fazer separar os glóbulos vermelhos, plaquetas e detritos. FL1 e FL2 foram usados como um diagrama de pontos usando a Região 1. Uma porta (Região 2) foi colocada em torno da população celular que manchou com os anticorpos monoclonais anti-CD45 e anti-CD34. Para efeitos de análise, a percentagem de células que mancham com os anticorpos monoclonais anti-CD34 (FL2) e anti-CD45 (FLl) foi determinada na Região 2. Isto representa o número de células positivas CD34 como uma percentagem do número total de células nucleadas. O número total de células positivas CD34 foi determinado na amostra não processada e na fracção celular obtida da interface e da pastilha após processamento das amostras de PCPB na solução de gradiente de densidade. 54

Exemplo 6

Ensaio de formação de colónias (CFU)

As características funcionais das células CD34+ numa amostra celular foram determinadas pelo ensaio de formação de colónias (CFU). Este ensaio proporciona a quantificação do número de células progenitoras hematopoiéticas empenhadas na solução celular.

As células foram diluídas até uma concentração de 105 células em metilcelulose semi-sólida preparada comercialmente, contendo vários factores estimulantes de colónias e eritropoietina (meio H4433 MethoCult, Terry Fox Laboratories, Vancouver).

Após 14 dias de cultura a 37°C, as colónias eritróides (CFU-E, BFU-E), granulócitos / macrófagos (CFU-GM) e colónias misturadas (CFU-GEMM) foram contadas sob um microscópio invertido (40x) de acordo com métodos Standard. O número total de CFU presentes numa mistura celular foi definido por totalização dos tipos diferentes de colónias contadas.

Exemplo 7

Determinação da recuperação total de células A percentagem de recuperação de células foi determinada pela fórmula: % Recovery = 100 x

Nr. of cells after mantoulation Nr. of cells at stait 55 A percentagem de recuperação de células CD34 foi determinada pela fórmula: % Recovery = 100

Nr of ÇD34* cells after manipulation Number of CD34 cells at start A percentagem de recuperação de células clonogénicas foi determinada pela fórmula: % Recovery = 100 x

Nr. clonogenic cells (CFUI after manipulation Nr. of clonogenic cells (CF ll) at start

Exemplo 8

Efeito da radiação na recuperação de células hematopoiéticas O efeito das partículas de sílica coloidal organosilanizada na integridade das células hematopoiéticas foi testado, usando o protocolo descrito no exemplo 4 como "Métodos 3 e 4". As partículas OCS, partículas OCS suplementadas com 0,5% de PVP, ou PBS suplementadas com 0,5% de PVP (5 ml do volume total) foram sujeitas a radiação num tubo cónico de 50 ml de centrif ugadora por meio de uma dose de radiação gama (2,5 - 3,5 megaRad). Nestas experiências, a densidade da suspensão de partículas OCS usada foi 1,0605 g/ml, uma densidade que é inferior à das células a serem isoladas, para facilitar a subsequente peletização e quantificação de células presentes no tubo.

Uma alíquota contendo 3xl07 células PBPC, isoladas tal como está descrito no exemplo 1, foi adicionada a cada tubo, e o número inicial de células foi anotado. As células foram 56 incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente, com mistura suave em intervalos de 15 minutos. A mistura celular foi então centrifugada a 550 x g durante 10 minutos. A seguir à centrifugação, o sobrenadante foi descartado e a pastilha de células voltou a ser suspensa em 5 ml de um meio Iscove suplementado com 10% de soro de vitelo-fetal. A mistura celular foi então incubada durante 24 horas à temperatura ambiente e então testado no ensaio CFU descrito no exemplo 6. Os resultados desta experiência estão ilustrados na figura 1.

Exemplo 9

Conjunto de centrifugação esterilizado

Um conjunto de centrifugadora esterilizado foi preparado para separar células progenitoras hematopoiéticas CD34+ a partir de células mononucleares de sangue periférico (PBPC) tal como segue: uma suspensão de gradiente de densidade à base de partículas OCS foi preparada tal como está descrito no exemplo 1. Uma solução-mãe foi preparada misturando 12 partes da suspensão de partículas OCS com uma parte de fosfato salino tamponado (PBS) isento de cálcio e de magnésio e PVP concentrado (PVP-10; Sigma) para preparar um meio tendo uma densidade de 1,0605 ± 0,0005 g/ml, pH 7,4, uma osmolalidade de 280 mOsm/kg de H20, uma concentração de PVP a 4%. A densidade da solução de partículas OCS pode ser ajustada num densitómetro para definir com exactidão a sua precisão até pelo menos à quarta casa decimal. 15 ml desta suspensão foram adicionados a um tubo cónico de centrifugadora de 50 ml em polipropileno (Baxter) . O tubo foi selado com a tampa de rosca Standard fornecida com o tubo. 57 0 tubo e o seu conteúdo foram então expostas a radiação gama (2,5 - 3,5 megaRad) colocando-o numa câmara. 0 conjunto de centrifugação esterilizado resultante foi usado na separação de células CD34+ das PBPC, tal como está descrito no exemplo 4 aqui .

Exemplo 10

Enriquecimento de células CD34+ a partir de misturas celulares A. Preparação de gradientes de densidade A.l. Gradiente de densidade PERCOLL®

Uma solução PERCOLL® foi comprada na Pharmacia Biotech (Uppsala, Suécia) e armazenada a 4°C de acordo com a recomendação do vendedor. Uma solução-mãe foi preparada misturando 12 partes de PERCOLL com 1 parte de parte de fosfato salino tamponado (PBS) isento de cálcio e de 10 x (PBS) . 0 pH da solução foi ajustado para os 7,4 e a osmolalidade para 280 mOsm/kg de H20. Para utilização na separação de células CD34+ numa mistura celular, a solução-mãe foi ainda diluída com PBS sem cálcio e magnésio para uma densidade de 1,0605 ± 0,0005 g/ml, e usada à temperatura ambiente. Foi crucial ajustar a densidade do gradiente para uma precisão compreendida em ± 0,0005 g/ml de 1,0605 g/ml para garantir a reprodutibilidade e precisão da separação celular. Isto foi feito com um densitómetro digital de elevada precisão tal como o DMA48 (Anton PAAR USA, Ashland, VA) . Todos os procedimentos foram executados sob condições esterilizadas e à temperatura ambiente. 58 A. 2. Gradiente de densidade de sílica coloidal organosilanizada (OCS)

Uma suspensão de partículas OCS é uma suspensão de partículas de sílica coloidal organosilanizada preparada tal como está descrito por Dorn (patente US 4,927,749). As partículas OCS, com uma dimensão compreendida entre 3-22 nm, e particularmente entre 13 - 18 nm, formam uma suspensão estável que actua como um meio de gradiente de densidade para separar misturas heterogéneas de células com base na densidade de flutuação. A menos que esteja indicado de outra forma, a suspensão de partículas OCS foi preparada numa solução salina fisiológica para ter uma densidade de 1,0605 g/ml e uma osmolalidade de 280 mOsm/kg de H20 tal como está definido para o enriquecimento de células CD34+ de amostras de PBSC. Ά suspensão foi produzida sob condições GMP e esterilizada por radiação gama na presença de pelo menos 0,05% de polivinilpirrolidona (PVP-10; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) . O PVP foi adicionado como um pó seco a uma suspensão de partículas OCS pré-ajustadas aproximadamente para a densidade específica desejada final. As concentrações PVP de pelo menos 0,05% e até 10% são preferidas para utilização nos métodos, dispositivo e conjunto do invento. B.Centrifugação de gradiente de densidade de camadas leucocitárias do sangue e de medula óssea O sangue periférico separado (aférese) foi aplicado directamente no gradiente de densidade. No entanto, a menos que esteja indicado de outra forma, os aspirados do sangue completo 59 e da medula óssea foram processados para uma camada leucocitária (remoção de glóbulos vermelhos), de acordo com métodos Standard, antes de serem aplicados no gradiente de densidade.

As amostras de sangue separado (aférese) foram depostas em camadas num gradiente PERCOLL® ajustado previamente para uma densidade de 1,0605 ± 0,0005 g/ml, uma osmolalidade de 280 mOsm/kg de H20, e um pH de 7,4 num tubo armadilha cónico de 50 ml ou num tubo disponível comercialmente. O tubo armadilha continha numa constrição num local para que aproximadamente 15 ml de PERCOLL® estivesse no compartimento inferior e 5 ml de PERCOLL® por cima da constrição. Era crítico encher completamente o volume sob a constrição com PERCOLL® para evitar a formação de bolhas de ar. Normalmente, 20 ml de amostras de sangue separado (aférese) são depostos em camadas por cima deste gradiente. O tubo foi centrifugado a 850 x g durante 30 minutos à temperatura ambiente. As células alojadas na interface do gradiente, isto é, por cima do PERCOLL®, foram recolhidas, despejando todo o conteúdo do compartimento superior do tubo noutro tubo de 50 ml. Evitou-se o vazamento da pastilha de células na zona por baixo da constrição quando o tubo foi invertido.

Para comparar o método de separação celular descrito no parágrafo precedente com métodos de separação convencionais, as amostras teste foram também depostas em camadas num Ficoll-Hypaque (Pharmacia). A densidade da solução-mãe FICOLL era de 1,077 ± 0,01 g/ml e a osmolalidade a 320 mOsm/kg de H20, tal como está publicado pelo vendedor.

As células da medula óssea foram preparadas tal como está descrito no exemplo 2. 60 C. Classificaçao de células com ajuste de densidade (DACS) C.l. Preparação de partículas portadoras

Microesferas de Sílica (1,4 micrómetros) obtidos na Bangs Laboratories, Carmel, IN, foram lavados com HC1 concentrado durante 2 horas à temperatura ambiente e sujeitos intensamente a vórtex a cada 15 minutos para partir a aglutinação. Após lavagem, as microesferas foram centrifugadas a 850 g durante 5 minutos. O HC1 contendo o sobrenadante foi decantado e as microesferas foram lavadas com H20 desionizada sujeitas a vórtex intenso para partir a aglutinação.

As microesferas foram incubadas à temperatura ambiente durante a noite em ácido nítrico concentrado com agitação constante, usando um agitador magnético. As microesferas foram então centrifugadas a 850 g durante 5 minutos e lavados 3 vezes com água desionizada, usando 50 ml de H20 desionizada a cada passo. As microesferas foram sujeitas a vórtex intenso entre lavagens para evitar a aglutinação de microesferas. Para prevenir a contaminação microbacteriana, as microesferas foram guardadas a 0-4°C em H20 desionizada até posterior utilização.

Para silanizar as microesferas, foram usados quer 3-aminopropiltrietoxisilano, (3-iodopropil)trimetoxisilano ou [1-9trimetoxosilil)-2(m-(ou p)clorometi1)fenil]etano. 40 ml de solução de silano (uma solução a 10% em etanol em 95% de etanol/água desionizada) foram adicionados por cada 4 g de microesferas. A mistura de microesferas foi rodada verticalmente durante 1 hora à temperatura ambiente. As microesferas foram centrifugadas a 850 g durante 5 minutos e o silano em excesso foi removido por lavagem usando etanol a 95%/ H20 desionizada num volume de 100 ml. As microesferas foram 61 sujeitas a vórtex intenso entre cada passo de lavagem para evitar a aglutinação de microesferas. Após o passo de lavagem, as microesferas podem ser secas e guardadas. Em alternativa, as microesferas podem ser guardadas em etanol a 95%/ H2O desionizada no frio, o que evita a aglutinação das microesferas.

As microesferas silanizadas foram incubadas durante a noite em glutaraldeido a 2,5% à temperatura ambiente. No dia seguinte, as microesferas foram centrifugadas a 850 g durante 5 minuto e o glutaraldeido livre foi removido por lavagem com H2O desionizada num volume de 100 ml por 5 g de microesferas. As microesferas foram sujeitas a vórtex intenso entre cada passo de lavagem para evitar a aglutinação de microesferas. O anticorpo foi adicionado às microesferas de aminopropil em excesso, pelo menos 3 mg/m2 da superfície total da microesfera e rodado verticalmente durante a noite, à temperatura ambiente. No dia seguinte, as microesferas foram centrifugadas a 850 g durante 5 minutos e a proteína livre foi removida por lavagem com 100 ml de H20 desionizada. As microesferas foram sujeitas a vórtex intenso entre cada passo de lavagem para evitar aglutinação de microesferas. As microesferas foram guardadas em H20 desionizada contendo 0,1% de azida de sódio no frio. A suspensão final de microesferas deveria conter 70 - 90% de microesferas únicas e 10 - 30% de microesferas predominantemente duplas e triplas. A eficiência de ligação das microesferas conjugadas com o anticorpo (em termos da percentagem de microesferas que são revestidas) pode ser determinada usando análise citométrica de fluxo e um anticorpo fluorosceinado dirigido para o anticorpo acoplado. Em alternativa, o anticorpo pode ser adicionado 62 directamente às microesferas silanizadas sem a ligação e glutaraldeído. C.2. Microesferas revestidas com anti-CD45 O produto de sangue separado (aférese) foi incubado com microesferas de 1,4μ em vidro aminopropil (Bangs Laboratories Inc., Carmel, IN) que foram revestidas com glutaraldeído com um anticorpo anti-CD45 (Clone ALB-12, Biodesign International, Kennebunk, ME) durante 45 minutos à temperatura ambiente. A mistura das células do sangue completo foi deposta em camadas em OCS + 0,5% Pip (1,0605 ± 0,0005 g/ml, 280 mOsm/kg de H20, pH 7,4) num tubo de 50 ml. C.3. Microesferas revestidas com cabra anti-IgG de rato

As células da amostra PBSC foram contadas por exclusão de azul de tripano, lavadas e voltadas a suspender em PBS suplementado com albumina de soro bovino a 0,1% (BSA) numa concentração de 107 células/ml. mAbs de anti-CD3, CD4 e CD8 foram adicionadas para dar uma concentração final de 3-10 kg/ml. As células foram incubadas durante 30 minutos em gelo e então centrifugadas. A pastilha de células voltou a ser suspensa em BSA a 0,1% em PBS com uma concentração celular de 107 células/ml. Microesferas DACS revestidas com cabra anti-IgG de rato (GAM-IGG) foram contadas e adicionadas às células para dar relações de microesfera:células entre 4:1 e 8:1. As microesferas e células foram incubadas durante 15 minutos. Durante a incubação, a mistura de células:microesferas voltou a ser suspensa suavemente a cada 5 minutos. A mistura célula:microesfera foi então deposta em camadas na suspensão de 63 gradiente de densidade OCS e centrifugada à temperatura ambiente a 850 x g durante 30 minutos. As células da interface foram colhidas decantando o tubo de centrifugação, contadas e preparadas para análise FACS. Para examinar a deplecção não especifica, foi usado um procedimento semelhante, mas a incubação com os anticorpos monoclonais foi omitida.

As experiências para examinar a eficácia da DACS para a depuração de linfócitos T foram executadas usando preparações PBSC mobilizadas e mAbs anti-CD3, CD4 e CD8. O rendimento dos linfócitos T foi monitorizado usando um mAb anti-CD2 para evitar artefactos associados com mAbs reconhecendo os mesmos epitopos nos antigénios de diferenciação. D. Conjugação de moléculas de fixação de células a partículas portadoras D.l. Anticorpos monoclonais

Os anticorpos monoclonais anti-CD34 conjugados com ficoeritrina (PE-CD34) (marcador de célula progenitora hematopoiética) e anticorpos monoclonais anti-45 conjugados com isoticianato de fluoresceína (FITC-CD45) (marcador pan- leucócito) foram obtidos na Becton, Dickinson, Inc., San Jose, CA) . Os anticorpos não conjugados dirigidos para CD45, CD16 (granulócitos, monócitos), CD3 (linfócitos T), CD14 (monócitos) foram preparados em laboratório, de acordo com métodos bem conhecidos na técnica.

Os mAbs anti-CD3 (clone Leu4), CD4 e CD8 foram obtidos no Dr. E. E. Engleman da Stanford University Hospital Blood Bank. Para além disso, o FITC-CD2, PE-CD34 e FITC-CD45 foram adquiridos no mesmo vendedor. 64

Os anticorpos foram conjugados, quer para microesferas magnéticas revestidas com cabra anti-rato, quer microesferas de vidro aminopropil revestidas com cabra anti-rato através de incubação durante a noite à temperatura ambiente. Em alternativa, os anticorpos poderiam ser ligados directamente a essas microesferas sem a ponte cabra anti-rato, ou poderiam ser ligados através de uma reacção de acoplamento avidina-biotina. Para além disso, os anticorpos poderiam ser clivados em fragmentos Fab2 para reduzir a ligação não especifica de células às microesferas através da sua porção Fc. D. 2. Cabra anti-IgG de rato (GAM-IGG) 0 rato IgGI conjugado, quer com FITC quer com PE foram adquiridos na Becton Dickinson (San Jose, CA) e usado como controlo do isótopo. Vários procedimentos diferentes foram usados para preparar microesferas DACS revestidas com cabra anti-IgG de rato (GAM-IgG) (Biodesign International). 0 objectivo consistiu em maximizar a deplecção específico e minimizar a deplecção não especifico durante o DACS. As microesferas DACS foram revestidas de forma covalente, quer com GAM-IgG ou F(ab)2 GAM-IgG (East Coast Biologicals) numa orientação aleatória ou GAM-IgG numa orientação especifica para maximizar a disponibilidade dos sítios de ligação Ig para fixação ao antigénio. Para além disso, algumas preparações de microesferas foram revestidas com polietilenoglicol (PEG) (Shearwater) para reduzir a afinidade não específica das microesferas para a proteína ou células. As diferentes fórmulas químicas estão definidas abaixo. GAM-IgG ou F(ab>2 GAM-IgG aleatório 65

As microesferas de sílica foram revestidas com aminopropiltrietoxisilano (Sigma) que tinha grupos -NH2 disponíveis para serem conjugados com o -CHO do glutaraldeído (Sigma). De acordo com a fórmula química utilizada, o glutaraldeído forma então uma ponte e liga-se ao grupo -NH2 em lisinas ao longo das moléculas GAM-IgG ou F(ab)2 GAM-IgG, quando o anticorpo e o glutaraldeído foram adicionados à preparação. A orientação da moléculas de proteína relativamente à microesfera foi considerada aleatória, com base no facto de qualquer lisina com um cadeia lateral de -NH2 conjugar-se potencialmente com o -CHO do glutaraldeído. Isto dá uma cadeia ATES-GLUT-IgG com o GAM-IgG ou F(ab)2 numa orientação aleatória. GAM-IgG numa orientação especifica

As microesferas de sílica foram revestidas com aminopropiltrietoxisilano tendo grupos -NH2 disponíveis para serem conjugados com o grupo -CHO do hidrato de carbono na região glicosilada da porção FC da molécula GAM-IgG. A molécula GAM-IgG só é glicosilada na porção Fc, para que a ligação GAM-IgG à superfície da microesfera ao longo desta região tenha o efeito de orientar a molécula IgG com a porção Fc próximo da superfície da microesfera e dos locais de ligação IgG afastados da superfície. Este tratamento aumenta teoricamente o número de sítios de ligação disponíveis para ligar antigénios e diminui a disponibilidade da porção FC para ligar receptores Fc. Isto proporciona uma cadeia ATES-CHO-IgG com o IgG numa orientação específica. 66 GAM-IGG aleatório PEG-aldeido

As microesferas de sílica foram revestidas com aminopropiltrietoxisilano que tem grupos -NH2 disponíveis para serem conjugados com um grupo -CHO de uma molécula aldeído-PEG-aldeído em que o PEG está ensanduichado entre dois resíduos de aldeído. 0 GAM-IgG liga-se então ao outro resíduo -CHO para dar uma cadeia ATES-CHO-PEG-CHO-IgG com o IGG numa orientação aleatória. E. Análises 0 manchamento do anticorpo, a análise FACS e ensaios CF foram executados tal como está descrito nos exemplos 5 e 6. F. Ensaio de célula iniciadora de cultura de longo prazo (LTC-IC) / determinação funcional de células CD34+ não cometidas 0 número de células hematopoiéticas progenitoras não cometidas numa mistura celular foi determinada pela cultura de iniciação de longo prazo. As células foram semeadas numa camada de alimentação de estroma sujeito a radiação e foi feita uma determinação de CFU em função do tempo. As células estaminais hematopoiéticas puderam autorenovar-se e dar origem a CFUs neste sistema, durante um período que excedeu as 5 semanas. As culturas de longo prazo do estroma da medula óssea foram iniciadas em 96 placas de cavidade (106 células em 200 μΐ/poço) num meio α-MEM suplementado com 12,5% de soro de cavalo, 12,5% de soro de vitelo-fetal, 2 mM de 1-glutamina, 0,2 mM de i-inositol, 20 μΜ de ácido fólico, 10”4 M de 2-mercaptoetanol e foram mantidas a 33°C numa atmosfera humidificada. Em 67 intervalos de 1 semana, metade do meio foi removido e substituído por um volume igual de meio fresco. Depois de duas semanas de cultura, as camadas confluentes de estroma foram sujeitas a radiação gama (2000 rad) para matar células hematopoiéticas endógenas. Amostras não fraccionadas e preparações celulares após separação foram semeadas nas camadas sujeitas a radiação do estroma no mesmo meio suplementadas, com 10-6 M de hidro-cortisona. Após 5 semanas de cultura, as células aderentes e não aderentes foram recolhidas e filtradas no ensaio CFU, tal como na parte G, acima. G. Ensaio de células exterminadoras naturais (NK)

As células alvo K562 foram marcadas com 100 pCi51Cr durante 1 hora a 37°C, e então lavadas 4 vezes e contadas. As células alvo foram co-cultivadas durante 4 horas em placas multi-cavidade de uma cavidade 96 com fundo em V com sangue separado (aférese) não fraccionado e células de diferentes fracções após separação celular. 0 efector e células alvo foram misturados em relações diferentes 100:1, 50:1, 25:1 e 12:1. Por exemplo, a relação 100:1 continha 5xl05 células e 5xl03 células-alvo. Após o período de incubação, 100 μΐ do sobrenadante foram recolhidos e contados num contador de cintilação. A libertação máxima e espontânea de 51CR foi medida contando quer os 50 μΐ da solução-mãe alvo e sobrenadante dos efectores por si próprios, respectivamente. A citotixicidade em percentagem foi determinada de acordo com a fórmula:

Percent Cvtotoxicitv = com experiment - com spontaneous release_ 3 3 cpm maximai release - cpm spontaneous release 68 J. Cultura mista de linfócitos e actividade de células supressoras naturais

As células de duas camadas leucocitárias diferentes foram misturados numa placa multi-cavidade com fundo liso 96 com 105 células cada. Uma das camadas leucocitárias recebeu 3000 rad e foi referida como os "estimuladores". A outra camada leucocitária foi usado não tratada e referida como

"respondedores". Os produtos de sangue periférico separado (aférese) não fraccionado (APBL) ou células de fracções com densidade diferente foram adicionadas a estas co-culturas com 105 células por poço. Estas células são referidas como as "supressoras" e receberam 1500 rad antes de serem adicionadas ao MLR. As células estiveram em cultura durante 5 dias e então pulsadas com [H]-timidina (1 pCi por cavidade). 18 horas depois, as células foram colhidas e a quantidade de timidina incorporada determinada num contador de cintilação. A supressão, em percentagem, induzida pelas células supressoras foi determinada pela fórmula:

Percent Suppression com control - com exoeciment cpm experiment

Exemplo 11

Depurar células tumorais do sangue periférico A linha celular SU-DHL4 do linfoma humano da célula B (Stanford University Blood Bank, Stanford, Califórnia) foi usado como um modelo experimental Standard para modelar contaminação de células tumorais do sangue periférico. Esta 69 linha celular tem uma translocação recíproca entre os braços compridos dos cromossomas humanos 14 e 18, resultando numa justaposição do proto-oncogene bcl-2 na zona contígua do gene da cadeia pesada da imunoglobulina (Ig). Esta translocação, que leva a níveis elevados do produto do gene bcl-2, é encontrado em 85% de linfomas foliculares de células pequenas clivadas e 25% de linfomas difusos de células grandes. 0 ponto de ruptura da translocação no gene bcl-2 está localizado, quer na major breakpoint region (MBR) espalhando-se aproximadamente 150 bp na zona na traduzida 3' (UTR) do gene bcl-2 ou na minor cluster region (MCR) de 500 bp localizada aproximadamente 20 kb a jusante do gene bcl-2. Usando pares de iniciadores específicos da translocação e PCR quantitativo limitando as técnica de análise por diluição conhecidas na técnica, a deplecção de células SU-DHL4 nas experiência de depuração de DACS pode ser monitorizada. A linha celular do adenocarcinoma humano SK-BR3 (American Type Culture Collection (ATTC), Rockville, MD) foi usada para modelar a infiltração de células do cancro da mama do sangue periférico. Estas células reagem com o anticorpo monoclonal anti-humano de rato HR2/Neu, indicando que possuem o antigénio Her2/Neu. Antes de serem transformadas em camadas leucocitárias normais, as células SK-BR3 foram pré-carregadas com calceína AM, um substrato fluorogénico, para poderem ser enumeradas por análise de citometria de fluxo (FACS - fluorescence activated cell sorting) . Em alternativa, ou para além disso, as células do tumor mamário contêm receptores de estrogénio e reagem com anticorpos a estes receptores e outras moléculas de ligação do receptor tal como o estrogénio e agonistas do estrogénio. Para efeitos do presente invento, estas células podem ser capturadas, tal como nos métodos de depuração de células 70 tumorais aqui descritos, por qualquer molécula que se ligue com afinidade suficiente para um tal antigénio da célula tumoral incluindo, mas não estando limitado, a anticorpos, estrogénio ou agonistas do estrogénio. Neste contexto, uma afinidade de ligação suficiente é uma afinidade aproximadamente igual a ou compreendida dentro de 2 log unidades de afinidade de ligação do anticorpo monoclonal anti-humano do rato Her2/Neu (HB 8694, 520C9; ATTC Rockville, MD).

Análise PC

Um DNA genómico com elevado peso molecular foi criado usando o QIAmp Blood Kit (Qiagen, Chatsworth, Ca.) e quantificado por densidade óptica a 260 nm. Foram feitas reacções PCR usando um termociclador modelo 9600 da Perkin-Elmer, durante 35 ciclos. Cada ciclo de amplificação consistiu em 94°C (15"), 55° (60") e 72°C (15"), com uma extensão de 72°C (6 minutos) após o ciclo final. Para reacções com iniciadores internos, foi usado 1 ml da reacção da primeira volta como modelo. Foram usados os seguintes oligonucleótidos para análise de amostras: (i) 5-CAGCCTTGAAACATr-GATGG-3 (MBR) (ii) 5- ACCTGAGGAGACG-GTGACC-3 (JH Consensus) (iii) 5-ATGCTGT-GGTTGATATTTCG-3 (MBR) (iv) 5-ACCTGAGGAGACGGTGACC-3 (JH Consensus s) . Os produtos de amplificação foram visualizados por electroforese em gel de agarose.

Análise FACS

As células SK-BR3 foram pré-carregadas incubando-as em calceína AM e então semeadas em células mononucleares normais de sangue periférico com uma frequência final de 2%. O DACS foi 71 executado tal como está descrito abaixo, usando o anticorpo monoclonal anti-humano de rato HR2/Neu. As alíquotas das amostras experimentais foram analisadas por análise FACS usando o programa LYSYS II. Para análise foram recolhidos 100000 eventos para cada amostra.

Classificação de células com ajuste de densidade (DACS)

As células progenitoras do sangue periférico (PBPC) e camadas leucocitárias foram obtidas no Bone Marrow

Transplantation Laboratory, Paio Alto, CA, na Stanford University Blood Bank, Paio Alto, CA. Os anticorpos monoclonais para CD9, CD10; CD19 e CD20 foram obtidos no Caltag Laboratories (So. San Francisco, CA). O mAb anti-CD-20 (clone IF5) e o mAb anti-humano Her2/Neu (HB 8694, 520C9) e a linha celular do adenocarcinoma SK-BR3 foram obtidos no ATCC (Rockville, MD). O rato IgGl e o rato anti-humano CD45 conjugado com isoticianato de fluoresceína (FITC), assim como os anticorpos do rato IgGl e rato anti-humano CD34 conjugados com ficoeritrina (PE foram obtidos na Becton Dickinson (San Jose, CA) . O procedimento FACS e análise citométrica de fluxo de amostras foram executados tal como está descrito acima.

Depuração e análise electroforética de células do sangue periférico

Uma camada leucocitária de sangue periférico, spiked (5%) com o t(14:18) + linha celular SUDHL-4 do linfoma da células B foi incubada com um cocktail mAb de células anti-B para as células CD9, CD10, CD19 e CD20. Após lavagem, a mistura celular foi incubada com microesferas DACS revestidas com GAM-gGG numa 72 relação de 8:1 microesferas:células e então carregada numa suspensão OCS com densidades compreendidas entre 1,0605 a 1,0720 com resultados comparáveis. A seguir à centrifugação durante 30 minutos a 850 g, o DNA foi preparado a partir das células na interface e analisado através de métodos Standard electroforéticos em gel com diferentes concentrações (1 mg, 0,1 mg, 0,01 mg, 0,001 mg) durante 2 voltas de PCR usando T (14; 18) usando iniciadores específicos. O número de translocações t(14:18) foi ainda determinado limitando a diluição PCR. Como controlo, foi usado o mesmo protocolo em células não spiked, amostra spiked SUDHL-4 e amostra spiked SUDHL-4 tratada com microesferas DACS sem incubação prévia com o cocktail mAbs de células anti-B. A centrifugação da mistura celular sobre a suspensão OCS não resultou numa redução do sinal PCR. Enquanto as microesferas DACS por si só induziram uma pequena redução do sinal PCR, o sinal PCR estava completamente ausente na amostra spiked SUDHL-4, que foi tratada, quer com o cocktail mAb de células anti-B, quer com microesferas DACS. A determinação do número translocações t(14; 18) através da limitação da diluição PCR, mostrou que no último grupo experimental o número de células SUDHL-4 foi reduzido em 2-3 logs (100 - 1000).

Experiências preliminares indicam que uma volta adicional de DACS neste contexto diminui ainda mais o números de células SUDHL-4 em aproximadamente um log adicional.

Exemplo 12

Isolamento de células dendríticas 73

As camadas leucocitárias preparadas a partir de uma unidade de sangue de dadores voluntários saudáveis positivos HLA-A02 01 foram obtidas na Stanford University Blood Center (Stanford, CA). As células foram colhidas dos leukopacs, diluídos para 60 ml usando fosfato salino tamponado isento de CA++/MG++ (D-PBS; Gibco Laboratories, Grand Island, NY) e depostas em camada sobre duas colunas de 15 ml de meio de separação OCS (densidade 1,0720 g/ml, pH 7,4, 280 mOsm/kg de H20), em tubos de centrifugadora de 50 ml, de preferência tubos armadilha. Os tubos são centrifugados em 1000 x g durante 35 minutos à temperatura ambiente. O lote de centrifugação é deixado parar sem travagem e as células mononucleares do sangue periférico (PBMC), presentes na interface, são colhidas.

As PBMC são suspensas de novo em D-BPS, centrifugados uma vez a 650 x g durante 10 minutos e duas vezes mais a 200 x g durante 5 minutos para remover as plaquetas. As PBMC sem plaquetas são suspensas de novo em 60 ml de D-PBS, colocadas por cima de duas colunas de 15 ml de OCS (densidade 1,0610 g/ml, 280 mOsm/kg de H20) num tubo armadilha do presente invento e centrifugadas a 650 x g durante 25 minutos a 4°C, sem travagem. A interface resultante (principalmente monócitos) e pastilhas de células (principalmente linfócitos) são colhidas e lavadas com D-PBS por centrifugação à temperatura ambiente (uma vez a 650 x g durante 10 minutos e duas vezes seguidamente a 200 x g durante 5 minutos).

Nas situações em que são usadas células dendríticas para gerar linfócitos T citotóxicos específicos de péptido (CTL) para efeitos de elucidar a sua função de apresentação do antigenio, a fracção de interface (maioritariamente monócitos) é suspensa de novo num soro AB humano frio (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) ao qual um volume igual de 80% de soro AB e 20% 74 dimetil sulfóxido (DMSO) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) é adicionado gota a gota. A suspensão celular resultante é aliquotada em crioviais e congelada em azoto líquido. Os monócitos podem ser usados para um novo estímulo de CTL para expansão. A fracção peletizada é suspensa de novo em 100 ml de um AB Culture Médium, inoculado em frascos de cultura de tecido T7-5 e colocada em cultura num incubador humidificado com 5% de CO2, durante 40 horas. A seguir à incubação, as células não aderente são colhidas moderadamente com uma pipeta, lavadas e suspensas de novo numa concentração de 2 - 5 x 106 células/ml num meio de cultura AB. A suspensão celular é posta por cima de quatro colunas de um meio de separação OCS 4,0 ml (densidade 1,0565 g/ml, pH 7, 4, 280 mOsm/kg de H20) , num meio de cultura AB e centrifugado a 650 xá g durante 20 minutos à temperatura ambiente, sem travagem. A interface e células peletizadas são recolhidas e lavadas num AB Culture Médium (meio Basal RPMI-1640, Gibco Laboratories, Grand Island, NY) por centrifugação uma vez a 650 x g durante 10 minutos e duas vezes seguidamente a 200 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente. O rendimento e viabilidade de ambas as fracções celulares é estimada por contagem num hemocitómetro usando exclusão do azul de tripano. A pureza das células dendríticas na fracção de interface é quantificada a seguir à análise num citómetro de fluxo (FACS). As células dendríticas são caracterizadas como negativas para marcadores do fenótipo celular CD3 (linfócitos T) , CD14 (monócitos), CD16 (células NK) e CD20 (células B) e positivo para expressão HLA classe II usando manchamento duplo com HLA-DR (no canal FTTC) e um cocktail de CD3, CD14, CD16, CD20 (no 75

canal PE) . 0 manchamento duplo com IgG2a nos canais FITC e PE pode ser usados como controlo do isótipo. A morfologia das células também pode ser avaliada usando fotomicroscopia. A fracção DC enriquecida contém células grandes veladas com processos citoplásmicos estendendo-se da superfície da célula, características das DC.

Lisboa, 20 de Dezembro de 2011. 76

Claims (26)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composição para uma utilização na separação celular, compreendendo um meio de separação celular à base de partículas de sílica coloidal silanizada contendo pelo menos cerca de 0,05% de polilactama, em que o dito meio de separação contendo a dita polilactama é esterilizado.
2. 2. Composição de acordo com a reivindicação 1, na qual o dito meio de separação celular à base de partículas de sílica coloidal é constituído por partículas de sílica organosilanizada.
3. 3. Composição de acordo com as reivindicações 1 ou 2, na qual a dita composição é esterilizada por autoclavagem ou por radiação ionizante.
4. 4. Composição de acordo com a reivindicação 3, na qual a dita radiação ionizante é escolhida de entre os raios gama e uma radiação de feixe de electrões.
5. 5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, na qual a dita polilactama é a polivinilpirrolidona presente numa concentração situada entre cerca de 0,1 e cerca de 10%.
6. 6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, na qual a dita partícula é uma microesfera tendo um diâmetro entre cerca de 0,003 e 50 micrómetros. 1
7. 7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, para utilização no isolamento de uma célula sanguínea rara escolhida de uma mistura celular, na qual a dita suspensão de partículas de sílica coloidal silanizada tem uma densidade específica de cerca de ±0,0005 g/ml da dita célula escolhida.
8. 8. Composição de acordo com a reivindicação 7, na qual a célula sanguínea rara é escolhida de entre o grupo consistindo em células progenitoras hematopoiéticas CD34+, células dendríticas, células exterminadoras naturais, células supressoras naturais, células T citotóxicas, células tumorais e células nucleadas de origem fetal.
9. 9. Composição de acordo com a reivindicação 8, na qual a dita célula sanguínea rara é uma célula progenitora hematopoiética CD34+, a dita mistura celular compreende células mononucleares do sangue periférico, e a dita suspensão de partículas de sílica coloidal organosilanizada tem uma densidade específica de 1,0605 g/ml.
10. 10. Composição de acordo com a reivindicação 8, na qual a dita célula sanguínea rara é uma célula progenitora hematopoiética CD34+, a dita mistura celular consiste em células de medula óssea, e a dita suspensão de partículas de sílica coloidal organosilanizada tem uma densidade específica de 1,0605 g/ml.
11. 11. Composição de acordo com a reivindicação 8, na qual a dita célula sanguínea rara é uma célula dendrítica, a dita 2 mistura celular compreende células mononucleares do sangue periférico, e a dita suspensão de partículas de sílica coloidal organosilanizada tem uma densidade específica escolhida de entre o grupo consistindo em 1,0770 g/ml, 1,0720 g/ml, 1,0650 g/ml, 1,0610 g/ml e 1,0565 g/ml.
12. 12. Conjunto de separação celular, compreendendo um recipiente que pode ser centrifugado e uma suspensão de separação celular à base de partículas de sílica coloidal silanizada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11.
13. 13. Processo de esterilização de um meio de separação celular à base de partículas de sílica silanizada, compreendendo a submissão do dito meio de separação a uma autoclavagem ou a radiação ionizante na presença de pelo menos 0,05% de peso de polilactama.
14. 14. Processo de acordo com a reivindicação 13, no qual a dita polilactama é polivinilpirrolidona presente numa concentração situada entre cerca de 0,1 e cerca de 10%.
15. 15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 ou 14, no qual a dita partícula de sílica é uma partícula de sílica coloidal organosilanizada.
16. 16. Processo de isolamento de uma célula sanguínea rara escolhida a partir de uma mistura celular, compreendendo: a deposição em camadas da mistura contendo a dita célula hematopoiética rara no meio de separação celular à base de partículas de sílica coloidal 3 silanizada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e a centrifugação da dita mistura com uma força centrífuga suficiente para peletização das células tendo uma densidade específica que é superior à densidade específica da célula escolhida.
17. 17. Processo de acordo com a reivindicação 16, no qual a dita mistura contendo a dita célula rara e o dito meio de separação celular está contida num tubo de centrifugação tendo paredes laterais e um fundo fechada, um elemento de constrição disposto no interior do tubo, o dito elemento de constrição colocado e construído para reter o líquido na parte inferior do tubo por debaixo do elemento de constrição, quando o tubo é invertido, e no qual o dito meio de separação celular tem uma densidade específica que está dentro de ±0,0005 g/ml da densidade específica do tipo de célula escolhida e o dito meio está contido na parte inferior do tubo e estende-se por cima do dito elemento de constrição até um nível por cima de uma abertura formada pelo dito elemento de constrição, de forma a que as células que são capturadas ao nível de uma interface entre o meio de separação celular e o meio de densidade inferior, após centrifugação, sejam descarregadas com o meio de densidade inferior quando o tubo é invertido. 4
18. 18. Processo de acordo com a reivindicação 17, no qual o dito tubo compreende uma topo fechado, uma primeira porta no dito topo através do qual o material líquido pode ser introduzido no tubo, uma segunda porta no dito topo, e um canal de líquido fechado estabelecendo a comunicação entre a segunda porta e o fundo do tubo por baixo do dito elemento de constrição.
19. 19. Processo de acordo com a reivindicação 16, no qual a célula rara escolhida é uma célula progenitora hematopoiética funcional, a mistura celular é uma mistura de células mononucleares do sangue periférico, e a densidade específica da suspensão em gradiente de densidade de separação celular é de 1,0605 g/ml.
20. 20. Processo de acordo com a reivindicação 16, no qual a célula rara escolhida é uma célula progenitora hematopoiética funcional, a mistura celular é uma mistura celular da medula óssea, e a densidade específica da suspensão em gradiente de densidade de separação celular é de 1,0685 g/ml.
21. 21. Processo de acordo com a reivindicação 16, no qual a célula sanguínea rara escolhida é uma célula tumoral, a mistura celular é derivada do sangue ou da medula óssea, e no qual o meio de separação celular tem uma densidade específica escolhida no intervalo de 1,0490 a 1,0580 g/ml.
22. 22. Processo de acordo com a reivindicação 16, no qual a célula sanguínea rara escolhida é uma célula dendrítica e no qual o dito meio de separação celular tem uma densidade 5 específica escolhida no grupo consistindo em 1,0770 g/ml, 1.0720 g/ml, 1,0650 g/ml, 1,0610 g/ml e 1,0565 g/ml.
23. 23. Processo de acordo com a reivindicação 16, no qual a célula sanguínea rara escolhida é um linfócito T citotóxico e no qual o dito meio de separação celular tem uma densidade especifica escolhida no grupo consistindo em 1.0720 g/ml, 1,0610 g/ml e 1,0565 g/ml.
24. 24. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 23, que compreende ainda a adição à mistura celular de uma suspensão que compreende uma partícula de sílica silanizada à qual é fixa uma molécula de ligação específica de um antigénio celular.
25. 25. Processo de acordo com a reivindicação 24, para uma utilização na deplecção dos linfócitos T, no qual a dita molécula de ligação específica de um antigénio celular se liga a um antigénio presente nos ditos linfócitos T.
26. 26. Processo de acordo com a reivindicação 25, no qual a dita molécula de ligação específica de um antigénio celular é escolhida de entre o grupo consistindo em anticorpos monoclonais de rato anti-CD3, anti-CD4 e anti-CD8. Lisboa, 20 de Dezembro de 2011. 6