PT91391A - Processo para a preparacao de derivados de proteina c humana hibrida por tecnologia genetica e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

Descrição referente à patente de invenção de HOECHST JAPAN LIMITED, alemã, industrial e comerei al, com sede em 10-16, 8-chome, Akasaka, Minato-ku, Tokyo, Japão, (inventores: Tamotsu Hashimoto e Mikiko Takahashi, residentes no Japão), para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE DERIVADOS DE PROTEÍNA C HUMANA HlBRIDA POR TECNOLOGIA GENÉTICA E DE COMPOSI-ÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTSM".

DESCRIÇÃO 1. Campos Aplicados na Indústria A presente invenção refere-se a novos construtos de proteína C híbridos que têm actividade anticoagula ção do sangue. 2. Enquadramento Geral Tecnológico A proteína humana C é um precursor de uma serina-protease detectada no plasma humano.

Sabe-se bem que a proteína C humana é ac-tivada por um complexo de trombina-trombomodulina. A proteína ac | tivada C inibe a coagulação do sangue por inactivação do factor ^ VlIIa e do factor Va na presença de iões cálcio ou acelera a fi- N.

brinólise do sangue através da inactivação do inibidor do activa dor do plasminogênio dos tecidos (na presente memória descritiva, designado por "PAI").

Os genes que codificam proteína C humana e bovina foram clonados e sequenciados por Foster e col., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82, 4673 - 4677 (1985) e por Long e col., Proc. Natl. Acad. Sei USA, 81, 5653 - 5656 (1984), respectivamen te. A proteína C humana tem nove resíduos de ácido glutâmico característicos nas posições 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26 e 29, na região do terminal de amino e a proteína bovina C tem dois resíduos de ácido glutâmico característicos adicionais nas posições 23 e 35. Estes resíduos de ácido glutâmico são carboxilados no seu carbono gama por modificação pós-transla cional dependente da vitamina K. O domínio que inclui estes resíduos de ácido gama-carboxilo-glutâmico (na presente memória descritiva, designado por "domínio Gla") é necessário para a formação comple xa na presença de cálcio com fosfolípidos carregados negativamen te na membrana das células. A função do domínio Gla foi revista em Taisha (Metabolism) , 19^, NQ. 9 (1982) (em japonês) . A proteína C bovina tem actividades seme lhantes às da proteína C humana e a homologia das estruturas prjL márias entre estas proteínas sabe-se que é muito grande. 3. Finalidades da Invenção A finalidade da presente invenção é proporcionar um novo construto de proteína C híbrida preparada por substituição do domínio Gla da proteína C humana por um correspondente segmento de proteína C bovina para incrementar a activi-dade de ligação do cálcio da proteína C humana, aumentando o número de resíduos de ácido gama-carboxil-glutâmico de nove para Dnze e, em seguida, aumentar a sua activação ou a actividade própria da proteína C. 2 f

4, Construção da Invenção A presente invenção refere-se a proteínas híbridas construídas substituindo o domínio Gla de proteína humana C pelo domínio Gla de proteína C bovina ou com o seu equi valente.

As sequências de aminoãcidos próximas da extremidade de amino da proteína C humana e da proteína C bovina encontram-se indicadas na Tabela 1.

Os resíduos de aminoãcidos na Tabela 1 são abreviados da seguinte maneira A = Ala; N = Asn; S = Ser; F = Phe; L = Leu; E = Glu; R =* Arg; H - His; C = Cys; I = Ile; D = Asp; K = Lys; Q = Gin; V = Vai; P = Pro; T = Thr; W = Trp; M = Met; G = Gly; Y = Tyr.

Os resíduos de ácido glutâmico, designados por E nesta Tabela, são gama-carboxilados.

Na presente invenção, a sequência de ami no-ácidos que inclui o domínio Gla indica a sequência de aminoãcidos desde o primeiro até ao 43Q resíduo. Para substituir o do mínio Gla de proteína C humana pelo domínio Gla de proteína C bo vina, os correspondentes segmentos do alinhamento indicado na Ta bela 1 são substituídos.

As proteínas híbridas de acordo com a presente invenção podem obter-se por técnicas de engenharia gené tica. Portanto, a presente invenção refere-se também a ADN que codifica estas proteínas híbridas e ao método para produzir estas proteínas híbridas por meio de técnicas de engenharia genéti ca. 0 gene que codifica as proteínas híbridas de acordo com a presente invenção pode construir-se substituindo a sequência de nucleótidos que codifica o domínio Gla de proteína C humana pela sequência de nucleótidos que codifica o domínio Gla de proteína C bovina. A pré-sequência de proteína C . humana pode adicionalmente ser substituída pela pré-pró-sequên-] cia de proteína C bovina. A pré-pró-sequência pode também ser 3

substituída pela pré-pró-sequência de proteínas de coagulação do sangue dependentes da vitamina K, como, por exemplo, o factor X.

Os genes construídos pelos métodos acima descritos podem ser expressados nas células de hospedeiros apropriados transformados por vectores de expressão próprios construídos ligando a sequência de codificação da proteína com um promotor, um terminador, etc, pelos métodos vulgarmente usados neste campo. Preferivelmente os hospedeiros são células eucarió-ticas que podem modificar as proteínas recombinantes de maneiras põs-translacionais, por exemplo, glicosilaçao, gama-carboxilação ou beta-hidroxilação. São exemplos de células hospedeiras favo rãveis para esta produção células animais, tais como células CHO ou BHK. A construção de genes recombinantes, a ligação adicional de regiões funcionais necessárias para a expressão eficiente, a transfecção para células hospedeiras, a expressão de produtos re combinantes em células hospedeiras e o isolamento de produtos re combinantes, etc. pode realizar-se por quaisquer métodos geralmente disponíveis neste campo. 5. Efeito da Invenção

As proteínas híbridas de acordo com a presente invenção têm um numero aumentado de resíduos de ácido glutâmico (passando de nove para onze) substituindo o domínio Gla do tipo humano por domínio Gla do tipo bovino. Mediante este aumento do número de sítios de gama-carboxilação, obtêm-se efeitos reforçados. 6. Explicação por Meio de Exemplos A presente invenção é explicada por meio de Exemplos, mais adiante. Nos Exemplos, utilizou-se o gene cons truído substituindo o domínio Gla e a pré-prõ-sequência de pro-• teína C humana pelo domínio Gla de proteína C bovina e a pré-pró- 4

-sequência do factor X humano. A sequência de ADN que codifica o factor X foi descrita em Biochemistry, 25, 5098 (1986).

Nos Exemplos seguintes, utilizou-se o ge ne que codifica a proteína C humana descrito no Pedido de Patente de Invenção Japonesa Número 96341/87 (Publicação Não Examinada Depositada Número 263083/88), assim como o vector de expressão que inclui o gene acima mencionado e o novo processo de fabricação por meio de técnicas de engenharia genética, descritos no Pedido de Patente de Invenção Japonesa Número 96340/87 (Publi cação Não Examinada Depositada Número 267288/88) . Estes métodos são explicados como exemplos de referência. No entanto, os Exemplos e os Exemplos de Referência não limitam a presente invenção,

EXEMPLOS

Exemplo de Referência 1 Construção de pCs4 0 plasmídio pPCl que inclui o gene que codifica a proteína C foi construído pelos inventores e colabora dores como se descreveu na Publicação da Patente Japonesa Não Examinada Depositada Número 263083/88. O plasmídio foi transformado em E. coli K-12/Om225, que foi depositado no Fermentation Research Institute da Agency of Industrial Science and Technology, sob a referência FERM BP-1858.

Além disso, construiu-se um vector de ex pressão pCsl a partir do gene que codifica a proteína humana C e o promotor precoce SV40. O plasmídio foi transformado em E. coli K-12/Om225, que foi depositado no Fermentation Research Institu-te como FERM BP-1473. O mapa de restrição está representado na Figura 2. 0 pCs4 foi construído a partir de pCsl, somo se descreveu na Publicação da Patente Japonesa Não Examinada Depositada Número 267288/88. 0 pCs4 tem dois sítios de BstXI a \ nontante do promotor precoce SV40 e a jusante do sinal poli A. O sítio de BstXI foi concebido para produzir as seguintes extremida 5

r

des coesivas assimétricas, por digestão com BstXI

5'.....C T G G 3'. CCCCGACC

Gene CCACGGGG G G T G . · . · 3' 5'

Os fragmentos são ligados uns com os outros necessariamente em série. Isto torna possível preparar ADN que compreende muitas repetições em série da unidade de expressão de proteína C (um promotor mais um gene de proteína C mais um sinal de poli A). A proteína C é produzida com elevado rendimento cultivando células animais hospedeiras transfectadas com o ADN que compreende muitas repetições em série. 0 processo de produção de pCs4 é como se segue. 0 fragmento obtido digerindo pCsl com EcoRI foi ligado com o oligonucleõtido de dupla cadeia lateral sintetizado quimicamente como se menciona mais adiante

5' p A A T T G C C A C G G G G C T G G 3'.....C G G T G C C C C G A C C C.....3' G A G C T p 5' t em que p representa o grupo fosfato acoplado nas extremidades 5' para a ligação; | | indica o sítio de reconhecimento de BstXI; e | indica o sítio de clivagem pela referida enzima. 0 lado da esquerda do oligonucleõtido é arranjado de modo a ser uma sequência saída 5' que pode ser liga da â extremidade coesiva de pCsl clivado com EcoRI, que não rege nera o sítio de EcoRI. Este arranjo ê feito de tal maneira que o sítio de EcoRI produzido na operação subsequente é um sítio único. 0 lado da direita é a porção a ser ligada â extremidade coesiva Xhol.

Direriu-se o produto da ligação com Xhol, seguido igualmente por ligação. Ambas as extremidades de pCsl cld vadas com EcoRI foram ligadas respectivamente com uma molécula do oligonucleõtido sintético. Ambas as extremidades do produto foram submetidas a ligação (em que se forma o sítio Xhol) para . formar um plasmídio circular. l_ Então, o plasmídio resultante foi parci- 6

ssffiiaaBÍU!tta!^

I 5' p T T C C A G C C C C G T G G 3' . A A G G T CG G G G C A C C .....3' T T A A p 5' almente digerido com PvuII. Como havia dois sítios de PvuII em pCsl, a clivagem realizou-se em ambos, em um ou em nenhum dos sí tios, originando uma mistura. Por consequência, a mistura foi submetida a fraccionamento de tamanho por meio de electroforese em gel de agarose, para se isolar o produto em que tinha sido clivado apenas o sítio de PvuII a montante do promotor precoce SV40, A cadeia de ADN isolada foi ligada com um oligonucleótido de cadeia lateral dupla quimicamente sintetizado, com a seguinte estrutura química em que os símbolos são como se definiu acima e o lado da direita é a porção a ser ligada à secção clivada por EcoRI. 0 lado da esquerda do oligonucleótido foi ligado ao sítio de PvuII do plasmídio de ADN clivado que não regenerou o sítio de PvuII. 0 produto da ligação foi digerido com EcoRI, seguido novamente por ligação. Ambas as extremidades do ADN do plasmídio clivado com PvuII foram ligadas com uma molé cuia do oligonucleótido sintético respectivamente. Ambas as extremidades do produto foram submetidas a ligação (na qual se localiza um sítio de EcoRI) para formar um plasmídio circular. 0 plasmídio resultante foi clivado com Xhol e EcoRI e um fragmento foi clonado em pHSG396 tendo um marcador resistente a cloranfend. col (disponível na firma Takara Shuzo Co., Ltd.) clivado com Xhol e EcoRI. 0 plasmídio do vector de expressão de proteína C resistente a cloranfenicol assim obtido foi designado por pCs4. EXEMPLO 1 Síntese de um fragmento de ADN que codifica uma sequência de ami" noácidos que inclui o domínio Gla de proteína C bovina e a pré--prõ-sequência de factor X humano

Sintetizou-se um fragmento de ADN, cuja | sequência se encontra representada na Tabela 2, de modo a ter um sítio de Sall por conveniência de ligação e um sítio de EcoRI e - 7 -

4 I cobrir a) os quarenta resíduos de aminoãcidos da pré-pró-sequência do factor X; b) os resíduos lõ até 43Q de aminoãcidos da extremidade N da proteína C bovina a seguir à pré-pró-sequência; e c) a sequência de nucleótidos que codifica os 44Q até 46Q resíduos de aminoãcidos da proteína humana C. A adenina precisamente antes do ATG de início foi escolhida para se esperar um efeito preferível sobre a expressão de proteínas híbridas. E a sequência de nucleótidos que codifica para os 44Q a 46Q resíduos de aminoãcidos da proteí^ na C foi introduzida para criar um novo sítio de Sall para ligar o fragmento de ADN ao gene da proteína C humana.

Sintetizaram-se oito oligonucleõtidos pa ra originar quatro fragmentos de ADN separados com HindIII, Xbal e BglII, representados na Tabela 2, com um sintetizador de ADN, Modelo 380A (Applied Biosystem Co.f Estados Unidos da América). Depois de se analisar, ligaram-se quatro fragmentos de cadeia la teral dupla com ADN ligase, nos sítios de HindIII, Xbal e BglII respectivamente. 0 fragmento de ADN ligado, flanqueado pelos sítios Sall, foi inserido em pUC18, comercialmente disponível em Takara Shozo Co,, Ltd. e amplificou-se em E. coli K-12/ /HB101. 0 vector amplificado foi digerido por Sall e o fragmento de ADN sintético foi obtido por métodos vulgares de purificação. EXEMPLO 2

Construção de vectores de expressão de proteínas híbridas 0 gene que codifica a parte de proteína C pôde ser removido de pCs4 por digestão com Sall no sítio Sall precisamente a montante da sequência principal que codifica a se quência e no sítio de Sall que corresponde ao resíduo 45Q de va-. lina e ao resíduo de ãcido aspãrtico 46Q da proteína C. 0 fragmen * to de ADN sintético, sintetizado no Exemplo 1, foi inserido em • - 8 -

pCs4 entre os sítios de Sall e introduzido em E. coli K-12/HB101 Os transformantes que possuem um plasmídio com orientação apropriada, designados pCs8, foram seleccionados e cultivados. 0 pCs8 tinha a sequência de nucleótidos, indicada na Tabela 3, da proteína híbrida. 0 seu mapa de restrição está representado na Figura 1.

Exemplo de Referência 2 Construção de pHSG293

Também se construiu o pHSG293 que tinha um gene neo como marcador de selecção e um sítio de BstXI que proporciona as mesmas extremidades coesivas assimétricas que pCs8, por digestão como se descreveu na Publicação da Patente de Invenção Japonesa Não Examinada Depositada Número 267288/88. 0 fragmento obtido digerindo pHSG293 com BstXI foi ligado com o fragmento obtido por digestão de pCs8, de modo que fosse possível a selecção de transfectantes. Um processo de produção é o seguinte: quando pHSG274, depositado como ATCC 37301, um vector cosmídio com o gene neo que confere resistência à canamicina ao hospedeiro E. coli e G418 (geniticina) em células sucariõticas, foi digerido com BstXI, a clivagem teve lugar, como se mostra no seguinte diagrama de blocos: 9 Π

pHSG274 1 BstXI CCA TCATG * A TGG GGT A GTACT ACC ---- Hindiii_ cos

Oligonucleótido CCA GCCCCG TGG Sintético GTAC GGT CGGGGc ACC (BstXl") BstXI - Xbal-LacOP- ttcga (Hindlii)

í CCA GCCCCG TGG -BstXI - GGT CGGGGC ACC -Xbal-lacOP-' BstXI

Ligação

A

TTCGA (Hindlll) cos

A GTACT

----Hindlll

I

Hindlll

BstXI - CCA GCCCCG TGG .G.G1L. CGGGGC ACC -Xbal-lacOP- BstXI

A cos TTCGA (Hindlll) (Hindlll)

Ligação pHSG 293

BstXI l

Fragmento de 3,6 kb 10 J t

Então, ligou-se o fragmento digerido com o oligonucleõtido sintetizado representado no diagrama de blocos anteriormente referido e destriu-se o sítio de BstXI. A subsequente digestão do produto da clivagem com HindIII tem como resultado a remoção da parte de HindIII-BstXI contida no vector cosmídio e ligaram-se repetidamente os fragmentos sintéticos excessivos. Submeteu-se o produto resultante a ligação, para proporcionar um plasmídio circular em que o lado esquerdo do oligo-nucleótido sintético foi ligado ao sítio de HindIII do vector cosmídio. 0 sítio de Xbal, na sequência de oligonu cleõtidos sintéticos, foi introduzido para distinguir pHSG274 e pHSG293 um do outro. 0 operador lac, no oligonucleõtido sintético, foi introduzido para seleccionar transformantes por resistên cia à canamicina depois do embalamento do cosmídio e para distin guir transformantes que formam colónias azuis na presença de X--gal. 0 plasmídio foi designado pHSG293. 0 seu mapa de restrição está representado na Figura 3.

No Exemplo seguinte, as unidades de gene construídas, derivadas de pCs8, para expressão de uma proteína híbrida e o gene neo removido de pHSG293, foram ligados multipli cadamente com a mesma orientação, usando extremidades coesivas uni-dirigidas de BstXI.

Então, estes genes múltiplos ligados foram embalados in vitro em partículas de fago e transfectados para células de E. coli. Os transfectantes foram escolhidos para se obter ADN de cosmídios recombinantes pretendidos que originam clones através da resistência â canamicina derivada do gene neo. Em seguida, os ADN dos cosmídios recombinantes obtidos pelo méto do acima descrito foram introduzidos em células de CHO por um mé todo usual, disponível neste campo. De novo, foram seleccionadas células de CHO resistentes G418 derivadas do gene neo, que produ ziram eficientemente as proteínas híbridas pretendidas. 11

Produgão de proteínas híbridas em células animais e confirmação

das suas actividades de Proteína C

Depois de se digerir pCs8, preparado no Exemplo 2, com BstXI, isolou-se um fragmento de ADN com 2,0 Kbp por electroforese em gel de agarose. Este ADN de 2,0 Kbp e o pHSG293 digerido com BstXI foram ligados numa proporção molar de 20 e 1, respectivamente. Este ADN ligado foi embalado in vitro por uma mistura de embalagem de lambda fagos comercialmente disponível na firma Takara Shozo Co., Ltd.. Em seguida, os lambda genomas recombinados embalados foram transfectados em E. coli K-12/Om206, depositado como FERM BP-1472 no Fermentation Research Institute.

Os transfectantes foram cultivados sob as condições para seleccionar resistentes a canamicina. As colónias que contêm grande número de cópias de genes que codificam uma proteína híbrida foram escolhidas e cultivadas para isolar cosmídios de ADN circulares.

Estes cosmídios circulares de ADN foram introduzidos em células pelo método do fosfato de cálcio. Em seguida, seleccionaram-se transfectantes resistentes G418 derivados do pHSG293 e cultivados em meio MEM-alfa, comercialmente disponível em Gibco Laboratories Inc., que inclui 10% de FCS, comprado em Gibco Laboratories Inc. e 0,4 pg/ml de vitamina K^. Cer- 6 ^ ca de 1 x 10 transfectantes foram semeados numa cápsula de Petri com 6 centimetros de diâmetro e cultivados a 37QC durante a noite. Depois de trocar vinte e cinco vezes o meio durante a noite por meio fresco, as células foram adicionalmente cultivadas duran te pelo menos vinte e quatro horas. Depois de se colectar o sobre ladante da cultura, determinou-se a quantidade de proteína C hí-crida no meio por ensaio ELISA, usando a preparação de anticorpos le proteína C anti-humana.

Consequentemente, confirmou-se que vinte 5 dois de vinte e quatro clones produzem 432 ng/ml ou 274 ng/ml , de proteína C híbrida imuno-reactiva no meio. Cultivou-se a coió .1 nia mais rica numa escala maior. - 12 -

Λ**' EXEMPLO 4

Purificação de uma proteina C híbrida

Purificou-se a proteína C híbrida obtida de 236 ml do sobrenadante da cultura de células fortemente produ toras obtidas no Exemplo 3.

Ao sobrenadante adicionou-se um terço do volume de água destilada fria e um volume de 1/20 de solução de tampão de imidazol-HCl 1 molar (pH 6,5). A mistura foi aplicada a uma coluna de caudal rápido de QAE-Sepharose (com o volume de cerca de 10 ml), adquirida na firma Pharmacia Co.. A coluna foi lavada com NaCl 0,11 molar, solução de tampão de imidazol-HCl 50 mM (pH 6,5), até não se detectarem proteínas no líquido eluído. A proteína C híbrida ligada foi então eluída com NaCl 0,5 molar, solução de tampão de imidazol-NaCl 50 mM (pH 6,5). Adicionou-se ao eluído CaCl2, até se obter a concen tração final de 5 mM. De novo, o eluído foi aplicado a uma coluna de anticorpo de proteína C anti-humana dependente de cálcio, preparada a partir de CH-Sepharose CL-4B, adquirida em Pharmacia Co.. Eluiu-se a proteína C híbrida ligada com solução de tampão TBS (0,15 molar NaCl, 20 mM de Tris-HCl; pH 7,2), compreendendo EDTA 5 mM. Finalmente, obtiveram-se 134 microgramas de proteína C híbrida purificada. EXEMPLO 5

Actividade de proteína C híbrida purificada

Determinou-se a actividade cromogénica da proteína C híbrida purificada obtida no Exemplo 4. 40 microli tros do eluído (concentração de proteína : 23 microgramas/milild. tro) e 40 microlitros da solução de tampão usado na reacção (2,5

micrograma/mililitro de BSA, 5 mM de EDTA, 50 mM de tris-HCl; pH ÍR) 8,0) foram misturados com 20 microlitros de Protac '(1 U/ml, ad \ quirida à firma Pentafarm Co., Suiça) e incubou-se a 37QC duran-* te dez minutos. - 13 -

Adicionou-se à mistura reaccional Chromo zyme PCa, um substrato sintético adquirido à firma Boeringer-Man nheim-Yamanouchi Co. e ajustou-se o volume da solução de maneira a ser igual a 500 microlitros. Incubou-se a mistura a 37QC duran te mais cinco minutos. Interrompeu-se a reacção adicionando 400 microlitros de acetato a 50% e determinou-se a quantidade do pro duto da reacção pela absorvância da solução a 405 nm. Quando com parada com proteína C purificada derivada de sangue humano, a ac tividade cromogénica da proteína C híbrida foi igual a 172%.

Explicação das Tabelas A Tabela 1 mostra alinhamentos da sequen cia de aminoãcidos perto da extremidade de amino da proteína C bovina e da proteína C humana. A Tabela 2 mostra a sequência de nucleõ-tidos de ADN sintético que codifica a sequência de aminoãcidos que inclui a pré-pró-sequência de factor X humano e o domínio Gla de proteína C bovina. A Tabela 3 mostra a sequência de nucleõ-tidos que codifica a proteína C híbrida construída substituindo o domínio Gla e a pré-pró-sequência de proteína C humana pelo do mínio Gla de proteína C bovina e a pré-pró-sequência de factor X humano, respectivamente e a sequência de aminoãcidos da proteína híbrida C. 14

TABELA m 3 κ 3 co co 0 IS 15 64 ictí 3 g £1 Eh EH Q α 63 Q EH > 3 3 α α o ϋι 64 m Η Η Ή 63 Çm 3 < 3 63 63 63 63 Ed 64 63 Q α U 0 > Η CM Μ 63 63 63 C0 Η ο U Η 63 κ (¾ Μ 63 > α 3 CQ 0 ϋ C0 iH κ (¾ 3 £1 ι-3 63 63 Μ 63 £1 £3 64 64 cn C0 3 J3 <3 δ; Ο υ cd (C £ £ Vr) cd Vr| cd cu η α) £ μ ·η 4-) cd 0 > 0 g μ ο Μ £ ΡΜ Λ (¾ Λ

15

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TABELA

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Breve Descrigão dos Desenhos restri- ção de pCs8. ção de pCsl. ção de pHSG293. A Figura 1 representa um mapa de A Figura 2 representa um mapa de restri-A Figura 3 representa um mapa de restri- - 20 -

Claims (2)

1. » *

   REIVINDICAÇÕES - lã - Processo para a preparação de derivados de proteína C humana híbrida por tecnologia genética, caracteri-zado pelo facto de a sua região de amino terminal que tem os resíduos de ácido glutâmico ^-carboxilado (domínio Gla) ser substituído pelo domínio Gla de proteína C bovina ou por uma sequência equivalente a esta sequência de proteína bovina relativamente à actividade de ligação do cálcio e/ou a actividade da proteí^ na C melhorada. - 2S - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se obter uma proteína cujos primeiros 43 aminoãcidos são os da proteína C bovina. - 3B - Processo para a preparação de ADN que co difica uma proteína de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se substituir a sequência de nucleótidos que codifica o domínio de Gla de proteína C humana pela sequência de nucleótidos que codifica o domínio de Gla de proteína C bovina. - 4§ - Processo para a preparação de uma estru- 21

   ro tura genética que contém um ADN de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se sintetizar um fragmento de ADN, cuja sequên cia de resíduos de aminoácidos é a seguinte TABELA
2. 2 Pré-pró-sequência de Factor X GTCGACGAAT TCAATGGGGC GCCCACTGCA CCTCGTCCTG CTCAGTGCCT CCCTGGCTGG Sall EcoRI CCTCCTGCTG CTCGGGGÃAA GCTTGTTCAT CCGGAGGGAG CAGGCCAACA ACATCCTGGC Hind III ie a 43Q resíduos de aminoácidos de de proteína C bovina GAGGGTCACG AGGGCCAATT CCTTTCTAGA GGAGCTGCGG CCCGGCAACG TGGAGCGTGA Xba I GTGCTCAGAG GAGGTCTGTG AGTTCGAGGA AGCTCGGGAG ATCTTCCAAA ACACGGAAGA Bgl II 44Q a 46© resíduos de aminoácidos de proteína C humana CACAATGGCC TTCTGGTCCA AGCACGTCGA C Sal I de modo a ter um sítio de Sall para conveniência de ligação e um sítio de EcoRI e cobrir os 40 resíduos de aminoácidos da pré-pró -sequência de Factor X, o 10 a 430 resíduos de aminoácidos da ex tremidade N de proteína C bovina a seguir à pré-pró-sequência e a sequência de nucleótidos que codifica o 440 a 46Q resíduos de aminoácidos de proteína C humana. - 5§ - Processo para a obtenção de uma célula hospedeira contendo uma estrutura genética de acordo com a reivir. . dicação 4, caracterizado por se introduzir o cosmídio circular ] de ADN em células hospedeiras pelo método do fosfato de cálcio. 22 - 6& - i 4 Processo para a produção de uma proteína de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se exprimir numa célula hospedeira uma estrutura genética de acordo com a reivindicação 4. - 7ã - Processo para a preparação de composições farmacêuticas apropriadas para o tratamento de perturbações de coagulação do sangue, caracterizado pelo facto de se incorporar uma proteína quando preparada de acordo com os processos das reivindicações 1, 2 ou 6 nas substâncias veiculares e/ou auxiliares farmaceuticamente aceitáveis. - 8ã - Processo para a preparação de uma proteí na de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 6, caracterizado pelo facto de a proteína obtida ser apropriada para utilização em terapia. A requerente reivindica a prioridade do pedido japonês apresentado em 9 de Agosto de 1988, sob o nQ. Sho-63-197 144. Lisboa, 7 de Agosto de 1989 © AQSHH3 ©jMSAIí IA fB®0ZB®AlE

   23