JPH02485A - 新規なヒトインターロイキン４、該因子を発現させるための組換えベクター及びそのベクターにより形質転換された形質転換体 - Google Patents
新規なヒトインターロイキン４、該因子を発現させるための組換えベクター及びそのベクターにより形質転換された形質転換体Info
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- JPH02485A JPH02485A JP63186871A JP18687188A JPH02485A JP H02485 A JPH02485 A JP H02485A JP 63186871 A JP63186871 A JP 63186871A JP 18687188 A JP18687188 A JP 18687188A JP H02485 A JPH02485 A JP H02485A
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- human interleukin
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、
（１）免疫賦活作用を有する新規なヒトインターロイキ
ン４、 （２）該因子を発現させるための新規な組換えベクター
及び （３）そのベクターにより形質転換された新規な形質転
換体 に関するものである。
ン４、 （２）該因子を発現させるための新規な組換えベクター
及び （３）そのベクターにより形質転換された新規な形質転
換体 に関するものである。
［従来の技術と（の問題点］
インターロイキン４（以下、ＩＬ４と略す。）はレクチ
ンヤフオルボールエステルあるいは抗原の刺激を受けた
Ｔリンパ球が産生する他蛋白貿であり、Ｂリンパ球の分
化・増殖、Ｔリンパ球の分化・増殖、肥満細胞の分化・
増殖など生体の免疫反応にとって重要な種々の作用を有
している［Ｙ、Ｎｏｍａ ｅｔ ａｔ、、 Ｎａｔｕｒ
ｅ、 ３１９．６４０−６４６．１９８６（以下、文献
Ａと記す。） ； Ｆ、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒ
ｏｃ。
ンヤフオルボールエステルあるいは抗原の刺激を受けた
Ｔリンパ球が産生する他蛋白貿であり、Ｂリンパ球の分
化・増殖、Ｔリンパ球の分化・増殖、肥満細胞の分化・
増殖など生体の免疫反応にとって重要な種々の作用を有
している［Ｙ、Ｎｏｍａ ｅｔ ａｔ、、 Ｎａｔｕｒ
ｅ、 ３１９．６４０−６４６．１９８６（以下、文献
Ａと記す。） ； Ｆ、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒ
ｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ、 ８３．２０
６１−２０６５．１９８６ （以下、文献Ｂと記す。）
： Ｅ、５ｅｖｅｒｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ、、Ｅｕ
ｒ、Ｊ。
６１−２０６５．１９８６ （以下、文献Ｂと記す。）
： Ｅ、５ｅｖｅｒｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ、、Ｅｕ
ｒ、Ｊ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、、 １７．６７−７２． １９８７
及びＴ、Ｒ，Ｈｏｓｍａｎｎ ｅｔａｌ、、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８
３ ．５６５４−５６５８゜１９８６参照のこと］。よ
って、その強い免疫賦活作用から感染症、エイズ、癌、
免疫不全症などの治療や予防への応用が切望されている ［Ｒ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｂｏｔｒａｎ ｅｔ ａｌ
、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、ＡｃａｄＳＣｉ、ＵＳ八、
８３．９６８９−９６９３，１９８６；Ｒ，Ｐａ１ａＣ
ｉＯ３ｅｔ ａ 。
及びＴ、Ｒ，Ｈｏｓｍａｎｎ ｅｔａｌ、、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８
３ ．５６５４−５６５８゜１９８６参照のこと］。よ
って、その強い免疫賦活作用から感染症、エイズ、癌、
免疫不全症などの治療や予防への応用が切望されている ［Ｒ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｂｏｔｒａｎ ｅｔ ａｌ
、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、ＡｃａｄＳＣｉ、ＵＳ八、
８３．９６８９−９６９３，１９８６；Ｒ，Ｐａ１ａＣ
ｉＯ３ｅｔ ａ 。
ＥＨＢＯＪ、、 ６．９１−９５．１９８７参照のこと
］。
］。
天然のヒトＩＬ４は正常人末梢血リンパ球あるいはガン
化したヒトＴ細胞株おるいはヒトＴ細胞ハイブリドーマ
を薬剤処理して得ることができるが、その生産量は極め
て低く、物質自体としての物理化学的性質（例えば、全
分子量、糖鎖の分子量、等電点等）すら確認されていな
い。ましてや臨床使用に足る充分♀の精製ヒトＩＬ４を
（７ることは困難であった。そのため、近年急速な進歩
を遂げている遺伝子組み換え技術を応用してこれらの生
体内微量生理活性物質を大量に得る方法を確立すること
が期待されている。
化したヒトＴ細胞株おるいはヒトＴ細胞ハイブリドーマ
を薬剤処理して得ることができるが、その生産量は極め
て低く、物質自体としての物理化学的性質（例えば、全
分子量、糖鎖の分子量、等電点等）すら確認されていな
い。ましてや臨床使用に足る充分♀の精製ヒトＩＬ４を
（７ることは困難であった。そのため、近年急速な進歩
を遂げている遺伝子組み換え技術を応用してこれらの生
体内微量生理活性物質を大量に得る方法を確立すること
が期待されている。
最近、マウスＩＬ４のＣＤＮＡがクローン化された（文
献へ及び文献Ｂ）のに続き、該ＤＮＡをプローベとして
ヒトＩＬ４のＣＤＮＡもクローン化され［Ｔ、Ｙｏｋｏ
ｔａ ｅｔ ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、
Ｓｃ ｉ 。
献へ及び文献Ｂ）のに続き、該ＤＮＡをプローベとして
ヒトＩＬ４のＣＤＮＡもクローン化され［Ｔ、Ｙｏｋｏ
ｔａ ｅｔ ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、
Ｓｃ ｉ 。
ＵＳＡ、８３．５８９４−５８９８．１９８６ （以下
、文献Ｃと記す。）］、その塩基配列が明らかにされる
一方、サル細胞での発現が報告された（文献Ｃ及びＰＣ
Ｔ特許国際公開番号 ＷＯ８７１０２９９０号明細書参
照のこと）。ざらに酵母を宿主とした発現系も報告され
ている（ Ｊ、 ＥＸｐ、 １（ｅｄ、 、 １６６、
４７６（１９８７）参照のこと）。しかし、サル細胞に
よる発現は一過性であり、生産に使用した細胞はヒトｒ
Ｌ４産生後死滅するため、細胞の再使用ができず常に新
しい細胞を形質転換しなければならない。しかも形質転
換には多量のベクターＤＮＡと多大な労力を必要とする
ため臨床使用に足る量を供給する方法としては不適であ
る。遺伝子組換え技術によってヒ１−ＩＬ４を高い産生
効率で恒常的に産生し続ける発現ベクターと宿主細胞株
を樹立することができれば、上述の欠点が解消され、か
つ一定した物理化学的性質を有するまったく新規なヒト
ＩＬ４を大量に生産できると予想されるが、そのような
有効な発現系ができたという報告は今のところ皆無であ
る。
、文献Ｃと記す。）］、その塩基配列が明らかにされる
一方、サル細胞での発現が報告された（文献Ｃ及びＰＣ
Ｔ特許国際公開番号 ＷＯ８７１０２９９０号明細書参
照のこと）。ざらに酵母を宿主とした発現系も報告され
ている（ Ｊ、 ＥＸｐ、 １（ｅｄ、 、 １６６、
４７６（１９８７）参照のこと）。しかし、サル細胞に
よる発現は一過性であり、生産に使用した細胞はヒトｒ
Ｌ４産生後死滅するため、細胞の再使用ができず常に新
しい細胞を形質転換しなければならない。しかも形質転
換には多量のベクターＤＮＡと多大な労力を必要とする
ため臨床使用に足る量を供給する方法としては不適であ
る。遺伝子組換え技術によってヒ１−ＩＬ４を高い産生
効率で恒常的に産生し続ける発現ベクターと宿主細胞株
を樹立することができれば、上述の欠点が解消され、か
つ一定した物理化学的性質を有するまったく新規なヒト
ＩＬ４を大量に生産できると予想されるが、そのような
有効な発現系ができたという報告は今のところ皆無であ
る。
［問題点を解決するための手段］
現在までに、遺伝子組み換え技術を利用して外来の遺伝
子産物を（ｑるために多くの発現ベクターとそのベクタ
ーを発現させるための宿主（例えば、大腸菌、枯草菌、
放線菌、乳酸菌なとの原核動物や酵母、かび、動物細胞
などの真核細胞等が含まれる。）が見い出されている。
子産物を（ｑるために多くの発現ベクターとそのベクタ
ーを発現させるための宿主（例えば、大腸菌、枯草菌、
放線菌、乳酸菌なとの原核動物や酵母、かび、動物細胞
などの真核細胞等が含まれる。）が見い出されている。
しかし特定の遺伝子産物を得るためには、とりわけ工業
レベルで用い得るような高い生産効率で生産するために
は、その遺伝子に最適の発現ベクターと宿主を選択する
必要のあることが、最近になってわかってきた。
レベルで用い得るような高い生産効率で生産するために
は、その遺伝子に最適の発現ベクターと宿主を選択する
必要のあることが、最近になってわかってきた。
そこで本発明者らは、ヒトＩＬ４を効率よく生産するた
めの最適の発現ベクター及び宿主を児い出すべく鋭意研
究を中ねた結果、ＳＶ４０初期プロモーターの下流にヒ
トＩＬ４の遺伝子を有するＤＮＡ断片と、適当なプロモ
ーターの下流にジヒドロ葉酸還元酵素（以下、Ｄ ＨＦ
Ｒと略記する。）の）口伝子を有するＤＮＡ断片が共
存するような発現ベクターとＤ ＨＦ Ｒの欠損したチ
ャイニーズハムスター卵巣由来細胞（以下、ＣＨＯ細胞
と略記する。）を用いることによって一定した物理化学
的性質を有するまったく新規なヒトＩＬ４が得られるこ
とを見い出し、本発明を完成した。
めの最適の発現ベクター及び宿主を児い出すべく鋭意研
究を中ねた結果、ＳＶ４０初期プロモーターの下流にヒ
トＩＬ４の遺伝子を有するＤＮＡ断片と、適当なプロモ
ーターの下流にジヒドロ葉酸還元酵素（以下、Ｄ ＨＦ
Ｒと略記する。）の）口伝子を有するＤＮＡ断片が共
存するような発現ベクターとＤ ＨＦ Ｒの欠損したチ
ャイニーズハムスター卵巣由来細胞（以下、ＣＨＯ細胞
と略記する。）を用いることによって一定した物理化学
的性質を有するまったく新規なヒトＩＬ４が得られるこ
とを見い出し、本発明を完成した。
本発明者らは、ＩＬ４研究の初期段階としてまずマウス
ＩＬ４の発現系の検討を行なった。最初は大腸菌を宿主
に選び発現を試みた。この理由は、多数の宿主のうち、
増殖スピードが最も速く、効率的に培養でき、ある目的
遺伝子の発現系を新たに考える場合には、まず大腸菌で
試みてみることが一般的に行なわれているからである。
ＩＬ４の発現系の検討を行なった。最初は大腸菌を宿主
に選び発現を試みた。この理由は、多数の宿主のうち、
増殖スピードが最も速く、効率的に培養でき、ある目的
遺伝子の発現系を新たに考える場合には、まず大腸菌で
試みてみることが一般的に行なわれているからである。
しかしながら大腸菌では通常の遺伝子組み換え技術によ
って目的を達成することができなかった。例えば、ｔｒ
ｐプロモーターの支配下に０１１１１）Ｆのシグナルペ
プブドとマウスＩＬ４の融合蛋白質が発現されたがその
量はきわめて微量であった。またｔａｃ 。
って目的を達成することができなかった。例えば、ｔｒ
ｐプロモーターの支配下に０１１１１）Ｆのシグナルペ
プブドとマウスＩＬ４の融合蛋白質が発現されたがその
量はきわめて微量であった。またｔａｃ 。
ＰＬ、ｏｍｐＦなとのプロモーターの支配下では形質転
換体すら得ることができなかった。
換体すら得ることができなかった。
次に、真核細胞である酵母を宿主として、ＧＡＬｌｏ、
Ｐｆ−１０５などのプロモーターの支配下にマウスＩＬ
４の発現を試みたが、やはり通常の遺伝子組み換え技術
による方法では目的を達成することは出来なかった。
Ｐｆ−１０５などのプロモーターの支配下にマウスＩＬ
４の発現を試みたが、やはり通常の遺伝子組み換え技術
による方法では目的を達成することは出来なかった。
そこで、宿主を動物細胞に限定して研究を続けた結果、
ＳＶ４０初期プロモーターを含む発現ベクターとＣＨＯ
細胞を組み合わせて用いることによって、初めて生産性
の高い発現系を見い出すに至った。今回、ヒトＩＬ４の
発現系を検討するに際し、マウスＩＬ４の塩基配列とヒ
トＩＬ４のそれとのホモロシーを考慮し、ヒトＩ Ｌ４
ｍ伝子６マウスＩＬ４同様、大腸菌やＭ母では効率よく
生産することはむずかしいであろうと考え、最初からＳ
Ｖ４０初期プロモーターを含む発現ベクタとＣ）−１０
細胞を組み合わけて用い、ざらに発現べ々ターにＤ Ｈ
Ｆ Ｒ遺伝子を組み込むと同時にＤＨＦＲ欠損株を用い
ることによって、生産効率の高い発現系となることを見
い出した。
ＳＶ４０初期プロモーターを含む発現ベクターとＣＨＯ
細胞を組み合わせて用いることによって、初めて生産性
の高い発現系を見い出すに至った。今回、ヒトＩＬ４の
発現系を検討するに際し、マウスＩＬ４の塩基配列とヒ
トＩＬ４のそれとのホモロシーを考慮し、ヒトＩ Ｌ４
ｍ伝子６マウスＩＬ４同様、大腸菌やＭ母では効率よく
生産することはむずかしいであろうと考え、最初からＳ
Ｖ４０初期プロモーターを含む発現ベクタとＣ）−１０
細胞を組み合わけて用い、ざらに発現べ々ターにＤ Ｈ
Ｆ Ｒ遺伝子を組み込むと同時にＤＨＦＲ欠損株を用い
ることによって、生産効率の高い発現系となることを見
い出した。
さらに、この発現系によって産生された新規なヒトＩＬ
４は特徴的な物理化学的性質（糖鎖部分の分子量等）を
有していることが確認された。
４は特徴的な物理化学的性質（糖鎖部分の分子量等）を
有していることが確認された。
すなわち、ＣＨＯ細胞を宿主に用いた発現系は、いくつ
かの生理活性タンパクで試みられているが、アミノ酸部
分に結合する糖鎖は、その結合位置、鎖長、糖組成等の
点でそれぞれの生理活性物質によってまったく異なって
いる。この事実は包括的に糖鎖部分の分子量等の違いと
なって現われる。
かの生理活性タンパクで試みられているが、アミノ酸部
分に結合する糖鎖は、その結合位置、鎖長、糖組成等の
点でそれぞれの生理活性物質によってまったく異なって
いる。この事実は包括的に糖鎖部分の分子量等の違いと
なって現われる。
例えば、次表のとおりである。
表 ■
１） Ｒｏｇｅｒ Ｄｉｊｋｍａｎｓ ｅｔ ａｌ、
、 Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、。
、 Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、。
２６２、２５２８−２５３５．１９８７２） Ｆｕ
−にｕｅｎ Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ、、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
−にｕｅｎ Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ、、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
ＵＳＡ、８２． ７５８０−７５８４． １９８５３）
Ｒａｎｄａｌ Ｊ、Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ
ａｌ、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ａｎｄＣｅｌｌ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 ５ 、 １７５０−１
７５９．１９８５従って、ＣＨＯ細胞発現系を用いたら
、生理活性物質の種類に係らずある一定の特徴をもった
糖タンパクが得られるとは言えない。今回、特定の物理
化学的性質を有する糖鎖をもったヒトＩＬ４が得られた
ということは全く予測されないことであった。
Ｒａｎｄａｌ Ｊ、Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ
ａｌ、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ａｎｄＣｅｌｌ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 ５ 、 １７５０−１
７５９．１９８５従って、ＣＨＯ細胞発現系を用いたら
、生理活性物質の種類に係らずある一定の特徴をもった
糖タンパクが得られるとは言えない。今回、特定の物理
化学的性質を有する糖鎖をもったヒトＩＬ４が得られた
ということは全く予測されないことであった。
［発明の構成］
従って、本発明は
（１） （ａ）分子量が１７０００〜１９０００であり
、（ｂ）糖鎖部分の分子量が２０００〜４０００である
ことを特徴とする新規なヒト［４、 （２＞（ｉ）ＳＶ４０初期７ｏモーＪ−ｃＤ［にヒトＩ
ｔ４の遺伝子を有するＤＮＡ断片、及び （ｉｉ）真核細胞中で機能するプロモーターの下流にＤ
ＨＦ Ｒの遺伝子を有する ＤＮＡ断片、 が共存することを特徴とする新規なヒトＩＬ４発現ベク
ター （３）上記（２）で示されるヒトＩＬ４発現ベクターに
より、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株を形質転換してｊＷら
れる新規な形質転換体及び （４）上記（３）で示される形質転換体を宿主に用いて
産生される新規なヒトＩＬ４ に関するものである。
、（ｂ）糖鎖部分の分子量が２０００〜４０００である
ことを特徴とする新規なヒト［４、 （２＞（ｉ）ＳＶ４０初期７ｏモーＪ−ｃＤ［にヒトＩ
ｔ４の遺伝子を有するＤＮＡ断片、及び （ｉｉ）真核細胞中で機能するプロモーターの下流にＤ
ＨＦ Ｒの遺伝子を有する ＤＮＡ断片、 が共存することを特徴とする新規なヒトＩＬ４発現ベク
ター （３）上記（２）で示されるヒトＩＬ４発現ベクターに
より、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株を形質転換してｊＷら
れる新規な形質転換体及び （４）上記（３）で示される形質転換体を宿主に用いて
産生される新規なヒトＩＬ４ に関するものである。
ヒトＩＬ４の蛋白部分のアミノ酸配列は、式８式％
で示される（文献Ｃ参照のこと）ａ
上記式中、本発明のＩＬ４は１番目のメチオニンから２
４番目のグリシンまでが欠如しており、２５番目のヒス
デシンから１５３５３番目リンまでの１２９アミノ酸で
あることが確認された（実施例８及び９参照のこと）。
４番目のグリシンまでが欠如しており、２５番目のヒス
デシンから１５３５３番目リンまでの１２９アミノ酸で
あることが確認された（実施例８及び９参照のこと）。
本発明のヒトＩＬ４は、糖鎖部分が今までに知られてい
るヒトＩＬ４と異なるという点で完全に新規である。
るヒトＩＬ４と異なるという点で完全に新規である。
本発明のヒトＩＬ４の分子量は１７〜１９ｋｄ（キロダ
ルトン）である。蛋白質部分のみの分子量は１４９Ｂ２
であることから、その差２０００〜４０００、好ましく
は２５００〜３５００は糖鎖であると考えられる。
ルトン）である。蛋白質部分のみの分子量は１４９Ｂ２
であることから、その差２０００〜４０００、好ましく
は２５００〜３５００は糖鎖であると考えられる。
一方、ＰＣＴ特許国際公開番号四８７１０２９９０号明
細書に記載されたサル細胞で発現したヒトＩＬ４の分子
量は２２ｋｄであり、従って糖質は約７ｋｄであると考
えられる。このことからサル細胞発現ヒトＩＬ４は本発
明のヒト［４の２倍以上の糖質が結合したものであり、
両者の糖鎖部分はその分子量において大きく異なること
が判明した。また酵母発現ヒトＩＬ４の分子量は６０ｋ
ｄであり糖鎖部分の分子量は４５ｋｄと予想されるので
、本発明ＩＬ４の糖鎖との分子量の差はきわめて大きい
。
細書に記載されたサル細胞で発現したヒトＩＬ４の分子
量は２２ｋｄであり、従って糖質は約７ｋｄであると考
えられる。このことからサル細胞発現ヒトＩＬ４は本発
明のヒト［４の２倍以上の糖質が結合したものであり、
両者の糖鎖部分はその分子量において大きく異なること
が判明した。また酵母発現ヒトＩＬ４の分子量は６０ｋ
ｄであり糖鎖部分の分子量は４５ｋｄと予想されるので
、本発明ＩＬ４の糖鎖との分子量の差はきわめて大きい
。
本発明のヒト［４のうち、好ましいものは等電点が８．
５〜１０．５、より好ましくは９．８〜１０．１のもの
である。
５〜１０．５、より好ましくは９．８〜１０．１のもの
である。
本発明のヒトＩＬ４のうち、より好ましいものは糖鎖を
構成する中性糖として少なくともマンノース、フコース
及びガラクトースを含むものである。またアミン糖とし
て、少なくともグルコサミンを含むものである。ざらに
シアル酸として、少なくともＮ−アセチルノイラミン酸
を含むものである。
構成する中性糖として少なくともマンノース、フコース
及びガラクトースを含むものである。またアミン糖とし
て、少なくともグルコサミンを含むものである。ざらに
シアル酸として、少なくともＮ−アセチルノイラミン酸
を含むものである。
本発明のヒトＩＬ４のうち、ざらに好ましいものは、糖
鎖部分の総モル当り、マンノース、フコース、ガラクト
ース、グルコサミン及びＮ−アセチルノイラミン酸がそ
れぞれ３．０〜４．０ 、１．０〜２．０ 、２．５〜
３．５ 、 Ｌ５〜５，５及び１，５〜２．５モルの割
合で含有しているものである。
鎖部分の総モル当り、マンノース、フコース、ガラクト
ース、グルコサミン及びＮ−アセチルノイラミン酸がそ
れぞれ３．０〜４．０ 、１．０〜２．０ 、２．５〜
３．５ 、 Ｌ５〜５，５及び１，５〜２．５モルの割
合で含有しているものである。
本発明のヒトＩＬ４は十分に純粋であるが、単一の化合
物でなくてもよい。本発明には、諸性質が前記した節回
内で、ホモジニアスなヒトＩＬ４、及び糖鎖のわずかに
異なるヘテロジニアスなヒト［４が含まれる。
物でなくてもよい。本発明には、諸性質が前記した節回
内で、ホモジニアスなヒトＩＬ４、及び糖鎖のわずかに
異なるヘテロジニアスなヒト［４が含まれる。
本発明の（１）で示される新規なヒト［４は、以下に示
されるヒトＩｔ４発現ベクターと該ベクターにより形質
転換された形質転換体を用いて産生される。
されるヒトＩｔ４発現ベクターと該ベクターにより形質
転換された形質転換体を用いて産生される。
本発明には該ヒト発現ベクター［上記（２）］及び該形
質転換体［上記（３）］が含まれる。
質転換体［上記（３）］が含まれる。
本発明のヒトＩＬ４発現ベクターは、前記（ｉ）及び（
ｉｉ）で示されるＤＮＡ断片の他に、（ｉｉｉ）大腸菌
での複製開始点と薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を結
合することにより作製される。
ｉｉ）で示されるＤＮＡ断片の他に、（ｉｉｉ）大腸菌
での複製開始点と薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を結
合することにより作製される。
ヒトＩＬ４遺伝子は正常ヒトリンパ球などＩＬ４を産生
じ得る細胞より伝令ＲＮＡ （ｍＲＮＡ）を調製し、こ
れより逆転写酵素を用いて合成したＣＤＮＡを大腸菌に
クローン化したもの（ｃＤＮＡライブラリー）より得る
ことができる。
じ得る細胞より伝令ＲＮＡ （ｍＲＮＡ）を調製し、こ
れより逆転写酵素を用いて合成したＣＤＮＡを大腸菌に
クローン化したもの（ｃＤＮＡライブラリー）より得る
ことができる。
例えば、マウスＩＬ４のｃＤＮＡ （文献Ａおよび文献
Ｂに記載）の一部をプローベとしてクロスハイブリダイ
ゼーションにより選別することができるし、ヒトＩＬ４
の活性を指標にして（ｑることもできる。またこれらの
方法を併用することにより能率よく選別することができ
る。またすでに報告されているヒトＩＬ４のＣＤＮＡ
（文献Ｃに記載）の一部の塩基配列を有する合成Ａリボ
マーをプローベとしてハイブリダイピージョンにより選
別することも可能である。
Ｂに記載）の一部をプローベとしてクロスハイブリダイ
ゼーションにより選別することができるし、ヒトＩＬ４
の活性を指標にして（ｑることもできる。またこれらの
方法を併用することにより能率よく選別することができ
る。またすでに報告されているヒトＩＬ４のＣＤＮＡ
（文献Ｃに記載）の一部の塩基配列を有する合成Ａリボ
マーをプローベとしてハイブリダイピージョンにより選
別することも可能である。
最近、ＩＬ４のようなリンホカインの遺伝子のαｌＲＮ
Ａの３′側非翻訳部分に存在するアデニン（Ａ＞とウラ
シル（Ｕ）に富む塩基配列がこれらｍＲＮ△の不安定性
に関与していることが報告された［Ｇ、Ｓｌｌａｗ ｅ
ｔ ａｌ、、Ｃｅ１ｌ、 ４６．６５９−６６７．１９
８６参照こと］。本発明者らによれば、ヒトＩＬ４では
、パ△Ｔ Ｔ Ｔ Ａ ”で示される塩基配列（４７２
番目から４７６番目、５０６番目から５１０番目、及び
５１４番目から５１８番目の３ケ所存在する。）がそれ
に相当すると考えられる。従って、これら不安定化に関
与する塩基配列を除いたベク形質転換された宿主を用い
て培養すると、目的とする物質の生産効率が向上するこ
とが考えられる。
Ａの３′側非翻訳部分に存在するアデニン（Ａ＞とウラ
シル（Ｕ）に富む塩基配列がこれらｍＲＮ△の不安定性
に関与していることが報告された［Ｇ、Ｓｌｌａｗ ｅ
ｔ ａｌ、、Ｃｅ１ｌ、 ４６．６５９−６６７．１９
８６参照こと］。本発明者らによれば、ヒトＩＬ４では
、パ△Ｔ Ｔ Ｔ Ａ ”で示される塩基配列（４７２
番目から４７６番目、５０６番目から５１０番目、及び
５１４番目から５１８番目の３ケ所存在する。）がそれ
に相当すると考えられる。従って、これら不安定化に関
与する塩基配列を除いたベク形質転換された宿主を用い
て培養すると、目的とする物質の生産効率が向上するこ
とが考えられる。
本発明者らは、これらの仮定に基づいて検討を重ねた結
果、ヒトＩＬ４の翻訳終止を暗号化する塩基配列の下流
の塩基配列（すなわち、４６４番目のＡ以降の塩基配列
）を除去したベクターを用いた場合は、相当する塩基配
列を除去しないベクターを用いた場合に比べ、数１０倍
生産量が向上することを確認した。このような事実を実
験により実証したのは、本発明者らが初めてである。も
ちろん、不安定化に関与する３つの塩基配列だけを除去
したベクターを用いても同様の効果が十分期待できる。
果、ヒトＩＬ４の翻訳終止を暗号化する塩基配列の下流
の塩基配列（すなわち、４６４番目のＡ以降の塩基配列
）を除去したベクターを用いた場合は、相当する塩基配
列を除去しないベクターを用いた場合に比べ、数１０倍
生産量が向上することを確認した。このような事実を実
験により実証したのは、本発明者らが初めてである。も
ちろん、不安定化に関与する３つの塩基配列だけを除去
したベクターを用いても同様の効果が十分期待できる。
不安定化に関与する塩基配列を除去したヒトＩＬ４遺伝
子は以下のようにして調製される。すなわち、ヒトＩＬ
４遺伝子を含むベクターＤＮＡをそれらの配列の下流に
単一に存在する特定塩基配列を認識する制限酵素、例え
ば５ａＮＩで切断し、次にＢａ、Ｑ３１のようなエクリ
ヌクレアーゼで消化し、得られたＤＮＡ断片を大腸菌に
クロン化することによって行なわれる。
子は以下のようにして調製される。すなわち、ヒトＩＬ
４遺伝子を含むベクターＤＮＡをそれらの配列の下流に
単一に存在する特定塩基配列を認識する制限酵素、例え
ば５ａＮＩで切断し、次にＢａ、Ｑ３１のようなエクリ
ヌクレアーゼで消化し、得られたＤＮＡ断片を大腸菌に
クロン化することによって行なわれる。
従って、本発明で用いるヒトＩ Ｌ４遺伝子としては不
安定化に関与する塩基配列を除去しない遺伝子、および
少なくとも該塩基配列を除去した遺伝子のいずれであっ
ても本発明の目的を達成することができる。ここで、「
少なくとも不安定化に関与する塩基配列を除去した遺伝
子」とは、” Ａ Ｔ Ｔ Ｔ Ａ ”で示される不安
定化に関与する塩基配列が３ケ所すべて除去されており
、かつ３′側非翻訳部分の残りの塩基配列が全て又は部
分的に除去されているか、あるいは除去されていない遺
伝子を意味する。好ましくは少なくとも不安定化に関与
する塩基配列を除去した遺伝子である。
安定化に関与する塩基配列を除去しない遺伝子、および
少なくとも該塩基配列を除去した遺伝子のいずれであっ
ても本発明の目的を達成することができる。ここで、「
少なくとも不安定化に関与する塩基配列を除去した遺伝
子」とは、” Ａ Ｔ Ｔ Ｔ Ａ ”で示される不安
定化に関与する塩基配列が３ケ所すべて除去されており
、かつ３′側非翻訳部分の残りの塩基配列が全て又は部
分的に除去されているか、あるいは除去されていない遺
伝子を意味する。好ましくは少なくとも不安定化に関与
する塩基配列を除去した遺伝子である。
ヒトＩＬ４ｍ仏子を動物細胞中で発現するためのベクタ
ーとしては、ＳＶ４０初期プロモーターを含むものであ
れば何でもよい。例えば、ｐｓ２ベクター（Ｒ，Ｃ，Ｈ
ｕｌｌ＋ｇａｎ ｅｔ ａｌ、。
ーとしては、ＳＶ４０初期プロモーターを含むものであ
れば何でもよい。例えば、ｐｓ２ベクター（Ｒ，Ｃ，Ｈ
ｕｌｌ＋ｇａｎ ｅｔ ａｌ、。
Ｓｃ １ｅｎｃｅ、 ２０９．１４２２−１４２７．１
９８０ ）ヤｐＫＣＲ＃ Ｈ２ベクター（Ｋ、０°ｆｌ
ａｒｅ ｅｔ ａｌ、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
。
９８０ ）ヤｐＫＣＲ＃ Ｈ２ベクター（Ｋ、０°ｆｌ
ａｒｅ ｅｔ ａｌ、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
。
Ｓｃｉ 、、ＵＳＡ、７８．１５２７−１５３１．１９
８１ ）が挙げられるが、好ましくはｐＫＣＲ−８２ベ
クターである。
８１ ）が挙げられるが、好ましくはｐＫＣＲ−８２ベ
クターである。
ｐＫｃＲ・町ベクターにはＳＶ４０初期プロモーターの
他にウナギβ−グロビン遺伝子由来のスプライシング部
位とポリアデニル化部位が含まれているため、目的とす
る遺伝子を動物細胞中で発現するのに適している。又、
該ベクターには大腸菌で複製可能にするＤＮＡ複製開始
点と選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子が含ま
れているので、大腸菌を用いてベクターＤＮＡを大量か
つ純粋に調製することができる。
他にウナギβ−グロビン遺伝子由来のスプライシング部
位とポリアデニル化部位が含まれているため、目的とす
る遺伝子を動物細胞中で発現するのに適している。又、
該ベクターには大腸菌で複製可能にするＤＮＡ複製開始
点と選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子が含ま
れているので、大腸菌を用いてベクターＤＮＡを大量か
つ純粋に調製することができる。
ＤＨＦＲ遺伝子は公知の方法［Ｒ，Ｊ、Ｋａｕｆｍａｎ
ｅｔａｔ、、 ）ｌｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅ
１ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２．１３０４〜１３１
９ ’＋ １９８２参照のことコにより得られる。また
、ＤＨＦＲ遺伝子を発現するためのプロモーターとして
は、ＳＶ４０初期プロモーター、メタロチオネイン遺伝
子のプロモーター、アデノウィルス遺伝子のプロモータ
ー、レトロウィルス遺伝子のプロモーター等真核細胞中
で機能しうるものであれば何でもよい。
ｅｔａｔ、、 ）ｌｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅ
１ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２．１３０４〜１３１
９ ’＋ １９８２参照のことコにより得られる。また
、ＤＨＦＲ遺伝子を発現するためのプロモーターとして
は、ＳＶ４０初期プロモーター、メタロチオネイン遺伝
子のプロモーター、アデノウィルス遺伝子のプロモータ
ー、レトロウィルス遺伝子のプロモーター等真核細胞中
で機能しうるものであれば何でもよい。
以上のような特徴を持った三つのＤＮＡ断片を結合する
ことによってヒトＩＬ４発現ベクターを作製することが
できるが、ベクターＤＮＡの調製は一般的な方法で行な
うことができる ［丁、Ｈａｎｊａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、、 Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇ ｔｌａｒｂｏｒ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ、
１９８２ ］。
ことによってヒトＩＬ４発現ベクターを作製することが
できるが、ベクターＤＮＡの調製は一般的な方法で行な
うことができる ［丁、Ｈａｎｊａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、、 Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇ ｔｌａｒｂｏｒ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ、
１９８２ ］。
ヒトＩＬ４発現ベクターを導入する、Ｄ ＨＦ Ｒを欠
損したチャイニーズハムスター卵巣由来細胞（以下、Ｃ
）ｌＱｄＭｒ−細胞と略記する。）は、Ｇ、Ｕｒｌａｕ
ｂ ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ。
損したチャイニーズハムスター卵巣由来細胞（以下、Ｃ
）ｌＱｄＭｒ−細胞と略記する。）は、Ｇ、Ｕｒｌａｕ
ｂ ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ。
７７、４２１６〜４２２０．１９８０に記載されている
。ベクターＤＮＡのＣＨＯｄＭｒ−細胞への導入は、公
知の方法、例えば、リン酸カルシウム法［Ｆ、 Ｌ 、
Ｇｒａｈａ…ｅｔ ａｌ、、 Ｖ＋ｒｏｌｏｇｙ、５４
，５３６〜５３９．１９７３に記載されている。］によ
り行なわれる。
。ベクターＤＮＡのＣＨＯｄＭｒ−細胞への導入は、公
知の方法、例えば、リン酸カルシウム法［Ｆ、 Ｌ 、
Ｇｒａｈａ…ｅｔ ａｌ、、 Ｖ＋ｒｏｌｏｇｙ、５４
，５３６〜５３９．１９７３に記載されている。］によ
り行なわれる。
本発明による発現ベクターを導入された上記細胞は形質
転換前の親細胞であるＣ ＨＯｄＭｒ−細胞が生き残れ
ないチミジン及びヒポキサンチンを欠いた選択培養液で
も生育できる性質を得ていることを利用して選別できる
。
転換前の親細胞であるＣ ＨＯｄＭｒ−細胞が生き残れ
ないチミジン及びヒポキサンチンを欠いた選択培養液で
も生育できる性質を得ていることを利用して選別できる
。
又、Ｄ ）−Ｉ Ｆ Ｒの拮抗阻害剤の作用でＤＨＦＲ
Ｊ仏子が増幅した細胞は選択培養液中にＤ ＨＦ Ｒの
拮抗阻害剤、例えばメトトレキセートを加えた培養液で
生育できるため容易に識別できる。
Ｊ仏子が増幅した細胞は選択培養液中にＤ ＨＦ Ｒの
拮抗阻害剤、例えばメトトレキセートを加えた培養液で
生育できるため容易に識別できる。
このようにして得られた本発明の形質転換体のうちのひ
とつは、ＣＨＯ−８９１細胞として財団法人発酵研究所
に寄託番号Ｉ ＦＯ５０１３７号で、さらに微生物工業
技術研究所に寄託番号ＢＰ−１７５２号で寄託されてい
る。
とつは、ＣＨＯ−８９１細胞として財団法人発酵研究所
に寄託番号Ｉ ＦＯ５０１３７号で、さらに微生物工業
技術研究所に寄託番号ＢＰ−１７５２号で寄託されてい
る。
本発明のヒトＩＬ４高産生細胞株は通常の培養液（例え
ば、１０％ウシ胎児血清を含むα−ＭＥＭ）を用いてメ
トトレキセート存在下あるいは非存在下に培養され、培
養液中に分泌される該蛋白質は一般的な方法、例えば、
塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル口過、疎水
性クロマトグラフィー、アフィニティークロントゲラフ
イー等により精製することができる。
ば、１０％ウシ胎児血清を含むα−ＭＥＭ）を用いてメ
トトレキセート存在下あるいは非存在下に培養され、培
養液中に分泌される該蛋白質は一般的な方法、例えば、
塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル口過、疎水
性クロマトグラフィー、アフィニティークロントゲラフ
イー等により精製することができる。
本発明は、前記（３）で示される新規な形質転換体を宿
主に用いて産生されるヒトＩＬ４をも含むものである。
主に用いて産生されるヒトＩＬ４をも含むものである。
［効 果］
本発明によって得られるヒトＩＬ４は、生体の免疫応答
を改善するために、その様な改善が望まれるような疾患
、例えばガン、感染症、エイズ、機能的免疫不全症など
の治療や予防のために用いることができる。この様な場
合、症状や年令や体重などによって投与量は異なるが、
０．１μびから１ ｍＦｌの範囲で静脈内投与すること
ができる。
を改善するために、その様な改善が望まれるような疾患
、例えばガン、感染症、エイズ、機能的免疫不全症など
の治療や予防のために用いることができる。この様な場
合、症状や年令や体重などによって投与量は異なるが、
０．１μびから１ ｍＦｌの範囲で静脈内投与すること
ができる。
本発明のヒトＩＬ４が有する免疫賦、活活性は、ヒトリ
ンパ球増殖刺激活性を指標にして測定した。
ンパ球増殖刺激活性を指標にして測定した。
ヒトリンパ球増殖刺激活性は以下の方法により測定した
。
。
ヒト末梢血より調製したリンパ球をフィトヘマグルチニ
ン（１０μｇ／ｄ）を含む培養液［１０％ウシ胎児血清
、５Ｘ１０−５Ｍ２−メルカプトエタノールを含むＲＰ
Ｍ ｌ−１６４０］に懸濁し、３７°Ｃ１５％ＣＯ２存
在下で４〜６日間培養した。
ン（１０μｇ／ｄ）を含む培養液［１０％ウシ胎児血清
、５Ｘ１０−５Ｍ２−メルカプトエタノールを含むＲＰ
Ｍ ｌ−１６４０］に懸濁し、３７°Ｃ１５％ＣＯ２存
在下で４〜６日間培養した。
培養液を用いて充分洗浄（３回以上）したリンパ球を２
００μｇの培養液中に５Ｘ１０４個含まれる様に再懸濁
し、被検リンプルを加えて、更に３日間培養を続けた。
００μｇの培養液中に５Ｘ１０４個含まれる様に再懸濁
し、被検リンプルを加えて、更に３日間培養を続けた。
最後の１２時間をトリチウムチミジン（０，２５μＣｉ
／カルチヤー）でパルスした後、その高分子画分への取
込呈を液体シンチレーションカウンターを用いて測定し
た。
／カルチヤー）でパルスした後、その高分子画分への取
込呈を液体シンチレーションカウンターを用いて測定し
た。
この結果得られた比活性は ２，５〜
１０ｘ １０” ＩＪ／ｍｙ蛋白Ｔ：−アッタ。
ざらに本発明によって１ｑられるヒトＩＬ４は、それを
抗原としてヒトＩＬ４に対する抗体を作成することがで
きる。また該因子をリガンドとしてヒトＩＬ４のレセプ
ターを分離精製することができるなど種々の目的のため
に利用することができる。
抗原としてヒトＩＬ４に対する抗体を作成することがで
きる。また該因子をリガンドとしてヒトＩＬ４のレセプ
ターを分離精製することができるなど種々の目的のため
に利用することができる。
［実施例］
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが
、これらは本発明の範囲を制限するものではない 実施例 １ ヒト１１４遍伝子の調製 （ｉ）ヒトＩＬ４をコードするｍ ＲＮ Ａの分離ヒト
末梢血より調製したリンパ球をフォルボール−１２−ミ
リステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）（１μ９／〃
認）を含む培養液［１０％ウシ胎児血清、５Ｘ１０’Ｍ
２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭ ｌ−１６４０
］に懸濁し、３７°Ｃ１５％ＣＯ２存在下で１２時間培
養した。培養液を用いて２回洗浄しＰＭＡを除去したリ
ンパ球をコンカナバリンＡ（３μｇ／ｍｌ＞を含む培養
液に再懸濁し、さらに培養を続けてヒトＩＬ４を誘導し
た。６時間後、該リンパ球（６×１０９個）からグアニ
ジウムチオシアネート法にてＲＮＡを採取し、オリゴ（
ｄＴ）セルロースカラムによりＦｆｉ”ＡしてポリＡを
含むｍＲＮＡ８９μびを分取した。
、これらは本発明の範囲を制限するものではない 実施例 １ ヒト１１４遍伝子の調製 （ｉ）ヒトＩＬ４をコードするｍ ＲＮ Ａの分離ヒト
末梢血より調製したリンパ球をフォルボール−１２−ミ
リステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）（１μ９／〃
認）を含む培養液［１０％ウシ胎児血清、５Ｘ１０’Ｍ
２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭ ｌ−１６４０
］に懸濁し、３７°Ｃ１５％ＣＯ２存在下で１２時間培
養した。培養液を用いて２回洗浄しＰＭＡを除去したリ
ンパ球をコンカナバリンＡ（３μｇ／ｍｌ＞を含む培養
液に再懸濁し、さらに培養を続けてヒトＩＬ４を誘導し
た。６時間後、該リンパ球（６×１０９個）からグアニ
ジウムチオシアネート法にてＲＮＡを採取し、オリゴ（
ｄＴ）セルロースカラムによりＦｆｉ”ＡしてポリＡを
含むｍＲＮＡ８９μびを分取した。
このようにして得たｍＲＮＡの一部を成熟したメスのア
フリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ、 １ｅａｖｉｓ）
の卵母細胞に注入し、修正パース（Ｂａｒｔｈ“Ｓ）培
養液 （ｃｏｌｍａｎ、Ａ、、丁ｒａｎｓｃｒｉｐｔｉ
ｏｎ ａｎｄ 丁ｒａｎＳｌａｔｌＯｎ−ａ ｐｒ
ａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ＰＰ、２９１
編者ＨａｍｅＳ、 Ｂ、 Ｄ、 。
フリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ、 １ｅａｖｉｓ）
の卵母細胞に注入し、修正パース（Ｂａｒｔｈ“Ｓ）培
養液 （ｃｏｌｍａｎ、Ａ、、丁ｒａｎｓｃｒｉｐｔｉ
ｏｎ ａｎｄ 丁ｒａｎＳｌａｔｌＯｎ−ａ ｐｒ
ａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ＰＰ、２９１
編者ＨａｍｅＳ、 Ｂ、 Ｄ、 。
及び１ｌｉｑｃ＋ｉｎｓ、Ｓ、Ｊ、、ＩＲＬ Ｐｒｅｓ
ｓ、 １９８４）で２０°Ｃ１３６時間培養した。この
後培養上清中のヒトＩＬ４活性をヒトリンパ球増殖刺激
活性（ヒト末梢血より調製したリンパ球をフィトヘマグ
ルチニン（１０μｇ／威）を含む培養液［１０％ウシ胎
児血清、５Ｘ１０−５Ｍ２−メルカプトエタノールを含
むＲＰＭ ｌ−１６４０］に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ
２存在下で４〜６日間培養した。培養液を用いて充分洗
浄（３回以上）したリンパ球を２００μｇの培養液中に
５Ｘ１０４ｆｆ６］含まれる様に再懸濁し、被検サンプ
ルを加えて、更に３日間培養を続けた。最後の１２時間
をトリチウムチミジン（０，２５μＣｉ／カルチャー）
でパルスした後、その高分子画分への取込量を液体シン
チレーションカウンターを用いて測定した。）及びヒト
扁桃腺Ｂリンパ球増殖刺激活性（ヒト扁桃腺より調製し
たリンパ球を２−アミンエチルイソチオウロニウムブロ
マイド処理したヒツジ赤血球を用いるロゼツタ形成法に
よりＴリンパ球を除去した。この様にして得たＢリンパ
球を抗ｆｃ］Ｍ抗体結合ビズ（５μｇ／ｄ）を含む培養
液［１０％ウシ胎児血清、５ｘ１０”５Ｍ２−メルカプ
トエタノールを含むＲＰＭ ｒ−１６４０］に懸濁し、
３７°Ｃ１５％ＣＯ２存在下で２〜３日間培養した。リ
ンホプレップ（Ｎｙｅｇａａｒｄ社製）を用いる比重遠
心により抗ＩｇＭ抗体結合ビーズを除き、ざらに培養液
を用いて洗浄したＢリンパ球を２００μｇの培養液中に
５Ｘ１０’個含まれる様に再懸濁し、被検サンプルを加
えて更に２日間培養した。トリチウムチミジンの高分子
画分への取込量を液体シンチレーションカウンターを用
い測定した。）を測定づることにより確認した。
ｓ、 １９８４）で２０°Ｃ１３６時間培養した。この
後培養上清中のヒトＩＬ４活性をヒトリンパ球増殖刺激
活性（ヒト末梢血より調製したリンパ球をフィトヘマグ
ルチニン（１０μｇ／威）を含む培養液［１０％ウシ胎
児血清、５Ｘ１０−５Ｍ２−メルカプトエタノールを含
むＲＰＭ ｌ−１６４０］に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ
２存在下で４〜６日間培養した。培養液を用いて充分洗
浄（３回以上）したリンパ球を２００μｇの培養液中に
５Ｘ１０４ｆｆ６］含まれる様に再懸濁し、被検サンプ
ルを加えて、更に３日間培養を続けた。最後の１２時間
をトリチウムチミジン（０，２５μＣｉ／カルチャー）
でパルスした後、その高分子画分への取込量を液体シン
チレーションカウンターを用いて測定した。）及びヒト
扁桃腺Ｂリンパ球増殖刺激活性（ヒト扁桃腺より調製し
たリンパ球を２−アミンエチルイソチオウロニウムブロ
マイド処理したヒツジ赤血球を用いるロゼツタ形成法に
よりＴリンパ球を除去した。この様にして得たＢリンパ
球を抗ｆｃ］Ｍ抗体結合ビズ（５μｇ／ｄ）を含む培養
液［１０％ウシ胎児血清、５ｘ１０”５Ｍ２−メルカプ
トエタノールを含むＲＰＭ ｒ−１６４０］に懸濁し、
３７°Ｃ１５％ＣＯ２存在下で２〜３日間培養した。リ
ンホプレップ（Ｎｙｅｇａａｒｄ社製）を用いる比重遠
心により抗ＩｇＭ抗体結合ビーズを除き、ざらに培養液
を用いて洗浄したＢリンパ球を２００μｇの培養液中に
５Ｘ１０’個含まれる様に再懸濁し、被検サンプルを加
えて更に２日間培養した。トリチウムチミジンの高分子
画分への取込量を液体シンチレーションカウンターを用
い測定した。）を測定づることにより確認した。
（ｉｉ） ｃＤＮＡライブラリーの作製プラスミドＩ
）ＣＤＶｌ−ＰＬ ［文献Ａに記載］を制限酵１Ｋｐｎ
ｌで消化した。ＤＮＡのＫｐｎＩ断片にターミナルトラ
ンスフェラーゼを用いて平均長４５塩基のｄＴ鎖を付加
した。次にこのＤＮＡをＥＣ０ＲＩで消化後大きい方の
フラグメントを回収した。得られたＤＮＡフラグメント
をオリゴｄＡカラムを用いて精製し、ベクタープライマ
ＤＮＡとした。プラスミドｐＳＰ６２−に２ ［文献Ａ
に記載］を３ａｃｌで消化し、Ｓ ａＣＩ ＩＪｆｒＥ
にターミナルトランスフェラーゼを用いて平均長１４塩
基のｄＱ鎖を付加した。このＤＮＡを旧ｎｄｌｌで消化
後、小さい方のフラグメントを回収し、リンカ−ＤＮＡ
を得た。
）ＣＤＶｌ−ＰＬ ［文献Ａに記載］を制限酵１Ｋｐｎ
ｌで消化した。ＤＮＡのＫｐｎＩ断片にターミナルトラ
ンスフェラーゼを用いて平均長４５塩基のｄＴ鎖を付加
した。次にこのＤＮＡをＥＣ０ＲＩで消化後大きい方の
フラグメントを回収した。得られたＤＮＡフラグメント
をオリゴｄＡカラムを用いて精製し、ベクタープライマ
ＤＮＡとした。プラスミドｐＳＰ６２−に２ ［文献Ａ
に記載］を３ａｃｌで消化し、Ｓ ａＣＩ ＩＪｆｒＥ
にターミナルトランスフェラーゼを用いて平均長１４塩
基のｄＱ鎖を付加した。このＤＮＡを旧ｎｄｌｌで消化
後、小さい方のフラグメントを回収し、リンカ−ＤＮＡ
を得た。
実施例１（ｉ）で得たポリＡ ＲＮＡ６μ９を用い、
２μ９のベクタープライマーから１０ユニツトの逆転写
酵素により相補ＤＮＡを合成した。さらにＤＮＡ末端に
ターミナルトランスフェラーゼを用いて平均長１４塩基
のａＣ鎖を付加した。このＤＮＡを旧ｎｄＩ［Ｉで切断
して上記リンカ−ＤＮＡとライゲーションした。その後
のＥ、ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＪ、 Ｅ、ｃｏｌ
ｉ ＲＮａＳｅ Ｈを用いて、ＲＮＡ部分をＤＮＡに置
きかえ、得られたＣＤＮＡを持つプラスミドＤＮＡを用
いて、大腸菌ＨＢＩＯ１を常法により形質転換して約１
００万個の独立した形質転換菌よりなるＣＤＮＡライブ
ラリーを作成した。
２μ９のベクタープライマーから１０ユニツトの逆転写
酵素により相補ＤＮＡを合成した。さらにＤＮＡ末端に
ターミナルトランスフェラーゼを用いて平均長１４塩基
のａＣ鎖を付加した。このＤＮＡを旧ｎｄＩ［Ｉで切断
して上記リンカ−ＤＮＡとライゲーションした。その後
のＥ、ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＪ、 Ｅ、ｃｏｌ
ｉ ＲＮａＳｅ Ｈを用いて、ＲＮＡ部分をＤＮＡに置
きかえ、得られたＣＤＮＡを持つプラスミドＤＮＡを用
いて、大腸菌ＨＢＩＯ１を常法により形質転換して約１
００万個の独立した形質転換菌よりなるＣＤＮＡライブ
ラリーを作成した。
（ｉｉｉ） プローベの調製
マウスＩＬ４をコードするプラスミド（ｐＳＰ６Ｋｍ
ＩＬ４−３７４＞（文献Ａに記載）より制限酵素３ａ
ｍＨＩで約８００ｂｐのインサートを切り出し、これを
ざらに４０μｇの反応液中［ＤＮＡ ３５μｙ、１２
ｍＭ ＣａＣＮ２．１２ｍＭ ＭｑＣｌ）２．０．
２Ｍ ＮａＣＪ！ 、２０ｍＭ トリス・塩’Ｗ （
ｐＨ８，０＞ 、１ｍＭＥＤＴＡ、Ｂａ、Ｉｌ ３１
０．３ユニット］３０℃で３分間反応させた。フェノ
ール抽出後、エタノル沈澱したものに、３ａｍｔ−ＩＩ
リンカ−をＴ４−リガーゼで結合した。更にＢａｍＨＩ
処理後精製した縮少インリートを、ｌｃｌ ８のＢａ１
ｌｌＨＩサイトに組み込みｐｓＰ６ｍｌＬ４Δを調製し
た。この１ラスミドより得られた５′側のＢａｍＨＩ／
ＲｓａＩ断片にはＳＰ６ベクタ一部分は含まれておらず
プローベとして使用可能である。同時にこのベクターか
らほぼ全体をカバーするＲ Ｓａ Ｉ ／ Ｒｓａ ｆ
断片も合わけて調製した。
ＩＬ４−３７４＞（文献Ａに記載）より制限酵素３ａ
ｍＨＩで約８００ｂｐのインサートを切り出し、これを
ざらに４０μｇの反応液中［ＤＮＡ ３５μｙ、１２
ｍＭ ＣａＣＮ２．１２ｍＭ ＭｑＣｌ）２．０．
２Ｍ ＮａＣＪ！ 、２０ｍＭ トリス・塩’Ｗ （
ｐＨ８，０＞ 、１ｍＭＥＤＴＡ、Ｂａ、Ｉｌ ３１
０．３ユニット］３０℃で３分間反応させた。フェノ
ール抽出後、エタノル沈澱したものに、３ａｍｔ−ＩＩ
リンカ−をＴ４−リガーゼで結合した。更にＢａｍＨＩ
処理後精製した縮少インリートを、ｌｃｌ ８のＢａ１
ｌｌＨＩサイトに組み込みｐｓＰ６ｍｌＬ４Δを調製し
た。この１ラスミドより得られた５′側のＢａｍＨＩ／
ＲｓａＩ断片にはＳＰ６ベクタ一部分は含まれておらず
プローベとして使用可能である。同時にこのベクターか
らほぼ全体をカバーするＲ Ｓａ Ｉ ／ Ｒｓａ ｆ
断片も合わけて調製した。
（ｉｖ） ｃＤＮＡクローンの単離
ＧＳＮＳＮフィル−（ゲル′ンンサイエンス社製）上に
得られた形質転換株で常法により４枚のレプリカを作成
した。ブローへとして、ニックトランスレーションによ
り〜５ Ｘ １０８ｃｐｍ／μ７にラベルされたマウス
ＩＬ４のＢａｍＨＩ ／ Ｒｓａ Ｉ断片（１２０ｂｐ
） 、ＲｓａＩ／Ｒｓａｌ断片（３７３ｂｐ）を用い、
各々２枚のフィルターを反応液［５０ｍＭ ｌ〜リス
・塩酸（ｐＨ７，８）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ
ＮａＣ（Ｊ、０．１％ＢＳＡ、０．１％ポリビニルピ
ロリドン、０．１％フィコール４００．０．１％５ＤＳ
１５０μｇ／ｄ超音波処理したリケ精液ＤＮＡ］中にお
いて３７℃で２４時間ハイブリダイゼーションを行った
。反応後フィルターは６ＸＳＳＣ（１ｘＳＳＣ： ０．
１５ ＭＮａＣＩ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）
、次いで０．１％ＳＤＳ中で室温１時間の洗浄を３度く
り返し、さらに２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中３７°Ｃ
ｌ２Ｏ分で洗浄を２度行った。ＢａｍＨＩ／Ｒ３ａｌ、
ＲＳａ Ｉ ／ ＲＳａ Ｉプローベを用いた各々２枚
のフィルターのうち、１枚ずつをさらに２ＸＳＳＣ１０
，１％ＳＤＳ中４２°Ｃ，２０分洗浄にかけた。オドラ
ジオグラフィーの結果、バックグラウンドより比較的強
いシグナルをもつクローンがＢａｍＨＴ／Ｒｓａｌから
２５８個とＲＳａ Ｉ ／ ＲＳａ Ｊから６８個選び
出された。シグナル付近のクロー２〜１０個を白金耳で
かきとり、１００μｐのＬ培地に懸濁させた。この時無
作為に１０ケ所の独立した部位からとったクローンをひ
とつのチューブに集め、結局８ａｍＨＩ／ＲｓａＩプロ
ーベより２６プール、Ｒｓａ Ｉ ／ Ｒｓａ Ｉプロ
ーベにより７１−ルのクローンを１ｑた。それぞれのプ
ールよりプラスミドＤＮＡを分離し、Ｓａ、ＩＮで切断
後鋳型とし、５Ｐ６ＲＮＡポリメラーゼを用いてｒｎＲ
ＮＡを合成した（ １．５〜２．５μｇ＞、ｍＲＮＡは
、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈澱後、
ＰＢＳで溶解し、０．３μｑ／μｇに調製した。
得られた形質転換株で常法により４枚のレプリカを作成
した。ブローへとして、ニックトランスレーションによ
り〜５ Ｘ １０８ｃｐｍ／μ７にラベルされたマウス
ＩＬ４のＢａｍＨＩ ／ Ｒｓａ Ｉ断片（１２０ｂｐ
） 、ＲｓａＩ／Ｒｓａｌ断片（３７３ｂｐ）を用い、
各々２枚のフィルターを反応液［５０ｍＭ ｌ〜リス
・塩酸（ｐＨ７，８）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ
ＮａＣ（Ｊ、０．１％ＢＳＡ、０．１％ポリビニルピ
ロリドン、０．１％フィコール４００．０．１％５ＤＳ
１５０μｇ／ｄ超音波処理したリケ精液ＤＮＡ］中にお
いて３７℃で２４時間ハイブリダイゼーションを行った
。反応後フィルターは６ＸＳＳＣ（１ｘＳＳＣ： ０．
１５ ＭＮａＣＩ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）
、次いで０．１％ＳＤＳ中で室温１時間の洗浄を３度く
り返し、さらに２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中３７°Ｃ
ｌ２Ｏ分で洗浄を２度行った。ＢａｍＨＩ／Ｒ３ａｌ、
ＲＳａ Ｉ ／ ＲＳａ Ｉプローベを用いた各々２枚
のフィルターのうち、１枚ずつをさらに２ＸＳＳＣ１０
，１％ＳＤＳ中４２°Ｃ，２０分洗浄にかけた。オドラ
ジオグラフィーの結果、バックグラウンドより比較的強
いシグナルをもつクローンがＢａｍＨＴ／Ｒｓａｌから
２５８個とＲＳａ Ｉ ／ ＲＳａ Ｊから６８個選び
出された。シグナル付近のクロー２〜１０個を白金耳で
かきとり、１００μｐのＬ培地に懸濁させた。この時無
作為に１０ケ所の独立した部位からとったクローンをひ
とつのチューブに集め、結局８ａｍＨＩ／ＲｓａＩプロ
ーベより２６プール、Ｒｓａ Ｉ ／ Ｒｓａ Ｉプロ
ーベにより７１−ルのクローンを１ｑた。それぞれのプ
ールよりプラスミドＤＮＡを分離し、Ｓａ、ＩＮで切断
後鋳型とし、５Ｐ６ＲＮＡポリメラーゼを用いてｒｎＲ
ＮＡを合成した（ １．５〜２．５μｇ＞、ｍＲＮＡは
、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈澱後、
ＰＢＳで溶解し、０．３μｑ／μｇに調製した。
それそ゛れの汀ｌＲＮＡをアフリカッメガエルの卵母細
胞に２０個ずつ（７０ｎ、ｌ）／飼）注入した。卵母細
胞は修正パース培養液中（１０μｇ／個）で２０℃３０
時間培養後、培養上清を回収し１１４の活性を測定した
。その結果、プール６とプール１５にＩｌ４の活性を認
めた。このうらプール６より、それぞれプラスミドＤＮ
Ａを採取し、大腸菌ト１３１０１を形質転換し、うち３
００個のクローンを無作為に選び、１０個ずつ３０個の
プルを作成した。この３０個のプールに対して上記と同
様の手順でスクリーニングし、５個のプールにＩｌ４の
活性を認めた。このうち２つのプールの構成りローン２
０個よりプラスミドＤＮＡを採取し、同様の手順でスク
リーニングした結果、それぞれのプールに１個ずつ［ｐ
ＳＰ （６−１２７＞及びｐｓＰ （６−２３０）］の
クローンに１４活性を認めた。ｐＳＰ （６−１２７）
及びｐＳＰ（６−２３０＞の塩基配列は各々ジデオキシ
法により決定した。その結果ｐＳＰ （６−１２７）及
びｐＳＰ （６−２３０）は同じ内容をコードしている
ことがわかった。インサートの塩基配列とそれより導か
れたアミノ酸配列を第１図に示した。
胞に２０個ずつ（７０ｎ、ｌ）／飼）注入した。卵母細
胞は修正パース培養液中（１０μｇ／個）で２０℃３０
時間培養後、培養上清を回収し１１４の活性を測定した
。その結果、プール６とプール１５にＩｌ４の活性を認
めた。このうらプール６より、それぞれプラスミドＤＮ
Ａを採取し、大腸菌ト１３１０１を形質転換し、うち３
００個のクローンを無作為に選び、１０個ずつ３０個の
プルを作成した。この３０個のプールに対して上記と同
様の手順でスクリーニングし、５個のプールにＩｌ４の
活性を認めた。このうち２つのプールの構成りローン２
０個よりプラスミドＤＮＡを採取し、同様の手順でスク
リーニングした結果、それぞれのプールに１個ずつ［ｐ
ＳＰ （６−１２７＞及びｐｓＰ （６−２３０）］の
クローンに１４活性を認めた。ｐＳＰ （６−１２７）
及びｐＳＰ（６−２３０＞の塩基配列は各々ジデオキシ
法により決定した。その結果ｐＳＰ （６−１２７）及
びｐＳＰ （６−２３０）は同じ内容をコードしている
ことがわかった。インサートの塩基配列とそれより導か
れたアミノ酸配列を第１図に示した。
実施例 ２
ヒトＩＬ４を発瑛させるベクターの構築プラスミドｐｓ
Ｐ （６−１２７＞よりヒト１４コーデイング部分を含
む０．８ｋｂのＢａｍＨＩ断片をアガロースゲルにて切
り出し、クレノー断片で両端を平滑化した後に旧ｎｄＩ
［Ｉリンカ−を付加した。これを動物細胞発現用ベクタ
ーｐＫＣＲＨ２［に、０’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｔ、、
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ。
Ｐ （６−１２７＞よりヒト１４コーデイング部分を含
む０．８ｋｂのＢａｍＨＩ断片をアガロースゲルにて切
り出し、クレノー断片で両端を平滑化した後に旧ｎｄＩ
［Ｉリンカ−を付加した。これを動物細胞発現用ベクタ
ーｐＫＣＲＨ２［に、０’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｔ、、
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ。
７８、１５２７−１５３１．１９８１に記載］のｔｌｉ
ｎｄ［ｌｌナイトに組み込み、プラスミドＩ）ＫＣＲｈ
ＩＬ４を（ｑた。
ｎｄ［ｌｌナイトに組み込み、プラスミドＩ）ＫＣＲｈ
ＩＬ４を（ｑた。
次にネオマイシン耐性遺伝子ｎｅｏを動物細胞で発現で
きるベクター・プラスミドＤ Ｓ Ｖ ２ ｎｅ。
きるベクター・プラスミドＤ Ｓ Ｖ ２ ｎｅ。
（Ｒ，Ｃ，）ｌｕｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ、、５ｃｉ
ｅｎｃｅ、２０９．１４２２−１４２７゜１９８０に記
載）から、酵素Ａｃｃ Ｉ ＋ＥｃｏＲＩで切り出した
２、５ｋｂ断片をクレノー断片で平滑化し、３ａｍｌ−
ＩＩクリンカを付加した。これをＤＨＦＲを発現するた
めのベクター・プラスミドｐ〜ＩＤ０（Ｓ、に、Ｋｉｍ
ｅｔ ａｌ、、Ｃｅ１ｌ、４２． １２９−１３８．
１９８５に記載）のｆ３ａｍ）−ｍｌサイトに組み込み
、Ｄ ＨＦ ＲｊＭ伝子とｎｅＯか同方向に並んで転写
される様なプラスミドｐ ［） ｎｅｏを調整した。ｇ
［） ｎｅｏをＥＣ０Ｒｒで消化し、クレノー断片で
平滑化したのら３ａ、Ｑｉクリンカを付加した。これを
Ｓａρ工で消化し、６．５ｋｂ断片をアガロースゲルで
°精製、これをｐＫＣＲｈｌＬ４の５ａｊＩサイトに組
み込／υだ。
ｅｎｃｅ、２０９．１４２２−１４２７゜１９８０に記
載）から、酵素Ａｃｃ Ｉ ＋ＥｃｏＲＩで切り出した
２、５ｋｂ断片をクレノー断片で平滑化し、３ａｍｌ−
ＩＩクリンカを付加した。これをＤＨＦＲを発現するた
めのベクター・プラスミドｐ〜ＩＤ０（Ｓ、に、Ｋｉｍ
ｅｔ ａｌ、、Ｃｅ１ｌ、４２． １２９−１３８．
１９８５に記載）のｆ３ａｍ）−ｍｌサイトに組み込み
、Ｄ ＨＦ ＲｊＭ伝子とｎｅＯか同方向に並んで転写
される様なプラスミドｐ ［） ｎｅｏを調整した。ｇ
［） ｎｅｏをＥＣ０Ｒｒで消化し、クレノー断片で
平滑化したのら３ａ、Ｑｉクリンカを付加した。これを
Ｓａρ工で消化し、６．５ｋｂ断片をアガロースゲルで
°精製、これをｐＫＣＲｈｌＬ４の５ａｊＩサイトに組
み込／υだ。
こうして選択マーカーとしてＤＨＦＲと口ｅｏを持つヒ
トｆＬ４発ＪｆｆベクターＤＫＣＲｈ Ｉ Ｌ４−［）
ｎを構築した。
トｆＬ４発ＪｆｆベクターＤＫＣＲｈ Ｉ Ｌ４−［）
ｎを構築した。
実施例 ３
プラスミドｐＳＰ （６−１２７＞をＳａｄ Ｉで開き
、３．５μｇ／４０μｇの濃度にて０５２６ユニツトの
８ａ、Ｉ！３１で消化した。反応は３０℃で行い各々９
μｇずつを２分、４分、６分、１０分後に１Ｍｇの０．
２Ｍ ＥＧＴＡ中にサンプリングすることによって停
止させた。このうち一部（２μｇ）をＥＣ０ＲＩで消化
し、ＰＡＧＥにて１００ｂｐ付近にＤＮＡが認められる
プール（４分反応）について残りの８μｇをクレノー断
片で平滑化し、Ｘ ｈｏ Ｉリンカ−を付加した。これ
を閉環後、大腸菌Ｄ Ｈ１に形質転換し、得られた約２
０００株のうち１２０株についてプラスミドを得た。こ
のうちＥｃｏＲＩ ＋ＸｈｏＩ ニテ約１００ｂｐの断
片を生ずるもの２８株について部分シーケンスを行い、
ＴＧＡ終止コドンに直接ＸｈｏＩサイトが続いているプ
ラスミドｐｓＰ （６−１２７）Δを得た。このことは
、ヒトＩＬ４の翻訳終止を暗号化する塩基配列の下流の
塩基配列かりべて除去されていることを示している。
、３．５μｇ／４０μｇの濃度にて０５２６ユニツトの
８ａ、Ｉ！３１で消化した。反応は３０℃で行い各々９
μｇずつを２分、４分、６分、１０分後に１Ｍｇの０．
２Ｍ ＥＧＴＡ中にサンプリングすることによって停
止させた。このうち一部（２μｇ）をＥＣ０ＲＩで消化
し、ＰＡＧＥにて１００ｂｐ付近にＤＮＡが認められる
プール（４分反応）について残りの８μｇをクレノー断
片で平滑化し、Ｘ ｈｏ Ｉリンカ−を付加した。これ
を閉環後、大腸菌Ｄ Ｈ１に形質転換し、得られた約２
０００株のうち１２０株についてプラスミドを得た。こ
のうちＥｃｏＲＩ ＋ＸｈｏＩ ニテ約１００ｂｐの断
片を生ずるもの２８株について部分シーケンスを行い、
ＴＧＡ終止コドンに直接ＸｈｏＩサイトが続いているプ
ラスミドｐｓＰ （６−１２７）Δを得た。このことは
、ヒトＩＬ４の翻訳終止を暗号化する塩基配列の下流の
塩基配列かりべて除去されていることを示している。
プラスミドｐｓＰ （６−１２７）△よりＢａｍＨＩ
＋Ｘｈｏｌで切り出した０、５ｋｂ断片ヲクレノー断片
で平滑化し、旧ｎｄ［［リンカ−を付加した。これをｐ
ＫＣＲＨ２の旧ｎｄ［ｌサイトに挿入し、プラスミドｐ
ＫＣＲｈ１４Δを（ｑた。
＋Ｘｈｏｌで切り出した０、５ｋｂ断片ヲクレノー断片
で平滑化し、旧ｎｄ［［リンカ−を付加した。これをｐ
ＫＣＲＨ２の旧ｎｄ［ｌサイトに挿入し、プラスミドｐ
ＫＣＲｈ１４Δを（ｑた。
実施例２で述べたプラスミドｐＭＤｏをＥＣＯ［で消化
し、クレノー断片で平滑化してから５ａＯＩリンカ−を
付加した。ここに（ｑられたＤ ＨＦ ＲＭ伝子を含む
３．５ｋｂのＳａ、ＩＩＩ断片をｐＫＣＲｈｌＬ４Δの
３ａ、Ｑ （サイトに組み込み、プラスミドｐＫｃＲｈ
ｌＬ４Δ−Ｄを得た。
し、クレノー断片で平滑化してから５ａＯＩリンカ−を
付加した。ここに（ｑられたＤ ＨＦ ＲＭ伝子を含む
３．５ｋｂのＳａ、ＩＩＩ断片をｐＫＣＲｈｌＬ４Δの
３ａ、Ｑ （サイトに組み込み、プラスミドｐＫｃＲｈ
ｌＬ４Δ−Ｄを得た。
実施例 ４
形質転換細胞の作成
プラスミドｐＫＣＲｈ １１４−Ｄｎを制限酵素ｐｖｕ
［で消化し直鎖状にした。約１ Ｘ １０６個のＣＨＯ
ｄＭｒ−株細胞［Ｇ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｔ、、
Ｐｒｏｃ。
［で消化し直鎖状にした。約１ Ｘ １０６個のＣＨＯ
ｄＭｒ−株細胞［Ｇ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｔ、、
Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ７
７、４２１６−４２２０．１９８０に記載］に、上記直
鎖状ｐＫＣＲｈＩＬ４−ＤｎＤＮＡ ２０μｑをリン
酸カルシウム沈澱法［Ｆ、Ｌ、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａ
ｌ、、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５４．５３６−５３９．１
９７３に記＠］により形質導入した。
７、４２１６−４２２０．１９８０に記載］に、上記直
鎖状ｐＫＣＲｈＩＬ４−ＤｎＤＮＡ ２０μｑをリン
酸カルシウム沈澱法［Ｆ、Ｌ、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａ
ｌ、、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５４．５３６−５３９．１
９７３に記＠］により形質導入した。
２日後に、培養液（１０％ウシ胎児血清を含むαＭＥＭ
）を選択用培養液［１０％透析ウシつ児血清（ＧＩＢＣ
Ｏ社製）を含むヒボキサンチン・チミジン不含のαＭＥ
Ｍ （Ｆ Ｉ ｏｗ社製）］に代えて、直径”ｌ０ｃｍ
のシャーレ５枚にまぎ直して２週間培養した。得られた
約１Ｘ１０３個のコロニーから１００個の細胞をクロー
ニングし、それぞれのクローンのヒトＴＬ４活性（前述
のヒトリンパ球増殖刺激活性）を測定した。このうち、
比較的増殖の速いクローン１０個を表■に示す。
）を選択用培養液［１０％透析ウシつ児血清（ＧＩＢＣ
Ｏ社製）を含むヒボキサンチン・チミジン不含のαＭＥ
Ｍ （Ｆ Ｉ ｏｗ社製）］に代えて、直径”ｌ０ｃｍ
のシャーレ５枚にまぎ直して２週間培養した。得られた
約１Ｘ１０３個のコロニーから１００個の細胞をクロー
ニングし、それぞれのクローンのヒトＴＬ４活性（前述
のヒトリンパ球増殖刺激活性）を測定した。このうち、
比較的増殖の速いクローン１０個を表■に示す。
表■
ＩＬ４活性を測定した。このうち、比較的増殖の速いク
ローン１０個を表出に示す。
ローン１０個を表出に示す。
表■
次に、プラスミドｐＫＣＲｔ１１Ｌ４Δ−りにつイテも
、プラスミドｐＫＣＲｈ Ｉ Ｌ、４−Ｄｎの場合と同
様にしてＣＩ−Ｃｌ−１０ｄ株細胞に形質導入し、選択
用培地中での生存コロニーより１００個の細胞をクロー
ニングし、それぞれのクローンのヒトｐＫＣＲｈＩＬ４
Δ−りを形質導入した場合は、ｐＫＣＲｈ Ｉ Ｌ４−
Ｄｎを形質導入した場合に較ぺて、平均値で約３０倍生
産効率のすぐれたヒトＩＬ４産生細胞が得られた。
、プラスミドｐＫＣＲｈ Ｉ Ｌ、４−Ｄｎの場合と同
様にしてＣＩ−Ｃｌ−１０ｄ株細胞に形質導入し、選択
用培地中での生存コロニーより１００個の細胞をクロー
ニングし、それぞれのクローンのヒトｐＫＣＲｈＩＬ４
Δ−りを形質導入した場合は、ｐＫＣＲｈ Ｉ Ｌ４−
Ｄｎを形質導入した場合に較ぺて、平均値で約３０倍生
産効率のすぐれたヒトＩＬ４産生細胞が得られた。
次にクローンＡより２ｇ（クローンＮＯ，Ａ−８゜−１
０）とクローンＢより６個（クローンＮ（ｌＢ１、−２
．−３．−４．−９．−１０＞を選んで、それぞれ５０
ｎＭのメトトレキセート（以下、ＭＴＸと略記する。）
を含む選択培地中で１０ｃｍプレート当り７Ｘ１０”Ｉ
の細胞を含むようにプレートし、生存細胞を２週間〜１
ケ月培養後、培地に分泌されるＩＬ４活性をアッセイし
た。
０）とクローンＢより６個（クローンＮ（ｌＢ１、−２
．−３．−４．−９．−１０＞を選んで、それぞれ５０
ｎＭのメトトレキセート（以下、ＭＴＸと略記する。）
を含む選択培地中で１０ｃｍプレート当り７Ｘ１０”Ｉ
の細胞を含むようにプレートし、生存細胞を２週間〜１
ケ月培養後、培地に分泌されるＩＬ４活性をアッセイし
た。
８個のうら、りローンＡ−１０６よびＢ−１はＭＴＸ処
理後に大きなＩＬ４産生増大が認められた。そこで５０
ｎＭ ＭＴＸ存在下で生存するクローンＡ−１０およ
びＢ〜１由来の細胞群より２ＯｆＦＭのりブクローンを
分離した。
理後に大きなＩＬ４産生増大が認められた。そこで５０
ｎＭ ＭＴＸ存在下で生存するクローンＡ−１０およ
びＢ〜１由来の細胞群より２ＯｆＦＭのりブクローンを
分離した。
また、クローンＢ−９は、５０ｎＭ ＭＴＸ存在下で
はＩＬ４活性の増強が認められなかったので、２００ｎ
Ｍ ＭＴＸ存在下で同様の実験を行ない、生存するク
ローンより１０個のサブクローンを分離した。
はＩＬ４活性の増強が認められなかったので、２００ｎ
Ｍ ＭＴＸ存在下で同様の実験を行ない、生存するク
ローンより１０個のサブクローンを分離した。
クローンＡ−１０，８−１及びＢ−９由来のＩＪブクロ
ーンのうち、比較的増殖速度の速いクローン１５個のヒ
トＩＬ４活性を表Ｉｖに示す。
ーンのうち、比較的増殖速度の速いクローン１５個のヒ
トＩＬ４活性を表Ｉｖに示す。
これら１５個のクローンは、２ケ月間培養後もその１１
−４産生早を維持した。このうち、ＩＬ４産生ηの高い
クローン、Ｂ−９−１はＣＨＯ−８９１細胞と命名され
、財団法人発酵研究所に寄託番号Ｉ ＦＯ５０１３７号
で、ざらに微生物工業技術研究所に寄託番号３ｐ−１７
５２号で寄託されている。
−４産生早を維持した。このうち、ＩＬ４産生ηの高い
クローン、Ｂ−９−１はＣＨＯ−８９１細胞と命名され
、財団法人発酵研究所に寄託番号Ｉ ＦＯ５０１３７号
で、ざらに微生物工業技術研究所に寄託番号３ｐ−１７
５２号で寄託されている。
実施例 ５
形質転換体の培養
１．０容マイクロキヤリヤースピンナーフラスコ［ベル
コ（Ｂｅｔ Ｉｃｏ）社製造］にマイクロキャリヤー［
商品名：サイトデックス（ｃｙｔｏｄｅｘ） ３、ファ
ルマシア社製ｊ聞］３ｇを入れ、生理的食塩含有リン酸
緩衝液（ＤＨ７，３＞ ［以下、ＰＢＳ （−）と略
記する。］に膨潤させた後、オートクレーブ殺菌を行な
った。
コ（Ｂｅｔ Ｉｃｏ）社製造］にマイクロキャリヤー［
商品名：サイトデックス（ｃｙｔｏｄｅｘ） ３、ファ
ルマシア社製ｊ聞］３ｇを入れ、生理的食塩含有リン酸
緩衝液（ＤＨ７，３＞ ［以下、ＰＢＳ （−）と略
記する。］に膨潤させた後、オートクレーブ殺菌を行な
った。
フラスコ内のＰＢＳ （−）を、１％牛脂児血清（ＦＢ
Ｓ）を含有した無血清培地（商品名：ＳＦＭｌｏｌ、日
永”ＡＭ製造） ４００ ｒｎｌｌで置換した後、ＣＨ
Ｏ−８９１細胞（実施例４で調製した。）７Ｘ１０７（
固を（番種した。フラスコを３７℃の５％ＣＯ２インキ
ュベーター中で、２Ｏｒｐｍ２分間攪拌してから１時間
静置した。この操作を４回繰り返して細胞をマイクロキ
ャリヤーに付着させた。
Ｓ）を含有した無血清培地（商品名：ＳＦＭｌｏｌ、日
永”ＡＭ製造） ４００ ｒｎｌｌで置換した後、ＣＨ
Ｏ−８９１細胞（実施例４で調製した。）７Ｘ１０７（
固を（番種した。フラスコを３７℃の５％ＣＯ２インキ
ュベーター中で、２Ｏｒｐｍ２分間攪拌してから１時間
静置した。この操作を４回繰り返して細胞をマイクロキ
ャリヤーに付着させた。
フラスコに１％Ｆ Ｂ Ｓ含有ＳＦＭＩＯＩ培地１００
ｍｌ！を加え、３７°Ｃの５％ＣＯ２インキュベータ
ー中で２Ｏｒｐｍ２日間培養した後、ざらに上記培地５
００ｍ１を添加した。
ｍｌ！を加え、３７°Ｃの５％ＣＯ２インキュベータ
ー中で２Ｏｒｐｍ２日間培養した後、ざらに上記培地５
００ｍ１を添加した。
４日間培養後、各マイクロキレリヤー上で、細胞か単層
になっているのか確認されたので、培地をＦ Ｂ Ｓを
含まないＳＦＭＩＯＩ培地に置換して培養を続けた。
になっているのか確認されたので、培地をＦ Ｂ Ｓを
含まないＳＦＭＩＯＩ培地に置換して培養を続けた。
５００ｄ、／日の回合で培地を更新し、培養上清を回収
しなから、２４Ｆ１間培養を続（］た。
しなから、２４Ｆ１間培養を続（］た。
実施例 ６
ヒトＩＬ４の精製
実施例５で得られた培養上清１２ｇを４ ’Ｃに冷ＩＪ
ｊシ、１０％トリフルオロ酌酸（以下、Ｔ Ｆ Ａと略
記づる。） １２０７！を加えて酸↑；［とした後、ア
セトニトリルで前もって洗浄したヒブラライｌ−Ｃ１（
Ｓｅｐｒａｌｙｔｅ Ｃ−１、商品名） （アナリティ
ケム・インターナショヅルネｌ製造） １２０ ｇを加
えて、２時間ゆっくりと攪拌した。３０分間静置した後
上清を除去し、ビーズ部分をガラスフィルター（３Ｇ）
上に回収した。４℃でビーズを総量２ｇ３０％アセトニ
トリル（０，１％ＴＥＡを含有している）で数回に分け
て洗浄し、ざらに総量４００ ｄの５０％アセトニトリ
ル（０，１％ＴＦＡを含有している）で同様に洗浄して
吸着物を流し出した。
ｊシ、１０％トリフルオロ酌酸（以下、Ｔ Ｆ Ａと略
記づる。） １２０７！を加えて酸↑；［とした後、ア
セトニトリルで前もって洗浄したヒブラライｌ−Ｃ１（
Ｓｅｐｒａｌｙｔｅ Ｃ−１、商品名） （アナリティ
ケム・インターナショヅルネｌ製造） １２０ ｇを加
えて、２時間ゆっくりと攪拌した。３０分間静置した後
上清を除去し、ビーズ部分をガラスフィルター（３Ｇ）
上に回収した。４℃でビーズを総量２ｇ３０％アセトニ
トリル（０，１％ＴＥＡを含有している）で数回に分け
て洗浄し、ざらに総量４００ ｄの５０％アセトニトリ
ル（０，１％ＴＦＡを含有している）で同様に洗浄して
吸着物を流し出した。
得られた溶液を４０℃以下で減圧濃縮してアセトニトリ
ルを除去した後、５０ｍＭリン酸ｔｒｉ ｅｓ液（ＤＨ
６，０＞で平衝化した陽イオン交換カラム［商品名：モ
ノ（Ｍｏｎｏ）Ｓ （ファルマシア礼製造）］に吸着さ
せた。５０ｒｒ１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）を２〜
３威／ｍｉｎの割合で１０分間流して洗浄した後、０．
３Ｍ ＮａＣ，Ｑを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（
１）１６．０ ＞で吸光度（２８０μＴｒＬ）が０．１
以下になるまで洗浄した。次に０．４Ｍ Ｎａ（Ｊ）
を含有する５０ｍＭリンｉｙ２緩衝液（０１１６，０）
ヲ溶出液として、ファストシステム（Ｐｈａｓｔ Ｓ
ｙｓｔｅｍ、商品名）（ファルマシア社製迄）でモニタ
ーしながら溶出させ、１８〜２０ｋｄにバンドのあるフ
ラクションを集めた。
ルを除去した後、５０ｍＭリン酸ｔｒｉ ｅｓ液（ＤＨ
６，０＞で平衝化した陽イオン交換カラム［商品名：モ
ノ（Ｍｏｎｏ）Ｓ （ファルマシア礼製造）］に吸着さ
せた。５０ｒｒ１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）を２〜
３威／ｍｉｎの割合で１０分間流して洗浄した後、０．
３Ｍ ＮａＣ，Ｑを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（
１）１６．０ ＞で吸光度（２８０μＴｒＬ）が０．１
以下になるまで洗浄した。次に０．４Ｍ Ｎａ（Ｊ）
を含有する５０ｍＭリンｉｙ２緩衝液（０１１６，０）
ヲ溶出液として、ファストシステム（Ｐｈａｓｔ Ｓ
ｙｓｔｅｍ、商品名）（ファルマシア社製迄）でモニタ
ーしながら溶出させ、１８〜２０ｋｄにバンドのあるフ
ラクションを集めた。
染めたフラクションを５０ｍＭリンｌ’１ｉｆｌ衝液（
ｐＨ６，０＞で１０倍に稀釈した後、再度陽イオン交換
カラムに吸着させた。０．３Ｍ ＮａＣＪを含有する
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で吸光度（２８０
μｍ）が０．０２以下になるまで洗浄し、Ｎａ（ｆＪｊ
Ｒ度が０．３Ｍから０．５Ｍへのリニアグラジェントを
３０分間かけて行ない、フラクションを同様に紫外吸収
及びソシウムドデシルリルフエート／ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ／ＰＡＧＥと略記する。
ｐＨ６，０＞で１０倍に稀釈した後、再度陽イオン交換
カラムに吸着させた。０．３Ｍ ＮａＣＪを含有する
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で吸光度（２８０
μｍ）が０．０２以下になるまで洗浄し、Ｎａ（ｆＪｊ
Ｒ度が０．３Ｍから０．５Ｍへのリニアグラジェントを
３０分間かけて行ない、フラクションを同様に紫外吸収
及びソシウムドデシルリルフエート／ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ／ＰＡＧＥと略記する。
）でモニターした。
集めたフラクションに硫酸アンモニウムを最終濃度１．
７Ｍになるように溶かした後、１．７Ｍｔｉ＋！Ｌ酸ア
ンモニウム含有５０ｒｒ１Ｍリン酸緩衝液（ｐｔ１６．
０ ）で平衡化した疎水↑ノ［カラム［商品名：フェニ
ル・スーパーロース（ファルマシア社製造）］に吸着さ
け、硫酸アンモニウム濃度が１．７ＭからＯ（ピロ）Ｍ
へのリニアグラジェントを６０分以上かけて行ない、フ
ラクションを紫外吸収及びＳＤＳ／ＰＡＧＥでモニター
しながら、１８〜２Ｑｋｄのバンドのあるフラクション
を集めた。主に０．５〜０．３Ｍの広いフラクションが
（守られた。次にＬｉ−バンドの部分を集め、限外濾過
膜［商品名：ＹＭ−１０（７ミコン社製造）］を用いて
濃縮した。
７Ｍになるように溶かした後、１．７Ｍｔｉ＋！Ｌ酸ア
ンモニウム含有５０ｒｒ１Ｍリン酸緩衝液（ｐｔ１６．
０ ）で平衡化した疎水↑ノ［カラム［商品名：フェニ
ル・スーパーロース（ファルマシア社製造）］に吸着さ
け、硫酸アンモニウム濃度が１．７ＭからＯ（ピロ）Ｍ
へのリニアグラジェントを６０分以上かけて行ない、フ
ラクションを紫外吸収及びＳＤＳ／ＰＡＧＥでモニター
しながら、１８〜２Ｑｋｄのバンドのあるフラクション
を集めた。主に０．５〜０．３Ｍの広いフラクションが
（守られた。次にＬｉ−バンドの部分を集め、限外濾過
膜［商品名：ＹＭ−１０（７ミコン社製造）］を用いて
濃縮した。
これを５０ｒＴＩＭリンＭｉＮ衝液（ρｉ１６．０）で
平衡化したスーパーカラム１２カラム（２，６ｘ ８０
ｃｍ）にて分離したところ、０．７４力ラム体積を中心
とする単一ピークが（ｑられた。これを前記膜（ＹＭ−
１０＞を用いて濃縮し最終標品を（ｑた。
平衡化したスーパーカラム１２カラム（２，６ｘ ８０
ｃｍ）にて分離したところ、０．７４力ラム体積を中心
とする単一ピークが（ｑられた。これを前記膜（ＹＭ−
１０＞を用いて濃縮し最終標品を（ｑた。
最終標品は、ウシ血清アル１ミンを標準とした色素法（
バイオラット社製）により濃度を決定した。その結果、
収量は５ｍｙであった。また活性を指標とした回収率は
最初の培養上清からみて２３％であった。
バイオラット社製）により濃度を決定した。その結果、
収量は５ｍｙであった。また活性を指標とした回収率は
最初の培養上清からみて２３％であった。
実施例 ７
ヒトＩＬ４の分子♀
実施例６で（ｑられた精製ＩＬ４ （２μｇ）に同市の
ローディングバッファー（２５０ｍＭトリス塩酸： ｐ
Ｈ６，８，４％ＳＤＳ、１８％グリセロール、１．４Ｍ
２−メルカプトメタノール フェノールブルー）を混合し、１００℃で３分間加熱し
た後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ［１０−２０％厚さ１１１ＩＩ
ｎのスラブグル（第−化学薬品製）］を用いて分離した
。クーマジー・ブルー染色で分子＠１８ｋｄにバンドを
認めた。銀染色にて単一バンドを確認しデンシトメータ
ー（ Ｃ Ｓ − ９１０型、島津製作所製）で４１１
４度を測定した結果、ピーク純度は９８％以上でめった
（第４図参照のこと）。
ローディングバッファー（２５０ｍＭトリス塩酸： ｐ
Ｈ６，８，４％ＳＤＳ、１８％グリセロール、１．４Ｍ
２−メルカプトメタノール フェノールブルー）を混合し、１００℃で３分間加熱し
た後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ［１０−２０％厚さ１１１ＩＩ
ｎのスラブグル（第−化学薬品製）］を用いて分離した
。クーマジー・ブルー染色で分子＠１８ｋｄにバンドを
認めた。銀染色にて単一バンドを確認しデンシトメータ
ー（ Ｃ Ｓ − ９１０型、島津製作所製）で４１１
４度を測定した結果、ピーク純度は９８％以上でめった
（第４図参照のこと）。
実施例 ８
ヒトＩ［−４のＮ末端分析
液相ブ［］テインシークエンサー（−Ｅデル４７７Ａ、
アプライドバイＡシスデムネ１製）を用いて、次の単一
シーフェンスを確認した。
アプライドバイＡシスデムネ１製）を用いて、次の単一
シーフェンスを確認した。
ＩＩ＋ｓ−Ｌｙｓ−Ｘ−八ｓｐ−ｒｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕｌｌｅ−ｆｌｅ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−
Ｌｃｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｘ−ｒｈｒ−Ｇｌｕ−
Ｌｅｕ（上記式中、Ｘ部分はＣｙｓに相当する。）この
Ｎ末端シーフェンスはＣＯＳ−７細胞を用いて（ワられ
たヒＩ− １１４のぞれと完全に一致した［Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、 ８３
． ５３９４ （１９８６） 参照のこと］。この結果
からＣＤＮＡから予想される２４１Ｆ１のクリシンと２
５１［−Ｊのヒスチジンの間でシグナルペプチドの分離
が完全に行なわれていることがわかる。
ｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕｌｌｅ−ｆｌｅ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−
Ｌｃｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｘ−ｒｈｒ−Ｇｌｕ−
Ｌｅｕ（上記式中、Ｘ部分はＣｙｓに相当する。）この
Ｎ末端シーフェンスはＣＯＳ−７細胞を用いて（ワられ
たヒＩ− １１４のぞれと完全に一致した［Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、 ８３
． ５３９４ （１９８６） 参照のこと］。この結果
からＣＤＮＡから予想される２４１Ｆ１のクリシンと２
５１［−Ｊのヒスチジンの間でシグナルペプチドの分離
が完全に行なわれていることがわかる。
実施例 ９
ヒトＩＬ４のアミノ酸絹成
１００μＵのリンプルを６ＮｍＭ及び４％ヂＡグリコー
ル酸に溶解し、減圧シール下、１１０℃で２２時間かけ
て加水分解した。これをアミノ酸分析に１ （日立８３
５型）を用いて分析し以Ｆの結果を１７だ。
ル酸に溶解し、減圧シール下、１１０℃で２２時間かけ
て加水分解した。これをアミノ酸分析に１ （日立８３
５型）を用いて分析し以Ｆの結果を１７だ。
表 Ｖニアミノ酸分析
実施例 １０
ヒト１１−４の糖含伍
ＣＤＮＡから予想されるタンパク貿部分の分子量は１４
９Ｂ２であるので、その差約３０００ （約１７％）は
糖質である。
９Ｂ２であるので、その差約３０００ （約１７％）は
糖質である。
実施例 １１
ヒト［４の糖成分
（ａ）中性糖
サンプル３０μ９に２Ｎトリフルオロ酢酸を加えて、１
００℃、６時間加熱して加水分解した後、減圧乾固した
。これを蒸留水に溶解してＨＰ Ｉ Ｃ分析にかけた。
００℃、６時間加熱して加水分解した後、減圧乾固した
。これを蒸留水に溶解してＨＰ Ｉ Ｃ分析にかけた。
０．５Ｍホウ酸緩衝液（ｐｔ１８．７ ＞中、ＴＳＫ−
（Ｉｅｌ ５ＩＪＣ１ａｒ ＡＸＧカラム（東洋ｇ達ｉ
ｌｌ製造）を用いて分析した。その結果、マンノース、
フコース及びガラクトースを含むことを確認した。
（Ｉｅｌ ５ＩＪＣ１ａｒ ＡＸＧカラム（東洋ｇ達ｉ
ｌｌ製造）を用いて分析した。その結果、マンノース、
フコース及びガラクトースを含むことを確認した。
（ｂ）アミノ糖
リンプルに４Ｎ塩酸を加えて、中性糖の場合と同様にし
て分析用リンプルを（ｑた。
て分析用リンプルを（ｑた。
０、１６Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ７，６＞中、ＴＳＫ−ｇ
ｅｔＳＣＸカラム（東洋費達（１朱製造）を用いて１−
Ｉ Ｐ Ｌ Ｃ分析した。その結果、グルコサミンを含
むことを確認した。
ｅｔＳＣＸカラム（東洋費達（１朱製造）を用いて１−
Ｉ Ｐ Ｌ Ｃ分析した。その結果、グルコサミンを含
むことを確認した。
（ｃ）シアル酸
サンプルに０．０１Ｍ硫酸を加えて、８０℃、１時間加
熱して加水分解した後、減圧乾固した。これを蒸留水に
溶解してトＩ Ｐ Ｌ Ｃ分析した。
熱して加水分解した後、減圧乾固した。これを蒸留水に
溶解してトＩ Ｐ Ｌ Ｃ分析した。
０．３％リン酸中、ゲルバック（Ｇｅｌｐａｋ） Ｃ−
６２０−１０（ト１ 型）カラム（日立製）を用いて分
析した。その結果、Ｎ−ア廿プルノイラミン酸く以下、
ＮＡＮＡと略記する。〉を含むことを確認した。
６２０−１０（ト１ 型）カラム（日立製）を用いて分
析した。その結果、Ｎ−ア廿プルノイラミン酸く以下、
ＮＡＮＡと略記する。〉を含むことを確認した。
ざらに各糖成分の割合は下表のようであった。
実施例 １２
ヒトＴＬ４の等電点
サンプル０．２ｍ９を用いて、）ｌｏｎｏ Ｐカラム（
ＨＲ５／２０．ファルマシア社製）を用いたクロマトフ
オーカシングを行なった。
ＨＲ５／２０．ファルマシア社製）を用いたクロマトフ
オーカシングを行なった。
２５ｒＴＩＭトリエチルアミン緩衝液（ａｌｌ １１．
０ ＞から１７４５希釈フアルマライト８〜１０．３
（ｐＨ８，０゜ファルマシア社製）へと変換したところ
、ｐＨ９，９６に単一ピークとしで溶出された。従って
、等電点は１０附近で必ると考えられる。
０ ＞から１７４５希釈フアルマライト８〜１０．３
（ｐＨ８，０゜ファルマシア社製）へと変換したところ
、ｐＨ９，９６に単一ピークとしで溶出された。従って
、等電点は１０附近で必ると考えられる。
実施例 １３
ヒトＩ［−４の叫グリコジル化
サンプル５μ’Ｊ（Ｉｍ’ｊ／ｄ）をＲＫＭ ２９度０
．５％のＳＯ８及び０．１Ｍの２−メルカプトエタノー
ルで１００°Ｃ１３分間処理した後、最終濃度０．２Ｍ
のリン酸太ト・リウム緩衝液（Ｏｆｔ ８．６） 、１
０ｍＭの１．１０−−フ１ナンドロリン、１．２５％の
ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０＞、１０ユニット／ｍ
ｌのＮ−グリカブ−しくジエンザイム社製）と−緒に３
７℃で１６時間反応させた。υンプルの一部をＳＤＳ
ＰＡＧＥ ［２０％厚さ１ ｍｍのスラブゲル］用い
て分離した。クーマジー・ブルー染色で分子♀１５ｋｄ
に単一ハンドを認めた。
．５％のＳＯ８及び０．１Ｍの２−メルカプトエタノー
ルで１００°Ｃ１３分間処理した後、最終濃度０．２Ｍ
のリン酸太ト・リウム緩衝液（Ｏｆｔ ８．６） 、１
０ｍＭの１．１０−−フ１ナンドロリン、１．２５％の
ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０＞、１０ユニット／ｍ
ｌのＮ−グリカブ−しくジエンザイム社製）と−緒に３
７℃で１６時間反応させた。υンプルの一部をＳＤＳ
ＰＡＧＥ ［２０％厚さ１ ｍｍのスラブゲル］用い
て分離した。クーマジー・ブルー染色で分子♀１５ｋｄ
に単一ハンドを認めた。
第１図は、ヒトＩＬ４ｃＤＮＡの構造及びそれから導か
れるポリペプチドの構）ｂを示し、第２図は本発明のヒ
ト■［−４発現ベクタＤＫＣＲｉｌ ＩＬ４−Ｄｒｌの
構築を示し、第３図は本発明のヒト［４発現ベクターＤ
Ｋ（ｆｌｌＬ−４Δ−Ｄの構築を示し、第４図は、本１
ｉ明のヒト（ｆ４を５ＤＳ−Ｐ Ａ Ｇ ［により分離
した後にデンシトメーターで測定した図である。 特８′ト出願人
れるポリペプチドの構）ｂを示し、第２図は本発明のヒ
ト■［−４発現ベクタＤＫＣＲｉｌ ＩＬ４−Ｄｒｌの
構築を示し、第３図は本発明のヒト［４発現ベクターＤ
Ｋ（ｆｌｌＬ−４Δ−Ｄの構築を示し、第４図は、本１
ｉ明のヒト（ｆ４を５ＤＳ−Ｐ Ａ Ｇ ［により分離
した後にデンシトメーターで測定した図である。 特８′ト出願人
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）（ａ）分子量が１１０００〜１９０００であり、 （ｂ）糖鎖部分の分子量が２０００〜４０００であるこ
とを特徴とするヒトインターロイキン４。 ２）糖鎖部分の分子量が２５００〜３５００である特許
請求の範囲第１項記載のヒトインターロイキン４。 ３）（ａ）分子量が１７０００〜１９０００であり、 （ｂ）糖鎖部分の分子量が２０００〜４０００であり、 （ｃ）等電点が８．５〜１０．５である ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のヒトイン
ターロイキン４。 ４）等電点が９．８〜１０．１である特許請求の範囲第
３項記載のヒトインターロイキン４。 ５）（ａ）分子量が１１０００〜１９０００であり、 （ｂ）糖鎖部分の分子量が２０００〜４０００であり、 （ｃ）等電点が８．５〜１０．５であり、 （ｄ）糖鎖を構成する中性糖として少なくともマンノー
ス、フコース及びガラクトースを含む ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のヒトイン
ターロイキン４。 ６）（ａ）分子量が１７０００〜１９０００であり、 （ｂ）糖鎖部分の分子量が２０００〜４０００であり、 （ｃ）等電点が８．５〜１０．５であり、 （ｅ）糖鎖を構成するアミノ糖として少なくともグルコ
サミンを含む ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のヒトイン
ターロイキン４。 ７）（ａ）分子量が１７０００〜１９０００であり、 （ｂ）糖鎖部分の分子量が２０００〜４０００であり、 （ｃ）等電点が８．５〜１０．５であり、 （ｆ）糖鎖を構成するシアル酸として少なくともＮ−ア
セチルノイラミン酸を含む ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のヒトイン
ターロイキン４。 ８）（ａ）分子量が１７０００〜１９０００であり、 （ｂ）糖鎖部分の分子量が２０００〜４０００であり、 （ｃ）等電点が８．５〜１０．５であり、 （ｄ）糖鎖を構成する中性糖として少なくともマンノー
ス、フコース及びガラクトースを含み、 （ｅ）糖鎖を構成するアミノ糖として少なくともグルコ
サミンを含み、 （ｆ）糖鎖を構成するシアル酸として少なくともＮ−ア
セチルノイラミン酸を含む ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のヒトイン
ターロイキン４。 ９）（ａ）分子量が１７０００〜１９０００であり、 （ｂ）糖鎖部分の分子量が２０００〜４０００であり、 （ｃ）等電点が８．５〜１０．５であり、 （ｄ）糖鎖を構成する中性糖として少なくともマンノー
ス、フコース及びガラクト ースを含み、 （ｅ）糖鎖を構成するアミノ糖として少なくともグルコ
サミンを含み、 （ｆ）糖鎖を構成するシアル酸として少なくともＮ−ア
セチルノイラミン酸を含み、 （ｇ）糖鎖部分の総モル当り、マンノース、フコース、
ガラクトース、グルコサミン及びＮ−アセチルノイラミ
ン酸がそれぞれ３．０〜４．０、１．０〜２．０、２．
５〜３．５、４．５〜５．５及び１．５〜２．５モルの
割合で含有すること を特徴とする特許請求の範囲第１項記載のヒトインター
ロイキン４。 １０）（ｉ）ＳＶ４０初期プロモーターの下流にヒトイ
ンターロイキン４の遺伝子を有するＤＮＡ断片及び （ｉｉ）真核細胞中で機能するプロモーターの下流にジ
ヒドロ葉酸還元酵素の遺伝子を有するＤＮＡ断片が共存
するヒトインターロイキン４発現ベクターにより、ジヒ
ドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズハムスター卵巣由来
細胞株を形質転換して得られる形質転換体を宿主に用い
て産生されるヒトインターロイキン４。 １１）特許請求の範囲第１０項記載のヒトインターロイ
キン４発現ベクター中のヒトインターロイキン４の遺伝
子が、少なくとも不安定化に関与する塩基配列を除去し
た遺伝子であることを特徴とする特許請求の範囲第１０
項記載のヒトインターロイキン４。 １２）（ａ）分子量が（１７０００〜１９０００であり
、 （ｂ）糖鎖部分の分子量が２０００〜４０００であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１０項記載のヒトイン
ターロイキン４。 １３）（ａ）分子量が１７０００〜１９０００であり、 （ｂ）糖鎖部分の分子量が２０００〜４０００であり、 （ｃ）等電点が８．５〜１０．５である ことを特徴とする特許請求の範囲第１０項記載のヒトイ
ンターロイキン４。 １４）（ａ）分子量が１７０００〜１９０００であり、 （ｂ）糖鎖部分の分子量が２０００〜４０００であり、 （ｃ）等電点が８．５〜１０．５であり、 （ｄ）糖鎖を構成する中性糖として少なくともマンノー
ス、フコース及びガラクトースを含む ことを特徴とする特許請求の範囲第１０項記載のヒトイ
ンターロイキン４。 １５）（ａ）分子量が１７０００〜１９０００であり、 （ｂ）糖鎖部分の分子量が２０００〜４０００であり、 （ｃ）等電点が８．５〜１０．５であり、 （ｅ）糖鎖を構成するアミノ糖として少なくともグルコ
サミンを含む ことを特徴とする特許請求の範囲第１０項記載のヒトイ
ンターロイキン４。 １６）（ａ）分子量が１７０００〜１９０００であり、 （ｂ）糖鎖部分の分子量が２０００〜４０００であり、 （ｃ）等電点が８．５〜１０．５であり、 （ｆ）糖鎖を構成するシアル酸として少なくともＮ−ア
セチルノイラミン酸を含む ことを特徴とする特許請求の範囲第１０項記載のヒトイ
ンターロイキン４。 １７）（ａ）分子量が１７０００〜１９０００であり、 （ｂ）糖鎖部分の分子量が２０００〜４０００であり、 （ｃ）等電点が８．５〜１０．５であり、 （ｄ）糖鎖を構成する中性糖として少なくともマンノー
ス、フコース及びガラクトースを含み、 （ｅ）糖鎖を構成するアミノ糖として少なくともグルコ
サミンを含み、 （ｆ）糖鎖を構成するシアル酸として少なくともＮ−ア
セチルノイラミン酸を含む ことを特徴とする特許請求の範囲第１０項 記載のヒトインターロイキン４。 １８）（ａ）分子量が１７０００〜１９０００であり、 （ｂ）糖鎖部分の分子量が２０００〜４０００であり、 （ｃ）等電点が８．５〜１０．５であり、 （ｄ）糖鎖を構成する中性糖として少なくともマンノー
ス、フコース及びガラクト ースを含み、 （ｅ）糖鎖を構成するアミノ糖として少なくともグルコ
サミンを含み、 （ｆ）糖鎖を構成するシアル酸として少なくともＮ−ア
セチルノイラミン酸を含み、 （ｇ）糖鎖部分の総モル当り、マンノース、フコース、
ガラクトース、グルコサミン及びＮ−アセチルノイラミ
ン酸がそれぞれ３．０〜４．０、１．０〜２．０、２．
５〜３．５、４．５〜５．５及び１．５〜２．５モルの
割合で含有すること を特徴とする特許請求の範囲第１０項記載のヒトインタ
ーロイキン４。 １９）（ｉ）ＳＶ４０初期プロモーターの下流にヒトイ
ンターロイキン４の遺伝子を有するＤＮＡ断片及び （ｉｉ）真核細胞中で機能するプロモーターの下流にジ
ヒドロ葉酸還元酵素の遺伝子 を有するＤＮＡ断片が共存することを特徴とするヒトイ
ンター ロイキン４発現ベクター。 ２０）前記ヒトインターロイキン４の遺伝子が、少なく
とも不安定化に関与する塩基配列を除去した遺伝子であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第１９項記載の発現
ベクター。２１）（ｉ）ＳＶ４０初期プロモーターの下
流にヒトインターロイキン４の遺伝子を有するＤＮＡ断
片及び （ｉｉ）真核細胞中で機能するプロモーターの下流にジ
ヒドロ葉酸還元酵素の遺伝子を有するＤＮＡ断片が共存
するヒトインターロイキン４発現ベクターにより、ジヒ
ドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズハムスター卵巣由来
細胞株を形質転換して得られる形質転換体。２２）ヒト
インターロイキン４の遺伝子が、少なくとも不安定化に
関与する塩基配列を除去した遺伝子であるヒトインター
ロイキン４発現ベクターにより形質転換して得られる特
許請求の範囲第２１項記載の形質転換体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63186871A JPH02485A (ja) | 1987-08-03 | 1988-07-28 | 新規なヒトインターロイキン４、該因子を発現させるための組換えベクター及びそのベクターにより形質転換された形質転換体 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62-192666 | 1987-08-03 | ||
| JP19266687 | 1987-08-03 | ||
| JP63-39482 | 1988-02-24 | ||
| JP63186871A JPH02485A (ja) | 1987-08-03 | 1988-07-28 | 新規なヒトインターロイキン４、該因子を発現させるための組換えベクター及びそのベクターにより形質転換された形質転換体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02485A true JPH02485A (ja) | 1990-01-05 |
Family
ID=26504023
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63186871A Pending JPH02485A (ja) | 1987-08-03 | 1988-07-28 | 新規なヒトインターロイキン４、該因子を発現させるための組換えベクター及びそのベクターにより形質転換された形質転換体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02485A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07506116A (ja) * | 1992-08-19 | 1995-07-06 | シェリング・コーポレーション | Ｉｌ−４を用いるｈｉｖ複製を阻害する方法 |
| JP2002529100A (ja) * | 1998-11-06 | 2002-09-10 | スターンベルド バイオテクノロジー ノース アメリカ， インコーポレイテッド | 組換えヒトエリスロポイエチンを発現する宿主細胞 |
| KR100443570B1 (ko) * | 2001-07-31 | 2004-08-09 | 크레아젠 주식회사 | 재조합 인간 인터루킨-4의 제조방법 |
| WO2022004597A1 (ja) | 2020-07-01 | 2022-01-06 | ダイキン工業株式会社 | 熱源ユニットおよびスクロール圧縮機 |
Citations (1)
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-
1988
- 1988-07-28 JP JP63186871A patent/JPH02485A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0230107A1 (en) * | 1985-11-19 | 1987-07-29 | Schering Biotech Corporation | Mammalian interleukin-4 |
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