JP2894355B2 - 部位特異的突然変異または化学的誘導化を利用するシステイン残基の修飾による成長ホルモンの安定化 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、組み換え体動物成長ホルモン（recombinan
t animal somatotroppins）の４つ（４）のシステイン
アミノ酸残基のうち少なくとも１つ（１）が置換、修
飾、欠失または誘導化されている、新規な修飾または誘
導化された組み換え体動物成長ホルモンに関する。成長
ホルモンは組み換えで産生されかつされ続けているが、
しばしばそれらの成長ホルモンは動物に選択的に投与す
るために配合することが困難である。このような発現さ
れた成長ホルモンと異なり、成長ホルモン中に存在する
４つのシステイン残基を、他のアミノ酸による置換によ
るか、あるいはシステインの誘導化により、変更または
排除すると、動物への投与に許容されうる方法で配合す
るための安定性が増大した、生物学的に活性な化合物が
生ずることが発見された。

本発明は、要約すれば、次の通りである：本発明は、
新規な修飾または誘導化された組み換え体動物成長ホル
モンに関する。本発明は、また、部位特異的突然変異を
利用して成長ホルモンのシステインアミノ酸残基の１つ
〜４つを１または２以上の異なるアミノ酸残基で置換し
てシステイン残基を修飾または欠失するか、あるいは
（１）前記成長ホルモンの小さいループ中の両者のアミ
ノ酸残基、大きいループ中の両者のアミノ酸残基または
前記成長ホルモンの両者のループ中の４つのアミノ酸残
基を誘導化することによって、組み換え体動物成長ホル
モンを安定化する方法を提供する。

したがって、本発明の目的は、組み換え体動物成長ホ
ルモン中の４つのシステインアミノ酸残基の少なくとも
１つが他のアミノ酸により置換、修飾、欠失または化学
的に誘導化されている、新規な動物成長ホルモンを提供
することである。本発明の他の目的は、動物成長ホルモ
ンのシステイン残基の２つ（２）、３つ（３）またはす
べての４つ（４）を置換および／または誘導化するこ
と、およびそれらの新規な化合物を提供することであ
る。２つのシステインは小さいループ中に存在し、そし
て２つは大きいループ中に存在する。

また、本発明の他の目的は、生物学的に有効でありか
つ投与のために安定である、前記置換、修飾、排除およ
び／または誘導化された動物成長ホルモンを提供するこ
とである。本発明の他の目的は、成長促進量の修飾また
は誘導化された組み換え体動物成長ホルモンまたは製剤
学的に許容されうるそれらの塩類、および製剤学的に許
容されうる固体または液状担体からなり、５日以上の延
長した期間にわたって動物の成長速度を増加するために
有効である、生物学的に活性な組み換え体動物成長ホル
モンの組成物を提供することである。

本発明のこれらの目的および他の目的は、以下の本発
明の詳細な説明から明らかとなるであろう。

本発明は、成長ホルモンのシステインアミノ酸残基の
１〜４つがアルギニン、リジン、アスパラギン酸、グル
タミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、ア
ラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、
フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、メチオ
ニン、セリン、スレオニンまたはプロリンから別々に選
択される１〜４つのアミノ酸残基により置換されている
か、あるいはすべての４つのシステインがシステイン酸
変換されているか、あるいは小さいループ中の両者のシ
ステインまたは大きいループ中の両者のシステインまた
は前記ループの両者中のすべての４つのシステインが、
(CH₂COOH)、［(CH(CO₂H)(CH₂)_xCO₂H］、(CH₂CONR₃R₄)、
(R₅)、［(CH₂)_nSO^- ₃］、(CHCH₂CONR₃CO)、(CH₂)_mNR
₃R₄、(CH₂OCOCH₂R₅)または(SR₆)から選択される置換基
で誘導化されており；R₃およびR₄は各々Ｈ、［(CH₂)_xCO
₂H］、［CH(CO₂H)(CH₂)_xCO₂H］、C₁‐C₆アルキル（前記
アルキル基は０〜６のヒドロキシル基で置換されていて
もよい）またはポリエチレングリコールであり；R₅はC₁
‐C₆アルキルまたはC₁‐C₄アルコキシメチルであり、そ
してR₆はC₁‐C₆アルキル、ポリエチレングリコールまた
はフェニル（前記フェニルは１つまたは２つのカルボン
酸またはスルホン酸基で置換されていてもよい）であ
り;nは０〜４の整数であり;mは２〜４の整数であり、そ
してｘは１〜３の整数であり；ただし前記組み換え体動
物成長ホルモンのシステインアミノ酸残基が誘導化され
ているとき、前記成長ホルモンの小さいループ中の両者
のシステイン残基または大きいループ中の両者のシステ
イン残基は同一の基で置換されており、そして、また、
小さいループ中のシステインアミノ酸残基上の置換基
（不安定なかつＣ−末端に近接する）は前記成長ホルモ
ンの大きいループ中のシステインアミノ酸残基上の置換
基（安定なかつＮ−末端に近接する）と同一であるか、
あるいは異なることができ、そしてさらに１つのシステ
インアミノ酸残基がシステイン酸に酸化されるとき、前
記成長ホルモン中のすべての前記システイン残基はシス
テイン酸に酸化されている、新規な修飾された（置換ま
たは排除されたシステイン）または誘導化された組み換
え体動物成長ホルモンに関する。

本発明は、また、組み換え体動物成長ホルモンの55、
166、183または191位置に位置するシステインアミノ酸
残基の１または２以上を、アルギニン、リジン、アスパ
ラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、
ヒスチジン、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイ
シン、バリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チ
ロシン、メチオニン、セリン、スレオニンまたはプロリ
ンで置換し、そして前記システイン残基のすべての４つ
を酸化することによって、組み換え体動物成長ホルモン
の凝集（aggregation）を抑制（inhibit）する方法を提
供する。

本発明は、さらに、組み換え体動物成長ホルモンの55
および166位置または183および191位置におけるシステ
インアミノ酸残基の間のジサルファイド架橋を還元し、
次いで55および166位置および／または183および191位
置における還元された架橋のシステインの各々を同一誘
導体で誘導化することからなり、ただし55および166位
置におけるシステイン上の誘導体は183および191位置に
おけるシステイン上の置換基と同一であるか、あるいは
異なることができる、組み換え体動物成長ホルモンの凝
集を抑制する方法を提供する。本発明の新規な誘導化さ
れた組み換え体動物成長ホルモンの調製において使用す
る置換基は、次のものを包含する：(CH₂COOH)、［(CH(C
O₂H)(CH₂)_xCO₂H］、(CH₂CONR₃R₄)、(R₅)、［(CH₂)_nS
O^- ₃］、(SR₆)、(CHCH₂CONR₃CO)、(CH₂)_m、NR₃R₄、また
は(CH₂OCOH₂R₅)、ここでR₃およびR₄は各々Ｈ、［(CH₂)_x
CO₂H］、［CH(CO₂H)(CH₂)_xCO₂H］、C₁‐C₆アルキル（前
記アルキル基は０〜６のヒドロキシル基で置換されてい
てもよい）またはポリエチレングリコールであり；R₅は
C₁‐C₆アルキルまたはC₁‐C₄アルコキシメチルであり、
そしてR₆はC₁‐C₆アルキル、ポリエチレングリコールま
たはフェニル（前記フェニルは１つまたは２つのカルボ
ン酸またはスルホン酸の基で置換されていてもよい）で
あり;nは０〜４の整数であり;mは２〜４の整数であり、
そしてｘは１〜３の整数である。

本発明によれば、好ましい新規な動物成長ホルモン
は、成長ホルモンの小さいループ中のジサルファイド架
橋が還元されており、そして183および191位置における
システインが(CH₂COOH)、［(CH(CO₂H)(CH₂)_xCO₂H］、(C
H₂CONR₃R₄)、(R₅)、(CH₂)_nSO^- ₃または(SR₆)から選択さ
れた置換基で誘導化されており、ここでR₃、R₄、R₅、
R₆、ｎおよびｘが上に定義したとおりである、組み換え
体ブタ、ウシ、ヒツジ、ヒトおよびトリ成長ホルモンで
ある。

また、システインは１つないしすべてのシステインが
排除される。

本発明に関連するプラスミド、DNA配列および微生物
のすべては、特記しない限り、アメリカン・サイアナミ
ド・カンパニー（American Cyanamid Company）の培養
物収集所（米国ニュージャージイ州プリンセトンにおい
て維持されている）の受託され、そしてアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（ATCC）（American T
ype Culture Collection、米国マリランド州20952ロッ
クビレ）に受託されている。

本発明の好ましい修飾した組み換え体動物成長ホルモ
ンは、下に示すが、追加のAsp-Glnの追加の置換基をも
たないか、あるいは他の置換基をもつ組み換えで誘導化
した成長ホルモンは、同様によく、本発明に従い調製さ
れる。アミノ酸の鎖の長さの欠失、アミノ酸の鎖の長さ
への付加、アミノ酸（システインの外に）の置換、活性
部分をもつ断片などをもつ他の動物成長ホルモンは、本
発明の領域内にすべて入る。ここにおけるアミノ酸残基
の番号はMet-Asp-Gln類似体に関するが、番号は４つの
システイン残基により形成されるジサルファイド架橋を
同定するために当業者によりそれに応じて変更される。

ここで前記組み換え体動物成長ホルモンのR₁、R_1a、R
₂およびR_2aの各々は、独立に、アルギニン、リジン、ア
スパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミ
ン、ヒスチジン、アラニン、グリシン、イソロイシン、
ロイシン、バリン、フェニルアラニン、トリプトファ
ン、チロシン、メチオニン、セリン、スレオニン、プロ
リンまたはシステインから選択されるアミノ酸残基を表
す；ただし上に示す成長ホルモン中のR₁、R_1a、R₂およ
びR_2aはシステイン以外のアミノ酸残基を表す。

本発明のことに好ましい修飾された組み換え体動物成
長ホルモンは、成長ホルモンの183および191における
か、あるいは組み換え体ヒト成長ホルモン184および191
におけるR₁およびR_1aの置換基の一方または双方がシス
テイン以外のアミノ酸を表すものである。

部位特異的突然変異 本発明の上の修飾した（置換した）組み換え体動物成
長ホルモンの調製は、部位特異的突然変異により達成さ
れる。特定の定めた部位におけるDNAのクローニングし
たセグメントのDNA配列の変更の現在利用されている技
術は、そのDNAの一本鎖の形態の産生を要求する。一本
鎖DNAをその一部分に対して相補的である合成オリゴヌ
クレオチドにアニーリングし、ただしオリゴヌクレオチ
ドはその中に不一致の領域をもつ。不一致の領域は、通
常、オリゴヌクレオチドの中央部分に位置する。次い
で、アニーリングした混合物は、T4 DNAリガーゼリガー
ゼおよびアデノシン５′トリホスフェートの存在下に、
E.coli DNAのポリメラーゼＩ、大きい断片およびデオキ
シヌクレオチドトリホスフェートの添加により、二本鎖
としかつ共有結合的に閉じる。次いで、二本鎖DNAを適
当なE.coli菌株中に形質転換し、ここでDNAの不一致領
域を修復し、そして複製する。クローンの２つの集団が
得られる。どの鎖を修復合成のための鋳型して選択する
かに依存して、クローンは野生型または変更した（突然
変異した）配列を含有する。突然変異した配列を含有す
るクローン、すなわち、オリゴヌクレオチドの配列に相
当するものを、放射性標識オリゴヌクレオチドへのハイ
ブリダイゼーションにより選択する。オリゴヌクレオチ
ドと野生型配列との間の不一致のために、放射性標識オ
リゴヌクレオチドは突然変異した配列を含有するクロー
ンにより安定に結合する。したがって、適当な温度にお
けるインキュベーションは、野生型のクローンと突然変
異したクローンと分別する。次いで、同定されたクロー
ンにおける変更は、関連する領域のDNA配列決定により
確証される。次の説明において、組み換え体ブタ成長ホ
ルモンを本発明の修飾および誘導化した組み換え体動物
成長ホルモンおよびそれらの調製の方法の代表として選
択する。

ベクターバクテリオファージM13mp11（ATCC受託番
号、受託 ）を産生する一本鎖の形態
にブタ成長成長ホルモン（rpST）遺伝子のクローニング
は、第１図に線図的に示す一般手順に従って達成され
る。

ブタ成長ホルモンを含有するDNAの断片は、バクテリ
アの発現プラスミドpEFF-902（ATCC受託番号、受託
）から、制限酵素EcoRIおよびHindIIIで
切断することによって分離される。次いで、rpST遺伝子
含有断片をアガロースゲルの電気泳動により精製する。
M13mp11複製形態（RF）のDNAをEcoRIおよびHindIIIで消
化し、仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼで処理し、そ
して大きい断片をアガロースゲルの電気泳動により精製
する。次いで、２つの精製した断片を一緒に混合物し、
そしてT4 DNAリガーゼと結合する。この混合物をE.coli
JM101（ATCC受託番号、受託 ）中に
形質転換し、そして得られるプラークのいくつかを増殖
する。複製の形態（RF）のDNAを標準のアルカリ性溶菌
手順により調製し、そして構造を適当な制限酵素で消化
することによって決定する。期待する断片を含有するク
ローンを分離し、そしてM13mp11pST（ATCC受託番号、受
託 ）と表示する。DNA配列の分析を
使用してクローンを同定する。

次いで、M13mp11pST中のrpST遺伝子の突然変異誘発
は、下に記載しかつ第２図に示すように達成する。突然
変異誘発のプログラムの目的は、他のアミノ酸により関
連するシステイン残基の置換により小さいループのジサ
ルファイド架橋、大きいループのジサルファイド架橋ま
たは両者を形成することができないrpST分子を発生する
ことである。大きいループジサルファイドは、rpST遺伝
子における位置55および166におけるシステインの間に
位置する。小さいループのジサルファイドは183および1
91に位置するシステインの間である。番号のシステムは
記載する通りである。２つの基本的プロトコルを使用し
て、要求される突然変異体を得、そして各々の例を後述
する。

第１方法において、小さいループジサルファイド結合
におけるシステインの置換は長い合成オリゴヌクレオチ
ドを使用して達成する。この方法において、AA1と表示
するオリゴヌクレオチドを使用し、そしてこれは次の配
列を有する： これはpST遺伝子の配列を変更し、ここで位置183にお
けるシステインのためのコドンはTGTからアラニンの遺
伝情報を指定するGCGに変換され、そして位置191におけ
るシステインはTGTから、また、アラニンの遺伝情報を
指定するGCTに変換される。したがって、小さいループ
におけるシステインの両者はアラニンに変換される。一
本鎖M13mp11pST DNAは、標準のプロトコルにより精製さ
れたファージから調製される。第２図は突然変異誘発法
の概要である。1000ngの一本鎖M13mp11pST DNAを、アデ
ノシン５′トリホスフェートおよびポリヌクレオチドキ
ナーゼで５′リン酸化されている、50ngのAA1オリゴヌ
クレオチドと混合する。この混合物を65℃に７分間加熱
し、次いで室温に10分間保持する。このプロトコルはオ
リゴヌクレオチドを一本鎖DNAにアニーリングする。次
いで、アニーリングしたDNA、ATP、dNTP（４つのデオキ
シリボヌクレオチド５′トリホスフェートの混合物）、
T4 DNAリガーゼおよびDNAポリメラーゼＩの大きい断片
の添加により、共有結合的に閉じた形態の二本鎖に変換
する。この混合物をを室温において１時間インキュベー
ションする。次いで、この混合物を標準の塩化カルシウ
ムの手順により、E.coli JM101中に形質転換する。37℃
において一夜インキュベーションした後、プラークはJM
101の菌叢上に見られる。プラークをニトロセルロース
のフィルター上に持ち上げ、そして標準のプロトコルに
よりハイブリダイゼーションために処理する。AA1Dと表
示する第２オリゴヌクレオチドを突然変異体の検出に使
用する。AA1Dは次の配列５′ C ATG AAG GCG CGC CGC T
T 3′を有する。それをc-³²P‐ATPおよびポリヌクレオ
チドキナーゼで５′末端において放射線標識する。ハイ
ブリダイゼーションは一夜37℃において５×SSC（１×S
SCは0.15モルの塩化ナトリウム、0.015モルのクエン酸
ナトリウムpH7.0である）、１×デンハルト溶液［0.02
％（w/v）のフィコール（Ficoll）、0.02％（w/v）のウ
シ血清アルブミン、0.02％のポリビニルピロリドン］、
150g/mlのtRNA中で実施する。ハイブリダイゼーション
後、フィルターを順次に５×SSCで４℃において、TAC
［TACは３モルの塩化テトラメチルアンモニウム、50ミ
リモルの（トリス）」ヒドロキシメチル］アミノメタン
pH8.0、１ミリモルのEDTA（エチレンジアミノテトラ酢
酸）、0.1％（w/v）のドデシル硫酸ナトリウムである］
で37℃においておよび最後にTAC中で所望の温度におい
て洗浄する。この最後の洗浄は特異性を決定する。AA1D
のため、温度は52.2℃である。ｘ線に露出後、AA1Dに対
して完全に相補的であるクローンのみが観察される。こ
れらのクローンのいくつかをDNAの配列決定により分析
する。これらのすべては第１突然変異を含有するが、そ
れらのいずれも第２（システイン191において）突然変
異を含有しない。

位置191におけるシステインを突然変異するために、A
1と表示する第２オリゴヌクレオチドを使用する。A1は
次の配列を有する： 突然変異誘発の方法は前述のものに同一であるが、た
だし鋳型DNAはM13mp11pSTA3（これはアラニンに変換し
た位置183におけるシステインを有するAA1の突然変異誘
発から分離したクローンである）であり、そしてハイブ
リダイゼーションはA1を使用する。最終の洗浄温度は56
℃である。DNAの配列決定は、同定したクローンは期待
する配列を有する。突然変異したクローンはM13mp11pST
A34（ATCC受託番号、受託 ）と表示
する。DNA配列は第３図に示されている。

第２方法において、小さいループのジサルファイドの
置換は同一方向に２つのオリゴヌクレオチドを使用する
ことにより得られ、そして第４図に線図で示されてい
る。２つのオリゴヌクレオチドは次の配列を有する： 鋳型の一本鎖DNAはM13mp11pST（ATCC受託番号、受託
）である。２つのオリゴヌクレオチ
ドおよび、同一方向の、鋳型DNAを、前のように、アニ
ーリングし、伸長し、そして結合する。この混合物をE.
coli JM101中に形質転換する。この方法における差は、
２つのリフト（lift）を各板（plate）から取ることで
ある。各リフトを³²P標識GLU3またはGLU4に別々にハイ
ブリダイゼーションする。最終の洗浄温度は56℃であ
る。両者オリゴヌクレオチドに対して陽性であるプラー
クのみを取り上げる。DNAの配列決定は、Cys183およびC
ys191の両者がグルタミン酸に変換されていることを明
らかにする。このクローンをM13mp11pSTAE34（ATCC受託
番号、受託 ）と表示する。この方法
を使用して、前述の２つの適当なオリゴヌクレオチドお
よびM13mp11pSTを使用することにより、大きいループの
ジサルファイドの形成を防止する突然変異を得る。明ら
かなように、鋳型DNAとしてM13mp11pSTA34およびCys55
およびCys166をアラニンに変更するために適当な２つの
オリゴヌクレオチドを使用することにより、システイン
残基のすべてをアラニンに変換されているクローンを得
る。

次いで、変更した（突然変異の）クローンを、第５図
に線図的に示すバクテリアの発現プラスミドpRO211（AT
CC受託番号、受託 ）中に再構成する
［欧州特許（EP）173,280号に記載されている］。M13ク
ローンをEcoRIおよびHindIIIで切断し、そしてpST遺伝
子断片を分離する。pRO211を同一酵素で消化し、仔ウシ
腸アルカリ性ホスファターゼで処理し、そして大きい断
片を分離する。２つの片を一緒にT4 DNAリガーゼで結合
し、そして適当なバクテリア菌株、例えば、E.coli N99
cI（ATCC受託番号、受託 ）中に形質
転換する。この菌株において、野生型ｋリプレッサーが
存在する。これはpRO211中のP_Lプロモーターからの発現
を防止する。いったん適当な構成が分離されると、それ
を温度感受性ｋリプレッサーを含有するバクテリア菌
株、例えば、（ATCC受託番号、受託
）E.coli 4200中に移す。これらの菌株において、pST
の発現は温度に依存する。42℃において、リプレッサー
は不活性であり、そして発現は起こる。この段階におい
て、pSTを欧州特許（EP）173,280号に記載されている手
順により調製し、ここで発現は起こる（参照のため、こ
こに加える）。pSTの発現はこれらの特定のE.coliの菌
株に限定されない。適当な性質をもつ他の菌株を代わり
に使用する。プラスミド発現ベクターはATCCに受託され
ている。バクテリア菌株は別々に受託されている。

他のアミノ酸の置換は、適当なコドンおよびオリゴヌ
クレオチドを利用して上の手順により行う。同様に、こ
れらの手順を使用して種々の動物成長ホルモンを修飾す
る。

上の手順により容易に調製される修飾された組み換え
体動物成長ホルモンは、次のとおりである：（Ala 55,1
66）rpST;（Ser 55,166）rpST;（Ala 183,191）rpST;
（Glu 183,191）rpST;（Glu 183-Ala 191）rpST;（Ser
183,191）rpST;および（Glu 183-Ser 191）rpST。

誘導化された動物成長ホルモン 誘導化された動物成長ホルモン、好ましい組み換え
体、は、水またはグアニジン塩酸塩、重炭酸ナトリウム
の水溶液、これは水性塩基、例えば、水酸化ナトリウム
または水酸化アンモニウムでpH8.4で調節した、中に動
物成長ホルモンを溶解または分散することによって調製
される。次いで、この溶液にジチオスレイトール、すな
わち、（DL-スレオ−1,4−ジメルカプト−2,3−ブタン
ジオール）をゆっくり添加する。この添加は、一般に、
室温において窒素雰囲気下に実施する。次いで、得られ
る溶液に、ヨウドアセトアミド、ヨウド酢酸、ナトリウ
ムテトラチオネート、メチルメタンチオスルホネート、
1,3−プロパンスルホンまたは他の誘導化剤を添加す
る。この混合物を約１〜４時間撹拌し、次いで限外濾過
により脱塩する。この溶液を濃縮し、次いで水、水性グ
アニジン塩酸塩などによる再希釈のいくつかのサイクル
にかけ、次いで限外濾過する。次いで、最終の濾過から
の残留物を凍結乾燥して誘導化rpSTを生成する。

使用の方法 有利には、本発明の新規な動物成長ホルモンは、動
物、ことに肉生産動物の成長速度を改良し、そしてこれ
により飼料の利用効率を増加するために有用である。こ
れらの化合物は、また、前記動物の胴体の量を増大す
る、すなわち、前記動物の脂肪のない肉対脂肪の比を増
加するために有効である。そのうえ、本発明の化合物は
乳を出す動物における乳の生産を増加し、そしてヒツジ
における羊毛の生産および毛皮のために飼育する他の動
物を改良するために有効である。

本発明の修飾（置換）したまたは誘導化した成長ホル
モンは、前述の生物学的改良を達成するための動物の処
理に有効であるが、本発明の修飾または誘導化された動
物成長ホルモンの改良された有効性および有用性は、一
部分、前記成長ホルモンの修飾または誘導化により生成
する成長ホルモンの凝集の抑制に起因する。このような
抑制は、本発明により記載されるように修飾または誘導
化されてない自然成長ホルモンまたは組み換え体成長ホ
ルモンを使用して、容易にまたは有効に達成されない、
顕著に改良された持続した放出系の調製を可能とする。

また、本発明の修飾または誘導化した成長ホルモンは
高度に安定であり、そして二量体の形成による凝集を本
質的に含まないことが発見された。そのうえ、本発明の
修飾または誘導化された成長ホルモンは、それら自体、
有意に改良された持続した放出の組成物の調製において
使用することを可能とする。

自然の動物成長ホルモンは単一の日で凝集することが発
見されたが、本発明の修飾 または誘導化された成長ホ
ルモンを含有する非経口的組成物は、修飾または誘導化
された成長ホルモンを10日以上の間放出し続ける。

組成物 実際に、本発明の組成物は、一般に、動物に、生物学
的に活性な非経口的組成物の形態で注射することによっ
て投与される。本発明の組み換え体動物成長ホルモンの
投与に有用な非組成物の例は、ゲル、ペースト、微小
球、マイクロカプセル、移植体などである。そのまま
で、物質を制御した方法で放出し、こうして投与の頻度
を減少する、生物学的に活性な物質の投与形態を提供す
ることにおいてかなり興味がある。

生物学的に活性な高分子の持続した放出の組成物の開
発は、高分子の作用のこみいったモードおよび複雑な構
造のために、特別な問題を提供する。こうして、生物学
的に活性な成長ホルモンを含有する、有効な持続した放
出の組成物の開発が要求される。

このタイプの投与に有用な組成物は、修飾または誘導
化した動物成長ホルモンを希釈水酸化アンモニウム中に
溶解し、次いでアルカリ金属安息香酸塩、乳酸塩、炭酸
塩などをそれに添加することによって調製される。その
後、非イオン性界面活性剤を前記溶液と混合し、そして
得られる混合物を噴霧乾燥する。次いで、こうして形成
した固体を溶融した脂肪またはろうまたはそれらの混合
物と混合し、そして得られる溶融した混合物を、入る空
気および溶融した相を融点以上の温度に維持する加熱ジ
ャケットを装備した空気／液体噴霧ノズルを通して噴霧
する。微小球を溶融した滴として冷却する。これらを１
系列の篩で約45〜180ミクロンの所望の範囲で集め、そ
して使用のため保持する。所望の大きさの範囲でない微
小球を再循環する。あるいは、均質な混合物を遠心ディ
スク上に供給し、そしてこうして形成した微小球を上の
ように集めるか、あるいは溶融した混合物を冷却し、そ
して所望の平均粒子大きさの範囲に微粉砕する。

次いで、生物学的に活性な微小球は、動物への注射の
ために製剤学的にかつ薬理学的に許容されうる液状賦形
剤中に分散する。この微小球−液状組成物は、一般に、
皮下注射により、動物の皮膚の下に通常頭、首または耳
付近に投与する。

本発明の修飾または誘導化した動物成長ホルモンは、
また、生物適合性移植体として調製し、動物の皮膚の下
に普通のペレット移植ガンを使用して注射する。これら
の組成物は、粉末状の修飾または誘導化された成長ホル
モンをろう、例えば、カスターろう（castor wax）と混
合するか、あるいはコポリ（グリコリド／ラクチド）、
水酸化マグネシウム、およびプロピレンオキシドとプロ
ピレングリコールとの縮合により形成した疎水性基剤を
使用して調製したエチレンオキシドの縮合物の混合物と
混合することによって調製される。次いで、こうして形
成された組成物をペレット化プレス中に導入し、そして
直径約0.31cm（1/8インチ）の円筒形ペレットに成形す
る。こうして形成されたペレットは普通のペレット移植
ガンで投与する。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。

実施例１ 長い合成オリゴヌクレオチドを使用する小さいループの
ジサルファイド架橋中のシステインの置換 AA1と表示するオリゴヌクレオチドは、次の配列を有
する： これはrpSTの配列を変更させ、位置183におけるシス
テインのコドンはTGTからアラニンの遺伝情報を指定す
るGCGに変換され、そして位置191におけるシステインは
TGTからアラニンの遺伝情報を指定するGCTに変換され
る。したがって、小さいループ中のシステインの両者は
アラニンに変換される。一本鎖M13mp11pST DNAは標準の
プロトコルにより精製したファージから調製される。１
×アニーリング緩衝液（１×アニーリング緩衝液は75ミ
リモルのKCl 5ミリモルのトリス pH8.0）を含有する10
11の最終の体積でアデノシン５′トリホスフェートおよ
びポリヌクレオチドキナーゼで前以て５′リン酸化し
た、50ngのAA1と、1000ngの一本鎖M13mp11pST DNAを混
合する。この混合物を65℃に７分間加熱し、次いで室温
に10分間保持する。このプロトコルはオリゴヌクレオチ
ドを一本鎖DNAにアニーリングする。次いで、アニーリ
ングしたDNAを、2011 H₂O、411 10×充填（fillin）緩
衝液、（１×充填緩衝液は275ミリモルのMgCl₂ pH7.5 2
ミリモルのDTT）、111 20ミリモルのATP、pRO211 dNTP
（各々２ミリモルの濃度の４つのデオキシリボヌクレオ
チド５′トリホスフェートの混合物）、2U T4 DNAリガ
ーゼおよび2U DNA ポリメラーゼＩ大きい断片［単位の
定義についてはニュー・イングランド・バイオラブス
（New England Bio labs）のカタログ、1986参照］の添
加により、共有結合的に閉じた形態の二本鎖に変換す
る。この混合物を室温において１時間インキュベーショ
ンする。次いで、この混合物を標準の塩化カルシウム手
順によりE.coli JM101中に形質転換する。37℃において
一夜インキュベーションした後、プラークをJM101の菌
叢上に見ることが出来る。プラークをニトロセルロース
のフィルター上に持ち上げ、そして標準のプロトコルに
よるハイブリダイゼーションのために処理する。AA1Dと
表示する第２オリゴヌクレオチドを突然変異の検出に使
用する。AA1Dは次の配列を有する:5′ C ATG AAG GCG C
GC CGC TT 3′。それを５′においてd-32P-ATPおよびポ
リヌクレオチドキナーゼで放射線標識する。ハイブリダ
イゼーションは37℃において５×SSC、１×デンハルト
溶液、15olg/mlのtRNA中で一夜である。フィルターを順
次に５×SSC中で４℃において、TAC中で37℃において、
そして最後にTAC中で所望の温度において洗浄する。こ
の最後の洗浄は特異性を決定する。AA1Dについて、温度
は52.5℃である。ｘ線への露出後、AA1Dに対して完全に
相補的であるクローンのみが観察される。これらのクロ
ーンのいくつかをDNA配列決定により分析する。それら
のすべては第１突然変異を含有するが、それらのいずれ
も第２（システイン191における）突然変異を含有しな
い。位置191におけるシステインを突然変異させるため
に、A1と表示する第２オリゴヌクレオチドを使用する。
A1は次の配列を有する： 突然変異誘発の方法は、AA1Dを使用する上の実施例１
に記載する方法と同一であるが、ただし鋳型はM13mp11p
STA3（これはアラニンに変換された位置183を有するAA1
突然変異誘発から分離されたクローンである）であり、
そしてハイブリダイゼーションにはA1を使用する。最後
の洗浄温度は62℃である。DNA配列決定は、同定された
クローンが期待する配列を有することを明らかにする。
突然変異したクローンはM13mp11pSTAE34と表示する。

実施例２ 組み換え体ブタ成長ホルモンの小さいループ中のシステ
インの置換 小さいループのジサルファイド架橋の置換は、同一反
応における２つのオリゴヌクレオチドを使用することに
よって得られる。２つのオリゴヌクレオチドは、次の配
列を有する： 鋳型の一本鎖DNAはM13mp11pSTである。２つのオリゴ
ヌクレオチドおよび、同一方向の、鋳型DNAを、前のよ
うに、アニーリングし、伸長し、そして結合する。この
混合物をE.coli JM101中に形質転換する。この方法にお
ける差は、２つのリフト（lift）を各板（plate）から
取ることである。各リフトを³²P標識GLU3またはGLU4に
別々にハイブリダイゼーションする。最終の洗浄温度は
56℃である。両者オリゴヌクレオチドに対して陽性であ
るプラークのみを取り上げる。DNAの配列決定は、Cys18
3およびCys191の両者がグルタミン酸に変換されている
ことを明らかにする。この方法を使用して、前述の２つ
の適当なオリゴヌクレオチドおよびM13mp11pSTを使用す
ることにより、大きいループのジサルファイドの形成を
防止する突然変異を得る。明らかなよるに、鋳型DNAと
してM13mp11pSTA34およびCys55およびCys166をアラニン
に変更するために適当な２つのオリゴヌクレオチドを使
用することにより、システイン残基のすべてをアラニン
に変換されているクローンを得る。

実施例３ バクテリアの発現プラスミドへの再構成 変更した（突然変異の）クローンを、バクテリアの発
現プラスミドpRO211中に再構成する（欧州特許173,280
号に記載されている）（その開示をここに引用によって
加える）。M13クローンをEcoRIおよびHindIIIで切断
し、そしてpST遺伝子断片を分離する。pRO211を同一酵
素で消化し、仔ウシ腸アルカリ性ホスフェターゼで処理
し、そして大きい断片を分離する。２つの片を一緒にT4
DNAリガーゼで結合し、そして適当なバクテリア菌株、
例えば、E.coli N99cI⁺中に形質転換する。この菌株に
おいて、野生型λリプレッサーが存在する。これはpRO2
11中のP₂プロモーターからの発現を防止する。いったん
適当な構成が分離されると、それを温度感受性λリプレ
ッサーを含有するバクテリア菌株、例えば、4200中に移
す。これらの菌株において、rpSTの発現は温度に依存す
る。42℃において、リプレッサーは不活性であり、そし
て発現は起こる。この段階において、rpSTを欧州特許17
3,280号に記載されている手順により調製し、ここで発
現は起こる（参照のため、ここに加える）。pST遺伝子
の発現はE.coli 4200に限定されない。任意の適当なE.c
oli菌株を利用することができる。

実施例１、２および３の手順に従うが、位置183およ
び191におけるシステインの代わりにアラニン、セリ
ン、グルタミン酸、アルギニン、トリプトファンまたは
アスパラギンのための適当なコドンを使用することによ
り、システインのTGTをセリンのためのTCN、AGCまたはA
GT、グルタミン酸のためのGAGまたはGAA、ArgのためのC
GN、AGAまたはAGG、アスパラギンのためのAATまたはAA
C、アラニンのためのGCN、またはトリプトファンのため
のTGGに前記位置において変換する。

実施例４ （Cam-Cys 55,166,183,191）rPSTの調製 100mgの組み換え体ブタ成長ホルモン（rpST）および3
3mlの７モルのグアニジンHClの溶液を調製し、そしてpH
をNaOHで8.4に調節する。この溶液に18mg（20当量）の
ジチオスレイトールを添加し、そして反応混合物を窒素
雰囲気下に室温において１時間撹拌する。次いで、この
溶液に84mg（100当量）のヨウドアセトアミドを添加
し、そして反応混合物を室温において４時間撹拌する。
反応混合物を35mlのH₂Oで希釈し、そしてグアニジン塩
酸塩および過剰の試薬をアミコン（Amicon）8400型の撹
拌したセル中でアミコンUM2膜（分子量のカットオフほ
ぼ1000ダルトン）で限外濾過する。再希釈および再濾過
のいくつかのサイクル後、残留する水溶液を一定重量に
凍結乾燥してほぼ100mgの綿毛状の白色固体が生成す
る。非還元性条件下のSDS-PAGEゲル上の電気泳動の生成
物の移動度はrpSTと異なる。生成物は上に示した誘導化
した組み換え体ブタ成長ホルモンである。

実施例５ （Cam-Cys 183,191）rpSTの調製 脱気した0.02モルのNaCl（225ml）の溶液に、3.375g
の組み換え体ブタ成長ホルモン（rpST）を添加し、そし
てpHを希NaOHで8.1に調節し、この溶液のpHを8.1に維持
しながら、31.5mlの水中に溶解した18mg/mlの0.9463gの
ジチオスレイトールをこのrpST溶液に添加する。この混
合物を室温において一時間放置し、次いでpHを8.4に上
昇させる。次いで、40.5mlの水中に溶解した5.7gのヨウ
ドアセトアミドを滴々添加し、その間pHを8.4に維持す
る。微細な沈澱がこの添加の間形成し、これを遠心によ
り除去する。透明な上澄み液を取り出し、そしてセファ
デックス（Sephadex）G-25カラムに通過させて、過剰の
低分子量の物質を除去する。高分子量のrpST分画342.8g
を集め、そして凍結乾燥して2.2g（Cam-Cys 183,191）r
pSTを得る。

実施例６ （Cm-Cys 183,191）rpSTの調製 200mgの組み換え体ブタ成長ホルモン（rpST）および1
00mlの0.5NのNa₂CO₃（水性水酸化アンモニウムでpHをほ
ぼ8.4に調節した）の溶液に、15mgのジチオスレイトー
ルを添加し、そして反応混合物を室温において１時間撹
拌する。50mgのヨウド酢酸を添加し、そして反応混合物
を室温において２時間撹拌する。反応混合物をアミコン
（Amicon）8400型の撹拌したセル中でアミコンUM2膜で
限外濾過して脱塩する。再希釈および再濾過のいくつか
のサイクル後、残留する水溶液を一定重量に凍結乾燥す
る。ほぼ200mgの綿毛状の白色固体を回収する。得られ
る生成物は上に示した誘導化した組み換え体ブタ成長ホ
ルモンである。

上の手順に従うが、組み換え体ブタ成長ホルモンの代
わりに、組み換え体ウシ成長ホルモン、組み換え体ヒツ
ジ成長ホルモン、組み換え体ウマ成長ホルモン、組み換
え体ヒト成長ホルモンまたは組み換え体トリ成長ホルモ
ンを使用すると、それぞれ、次のものが得られる： １）（Cm-Cys 183,191）rbST ２）（Cm-Cys 183,191）roST ３）（Cm-Cys 183,191）rhoST ４）（Cm-Cys 183,191）rhST ５）（Cm-Cys 183,191）raST 実施例７ （^-O₃S‐Cys 55,166,183,191）rpSTの調製 200mgの組み換え体ブタ成長ホルモン（rpST）および5
0mlの7NのグアニジンHClの溶液を調製し、そしてpHをNa
OHで8.4に調節する。この溶液に33mgのジチオスレイト
ールを添加し、そして反応混合物を室温において１時間
撹拌する。次いで、この溶液に200mgのナトリウムテト
ラチオネートを添加する。pHは直ちに約６に低下し、そ
してこれをNaOHで8.4に戻す。次いで、反応混合物を２
時間撹拌する。この溶液をアミコンUM2膜で限外濾過す
る。反応混合物をほぼ20mlに濃縮し、次いで3Nのグアニ
ジン塩酸塩で約40mlに再希釈し、そして再濾過する。こ
の溶液を約20mlに濃縮した後、H₂Oで希釈し、そして再
濃縮する。この方法をさらに２回反復し、そして残留物
を一定重量に凍結乾燥する。ほぼ200mgの白色生成物が
得られる。この生成物は上に示した誘導化した組み換え
体ブタ成長ホルモンである。

実施例８ （^-O₃S‐Cys 183,191）rpSTの調製 100mlのH₂O中の250mgの組み換え体ブタ成長ホルモン
の溶液（pHをNaOHでほぼ8.4に調節した）に、70mgのジ
チオスレイトールを添加する。この溶液を室温において
１時間撹拌する。還元したrpSTの溶液に、40mgのナトリ
ウムテトラチオネートを添加し、そしてこの溶液を室温
において４時間撹拌する。反応混合物をアミコンUM2膜
で濾過し、そして約20mlに濃縮する。これを約200mlのH
₂Oで希釈し、そして濃縮する。この手順をさらに２回反
復する。最終の溶液を一定重量に凍結乾燥して、約240m
gの白色粉末を得る。これは上に示した誘導化した組み
換え体ブタ成長ホルモンである。

実施例９ （MeS-Cys 183,191）rpSTの調製 200mgの組み換え体ブタ成長ホルモン（rpST）を100ml
のH₂O水中に溶解する。この溶液を15mgのジチオスレイ
トール（DTT）を添加して、そして反応混合物を室温に
おいて１時間撹拌する。還元が完結した後、24μｌのメ
チルメタンチオスルホネートを添加し、そして反応混合
物を室温において４時間撹拌する。反応の間、pHを必要
に応じて１％のNaOHの添加により8.4に調節する。この
溶液をUM2膜で限外濾過し、そして約20mlに濃縮する。
残留物を200mlのH₂Oで希釈し、そして再濃縮する。次い
で、この溶液を凍結乾燥して210mgの前述の生成物、す
なわち、上に示した誘導化した組み換え体ブタ成長ホル
モンが得られる。

上の手順に従うが、組み換え体ブタ成長ホルモンの代
わりに、組み換え体ウシ成長ホルモン、組み換え体ヒツ
ジ成長ホルモン、組み換え体ウマ成長ホルモン、組み換
え体ヒト成長ホルモンまたは組み換え体トリ成長ホルモ
ンを使用すると、それぞれ、次のものが得られる： １）（MeS-Cys 183,191）組み換え体ウシ成長ホルモン ２）（MeS-Cys 183,191）組み換え体ヒツジ成長ホルモ
ン ３）（MeS-Cys 183,191）組み換え体ウマ成長ホルモン ４）（MeS-Cys 183,191）組み換え体ヒト成長ホルモン ５）（MeS-Cys 183,191）組み換え体トリ成長ホルモン 実施例10 （HO₃SCH₂CH₂CH₂‐Cys 183,191）‐rpSTの調製 100mlのH₂O中の200mgの組み換え体ブタ成長ホルモン
の溶液（pH＝8.4に調節した）に、15mgのジチオスレイ
トールを添加し、そして反応混合物を室温において窒素
雰囲気下に１時間撹拌する。この溶液に、50mgの1,3−
プロパンスルホンを添加し、そしてこの溶液を室温にお
いて６時間撹拌する。pHを8.4に１％のNaOHの添加によ
り維持する。粗生成物をUM2膜の限外濾過により約20ml
に濃縮する。これを２回200mlに希釈し、そして再濃縮
する。最終の溶液を凍結乾燥して200μｇの白色固体の
前述の生成物、すなわち、上に示した誘導化した組み換
え体ブタ成長ホルモンが得られる。

有利に、上の手順に従い、組み換え体ブタ成長ホルモ
ンの代わりに、適当な組み換え体動物成長ホルモンを使
用すると、次のものが得られる： １）（HO₃SCH₂CH₂CH₂‐Cys 183,191）組み換え体ウシ成
長ホルモン ２）（HO₃SCH₂CH₂CH₂‐Cys 183,191）組み換え体ヒツジ
成長ホルモン ３）（HO₃SCH₂CH₂CH₂‐Cys 183,191）組み換え体ウマ成
長ホルモン ４）（HO₃SCH₂CH₂CH₂‐Cys 183,191）組み換え体ヒト成
長ホルモン ５）（HO₃SCH₂CH₂CH₂‐Cys 183,191）組み換え体トリ成
長ホルモン 実施例11 修飾または誘導化した組み換え体動物成長ホルモンの安
定性のプロフィル リン酸塩緩衝液pH7.4（1000mlに蒸留中に溶解したNaH
₂PO₄ H₂O 3.45g、Na₂HPO₄ 3.55g、NaCl 9.50g）中の組
み換え体動物成長ホルモン誘導体（100mg/mlまで）の濃
厚溶液を調製する。これをミリポア（Millipore）無菌
ミレックス（Millex）‐0.22μｍのフィルター単位で濾
過し、そしてアリコートを管に入れる。これらを45℃の
炉に入れ、そして必要な間隔で取り出す。次いで、内容
物をリン酸塩緩衝液で希釈する。上澄み液をHPLCにより
モノマーおよび二量体についてアッセイする。質量のバ
ランスを実施し、沈澱した物質を記録する。結果を最初
の濃度と比較し、そして安定性のプロフィルを記載す
る。

あるいは、pH7.4において劣った安定性を示す成長ホ
ルモン誘導体を好ましさに劣るpH（４〜10）において溶
解するか、あるいは懸濁液として評価する。

実施例12 組み換え体動物成長ホルモン誘導体の非経口的投与のた
めの注射可能な微小球の調製 噴霧乾燥による微小球中への混入のために適当な大き
さの範囲の新規な組み換え体動物成長ホルモンの調製
は、組み換え体動物成長ホルモン誘導体を希水酸化アン
モニウム中に溶解し、次いで所望の塩、例えば、安息香
酸ナトリウムの溶液を添加することによって達成する。
非イオン性界面活性剤、例えば、エチレンオキシドおよ
びプロピレンオキシドのブロックコポリマーを添加し、
そして一定しておだやかに撹拌しながら溶解する。次い
で、この溶液を噴霧乾燥する。ブチ（Buchi）小型噴霧
乾燥器＃190をこの目的に使用できる。

熔融した脂肪、ろうまたはそれらの混合物中の、こう
して調製した活性成分および添加剤の均質な混合物を調
製し、そして得られる混合物を、入る空気および熔融し
た相を融点より高い温度に維持する加熱ジャケットを装
備した空気／液体噴霧ノズルを通して噴霧する。微小球
は熔融した滴として形成し、冷却し、そして約45〜180
ミクロンの所望の大きさの範囲の１系列の篩上に集め
る。所望の大きさ範囲でない微小球を再循環のために集
める。あるいは、均質混合物を遠心ディスク上に供給
し、そしてこうして形成した微小球を上のように集める
か、あるいは熔融した混合物を冷却し、そして所望の平
均粒子大きさ範囲に粉砕する。

本発明の組成物における使用に適当なろうおよび脂肪
は、一般に、40℃より高い融点を有する。これらのろう
は、グリセリドを含有しない以外、脂肪および油類に組
成が一般に類似する、室温において固体である、高分子
量の低融点の有機混合物または化合物として定義される
［ザ・コンデンスド・ケミカル・ディクショナリー（Th
e Condensed Chemical Dictionary）、第10版、ページ1
094、Van Nostrand Reinhold Publishers］。あるもの
は炭化水素である；他のものは脂肪酸およびアルコール
のエステルである。それらは脂質のなかに分類される。
ろうは熱可塑性であるが、高級ポリマーでないので、フ
ラスチックの族に入ると考えられない。共通の性質は撥
水性；滑らかなテキスチャー；無毒；不都合な臭いおよ
び色をもたないである。それらは燃焼性であり、そして
優れた誘電性を有する。ほとんどの有機溶媒中に溶解
し、水中に不溶性である。主なタイプは次のとおりであ
る： Ｉ、天然 １、動物性［蜂ろう、ラノリン、セラックワックス、チ
ャイニーズ・インセクト・ワックス（Chinese insect w
ax）］。

２、植物性（カルナウバ、カンデリラ、ヤマモモ、サト
ウキビ）。

３、好物 （ａ）化石または地ろう（オゾケライト、セレシン、モ
ンタンろう）。

（ｂ）石油ろう（パラフィン、微結晶質系統）（スラッ
クワックスまたはスケールワックス）。

II、合成 １、エチレン系ポリマーおよびポリオールエーテル−エ
ステル（「Carbowax）」ソルビトール）。

２、塩素化ナフタレン（「Halowax）」。

３、フィッシャー−トログシ合成による炭化水素タイ
プ。

本発明の脂肪は、高級脂肪酸、例えば、ステアリ酸お
よびパルミチン酸のグリセリルエステルとして定義する
ことができる。このようなエステルおよびそれらの混合
物は室温において固体であり、そして結晶質構造を示
す。脂肪と油との間に化学的差は存在せず、唯一の区別
は脂肪が室温において固体であり、そして油が液体であ
るということである。用語「脂肪」は通常特別にトリグ
リセリドを意味するが、「液体」はすべてを包含する。

脂肪は、好ましくは、長鎖C₁₀‐C₂₄脂肪酸、アルコー
ル、エステル、塩、エーテルまたはそれらと、主として
ステアレート、パルミテート、ラウレート、リノレエー
ト、ニノレネート、オレエート、および残留物またはそ
れらの混合物との混合物である、50℃より高い融点をも
つものは最も好ましい。グリセロールトリステアレート
は最も好ましい脂肪である。さらに、脂肪酸の新油性塩
類、例えば、ステアリン酸マグネシウムなどは、また、
適当である。

本発明の微小球は、製剤学的におよび薬理学的に許容
されうる液体中に分散させて、非経口的投与のための放
出が遅い組成物を形成する。賦形剤は水性の緩衝系また
は油系である。油は植物性または動物性の油である。好
ましい油は中性のトリグリセリドの液状脂肪である。中
性油は残留酸を含有しないものである。本発明の組成物
中の使用に適当な賦形剤は、次のものを包含する：水性
系、例えば、緩衝化生理的塩類溶液；有機溶媒、例え
ば、グリコールおよびアルコール；および水不混和性液
体、例えば、油、投与する活性成分の溶解度に依存す
る。得られるデータを表Ｉに報告する。

実施例13 胆汁酸の微小球 rpST誘導体および胆汁酸の緩衝液をブチ190型噴霧乾
燥器で噴霧乾燥する。この微細粒子の粉末（10部）を、
被覆物質の塩化メチレン溶液（１部）中に懸濁する。こ
の懸濁液を噴霧乾燥する。被覆した微小球を、注射前
に、適当な懸濁賦形剤中に懸濁する。これらの組成物を
表IIに記載する。組み換え体動物成長ホルモンの183お
よび191位置（ヒトについて184および191位置）におけ
る小さいループ中のシステインがアラニン、セリン、グ
ルタミン酸、アルギニン、リジンなどで置換されてい
る、修飾された組み換え体ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、
ヒトおよびオリ成長ホルモンを包含する、本発明の他の
誘導化または修飾した組み換え体動物成長ホルモンは、
表IIの記載に従って微小球として調製される。

実施例14 組み換え体動物成長ホルモンの移植体の調製 移植体は、所望の動物成長ホルモン誘導体および所望
の希釈剤の粉砕した均質な混合物の十分な量を秤量する
ことによって、調製される。次いで、この混合物をカー
バープレス（Carver press）で1000〜5000psigにおいて
直径0.476cm（3/16インチ）または0.318cm（1/8イン
チ）の円筒形ダイまたは回転錠剤プレスで要求されるポ
ンチおよびダイを使用して、圧縮する。次いで、こうし
て調製された移植体を、生物分解性または非生物分解性
の被膜で手順ＡおよびＢにより被覆する。

手順Ａ 非生物分解性シリコーンポリマー 清浄な等級のシリコーンエラストマー（10部）を硬化
剤（１部）と、時計皿上でスパチュラで混合する。これ
をデシケーター内で30分間脱気する。移植体をピンセッ
トの端でつかみ、シリコーンポリマー中に巻き込み、ア
ルミニウムはく上に端で配置し、そして40℃において５
時間硬化する。端の一方または双方をカミソリの刃で除
去して、被覆された円筒の「軸（shaft）」を残す。

あるいは、移植体をヘキサン中に分散された20％〜40
％の医学用接着剤［商品名SILASTIC^R、ダウ・コーニン
グ（Dow Corning）］で浸漬被覆し、そして40〜50℃に
おいて一夜乾燥および硬化した後、基剤の端の一方また
は双方から被膜を除去する。

手順Ｂ 生物分解性被膜 ポリマーまたはコポリマー（１部）をクロロホルム
（３〜８部）中に溶解する。各移植体をピンセットの端
でつかみ、ポリマー溶液中に浸漬し、次いでクロロホル
ムを室温において蒸発させる。各移植体を２回被覆す
る。被膜を室温において一夜乾燥した後、ポリマーの端
をカミソリの刃で除去し、被覆された円筒形の「軸」を
残す。

あるいは、rpSTまたは他の組み換え体動物成長ホルモ
ンを水溶液の形態で界面活性剤、緩衝塩および／または
防腐剤と配合する。次いで、この溶液をブチ190型噴霧
乾燥器で噴霧乾燥して、小さい粒子サイズの粉末を得
る。次いで、この粉末を脂肪またはろうと溶融配合し、
そして円筒形移植体に成形する。次いで、上のように調
製された移植体を生物分解性または非生物分解性のポリ
マーで手順ＡまたはＢを使用して被覆する。

実施例15 （Cam-Cys 183,191）rpSTを使用する移植体の調製およ
び生体外溶解による前記生体外の評価 1.3mlのCaCl₂に、92.4msのコポリ（グリセリド／ラク
チド）コポリマー、5.3mgのプロピレンオキシドおよび
エチレンオキシドの非イオン性ブロックコポリマー［pl
uronic 127、BASF Wyandottee Corp.）から市販されて
いる、平均分子量12,500、融点56およびブルックフィー
ルド粘度3100(cps)³⁵］、5.3mgの200メッシュのMg(OH)₂
および74.6mgの粉末状の（Cam-Cys 183,191）rpSTを添
加する。この混合物を撹拌し、大きい表面のペトリ皿上
に注ぎ、そしてCaCl₂を室温において蒸発させ、次いで
真空乾燥する。乾燥した残留物を集め、そしてやく1000
psigにおけるカーバープレスを使用して直径0.318cm（1
/8インチ）の円筒形の移植体に成形する。こうして形成
した移植体は各々60〜70mgの重量であり、そしてＩ−１
と表示する。

第２組の移植体を、ボルテックス−ゲニー（Vortex-g
enie）ミキサー内で、128mgの粉末状カスターろう（cas
torwax）（−270メッシュ）および32mgの（Cam-Cys 18
3,191）rpSTと混合することによって調製する。次い
で、こうして調製した混合物を前述の方法で直径0.318c
m（1/8インチ）の円筒形移植体に成形する。ペレットは
各々60〜70mgの重量であり、そしてＩ−２と表示する。

第３組の移植体を、また、前述の手順により96mgの−
270メッシュのカスターろうおよび64mgの粉末状（Cam-C
ys 183,191）rpSTを使用して調製する。前述のように調
製した0.318cm（1/8インチ）の直径の円筒形移植体は60
〜70mgの重量であり、そしてＩ−３と表示する。

次いで、こうして調製した移植体を生体外溶解の評価
にかける。移植体の各々を別々の10mlのリン酸塩緩衝液
（0.05％のアジ化ナトリウムを含む、pH7.4）を含有す
るプラスチック管に入れ、そして管を震盪する水のラッ
ク内に配置し、ここで管を震盪し、その間単位中の水の
温度を39℃に維持する。管を１日震盪し、次いで溶液を
各管から取り出し、HPLCによりrpSTについて分析し、そ
して溶液を廃棄する。新しいリン酸塩緩衝液を各管に添
加し、その後管をさらに３日間震盪する。各管からの溶
液を再びrpSTについてHPLCにより分析し、そして再び溶
液を廃棄する。新しいリン酸塩緩衝液を再び各管に添加
し、管を再び３日間震盪し、次いでrpSTについて再び分
析する。

これらの決定において使用した移植体は、得られた結
果と一緒に下に記載する。リン酸塩緩衝液は、蒸留水中
に1000mlに溶解した、NaH₂PO₄・H₂O 3.45g、Na₂HPO₄ 3.
55g、NaCl 9.5gである。

実施例16 マイクロカプセル化組み換え体動物成長ホルモンの調製 ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、0.85gを29.8gの
クロロホルム中に溶解し、そして２分間渦形成する。次
いで、25ミクロンのステンレス鋼の篩に通した乾燥した
組み換え体動物成長ホルモン誘導体（Cam-Cys 183,19
1）rpST、0.150gを、このポリマー／クロロホルム溶液
に添加し、そして３加熱渦形成する。タンパク質の得ら
れる懸濁液を、機械的撹拌装置を有する50mlの丸底容器
に供給する。撹拌速度は周囲温度において700rpmにセッ
トする。追加の3.2gのクロロホルムを使用して最初の容
器をすすぐ。次いで、合計のクロロホルムの量は32.95g
である。次いで、シリコーン油（350cs）を添加して
（８分かけて13.1g）ポリ（ラクチド−コ−グリセリ
ド）を沈澱させる。フラスコの内容物を4lのフラスコ内
の1720gのヘプタンに移し、機械的に撹拌する。３時間
後、硬化した微小球を１系列のステンレス鋼の篩に通し
て濾過し、そして真空下に乾燥する。

組み換え体動物成長ホルモンの55、166、183または19
1における１または２以上のシステイン、アミノ酸残基
が異なるアミノ酸残基で置換いる修飾された組み換え体
動物成長ホルモンあるいは55尾166位置の一方または双
方または183および191の間のサルファイド架橋の一方ま
たは双方が還元され、そして誘導化された、マイクロカ
プセル化に有用な他のポリマーおよび溶媒を下に記載す
る。

物質の記載において使用した略語は、次のとおりであ
る： A ＝重合した試料として B ＝再沈澱した試料 gly ＝グリコリド lact ＝ラクチド capro＝カプロラクトン TMC ＝トリメチレンカーボネート PHB ＝ポリヒドロキシブチレート PHV ＝ポリヒドロキシバレレート PEO ＝ポリエチレンオキシド 実施例17 修飾または誘導化した組み換え体動物成長ホルモンを与
える動物の成長の増強を決定する下垂体切除ラットの試
験 動物の成長速度を変更するための本発明の種々の修飾
（置換）または誘導化した組み換え体動物成長ホルモン
の効能は、下垂体切除（hypox）ラットのアッセイを利
用して決定する。下垂体切除したラットはそれ自身の成
長ホルモンを産生せず、そして注射したウシ成長ホルモ
ンに対して感受性である。測定する応答はある期間、例
えば、10日である。

下垂体切除したシロネズミ（Taconic Farms,Sprague
Dawley誘導）の各々に、0.2mlの記載する配合物中のブ
タ成長ホルモンの800マイクログラム（80μg/日）の10
日の投与量を与えるために十分な量の実施例XXにおいて
調製した組成物を注射する。あるいは、下垂体切除シロ
ネズミの各々を80マイクログラムのブタ成長ホルモン誘
導体を毎日注射する。

試験手順 試験の前に、動物を秤量し、そして試験に使用する動
物を体重に基づいて選択する。体重が群の平均の体重か
ら１標準偏差である動物のみを選択する。次いで、得ら
れる群を、コンピューター発生不規則化手順により８ラ
ット／群から成る処置群に不規則に分割する。次いで、
試験動物をきれいなかごに移し、そして４ラット／かご
で収容する。研究の最初の日に、試験動物を秤量し、そ
して過剰の体重の増加または損失（±5g）の動物を取り
替える。次いで、動物を試験群に割り当て、そして処置
する。

10日の試験期間の終わりに、各動物の合計の体重増加
を記録し、そして各処置について平均の体重増加／ラッ
トを決定する。これらの実験の結果を、下表XXに要約
し、これらの誘導体の生物活性を示す。

上のデータから明らかなように、修飾または誘導化組
み換え体ブタ成長ホルモンの各々は生物学的に活性であ
り、そして動物のきわめてすぐれた成長を提供する。

実施例18 誘導化組み換え体ブタ成長ホルモンを与えるブタの胴体
の評価 ブタを個々のおりに収容する。ブタの最初の体重はほ
ぼ60kgである。ブタを100kgの平均体重で屠殺する。試
験組成物の耳基部の注射は、４日の調節期間後に開始す
る。ブタに標準の「Cyホグ（Hog）規定食」を任意に与
え、そして水を任意に与える。

成長の性能は毎週の基準で決定する。次のデータを集
める：平均の毎日の増加、平均の毎日の飼料摂取、およ
び飼料効率。

ほぼ50kgの増加後、ブタを屠殺し、そして胴体（carc
ass）を評価する。次のデータを屠殺場において集め
る：温かい（hot）胴体の重量、半腱様筋（semitendino
sis）の重量、器官（肝臓、腎臓、心臓］の重量および
腎臓周辺脂肪層の重量。24時間冷却後、次の測定値を記
録する：胴体の長さ、背部脂肪（backfat）深さ［第１
リブ、最後のリブ、最後のぜい肉（last lumbar verteb
rae）、第10リブにおける3/4深さ、Ｐ−２］、腹部の深
さ、腰肉領域（loin eye area）、色、堅さ、マーブリ
ング（marbling）および筋肉のスコア。

この評価において、陰性の対照には生理的塩類溶液の
毎日の注射を与え、CAM-rpSTは上の実施例７に記載する
（Cam-Cys 183,191）rpSTであり、そして陽性の対照に
は自然pSTを毎日注射する。

胴体の評価−（Cam-Cys 183,191）rpST ６ブタ／処置を個々に収容し、そしてそれぞれ44から
94kgまでの生体重量の処置に投与する。成長および選択
した胴体のデータを相対的効能の計算と一緒に下に記載
する。

最終のブタの成長の性能および選択した胴体の特性へ
のカルボアミドメチル化rpST（CAM-rpST）の作用（最小
自乗法の平均） 実施例19 （Cam-Cys 183,191）rpSTを使用する窒素バランス実験 ブタを個々のステンレス鋼の代謝かごに収容する。ブ
タをかごに入れたとき、耳基部における注射を開始す
る。ブタを５日間新しい環境に調節させる。この期間
後、飼料の摂取を監視し、そしてすべてのブタが各日に
同一量の飼料（Cyホグ規定食）を消費するように調節す
る。糞便および尿の収集は一定の摂取後少なくとも３日
後に開始する。ブタには毎日２回の等しい量を供給し、
そして水は任意に与える。

合計の糞便および尿を５日間集める（収集は毎朝行
う）。Ｎの損失を減少するために、35mlのHClをプラス
チックの収集バケツに実験の収集期間の開始時および毎
日の収集後に添加する。集めた尿を一定に希釈し、体積
を記録し、次いでサンプリングし（50ml）、標識し、そ
して分析まで凍結する。糞便を毎日集め、標識したプラ
スチック袋中に入れ、そして分析まで凍結する。食べ残
しを、また、集め、秤量し、そして凍結する。飼料の小
さい試料を毎日取り、凍結し、そして分析の前にプール
する。

飼料および糞便の試料を100℃で一夜乾燥する（か、
あるいはこれより低い室温においてそれより長い時間乾
燥する）。乾燥した飼料および糞便の試料はウィリイ
（Wiley）ミルで粉砕し、そして２日間空気に平衡化す
る。飼料および糞便の乾燥物質およびＮ含量を決定す
る。すべての試料を自動化キールダール（Kjeldahl）手
順を使用して窒素について分析する。尿はそのまま分析
し、そして合計の毎日の尿の窒素の分泌を決定する。尿
を除外して、すべてのＮ値は乾燥物質基準で表す。

ブタの体重は調節の第１日、収集の第１日および収集
期間の完結時に記録する。これはブタが正のエネルギー
バランスにあることを保証する。

窒素のバランス 窒素のバランスの研究におけるCAM-rpSTの評価は、３
種類の実験について合計12頭の成長するブタを含んだ:
1、陰性の対照（毎日の生理的塩類溶液の注射）;2、CAM
-rpST、3mg/日；および３、陽性の対照、3mgの「自然」
PST。糞便および尿は２週の調節期間後７日間集めた。
結果および相対的活性の計算は、次のとおりである： 成長するブタへのカルボアミドメチル化rpST（CAM-Cy
s）および「自然」PSTの作用 実施例20 Cam-Cys^183,191）rpSTを使用するペーストの調製 安息香酸ナトリウム（７％w/w）およびエチレンオキ
シドおよびプロピレンオキシドのブロックコポリマー
（0.5％w/w）を含有するCam-Cys^183,191）rpSTの混合物
を、実施例13に記載する噴霧乾燥手順により調製する。

こうして調製した混合物（7.28g）を、カプリル酸、
カプリン酸およびカプロン酸のトリグリセリドの混合物
（Miglyol^R813）／大豆油（71ml）の4/1w/w/混合物中の
グリセリルトリステアレート（19.5g）の撹拌した溶液
に75〜80℃において添加する。この混合物を75〜80℃に
おいて均質になるまで撹拌し、次いで冷却する。得られ
る組成物は、重量基準で、Cam-Cys^183,191）rpST 6.96
％、安息香酸ナトリウム0.51％、界面活性剤（ブロック
コポリマー）0.03％および賦形剤73.0％から構成されて
おり、一般に、動物に皮下注射により、前記動物の頭ま
たは首の領域における皮下に投与される。

実施例21 （Ala-Cys^183,191）rpSTを含有する粘性注射可能なゲル
配合物の調製 ビーカー内の140gの超精製した大豆油に、12gのアル
ミニウムモノステアレートを添加する。この混合物を均
一になるまで撹拌し、そして30分にわたりほぼ140℃に
加熱し、このとき大豆油中のモノステアレートの見掛け
の溶解が起こる。ビカーをヒーターから取り出し、そし
てほぼ60℃に冷却する。次いで、噴霧乾燥した（Ala-Cy
s^183,191）rpSTを撹拌しながら添加して、均質に分布し
た懸濁液を生成する。粘性混合物を30mlの使い捨て注射
器に充填する。各注射器内の充填体積は20mlであり、こ
れは350mgの（Ala-Cys^183,191）rpSTを含有する。注射
器にゲル混合物を充填した後、組成物はクリーム状の硬
質に固化するが、押し出し可能なゲルである。次いで、
包装した注射器を使用するまで冷蔵庫に貯蔵する。

実施例22 Ala-Cys^183,191rpSTを使用するペーストの調製 ゴマ油（4.18g）およびゲルシレ（Gelucire）46/07
（Cattlefosse-0.74g）を、撹拌棒を使用して、ガラス
容器内で混合する。次いで、これを撹拌しながら均質に
なるまで65℃に加熱する。撹拌棒を除去し、そして0.05
2gのAla-Cys^183,191rpSTを添加して配合物を形成する。

実施例23 亜鉛関連Ala-Cys^183,191rpSTおよびそのペーストの調製 Ala-Cys^183,191を0.09モルのトリス溶液中に21.5mgの
rpST/mlで、40℃およびpH9.5において溶解する。これを
撹拌しながら１モルのZnCl₂の添加により亜鉛塩に転化
する。亜鉛塩は沈澱する。それを遠心により10,000×ｇ
において30分間で回収し、40℃に溶液を維持する。これ
を凍結乾燥して粉末を得る。ビーカー内の140gのゴマ油
に、12gのアルミニウムモノステアレートを添加する。
内容物を155℃に撹拌しながら加熱する（モノステアレ
ートが溶解するまで）。ビーカーをヒーターから除去
し、そして放冷する。冷却すると、溶液はゲルとなる。
このゲルをボールミル（高剪断撹拌機およびステンレス
鋼の球を装備する）中に供給する。ミルを真空にし、そ
して組成物が40％の亜鉛粉末を含有するまで、亜鉛粉末
をゆっくり添加する。亜鉛粉末のメジアン直径が10ミク
ロン以下に減少するまで、撹拌を続ける。ステンレス鋼
の球をゲルから除去し、そしてゲルを注射器に入れる。

上に言及したDNA菌株は、1988年８月23日にATCCに受
託された。それらはmpllpSTAE34ATCC No.40482）、pRO2
11（ATCC No.40483）およびpig24（ATCC No.40484）で
ある。当業者は認識するように、これらのDNAは適当な
発現系中に挿入して、本発明の成長ホルモンまたはその
突然変異体を得ることができる。

本発明の新規な動物成長ホルモンのあるものを発現す
るE.coli K12バクテリア菌株は、また、1988年８月23日
にATCCに受託された。バクテリア菌株は、次のものを包
含する:E.coli 菌株1655（ATCC No.67762）、1655/pRO
pSTA34（ATCC No.67763）、1655/pROpSTE34（ATCC No.6
7764）、1655/pROpST（ATCC No.67765）、4200（ATCC N
o.67766）、4200/pROpSTA34（ATCC No.67767）、4200/p
ROpSTE34（ATCC No.67768）、420/pROpST（ATCC No.677
69）、4255（ATCC No.67770）、4255/pROpSTA34（ATCC
No.67771）、4255/pROpSTE34（ATCC No.67772）、4255/
pROpST（ATCC No.67773）、4300（ATCC No.67774）、19
89年７月14日に受託されたpROpST-SXAK182UAG（ATCC 68
056）および1989年７月14日に受託されたpROpST-SX183,
191del（ATCC 68057）。

実施例24 ２つの合成オリゴヌクレオチドを使用する小さいループ
のジサルファイド結合中のシステインの欠失 C183delと表示する合成オリゴヌクレオチドは、次の
配列を有する： このオリゴヌクレオチドはrpST遺伝子の類似のDNA配
列と２つの面で異なる。第１に、位置183におけるシス
テインコドンをエンコードするDNAはオリゴヌクレオチ
ドにおいて欠失されている。第２に、位置184における
アルギニンコドンをエンコードするDNAはオリゴヌクレ
オチドにおいてCGCからAGAに変換されており、その後者
はまたアルギニンをエンコードする。したがって、位置
183に存在するシステインは欠失される。

一本鎖pGEM-3z（ｆ＋）pST-SX DNAは、突然変異誘発
のための基質である。このDNAは商業的に入手可能なフ
ァージミド（phagemid）、pGEM-3z（ｆ＋）中に含有さ
れる修飾あれたrpST遺伝子から構成されている。rpST遺
伝子の修飾は、DNA配列を変更して、解読領域の位置225
-230におけるScaI制限エンドヌクレアーゼ切断部位の導
入を可能とし、そして位置285-290におけるXbaI制限エ
ンドヌクレアーゼ切断部位の導入を可能とする。DNA配
列におけるこれらの変更は、rpSTタンパク質のアミノ酸
配列を変化させない。標準の手順を使用してこれらの制
限エンドヌクレアーゼで切断したEcoRI/HindIII断片
は、ファージミドpGEM-3z（ｆ＋）pST-SXを生ずる。一
本鎖pST-3z（ｆ＋） DNAは標準のプロトコルにより精製
したファージから調製される。2000ngのこのDNAを100ng
のC183delオリゴヌクレオチドと混合し、後者は前以て
５′においてアデノシン５′トリホスフェートおよびポ
リヌクレオチドキナーゼでリン酸化されている。この混
合物を１×アニーリング緩衝液（１×アニーリング緩衝
液は75ミリモルのKClおよび５ミリモルのトリス−Cl、p
H8.0である）中の10μｌの合計の体積中に含有される。
この混合物を65℃に７分間加熱し、次いで室温において
10分インキュベーションする。この手順はオリゴヌクレ
オチドを一本鎖の基質のDNAにアニーリングする。アニ
ーリングした分子を、22μｌのH₂O、１μｌの20ミリモ
ルのATP、２単位のDNAリガーゼおよびDNAポリメラーゼ
Ｉの大きい断片の各々［単位の定義については、ニュー
・イングランド・バイオラブス（New England Biolab
s）のカタログ、1986参照］、２μｌの20×dNTP（各々
２ミリモルの濃度における４つのデオキシリボヌクレオ
チド５′トリホスフェートの混合物）および４μｌの10
×充填緩衝液（１×充填緩衝液は27.5ミリモルのトリス
−Cl pH7.5、15ミリモルのMgCl₂、２ミリモルのDDT）の
添加により、共有結合的に閉じた二本鎖DNAに変換す
る。室温において１時間インキュベーションした後、反
応混合物の半分をHB101の能力細胞中に標準の形質転換
のプロトコルにより導入する。37℃において一夜インキ
ュベーションした後、コロニーをニトロセルロースのフ
ィルター上へ移し、そしてその５′末端にガンマ−³²P
‐ATPおよびオリゴヌクレオチドキナーゼで放射線標識
することによって所望の突然変異の検出によりハイブリ
ダイゼーションのために処理する。37℃において５×SS
C、１×デンハルト溶液および150μg/mlの酵母tRNA中で
３時間予備ハイブリダイゼーションした後、放射線標識
したオリゴヌクレオチドを添加し、そしてDNAと37℃に
おいて一夜フィルター上でハイブリダイゼーションす
る。フィルターを30分間37℃において５×SSC中で洗浄
し、次いで30分間TAC中で61.5℃において洗浄する。こ
の後者の洗浄の間、プラスミドDNAが所望の突然変異を
含有するコロニーのみは放射線標識したオリゴヌクレオ
チドプローブとハイブリダイゼーションし続ける。これ
らのコロニーを洗浄したフィルターをＸ線フィルムに露
光後検出する。プラスミドDNAをもとのペトリ平板から
のこれらのコロニーのいくつかから調製し、前述のよう
にHB101能力細胞中に導入し、そして上のように放射線
標識したオリゴヌクレオチドプローブで再スクリーニン
グする。プラスミドDNAをDNAがプローブとハイブリダイ
ゼーションするコロニーから調製し、そして所望のDNA
配列について分析する。分析したすべてのクローンはC1
83del突然変異を含有する。pGEM-3z（ｆ＋）pST-SXC183
delと表示する、１つのクローンからのプラスミドDNAを
JM101能力細胞中に形質転換により導入し、そして一本
鎖DNAを単一の形質転換から誘導した精製したファージ
から調製する。

位置191においてシステインをエンコードするDNAを欠
失するために、C191delと表示する次のオリゴヌクレオ
チドを合成する： このオリゴヌクレオチドは、rpSTにおける類似のDNA
と２つの面で異なる。第１に、位置191におけるシステ
インコドンをエンコードするDNAはオリゴヌクレオチド
において欠失されている。第２に、位置190におけるセ
リンをエンコードするDNAはオリゴヌクレオチドにおい
てABCからTCGに変換されており、後者はまたセリンをエ
ンコードする。

pGEM-3z（ｆ＋）pST-SXC183delからの鋳型一本鎖DNA
およびC191delオリゴヌクレオチドを、前のようにアニ
ーリングし、伸長し、そして結合する。この混合物をHA
101能力細胞中に導入し、そして形質転換体を正確にC18
3delについて記載したように突然変異の存在について分
析する。C191delオリゴヌクレオチドを放射線標識プロ
ーブとして使用する。ハイブリダイゼーションおよび洗
浄の条件は、正確にC183delについて記載したとおりで
ある。C191delを含有するいくつかのクローンをDNA配列
の分析から同定する。C183およびC191の欠失を含有する
プラスミドDNAを、pGEM-3z（ｆ＋）pST-SXC183,191del
と表示する。

本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。

１、組み換え体動物成長ホルモン中の４つのシステイン
アミノ酸残基の少なくとも１つが置換、修飾、排除また
は誘導化されていることを特徴とする、組み換え体動物
成長ホルモン。

２、小さいループにおける２つおよび大きいループにお
ける２つの４つ（４）のシステインのうちで、少なくと
も１つ（１）は、アルギニン、リジン、アスパラギン
酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチ
ジン、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、
バリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシ
ン、メチオニン、セリン、スレオニンまたはプロリンか
ら個々に選択されるアミノ酸により置換されている、上
記第１項記載の組み換え体動物成長ホルモン。

３、小さいループにおける２つおよび大きいループにお
ける２つの４つ（４）のシステインのうちで、少なくと
も１つ（１）は欠失されている、上記第１項記載の組み
換え体動物成長ホルモン。

４、４つのシステインはシステイン酸に修飾されてい
る、上記第１項記載の組み換え体動物成長ホルモン。

５、小さいループにおける２つ（２）または大きいルー
プにおける２つ（２）または両者のループにおけるすべ
ての４つ（４）のシステインは、(CH₂COOH)；［(CH(CO₂
H)(CH₂)_xCO₂H］、(CH₂CONR₃R₄)、(R₅)、［(CH₂)_nS
O^- ₃］、(CHCH₂CONR₃CO)、［(CH₂)_mNR₃R₄］、(CH₂OCOCH₂
R₅)または(SR₆)から選択される置換基で誘導化されてお
り；R₃およびR₄は各々Ｈ、［(CH₂)_xCO₂H］、［CH(CO₂H)
(CH₂)_xCO₂H］、C₁‐C₆アルキル（前記アルキル基は０〜
６のヒドロキシル基で置換されていてもよい）またはポ
リエチレングリコールであり；R₅はC₁‐C₆アルキルまた
はC₁‐C₄アルコキシメチルであり、そしてR₆はC₁‐C₆ア
ルキル、ポリエチレングリコールまたはフェニル（前記
フェニルは１つまたは２つのカルボン酸またはスルホン
酸基で置換されていてもよい）であり;nは０〜４の整数
であり;mは２〜４の整数であり、そしてｘは１〜３の整
数であり；ただし前記組み換え体動物成長ホルモンのシ
ステインアミノ酸残基が誘導化されているとき、前記成
長ホルモンの小さいループ中の両者のシステイン残基ま
たは大きいループ中の両者のシステイン残基は同一の基
で置換されており、そして、また、小さいループ中のシ
ステインアミノ酸残基上の置換基は前記成長ホルモンの
大きいループ中のシステインアミノ酸残基上の置換基と
同一であるか、あるいは異なることができる、上記第１
項記載の組み換え体動物成長ホルモン。

６、前記動物成長ホルモンは（Ala^183,191）rpST;（Ala
^183,191）rbST;（Ala^183,191）roST;（Ala^183,191）raS
T;（Ser^183,191）rpST;（Ser^183,191）rbST;（Ser
^183,191）roST;（Ser^183,191）raST;（Glu^183,191）rpS
T;（Glu^183,191）rbST;（Glu^183,191）roST;（Glu
^183,191）raST;（Glu¹⁸³−Ala¹⁹¹）rpST;（Glu¹⁸³−Ala
¹⁹¹）rbST;（Glu¹⁸³−Ala¹⁹¹）roST;（Glu¹⁸³−Al
a¹⁹¹）raST;（Glu¹⁸³−Ser¹⁹¹）rpST;（Glu¹⁸³−Se
r¹⁹¹）rbST;（Glu¹⁸³−Ser¹⁹¹）roST;（Glu¹⁸³−Se
r¹⁹¹）raST;（Arg^183,191）rpST;（Trp^183,191）rpST;
（Asp^183,191）rpSTおよび（Asn^183,191）rpSTである、
上記第１項記載の修飾組み換え体動物成長ホルモン。

７、前記組み換え体動物成長ホルモンは、 ここでR₁およびR_1aはCys、Cys(CH₂COOH)、Cys［CH(CO
₂H)(CH₂)_xCO₂H］、Cys(CH₂CONR₃R₄)、Cys(R₅)、Cys(C
H₂)_nSO^- ₃、Cys(CHCH₂CONR₃CO)、Cys(CH₂)_mNR₃R₄、Cys(C
H₂OCOCH₂R₅)、またはCys(SR₆)であり；R₂およびR_2aはCy
s、Cys(CH₂COOH)、Cys［CH(CO₂H)(CH₂)_xCO₂H］、Cys(CH
₂CONR₃R₄)、Cys(R₅)、Cys(CH₂)_nSO^- ₃、Cys(CHCH₂CONR₃C
O)、Cys(CH₂)_mNR₃R₄、Cys(CH₂OCOCH₂R₅)、またはCys(SR
₆)であり；R₃およびR₄は各々Ｈ、［(CH₂)_xCO₂H］、［(C
H(CO₂H)(CH₂)_xCO₂H］、C₁‐C₆アルキル（前記アルキル
は０〜２つのヒドロキシル基で置換されていてもよい）
またはポリエチレングリコールであり；R₅はC₁‐C₆アル
キルまたはC₁‐C₄アルコキシメチルであり、そしてR₆は
C₁‐C₆アルキル、ポリエチレングリコールまたはフェニ
ル（前記フェニルは１つまたは２つのカルボン酸または
スルホン酸基で置換されていてもよい）であり;nは０〜
４の整数であり;mは２〜４の整数であり；そしてｘは１
〜３の整数であり；ただしR₁およびR_1aがCysであると
き、R₂およびR_2aは誘導化されたCysでなくてはならず；
そしてR₂およびR_2aがCysであるとき、R₁およびR_1aは誘
導化されたCysでなくてはならず；そして、また、R₁お
よびR_1a、あるいはR₂およびR_2aのいずれかがCysである
とき、ジサルファイド架橋は前記R₁およびR_1aあるいは
前記R₂およびR_2aにより表される２つのCys官能の間で形
成される、上記第５項記載の組み換え体動物成長ホルモ
ン。

８、R₁およびR_1aはCys(CH₂OOH)であり、そしてR₂および
R_2aはCysである、上記第７項記載の組み換え体動物成長
ホルモン。

９、R₁およびR_1aはCys(R₅)であり、R₅はC₁‐C₆アルキル
またはC₁‐C₄アルコキシメチルであり、そしてR₂および
R_2aはCysである、上記第７項記載の組み換え体動物成長
ホルモン。

10、R₁およびR_1aはCys(SR₆)であり、R₆はC₁‐C₆アルキ
ル（前記アルキル基は約０〜２つのヒドロキシル基で置
換されていてもよい）、プロピレングリコールまたはフ
ェニル（前記フェニルは１つまたは２つのカルボン酸ま
たはスルホン酸の置換基で置換されていてもよい）であ
り、そしてR₂およびR_2aはCysである、上記第７項記載の
組み換え体動物成長ホルモン。

11、R₁およびR_1aはCys(CH₂)_nSO^- ₃であり、ｎは１〜４の
整数であり、そしてR₂およびR_2aはCysである、上記第７
項記載の組み換え体動物成長ホルモン。

12、R₁およびR_1aはCys(CH₂CONR₃R₄)であり、R₃およびR₄
は各々Ｈ、C₁‐C₆アルキル、ポリエチレングリコール、
［(CH₂)_xCO₂H］または［CH(CO₂H)(CH₂)_xCO₂H］であり、
ｘは１〜３の整数であり、そしてR₂およびR_2aはCysであ
る、上記第７項記載の組み換え体動物成長ホルモン。

13、R₁およびR_1aはCys［CH(CO₂H)(CH₂)_xCO₂H］であり、
ｘは１または２であり、そしてR₂およびR_2aはCysであ
る、上記第７項記載の組み換え体動物成長ホルモン。

14、R₂およびR_2aはCys(R₅)であり、R₅はC₁‐C₆アルキル
またはC₁‐C₄アルコキシメチルであり、そしてR₁および
R_1aはCysである、上記第７項記載の組み換え体動物成長
ホルモン。

15、R₂およびR_2aはCys(SR₆)であり、R₆はC₁‐C₆アルキ
ル（前記アルキル基は約０〜２つのヒドロキシル基で置
換されていてもよい）、プロピレングリコールまたはフ
ェニル（前記フェニルは１つまたは２つのカルボン酸ま
たはスルホン酸置の換基で置換されていてもよい）であ
り、そしてR₁およびR_1aはCysである、上記第７項記載の
組み換え体動物成長ホルモン。

16、R₂およびR_2aはCys(CH₂)_nSO^- ₃であり、ｎは１〜４の
整数であり、そしてR₁およびR_1aはCysである、上記第７
項記載の組み換え体動物成長ホルモン。

17、R₂およびR_2aはCys(CH₂CPNR₃R₄)であり、R₃はＨ、C₁
‐C₆アルキルまたはプロピレングリコールであり、R₄は
C₁‐C₆アルキルまたはポリエチレングリコールであり、
そしてR₁およびR_1aはCysである、上記第７項記載の組み
換え体動物成長ホルモン。

18、前記成長ホルモンは（CH₃S‐Cys^183,191)組み換え
体ブタ成長ホルモンである、上記第７項記載の組み換え
体動物成長ホルモン。

19、前記成長ホルモンは、（HO₃SCH₂CH₂CH₂Cys^183,191)
組み換え体ブタ成長ホルモンである、上記第７項記載の
組み換え体動物成長ホルモン。

20、R₁およびR_1aはCys(CHCH₂CONR₃CO)であり、そしてR₃
はC₁‐C₆アルキルであり、そしてR₂およびR_2aはCysであ
る、上記第５項記載の組み換え体動物成長ホルモン。

21、R₁およびR_1aは(CH₂)_mNR₃R₄であり、ｍは１であり、
R₃はＨであり、R₄はC₁‐C₆アルキルであり、そしてR₂お
よびR_2aはCysである、上記第５項記載の組み換え体動物
成長ホルモン。

22、R₁およびR_1aは(CH₂OCOCH₂R₅)であり、R₅はC₁‐C₆ア
ルキルであり、そしてR₂およびR_2aはCysである、上記第
５項記載の組み換え体動物成長ホルモン。

23、組み換え体動物成長ホルモンを、水中にあるいはグ
アニジン塩酸塩または重炭酸ナトリウムを含有する水溶
液中に溶解し、前記溶液のpHを8.4の値に調節し、前記p
H調節溶液をジチオスレイトールで処理し、その後、こ
うして形成した混合物をハロアセトアミド、ハロ酢酸、
アルカリ金属テトラチオネート、C₁‐C₄アルキルメタン
チオスルホネートまたはC₁‐C₆アルキルスルホンで処理
し、得られる混合物を限外濾過により脱塩し、そして得
られる脱塩混合物を再希釈、再濾過および凍結乾燥し、
これによりシステイン残基におけるサルファイド架橋の
少なくとも一方または双方を還元し、そしてシステイン
アミノ酸残基を誘導化することを特徴とする、組み換え
体動物成長ホルモンの凝集を抑制する方法。

24、前記組み換え体動物成長ホルモンは、 ここでR₁およびR_1aまたはR₂およびR_2aで表されるシス
テイン残基におけるサルファイド架橋の１つまたは２つ
は還元されており、そしてシステインアミノ酸残基は、
独立に、Cys、Cys(CH₂COOH)、Cys(CH₂CONR₃R₄)、Cys
(R₅)、Cys(CH₂)_nSO^- ₃、Cys(CHCH₂CONR₃CO)、Cys(CH₂)_mN
R₃R₄、Cys(SO^- ₃)、Cys(CH₂OCOCH₂R₅)またはCys(SR₆)で
あり；R₃およびR₄は各々Ｈ、［(CH₂)_xCO₂H］、［(CH(CO
₂H)(CH₂)_xCO₂H］、C₁‐C₆アルキル（前記アルキルは０
〜２つのヒドロキシル基で置換されていてもよい）また
はポリエチレングリコールであり；R₅はC₁‐C₆アルキル
またはC₁‐C₄アルコキシメチルであり、そしてR₆はC₁‐
C₆アルキル、ポリエチレングリコールまたはフェニル
（前記フェニルは１つまたは２つのカルボン酸またはス
ルホン酸基で置換されていてもよい）であり;nは１〜４
の整数であり；そしてｍは１〜６の整数であり；ただし
R₁およびR_1aがCysであるとき、R₂およびR_2aは誘導化さ
れたCysでなくてはならず；そしてR₂およびR_2aがCysで
あるとき、R₁およびR_1aは誘導化されたCysでなくてはな
らず；そして、また、R₁およびR_1a、あるいはR₂およびR
_2aのいずれかがCysであるとき、ジサルファイド架橋は
前記R₁およびR_1aあるいは前記R₂およびR_2aにより表され
る２つのCys官能の間で形成される、上記第23項記載の
方法。

25、前記成長ホルモンのＣ−末端に最も近くかつ前記組
み換え体動物成長ホルモンの不安定な小さいループ中の
２つのシステインアミノ酸残基の間で形成されたジサル
ファイド架橋を還元および誘導化する、上記第24項記載
の方法。

26、前記成長ホルモンのＮ−末端に存在しかつ前記組み
換え体動物成長ホルモンの安定な大きいループ中の２つ
のシステインアミノ酸残基の間で形成されたジサルファ
イド架橋を還元および誘導化する、上記第24項記載の方
法。

27、（１）成長ホルモンの大きいループ中の２つのシス
テインアミノ酸残基および（２）前記成長ホルモンの小
さい不安定なループ中の２つのシステインアミノ酸残基
の間で形成されたジサルファイド架橋の両者を還元およ
び誘導化する、上記第24項記載の方法。

28、組み換え体動物成長ホルモンのシステインアミノ酸
残基の少なくとも１つないしすべての４つ（４）を、ア
ルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ア
スパラギン、グルタミン、ヒスチジン、アラニン、グリ
シン、イソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラ
ニン、トリプトファン、チロシン、メチオニン、セリ
ン、スレオニンまたはプロリンから別々に選択される１
つ（１）ないし４つ（４）のアミノ酸残基で置換するこ
とを特徴とする、組み換え体動物成長ホルモンの凝集を
抑制する方法。

29、成長ホルモンのＣ−末端に対して183および191位置
に位置する、前記成長ホルモンの不安定な小さいループ
中のシステインの１つ（１）または２つ（２）を、アラ
ニン、セリン、グルタミン酸、アルギニン、トリプトフ
ァンまたはアスパラギンから選択されるアミノ酸で置換
し、そして安定な大きなループ中の55および166位置に
おけるシステインを置換しない、上記第28項記載の方
法。

30、組み換え体動物成長ホルモンのシステインアミノ酸
残基の少なくとも１つ（１）ないしすべての４つ（４）
を欠失することを特徴とする、組み換え体動物成長ホル
モンの凝集を抑制する方法。

31、組み換え体動物成長ホルモンのシステインアミノ酸
残基の４つ（４）をシステイン酸に酸化することを特徴
とする、組み換え体動物成長ホルモンの凝集を抑制する
方法。

32、183および191位置に位置するシステイン酸アミノ酸
残基を、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタ
ミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、アラ
ニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、フ
ェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、メチオニ
ン、セリン、スレオニンまたはプロリンから個々に選択
されるアミノ酸で置換されている組み換え体動物成長ホ
ルモンからなることを特徴とする、製剤学的組成物。

33、183または191または両者の位置に位置するシステイ
ンアミノ酸残基が欠失されている組み換え体動物成長ホ
ルモンからなることを特徴とする、製剤学的組成物。

34、成長促進量の修飾または誘導化された組み換え体動
物成長ホルモンまたは製剤学的に許容されうるそれらの
塩類、および製剤学的に許容されうる固体または液状担
体からなり、延長した期間にわたって動物の成長速度を
増加するために有効であることを特徴とする、製剤学的
組成物。

35、前記組成物は前記動物に非経口的に投与される、上
記第34項記載の組成物。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ブタ成長ホルモンのM13mp11中へのクローニ
ングを示す。M13mp11 RF DNAを制限酵素EcoRIおよびHin
dIIIで切断し、仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼで処
理する。発現プラスミドpEFF-902の制限酵素EcoRIおよ
びHindIIIで消化する。適当な断片を１％のアガロース
ゲルの電気泳動後で精製する。精製した断片を結合し、
そしてE.coli JM101中に形質転換する。得られるM13mp1
1pST- RF DNAの構造を示す。 第２図は、AA1オリゴヌクレオチドおよびM13mp11pST−
一本鎖DNAを使用する、突然変異誘発の概略的表示であ
る。 第３図は、サンガー（Sanger）ジデオキシ連鎖停止法を
使用する、M13mp11ST一本鎖DNAおよびM13mp11pST34−一
本鎖DNAのDNA配列の分析結果を示す電気泳動の写真であ
る。左から右のレーンの順序は、野生型ブタ成長ホルモ
ン（pST）についてのGATCおよび引き続く突然変異pSTA3
4についてのGATCである。 第４図は、オリゴヌクレオチドGLU3およびGLU4およびM1
3mp11pST−一本鎖DNAを使用する、突然変異誘発の概略
的表示である。 第５図は、突然変異したpST遺伝子を含有するバクテリ
アの発現ベクターの構成の概略的表示であり。プラスミ
ドは抗生物質アンピシリンに対する耐性（amp^R）を与え
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブライアン・リー・バツクウオルター アメリカ合衆国ペンシルベニア州19067 ヤードレイ・オビントンロード 102 (72)発明者 ジエラルド・ダブリユー・ストツクトン アメリカ合衆国ペンシルベニア州19076 ヤードレイ・サウスミルトンドライブ 391 (72)発明者 デボラ・ターデイ・チヤレフ アメリカ合衆国ニユージヤージイ州 08534 ペニントン・アービダドライブ 31 (56)参考文献 特開 昭61−28392（ＪＰ，Ａ) Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｖｏ ｌ．153（1985）ｐ．445−449 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ. 25（1986）ｐ．6907−6917 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/18 C12P 21/02 C07K 14/61 A61K 37/36 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】組み換え体動物成長ホルモンの小さいルー
   プ中の２つのシステインアミノ酸残基の少なくとも１つ
   が置換、修飾、排除または誘導化されており、そして持
   続放出製剤用として安定でありかつ、適するものである
   ことを特徴とする、組み換え体動物成長ホルモン。
2. 【請求項２】組み換え体動物成長ホルモンを、水中にあ
   るいはグアニジン塩酸塩または重炭酸ナトリウムを含有
   する水溶液中に溶解し、前記溶液のpHを8.4の値に調節
   し、前記pH調節溶液をジチオスレイトールで処理し、そ
   の後、こうして形成した混合物をハロアセトアミド、ハ
   ロ酢酸、アルカリ金属テトラチオネート、C₁−C₄アルキ
   ルメタンチオスルホネートまたはC₁−C₆アルキルスルホ
   ンで処理し、得られる混合物を限外濾過により脱塩し、
   そして得られる脱塩混合物を再希釈、再濾過および凍結
   乾燥し、これにより該動物成長ホルモンの小さいループ
   中のシステインアミノ酸残基におけるサルファイド架橋
   を少なくとも還元し、そして該システインアミノ酸残基
   を誘導化することを特徴とする、組み換え体動物成長ホ
   ルモンの凝集を抑制しかつ、安定性を増大させる方法。
3. 【請求項３】組み換え体動物成長ホルモンの小さいルー
   プ中のシステインアミノ酸残基の少なくとも１つを、ア
   ルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ア
   スパラギン、グルタミン、ヒスチジン、アラニン、グリ
   シン、イソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラ
   ニン、トリプトファン、チロシン、メチオニン、セリ
   ン、スレオニンまたはプロリンから別々に選択されるア
   ミノ酸残基で置換することを特徴とする、組み換え体動
   物成長ホルモンの凝集を抑制しかつ、安定性を増大させ
   る方法。
4. 【請求項４】組み換え体動物成長ホルモンの小さいルー
   プ中のシステインアミノ酸残基の少なくとも１つを欠失
   することを特徴とする、組み換え体動物成長ホルモンの
   凝集を抑制しかつ、安定性を増大させる方法。
5. 【請求項５】組み換え体動物成長ホルモンの小さいルー
   プ中のシステインアミノ酸残基の２つをシステイン酸に
   酸化することを特徴とする、組み換え体動物成長ホルモ
   ンの凝集を抑制しかつ、安定性を増大させる方法。
6. 【請求項６】183および191位置に位置するシステイン酸
   アミノ酸残基を、アルギニン、リジン、アスパラギン
   酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチ
   ジン、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、
   バリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシ
   ン、メチオニン、セリン、スレオニンまたはプロリンか
   ら個々に選択されるアミノ酸で置換されている組み換え
   体動物成長ホルモンを有効成分とする、製剤学的組成
   物。
7. 【請求項７】183または191または両者の位置に位置する
   システインアミノ酸残基が欠失されている組み換え体動
   物成長ホルモンを有効成分とすることを特徴とする、製
   剤学的組成物。
8. 【請求項８】成長促進量の請求項１記載の組み換え体動
   物成長ホルモンまたは製剤学的に許容されうるそれらの
   塩類、および製剤学的に許容されうる固体または液状担
   体からなり、長期間にわたって動物の成長速度を増加す
   るために有効であることを特徴とする、製剤学的組成
   物。