PT91512B

PT91512B - Processo para a estabilizacao de somatotropinas por modificacao e residuos cisteina utilizando mutagenese dirigida ou derivatizacao quimica

Info

Publication number: PT91512B
Application number: PT91512A
Authority: PT
Inventors: Brian Lee Buckwalter; Susan Mancini Cady; John Steele; Gerald W Stockton; Deborah Tardy Chaleff
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1988-08-24
Filing date: 1989-08-22
Publication date: 1995-05-31
Also published as: AU4020289A; HUT51331A; EP0355460A2; HU217095B; NO893387D0; YU163289A; DE68929273D1; EP0355460B1; JPH034797A; IE892706A1; IE892706L; FI893963A; DK416589D0; PT91512A; NZ230342A; ES2154627T3; NO893387L; DE68929273T2; FI893963A0; AR245138A1

Description

MEMóRIA DESORITIVA muMg

O presente invento está. relacionado com um processo para a preparação de novas soinatotropinas recoaibinantes animais iTodifiçadas ou derivatizadas. Nomeadamente, proporciona métodos para a. estabilização de somatotropinas recombinantes animais por modificação ou delecção dos resíduos Cisteina utilizando mutagénese dirigida para. substituir um a quatro dos resíduos do aminoácido cisteina das referidas somatotropinas com um ou mais resíduos de aminoâcidos diferentes ou por derivatização de ambos os resíduos· do aminoácido cisteina na ansa pequena da referida somatropina, ambos os resíduos do aminoácido cisteina na. ansa qrande ou. os quatro resíduos do aminoácido cisteina em ambas a n s a s d a r e f e r i d a soma t o t. r o p i n a .

Fu.nd emei > tu du InVefitu presente invente está relacionado com novas somato— tropinas animais recombinantes modificadas cu derivatizadas em que pelo um (1) dos quatro (4) resíduos do aminoàcido císteina das referidas somatotropinas animais recombinantes foi substituição modificado, eliminando ou derivatizado. Se bem que as somatotropinas tenham sido e continuem a ser produzidas por via reccmbinante, por vezes as somatotropinas são difíceis de formular de modo a serem administradas eficazmente a um animal. Ao contrário de tais somatotropinas expressas préviamente, descobriu-se que a alteração ou eliminação dos resíduos císteina, quatro dos quais existem nas somatotropinas, por substituição com um outro amino•ácido ou por derivatização das císteinas, resulta em compostos biologicamente activos com melhor estabilidade para formular de modo aceitável para ser administrado a animais.

Constitui pois objectivo do presente invento, proporcionar novas somatotropinas animais em que pelo menos um (1) dos resíduos da somatotropinas foi substituído por um outro aminoácido, modificado, eliminado ou derivatizado quimicamente. Constitui um outro objectivo do presente invento substituir e/ou derivatizar dois (2), três (3) ou quatro (4) somatotropinas animais e proporcionar dos resíduos císteina das aqueles novos compostos.

Duas císteinas estão na ansa pequena e duas estão na ansa grande.

Também um outro objectivo do presente é proporcionar composições das referidas somatotropinas animais substituídas, substituídas (modificadas), eliminadas e/ou derivatizadas as quais sáo biológicamente eficazes e estáveis para administrar. έ ainda um outro objectivo do presente invento proporcionar composições de somatotropinas animais recombinantes biologicamente

a i_ t i v a ·= que j am sdtíquadaij A admii 1i. '_tr .5^3^ parenteral i-uiiipreen··· dendo uma quantidade pro mo tora do crescimento de uma. som a. to— trooína animal recombinante modificada ou. derivatizada ou. seus sais farmacêutica e farmacológicamente aceitáveis num veículo sólido ou líquido farmacêutica e farmaco1óqicamente aceitável, em que a velocidade de crescimento de um animal é aumentada durante um período prolongado de tempo de cinco dias ou mais.

Estes e outros objectivos do invento tornar-se-ão aparente atra v e s d a d e s o r 1 ç á o m a 1 s d e t a 1 h a d a, d o 1. η 'v e n t o d a d a a ba. i;; o .

ourríé.rio do Invento presente invento está relacionado com novas somatotropmas animais recombinantes modificadas císteinaísi substituídaís) ou ε1iminada(s) ou derivatizadas em que entre um e quatro dos resíduos do aminoácido císteina das referidas somatctropinas foram substituídas por um a quatro resíduos de aminoácidos, separadamente seleccionados entre os aminoácidos arginina, lisina, ácido aspártico, ácido qlutãnico,, asparagina, glutamina, histidina, alanina, glicina, isoleucina, leucina, valina, feriilalanina, triptofano, tirosina. netionina, serina treonina ou prolina; ou em que as quatro císteinas são convertidas em ácido cístsico; ou em que ambas as císteinas da ansa pequena ou ambas as císteinas na ansa grande ou as quatro císteinas em ambas as ao derivatizadas :om substituintes seleccionados entre (CH_,COOH> , CCHCCOJ-I) (CH_r,) „C0_oHl ,

0-3 , ou (SR, > ; em gue R-, e R, (CH_C0NR_R,), (R ), [<CH-.> 50-3 , (CHCH^CONR^CO>, o 4 ' u — n z (CtL,') NR-R,, (CH-OCOCH^R^.) , - 0 4' z. z. ·_' são individualmente H, C(CH_n>_vC0_oH1, CCH(CO^H)(CH_O>_vC0^H3, alquilo C ~C, facultativamente substituído com 0 a. 2 ou alcoxi

UJ '1

C^ metilo e R, é alquilo Cx-C,., polietilenoglicol ou fenilo um ou doi:

g rupos de ácido facultativamente substituído com carboxílico ou ácido sulfónico; n é um inteiro de €> a 4, m é um inteiro de 2 a 4; e x é um inteiro de 1 a 3; desde que quando os resíduos do aminoácido císteina da referida somatotropina animal recombinante sejam derivatizados, ambos os resíduos de císteina na ansa pequena ou ambos os resíduas císteina na ansa grande da referida somatotropina sejam substituídos com o mesmo grupo; desde que também os substituintes nos; re;

pequena (estável e mais perto do extremo tuintes iguais ou diferentes dos presente:

duos císteina	na ansa
C) possam ser	substi-
nas císteinas	da ansa
N/ e ainda d	esde que

quando um resíduo de aminoácido cisteina for oxidado para ácido rísteico, todos os referidos resíduos de cisteina somatotropina sejam oxidados para ácido císteico,

U presente invento também proporciona métodos para inibição da agregação de somatotropina animal recombinante por z:,ihc tituição de um ou mais dos resíduos de cisteina situados nas 166, 183 ou 191 de uma somatotropina animal recora5 U b = L .1 L U .1 p posiçSes 5 binante comi arqinina lisina.

ácido aspá.rtico, ácido glutSnico. asparagina, glutSnica, histidina, alamina, glicina, leucina, valina, feni1alanina, triptofano, tirosina, serina, treonina ou. prolina. ou oxidação dos quatro resíduos de cisteina referidos para ácido císteico.

iso 1 euc ina.

meti on ina,

Este invento está ainda relacionado com um método para a inibição da agregação de somatotropina animal recombinante, reduzindo pelo menos uma das duas pontes dissulfureto entre os resíduos do aminoácido cisteina nas posições 55 e 166 ou nas posições 133 e 191 das referidas somatotropinas e depois derivacada uma .steinas da ponte □*, dissu1fureto mesmo e

166 e/ou nas posiçSes 183 e 151 com o íesde que os derivados nas císteinas nas posições 55 166 possam ser substituintes iguais ou diferentes dos substituintes nas císteinas nas posiçSes 183 e 191. Os substituintes empregues na preparaçao das novas somatotropinas animais recombinantes derivatizadas deste invento incluem dsrivado.

DS sequintes:

(CH_,COOH>, CCH(CO^H) ( CH_O )_t<C0_oHl , ( CH_oC0NR^R_a ) , ( H 1 CH_ ) SO J , (SR 6

2 η o o (CHCH^CONR^CCf) , (CH_O> , NR,R, , ( uH.JjOUH _H_) , em que R_ e R, são ind i vidua 1 men te H,

5 -.--4

E (CH,., > ./20,-,Hl , CCH(CO._,H) (CH^) „C0_oHl , alquilo Cg-Cg facultativamente substituído com 0 .3 2 grupos hidroxilo ou polietilenoglicol;

Fg é alquilo C„-C, ou alcoxi C,-0.-met11 o; R é alquila C,-C., O lo 1 η- o 1 to' p;jiietilenoqlicol ou. fenilo f acLil tativArien te substituído com um

ou. dais grupos de ácida carbaxílica ou ds ácido sulfónico; η é uuri inteiro ds 0 a 4; e m é um inteiro de 2 a 4 e x é um inteiro de 1

E)e acordo com o presente invento as novas somatotropinas animais preferidas são as soma.totropinas recombinantes porcina, bovina, ovina, humana e aviária em que a ponte dissulfureto na ansa pequena da somatotropina é reduzida e as císteinas nas posições 1B3 e 191 são derivatizadas com um substituinte seleccionado entre (CH-COOH), lCH ( CO,_,H ) (CH- í J3O_,H 1 , (CH-.COMR-R^ ) , (. R_) , (CH_) SO- ou (SR,); em que R-, R,, R-„ R. , n e x sSo como descritos.

Também uma a quatro· císteinas podem ser eliminadas.

Todos os plasmídeos, sequências de DMA e microorganismos depositados e relacionados com o presente pedido de patente, excepto quando especificado em contrário, foram depositados na colecção de culturas da American Cyanamid Company mantida em Rrinoeton, New Jersey e foram depositados na American T'/pe Cu.ltu.re Collection (ATCC) em Rockville, Maryland 20952, U.S.A.

Breve descrição da figuras

Fiqura 1 : Clonagem do gene da somatotropina bovina. em M13mpll. DMA de M13mpll RF foi cortado com as enzimas de restri çáo ECoRI e HindIII, tratado com fosfatose alcalina de intestino de vitela. □ plasmídeo de expressão pEFF-902 foi digerido oom as enzimas de restrição ECoRI e HindIII. Os fragmentos adequados foram purificados após eiectroforese num gel de 171 de agarose. Os fragmentos purificados foram ligados e usados para transformar E.

c ο 1 i JMlõl.

tS tá apresentada estrutura do DNA resultante

Mlumpl1 pST—RF

Figura

Representação esquemática do esquema de mutagénese usando o oligonucleotídeo AA1 e α simples de M13mpl1pST.

DNA de cadeia

Figura 3 : Análise da sequencia de DNA do DNA de cadeia simples de M13mpllST e do DNA de cadeia simples Μ13mp11pST34 u.sando o método de terminação de cadeias didesoxi de Sanger. A ordem das faixas da esquerda para a direita é GATC para a. somatotropina tipo PSTA34.

selvagem (pST) seguido de GATO para o mutante

Figura 4 ; Representação esquemática dos esquemas de mutagénese usando os ol iaortuc 1 eotídeos GLU3 e GLU4 da cadeia simples do Μ13mp 1 1 p3T ..

Figura 5 : Representação esquemática do :pressão bacteriano contendo o gene pST mutagenizado.

vector de Os plasmídeos conferem resistência ao antibiótico ampicilina (amp ).

Descrição detalhada do invento

Em baixo estão ilustradas as somatotropinas animais recombinantes modificadas preferidas deste invento, mas são igualmente preparadas de acordo com o presente invento somatotropinas derivadas por via recombinante sem as substituições de Asp-Gln ou com outras substituições. Outras somatotropinas animais com deleções- na cadeia de aminoácidos, adições á cadeia de aminoácidos, substituições de aminoácidos (além de císteinas), fragmentos com a fracção activa e similares estão todos dentro do âmbito do oresente invento. A numeração dos resíduas de

aminoácidos estão aqui relacionados com os análogos Met-Asp-Gln mas a numeração pode ser alterada para identificar as pontes dissulfureto formadas pelos quatro resíduos de cisteina.

iOntã!

itrupina

po r<_ ina reco rn b i. n .5 π t s

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Alã-Met-Pro-Leu-Ser-SerLeu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-LeuHis-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-Tyr-Lys-Glu-Phe-GluArg-Ala-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile55

Gln-Asn-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe-R₂-Phe-Ser-Glu-ThrIle-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Glu-Ala-Gln-GlnArg-Ser-Asp-Val-Glu-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser-Leu-LeuLeu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Val-Gln-Phe-LeuSer-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-ThrSer-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-GluGlu-Gly-Ile-Gln-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-AspGly-Ser-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-ThrTyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr—Asn-Leu-Arg-Ser-Asp-Asp166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-R_2a-PheLys-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Ala-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg183 191

Val-Met-Lys-R₁-Arg-Arg-Phe-Val-Glu-Ser-Ser-R_laAla-Phe-OH.

SOiTi-5. tu truu 1 i íct buVÍn3 rELuftbL· i l.í±

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Al-a-Met-Ser-Leu-Ser-GlyLeu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-LeuHis-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-Phe-Lys-Glu-Phe-GluArg-Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile55

Gln-Asn-Thr-Gln-Val-Ala-Phe-Rj-Phe-Ser-Glu-ThrIle-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asn-Glu-Ala-Gln-GlnLys-Ser-Asp-Leu-Glu-Leu-Leu-Arg-Ile-Ser-Leu-LeuLeu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Leu-Gln-Phe-LeuSer-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-ThrSer-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-GluGlu-Gly-Ile-Leu-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-AspGly-Thr-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-ThrTyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Met-Arg-Ser-Asp-Asp166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-R^-PheArg-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Thr-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg183 191

Val-Met-Lys-R₁-Arg-Arg-Phe-Gly-Glu-Ala-Ser-R_la~ Ala-Phe-OH.

S oín a t ο t r o pina d e o v ina r ec o m b i n a n t e

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Leu-Ser-GlyLeu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-LeuHis-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-Phe-Lys-Glu-Phe-GluArg-Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile• 55

Gln-Asn-Thr-Gln-Val-Ala-Phe-R₂-Phe-Ser-Glu-ThrIle-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Glu-Ala-Gln-GlnLys-Ser-Asp-Leu-Glu-Leu-Leu-Arg-Ile-Ser-Leu-LeuLeu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Leu-Gln-Phe-LeuSer-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-ThrSer-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-GluGlu-Gly-Ile-Leu-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-AspVal-Thr-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-ThrTyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Met-Arg-Ser-Asp-Asp166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-R -PheArg-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Thr-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg183 191

Val-Met-Lys-R₁-Arg-Arg-Phe-Gly-Glu-Ala-Ser-R_laAla-Phe-OH.

λ

b ι_ι m a t o-1 r ο ρ i π a

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Htet-Pro-Leu-Ser-SerLeu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-LeuHis-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-Tyr-Lys-Glu-Phe-GluArg-Ala-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile55

Gln-Asn-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe-R₂-Phe-Ser-Glu-ThrIle-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Glu-Ala-Gln-GlnArg-Ser-Asp-Met-Glu-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser-Leu-LeuLeu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Val-Gln-Leu-LeuSer-Arg-Va1-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Va1-Phe-Gly-ThrSer-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Arg-Asp-Leu-GluGlu-Gly-Ile-Gln-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-AspGly-Ser-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-ThrTyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Leu-Arg-Ser-Asp-Asp166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-R^-PheLys-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Ala-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg183 191

Vai-Met-Lys-R!-Arg-Arg-Phe-Va1-Glu-Ser-Ser-R_laAla-Phe-OH.

S o rn a. t o t r ο ρ ί η

iU.ÍBSn ·3 1' >=.'!_ >_>ίΤ;Ο ί Π·3ι ι Εθ

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Thr-Ile-Pro-Leu-Ser-ArgLeu-Phe-Asp-Asn-Ala-Met-Leu-Arg-Ala-His-Arg-LeuHis-Gln-Leu-Ala-Phe-Asp-Thr-Tyr-Gln-Glu-Phe-GluGlu-Ala-Tyr-Ile-Pro-Lys-Glu-Gln-Lys-Tyr-Ser-Phe56

Leu-Gln-Asn-Pro-Gln-Thr-Ser-Leu-R₂~Phe-Ser-GluSer-Ile-Pro-Thr-Pro-Ser-Asn-Arg-Glu-Glu-Thr-GlnGln-Lys-Ser-Asn-Leu-Glu-Leu-Leu-Arg-Ile-Ser-LeuLeu-Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Glu-Pro-Val-Gln-PheLeu-Arg-Ser-Val-Phe-Ala-Asn-Ser-Leu-Val-Tyr-GlyAla-Ser-Asp-Ser-Asn-Val-Tyr-Asp-Leu-Leu-Lys-AspLeu-Glu-Glu-Gly-Ile-Gln-Thr-Leu-Met-Gly-Arg-LeuGlu-Asp-Gly-Ser-Pro-Arg-Thr-Gly-Gln-Ile-Phe-LysGln-Thr-Tyr-Ser-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Ser-His-AsnAsp-Asp-Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Tyr167

R_2a-Phe-Arg-Lys-Asp-Met-Asp-Lys-Val-Glu-Thr-Phe184

Leu-Arg-Ile-Val-Gln-R^-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser191

R_la-Gly-Phe-OH.

Soma.totrooina a?

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Pro-Leu-Ser-AsnLeu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-LeuHís-Leu-Leu-Ala-Ala-Gln-Thr-Tyr-Lys-Glu-Phe-GluArg-Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Asp-Gln-Arg-Tyr-Thr-Asn55

Lys-Asn-Ser-Gln-Ala-Ala-Tyr-R^-Phe-Ser-Glu-ThrIle-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Asp-Ala-Gln-GlnLys-Ser-Asp-Met.-Gly-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser-Leu-ValLeu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Thr-Pro-Val-Gln-Tyr-LeuSer-Lys-Val-Phe-Thr-Asn-Asn-Leu-Val-Phe-Gly-ThrSer-Asp-Arg-Val-Phe-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-GluGlu-Gly-Ile-Gln-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-AspArg-Ser-Pro-Arg-Gly-Pro-Gln-Leu-Leu-Arg-Pro-ThrTyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Ile-His-Leu-Arg-Asn-Glu-Asp166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-R_2a-PheLys-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Val-Glu-Thr-Tyr-Leu-Lys183 191

Val-Met-Lys-R^-Arg-Arg-Phe-Gly-Glu-Ser-Asn-R^aThr-Ile-OH.

ι-Ίπ que R, , R. , R._ e R_._ das r«t«i· idas suma recombinantes representani independentemente re des seleccioriados de entre arginina, lisina, ácida glu.tãnico, asparag ina, glutaraina, hi· o t r ο ρ i π a s a.n i ui a i s í d uqs d e am i n oác i ácido aspártico, tidina, alanina.

glicina, isoleucina, leucina, valina, tirosina, metionina, serina, treonina, feni1 a 1anina, triptofano, prolina ou císteina; desde que pelo menos um dos referidos resíduos de aminoá.c idos representados por R,, R, , e Ra nas somatotrooinas atrás ilustradas,

1- la- Z ia representem um resíduo aminoácida que não seja císteina.

São especialmente preferidas as somatotropinas animais recombinantes modificadas do invento em que um ou ambos os substituintes R, e R, nas posicBes 163 e 191 da somatotropina ou 1 la nas posiçSes 1 Ei4 e 191 da somatotropina humana recombinante representam aminoácidos que não sejam císteina.

Mutagénese dirigida

A preparação das referidas somatotropinas animais recombinantes (substituídas) deste invento foi conseguida por mutagénese dirigida.. As técnicas normalmente utilizadas para a alteração da sequência de DNA de um segmento de DNA clonado num sitio definido especifico requere a produção daquele DNA na forma de cadeia simples. 0 DNA de cadeia simples foi emparelhado com um c> ligonucleóti deo sintético que é complementar de uma fracção dela, excepto o o1iqonuc1eotídeo conter dentro dele uma região de desempare 1 hamentoA região de desempare 1 hamento está geralmente situada na fracção central do oligonuc1eotídeo. A mistura emparelhada passa então a cadeia dupla covalentemente fechado pela adição de DNA-polimerase I, de E. coli, fragmento grande e trifosfatos de desoxinuc1eotídeo na presença de DNA—ligase de T4 e trifosfato de adenonina 5'. 0 DNA de cadeia dupla foi então transformado numa, estirpe de E coli adequada onde a região de desampare 1 bastenta do DNA foi reparada e replicada. Obtiveram-se duas populações de clones. Dependendo da cadeia escolhida como molde para a síntese e reparação, ura clone contém o tipo selvagem ou a sequência alterada (mutagenizada). Ds clones que contêm a sequência mutagenizada, i.e. aquela que corresponde à sequência do o 1 iqonuc 1 eotídeo, foram seleccionadas por bibridação com o oligonucleotídeo marcado radioactivamente. Devido ao desempare1 ha.mento entre o oliqonuc1eotídeo e a sequência tipo selvagem, oligonucleotídeo marcado radioactivamente liga-se mais estávelmente aos clones que contêm a sequência mutagenizada. A incubação a uma temperatura adequada diferencia portanto clones tipo selvagem de clones mutagenizados. As alteraçSes nos clones identificados foram então confirmados por sequênciação de DNA das regiões importantes. Nas discussões que se sequem, a somatotro— pina porcina recombinante foi seleccionada com representativa das somatotropinas animais recombinantes modificadas e derivatizadas do presente invento assim como os métodos empregues na sua preparação„

A clonagem do gene da somatotropina porcina (rpST) no bacteriófaqo vector de cadeia simples Nlompll foi conseguida pelo processo gerai que se seque e que está esquematizado na Fiqura I.

Um fragmento de DNA contendo o gene da somatotropina porcina (rpST) foi isolado a partir do plasmídeo de expressão bacteria.no pEFF-902 por clivagem com as enzimas de restrição ECoRI e HindIII. 0 fragmento contendo o gene rpST foi então purificado por electroforese em gel de agarose. 0 DNA forma repiicativa (RF) de MlumpII foi digerido CDffi ECoRI e HindIII, tratado com fosfatase alcalina de tino de vitela e o fragmento grande foi purificado por electroforese em gel de agarose. Ds dois fragmentos purificados foram então misturados e ligados DMA-1iqese de T4. A mistura foi usada para transformar E.

com coli

JillC‘1 e cultivadas várias das placas resultantes. 0 DMA farma reolicativa (RF) foi preparado por um processo convencional de 1 ise alcalina e a est.ru.tura determinada par digestão com os enzimas de restrição adequadas. Isolou—se um clone que contem os fragmentos esperados e que se designou il13mpIIpST. A análise da sequência, de DNA foi usada para confirmar a. identidade do clone.

c con

A mutagênese do gene egu.ida como descrito abaixo rpST em l'113mpllpST foi e esquematizada na Fiqura en tão

2. A finalidade do programa de mutagênese ê gerar uma molécula de rpST incapaz da formação da ponte dissul fureto na. ansa pequena, da. ponte dissul fureto na. ansa grande ou ambos os casos por substituição dos resíduos de císteina. importantes por outros aminoácidos. A ponte dissulfureto na ansa grande está situada. entre cisternas nas posiçSes 55 e 166 no gene rpST. A ponte dissulfureto na ansa pequena é entre as císteinas situadas nas posiçSes 183 e 191. O sistema de numeração é como descrito. Foram usados dois protocolos básicos para se obter os mutantes necessários e serão aqui descritos exemplos de cada um deles.

Mo primeiro método, a substituição das císteinas π<5 ponte dissulfureto da ansa pequena é consequioa usando um longo oligonucleotídeo sintético. Neste método o oligonucleotídeo AA1 foi empregue e possui a. sequinte sequência:

5’ GTC ATG AAG GCG CGC CGC TTC GTG GAG AGC AGC GCT GCC TTC TAG 3'

Isto altera a sequência do gene pST de tal forma que o codão para císteina na posição 193 é convertido de TGT para GCG que codifica alcanina e a císteina na posição 191 é convertida de TGT para GCT que também codifica alcanina. Portanto, as císteinas na ansa pequena são ambas convertidas em alanina. D DNA de cadeia simples de il 13mp 11 pST foi preparado a partir de fagos

J_>U Γί Τ ί ·_ ádQS citraVé de μΓυ tuuυ 1 os LU! ινθΠ'-ϊυΓίβΙΐι . (J ÍTíS todo de mutaqénese está esquematizado na Fiqura 2. lOOOnq de DNA de

Ladeia =iíliplee de 14 1 3mp I 1 pS T nucleotídeo AA1, o qual foi trifosfato de adenosina 5' e; ng o i ígopréviamente fosforilado em 5'com ; cinase de polinucleotídeos. A mistura foi aquecida a 655C durante 7 minutos e dqpois mantida à temperatura ambiente durante 10 minutos. Este protocolo emparelha o o 1 igonuc 1 eotídeo com o DNA de cadeia simples. 0 DNA emparelhado foi então convertido numa forma de cadeia dupla cova 1entemente fechado através da adição de ATF', dNTF''s (uma mistura dos quatro irifosfatos de desoxirribonucleotídeo 5'), DNA-ligase fragmento grande da DNA— pol imerase. A mistura. foi incubada durante 1 hora á temperatura ambiente. A mistura foi então usada para transformar E. coli JM101 pelo processo convencional com cloreto de cálcio. Após incubação durante a noite a 372C observaram-se placas numa camada uniforme de JM101. As placas foram transferidas para filtros de nitrocelulose e processadas para hi br idação através de protocolos convencionais,

Um sequndo ol igonucleotídeo designado AA1D foi usado na detecção dos mutantes. AA1D tem a seguinte sequência 5'C ATG AAG GCG CGC CGC TT 3'. Foi marcado radioactivamente no extremo 5' com c-^P-ATF e cinase jolmuc1eotídeos. Fez-se hibridação durante a noite em xóSó (IxSSC é cloreto de sódio O, 1514, citrato de sódio 0,01514 pH/,O), Denhardt' lx (0,027, (ρ/o) ds Ficoll, 0,027. (ρ/o) de albumina de soro bovino, 0,027. de polivini1 pirrolidona), 150 p.g / il) .

de tRNA após hibridação. Ds filtros foram lavados sequéncia 1mente em SxSSC a 4DC, TAC (TAC é tetrame ti 1 ~c 1 oreto de amónio 3Γ4, ( tris) [ hidroximeti 1 1 aminometano 50ml4 pH8,0, ImM EDTA eti 1 enodiaminatetracético) 0,17. (p/o) de dodecilsulfato de e finalmente em TAC à temperatura pretendida,

Esti (áC idD sódio)

Dl tima lavagem determina a especificidads é de 52,520. Após exposição a filmes de raios X observaram-se apenas os clones totalmente complementares ds AA1D. Vários destes

Para AA1D a temperatura

clones foram analisados por sequenciação de DMA continham a primeira mutação mas nenhum deles conti, mutação (na císteina í?l>.

Todos eles a ssq urf dd

Para mutagsnizar a císteina segundo o 1iqonuc1eotídeo designado Al na posição lAl usou-se um Al tem a sequinte sequên—

3' PAG AGC AtGC GCl GCC TTC TAG 3' □ processo de mutagénese é idêntico ao descrito atrás usando AA1 excepto o DNA molde ser N13mpllpSTA3 (este é o clone isolado a partir da mutagénese AA.l que tinha a císteina na posição 183 convertido em alanina) e a hibridação ser com Al. A temperatura da lavagem final é de 565C. A sequenciação do DNA revela que os clones identificados têm a sequência pretendida. 0 clone mutagenizado foi designado por M13mpl1p5TA34. A sequência de DNA está ilustrada na Figura 3.

No segundo na ansa pequena foi mesma reacção e está método, a substituição da ponte dissulfureto conseguida usando dois o 1iqonuc1eotídeos na esquematizado na Figura 4. Os dois oligo— nuc1eotídeos têm a seguinte sequência:

5' GTC ATG AAG GAA GCG CSC TTC 3' SLU3

GLU b ’ 6AG AGC AGC GAiG GLC TTC TAG 3' GLU4

GLU □ DMA molde de cadeia simples foi M13mpllpST. Os dois oliqonucleotídeos e o DNA molde, na mesma reacção foram emparelhados, prolongados e ligados como atrás. A mistura foi usada cara tranformar E. coli JMIOl. A diferença neste método reside em faz dua* transferê n c i as

□artir d.a mesm;

Cada transferência é hibridada seDaradamente

OiTl

5LU3 ou GLU4 marcado* ίperatura lavaqesn fin;

cad;

o i ioonuc1eotídeo ê de 562c. Apenas as placas positivas para ambos os oligonucleotídeos foram repicadar luência de DMA revelou, que

183 o Cis 191 foram convertidas em ácido glutãnico. 0 clone foi designado Ml 3mpl 1 pSTE34Este método é usado para se obter mutações que evitem a formação da ponte dissulfureto da ansa grande através da utilização ds dois oligonuc1eotídeos adequados como descrito atrás e Ml 3mp 1 1 pST - Claramente -através da utilização de Ml3mpl1pSTA34 como DMA molde e os dois o 1 iqonuc1eotídeos adequados para alterar Cis 55 e Cis 166 para alamina, obteve—se um clone em que todos os resíduos císteina foram convertidos em a 1 amina.

mesmas enzimas, tratado com vitela e isolado o fragmento

Os clones alterados (mutantes) foram então reconstruídos no plasmídeo de expressão bacteria.no pR0211 (ATCC Numero de Acesso 49483, depositado em 23 de Agosto de 1988) conforme esquematizado na Figura 5 (descrito em EF’ 173.230). Os clones M13 foram cortados com EcoRI e HindIII e isolado o fragmento do gene pST. pR'0211 foi digerido com as fosfatase alcalina ds intestino de grande. Os dois pedaços foram ligados u.m ao outro com DNA-ligase de T4 e usados para transformar uma. estirpe bacteriana adequada, e.g. E. coli N99cI. Nesta, estirpe existe um repressor k tipo selvagem. Isto evita a expressão a partir do promotor F'^ em pRÕ211. Uma vez isolada a construção adequada, foi então transferida. para estirpes bacterianas que contêm um repressor K sensível ã temperatura, e.g. E. coli 4200. Mestas estirpes, a expressão de pST está dependente da temperatura. A 4252C, o repressor é inactivo e dá—se a expressão. Nesta fase pST é preparado pelos processos descritos em EF' 173,280 em que se dá expressão (aqui incluído como referência).A expressão de pST não está limitada a estas

t i z ad as estirpes de E. co 11 particulares. Uutras estirpes com propriedades adequadas podem iquaImente ser usadas. Os vectores de expressão do tipo piasmídeo foram depositados na ATCC.. As estirpes bacterianas foram depositadas separadamente.

Fizeram-se outras substituições de aminoãcidos pelos processos atrás referidos utilizando os codoes e oligonuc1eotídeos adequados. De modo semelhante estes processos foram empregues para modificar uma. variedade de somatotropinas animais.

Entre as somatotropinas animais recombinantes modificadas fácilmente preparadas pel 55,166)rpST; (Ser 55,166)rpST rpSf; (Glu 183 - Ala 191)rpST 1T 1 )rpST.

G c m a t o t r ο ρ i. n a s a n i m ais d e r i v a_

As somatotropinas animais der i va ti zad as , de preferência recombinantes, foram preparadas por dissolução ou dispersão de uma somatotropina animal em água ou numa solução aquosa de hidrocloreto de guanidina, bicarbonato de sódio ou similares, que ê ajustada a pH 8.4 com base aquosa, como seja hidróxido de sódio ou de amónio. A esta solução adicionou-se então lentamente d i t iotrei to 1 , i.e. (DL-treo-1,4-dimercapto-2,3-butanediol). A adição é geralmente efectuada numa atmosfera de azoto à temperatura ambiente. A solução resultante adicionou-se então iodoaceta«ida, ácido iodoacético, tetrationato de sódio, metanotiossulfo— nato de metilo, í,3-propanossulfona ou outro agente derivatizante. A mistura foi agitada durante cerca de uma a quatro horas, depois removido o sal por u1trafi1 tração„ Concentrou-se a solução e depois submeteu—se a vários ciclos de rediluição com água hidrocloreto de guanidina aquoso ou similares, seguido de os processos acras enconcram—se Hia ; (Ala 183,191)rpST; (Glu 183,191): (Ser 1B3,191)rpST: e (Glu 183-Ser

uItrafi1 tração. 0 resíduo da filtração final foi então liofilizado cara dar roST derivatizado.

Método de U1.1.1 ização

Com vantagem, as novas somatotropinas animais do presente invento sáo úteis para o melnoramenio da velocidade do crescimento de animais, especia 1mente animais produtores de carne e aumento da eficácia de utilização de alimentos. Estes compostos são também eficazes para o melhoramento da qualidade da carcaça dos referidos animais, i.e. aumento da razão carne magra/gordura dos referidos animais. Ainda, os compostos do presente invento são eficazes para aumentar a produção de leite de animais em lactação e melhoramento da. produção de lã e carneiros e outros animais criados para indústria de confecçSes.

Se bem que as somatotropinas modificadas (substituídas) ou derivatizadas deste invento sejam eficazes no tratamento de animais para se conseguir os melhoramentos biológicos descritos atrás, parece que a eficácia e utilidade melhoradas das somatotropinas animais modificadas ou derivatizadas do invento é atribuído, em parte, á inibição da agregação da somatotropina produzida através da modificação ou derivatização das referidas somatotropinas. Tal inibição permite a preparação de sistemas de libertação prolongada marcadamente melhoradas que não são fácilmente ou eficazmente conseguidos com somatotropinas nativas ou somatotropinas- recombinantes que não são modificadas ou derivatizadas coma descrito pelo presente inventa.

Também se encontrou que as. somatotropinas modificadas ou derivatizadas do presente inventa são altamente estáveis e praticamente sem agregação devido à formação de dímeros. Ainda, as somatotropinas modificadas ou derivatizadas do inven to

tornam-nas adequadas para uso na preparação de composições de libertação prolongada significativamente melhoradas.

Ε η c o n t. r o u—s e q u e e n q u. a n t o a s s o m a t o t r ο ρ i. n a s a n i m a i. s nativas agregam num único dia, as composições parenterais conten— d o as somatotropinas mod i f i c ad as ou d e riva t i 2ad as d es te i nven to continuam a. libertar a somatotropina modificada ou derivatizada durante 10 dias ou mais.

L Ο (Π p ΰ S I C c «Ξ? '3

Na prática, as composições do presente invento são geralmente administradas a animais através de injecção na forma de composições parenterais biolóqicamente activas. Entre as composições parenterais úteis para administração das somatotropinas animais recombinantes deste invento, encontram-se géis, pastas, microsferas, microcápsulas, implantações e similares. Como tal existe considerável interesse em arranjar dosaqem de substâncias biológicamente activas que formas de libertam a substancia de modo controlado admimstracão.

reduzem assim a frequência de

U desenvolvimento de composições de libertação prolongada de macromo1écu1 as biológicamente activas apresenta problemas especiais devido aos seus modos complexos de actuação e estruturas intricadas das macromo1écu1 as. Assim, é necessário o desenvolvimento de composições de libertação controlada eficazes que contenham a somatotropina biológicamente activa.

As composições úteis para este tipo de administração são preparadas por dissolução da somatotropina animal modificado ou derivatizada em hidróxido de amónio diluído seguido da adição de uma solução de um carbonato.

laurato, benzoato ou similar de

metais alcalinos. Um tensioactivo não iónico é depois misturado com a solução e a mistura resultante seca com spray. Os sólidos assim formados são então misturados com gordura ou c'è'ra. fundida, ou uma misture, das duas e a mistura fundida resultante é vaporizada através de um bico de pulverizador ar/líquido equipada com uma manta de aquecimento para manter o ar que entra e a fase fundida a. uma temperatura acima do ponto de fusão. As microsferas sáo formadas à medida que as gotículas fundidas arrefecem. Estas são colhidas numa, série de crivos na. gama de tamanhos pretendida, de csrca de 45 a 180 microns e guardadas para utilização. As microsferas que não possuem o tamanho pretendido são recicladas. Como alternativa, a mistura homogénea é passada a um disco de centrifugação e as microsferas assim formadas colhidas como atrás, ou a mistura fundida é arrefecida s moída até à gama média de tamanho de partículas pretendida.

As .microsferas biologicamente activas são então dispersas num veículo líquido farmacêutica e farmacológicamente aceitável para injecção no animal. A composição microsfera-1íquido é geralmente administrada por injecção subcutânea sob a pele do ani.nil geralmente na vizinhança da cabeça, pescoço ou orelhas.

As somatotropinas animais modifiçadas ou derivatizadas do presente invento também são preparadas como implantes * biocompatíveis que são injectadas sob a pele do animal u.sa.ndo uma pistola convencional para implantação de pastilhas. Estas composições são preparadas misturando uma somatotropina modificada ou. derivatizada em pó com u.ma cêra como seja cêra de castor ou com uma mistura de um copolímero (g1ico1eto/1acteto), hidróxido de magnésio e um condensado de óxido de etileno preparado com uma base hidrofóbica. formada por condensação de óxido de propileno e pro pi 1 er>og 1 i co 1 .

Α±, >_ Qm pui i ι_, όϋ assim formadas foram entáu introduzidas numa prensa de pastilhas e formadas pastilhas cilíndricas com cerca de 1/8 de polegada de diâmetro. As pastilhas assim formadas foram administradas com uma pistola convencional para implantação de pastilhas.

presente invento está ainda, ilustrado pelos exemplos aqui descritos a seguir.

EXEMPLO I

Substituições das císteinas da ligação dissulfureto na ansa pequena usando um c<l iqonuc leotldeo sintético longo

Um o1igonuc1eotídeo designado AA1 tem a seguinte sequ?ncia;

5' GTC ATG AAG GCb CGC CGC TTG GTG GAb Abb AbC GCT GCb TTC T Ab 3'

Esta altera a sequência do qene rpST de tal forma que o codãc da cisteina na posição 183 é convertido de TGT para GCG que codifica alamina e a cisteina na posição 191 é convertido de lue também codifica alamin;

cortanto, c í steii

TGT na ansa pequena são ambas convertidas em alanina. 0 DNA de cadeia simples do M13mpllp3T foi preparado a partir de fagos purificados por protocolos convencionais. l/OOrt de DNA de cadeia simples do N13mp11pST foi misturado com 50ng do oligonucleotldeo AA1 , o qual foi préviamente fosforilado em 5' com trifosfato de adenosina 5' e po1inuc1eotídso-cinass num volume final de ΙΟμΙ contendo tampão de emparelhamento IX (tampão de empare1hamento IX é 75mT1Kcl, 5mM Tris pH8,0). A mistura foi aquecida a 65CC durante 7 minutos e depois mantido a temperatura ambiente durante lú minutos. Este protocolo permite emparelhar o oliqonuc1eotídeo com o com o

uadeia simples. Ο DNA empai' e?lhadu tui antãu uunvei de cadeia dupla covalentemente fechado pela adiçã :ido numa.

•orma de 2Ãul de í-L.O , 4μ1 uS t aiiiEu de preei í'_! liiTien tu lúX '·. tampão de pr et'i iChliTten t.u.

r,M ET.. pH 7,5, 2mN DTT) Ιμΐ 2DmN ATP, 2ul dNTP's (um;

mistura dos quatro trifosfatos de deoxiribonuc1eotídeo 5'cada um na concentração 2mM >, 2U de DNA-1 igase de T4 s 2U de DNA-pol .imeragmento grande ( para definição da unidade ver catáloqc de 1986. da New England Biolabs ). A mistura foi incubada durante 1 hora à temperatura ambiente» A mistura foi então usada para transformar Ε. coli Jf-1101 por um processo convencional de precipitação comi cloreto de cálcio. Após incubação durante a noite a 372C puderam ser observadas placas numa, camada uniforme de JMIOI . As placas foram transferidas para filtros de nitrocelulose e processadas para. hibridação por processos convencionais. Um sequncío oligonucleotídeo designado AA1D foi usado na detecção dos mutantes. AA1D tem a seguinte sequência 5'C ATG AAG GCG CGC CGC ”T TC

TT 3' . Marcou-se rad .ioac t i vamen te no extremo 5'com d —~’^Ρ-ΑΤΡ e polinuc1eotídeo-cinsse. A hibridação fez-se durante a noite a 372C em 5xSSC, íx Denhardt's, 150pq/ínl tRNA. Os filtros foram lamente

4ã‘C, TÃO a 37°C e finalmente em TAC à temperatura pretendida. Esta última lavagem determina a especificidade. Para AA1D a temperatura é de 52,52C. Após exposição a filme de raios x apenas os clones totalmente complementares de AA1D foram observados. Vários destes clones foram analisados por sequenciação de DNA. Todos eles continham a primeira mutação mas nenhum deles continha a segunda mutação ( na. císteina 191). Para mutagenizar a císteina nas posiçSes 191 usou—se um oliqonucleotídeo designado A

Al ism rf seguin ;equencia

GAG AGC AGC GCT GCC TTC TAG 3

Exemplo 1 acima usando AA1

G 3 t fc?

processo de mutagênese foi idêntico do descrito no excepto o molde ser M13mpllpSTA3 se com AA1 que tinha a lamina) e a bibridação é de 622C. A sequenciação é o c 1 on e com Ai. A cie DMA re··. esperada.

isolado a partir da mutagén a posição 183 convertida em temperatura de lavagem final elou que os clones identificados tinham a sequência 0 clone mutagenizado foi designado Ml3mp11pSTA34.

Substituição das císteinas na ansa pequena da somatotropina ρ o r c ,i na recom bi n an t e

A substituição da ponte dissulfureto na ansa pequena foi obtida usando dois oliqonucleotídeos na mesma reacção. Os dois oliqonucleotídeos tinham a sequ.inte sequencia:

5’ GTC ATS AAG GAA CGC lG’C TTC 3‘ GLU3

GLU b' GAG AGC AgG GAG GUC TTG TAG 3' GLU 4 GLU

DMA molde de cadeia simples foi i”1l3mp 1 1 pST. Os dois ο Iiqonucleotídeos e o DMA molde, na mesma reaccão, foram emparelhados, prolongados e ligados como anteriormente. A mistura toi usada para transformar E. coli JM101. A diferença neste método é que obtiveram-se duas transferênci-_: partir de cada placa transferência foi hibridada separadamente com 6LU3 ou GLU4 ~T *?

marcado com 'Ρ, A temperatura da lavagem final para cada oliqonucleotídeo foi de 560C. Apenas as placas positivas para ambos os o 1iqonuc1eotídeos foram reficadas. A sequenciação do DMA revela que tanto Cis 183 como Cis 191 foram convertidas em ácido glu— tSmico. Este método foi usado para se obter mutações que evitem a formação da ponte dissulfureto na ansa grande através da utilização de dois oliqonuc1eotídeos adequados como descrito atrás e doi s c orno

Ml3mpí1oST. Llaramente usando Μ13mpl 1 pbTA34 como DNA molde ε dois ara alterar tis 55 e Cis 1 &6 para clone em que todos os resíduos; císteina . amina...

.deos adequado;

a 1 a mina, ob t ev e-se um 'os; em ;

li L Ul i 7 tr’ i L .

TEMPLO 3

Reconstrução em plasmídeos cie expressão bacterianos

Os clones alterados (mutantes) foram reconstruídos no (descrito em

EP plasmídeo de expressão bacteriano pRO0211 173250) aqui incluído como referência. Os clones M13 foram cortados com ECoRI e HindIII e isolado o fragmento do gene pST. pR0211 foi clonado com as mesmas enzimas, tratado com fosfatase alcalina de intestino de vitela e isolado o fragmento grande. Os dois pedaços foram ligados um ao outro com DNA-ligase de T4 e usados para tranformar uma. estirpe bacteriana adequado, e.g. N99cl⁺. Nesta estirpe está presente gem. Isto evita a expressão do promotor P,

p.-ese-iice um repressor 11 tipo selvaem □R0211. Uma isolada a construção adequada esta foi □ ara síiros bacterianas que continham um repressor lambda sensível à tempera— tura, e.q. 4200. Nestas estirpes, dependente da temperatura. A 4220, dá-se a expressão. Nesta fase, pode-se preparar rpST por processos descritos em EF' 173230, aqui incluído como referência. As estirpes de E. coli usadas na expressão do produto do gene pST e ;·; p r e ssão de r p 3 T es t ã repressor está inactivo e n ã u e = t ã u> li m 11 a d a e

Pode ser utilizada qualquer estirpe adequada de E. colι

Seguindo os processos dos Exemplos 1, 2 substituindo por codoes adequados de alanina.

glutánico arginins, triptofano ou ? --·* atrás,, iri-as serina, ácido císteina nas ct LJ JL Π ct pusições 133 e ívl converte—se TGT da císteina em TCN, AGC ou ATG de

GAG

Ο Li L« Η Η

ί r χ d Ο Q 1 Li t.-ζίΓί i C i áHh »_<Ll rtUb arginins, AAT ou AAC de asparagins, bCM triptofano na referida, posição.

ou TGÍ

EXEMPLO

F' r e pa r a ção d e ( C a m —C i :

-j , 1 άό , 1 33 , 1V1 ) h Ρ3T

F'repsroLi-se u.ma solução de lôô mg de somatotropina

-se o pH a 3,4 com NaOH. A esta solução adicionou-se 13 mg (20 equivalentes) de ditiotreitol e a mistura de reacção foi agitada durante uma hora à temperatura ambiente em atmosfera de N_Q . A esta solução adicionou-se então Θ4 mg (100 equivalentes) de iodoacetamida e a mistura de reacção foi agitada à temperatura ambiente durante quatro horas. A mistura de reacção foi diluída com 35 ml de FL,0 e guanidina HCl e os reagentes em excesso foram removidos por ultrafíltração através de uma membrana Amicon UM2 (peso molecular de exclusão de aproximadamente 1000 Dalton) numa célula Amicon Modelo 3400. Após vários ciclos de rediluição e refi1 tração, a solução aquosa residual foi liofilizada para peso constante para dar aproximadamente lOOmg de um sólido branco fofa. A mobilidade electroforética do produto em gel de SDS-F’AGE em condiçoes não redutoras é diferente de rpST. 0 produto é a somatotropina porcina recombinante derivatizada indicada atrás.

EXEMPLO •gparação de (Lam-Lis 135,,191 ) rpS ρ o r c i n a r e c o m bina n t. e ( r p 3 T )

A uma solução de 0,02 M Na.Cl (225 ml) desgaseada licionou-se 3,375g de somatotropina _i_'íii HC1, diluído, mantendo pH d

8,1 15 mq/ml, 0,9463 g de ditiotreitol dissolvido água foi adicionado durante uma hora e depois o pH

8,4, 5,7g de iodoacetamida dissolvido em 40,5 adicionado gota a gota à solução de em

a u m -5 n t a d o p a f de água rpST mantendo o pH a 8,4. Durante esta adição dá-se a formação um precipitada fino que é r e m o v i d ο ρ o r c e n t r i. f u g a ç 3 o

I í q u. i d o límoido do sobrenadante c o 1 u n a d e 3 e ρ ti a d e >: G—2 5 baixo peso molecular. A totalizando 342,3g foi ÍCam-Cis 183, 191) rpST foi removido e passado através de uma para remover o excesso de materiais de fracção de rpST de alto peso molecular colhida e liofilizada para dar 2,2g de

EXEMPLO 6

Preparaçao de (Cm-Cis ls3,191)rpST

	A uma	solução		200mg de somatotropina porcina recom-
binante	í rpST) e	1 00 m 1	de	0,5 N MaHCO_, ( pH ajustado a aproxima-
d amen te	3,4 com	hldró	>. 1 d	o de amónio aquoso) adicionou-se de
ditiotreitol e	a m i s 11	lí r a	de reacção foi deixada a agitar à.

temperatura ambiente durante uma hora, A iodoacético e a mistura de reacção fo a rnb i en te d u r an t e d u a s ho r a s . Remo veu -se reacção por ul tre.fi 1 tração através de numa célula com agitação Amicon Modelo de rediluiçã.o e refiltração a solução para um peso constante. Recuperou-se apr sólido branco fôfo. D produto obtido é recombinante deri tizada conforme aqui indicado.

d i c i ο π o u - s e 5 V m q d e á c i d o i agitada à temperatura então o sal á mistura de uma membrana Amicon UM2 3400. Após vários ciclos residual foi liofilizada oximadamente 200 mg de um a soiTiatotropina bovina tropin·;

Seguindo o processo atrás mas substituindo a somatoporcina recombinante por somatotropina bovina

recombinante, s o m a t o t r o pina o vi na rec omb c av a 1c rec om bi nan te, soma t ot rο ρ i na huma n recombinante dá resoectivamente:

ante, somatotropina de recombinante ou aviária

1 )	(Cm-Cis	1B3,	191 )rbST
'	(Cm—Cis	183,	191)ro3T
3)	(Cm-Cis	1ÍJ3 _?	191IrhoST
4)	(Cm-Cis	184 ,	191 ) rh.ST
5)	(Cm-Cis	183%	191 ) ra.BT
			EXENFLO 7
ep·	a.ração de	(~0	-.8—Cis 55, íóó, 183, lí	>1 ) rpST

	F'reparou-se uma. solução	de	20õ
poro i.na	recombinante (rpST) e 50	m 1	de
a j us tou—	se o pH a aproximadamente	8,4	com

mq >=t somatotropina ditiotreitol e a mistura

N e

A de

A

H solução adicionou—se 33mg de eacção foi agitada è. temperatura ambiente durante uma hora, sta solução adicionou-se 20Θ mg de tetrationato de sódio, o p ai ι med ia. tamente para ca. 6 e este é novamente ajustado a pHS,4 om NaOH. A mistura foi então deixada em agitação durante 2 oras, A solução foi ultrafi1trada através de uma membrana Amicon W2. A mistura de reacção foi concentrada para <

e depois rediluída com cerca de 40 ml d( efiltrada. Após concentração a p r o i m a ó a m e n t. e 2 0 quanidina-HCl 3 N e para cerca de 20ml, a solução foi ovamente diluída com H^.0 e concentrada outra vez. Est oi repetido mais duas vezes e o resíduo ii onstante. Obteve-se aproximadamente 200 anca. □ produto é a somatotropina porei processo otilizado para um peso mg de um produto sólido na recombinante derivaízada descriti

EXEMPLO S

I-'reparaçâ' ( O_S-Ci .915 rpST

A Lima solução de 230;nq de somatotropina porcina recombinante (rpST) em 100 ml de H„0 (pH ajustado a aproximada mente 3,4 com NaOH) adicionou-se 70mg de ditiotreitol. A solução foi agitada durante uma hora à temperatura ambiente. À solução de rpST reduzida adicionou-se 400mg de tetrationato de sódio e a. solução foi agitada A temperatura ambiente durante quatro horas. A mistura de reacção foi filtrada através de uma membrana Amicon UMb concentrada para cerca de 20ml . Est;

foi diluída com cerca de 200ml de H^O e novamente concentrada. Este processo foi repetido mais duas vezes. A solução final liofilizada para peso constante deu cerca de 240 mg de pó branco. Este é a somatotropina porcina recombinante derivatizada descrita atrás.

EXL!“!r'LO 9

Preparação de (HeS-Cis 133,1915roST

A esta solução adicioreacção foi aqitada à

200mq de somatotropina porcina recombinante (rpST) foram dissolvidas em 100 ml de H._,0. 0 pH desta solução foi ajustado a cerca de 3,4 com NaOH aquoso) nou-se 15 mg de ditiotreitol (DTT) s temperatura ambiente durante uma hora. Após completada a redução adicionou—se 24 p.l de metanotiossulfonato de metilo e a mistura de reacção foi agitada á temperatura ambiente durante quatro horas. Durante a reacção o pH foi mantido a 3,4 pela adição de Na OH a IX conforme necessário. A solução foi ultrafi1trada através de uma membrana UM2 e concentrada até cerca de 20 ml. D resíduo

^Foi diluído com 2ΘΘ ml de H^O e ^:ui então 1iofi1izada para dar . ,e. a somatetropina porcina S esc r i ta at. rás.

□ j. U.Ç ád

210mg do produto descrito atrás, recombinante cerivatizada aqui

Seguindo o processo descrito atrás mas substituindo a somatotropina porcina recombinante por somatotropina bovina recombinante, somatotropina ovina recombinante, somatotropina recombinante de cavalo, somatotropina humana recombinante ou somatotropina aviárias recombinante dá os seguintes produtos:

1) Somatotropina bovina recombinante (MeS-Cis 183,191)

2) Somatotropina ovina recombinante (MeS-Cis 183,191)

3) Somatotropina recombinante de cavala (MeS-Cis 183,191)

4) Somatotropina humana recombinante (l^vleS-Cis 184,191) Somatotropina aviária recombinante (MeS-Cis 183,191) ly

Preparação de (HO-rSuH^LH-CH^,—Cis ls3 , lv 1 )-rpsT temperatura ambiente durante· sei? 3,4 pela adição de NaOH a IX. 0 pH produto bruto

A uma solução de 200 mg de somatotropina porcina recombinante (rpST) em lOCml de H^.,0 ajustada a pH=3,4 adicionou -sa 15 mg de ditiotreitol e a mistura de reacção foi agitada à temperatura ambiente durante uma hora em atmosfera de M-,. A esta solução adicionou-se 50mq de 1,3-propanossulfona e a solução agitada á temperatura ambiente durante seis hora mantido a concentrado por ultrafi1 tração através de uma membrana UM2 até cerca ds 20 ml. Isto foi duas vezes diluído para. 200 ml e novamente concentrado. A solução final foi liofilizacla para dar 200mg

ΤΟ1 foi f o.i

da produto sólido branco descrito atrá·: bovina recombinante derivatizada.

s o m a >_ □ >_ r α μι i n a.

Com vantagem, a substituição da soraatotropina porcina recombinante por somatotropina animal recombinante adequada no processa acima produz as seguintes somatotropinas.

í)Somatotropina bovina recombinante ( ΗΟ_.ΕΕ:Η^0Ή._,Ε:Η._,-0·1ξ· 163,191)

2) Somatotropina ovina recombinante (HCuSCH^CH^CH^-Cis 163,191)

3) Somatotropina de cavalo recombinante (HO-.SCH^CH^CFL.-Cis 183,191)

4) Somatotropina humana recombinante (H0^SCH_oCH_oCH^-Cis 184,191) ) Somatotropina aviária recombinante (HO-^SCH.-.CH.-.CH.-,—Ci s 183,191)

EXEMPLO 11

Perfis de estabilidade de somatotropinas animais recombinantes· modificadas ou derivatizadas

Preparou—se uma solução concentrada do derivado de somatotropina. animal recombinante (até 100 mg/ml) em tampão de fosfato salino pH 7,4 (NaH^,F'O_n H_0 3,45g, Na^HPO 3,5og, NaCl ·*-τ xi ... -H9,5g dissolvido em água destilada para 1000 ml). Esta foi filtrada através de uma unidade de filtração estéril Mllle:·; de 0,22pm e colocou-se quantidade de 0,1 ml em tubos. Estes foram colocados numa estufa a 455C e removidos nos intervalos de tempo necessários. Os contendos foram então diluídos com tampão de fosfato salino. Testou—se o sobrenadante quanto ao teôr em monómeros e dímeros por HPLC. Fez—se um balanço de massas,, qualquer material precipitado foi registado. Os resultados foram comparados com as c o n c en t raç3e s ί π i c i ai s e d oc u men t ad o um perfil d e es

Como alternativa um deri fraca solubilidade a pH 7,4 foi diss ado da some, to tropina tend Ivido a um pH menos preferi

Ctu .

pH (4-10)

OU.

avaliado L-oiTiO sUspfii ι Γ

3135

Fracção 3ο1úve1 ( Dí mer o)

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F racção 3 o 1 ú v e 1 (Dímero) dias F racção 3o1úve1 (D í mero) dias F racção 3o1úve1 (Dímero

Γμ3 ί Ικ( r ρ□ι Tech, rpST Tech.

( CãiTl-CiS 183-191>rpST (Cam—Cis

183.191) rpST (Cam-Cis

133.191) rpST (Cam-Ci s 183,191 )rpST ch. 93,1(17,2) 92,4(27,6) 92,0(34,9)

79,8(20,7) 81,5(18,6) 75,2(2,0)

72,3(1,0)

3(2,0)

79,7(2,2)

183,191) rpST

Disul fite 83,2(1,0) rpST i Extraído em tampão PBS. Restantes ex.traídos em CBS *85,9(29,4) 89,5 ( 31 ,0 )

73,0(3,0)

73,4(3,9) * — — Q f cr Ί ' -i. n, '

35,0(1,6)

cão

I 1' a c c =1 u ·=·u i U V e i ί u 1Π5e f- o .

Der i v a d u a r bu x ι we t i 1 ad o de rpST

Derivado metiisulfito de rpST

Derivado do ácido hidroxisuccinico de rpST d e r i v a d o c a r bamidometila d o (CAM) de rpST hn ica 1 de roST dias oo a í 5 Tί ' ·*- ί '-i * n ·-' · >1,5 (7,8) tí5, ó (5,9) (3.0) r/yç i-j η 1ti..:.

Preoarscão de mierósferas iniectáveis cari s o m a. totropin a s a n i m a 1 a d nt ί η i s r r a ç: a o ecombinarr fí preparação das novas somatotropinas animais recombi·nan tes numa gama de tamanhos adequada à incorporação em microsferas por secagem de produto vaporizado foi consequida dissolvendo o derivado de somatotropina animal recombinante em solução de hidróxido de amónio e depois adicionando as soluçoes de sais pretendidas tais como benzoato de sódio. Adicionou-se um tensoactivo como seja um copolímero de blocos de óxido de etileno e óxido de propileno e deixou-se dissolver com agitação suave constante. A solução foi então vaporizada e seca. Para esta finalidade pode-se usar um mini vaporizador secador Euchi modelo # 1 9 0 ,

Preparou-se uma mistura homogénea do ingrediente activo assim preoarado e aditivos na gordura, cãfa ou mistura de ambas

fundida e a mistura resultante foi vaporizada através de um bico de pulverizador ar/liquido equipado com uma manta de aquecimento para manter o ar que entra e a fase fundida a uma temperatura acima do ponto de fusão. As microsferas formam-se à medida que as qotículas fundidas arrefecem e são colhidas numa série de crivos na gama de tamanhos pretendida de cerca de 45 a ISO microns e qu.ardada.s até serem usadas. As micrósferas que não tinham a gama de tamanhos pretendida foram colhidas para reciclagem. Como alternativa a mistura homogénea foi passada a um disco de centrífuga e as microsferas assim formadas foram colhidas como atras ou as misturas fundidas foram arrefecidas e trituradas até à gama de tamanho médio de partículas pretendida.

As cãras e qordu.ras adequadas para serem usadas nas composiçoes deste invento tem em geral pontos de fusão superiores a 40QC. tEstas cãras são definidas como uma mistura ou composta orgânico de baixo ponto de fusão e do alto peso molecular, sólido á temperatura ambiente e geralmente semelhante em composição a.

h i d r o c a r b o n e t o s ; o u. t r o s s Classificam-se no grupo d mas uma vez que não são ρ dos na família dos plásti lència pela águ.a; textura São combustíveis e tem solúveis na maior parte água. Os tipos principais o não conter glicéridos. Alguns são ão ésteres de ácidos gordos e alcoóis. os lípidos. As cãras são termoplásticas, olímeros elevada.dos, não são consideracos.. As propriedades comum são a repelisa; não tóxicos; sem cheiro ou côr. boas propriedades dieléctricas. São dos solventes orgânicos; insolúveis em são como se segue;

t The Ccndensed Chemical Dictionarv , en cn uiCior

V a η N o s t r a n d R e i n h o 1 d F' u. b lis h e r

Na tu. r ai s

Animais (cêra de abelhas, lanolina, cêra de goma-laca, cêra de insectos chineses!.

Vegetais ícarnaufaa, candelila, bagas de loureiro, cana sacarina)

Minerais (a) Cêra.s fosseis ou terrosas (ozocerite, ceresina, cera de 1enhi te) (b) Ceras de petróleo (parafina, linha microcrístalina! (Cêra de parafina apagada ou de escala)

II. Sintéticos

1,. Polímeros de etileno e éteres-ésteres cie polióis ! Carbowa:: , sorbitol)

2« Naftalenos clorados (Halowax)

3. Tipo hidrocarbcnatos via síntese de Ficher-Tropsch

A gordura do invento pode ser definida como um éster de qlicerilo de ácidos gordos superiores tais como esteárico e palmítico. Tais ésteres e suas misturas são sólidos à temperatura ambiente e aoresentam estrutura cristalina. SSo exemplos a banha e o cebo. Não existe diferença química entre uma gordura e um óleo, a única diferença sendo as gorduras apresentarem-se sólidas â temperatura ambiente e os óleos apresentarem-se líquidos. □ termo gordura geralmente refere-se a tríg1icéridos específicamente enquanto que lípide inclui tudo..

C. . -C 1 0 c om poli η o 1

A gordura, é de preferência ácido gordo, álcool, éster, ter ou mistura deles de ácidos gordos de cadeia longa j sendo os mais preferidos mono-, di- ou triglicéridos tos predominantemente por estearatos, palmitatos, lauratos, atos, linolenatos, oleatos e resíduos ou. misturas deles.

tendo pontos de fusão superiores cerol é a. gordura mais preferida. sais lipofílicos de ácidas gordos e símil a res·„ a pysC. U tristearato de gliEm adieão são também adequados tais como estearato de· magnésio

As; mierosfsras do invento são dispersas num líquido farmacêutica e farmacológicamente aceitável para se obter uma composição de libertação prolongadas para administração parenteral. 0 veículo é um sistema aquoso tamponado ou um sistema oleoso, 0 óleo pode ser um óleo animai ou. vegetal. Um óleo preferida é uma gordura líquida de triq1icéridos neutros. Um óleo neutro é um que não contenha um ácido residual. Veículos adequados para usar nas composiçoes deste invento incluem sistemas aquosos tais como soro fisiológico tamponado; solventes orq cí Π l· C D S tais como qlicóis e alcóois; e líquidos imiscíveis em água tais como óleos, dependendo da solubilidade do ingrediente activo a ser administrado. Os resultados obtidos estão apresentados na Tabela I.

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TABELA II

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TABELA cn o

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TABELA I (Continuação) ¹ tf) o

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(3.75)

GMS 10 — ΡΟΒ(23) _estear ato o

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TABELA II (Continuação) (D μ

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ε de dietilenoglicol

EXEMPLO 13

Microsferas de ácido biliar

e.i_ xuo

Bu.c hi resUraa solução tamponada de derivado de rpST e biliar foi pulverizada e seca. num pulverizador secadof Modelo 190. Este pó de partículas finas (10 partes) fc suspenso numa solução de cloreto de metileno de materiais de revestimento (1 parte). Esta suspensão foi pulverizada e seca. As microsferas revestidas foram ressuspensas num veículo de suspensão adequada antes da injecção. Estas composições estão descritas na Tabela II. Outras somatotropinas animais recombinantes derivatizados ou modificados do presente invento, incluindo as tropinas porcina, bovina, ovina, de cavalo, humana. e recombinantes modificadas, em que a nas posiçSes 1B3 e 191 (164 e 191 para humanas) das somatotropinas animais recombinantes foram substituídas por alanina, serina, ácido glutSnico, arginina, lisina. ou similares, foram preparadas como microsferas de acordo com a descrição na Tabela soma lua. vi ár i a císteinas na ansa pequena

EXEMPLO 14

Preparação de implantes de soma.totropin<

Anima ί

Os implantes foram preparados iente da mistura homogénea moída do animal recombinante pretendido e dos pesando uma derivado de quantidade somatotrodiluentes pretendidos.

Esta mistura foi então comprimida numa, prensa gravadora entre 100 e 5000 psig num cunho cilíndrico de 3/16 ou. 1/8 de diâmetro ou. numa, prensa rotatória para comprimidos usando a punção s cunhos necessários. Os implantes assim preparados foram então revestidos

com revestimen tos biodegradáveis ou. não biodegradáveis pelos

Polímero de silicone não biodegradável

Elastómero de silicone grau límpido (lõ partes) foi misturado com o agente terapêutico (uma parte) num vidro de relógio com uma espátula. Isto foi desgaseado num excicador durante 3Õ minutos. Os implantes foram agarrados pelos extremos com pinças, rolados no polímero de silicone, colocados em folha de alumínio e incubados a 400C durante cinco horas. Um ou ambos os extremos foram removidos com uma lâmina de barbear deixando o veio do cilindro revestido.

Como a 11erna t i va os implantes foram revestidos com 207.

a 4Θ7. de um adesivo médico, vendido sob a marca registada SILAS_ (R)

TIó pela Dow Corning, o qual ιοί disperso em hexano e seco e incubado entre 40QC e 502C durante a noite antes da remoção do revestimento de um ou de ambos os extremos da base.

Processo B

Revestimentos biodegradáveis polímero ou copolímeros (uma parte) foi dissolvido em clorofórmio (três a oito partes). Cada um dos implantes foi agarrado pelos extremos com pinças, mergulhado na solução de polímero e depois o clorofórmio evaporado à temperatura ambiente. Cada implante foi revestido duas vezes. Após secagem do revestimento durante a noite à temperatura ambiente.. os extremos dos pu 1 íra«rus foram removidus com uma lâmina d« barbear, deixai ida a longo veio dc> cilindro revestido,

Formulação do implante

X derivado de

s ο iti a t o t r o p i n a	X estearato X etii- X Cera
oorcina recombinante	de maonésio celulose de castor
5Θ	5,0 45
40	— 5,0 50
v ÇÍ	5,0 75
50	0,5 3,5 46
'20	0,5 3,5 76

X d e r i v a d o	X tristearato
de rpST X colesterol	X tensoactivo de qlicerilo
(-7 hK	2 -
1b 41,5	2 41,5

X derivado	X ácido
de rpST	esteárico
50	50
20	80
Como alternativa.	rpST ou outra somatotropina animal
recombinante é misturadas com	tensoactivDS, sais tamponados b/du
preservativos numa solução	aquosa. Esta solução fa.i. então

vaporizada e seca num vaporizador secador E-!uchi Modelo 190 dando um pó com partículas de pequeno tamanho. Este pó foi então misturado e fundido com uma gordura ou cãra e moldado em implantes cilíndricos. Os implantes preparados atrás foram então revestidos com um oolímero biodeqra.dável ou um não deqradável

Uí o processo ,4 ou b.

Formulações dos implantes de rpST

7. tristearatí de q 1 iceri 1 o

7. benzoato de sódio tensoactivo

43.

2,0 1 ,5

0,15

EXEMPLO 15

Preparação de implantes usando (Cam-Lis 13-3,191) rpST e avaliação d o s referidos imoI antes oo r_d i s solução i n v i tr o

A 1,3 ml de CH._, Cl^ adicionou-se 92,4 mg de copolímero co-poli ígricolídeo/latídeo), 5,3 mg de um copolímero de blocos não iónicos de óxido de propileno e óxido de etileno comercializado pela E-:ASF Wyandottes Corp. como seja pluronic 127 que tem um peso molecular médio de 12 500,p.f. 562 e viscosidade Brook-rcr field de 3100 (cps)'^,J , 5,3 mg de 200 mesh mg (OH) „ e 74,ó mq de (Cam-Cis 133,191)rpST em pó. A mistura foi agitada, vertida sobre uma placa, de petri Larga e deixado evaporar o CH._,CL-, è temperatura ambiente e depois seca por secagem sob vácuo. 0 resíduo seco foi colhido e formados implantes cilíndricos de 1/6 de diâmetro usando uma Prensa Carver a cerca de 1000 psig. Os implantes assim formados oesam 60 a 70 mq cada e foram desionados 1-1.

Preparou.—se uma sequnda série de implantes misturando num misturador Vortex-qeni “o iqdf :êra de castor em pó (-270 mesh) e 32 mq de (Cam-Cis 183,191>rpST em pó. A mistu.ra preparada foi então usada para formar implantes cilíndricos de 1/8 de diâmetro como descrito atrás. Os sedimentos pesam 60 a 70 mq cada e foram designados 1—2.

assim

Preparou—se também uma terceira série de implantes pelos processos descritos atrás usando 96 mg de c?ra de castor de -270 mesh e 64 mq de (Cam-Cis 133,191)rPST. em pó. Os implantes cilíndricos de 1/8 de diâmetro preparados como descrito atrás pesam 60 a 70 mq e foram designados 1-3.

)s implantes assim preparados foram então sujeito?

.valiaqão de dissolução in vitro. Cada um do= imo 1an tes foi uma.

os tubo de plástico separado contendo 10 ml de solução de tampão fosfato (pH 7,4 com 0,057 de Na-acida) e tubos colocados num tabuleiro de agitação com água onde os tubos foram agitados mantendo a temperatura do banho na unidade a. 393C. Os tubos foram agitados durante um dia, depois as soluçoe;

removidas de cada tubo e analisadas quanto a rpST por HPLC e ΐ oram ,lução rejeitada. Adicionou-se nova solução tampão de cada tubo e os tubos foram agitados ainda durante mais três dias. As soluções de cada tubo foram novamente analisadas quanto a rpST por HPLC a solução novamente rejeitada. Adicionou-se novo tampão fosfato a cada tubc tubc ^:oi novamente aqitado durante três e depois analisado quanto a rpST,

Os imolantes usados nestas de!

í rm;

?stão descrio j u n t a. m ente com resultados obtidos. A solução tamoão de fosfates é NaH-,ΡΟ „ ’ HL,0 3,45a, Na.HPO, 3,55q, Nacl 9,5« dissolvido em áaua destilada até 1000 ml.

Preparação e designação de implantes rpST em Implante

Oriqem do	implante	Peso do implante	(Teoria)	mq
1-1			39,3 mq		29,23	mg
1-2			33,7 mg		23,35	mg
I -3			32,S mg		12,53	mçi
1-4			33,3 mg		12,33	mg
I -5			33,3 mq		23,72	mq
1-3			l3'£> 4 .*2 ÍTlQ		23,48	mg
		Resu1t	ados da dissolução	in vitro
Vol de		1-1	1-2 1-3	1-4	1-5	1-3
meio			Z Z	Z	Z	·/
1i bertado		Dímero	Dímero Dímero	Dímero	Dímero	D í me r o
(ml )	Dia
1 y	-	Inicial	Inicial Inicial	Inicial	Inicial	Inicial
10	1	1,59	1,134 0,435	0,499	1,305	1,570
		( bai :·: o )	(1,3Z) (baixo,	(baixo,	(bai X D)	(baixo)
			não	não
			medido	medido
10	4	0,417	0,459 0,033	0,033	0,133	0,140
		( ba i o ')	(1,77.) (baixo)	(baixo)	(baixo)	(baixo)
10	7	0,044	0,033 0,007	0,007	0,019	0,019
		( bai o ,	(baixo, (baixo,	(baixo,	(bai xo,	(baixo,
		não	não não	não	não	não
		me;d ido	medido medido	medido	medido	medido

Liber	_ i. _ _ v — i ·ζ* Έ -zí tí'	c u mulati va d e	rpST
Cumu1ativo	1-1 mais 1-2	Cu.iTiu 1 ativo

ί ί .z;	mq libertado		7 de libertado oriqinal
1	s 1 -7 --n i 1 , /		40,47
4	.16,10		55,47
	16,51	1-3 mais 1-4	56,97
1	4,92
4	5,58		44,257
7	t=- £ [= ^_i 4 vj	1-5 mais 1-6	44,817
i	X _i i		J η /
⁴v	17,26		64,
	, r-		2_ cr A. · ·'
	i X i» 4 -Σ)	EXEMPLO 16	'_· ·—! q '—X X n
	r · Γ tí j j zt! zt u =10 G	tí SOíTití cG c l^1-'” u 1Π Zs ΓΊ 1 fiVzi 1 I“tíuuiu 1 u <?Π 11-_‘
		mic roen c apsu1ad	₃
	Poli(lactíd	eo-co-g1icolídeo),	0,85g, foi dissolvido
29 „ 8q	de clorof6r m i o	e agitado com vor	tex durante 2 minutos. I

derivado de somatotropina porcina recombinante (Cam-Cis 183,191)rpST, 0,150g, que foi seca e passada através de um crivo de aço inoxidável de 25 microns foi então adicionado à solução de polímero/cIorofórmio e agitado num vortex durante 3 minutos. A

suspensão de proteína resultante foi então colocada num recipiente de fundo redondo de 50 ml tendo um agitador mecânico. A velocidade de aqit ação fui marcada 700 rpm à temperatura ambiente. Usou-se mais 3,2g de clorofórmio para lavar o recipiente inicial. Então a quantidade total de Adicionou-se em seguida, óleo de silicone um período de 8 minutos) para precipitar co1í deo).

clorofórmio é 32,95g.

(350 cs) (13,lg durante o poli(lactídeo-co-q1ί0 conteúdo do recipiente foi transferido para 1720g de heptano com agitação mecânica num balão de 4 litros. Após 3 horas, ao microsferas endurecidas foram filtradas através de uma série de crivos de ácido inoxidável e secas sob vácuo.

Estão descritos abaixo outros polímeros e solventesúteis para a microencapsulação de somatctropinas animais recombinantes modificadas em gue um ou mais dos resíduos do aminoácido císteina nas posições 55, lóó, 183 ou 191 da somatotropina animal recombinante foi substituído por um resíduo de aminoácido diferente ou de um recombinante derivatizado em que uma ou ambas as pontes dissulfureto entre as císteinas nas posições 55 e lóó ou entre as posições 183 e

191 foi reduzida e derivatizada tos

As abrevii a ba. i χ o s ãc :

; tUTi usadas ns

.staqem de ;cr i

A = como amostra polimerizada

B = amostra reprecipitada g 1 i = g Ι ico1ídeo lact = la.ctídeo capro = capralactona

TMC = carbonato de trimetileno PHB = poli-hidroxibutirato

F'Hv -- pol i-hidroxivalerato

PEQ - óxido de polietileno

C Λ

Ρο 11 rneros ώt e i s na microenc-apsulaçãg de somatotropina anima 1 recombinante modificada e derivatizada

Ν i 11 i ι omposipSes

F'o 1 í mero	(	□O 1 Vf	-nte)		( peso 7.)
G1y/dl-lactide	0	. A , .jõ	(HFIP)		.·, -r , , , -A 4ó , ò / ·_^?ό « 4
Gly/dl-lactide	0		(HFIP)		42,4/57,4^A
Gly/dl-lactide	θ	,63^tí	(HFIP)		43,3/56,7^B
61y/d 1-1ac tide	0	,66^B	(HFIP)		41,2/58,B^B
Gly/dl-lactide	0	,61^fi	(HFIP)		41,6&5B,4^A
61y/d1-1actide	0		(HFIP)		41,5/58,5^B
Gly/dl-lactide	0	, 26^B	(HFIP)		40,6/59,4^B
Gly/dl-lactide	0	,27^B	(HFIP)		40,7/59,3^B
G1y/L-Iac t	0	_,B «<	(CHCl^	'}	H 48/52
d 1 -1ac t	0	, 46®	(HF IP)		100^B
dl~lêCt	0	π-τΒ , a /	(HFIP)		, - -B i y 0
PHB		,92^fl	(HFAS)		100^A
PHB/HV	7,	._.,^A !» *- ^z	(HFAS )		70/30^A
Capro/1-1ac t	0	,45^A	(CHC1 _	>	_ . , .A y 4 .« o / 1 -i 5 4·
Capro/1 — 1ac t	0	Λ ‘ ^A 4 MD	(CHC1-,	)	84,0/1 6,0^r'
Capro/1-1ac t	0	,ol^A	(CHC1	)	85,2/14,8^A
Capro/1-lact	0	, 50^H	(CHCU	)	84,4/15,Ó^A
C a ρ ro/1 — 1 a c t		n ·-' >	<CHC1_,	)	85,1/14,9^A
Capro/1-1ac t	0	,36^A	(CHCU	)	86 ,1/13,9¹'’
Capro/1-1act	0	,3.^E	(CHC1-.	)	11,4/83,6®
Capro/g1y	0	,34^A	(CHC1-.	)	84,0/16,0^A
gly/PEO 8,000/TMC	0		(CHC1	)	50,3/8,4/41,
gly/PEO S,000/TMC	0	,38^EI	(CHC1,	)	58,2/4,8/37,
gly/dl-lactide/	0	, -·_ι	(CHC1	)	35,8/54,4/9,
PEO 8,000 1-lact/TMC	0	,26®	(CHC1_	)	85,4/14,6®
	0	M X-·-'	(CHCU	)	69/31^B

B

coma amostra polimerizada amostra reprecipitada

EXEMPLO 17

Método do toste de ratos hvpo'.·; para determinação do aumento de crescimento de animais que receberam somatotropina animal recombinante modificada ou derivatizada

A eficácia de várias somatotropinas animais recombinantes modificadas (substituídas) ou derivatizadas do presente invento na alteração da velocidade de crescimento de animais foi determinada utilizando um ensaio em ratos a que se removeu a hipófise (hypox). Os ratos sem hipófise não produzem a sua própria hormona de crescimento e são sensíveis â hormona de crescimento bovina injectada. A resposta medida é o crescimento ao longo de um, certo período de tempo, como eja 10 dias.

Cada um dos ratos albinos hypox (Taconio Farms, derivados de Spraque Dawley) foi injectado com uma quantidade suficiente de composiçSes preparadas no Exemplo XX para dar uma dose de 10 dias de B00 microgramas (B0 microgramas/dia) de hormona de crescimento porcina em 0,2 ml de formulação da lista. Como alternativa, cada um dos ratos albinos hypo:·: foi injectado diáriamente com 30 microgramas de derivado da hormona de crescimento porcina.

Processo do Teste

Antes do teste os animais foram pesados e os animais a serem usados no teste foram seleccionados com base no peso do corpo. Apenas foram seleccionados os animais cujo peso apresentam

um desvio padrão de un: do peso médio do grupo. 0 gru.po resultante foi então dividido ao acaso em grupos de tratamento consistindo em oito ratos/grupo através de um processo casualista obtido num computador. Os animais do teste foram então transferidos para, uma gaiola limpa, e guardados quatro ratos/gaiola. No primeiro dia do estudo os animais do teste foram pesados e quaisquer animais com ganho ou perda. de peso excessivo ( h— 5 gramas) foram substituídos. Os animais foram distribuídos por grupos de teste e tratados .

No final do período do teste de dez dias, o ganho total de peso de cada animal foi registado e determinado o ganho médio de peso para cada tratamento. Os resultados destas experiências

que estão resumidos na. dade destes derivados,.	Tabela	XX abai	xo demonstram a	bioact
Resultados de Ratos Hvoox
	c res	cimento g
d e r i v a d o	y-2	2-4	4-7	7-10	to ta 1
	ó 1 õt S	dias	d i Ξ·: S	d 1 8.5
rpST	7,5	5,6	3 ₅ 3	10, 1	30
(Cam-Cis 183,191)rpST	/ Cj	£=· ~T ·_? r\| ·_'	cj i, f	Ο η H	^>í~i ~T -Í.V , /
(Sulfato-Cis 183,191)
rpST	ry -t >i 7	4 η S	11,1	8,1	T Έ Q
(Ala 183,191)rpST	7,1	6,3	Q I	6,5	29,2
( SCH-.—Cis 183,191) rpST	7,0	u, 4	6,9	9,5	29,8
(S~CH_oC00~~Cis 183,191
rpST	5,9	5,6	9,1	“7 O / , *7	28,5
( S-CH-,CH-,CH-,SQ,-~Cis
183,191)rpST	6,9	5,3	6 χ B	P n ⁷ ? -	2 o, y

onstrani que cada uma das dificadas ou derivatizaproporciona um crescimen-

Os resultados apresentados der totropinas porcinas recombinantes mc avafiadas é biológicamente activa e to excelente de animais.

EXEMPLO 18

M V cl Λ .1 i ;ãd carcaça de porcos que receberam somatotropina porcina recombinante derivatizada

Mantiveram-se os porc peso inicial dos porcos foi de foram abatidos com um peso vivo base da orelha das composições período de ajustamento de 4 dia a ração convencional Cy Hoq a s em compartimentos separados.. 0 apro ;·: i m a d a m e n t e ά O kg. O s ρ o r c o s médio de 1ΘΘ kg. As injecçóes na.

testar for	a m i	niciados após	u m
Os porcos	f >_i r m a 1 i men t =sd uí	com
libitum e	áqua	foi também c	dada

;1 tum.

crescimento foi determinado semana 1mente. Registaram~se os seguintes dados: aumenta média diário, ingestão de alimentos média diária e eficácia da alimentação.

Após um aumento de aproximadamente 40 kg os porcos foram abatidos e avaliada a carcaça. Na altura do abate colheram—se os seguintes dados: peso da carcaça quente, peso de semitendi nose, pesos de orgãos- (fígado, rim, coração) e peso da folha de gordura. Após 24 horas de arrefecimento registaram-se as seguintes medições: comprimento da carcaça, profundidade da gordura, das castas (primeira costela, última costela, última vértebra lombar, profundidade a três quartos na décima costela, P-2), espessura do .entre, área de janela do lombo, côr, firmeza, marmoreado e c 1 a s s i f i c a c ã o d o m ú s c u 1 o .

Nesta avaliação um controle negativo recebe uma. injec— diária de soro fisiológico, CAM-rPST é (Cam-Cis 183,191) rpST d e s c r i. t ο η o t x emolo atrás e o controle positivo recebi Γ nativo.

uma

AVALIAÇÃO DA CARCAçA - (Cam-Cis 133,191)rPST

Sais porcos por tratamento foram mantidos em compartimento individuais e administrado o respectivo tratamento desde 44 até 94 kg de peso vivo. Ds dados sobre crescimento e carcaça estão apresentados abaixo juntamente com os cálculos da eficácia relativa.

Eifeitos· de Carbamidometi 1-rpST (Cam-rpST) no Crescimento e Caracteristicas da Carcaça de Porcas Desenvolvidos (Método d os Μ ί n i mos Guad rados)

Critéria

Neq Con t

CAM-rpST

Pos Con t

Aumento diário médio, kg Ingestão de alimentas diária média, kg Aumen to/A 1i mento ,07 3,03 , U--J

Fígado, q

Folha de gordura.

Gordura das costasna décima costela, cm Gordura das costas P-2, cm Peso de semitendinose, g Área da janela do lombo, cm

172Ó

,90

1892,8 2085.5

765,5 5ó3,3

2,00 1,88

1,50 1,45

EXEMPLO 19 perièncía de equilíbric azoic , L a m L i s 1 υ -Z¹·, 19 rp;

Os porcos foram estabulados- indivídua lmente em gaiolas metabólicas de ácido inoxidável. Iniciaram—se as injecçoes na base da orelha, guando os porcos foram colocados nas gaiolas. Os porcos foram deixados assim durante um periodo de cinco dias para se adaptarem ao novo ambiente. Durante este período, a ingestão de alimentos foi controlada e ajustada de modo a todos os porcos consumirem a mesma, quantidade de alimento diáriamente (ração Cy Hog, 137. de proteina bruta). A colheita de fezes e urina começa, após pelo menos três dias de ingestão constante. Diáriamente foram dadas duas quantidades iguais de alimenta e foi dada água ad libitum..

urina totais foram colhidas durante :inco manhãs ). Para reduzir a oerda dias ( colheitas feitas todas as de 1'-ΐ , adicionou-se 35 ml de óN H em plástica no .início da fase d cada colheita diária. Tomou-se possível perda de urina. A uri volume constante que se registou nos volumes (50 ml), marcada e c —se as fezes diáriamente, colocaram-se err

os ds colheita	de urina
d a e >: ρ e r i ê n c i a	e a. oós
para evitar	q u a I q u e r
a foi d i1uí da	para u.m
distribuída por	peque-
té á aná1ise. C	o1heram-
em sacos de	plástico

marcados e congelaram-se até à análise. Também se colheram, pesaram e congelaram orts. Pequenas mostras de alimento foram retiradas diáriamente, congeladas e reunidas antes da análise.

As amostras de alimento e de fezes foram secas durante a noite a 1DD2C (ou durante mais tempo a uma temperatura mais baixa). As amostras de alimento e fezes foram trituradas num

moinho Wiley e deixadas dois dias a equilibrar com o ar. Deterrainou-se a matéria seca e o teôr em N dos alimentos e fezes. Todas as amostras processo de foram analisadas quanto ao teôr em azoto usando

K ieldahl automati zado.

A urina. foi analisada e determinada a excreção total diária, de azoto da urina. Exceptuando para a urina, todos os valores de N foram expressos numa base d e ma tér i a seca.

Os pesos dos porcos foram registados no primeiro dia da adaptação, no primeiro dia da colheita e no fim da fase de colheita. Isto assegura que os porcos estão num equilíbrio de energia positivo.

Eauiiíbrio de )tc

A avaliação de CAM-rPST num estudo de equilíbrio de azoto envolveu um total de 12 porcos em crescimento em três tratamentos: 1, testemunha negativa (injecção diária de soro tisiolóqico) ; 2, CAM-rFtíT, 3 mq/d

3, testemunha positiva.

'nativo. As fezes e urina foram colhidas durante sete dias apôs um período de adaptação de duas semanas. Os resultados e cálculos de actividade relativa são os sequintes:

Efeitos de carbamidometi 1—rpST (tam-rpbT) e de PôT 'Nativa, no Equilíbrio de Azoto de Porcos em Crescimento.

>st. Po;

ι_.γϊ. υ=πο , Neg

1Μ— rpS

Ingestão de azoto, g/d	4 i , 86	41 .30	41 ,
L;; c reç ão d e a z o to,
q/d fezes	cr cr ,_t _B .··	-< n 1	4,	O·-'
urina	23,06	10,74	·! cr i ,	12
Azoto adsorvido, g/d	3ó, ó 1	6, 15	~T_t*7 ¹ !»	18
Digestibi1 idade de	37,46	87,43	.—«m CIO «,	33
azoto %
Retenção de azoto, g/d	·< τ cr _ 1 ·_' q	19,41	o	06
Aumento diário médio, g	323 _v ó	383,9	401 ,	8

Ι-ΡΞΤ =

133,191)rPST

EXEMPLO 20 i- reparação pasta usando ÍCam-Cis 133 , .191 ) r pST (Câdi-Lis 183 , 191 ) rpST contendo benzoato ds sódio (7% p/p) e um cooolímero de blocos de

Preparou	~ΞΈ	uma	mistura	ds
benzoato	ds sá	dis	(7% p/p) e	um
etileno e	6x i d	n d s	propi1eno	( O

vaporização descrito

Sifi pi lo 13,

so1uç ão	em	agi tação
mistura	de	4/1 p/p !
e capró	ICO	(Miglyol
302CA	m i s	tura foi

(R)

Η a

A mistura assim preparada (7,2o g) foi adicionada a uma de tristearato de qlicerilo (19,5 q) numa.

813 > 7 óleo de soja (71 ml), entre 752C e depois foi arrefecida. A composição resultante que é constituínuma base de peso por: (Cam-Cis 133,,191) rpST benzoato ri ra e sódio 0,15%, tensoactivo (copolímero de bloco) 0,03% e veículo foi almente administrada a animais por ínjeLçãO subcutânea, sob a pele dos referidos animais na região da cabeça ->u do ρescoço „ : XEMPLO

ΞΙ

Preparação de uma formulação de gel injectàvei e viscosa contendo (Ala-Cis 183,191)rpST

A 140q de óleo de soja super-refinado num adicionou-se 12g de monostearato de alumínio. A agitada até estar uniforme e aquecida durante 30 copo graduado mistura foi minutos até aproximadamente 1402C, quando se dá a solubilização aparente do monostearato no óleo de soja. D copo foi removido do aquecimento e deixado arrefecer até aproximadamente 6Ô2C. (Ala—Cis 183,191)— rpST seca por vaporização (2,óóg) foi então adicionada comi agitação para produzir uma suspensão homogeneamente distribuída. A mistura viscosa foi usada para encher seringas descartáveis de 3y ml. 0 volume usado para encher cada seringa foi de 20ml, o qual contem 350 mg de (Ala-Cis Í83,191)rpST. Após introdução do gel nas seringas a composição tornou-se cremosa, rígida mas extrudível. As seringas cheias foram então guardadas num frigorífico antes de serem usadas.

EXEMPLO

Prepa:

pasta usando (Ala183.191)roST óleo de sésamo (4,lBg) e Gelucine 46/07 (Catt1efosse— -0,74 g) foram misturados num recipiente de vidro usando uma barra de agitação. Isto foi então aquecido até 652C com agitação até à homogeneidade. Removeu—se a barra magnética e adicionou.-se 0,052q de Ala-Cis 183,191 rPST para, se conseguir a formulação.

EXEMPLO 23 e res p e c t i v a. pasta

Ala-Cis 153,191 rPST foi dissolvido numa solução de 0,09M TRIS a 21,5 mg de rF'ST por ml, 402C e pH 9,5. Isto foi convertido no sal de zinco pela adição de lr! 2nCl_, com agitação. 0 sal de zinco precipita. Foi recuperado por centrifugação a 10,,000 :< q durante 30 min. , mantendo a solução a 40QC. Esta foi liofi lizada para dar ο ρό. A 140 g de óleo de sésamo, num copo qraduado adicionou-se 12q de monostearato de alumínio. 0 conteúdo foi aquecido a 1552C com agitação (até o monostearato estar dissolvido). 0 copo foi removido do aquecimento e deixado arrefecer. Quando do arrefecimento a solução passa a gel. □ gel foi introduzido num moinho de bolas (equipado com um agitador de altas forçais tangenciais e bolas de aço inoxidável. Aplicou-se vácuo ao moinho e o pó de zinco foi adicionado lentamente até a composição conter 407. do pó de zinco. A agitação continuou até o diâmetro médio do pó de zinco estar reduzido a menos de 10 microns. As bolas de aço foram removidas do gel que foi colocado em seringas.

As estirpes de DNA referidas atrás foram depositadas na ATCC em 23 de Agosto, 19SS. Elas foram mpllpSTE34 (ATCC número 40452), pR0211 (ATCC número 40483) e pig24 (ATCC número 40484). Como é óbvio para os familiarizados com a matéria estes DNAs podem ser inseridos em qualquer sistema cie expressão adequado para se obter as somatotropinas do invento ou mutações delas.

As estirpes bacterianas de E. coli K12 expressando algumas das novas somatotropinas animais do presente invento foram também depositadas na ATCC em 23 de Agosto de Í9SS. As bacteriana;

γί ú m e r o 67762 ) (ATCC número número 67766) (ATCC número n ú mero 6777< ύ ') (ATCC número número 67774).

estirpe , 1655/pRO pS7 A34 (ATCC n úmero 67 67764), 1655/pROpST (ATCC número , 4200/pRDpSTA34 (ATCC número 67 67763), 420/pROpST (ATTC número , 4255/pR0pSTA34 (ATCC número 67 67772), 4255/pROpST (ATCC número

Ε, o o 1i 1655 (ATCC

763), 1655/pRDpSTE34

67765), 42ÕÕ (ATCC 767), 4200ípR0s5TE34

67763), 4255 (ATCC 771), 4 255/pROpSTE34

67773) e 4300(ATCC

Eliminação das císteinas na ponte dissu 1 f u.reto da ansa pequena, u. s ando dois o 1 iqon uc 1 e otí de o s s i n t é t i c o s

Um oligonucleotideo sintético designado Cltí3 del tem ;a seguinte sequencia:

5' CGG cTC ATG AAG AGA CcC TTC GTG GAG c'

Este oligonuc1eótideo difere da sequência de DNA análoga do gene rpST em dois aspectos. Primeiro o DNA codificador do codão da cisteina na. posição 133 foi removido do oligonucleotídeo. Segundo, o DNA codificador do codão da arqinina na posição 134 foi mudado de CGC para AGA no oligonucleotideo, o último dos quais também codifica arqinina. Assim, a cisteina presente na. posição 133 foi eliminada.

DNA de cadeia simples de pGEM-3z(f+)pST-SX foi os substrato da mutagénese. Este DNA é composto por um gene rpST modificado contido no fagemídeo pGE'M-3z(f + ) adquirido comercial— mer

A modificação do gene rpST resulta na alteração da sequênnas cia de DNA para permitir a introdução de um sítio de clivagem para a endonuclsase de restrição Sac I nas posiçSes 225—230 da

6j li tio de clivagem com -a e 285-290. Estas região codificadora e a introdução de um =··'+·ΐ endonu.clea.se de restrição Xba I nas i a 11 e r a ç 5 e s n a s e q u á nc i ·· eidos da. proteína. rpST. Um fragmento ECORI/HindIII clivado com estas endonucleases de restrição usando processos convencionais resultou no faoemídeo pGEM—3s ( f + ) pST-SX.. 0 DNA de cadeia simples da pbt.M—3z(f+) foi preparado a. partir dos tagos purificados por protocolos convencionais. SOOOnq deste DNA foi misturado com 100ng do o 1iqonucleotídeo C-133 del, este tendo sido préviamente seu extremo :om trifosfa.to 5 ' de adenosina

X. — 4 \/ .i.

LU I Λ L=

- A SOÍ^-' f o s τ o r i 1 a. d ο η o pol ínucleoti.dea^-cinase. A mistura está contida num volume total de lb μ 1 em tampão de empareihamento IX. (tampão de emparelhamen75 mM KCl e 5ιτιΙ·Ί Tris-Cl, pH 3,0).. A mistura foi aquecida durante 7 minutos seguido de uma incubação de 10 minutos â temperatura ambiente. Este processo permite qu.e o oliqonucleo— tídeo emparelhe com o DNA substrato de cadeia, simples. As moléculas emparelhadas foram convertidas em DNA de cadeia dupla cova— lentemente fechada através da adição de 22 μΐ de Η._,, μΐ de 2'0mM ATP, 2 unidades de DNA~liga.se de T4 e de DNA polimera.se I, (para, a definição de unidade ver catálogo da New 193ó), 2 μΐ de 20X dNTF’'s (uma mistura dos 5' de desoxirribonuc leotídeo cada um numa.

fragmento grande England Biolabs, quatro trifosfatos ncentracão de 2mM) e 4 μ 1 de tampão de preenchimento 10X (tampão de preenchimento IX mM Tri s-u 1 pH 7,5, mM

MqUl2, 2mM

DTT). Após uma hora de incubação à temperatura ambien· metabe aa reacção foi introduzida :élulas competente?

HB101 seguindo um protocolo de transformação convencional. Após inc uoaçSo durant e noi

372C as colónias foram transferidas para filtros de nitroceluloss e processadas para hibridaçâo e deteção da mutação pretendida por radiornarcação do seu extremo 5 com gama--32P—ATp e o 1iqonuc1eotideo—cinase. Após uma pré—híbritres horas a. 372U em 5X iharc s 150 pg/iTil do tRNA levedura, adicionou—se o o1iqonuc1eotídeo marcado

Preparou-se DNA hibrida com a rac ioac ti vamen te e deixou-se hibridar durante a. noite a 3/90. L) filtros foram lavados durante 30 minutos a 372C em 5'X S-Sc seguido de uma lavagem de 30 minutos em TAC a ól,5°C. Duranti esta última lavagem, apenas as colónias cujo DNA de plasmídei contem a mutação pretendida continuarão a hibridar com a sond, oligonucleótidica marcada radioactivamente. Estas colónias forai detectadas após exposição dos filtros lavados a filme de raios X Preparou-se DNA de plasmideo a partir de várias destas colónia: partindo da placa de petri original, introduziu-se em célula; competentes HB101 como descrito anteriormente e fez-se novi despiste com o o 1ioonuc1eotideo sendo marcado radioactivamente de plasmideo a partir de colónias cujo DM< sonda e analisou—se quanto à presença do DNí pretendido. Todos os clones analisados contem a mutação C183 del 0 DNA de plasmideo de um clone, designado pGEM~3z ( f + > pST—SXC18·’ del, foi introduzido em células competentes JM101 por transformação e preparado DNA de cadeia simples a partir dos fagos purificados derivados de um único transformante.

Para eliminar o DNA codificador de cisteina na posiç.ãí 191, sintetizou-se o oligonucleotídeo que se segue, designadt C;191 del:

5' TTC GTG GAG ASC TC6 TTC TAG TTG 3'

DNA análogo

Este oligonucleotídeo difere do rpST em dois aspectos. Primeiro, o DNA cisteina na posição 191 foi eliminado Segundo, o DMA codificador deserina na posição 190 foi alteradc de ABC para TCG no oligonucleotídeo, este último também codific;

ificador no qen« do codãc no o1ioonuc1eotideo

□ DMA molde de cadeia simples de pGh.M-3z ( f + ) pST-SXC133 o oiiqonucleotídeo C191 del foram emparelhados, prolcnqados .btufa fui intruduzid;m células competentes- HA 101 e os quanto à presença da mutação ex transformantes foram analisados t a. iii e n t e c o m o d e sc ri t ο ρ a r a u 13 3 del. 0 oliqonucleotídeo 3191 del foi usado como sonda de deteção marcada radioactivamente. As condiçoes de hibridação e de lavagem foram exactamente como descrito para C133 del. Foram identificados lones contendo a mutação C191 del a partir da análise da sequência de uNA de plasmídeo contendo as deleçSes C1B3 e C191 foi designado pGEM-uz-(f+)-p3T-SXC133, 191 del.

Claims

ΓνΐV I ND IC AuΰΞS lâ. - Processo para a preparação de somatotropina recombinante animais caracterizado por menos um dos quatro resíduos do amino ácido císteina. na referida somatotropina animal recombinante ser substituído, modificado, eliminado ou derivatiz ado.
2â.. - Processo de acordo com a reivindicaç terizado por se preparar somatotropina recombinant c|ue das quatro (4) císteinas, duas na ansa pequena e grande, pelo menos uma. (1) foi substituída. pelos indιviduaIments seleccionados entre arqinina, li aspártico, ácido glutãmico, asparagina, alanina, qlicina, isoleucina, leucina.

q lutamina vali n a, triptofano, tirosina, metionina, treonina ou prolina ão 1, carace animal, em duas na ansa aminoác idos sina, ácido , h :i. s t i d i n a , fen i1 a1an ina ,
3á. — Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar somatotropina recombinante animal, em que das quatro (4) císteinas, duas nat ansa pequena e duas nat ansa grande, pelo menos uma (1) foi eliminada.
4â„ - Processo de acordo com terizado por se preparar somatotropina das quatro císteinas foram modificadas a reivindicação 1, recombinante animal para ácido císteico caracem que
5â. - Processa de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ss preparar somatotropina recombinante animal, em que as duas (2) císteinas na ansa pequena ou as duas (2) císteinas na ansa grande ou as quatro (4) císteinas em ambas as ansas foram derivatizadas com substituintes seleccionados entre (CH^COOH),

ECH(CO^H) (OL·} CO^Hl ( CH.-.CONR-.R , > , ^3 -j·

E(CH_,>_SO ,3, (CHCH„CONR,CO> , E(CH^) NR,R,3 S ! I '-· j' O iTl O 4

(RR . ) ; R-. e R,„ são cada um H, ΕΓ.ϋΗ. , , . CO..,H3 ? L alquil c — 1 , facultativament 0 e substituí do n i d r 0 x 110 ou po1i e t i1enoq1i c 01 ; R,_ é alqui I — meti 1 0 e R, o é a1quilo C,-C,, po1ieti1enoq I ic tativa men te substituído com um ou dois g ru ρos co ou de ác i d 0 su1fónico; π é um inteiro a

, (CH^OCOCH_,R,_) ou

X Z. _f

CH(CO^H)(CH_o)_wCD^H3, com d a 2 qrupos

C,-C, alcoxi (C.-C.)1 ó 14 ol ou fenilo f ac li 1d e ácido c a r boχ ί 1 i -

inteiro entre 2 e 4; e x é um in tei ro en t r qUaΠd0 u resí dU.O- do z ;T: 11 ·;0ái_ I.d0 c í s te m -a da. pina recombinante animal se j am der i va. t i z ad os- de cisteina na ansa mais pequena ou ambos os ansa qrande da. referida somatot rDpi na. se j am

ntre 0 e e 1 e á referida

4 ; m é u 1 Ti desde que somatotro— , ambos os resíduos resíduos cisteina na substit u í dos c om o mesmo grupo; uesde que também os substituin 3íiiinoécido cisteina na ansa mais pequena, po substituintes ou substituintes diferentes resíduos do aminoácido cisteina na ansa s o m a t o t r ο ρ i n a .

tes nos resíduos do ssam ser os mesmos d o s ρ resentes η o s qrande da referida
6ê. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar somatotropina recombinante animal ivoditicada, em que a. referida somatotrooina animal é
7s. - Processo de acordo com a reivindicação 5, ca terizado por se preparar somatotropina recoisbi que a referida somatotropina recombinante animal n tí ο ο m a t o t r o p i n <

rtf_r,mbin_£ ρο rei na

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Alã-Met-Pro-Leu-Ser-SerLeu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-Leu His-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-Tyr-Lys-Glu-Phe-Glu Arg-Ala-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile

Gln-Asn-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe-Rj-Phe-Ser-Glu-ThrIle-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Glu-Ala-Gln-Gln

Àrg-Ser-Asp-Val-Glu-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser-Leu-Leu

Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Val-Gln-Phe-LeuSer-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-ThrSer-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-GluGlu-Gly-Ile-Gln-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-AspGly-Ser-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lye-Gln-ThrTyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Leu-Arg-Sex—Asp-Asp166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-R_2a-PheLyε-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Ala-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg183 191

Val-Met-Lys-R₁-Arg-Arg-Phe-Val-Glu-Ser-Ser-R_laAla-Phe-OH.

Soma, totrouins ret i b i n a n t e b o v i n a

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Leu-Ser-GlyLeu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-Leu His-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-Phe-Lys-Glu-Phe-Glu Arg-Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile

Gln-Asn-Thr-Gln-Val-Ala-Phe-R₂-Phe-Ser-Glu-ThrIle-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asn-Glu-Ala-Gln-Gln Lys-Ser-Asp-Leu-Glu-Leu-Leu-Arg-Ile-Ser-Leu-Leu Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Leu-Gln-Phe-Leu Ser-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-Thr Ser-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Glu Glu-Gly-Ile-Leu-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-Asp Gly-Thr-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-Thr Tyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Met-Arg-Ser-Asp-Asp

166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-R_2a-Phe

Arg-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Thr-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg

183 191

Vai-Met-Lys-R₁-Arg-Arg-Phe-Gly-Glu-Ala-Ser-R_lftÀla-Phe-OH.

Somatotropina. recombinante ovina

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Leu-Ser-GlyLeu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-LeuHis-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-Phe-Lys-Glu-Phe-GluArg-Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile• 55

Gln-Asn-Thr-Gln-Val-Ala-Phe-Rj-Phe-Ser-Glu-ThrIle-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Glu-Ala-Gln-GlnLys-Ser-Asp-Leu-Glu-Leu-Leu-Arg-Ile-Ser-Leu-LeuLeu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Leu-Gln-Phe-LeuSer-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-ThrSer-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-GluGlu-Gly-Ile-Leu-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-AspVal-Thr-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-ThrTyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Met-Arg-Ser-Asp-Àsp166

Ala- Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-R_2a~PheArg-Lys-Asp-Leu-His-Lye-Thr-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg183 191

Val-Met-Lys-R₁-Arg-Arg-Phe-Gly-Glu-Ala-Ser-R_laAla-Phe-OH.

-omatott opina recombinante de va 1 o

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Wet-Pro-Leu-Ser-SerLeu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-LeuHis-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-Tyr-Lys-Glu-Phe-GluArg-Ala-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile55

Gln-Asn-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe-Rj-Phe-Ser-Glu-ThrIle-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Aep-Glu-Ala-Gln-GlnArg-Ser-Asp-Met-Glu-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser-Leu-LeuLeu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Val-Gln-Leu-LeuSer-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-ThrSer-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Arg-Asp-Leu-GluGlu-Gly-Ile-Gln-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-AspGly-Ser-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-ThrTyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Leu-Arg-Ser-Asp-Asp166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-IÀu-Ser-R_2a-PheLys-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Ala-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg183 . 191

Vai-Met-Lys-R^-Arg-Arg-Phe-Val-Glu-Ser-Ser-R^_aAla-Phe-OH.

Somatotropína recombinante humacc

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Thr-Ile-Pro-Leu-Ser-ArgLeu-Phe-Asp-Asn-Ala-Met-Leu-Arg-Ala-His-Arg-LeuHis-Gln-Leu-Ala-Phe-Asp-Thr-Tyr-Gln-Glu-Phe-GluGlu-Ala-Tyr-Ile-Pro-Lys-Glu-Gln-Lys-Tyr-Ser-Phe56

Leu-Gln-Asn-Pro-Gln-Thr-Ser-Leu-R₂-Phe-Ser-GluSer-Ile-Pro-Thr-Pro-Ser-Asn-Arg-Glu-Glu-Thr-GlnGln-Lys-Ser-Asn-Leu-Glu-Leu-Leu-Arg-Ile-Ser-LeuLeu-Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Glu-Pro-Val-Gln-PheLeu-Arg-Sei—Val-Phe-Ala-Asn-Ser-Leu-Val-Tyr-GlyAla-Ser-Asp-Ser-Asn-Val-Tyr-Asp-Leu-Leu-Lys-AspLeu-Glu-Glu-Gly-Ile-Gln-Thr-Leu-Met-Gly-Arg-LeuGlu-Asp-Gly-Ser-Pro-Arg-Thr-Gly-Gln-Ile-Phe-LysGln-Thr-Tyr-Ser-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Ser-His-AsnAsp-Asp-Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Tyr167

R_2a-Phe-Arg-Lys-Asp-Met-Asp-Lys-Val-Glu-Thr-Phe184

Leu-Arg-Ile-Val-Gln-R^-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser191

R_la-Gly-Phe-OH.

Somatotropina recorabinante

á. r i a

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Pro-Leu-Ser-AsnLeu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-Leu

His-Leu-Leu-Ala-Ala-Gln-Thr-Tyr-Lys-Glu-Phe-Glu·

Arg-Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Asp-Gln-Arg-Tyr-Thr-Asn

Lys-Asn-Ser-Gln-Ala-Ala-Tyr-Rj-Phe-Ser-Glu-ThrIle-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Asp-Ala-Gln-Gln Lys-Ser-Asp-Met-Gly-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser-Leu-Val Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Thr-Pro-Val-Gln-Tyr-Leu Ser-Lys-Val-Phe-Thr-Asn-Asn-Leu-Val-Phe-Gly-Thr Ser-Asp-Arg-Val-Phe-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-Glu Glu-Gly-Ile-Gln-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-Asp Arg-Ser-Pro-Arg-Gly-Pro-Gln-Leu-Leu-Arg-Pro-Thr Ty r - Asp - Ly s - Phe - Asp -1 le-Hi s - Leu-Ar g-Asn-G lu-Asp

166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-R_2a-Phe

Lys-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Val-Glu-Thr-Tyr-Leu-Lys

183 191

Val-Met-Lye-R₁-Arg-Arg-Phe-Gly-Glu-Ser-Aan-R_laThr-Ile-OH.

onde R, e R, são Cis, Cis(CH-CQOH), CisCuH ( CC_H ) ( L-H_ 5 Cu.-Hl , C.i.s llã a' a 7. a (CH_CONR-R , ) , CisíR' ), Cis(CH->_SO-, Cis ( CHCH-CONR^CO ) , Cisa õ 4 o a 11 ú · a ú (CH- > NR-^R, Cis (CH-OCOCH-R-) ou CisíS6>; R._, e R-_ são Cis , Cis < CH-COOH ) , CisCCHÍCO-H) (CH-) _>;CO-H1 , Cis (CH-CONR-R^ > , C.is(R-),

Cis(CH-) SO Cis(CHCH-CONR-CO), Cis(CH-) NR-R,, Cis(CH-OCOH-R^>

□u. u;

S · ό 4 <CH_> CO-Hj, alouilo 0 são L?.diS um H, C í CH—) CO—Hj

Ci

ΣΟ.'Η)facultativamente substituído com Ô grupos alcoxi

1 “6 hidroxilo ou po 1 ieti 1 enog 1 icol , _ ·_< I o (C,—C,)meti1 d e R. alquilo C,-C,; ρα1ieti1enoq1ico1, 14 o 1 £j ’ fenilo facultativamente substituído

-u..

ou com um ou doi:

rupos de ãcido carboxί1ico cu ácido sulfónico; 0 e 4; e m é um inteiro entre 2 e 4; e é ai ι l

1 e π é um inteiro um inteiro entre desde que quando R^ e R sejam Cis, R, e R- devem xi a representar uma Lis derivatizada; e quando R- e R-_ forem Cis, R, e R, deve representar ι a xití 1 uma Cis derivatizada desde que também quando R, e R, ou R- e R-, representarem Cis, se forme uma ponte

1 la dissulfureto entr;

ouas f une õf

Cis representadas pelos 'feridos R, e R, ou referidos R_ e R_ , 11a ã ã a que R,

do ΠΑ? j'^- A R la q a do por a ^R1 1 a

são Cis (R-) ; R,

Cis

- Processo de acordo com a reivindicação 7, caracse preparar somatotropina recombinante animal, em são CisíCH-OOH) e R— e R,_. são Cis.

i_ a r au itotropina recombinante animal, em é C.-C, ou alcoxi C-C,-meti lo e filó 14 a

10C„ de acordo :om caracterizado por se preparar somatotropina recombinante animal ‘Ί la. substituído com ; ã i j C â s ( S R . cerca de alquilo C,-C. facultativamente lo qrupoí hidroxilo, propileno qlicol, fenilo ou fenilo facul ta. tivamen te substituído com ou dois substituintes de ácido carboxί 1 ico ou ácido sulfónico e R_n e R.-,_ s S o C .i s .

115. — PrDLK==u de aLurdu luíti a. rsivmdicaçau 7 caracterizado por se preparar somatotropina recombinante animal em que F2 e R„ são Cis(CH_ 30 : n é um inteiro entre 1 e 4 ι ón

R._ e R._,

1 i a :·3θ Cis,

125

Processo de acordo com rei v i nd i c ac So caracterizado por se preparar somatotropina recombinante animal.

em que R. e R.

1 i <5.

são Cis(CH„CONR__rR, ) ; R-. θ R', são cada um H, olietilenoqlicol E ( CH_ ). CO.-,Η) 3 (CH_) C0^H3 ; se é um inteiro entre 1 e 3; e R^, e R., alquilo C -C , , pol ieti lenoq 1 icol E ( CH„ ) C0.-,H)3 ou ECH(CO^H)ló' z X z. <la

135. caracterizado po cm qu

Processo de acordo com reivindicação 7, se preparar somatotropina recombinante animal.

e R. são CisECH(CD^H)< CH^) CCc,H3 ; se é um ou dois e R„ la 22 x 2 são Cis.

145. - Processo de acordo com a reivindicação 7, acterizado por se preparar somatotropina recombinante animal, são CisíR^); Rg é alquilo C.-C. ou alcoxi C.-C_vj ^_j 16 14 em que R_o e R —metilo e R . e R. são Cis, 1 1 a

155·. - Processo de acordo com a rei vindicação 7, caracterizado por se preparar somatotropina recombinante animal, em que Rg e R_o^ sã.o CisaSRg); R^ é alquilo C^-C^, facultativamen2 a t e su bs t i t u í d o com O a.

ó ’ 6 ~

1' grupos hidroxilo, propilenoq1icol ou fenilo facul tativamente substituída com um ou. dois de ácido carboxilico ou ácido sul fónico e R, e R.

1 la substituinte* aSo Cis.

165. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por se preparar somatotropina recombinante animal.

e m q u e R _ R, são C

Cis(CH-) nSu é um inteiro de O a 4 e RI

IS

17s. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por se preparar somatotropina recombinante animal, em qu.e R-, e R-,^ são Cis (CH^CONRu-R^ ) ; R, e H, alquilo C^—C^ ou po 1 ieti 1 snog 1 ico 1 ; R' é alquilo C.-C, ou polietilenog1icol; R. é *t i O *T alquilo C^-C^ ou polieti1enog1icoI e R^ e R^ são Cis.

lSâ. - Processo cíe acordo com a reivindicação 7, caracterizado por se preparar somatotropina recombinante animal, em que a referida somatotropina é somatotropina recombinante 187 1 ol porsina (CtkS-Cis ' ) .

19â. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por se preparar somatotropina recombinante animal, SiTi QU. & , referida somatotropina somatotropina recombinante porcina ( H0,5CH^CH^CH._,-Cis¹⁸-'' ^1Vl ) .

·-* *— F'ru cesso de c a. r acterizado por se preparar S (Tf que R e R ί ia Cis (CHC: 1 C_A e R'₂ e R_2a e2'o Cis „ 21 a¹. - Processo de car acterizado por se preparar επη que R, e R, 1 la são (CH.-,) MR,I 2 m a ^ϋΓ C. e R, e R„ ò d 2a são Cis. 223. - Pro cesso de caracterizado por C ÇXt preparar ! em q u t· R, t· R s 1 la ão <CH_OCOCHJ

acordi acordo a reivindicação 5, recom binante an i mal, em que R, é alquilo icordo com a reivindicação 5,

H e R^ é alquilo som reivindicação 5,

23â. - Método para a inibição d .a a qreqaçáo de urna somatotropina recombinante animal, caracterizado por compreender: dissolução da referida somatotropina recombinante animal era água ou numa solução aquosa contendo hidrocloreto de guanidina ou bicarbonato de sódio; do pH da referida solução para um valor de 8,4, tratamento da referida solução de pH acertado com ditio— treitol; depois tratamento da mistura assim formada com uma haloacetamida, ácido haloacético, tetraationato de metal alcalino, metanotiossu1fonato de alquila C -C alquilo C -C,-sulfona;

14 1 c?

remoção do sal da mistura resultante através de u1trafi1 tração e nova diluição da mistura resultante sem sal, nova filtração e liofilização pelo que pelo menos uma ou ambas as pontes dissulfureto nos resíduos císteina císteina der i. va t i zado .

reduzida e o resíduo de aminoácido

24S. - Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por a referida somatotropina animal recombinante ser

SI

Sumdtatropina rí ombinante ρorcina

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Àla-Met-Pro-Leu-Ser-SerLeu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-LeuHis-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-ThrrTyr-Lys-Glu-Phe-GluArg-Ala-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile55

Gln-As.n-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe-R₂-Phe-Ser-Glu-ThrIle-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Glu-Ala-Gln-GlnArg-Ser-Asp-Val-Glu-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser-Leu-LeuLeu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Val-Gln-Phe-LeuSer-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phô-Gly-ThrSer-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-GluGlu-Gly-Ile-Gln-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-AspGly-Ser-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Lau-Lys-Gln-ThrTyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Leu-Arg-Ser-Asp-Asp166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-R_ -PheLys-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Ala-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg183 191 s s

Val-Met-Lys-R^-Arg-Arg-Phe-Val-Glu-Ser-Ser-R^Ala-Phe-OH.

pina recombinante b □Oma totro □ovina

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Pro-Leu-Ser-SerLeu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-LeuHis-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-rTyr-Lys-Glu-Phe-GluArg-Ala-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile55

Gln-As.n-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe-R₂-Phe-Ser-Glu-ThrIle-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Glu-Ala-Gln-GlnArg-Ser-Asp-Val-Glu-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser-Leu-LeuLeu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Val-Gln-Phe-LeuSer-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu—Vai—Phe—Gly-Thr—

Ser-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-GluGlu-Gly-Ile-Gln-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-AspGly-Ser-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-ThrTyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Leu-Arg-Ser-Asp-Asp166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-R -Phe« d

Lys-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Ala-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg183 191 s s

Val-Met-Lys-R₁-Arg-Arg-Phe-Val-Glu-Ser-Ser-R_laAla-Phe-OH.

Sumatutrijpiiia recombinante ovina

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Pro-Leu-Ser-SerLeu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-LeuHis-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-ThrrTyr-Lys-Glu-Phe-GluArg-Ala-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile55

Gln-As.n-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe-R₂-Phe-Ser-Glu-ThrIle-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Glu-Ala-Gln-GlnArg-Ser-Asp-Val-Glu-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser-Leu-LeuLeu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Val-Gln-Phe-LeuSer-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-ThrSer-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-GluGlu-Gly-Ile-Gln-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-AspGly-Ser-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-Thx— Tyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Leu-Arg-Ser-Asp-Asp166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-R_ -Phe2â

Lys-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Ala-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg183 191 s s

Val-Met-Lys-R₁-Arg-Arg-Phe-Val-Glu-Ser-Ser-R_laAla-Phe-OH.

S4

Somatotropina recombinante aviária

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Pro-Leu-Ser-SerLeu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-LeuHis-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-Tyr-Lys-Glu-Phe-GluArg-Ala-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile55

Gln-Asn-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe-R₂-Phe-Ser-Glu-ThrIle-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Glu-Ala-Gln-GlnArg-Ser-Asp-Val-Glu-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser-Leu-LeuLeu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Val-Gln-Phe-LeuSer-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-ThrSer-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-GluGlu-Gly-Ile-Gln-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-AspGly-Ser-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-ThrTyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Leu-Arg-Ser-Asp-Asp166

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-S«r-R_ -PheLys-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Ala-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg183 191

S 5

Val-Met-Lys-R^-Arg-Arg-Phe-Val-Glu-Ser-Ser-R.^Ala-Phe-OH.

Sumatatrupina recombinante de cavala

H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Pro-Leu-Ser-SerLeu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-LeuHis-GIn-Leu-Ala-AIa-Asp-ThrrTyr-Lys-Glu-Phe-GluArg-Ala-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile55

Gln-Asn-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe-Rj-Phe-Ser-Glu-ThrIle-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Glu-Ala-Gln-GlnArg-Ser-Asp-Val-Glu-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser-Leu-LeuLeu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Val-Gln-Phe-LeuSer-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-ThrSer-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-GluGlu-Gly-Ile-Gln-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-AspGly-Ser-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-ThrTyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Leu-Arg-Ser-Asp-Asp166

Ala-Leu-Leu-Lys-Aen-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-R -Phe2 d

Lys-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Ala-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg183 191 s s

Val-Met-Lys-R₁~Arg-Arg-Phe-Val-Glu-Ser-Ser-R_laAla-Phe-OH.

Sumatotropina recombinaπ te human a

Leu-Gln-Asn-Pro-Gln-Thr-Ser-Leu-R₂-Phe-Ser-GluSer-Ile-Pro-Thr-Pro-Ser-Asn-Arg-Glu-Glu-Thr-GlnGln-Lys-Ser-Asn-Leu-Glu-Leu-Leu-Arg-Ile-Ser-LeuLeu-Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Glu-Pro-Val-Gln-Phe-Δτ-π-ser-Val-Phe-Ala-Asn-Ser-Leu-Val-Tyr-GlyAla-Ser-Asp-Ser-Asn-Val-Tyr-Asp-Leu-Leu-Lys-AspLeu-Glu-Glu-Gly-Ile-Gln-Thr-Leu-Met-Gly-Arg-LeuGlu-Asp-Gly-Ser-Pro-Arg-Thr-Gly-Gln-Ile-Phe-LysGln-Thr-Tyr-Ser-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Ser-His-AsnAsp-Asp-Ala-Leu-Leu-Lys-Àsn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Tyr167

R_2a-Phe-Arg-Lys-Asp-Met-Asp-Lys-Val-Glu-Thr-Phe184

Leu-Arg-Ile-Val-Gln-í^-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser191 s s ^Rla^_Gly_Phe“^0H· í d u o c í s t. e i n a resíduos do em que uma. ou d e s i o n a d o R duas das pontes dissulfureto no i i a a m i η o á c i d o c í s t e i n a ou K._.

e R„ _ é reduzido são independentemente Cis, Cis<CH_COOH),

C .1 s ( C HC SJ N R R )

Cis (R._)

Cis(CH^) SO 2 n

Lis í CHCH-, LUNR-. CU) ;is(CH-,· NR^R ,Cis(SQ Cis (CH^OC-OH^R^.) ou Cis(SR_£); R-, e R são cada um H, E ( CH_, ) _ουΟ^Η 1 , EcH (CU._,H ) (CH._,) ,CU._,H 1 , alquilo L^-C^ facultativamente substituído com O a qruoos hidroxilo ou polietilenoglicol; R_c é alquilo C^-C^ ou alcoxi íC^-C^>meti 1 o polietilenoglicol, fenilo facultativamente substituído com um ou dois grupos de ácido carboxí 1 ico ou ácido sulfónico; n é um inteiro entre 1 a 4; e m é um inteiro entre 1 e desde qus quando R. e R. seiam 1 1 a.

tar uma derivatizada; e quando R_o e F:„ za são Ci devem represendeve representar uma Cis derivatizada desde que também quando R, e F:, '11a ou Fu, e RU representarem Cis, se forme uma ponte dissulfureto entre as duas funçSes Cis representadas pelos referidos R ou referido Fu e R_ .

'la

Método de acordo

3m a reivinoic terizado oor comoreender a redução e derιvatização , caracda. nonte dissulfureto mais pereto do extremo C da referida somatotropina e formada entre os dois resíduos do aminoácido císteina. na ansa mais pequenas sensível da referida somatotropina recombinante an ima 1.

26ã. - Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por compreender a redução e derivatização da ponte dissulfureto no extremo N da somatotropina e formada entre os dois resíduos do aminoácido císteina na ansa grande estável da. somatotropina recombinante animal atrás referida.

t. e r i z a do po r ρ on t e s d i s s u aminoácido c dois resíduo referida somatotropina.

â. - Método de acordo com -a reivindicação 24 compreender: redução e derivatização de

1 fureto formadas entre (1) os dois resíduos ísteina. na ansa grande da somatotropina s do aminoácida cisteína na ansa pequena sen q f_ â Ι'” 0Ξ L_ ambas a.s do e (2) os sível da

2Qâ. - Método para inibição da agregação da somatotropina. animal recombinante, caracterizado por compreender: substituição de peio menos um (1) a todos os quatro (4) resíduos do aminoácido císteina da referida somatotropina recombinante animal c:om um(l) a quatro (4) resíduos de aminoácidos separadamente seleccionados entre arginina, lisina, ácido aspártico, ácido glutamico, asparagina, glutamina, histidina, alamina, glicina, isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, triptofano, tirosina, metionina, treonina ou. prolina.

29â. - Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por um (1) ou dois (2) das císteinas na ansa mais pequena sensível da referida somatotropina, situada nas posições 153 e 151 do extremo C; da somatotropina terem sido substituídos por aminoácidos seleccionados entre alanina, ácido glutánico, arginina, triptofano ou. asparagina e as císteinas nas posições 55 e 166 na ansa grande estável não são substituídos.

30â. - Método para a inibição da agregação de uma somatotropina recombinante animal, caracterizado por compreender: eliminação de pelo menos um (1) a todos os quatro (4) resíduos de aminoácidos císteina da referida somatotropina recombinante animal.

31ê, - Método para inibição da agregação da somatotropina animal, recombinante, caracterizado por compreender: ozidação dos quat.ro (4) resíduos do amino-ácido císteina da referida somatrotropine. recombinante animal para ácido císteico.

322. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica caracterizado por se incluir na referida composição uma somatotropina recombinante animal em que os resíduos do aminoácido císteina situados nas posiçSes· 183 e 191 estão substituídos por resíduos de aminoácidos individualmente seleccionados entre arginina, lisina, ácido aspârtico, ácido glutSnico, aspara— gina, glutamina, histidina, alamina, glicina, isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, triptofano, tirosina, metionina,serina, treonina ou prolina.

33â. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica caracterizado por se incluir na referida composição uma somatotropina recombinante animal em que os resíduos do a m 111 o áido l í=te i n a s 11 u a uo 11 a a p o o i ç o e s eliminado.

133 e 191 em ambas foi uma

34d. - Processo para a preparação de farmacêutica, caracterizado por se incluir na referida composição uma quantida.de promotora de crescimento de uma somatotropina recombinante animal modificada ou derivatizada ou um seu sal farmacêuticamente aceitável; e um veículo sólido ou líquido farmacêuticamente aceitável em que a referida composição é eficaz no aumento da velocidade de crescimento de um animal durante um período de tempo alonqado.

Cumpuslçau

35â. - Processo de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por se preparar uma composição, que é administrada parentáricamente ao referido animal»