PT89111B - Processo de preparacao de analogos de camptotecina hidrossoluveis, dos seus intermediarios e de composicoes que os contem - Google Patents

Description

presente invento refere-se a um processo de preparação de composto de fórmula

Fórmula (I) em que:

X é hidroxi, hidrogénio, ciano, -Ch^Nl·^ ou formilo;

R é hidrogénio quando X é ciano, -CH NH ou formilo; ou

R é -CHO ou -CH^R quando X é hidrogénio ou hidroxi;

R¹ é -0-R², -S-R², -N-R²(R³), ou -N⁺-R²(R³)(R⁴), com a condição de, quando R^ é -N⁺-R²(R³)(R^), o composto está associado com um anião farmaceuticamente aceitável;

3 4

R , R e R são iguais ou diferentes e são seleccionados de entre H, alquilo ^^-6’ ^idroxialquilo dialquilamino dialquilamino ^j_^(_alquilo ^2-6^ * alquilamino C^_^(alquilo C? ^),

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-2aminoalquilo ou um anel carbocíclico não substituído ou subs tituído com 3-7 membros; e

3 2 3 quando R é -N-R (R ), os grupos R e R podem ser combinados, em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados, ra formar um anel heterocíclico substituído ou não substituído, o qual pode conter heteroátomos adicionais;

ou de um seu sal, hidrato ou solvato farmaceuticamente aceitável, caracterizado por compreender:

(a) a condensação de 10-hidroxicamptotecina com formalde_í do e a amina primária ou secundária apropriada, para originar todos os compostos de fórmula (I) excepto o composto onde X é hidrjg

2 3 2 3 génio, ciano ou formilo e R é -N-R (R ) e R e R são iguais e são H; ou (b) formilação de 10-hidroxicamptotecina para produzir 9-formil-10-hidroxicamptotecina que é, em seguida, submetida a condensação com as aminas apropriadas, seguida pela redução com cianoboro-hidreto de sódio ou por redução catalítica; ou (c) tratamento dos compostos apropriados de fórmula (i),

2 3 em que R é -N-R (R ), com um agente alquilante para obter os cor respondentes compostos de fórmula (i), em que R¹ é -N⁺-R^(R)(R^) e , R^ θ R^ não são H; ou (d) aquecimento da 9-dimetilaminometil-10-hidroxicamptotecina ou de um seu sal com o álcool ou tiol apropriado num solvente inerte para formar compostos de fórmula (i) em que á O-R^; ou (e) submeter o trifluorometilsul fonato de 1O-hidroxicamptjo tecina a carbonilação catalisada por paládio; e à preparação dos seus intermediários.

invento refere-se ainda ao processo de preparação de com posiçães farmacêuticas, contendo tais compostos, úteis na inibição do crescimento de células tumorais.

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SKB 14346-1	-3- MEMORIA descritiva	ν' . Γ . ' Λ.

ANTECEDENTES 00 INVENTO

Este invento relaciona-se com o processo de preparação de análogos da camptotecina hidrossolúveis, composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade de tal análogo inibidora do cres. cimento de células tumorais, e um método de inibição do crescimen to de células tumorais, sensíveis a tal análogo, num animal neces sitando da mesma.

A estrutura da hélice de ADN nas células eucariotas impõe certos problemas topológicos que o aparelho celular tem de resolver a fim de poder utilizar o seu material genético como molde. A separação das cadeias de ADN é fundamental para os processos celij lares, tais como replicação e transcrição do ADN. Dado que o ADN eucariótico está organizado na cromatina pelas proteínas cromossó micas, as extremidades estão confinadas e as cadeias não podem ser desenroladas sem o auxílio de enzimas que alteram a topologia. E desde há muito reconhecido que o avanço da complexo de transcrição ou de replicação ao longo da hélice de ADN seria facilitada por um ponto giratório que libertaria a cadeia helicoidal gerada durante estes processos. As topo-isomerases são enzimas que são capazes de alterar a topologia do ADN em células eucariotas. São críticas para funções celulares importantes e para a proliferação celular.

Existem duas classes de topo-isomerases nas células eucariotas: tipo I e tipo II. A topo-isomerase I é uma enzima monomérica de peso molecular de, aproximadamente, 100 000. A enzima liga-se ao ADN e introduz uma quebra transiente numa única cadeia, desenrola a dupla hélice (ou permite que ela se desenrole), e subsequentemente restabelece a continuidade no ponto de quebra, an tes de se dissociar da cadeia de ADN.

A topo-isomerase II consiste em duas subunidades idênticas de peso molecular de 170 000. A topo-isomerase II quebra transientemente ambas as cadeias da hélice e passa outro segmento de cadeia dupla através da quebra.

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-4Α camptotecina é um alcalóide citotóxico insolúvel em égua produzido pelas árvores Camptotheca accuminata, indígenas da China e pelas árvores Nothapodytes foetida, indígenas da z

índia. A camptotecina e alguns dos seus congéneres mais próximos são a única classe de compostos conhecidos que inibem a topo-isomerase I.

A inibição da topo-isomerase II é o alvo principal de importantes agentes oncolíticos comerciais (p. ex. etoposido, doxo_r rubicina e mitoxantrona), assim como de outros agentes oncolíticos ainda em desenvolvimento. A camptotecina (e os seus congéneres conhecidos) não tem efeito sobre a topo-isomerase II, e nenhum dos inibidores da topo-isomerase II conhecidos tem qualquer efeito significativo sobre a topo-isomerase I.

A camptotecina e os seus congéneres conhecidos inibidores da topo-isomerase I não demonstraram ser atractivos para o desenvolvimento de drogas clínicas, como agentes citolíticos, por causa da falta de eficácia clínica, toxicidade limitante de dose, ina ceitável, toxicidade imprevisível, fraca hidrossolubilidade, e/ou estabilidade ao armazenamento inaceitável. Por conseguinte, exis te a necessidade de agentes inibidores da topo-isomerase I que evitem as características indesejáveis da camptotecina e dos seus congéneres afins, inibidores da topo-isomerase I, conhecidos. Os compostos deste invento preenchem tal necessidade.

RESUMO DO INVENTO

Este invento refere-se a um composto de fórmula

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em que:

X é hidroxilo, hidrogénio, ciano, -Ch^Nl·^, ou formilo;

R é hidrogénio quando X é ciano, -CH„NH„ ou formilo; ou ^{Z Z}

R é -CHO ou -Ch^R quando X é hidrogénio ou hidroxilo;

R¹ é -0-R², -S-R², -N-R²(R³), ou -N⁺-R²(R³)(R⁴), desde que, quando R^ é -N⁺-R²(R³)(R⁴), □ composto está associado com um anião farmaceuticamente aceitável;

3 4

R , R e R são iguais ou diferentes e são seleccionados de H, alquilo hidroxialquilo dialquilamino ₆, dial_ quilamino C^_^(alquilo C? ^), alquilamino C^_^(alquilo ^), ami noalquilo C„ ,, ou um anel carbocíclico substituído ou não substi Z — D tuído de 3-7 membros; e

2 3 2 3 quando R é -N-R (R ), os grupos R e R podem estar combinados com o átomo de azoto ao qual estão ligados para formar um anel heterocíclico substituído ou não substituído que pode conter heteroátomos adicionais;

□u um seu sal, hidrato ou solvato farmaceuticamente aceitável.

Este invento também se refere a um composto de fórmula

composto de fórmula (li) é útil na preparação de compos. tos de fórmula (i).

termo anel carbocíclico significa um sistema de anel completamente saturado, parcialmente saturado ou totalmente insaturado.

Os compostos preferidos de fórmula (i) incluem aqueles em

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-6que, quando X é hidroxilo, R é dimetilaminometilo, N-morfolinometilo, N-metilpiperazinilmetilo, (4'-piperidino)N-piperidinilmetilo, (2'-hidroxietil)aminometil, trimetilamoniometilo, ciclo-hexilaminometilo, N-metilanilinometilo, etoximetilo, ciclopropilam_i nome ti lo, Ν,Ν-dimetilaminoetiloximetilo, N,N-dimetilaminoetiltiometilo, N,N-dimetilaminoetilaminometilo, cianometilo, aminoetilo ou formilo. Os compostos preferidos de fórmula (i) também incluem aqueles compostos em que, quando R é hidrogénio, X é ciano, formilo ou aminometilo. Compostos preferidos adicionais de fórmu la (I) são aqueles em que X é hidrogénio e R é dimetilaminometilo ou N-morfolinometilo. Especialmente preferidos são os compostos de fórmula (i) em que R é dimetilaminometilo, particularmente a sua forma de isómero 5.

Este inuento também se TBfere a uma composição farmacêuti. ca compreendendo uma quantidade de um composto de fórmula (i) eficaz na inibição do crescimento de células tumorais, e um velcu lo ou diluente inerte farmaceuticamente aceitável.

Este invento também se refere a um método de inibição do crescimento de células tumorais sensíveis a um composto de fórmula (I), que compreende a administração a um animal, incluindo um humano, afectado com as referidas células tumorais, de uma quantj. dade de tal composto eficaz na inibição do crescimento das células tumorais.

E reconhecido que, devido ao átomo de carbono assimétrico no anel E dos compostos de fórmula (I) (i.e., átomo de carbono núi mero 20), existirão isómeros ópticos. 0 isómero S é o isómero preferido, mas o isómero R e a mistura racémica (racemato) estão também incluídos no âmbito dos compostos de fórmula (i).

Sais farmaceuticamente aceitáveis, e a sua preparação são bem conhecidos dos especialistas na matéria. Sais farmaceuticamente aceitáveis preferidos dos compostos de fórmula (i) incluem acetato, metanossulfonato e cloridrato , tal como mono- e dicloridrato, assim como sais de metais alcalinos dos compostos de fórmula (I), tais como sódio, em que o anel E de lactona foi submetido a hidrólise básica.

Aniões farmaceuticamente aceitáveis dos sais quaternários

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são bem conhecidos dos especialistas na matéria. Sais farmaceuti. camente aceitáveis preferidos dos compostos de fórmula (i) onde r! é -N⁺~r2(R³)(R^) incluem metanossulfonato e cloreto.

Os compostos de fórmula (i) podem formar hidratos ou solvatos. E conhecido dos especialistas na matéria que os compostos carregados formam espécies hidratadas quando liofilizados com água, ou formam espécies solvatadas quando concentrados numa soIlj ção com um solvente orgânico apropriado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO composto de fórmula (II) pode ser preparado de acordo com o procedimento delineado no Exemplo 22.

Os compostos de fórmula (I) podem ser preparados a partir de 10-hidroxicamptotecina por meio de uma reacção de Mannich. A condensação de 10-hidroxicamptotecina com formaldeído e uma amina primária ou secundária (reacção de Mannich) origina todos os compostos de fórmula (i), excepto o composto onde X é hidrogénio, ci_a no, ou Formilo, e R^ é -N-R^(R^), e R^ e R^ são iguais e são H. Alternativamente, a 10-hidroxicamptotecina pode ser formilada (reacção de Duff) originando 9-formil-10-hidroxicamptotecina que pode então sofrer condensação com aminas, seguida por redução qu_í mica com ciano-boro-hidreto de sódio ou redução catalítica (Pd/C, H„) , originando produtos análogos aos derivados da reacção de Mari nich,assim como o composto de fórmula (i) em que R^x é -N-R (R^) e

3 1

R e R são iguais e são H. Compostos de fórmula (i) onde R^-1 é -N⁺~r2 (R^) (r⁴) e f r-⁵ θ r⁴ não _s-g₀ h _sg₀ obtidos por tratamento dos compostos correspondentes de fórmula (I) em que R é -N-R (R ) com um agente alquilante. A reacção de Mannich é revelada por Magarian e colab. , 3. Pharm. Sei., 56, 987 (1967). A reacção de Duff é revelada por Duff e colab., 3. Chem. Soc., 547 (1941).

X 2 2

Compostos de fórmula (i) onde R é 0-R ou S-R^z podem ser preparados a partir de 9-dimetilaminometil —1O-hidroxicamptotecina ou de um seu sal por aquecimento com o álcool ou tiol apropriai do num solvente inerte tal como dimetilformamida. Quando é utili z^da a base livre, é adicionada uma pequena quantidade de um ácido forte, tal como ácido clorídrico. Tais derivados podem também

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ser formados directamente na reacção de Mannich quando o álcool □u tiol é incluído na mistura reaccional e é adicionado um ácido forte, ou o componente amina está sob a forma de um sal de ácido forte. Os compostos de fórmula (i) onde X é hidrogénio, ciano, formilo ou aminometilo, podem ser preparados a partir do composto de fórmula (II) por carbonilação catalisada por paládio. A carbonilação catalisada por paládio de triflatos (triflates) de arilo é revelada por Cacchi e colab. , Tetrahedraon Letters, 27, 3931 , 5541 (1986); Petrakis e colab., 3. Amer. Chem. Soc. , 109, 2831 (1987) e Chatani e colab., 3. Orq. Chem., 51, 4714 (1986).

material de partida para a preparação de compostos de fórmula (i), isto é, 10-hidroxicamptotecina, é um produto natural encontrado na mesma planta que a camptotecina Wani e colab.,

3. Org. Chem., 34, 1364 (1969)_7·A 10-metoxicamptotecina também foi isolada a partir da mesma planta que a camptotecina e pode ser convertida em 10-hidroxicamptotecina por refluxo com brometo de hidrogénio. A própria camptotecina pode também ser convertida em 10-hidroxicamptotecina por redução do anel piridina seguida por oxidação com tetra-acetato de chumbo £Ver, Yakult Honsha K.K., Pedido de Patente 3aponesa n9. 9 005 188, depositado em 30 de 3unho de 1982_/. A 10-hidroxicamptotecina racémica pode também ser preparada pelo método de Wani e colab., 3. Med. Chem., 23, 554 (1980). Um grande número de métodos para a síntese total de camptotecina foram relatados. l/er, p. ex., Hutchinson, Tetrahedron, 37, 1047 (1981) e Suffness e Coldel, The Alkaloids. Chemistry e Pharmacology, Brossi, A., ed. , Vol. 25, Academic Press, Orlando Florida, 73 (1985) para revisão. 0 caminho mais prático (daqui em diante referido como a via de Wani) para a produção de camptotecina, que é racémica no carbono na posição 20, é descrito por Wani e colab., 3. Med. Chem., 23, 554 (1980). Utilidade dos Compostos de Fórmula (I)

a. Citotoxicidade sal acetato do composto de fórmula (i) em que R é dimetilaminometilo (isómero S) (daqui em diante referido por composto nS. IS), demonstrou possuir actividade antiproliferativa potente numa variedade de linhas de células cultivadas (Tabela 1).

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Numa série de oito linhas de células de tumor de cólon humanas cultivadas, o composto N9. IS foi bastante estável na sua potência citotóxica. Para uma exposição breve à droga (2 horas), a concentração inibitória de 50% variou entre 0,12 - 2,1 ^g/ml. Se a droga for deixada no meio de cultura pelo período completo de 7 dias durante o qual as células são deixadas proliferar, os valores de IC^g variam entre 3,9 - 75 ng/ml.

Três linhas de células de tumor de roedores e duas linhas de roedores normais foram também avaliadas para a sensj.

bilidade ao Composto N2. IS. 0 carcinoma de cólon de ratazana K12/Tr e as linhas de células de epitélio intestinal e renal de ratazana foram avaliadas na mesma experiência utilizando os mesmos pontos de valorização usados nas experiências com células de tumor de cólon humanas. Estas células de roedores foram semelhari tes, em sensibilidade, às linhas de células de tumor de cólon humanas menos sensíveis, CACO-2 e WiDR. As linhas de células de tju mor de ratinho, leucemia L121D e melanoma B16, não foram mais sejn síveis ao Composto N5. IS que as linhas de células de tumor de c_ó lon humanas. Na verdade, a linha de células de melanoma B16 pare ceu ser consideravelmente menos sensível que as outras linhas de células testadas. Notavelmente, B16 e L1210 são ambos bastante sensíveis ao Composto N3. IS in vivo em provas terapêuticas em ra tinhos portadores de tumor.

protocolo utilizado para avaliar a citotoxicidade do

Composto N9. IS nas linhas de células registadas na tabela 1 foi, na generalidade, como se segue:

as linhas de células são utilizadas e mantidas como cultu[ ras em monocamada em Meio Essencial Mínimo (Grand Island Biological Co., Grand Island, N.Y.) suplementado com 10% de soro de vite la fetal numa incubadora humidificada com CC^ a 5%, a 373C. Vári as concentrações dum composto de fórmula (i), sob condições estéreis, foram deixadas reagir durante 2 horas, seguidas por aspiração do meio, ou foram expostas continuamente. As placas foram i_n cubadas durante 7 dias a 379C num incubador de CO2. 0 meio foi aspirado e as células foram fixadas e coradas com etanol e corante de Geisma. A população celular sobrevivente foi determinada

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por exploração das placas com um analisador de imagem. A percentagem de inibição da proliferação foi determinada relativamente a células incubadas na ausência da droga, e a concentração inibitória em 50% (ICç-q) foi determinada por interpolação.

Tabela 1

Citotoxicidade do Composto N9. 1S para células tumorais em Cultura

Linha de células	IC50
Exposição de 2 horas	Exposição contínua
Linhas de células de tumor de cólon humanas
SW-620	0,12	0,0065
SKCO-1	0,23	0,0039
SW-948	0,26	0,016
DLD-1	0,44	0,015
LOVO	0,58	0,0097
HT-29	0,58	0,016
CACO-2	1,7	0,075
WIDR	2,1	0,025
Linhas de células de tumor de roedores
Leucemia L1210	1,4	n. t.
Carcinoma do cólon K12/Tr	3,9	0,084
Melanoma Θ16	4- X Π. t.	0,62
Linhas de células de roedores normais
NRK52E (epitélio renal de ratazana)	1,2	0,052
IEC-6 (epitélio intestinal de ratazana)	3,9	0,017

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-11Avaliaram-se vários compostos de fórmula (I) em relação à citotoxicidade contra células de leucemia L1210 cultivadas numa cultura em suspensão (Tabela 2). As células foram expostas conti. nuamente durante a clonação num meio contendo ágar Noble a 0,2%. Após incubação a 3730 num incubador de 00^ durante 3 dias, as colónias foram coradas com corante de formazan específico para céljj las viáveis e, 24 horas depois, foram enumeradas por um contador de colónias (Biotran II, New Brunswick Scientific Co., Edison, NO) ajustado para identificar colónias de mais de 50 células. A concentração que reduziu a eficiência de clonação em 50% (ΐΟ^θ) foi determinada por interpolação. Os compostos de fórmula (i) apresentaram valores de IC^g de 12 a 690 nM, isto é, valores de que foram indicativos de actividade citotóxica. 0 produto natural afim, 10-hidroxicamptotecina, apresentou uma IC<-q de 18 nM. Os compostos citotóxicos de fórmula (i) são inibidores potentes da topo-isomerase I purificada. Tal como indicado na secção seguinte relacionada com a actividade in vivo, um certo número de compostos de fórmula (i), apesar de geralmente serem menos citotóxicos que a 10-hidroxicamptotecina, apresentaram actividade antitumor contra a leucemia L1210, in vivo, que foi equivalente ou sup_e rior à da 10-hiâroxicamptotecina. Por exemplo, □ composto NQ. IS foi cerca de 3 vezes menos potente que a lO-hibroxicamptotecina no que se refere à potência citotóxica in vitro contra as células de leucemia L1210, mas exibiu actividade inibidora do crescimento de células tumorais in vivo que foi geralmente superior à da 10-hidroxicamptotecina numa variedade de modelos de tumores de roedores transplantáveis.

6Θ 443

SKS 14346-1 . ..

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Actividade de compostos de fórmula (l), in vitro s in vivo, contra leucemia L1210 em ratinhos portadoras ds tumores implantados i.p.

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Actividade de compostos de fórmula (i), in v i tro e in vivo, contra leucemia L1210 em ratinhos portadores de tumores implantados i.p.

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443

SK8 14346-1

-15b. Inibição do Crescimento de Células Tumorais In Vivo

Os compostas de fórmula (I) foram inicialmente avaliados para a actividade antitumor in vivo em ratinhos portadores de let[ cernia L1210 implantada intraperitonealmente (ip) (Tabela 2). 0

Composto N2. IS e os Compostos N9s. 4S-13S prolongaram a expectativa de vida de ratinhos portadores de tumor em >40%, nos seus níveis respectivos de dose máxima tolerada. Três compostos - Com postos N2s. IS, 6S e 11S - foram particularmente activos, prolongando a expectativa de vida em >200% e produzindo sobreviventes a longo prazo livres de tumor. Um certo número de compostos apre sentou actividade superior à do produto natural, 10-hidroxicampto tecina, com os quais, os compostos de fórmula (i) estão estruturalmente relacionados. Para dois dos compostos - Compostos N?s. 7S e 13S - a dose mais alta testada não foi tóxica e, portanto, estes compostos podem apresentar maior actividade com níveis de dose mais elevados. Ainda assim, nos níveis de dose testados estes compostos foram activos.

Baseado no seu alto grau de actividade e potência in vivo (isto é, dose máxima tolerada baixa), o Composto N9. IS foi avaliado num certo número de modelos de tumores murino transplantados. 0 Composto N9. 1S apresenta alto grau de actividade na sua dose máxima tolerada numa variedade de modelos de tumores animais, incluindo leucemias e tumores sólidos de histiotipos diversos. 0 espectro de actividade do Composto N9. 1S está resumido na Tabela 3. Um alto nível de actividade foi observado na maioria dos mod.e los de tumores, com apenas um dos modelos, carcinoma do cólon 26, i.p., provando ser quase totalmente refractário à droga. Também dois dos modelos s.c., carcinoma do cólon 26 e carcinoma de Madison do pulmão, demonstraram ser de algum modo refractários à droga; isto é, nestes modelos, foi evidente uma actividade modesta, isto é, inibição do crescimento do tumor >70%, quando os ratinhos portadores dos tumores subcutâneos foram tratados com o Composto N9. IS. Noutros modelos de tumores s.c. foi observada actividade alta (maior que 90% de inibição). Notavelmente, o Compos. to NS. IS administrado i.p, demonstrou actividade alta não só con tra modelos de tumores i.p., mas também em ratinhos inoculados com tumores intravenosamente (i.v.) ou subcutaneamente (s.c.). A

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-16actividade curativa foi evidente em certos modelos de tumores incluindo leucemias Ρ3ΘΘ e L1210 implantadas i.p. e i.v. e carcinoma de Lewis do pulmão implantado i.v. e s.c.. 0 nível e espectro de actividade do Composto N3. 1S em modelos de tumores de ani. mais compara-se favoravelmente com as drogas antitumor conhecidas mais largamente eficazes, tais como ciclofosfamida, cisplatina e doxorrubicina.

Os resultados destes estudos de modelo de tumor murino transplantado estão sumarizados, com grande detalhe, na tabela 4, que mostra o prolongamento da expectativa de vida (AEU) ou a percentagem de inibição do crescimento de tumor sólido mensurável (isto é, subcutaneamente) alcançados com doses óptimas e esquemas de administração óptimos do Composto N2. IS. Estão também apresentados na tabela 4 os resultados obtidos em estudos comparativos, nestes modelos de tumores, com os compostos naturais aparentados, camptotecina e 10-hidroxicamptotecina. Estes resultados foram obtidos com administração i.p. ou i.v. do Composto N3. IS num esquema intermitente (i.é, de quatro em quatro ou de sete em sete dias). Em alguns casos, os resultados foram obtidos com um regime de tratamento óptimo em que o Composto NS, 1S foi administrado num regime de dose repartida (de 3 em 3 horas, 4 vezes) em cada dia de tratamento, tal como descrito mais abaixo com maior detalhe. A camptotecina e a 10-hidroxicamptotecina foram sempre administradas como suspensões i.p. dada a sua insolubilidade em veículos aquosos.

E evidente na tabela 4 que todos os três compostos têm um espectro de actividade largo em modelos de tumores de animais. A actividade superior para o Composto NQ. 13 é evidente em diversos modelos de tumores incluindo: leucemia L1210 i.p., melanoma B16

i.p., leucemia Ρ3ΘΘ i.v., leucemia L1210 i.v., carcinoma de Leu/is do pulmão s.c., melanoma B16 sc, melanoma B16/sublinha FIO s.c., carcinoma do cólon 51 s.c., e carcinoma de Madison do pulmão s.c.. A 1O-Hidroxicamptotecina é bastante activa em modelos de tumores implantados i.p., mas apresenta actividade inferior em modelos de tumores nos quais o tumor é implantado num local distante do local de administração da droga; esta droga tem, quando muito, ac68 443

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-17tividade mínima em modelos de tumores sólidos implantados s.c.. Provavelmente isto não é devido à fraca solubilidade da 10-hidroxicamptotecina dado que a camptotecina é igualmente insolúvel mas é bantante activa em certos modelos de tumores s.c.. E possível que o grupo hidroxilo aromático da 10-hidroxicamptotecina seja susceptível a uma primeira passagem de conjugação e excreção biliar e, portanto que/composto não alcance concentrações adequadas na circulação sistémica. Notavelmente, o Composto NQ. IS, que também tem um grupo 10-hidroxilo, é altamente activo em modelos de tumores s.c. e i.v.. Isto pode ser devido à presença da cadeia l.a teral básica na posição 9 do Composto N3. 15 que pode inibir o me tabolismo do grupo 10-hidroxilo por impedimento estereoquímico, ligação de hidrogénio ou formação interna de sal. A 10-hidroxicamptotecina é altamente activa no carcinoma de cólon 26 i.p., que é insensível ao Composto N9. IS e minimamente sensível à camptotecina. Contudo o mesmo tumor é refractário à 10-hidroxicamptotecina quando implantado s.c., ainda que tenha uma sensibilidade modesta ao Composto N9. 15 neste conJunto.

Para além do alto grau e largo espectro de actividade do Composto N9. IS, tal como demonstrado na tabela 4, o composto tam bém parece manter totalmente a actividade antitumor quando administrado oralmente. Isto foi demonstrado em ratinhos portadores de carcinoma de Lewis do pulmão implantado s.c. e está descrito detalhadamente mais abaixo. Outra característica do Composto N3. IS é a manutenção da sua actividade em sublinhas de leucemia Ρ3ΘΘ que apresentam resistência a múltiplas drogas antitumor, tal como descrito abaixo. Como um dos problemas maiores na quimioterapia do cancro é o aparecimento de populações de células resistentes que não respondem a regimes de drogas inicialmente eficazes assim como a regimes de tratamento de segunda linha, a disponibilidade de drogas às quais as células resistentes não apresentam resistêri cias cruzadas terá um impacto significativo no controlo do cancro.

A actividade do Composto N3. 1S em cada um dos modelos de tumores que foram testados está descrita com maior detalhe nas s.ecções seguintes.

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-18Modelos de Tumor i.p.

A actividade do Composto N9. IS administrado i.p. ou s.c. em vários esquemas de tratamento a ratinhos portadores de tumores implantados i.p. está apresentada na tabela 5. Os dados demonstram a dependência da dose do efeito antitumor do Composto N9. IS em seis modelos de tumores implantados i.p..

Leucemia P388: quando administrado i.p. nos Dias 1 e 5 a ratinhos portadores de leucemia P388 i.p., o Composto N9. 1S prodçj ziu AEU >200%, com 4/6 sobreviventes a longo prazo (curas), na sua dose máxima tolerada de 15 mg/kg. Doses mais baixas também foram altamente eficazes com aumentos na expectativa de vida de 125% e 92%. Este alto grau de actividade foi confirmado noutra experiência descrita mais tarde (ver tabela 8), em que a dose máxima tolerada produziu AEU de 228%, com 2/6 sobreviventes a longo prazo. Assim, o Composto N9. 1S apresentou actividade curativa em ratinhos portadores de leucemia P388 i.p..

Leucemia L1210: quando administrado i.p. nos Dias 1 e 5, o Composto N9. 1S foi reproductivelmente activo em ratinhos portja dores de leucemia L1210 i.p.. Na experiência representativa apre sentada na tabela 5, houve AEU de 219%, com 2/6 curas, na dose rná xima tolerada de 15 mg/kg. Foi também observada boa actividade em duas doses mais baixas. 0 Composto NQ. IS foi avaliado neste esquema em oito estudos adicionais de resposta à dose. A percentabem de AEU e os sobreviventes a longo prazo obtidos às doses máximas toleradas nestas experiências foram: 44% (O/ó), >300% (5/6), 119% (0/6), 156% (1/6), 138% (0/ó) , 156% (2/6), 350% (2/6) e 138% (l/ó). Assim em 8/9 experiências,o Composto N9. IS produziu AEU >100% e em 6/9 experiências houve sobreviventes a longo prazo.

Melanoma B16: neste modelo de tumor, no qual o Composto N9. IS foi marcadamente superior à camptotecina e à 10-hidroxicamptotecina (ver tabela 4), a droga produziu AEU de 152% à sua dose máxima tolerada de 15 mg/kg administrada i.p. nos Dias 1, 5, 9 e 13. Este resultado foi confirmado numa segunda experiência na qual a dose testada mais alta, 9,6 mg/kg, produziu AEU de 130%.

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-19Melanoma B16/5ublinha FIO: a sublinha FIO do melanoma B16, é uma sublinha deste tumor altamente metastática que foi seleccionada por clonação. 0 Composto NS. 1S produziu AEV de 105% à sua dose máxima tolerada de 15 mg/kg administrada i.p. nos Dias 1, 5, 9 e 13. A actividade, tal como indicada por aumentos na ex. pectativa de vida de >40%, foi também evidente em duas doses mais baixas.

Sarcoma M5076: o sarcoma M5076 é um sarcoma de células reticulares metastático que surgiu no ovário de um ratinho C57B1/6 e foi estabelecido como um tumor transplantado. Este tumor, implantado i.p., foi sensível ao Composto Νδ. 1S quando a droga foi administrada s.c., assim como por administração i.p. da droga. 0 grau de actividade foi virtualmente idêntico, AEV de 98% e AEV de 105%, pelas duas vias de administração no esquema de dose repartj. da de três em três horas x 4 nos Dias 1, 5 e 9. Este esquema, tal como descrito mais abaixo, parece ser óptimo para o Composto Νδ, 1S num certo número de modelos de tumores. 0 Composto NS. 1S foi avaliado em três estudos adicionais de resposta à dose em rat_i nhos portadores de sarcoma M5076 i.p.; nestes estudos a droga foi administrada como uma dose única i.p. nos Dias 1, 5 e 9 (AEV de 75%, com 1/8 curas), como uma dose única i.p. nos Dias 1, 5, 9 e 13 (AEV de 71%, com 1/8 curas), e como uma dose única s.c. nos Dias 1, 5 e 9 (AEV de 57%). Tal como nos modelos de tumor i.v. e s.c. (descritos mais abaixo), o Composto Νδ. IS parece ser mais eficaz no sarcoma M5076 i.p. quando administrado no regime de tra tamento de dose repartida. Apesar disso, independentemente do e.s quema de administração, o Composto Νδ. 1S é reproductivelmente aç tivo neste modelo de tumor.

Carcinoma do cólon 26:o carcinoma do cólon 26 é um modelo de tumor do cólon indiferenciado, altamente invasivo e metastático. Este tumor, no esquema testado, demonstrou ser refractário à dose máxima tolerada do Composto Νδ. 1S.

Modelos de tumor i.v.

A actividade do Composto N°. IS administrado i.p. ou i.v. a ratinhos portadores de leucemias sistémicas (inoculadas i.v.) □ u carcinoma de Leuiis do pulmão está apresentada na tabela 6. A

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SKB 14346-1

-20resposta à dose e a dependência do esquema do Composto NQ. IS é claramente demonstrada por estes estudos. Em cada um dos três mo delos de tumores, o Composto N2. IS demonstrou actividade curativa.

Leucemia Ρ3ΘΘ: a leucemia P388 é geralmente muito menos sensível às drogas quando implantada i.v. do que quando inoculada

i.p.. Contudo, o composto N2. IS foi altamente activo contra a leucemia P388 i.v. quando administrado à sua dose máxima tolerada nos Dias 1 e 5 quer i.p. (AEV de 279%, com 2/6 curas) quer i.v. (ACU de 250%, com 2/6 curas). Numa terceira experiência com este modelo de tumor, o Composto N9. 15 produziu AEV de 125%, com 1/6 curas, a uma dose máxima tolerada de 15 mg/kg administrada i.p. nos Dias 1 e 5.

Leucemia L1210: o Composto N5. IS demonstrou ser reproductível e altamente activo contra a leucemia L1210 implantada

1. v.. Os estudos extensos de dependência do esquema foram realizados neste modelo de tumor com a droga administrada i.v.. Tal como demonstrado na tabela 6, a administração segundo um regime de dose repartida resultou num maior grau de actividade numa gama de dosagem mais larga. A actividade curativa foi observada quando a droga foi administrada i.v. nos Dias 2 e 6 como dose única ou como quatro doses com intervalos de 3 horas. Para além dos d.a dos apresentados na tabela 6, existem 10 estudos de resposta à do^ se com o Composto N2. 1S administrado i.v. em ratinhos portadores de leucemia L1210 i.v.. Os resultados são os seguintes: Dias 2 e 6, AEV de 171%, com 2/6 curas; 4 tratamentos com intervalos de 3 horas nos Dias 2 e 6, AEV >300%, com 6/6 curas; três tratameri tos com intervalos de 6 horas nos Dias 2 e 6, AEV de 200%, com 2/7 curas; 2 tratamentos com intervalos de 12 horas nos Dias 2 e 6, AEV de 229%, com 2/7 curas; tratamentos únicos nos Dias 2 a 6, AEV de 143% e AEV de 129%; 2 tratamentos com intervalos de 12 horas nos Dias 2 a 6, AEV de 193% e AEV de 171%; uma dose única no Dia

2, AEV de 114%; e 4 tratamentos com intervalos de 3 horas no Dia

2, AEV de 244%, com 1/6 curas. 0 Composto N2. 1S parece ser mais z

eficaz quando administrado num esquema de 3 em 3 horas. E menos eficaz quando administrado diariamente do que quando administrado

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SKB 14346-1

-21de quatro em quatro dias. 0 esquema óptimo destes estudos foi utilizado para alguns tumores sólidos, tal como discutido acima para o sarcoma M5076 i.p. e tal como descrito abaixo. Numa varie dade de sistemas de tumores o grau de actividade aumenta e a variação da dosagem eficaz alarga-se quando o Composto N9. 1S é administrado num esquema de dose repartida (isto é, 4 vezes de 3 em 3 horas).

Carcinoma de Lewis do pulmão: □ carcinoma de Leu/is do pulmão é um cancro do pulmão, indiferenciado e altamente metastático, que tem sido largamente utilizado para avaliação de drogas. Este modelo de tumor é refractário a muitas das drogas antitumor estabelecidas e, quando utilizado como um sistema de investigação, identificarer.-se muito poucos compostos como activos. 0 Composto NQ. IS é curativo neste modelo de tumor quimiorefractário, em que o tumor é inoculado i.v. originando nódulos de tumor nos pulmães. A actividade curativa é um resultado invulgar neste modelo de tumor .

Como é evidente dos três modelos de tumores inoculados i.v. o Composto N°. 1S é bastante eficaz contra tumores sistémicos quando administrado i.p. assim como quando i.v.

Modelos de Tumores s.c.

Composto N3_f IS foi avaliado em dez modelos de tumores sólidos que foram implantados s.c., e a droga foi administrada i.p., i.v. ou oralmente (p.o.). Nestes modelos, a actividade antitumor é avaliada pelo grau de inibição do crescimento do tumor no local de implantação do tumor. Os tumores são geralmente medidos 2 a 3 semanas após a implantação do tumor quando grandes tumores ( >500 mm³) são evidentes em animais de controlo não tratados. Para tumores sólidos altamente metas tá ticos o tempo de sobrevivência pode também ser utilizado como medida da actividade da droga. Para mo delos de tumores menos metastáticos o tempo de sobrevivência de animais não tratados é altamente variável, e os animais podem sobreviver por longos períodos de tempo com tumores extremamente v£ lumosos que muitas vezes ulceram e se infectam. 0 Composto NS.

foi altamente eficaz em 8 dos 10 modelos de tumores sólidos s.c., inibindo o crescimento do tumor em mais de 90% na sua do3e

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SKB 14346-1 máxima tolerada (tabela 7). Inibição completa do crescimento do tumor em tumores altamente metastáticos, incluindo carcinoma de Lewis do pulmão, melanoma B16, melanoma Bló/sublinha F10, e sarco ma M5076, foi acompanhada por prolongamento da expectativa de vida. Mesmo nos modelos de tumor menos responsivos, carcinoma de Madison do pulmão e carcinoma do cólon 26, o composto NQ. 1S apre sentou alguma actividade inibitória do crescimento do tumor com >70% de inibição evidente na dose máxima tolerada.

Carcinoma de Lewis do pulmão: este tumor do pulmão altamente metastático foi o mais sensível ao Composto N3. 1S, dos modelos de tumores testados. Este é um resultado invulgar dado que o carcinoma de Lewis do pulmão tem sido largamente utilizado no estudo de drogas anti-tumor e é refractário à maioria das drogas anti-tumor conhecidas. Quando administrado i.p. nos Dias 1, 5, 9 e 13, o Composto NQ. IS inibe completamente o crescimento do carcinoma de Lewis do pulmão em virtualmente todos os ratinhos trat^ dos com 15 ou 9 mg/kg. Na dose máxima tolerada, 4 dos 8 ratinhos ficaram curados. Na altura da medição do tumor (Dia 14), os turno res nos controlos não tolerados tinham um volume médio de 1685 mn?. Numa segunda experiência, o Composto N9. 1S foi administrado i.v. e p.o. nos Dias 1, 5 e 9. Por ambas as vias de administrji ção houve 99% de inibição do crescimento do tumor (ICT) com metade ou mais dos animais não apresentando evidência do tumor na altura da medição (Dia 13). Além disso, a dose máxima tolerada foi virtualmente a mesma para ambas as vias de administração, sugeri_n do que o Composto NQ. IS tem excelente biodisponibilidade na admi nistração oral. Nesta experiência, os tumores cresceram eventual_ mente no local de implantação indicando que o tratamento i.p. é óptimo neste modelo de tumor ou que é necessária uma duração de tratamento mais longa para a actividade curativa.

Melanoma B16: este modelo de melanoma metastático tem si do largamente utilizado na avaliação e investigação de drogas anti-tumor. Quando implantado s.c. este tumor é refractário à maio ria das drogas anti-tumor. 0 Composto N9. 1S foi avaliado em ratinhos portadores do melanoma B16 s.c. em três estudos de resposta à dose. Quando administrada como dose única nos Dias 1, 5 e 9,

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a dose máxima tolerada do Composto N2. IS, administrada i.p. ou i.v., produziu 99% de inibição do crescimento do tumor (ICT), com a maioria dos animais não tendo tumores mensuráveis nos Dias 16 ou 14, quando os ratinhos de controlo apresentavam tumores com volumes médios, de 964 e 759 mn?, nas duas experiências. Quando admi nistrado no esquema de tratamento de dose repartida óptimo acima descrito, o Composto N3. 1S produziu inibição completa do crescimento do tumor numa gama de dosagem mais larga. Isto é consisten te com os resultados obtidos em outros modelos de tumores. Neste modelo de melanoma B16 s,c., os tumores cresceram eventualmente em todos os animais tratados e não houve curas. Neste modelo de tumor metastático, contudo, houve um prolongamento da expectativa de vida que ocorreu com a inibição completa do crescimento do tumor. No regime de dose repartida^AEV foi de 52%, enquanto que uma dose única i.p. de 24 mg/kg, nos Dias 1, 5 e 9, prolongou a expectativa de vida em 39%. Neste último esquema, a administração i.v. resultou num AEV de 53%.

Melanoma B16/5ublinha F10: esta sublinha do melanoma B16, seleccionada pelas propriedades metastáticas maiores foi similar ao melanoma B16 original na sua capacidade de resposta ao Composto NS. 1S. 0 tratamento i.p. nos Dias 1, 5, 9 e 13, resultou na inibição completa do crescimento do tumor à dose máxima tolerada. 0 tratamento i.v. nos Dias 1, 5 e 9, inibiu o crescimento do tumor em 97% em dois níveis de dose. Nestas experiências, os tumores foram medidos no Dia 16 e os tumores nos ratinhos de controlo eram muito grandes, medindo em média 1927 e 1196 mm. Os tumores em todos os grupos tratados cresceram eventualmente e não houve curas. Contudo, o tratamento i.p. a 25 mg/kg resultou num aumento da expectativa de vida (AEV) de 70%; o tratamento i.v. ao mes mo nível de dose deu um AEV de 38%.

Plasmacitoma AD0-PC6: este modelo de tumor, que é □ mais semelhante ao cancro humano do mieloma múltiplo, foi altamente sejn sível ao Composto N2. 1S administrado i.p. nos Dias 1, 5, 9 e 13. Os tumores foram medidos nos ratinhos de controlo no Dia 19 e tinham em média um volume de 828 mm\ 0 Composto N9. 1S produziu uma inibição do crescimento do tumor >90% a quatro níveis de do68 443

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-> Z

-24se, à dose máxima tolerada ou abaixo dela. Em cada um dos níveis de dose mais elevados havia 1 em 8 sobreviventes a longo prazo isentos de tumor. Como este tumor não é altamente metastático, o tempo médio de sobrevivência não foi determinado.

Sarcoma M5076: o sarcoma M5076 implantado s.c. foi bastante sensível ao Composto Νδ. 1S com >90$ de ICT a três níveis de dose, à dose máxima tolerada ou abaixo dela. Os tumores foram medidos no Dia 17 altura em que os tumores de controlo tinham em média 1045 mm\ A droga foi administrada i.p. nos Dias 1, 5, 9 e

13. A droga não foi curativa neste modelo mas prolongou a expectativa de vida em 31%.

Adenocarcinoma mamário 16/C: este modelo de tumor da ma ma é uma sublinha transplantável do tumor mamário espontâneo do ratinho C3H. 0 Composto Νδ, IS inibiu o crescimento do tumor em 96% à dose máxima tolerada de 10 mg/kg administrada i.p. nos Dias 1, 5, 9 e 13. Os tumores foram medidos no Dia 19, altura em que o volume médio dos tumores nos ratinhos de controlo era 630 mm\ Numa segunda experiência com o mesmo esquema de tratamento, o Com posto NS. 15 produziu 73% de inibição do crescimento do tumor (ICT) no adenocarcinoma mamário 16/C. Como este tumor não é alta mente metas tático, os animais não foram conservados para sobrevivência.

Adenocarcinoma do cólon 38: este modelo de tumor do cólon não metastático tem sido largamente utilizado na avaliação de drogas e é considerado como um dos modelos de tumor mais refractá. rio ãs drogas. 0 Composto N5. IS foi administrado i.p. como dose única ou num regime de dose repartida nos Dias 3, 10, 17 e 24. 0 regime de tratamento mais prolongado foi escolhido por causa do crescimento lento deste tumor sólido. Os tumores foram medidos no Dia 31 e apresentaram, em média, apenas 349 mm nos controlos não tratados. Tal como noutros modelos de tumor, o composto NS. 1S foi mais eficaz no esquema de dose repartida produzindo uma inibição >90% em dois níveis de dose. Uma actividade boa (ICT de 89%) foi também evidente no regime de dose única.

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-25Adenocarcinoina do cólon 51: este é outro modelo de tumor do cólon de crescimento lento, que demonstrou ser refractário à maioria das drogas anti-tumor. 0 protocolo utilizado para este tumor foi semelhante ao do adenocarcinoma do cólon 38. D Composto N9. IS foi activo contra o adenocarcinoma do cólon 51 produzi_n do 88% de ICT com o regime de dose única e 92% de ICT no tratamejn to de dose repartida. Tal como noutros tumores, o Composto N9. IS foi eficaz numa gama de dosagem mais larga quando administrado no regime de dose repartida. 0 adenocarcinoma do cólon 51 foi mje dido no Dia 24 quando os tumores de controlo apresentavam em média 766 mm\

Carcinoma de Madison do pulmão: o carcinoma de Madison do pulmão, tal como o carcinoma de Letuis do pulmão, é um modelo de tumor indiferenciado de crescimento rápido com alta actividade metastática. Em contraste com o tumor de Lewis do pulmão, o tumor de Madison do pulmão não é altamente sensível ao Composto N9. IS. Num regime de dose única administrada i.v. nos Dias 1, 5 e 9, não houve virtualmente inibição do crescimento do tumor (ICT de 28%) na dose máxima tolerada. Em duas experiências adicionais no mesmo esquema de tratamento com a droga administrada i.p., □ Composto NS. IS produziu apenas ICT de 50% e de 23%. Contudo, no re. gime de dose repartida óptimo, o Composto N9. IS , administrado i.v., apresentou actividade contra o carcinoma de Madison do pulmão com ICT de 85% na dose máxima tolerada. Esta droga foi algo menos eficaz neste esquema de tratamento quando administrada i.p. (ICT de 74% na dose máxima tolerada). Os tumores de Madison do pulmão foram medidos no Dia 12 ou 13 em duas experiências separadas, altura em que os tumores nos ratinhos de controlo apresentavam, em média, 1571 e 942 mm⁵ respectivamente, reflectindo um rápido crescimento deste tumor. Assim, mesmo num tumor refractário, a administração do Composto N9. IS no seu regime de tratamento óptimo pode ter como resultado uma inibição significativa do cres cimento do tumor.

Carcinoma do cólon 26: neste tumor do cólon indiferencia do, altamente invasivo e metastático, o Composto N9, 1S produziu apenas inibição marginal do crescimento do tumor (ICT de 72%) quajn

443

SKB 14346-1

-26do administrado i.p. à sua dose máxima tolerada nos Dias 1, 5, 9 e 13. Os tumores foram medidos no Dia 19 altura em que os tumores de controlo apresentavam em média 1052 mm\ Desconhece-se se o Composto NQ. IS apresentaria boa actividade neste modelo de tumor se administrado no seu regime de dose repartida óptimo.

Sublinhas resistentes a múltiplas drogas

Apesar de o problema mais significativo na terapêutica do candro ser o inerente à insensibilidade dos neoplasmas comuns a todos os agentes ou a regimes de combinação, disponíveis, outro problema principal é o aparecimento de células tumorais resistentes provenientes de tumores anteriormente responsivos. A maioria dos doentes com tumores quimio-sensíveis, tais como carcinoma do pulmão de células não-pequenas, adenocarcinoma do ovário, leucemia aguda não-linfocítica, carcinoma da mama e certos linfomas, podem ser colocados em remissão por regimes de combinação que foram instituídos como terapia de primeira linha para estas diversas doenças. Contudo, na maioria dos casos, os doentes apresent_a ram recorrência da doença e a capacidade de induzir subsequentemente remissão significativa, mesmo com regimes de combinação altamente intensivos, ficou grandemente reduzida. Característicamente, estes tumores recorrentes mostraram ser refractários a dro, gas que são estruturalmente e/ou mecanicamente não relacionadas com as drogas que foram inicialmente empregues para induzir a remissão. Este fenómeno de resistência a múltiplas drogas está actualmente a ser investigado intensivamente em vários laboratórios. Evidências recentes sugerem que a amplificação e expressão do gene de resistência a múltiplas drogas (mdr) e a presença do produto do gene mdr, a glicoproteína de membrana P170, está associada com a resistência a múltiplas drogas. Significativamente a P170 serve como uma bomba de transporte de efluxo com uma divei; sidade incrível de especificidade para o substrato. Um trabalho recente sugere que a forte expressão do gene mdr em certos tumores não tratados previamente, tais como feocromocitona e adenocajç cinoma do cólon, poderia ser responsável, pelo menos, em parte pelo inerente fenótipo refractário a drogas destes tumores.

Assim, é importante identificar novos agentes que aprese_n

443

SKB 14346-1

tam alto grau de actividade contra tumores que expressam o fenót_i po de resistência a múltiplas drogas. Tais agentes podem ser a esperança para mais progressos no tratamento de tumores quimio-sensíveis (isto é, por apresentarem eficácia em doentes previamente tratados ou por matarem a subpopulação mdr, quando usados como um componente de regimes de combinação de primeira linha), assim como de tumores vulgarmente não responsivos que são insensíveis às drogas disponíveis devido à expressão inata do gene mdr. Pi camptotecina provou ser original por ser um dos poucos agentes citotóxicos naturais que não demonstrou resistência cruz_a da nas bem caracterizadas sublinhas de tumores que apresentam o fenótipo mdr, isto é, sublinhas P388 resistentes a doxorrubicina, vincristina, amsacrina, elipticina ou mitoxantrona. Dado que a maioria das drogas que apresentam resistência cruzada em linhas de células resistentes a múltiplas drogas, são básicas, esperava-se que a adição de uma cadeia lateral básica à molécula de campto tecina, tal como no Composto Νδ. IS, resultasse num composto que seria transportado para fora das células pela glicoproteína P170, e assim demonstrar a ineficácia em tumores expressando o gene mdr.

Composto Νδ, 1S foi avaliado em ratinhos portadores de Ρ3ΘΘ e suas sublinhas resistentes à doxorrubicina e à mitoxantrona (tabela θ). A doxorrubicina e mitomicina C foram incluídas pa_ ra comparação. A P388/doxorrubicina e P388/mitoxantrona mantiveram sensibilidade ao Composto Νδ. IS. Estas linhas de células re sistentes a múltiplas drogas demonstraram a esperada resistência à doxorrubicina. A P38B/doxorrubicina também foi resistente à mi tomicina C. Assim, o Composto Νδ, 1Ξ mantém a actividade anti-tu mor em linhas de células resistentes a múltiplas drogas, o que é uma característica da camptotecina.

Forma racémica do composto N°. 1

Todos os estudos biológicos descritos até aqui foram realizados com o isómero S do Composto Νδ. 1, isto é, a configuração no C-20 que existe na camptotecina ocorrendo naturalmente e na 10-hidroxicamptotecina. Uma forma racémica do Composto Νδ. 1 foi preparada por síntese total e foi avaliada para a actividade anti. -tumor em ratinhos portadores de leucemia P388 (tabela 9). A forma

443

SKB 14346-1

-28racémica do Composto N9. 1S , daqui em diante designada por Compos^ to NS. 1RS, é altamente activa na leucemia Ρ38Θ, produzindo um AEU de 165%, com l/ó sobreviventes a longo prazo na dose de 29 mg/ /kg administrada i.p. nos Dias 1 e 5. Apesar de não ser tão acti_ vo como o Composto N9. IS (cf Tabelas 5 e 8), o Composto NQ. 1RS possui excelente actividade neste modelo de tumor.

Diferentes formas de sais do Composto Na. IS

Composto N9. IS é hidrossolúvel em virtude da presença da cadeia lateral básica na posição 9 que forma sais com ácidos, tais como ácido acético, ácido clorídrico e ácido metanossulfónico. As experiências descritas nas tabelas 2 a 9 foram realizadas quer com o sal acetato quer com o sal cloridrato do Composto N9. IS. Uma forma solúvel do Composto N9. 1S pode também ser prepara da por hidrólise básica do anel E de lactona do Composto N9. IS, com a formação de sais de metal alcalino hidrossolúveis, da forma carboxilato do composto. Uma comparação directa dos sais acetato, cloridrato, dicloridrato e de sódio, do Composto NQ. IS foi reali. zada em ratinhos portadores de leucemia L1210 i.v. (tabela 10). Os compostos foram administrados como soluções em dextrose a 5% i.v. nos Dias 1 e 5. 0 sal dicloridrato foi formado após adição de ácido clorídrico em excesso e resulta provavelmente a partir da protonação do azoto da quinolina no anel B, assim como do azoto do grupo dimetilaminometilo. Cada tipo de sal foi activo neste modelo de tumor com um AEU de 100% evidente para o acetato, AEV de 175% para o cloridrato, AEU de 133% para o dicloridrato, e AEU de 208% para o sal de sódio. Os três sais de ácido foram equipotentes, isto é, apresentaram níveis de dose máxima tolerada idênticos, de 15 mg/kg. Contudo, o sal cie sódio foi cerca de 3,5 vezes menos potente com uma dose máxima tolerada de 54 mg/kg.

443

SKB 14346-1

Tabela 3

Espectro de actividade do Composto N9. 13 em modelos de tumores de Animais

Modelo de tumor	Actividade à dose máxima tolerada
Modelos de tumores i.p.
Leucemia P388	+ + +
Leucemia L1210	+ + +
Melanoma B16	+ +
Melanoma B16/sublinha F10	+ +
Sarcoma M5076	+ +
Carcinoma do cólon 26	-
Modelos de tumores i.v.
Leucemia P388	+ + +
Leucemia L1210	+ + +
Carcinoma de Letuis do pulmão	+ + +
Modelos de tumores s.c.
Carcinoma de Leujis do pulmão	+ + +
Melanoma B16	+ +
Melanoma Bló/Subclone F10	+ +
Plasmocitoma AD3-PC6	+ +
Sarcoma M5076	+ +
Adenocarcinoma mamário ló/c	+ +
Adenocarcinoma do cólon 38	+ +
Adenocarcinoma do cólon 51	+ +
Carcinoma de Medison do pulmão	+
Carcinoma do cólon 26	+

Composta N2. IS foi administrada i.p. ou i.v. de quatro em quatro ou de sete em sete dias, durante 2 a 4 ciclos, começando 1 a 3 dias após implantação do tumor.

+++ = curativa (aumento da expectativa de vida (AEV) >200%) ++ = aumento da expectativa de vida (AEV) >100% ou inibição do crescimento do tumor (ICT) >90% + = AEV >50% ou ICT >70%

- = AEV <50% ou ICT <70%

443

SKB 14346-1

-30Tabela 4

Comparação do Composto N9. IS com camptotecina e 10-hidroxicampto cina num espectro de modelos de tumores de animais

Modelo de tumor	Aumento da expectativa de vida (AEV) ou inibição do crescimento do tumor (ICT)
Composto N°. 1Ξ	Camptotecina	10-hidrox icamptotecina
Modelos de tumores i.p.
Leucemia P388	Curativo	Cura tiva	Curativa
Leucemia L1210	Cura tivo	172% AEV	94% AEV
Melanoma B16	152% AEV	36% AEV	95% AEV
Melanoma B16/Sublinha F10	105% AEV	68% AEV	100% AEV
Sarcoma M5076	105% AEV	81% AEV	98% AEV
Carcinoma do cólon 26	25% AEV	50% AEV	Curativa
Modelos de tumores i.v.
Leucemia Ρ3Θ8	Curativo	75% AEV	40% AEV
Leucemia L1210	Curativo	136% AEV	100% AEV
Carcinoma de Letuis do pulmão	Curativo	não testada	não testada
Modelos de tumores s.c.
Carcinoma de Leu/is	Cura tivo	92% ICT	4% ICT
Melanoma B16	100% ICT	78% ICT	não testada
Melanoma B16/Sublinha FIO	100% ICT	90% ICT	58% ICT
Plasmocitoma AD3-PC6	100% ICT	100% ICT	76% ICT
Sarcoma M5076	100% ICT	100% ICT	66% ICT
Adenocarcinoma mamário 16/c	96% ICT	99% ICT	61% ICT
Adenocarcinoma do cólon 38	96% ICT	100% ICT	não testada
Adenocarcinoma do cólon 51	92% ICT	75% ICT	não testada
Carcinoma de Madison do pulmão	85% ICT	63% ICT	33% ICT
Carcinoma do cólon 26	72% ICT	66% ICT	37% ICT

A actividade apresentada foi obtida com a dose máxima tolerada. As drogas foram administradas i.p. ou i.v., a ratinhos portadores de tumor, de quatro em quatro ou de sete em sete dias, durante 2 a' 4 ciclos de tratamento, começando 1 a 3 dias após implantação do tumor. Os valores foram determinados com base no tempo médio de sobrevivência a no volume médio do tumor em grupos de 6 a Θ ratinhos em estudos completos de resposta à dose.

443

SKB 14346-1

-31Tabela 5

Actividade do Composto N8, IS em ratinhos portadores de tumores implantados i.p.

Modelo de tumor	Esquema de tratamento/ /Via de administra ção	Dose (mg/kg/ /injecção)	AEV (%)	Sobreviventes a longo prazo
Leucemia Ρ3ΘΘ	A/i.p.	30	tóxico	4/6
	15	>200
		7,5	125
		3,8	92
Leucemia L1210	A/i.p.	25	tóxico
		15	219	2/6
		9	138
		5,4	81
		3,2	31
Melanoma B16	B/i.p.	25	tóxico
		15	152
		9	100
		5,4	52
		3,2	43
Melanoma B16/	B/i.p.	25	tóxico
/Sublinha FIO	15	105
		9	68
		5,4	63
		3,2	37
Sarcoma M5076	C/i.p.	10	tóxico
		5	tóxico
		2,5	105
		1,2	75	1/8
		D,62	70	1/8
Sarcoma M5076	C/s.c.	10	tóxico
		5	tóxico
		2,5	98
		1,2	70	1/8
		0,62	36
Carcinoma do	B/i.p.	40	tóxico
cólon 26		20	tóxico
		10	25
		5	5
		2,5	7
Os esquemas de tratamento são:	A = Dias 1	e 5 ; B =	Dias 1, 5, 9
e 13; C = de 3 em 3 horas x 4	nos Dias 1,	5 e 9.
0 aumento da expectativa de vida (AEV) é baseado no	tempo médio de
sobrevivência de	grupos de 6 a	8 ratinhos	em relação	a controlos

nSo tratados. Os sobreviventes a longo prazo estavam isentos de tu mor no Dia 45 para as leucemias ou no Dia 60 para os tumores sólidos.

443

SKB 14346-1

*5·'

-32Tabela 6

Actividade do Composto N9. 1S em ratinhos portadores de tumores implantados i.v.

Modelo de tumor	Esquema de tratamento/ /Via de administra ção	Dose (mg/kg/ /injecção)	AEV (%)	Sobreviventes a longo prazo
Leucemia Ρ3ΒΘ	A/i.p.	25	279	2/6
		15	132
		9	100
		5,4	58
		3,2	42
Leucemia P388	A/i.v.	25	tóxico
		19	250	2/6
		14	145
		10	110
		7,9	65
Leucemia L1210	A/i.p.	25	tóxico
		15	171	1/6
		9	136
		5,4	93
		3,2	57
Leucemia L1210	D/i.v.	40	tóxico
		24	>300	4/7
		14	157
		8,6	129
		5,2	71
Leucemia L1210	E/i.v.	6	tóxico
		3,6	>300	5/7
		2,2	>300	1/7
		1,3	243	2/7
		0,78	186
Carcinoma de	B/i.p.	25	tóxico
Leuiis do pulmão		15	>2 00	7/7
		9	111	1/7
		5,4	37
		3,2	16
Os esquemas de tratamento são:	A = Dias 1	e 5 ; B =	Dias 1, 5, 9
e 13; D = Dias 2	e 6; E = de	3 em 3 horas	x 4, nos	Dias 2 e 6.
0 aumento na expectativa de vida (AEV) é baseado no	tempo médio

de sobrevivência de grupos de 6 a 8 ratinhos em relação a controlos não tratados. Os sobreviventes a longo prazo estavam isentos de tumor no Dia 45 para as leucemias ou no Dia 60 para os tumores sólidos.

443

SKB 14346-1

*.·

-33Tabela 7

Actividade do Composto NQ. IS em ratinhos portadores de tumores implantados s.c.

Esquema de tratamento/ Dose Ratinhos sem

Modelo de tumor /Via de (mg/kg/ ICT (%) tumores paladministra /injecção) páveis ção

Carcinoma de	8/i.p.	25	tóxico
Leu/is do Pulmão		15	100	b/b
		9	99	7/8
		5,4	68	2/8
		3,2	31
Carcinoma de	F/i.v.	25	99	5/8
Leiuis do pulmão		15	95	3/8
		9	93	1/8
		5,4	87	4/8
Carcinoma de	F/p.o.	45	tóxico
Leiuis do pulmão		27	99	4/8
		16	90	1/8
		9,7	89	2/8
		5,8	51
Melanoma B16	F/i.p.	24	99	7/8
		14	57	3/8
		8,6	63	3/8
		5,2	20	1/8
		3,1	63	2/8
Melanoma B16	F/i.v.	25	tóxico
		15	99	7/8
		9	96	6/Θ
		5,4	79	3/8
		3,2	54	2/8
Melanoma B16	C/i.p.	6	100	7/7
		3,6	100	7/7
		2,2	92	2/8
		1,3	64	1/8
		0,78	46	1/8

443

SK8 14346-1

Tabela 7 (cont.)

Actividade do Composto NQ. IS em ratinhos portadores de tumores implantados s.c.

Esquema de tratamento/ Dose Ratinhos sem

Modelo de tumor /Via de (mg/kg/ ICT (%) tumores paladministra /injecção) páveis ção

Melanoma B16/Sub	B/i.p.	25	100	7/8
linha FIO		15	87
		9	57
		5,4	62
		3,2	52
Melanoma 816/Sub	F/i.v.	25	97	6/8
linha FIO		15	97	7/8
		9	60	2/8
		5,4	34	1/Θ
		3,2	22	1/8
Plasmocitoma	B/i.p.	25	tóxico
ADJ-PC6		15	100	„ /_KX!K
		9	100	8/8***
		5,4	92	4/8 *
		3,2	93	3/8
Sarcoma M5076	B/i.p.	25	tóxico
		15	100	8/8
		9	98	6/8
		5,4	92	3/8
		3,2	64	2/8
Adenocarcinoma	8/i.p.	20	tóxico
mamário 16/C		10	96	5/B
		5	61	2/8
		2,5	59	1/8
A denocarcinoma	G/i.p.	24	89	4/7
do cólon 38		14	78	5/7
		8,6	55	3/7
		5,2	0	1/7
		3,1	0	2/7

68 443
SKS 14346-1
	-35-
	Tabela 7 (cont.)

Actividade do Composto NQ. 15 em ratinhos portadores de tumores implantados s.c.

Esquema de tratamento/ Dose Ratinhos sem

Modelo de tumor /Via de (mg/kg/ ICT (%) tumores paladministréi /injecção) páueis ção

A denocarcinoma	H/i.p.	6	96	5/7
do cólon 38		3,6	93	6/7
		2,2	74	4/7
		1,3	68	4/7
		0,78	53	2/7
Adenocarcinoma	G/i.p.	24	88	3/8
do cólon 51		14	76	1/B
		8,6	53	1/8
		5,2	36
		3,1	34
A denocarcinoma	H/i.p .	3,6	92	4/8
do cólon 51		2,2	89	4/8
		1,3	ΘΘ	3/8
		0,78	73	1/8
		0,47	37
Carcinoma de	F/i.v.	24	28	1/8
Madison do pulmão		12	0
		6	21
		3	0
		1,5	0
Carcinoma de	C/i.v.	3	tóxico
Madison do pulmão		1,5	85	3/8
		0,75	63	1/8
-		0,38	41
		0,19	0

443

SKB 14346-1

Tabela 7 (cont.)

Actividade do Composto NS, 1S em ratinhos portadores de tumores implantados s.c.

Modelo de tumor	Esquema de tratamento/ /Via de adminis tra ção	Dose (mg/kg/ /inj ecção)	ICT (%)	Ratinhos sem tumores palpáveis
Carcinoma do	B/i.p.	20	tóxico
cólon 26		10	72
		5	39
		2,5	38

Os esquemas de tratamento são: B -	Dias 1,	5,	9 e 13; C	- de	3
em	3 horas x 4, nos Dias	1, 5	e 9;	F = Dias	1	, 5 e 9; G	= Dias
3,	10,	17 e 24; H = de	3 em	3 horas	x 4, nos	Dias 3, 10,	14 e	24.
X	4/8	sobreviventes a	longo	prazo	isentos	de	tumor
XX	2/8	sobreviventes a	longo	prazo	isentos	de	tumor
XXX	1/8	sobreviventes a	longo	prazo	isentos	de	tumor

A inibição do crescimento do tumor (ICT) é baseada no volume médio do tumor de grupos de 7 ou 8 ratinhos em relação a controlos não tratados. Os tumores foram medidos entre os Dias 12 e 19 (excepto para cólon 51 no Oia 24 e para o cólon 38 no dia 31). Em todas, excepto em duas, das experiências, todos os ratinhos de controlo não tratados (ratinhos/grupo) apresentavam tumores mensjj ráveis. Nas experiências B16/F1O, esquema F, 21/24 ratinhos de controlo tinham tumores mensuráveis. Na experiência com adenocar cinoma do cólon 38, 19/21 ratinhos de controlo apresentavam tumores mensuráveis.

443

SKB 14346-1

-37Tabela 8

Falta de resistência cruzada ao composto N9. 15 de sublinhas de leucemia Ρ38Θ resistentes a várias drogas

Composto	Do se (mg/kg i. p. Dias 1 e 5)	Ρ38Θ	P 38B/doxorrubici na	P388/mitoxantrona
AEV (/)	MCL (log)	AEV W	MCL (log)
AEV (%)	MCL (log)
Compos to	25	tóxico	tóxico			tóxico
NQ. IS	15	228	6,5	176	6,0	107	5,7
	9	211	6,5	90	2,2	79	3,6
	5,4	128	3,5	33	0	57	2,1
	3,2	67	1,0	14	0	29	0
Doxorru-	9	233	6,5	14	0	7	0
bici na	5,4	156	4,6	' 19	0	4	0
	3,2	172	5,3	24	0	0	0
	1,9	167	5,1	24	0	0	0
	1,2	117	3,0	19	0	0	0
Mi tomic i	7,5	178	5,5	52	0,5	104	5,5
na C	4,5	156	4,6	62	1,0	136	6,5
	2,7	128	3,5	52	0,5	54	1,8
	1,6	106	2,6	4B	0,3	29	0
	1,0	83	1,7	29	0	14	0

aumento da expectativa de vida (AEV) é baseado no tempo médio de sobrevivência de grupos de 6 ratinhos. A morte de células tumorais líquidas(MCL) é calculada a partir do tempo médio de sobre vivência por métodos padronizados, dado que o tempo de sobrevivên cia é uma função linear do log da carga de células tumorais. Como a sublinha resistente à mitoxantrona tem um tempo de duplicação superior ao das outras duas linhas de células utilizadas nesta e_x periência, um AEV menor está associado com uma MCL maior do que na P388 ou na linha de células resistentes à doxorrubicina.

443

SKB 14346-1

-38Tabela 9

Actividade da mistura racémica do Composto NQ. 1S em ratinhos portadores de leucemia Ρ3Θ8 i.p.

Compos to N° .	Dose (mg/kg, i.p. Dias 1 e 5)	AEV (%)	Sobreviventes a longo prazo
1RS	29	165	1/6
	14	135
	7,2	80
	3,6	30

Os animais foram implantados i.p. com 10 células. 0 aumento da expectativa de vida (AEV) é baseado no tempo médio de sobrevivência de grupos de 6 ratinhos em relação a controlos não tratados.

Os sobreviventes a longo prazo estavam isentos de tumor no Dia 45.

443

SKB 14346-1 _rJ*'_Λ/ ~ -p-39Tabela 1D

Actividade comparada de diferentes formas de sais do composto Νδ, 15 em ratinhos portadores de leucemia L1210 i.v.

Composto Dose AEV

NS. (mg/kg, i.p., (%)

Dias 1 e 5)

IS	(sal	acetato)	25	tóxico
			15	100
			9	83
			5,4	67
			3,2	50
is	(sal	cloridrato)	25	tóxico
			15	175
			9	125
			5,4	92
			3,2	50
is	(sal	dicloridrato)	25	tóxico
			15	133
			9	83
			5,4	50
			3,2	50
15	(sal	de sódio)	90	tóxico
			54	208
			32	133
			19	100
			12	67
			6,5	33

Os animais foram inoculados i.v. com 10⁶ células. 0 aumento na expectativa de vida (AEV) é baseado no tempo médio de sobrevivê_n cia de grupos de 6 ratinhos em relação a controlos não tratados.

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15Ç

-40Composição farmacêutica e método de tratamento

As composiçães farmacêuticas deste invento compreendem uma quantidade de um composto de fórmula (i) eficaz na inibição do crescimento de células tumorais e um veículo ou diluente inerte farmaceuticamente aceitável. Estas composiçSes são preparadas sob a forma de unidades de dosagem apropriadas para administração parentérica ou oral.

Um composto de fórmula (i) é administrado sob a forma de dosagem convencional preparada por combinação duma quantidade terapeuticamente eficaz (isto é, uma quantidade eficaz na inibição do crescimento do tumor) dum composto de fórmula (i) (ingrediente activo) com veículos ou diluentes farmacêuticos padronizados, de acordo com procedimentos convencionais. Estes procedimentos podem envolver mistura, granulação e compressão ou dissolução dos ingredientes conforme for apropriado para a preparação desejada.

veículo farmacêutico empregue pode ser, por exemplo, sólido ou líquido. Exemplos de veículos sólidos são lactose, tejr ra alba, sacarose, talco, gelatina, ágar, pectina, goma arábica, estearato de magnésio, ácido esteárico e similares. Exemplos de veículos líquidos são xarope, óleo de amendoim, azeite, água e s_i milares. Igualmente, o veículo ou diluente pode incluir um material retardador bem conhecido na especialidade, tal como monoestearato de glicerilo ou diestearato de glicerilo só ou com uma c.e ra, etilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, metilmetacrilato e similares.

Uma extensa variedade de formas farmacêuticas podem ser empregues. Assim, se for utilizado um veículo sólido, a preparação pode ser comprimida, colocada dentro de cápsulas de gelatina dura sob a forma de pó ou pelota, ou preparada na forma de trocis co ou pastilha. A quantidade de veículo sólido variará largamente mas de preferência estará entre cerca de 25 mg e cerca de 1 g. Se for utilizado um veículo líquido, a preparação estará sob a forma de xarope, emulsão, cápsula de gelatina mole, solução ou suspensão injectável estéril numa ampola ou frasco, ou suspensão líquida não aquosa.

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Para obter uma forma de dosagem hidrossolúvel estável, um sal farmaceuticamente aceitável dum composto de fórmula (i), é dissolvido numa solução aquosa dum ácido orgânico ou inorgânico, tal como solução de ácido succínico 0,3M ou preferencialmente, ácido cítrico. Se uma forma de sal solúvel não estiver disponível, o composto de fórmula (i) é dissolvido num co-solvente adequado ou suas combinações. Exemplos de tais co-solventes adequados incluem, mas não estão limitados a, álcool, propilenoglicol, polietileno glicol 300, polissorbato 80, glicerina e similares, em concentrações entre 0-60% do volume total.

A composição pode também estar na forma de uma solução de um sal do ingrediente activo num veículo aquoso adequado, tal como água ou solução salina isotónica ou soluções de dextrose. Para □s compostos de fórmula (i) que não têm uma cadeia lateral básica na posição 9, tal como os compostos NQs. 2S e 10S (ver tabela 2 para estrutura), um sal de metal alcalino do carboxilato, formado por hidrólise alcalina do anel E da lactona, produzirá um sal solúvel, tal como exemplificado pelo sal de sódio do Composto NS. IS.

Será apreciado que as dosagens actualmente preferidas dos compostos de fórmula (i) utilizadas nas composições deste invento variarão de acordo com o complexo particular a ser utilizado, a composição particular formulada, o modo de administração e o local, hospedeiro e doença particular a ser tratada. Dosagens óptimas para um dado conjunto de condições podem ser determinadas pelos especialistas na matéria utilizando testes convencionais de determinação da dosagem tendo em vista os dados experimentais acima. Para administração parentérica, a dose geralmente empregue é de cerca de 20 a cerca de 150 mg/m de área de superfície do corpo, por dia, durante um a cinco dias, de preferência repetj. da aproximadamente de quatro em quatro semanas durante quatro ciclos de tratamento. Para administração oral, a dose geralmente empregue é de cerca de 20 a cerca de 150 mg/m de área de superf_í cie de corpo por dia, durante um a cinco dias, com ciclos de tratamento repetidos a intervalos apropriados.

método de inibição do crescimento de células de tumor

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-42de animal sensíveis a um composto de fórmula (i) de acordo com e_s te invento compreende a administração, a um animal hospedeiro afectado com as referidas células tumorais, duma quantidade dum composto de fórmula (i) eficaz na inibição do crescimento do tumor. Tal como acima descrito, durante o ciclo de tratamento o ingrediente activo será administrado parenteral ou oralmente numa 2 base diária e numa quantidade seleccionada de cerca de 20 mg/m a 2 cerca de 150 mg/m de área de superfície do corpo, durante um a cinco dias, em ciclos de tratamento repetidos a intervalos apropriados .

Os seguintes Exemplos ilustram: (a) o protocolo utilizado para avaliar a actividade de vários compostos de fórmula (i) em modelos de tumores murinos transplantados; (b) a preparação química dos compostos de fórmula (i) utilizados nas composiçães e métodos deste invento; e (c) uma composição farmacêutica oral e uma parentérica deste invento.

Sem mais elaboração, acredita-se que um especialista na matéria pode, utilizando a descrição precedente, utilizar o presente invento em toda a sua extensão. Os seguintes Exemplos são, por conseguinte, para serem interpretados como meramente ilustrativos e de nenhum modo como uma limitação do âmbito do presente invento.

EXEMPLOS

I. Protocolos utilizados para modelos de tumores murinos transplantados

Os protocolos utilizados para a avaliação da actividade antitumor de compostos de fórmula (i) estão bem estabelecidos e são largamente utilizados pelos especialistas no assunto, na avaliação da actividade de drogas em modelos de tumores pré-clínicos. Estes estudos geralmente seguem os protocolos estabelecidos pelo National Câncer Institute” tal como descrito por Geran e colab. , Câncer Chemotherapy Reports, Parte 3, Uol. 3, 1-103, 1972.

A) Modelos de tumores i.p.

Os tumores utilizados nestes estudos - leucemia Ρ3ΘΘ e suas sublinhas resistentes à doxorrubicina e à mitoxantrona, leu

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cemia L1210, melanoma B16, melanoma Bló/sublinhas FIO, sarcoma M5076 e carcinoma do cólon 26 - são mantidos por transplantações em série em estirpes de ratinhos consaguíneas. Para as leucemias, estes tumores são mantidos em ratinhos OBA/2. 0 sarcoma M5076, o melanoma B16 e a sua sublinha FIO são mantidos em ratinhos C57B1/6, e o carcinoma do cólon 26 é mantido em ratinhos BALB/c. As leuce mias e o sarcoma M5076 são transplantados seriadamente i.p. como suspensões de células de ascite, enquanto que as linhas de melano ma B16 e o carcinoma do cólon 26 são transplantados seriadamente como tumores sólidos s.c..

Em experiências terapêuticas, os tumores são removidos as septicamente dos ratinhos dadores e preparados como suspensões pa ra implantação i.p. em animais de teste. Os animais de teste para o carcinoma do cólon 26 são ratinhos BALB/c fêmeas (20-25 g). Os animais de teste para os outros modelos de tumores são ratinhos B6D2F1 híbridos de Fl, fêmeas, consanguíneas (C57Bl/6xDBA/2). 0 nível do inóculo varia com o tipo de tumor: a leucemia Ρ3ΘΘ é inoculada a 10⁶ células por ratinho; a leucemia L1210 a 10^ ou 10⁶ células por ratinho; o sarcoma M5076 a 5 x 10^ células por ratinho. Para implantação das linhas de melanoma B16 e do carcinoma do cólon 26, tumores s.c. dos ratinhos dadores são picados e homogeneizados num homogeneizador teflon-vidro de encaixe livre originando uma polpa de tumor. Os níveis do inóculo são 0,5 ml de uma polpa a 10% (p:v) das linhas de melanoma B16 e 0,5 ml duma polpa a 5% (p:v) de carcinoma do cólon 26. Após inoculação do tjj mor, os ratinhos são aleatoriamente distribuídos por grupos de trata mento ccntendo cada um, 6-8 ratinhos. Em cada experiência, existem três grupos de ratinhos de controlo não tratados. As drogas são dissolvidas ou suspensas em veículos aquosos apropriados e administradas por uma variedade de vias e com esquemas de adminis tração numa gama de níveis de dosagem. Os animais são alojados em gaiolas do tipo caixa de sapatos e monitorizados diariamente para mortalidade durante 30 (L1210), 45 (Ρ3Θ8) ou 60 (B16, M5076, cólon 26) dias. 0 ponto firial para a actividade é o tempo médio de sobrevivência e o aumento da expectativa de vida em relação aos controlos não tratados. Uma droga é considerada activa

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nestes modelos de tumores se prolonga a expectativa de vida em >40%.

B. Modelos de tumores i.v.

Os tumores utilizados nestes estudos - leucemia Ρ38Θ, lejj cernia L1210 e carcinoma de Lewis do pulmão - são mantidos por transplantações em série em estirpes de ratinhos consanguíneos: DBA/2 para as leucemias e C57B1/6 para o carcinoma de Lewis do pulmão. As leucemias são transplantadas seriadamente i.p. como suspensões de células de ascite, enquanto que o carcinoma de Lewis do pulmão é transplantado seriadamente como um tumor sólido s.c.. Para experiências terapêuticas, os tumores são removidos assepticamente dos ratinhos dadores e preparados como suspensões para implantação em animais de teste que, para cada tumor, são ratinhos 86D2F1 híbridos de F1 fêmeas consanguíneas (C57B1/6X xDBA/2). 0 nível do inóculo varia com o tipo de tumor: a leucemia Ρ3Θ8 é inoculada a 10 células por ratinho; a leucemia L1210

6 a 10 ou 10 células por ratinho; e o carcinoma de Lewis do pulmão a 0,25 ml duma polpa a 10% (p:v). A polpa do carcinoma de Lewis do pulmão é preparada tal como acima descrito para o melano ma B16. Após inoculação do tumor, os ratinhos são aleatoriamente distribuídos por grupos de tratamento de 6 a 8 ratinhos cada. Em cada experiência, existem três grupos de ratinhos de controlo não tratados. As drogas são dissolvidas ou suspensas em veículos aquosos apropriados e administradas i.v. ou i.p. em vários esquemas de tratamento com uma gama de níveis de dosagem. 0s animais são alojados em gaiolas tipo caixa de sapatos e monitorizados diariamente para mortalidade durante 30 (L121Q), 45 (Ρ38Θ) ou 60 (Lewis do pulmão) dias. 0 ponto final para actividade é o tem po médio de sobrevivência e o aumento da expectativa de vida em relação aos controlos não tratados. Uma droga é considerada acti va nestes modelos de tumores se prolonga a expectativa de vida em J>40%.

C. Modelos de tumores s.c.

0s tumores utilizados nestes estudos são mantidos por transplantações em série em estirpes de ratinhos consanguíneos - C57B1/6 para o carcinoma de Lewis do pulmão, melanoma B16 e sua

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SKB 14346-1 sublinha FIO, sarcoma M5076 e adenocarcinoma do cólon 38; BALB/c para o carcinoma do cólon 26, plasmocitoma AD3-PC6, carcinoma de Madison do pulmão e adenocarcinoma do cólon 51; C3H para o adeno carcinoma da mama ló/c. Com excepção do sarcoma M5076 que é mantido como uma suspensão de células de ascite i.p., todos os tumores Foram transplantados seriadamente como tumores sólidos s.c..

Para provas terapêuticas, os tumores foram removidos assepticamente dos ratinhos dadores e preparados para implantação s.c. nos animais de teste. Os animais de teste para o carcinoma de Leuiis do pulmão, melanoma B16 e sua sublinha FIO, sarcoma M5076 e adenocarcinoma do cólon 38 são ratinhos B6D2F1 híbridos de FI fêmeas consanguíneas (C57B1/6 x DBA/2). 0 plasmocitoma ADJ-PC6 e o carcinoma do cólon 26 são avaliados em ratinhos BALB/c fêmeas. 0 carcinoma de Madison do pulmão e o adenocarcinoma do cólon 51 são avaliados em ratinhos CD2F1 híbridos de FI fêmeas consanguíneas (BALB/c x DBA/2). 0 adenocarcinoma da mama 16/c é avaliado em ratinhos C3H fêmeas. 0 inóculo varia com o tumor. 0 adenocaj? cinoma do cólon 38 é implantado como fragmentos de 2 mm por/trochar. 0 sarcoma M5076 e o plasmocitoma AD3-PC6 são implantados como suspensães de células a 5 x 10^ e 2 x 10^ células por ratinho, respectivamente. 0 carcinoma do cólon 26, o adenocarcinoma do cólon 51, o carcinoma de Leuiis do pulmão, o carcinoma de Madison do pulmão e o melanoma B16 e a sua sublinha FIO são implantadas como polpas de tumores preparados como descrito acima num volume de 0,5 ml, A concentração da polpa era de 10% (p:v), excepto para o carcinoma do cólon 26 para o qual a concentração da polpa era de 5% (p:v). Após inoculação do tumor, os ratinhos são aleatoriamente distribuídos por grupos de tratamento de 7 ou 8 ratinhos. Em cada experiência, existem três grupos de ratinhos de controlo não tratados.

As drogas são dissolvidas ou suspensas em veículos aquosos apropriados e administradas por uma variedade de vias de admi nistração e de esquemas de tratamento numa série de níveis de dosagem. Os animais são alojados em gaiolas tipo caixa de sapatos e- monitorizados diariamente para mortalidade. Na altura em que os animais de controlo não tratados apresentam grandes tumores

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-46mensuráveis (geralmente >500 mu?), os tumores em todos os animais são medidos segundo diâmetros perpendiculares com uma crave_i ra e o volume do tumor é calculado pela fórmula: comprimento x x (largura) x 0,5. 0 tempo para medição dos tumores depende das diferentes velocidades de crescimento do tumor dos diferentes tumores: os tumores de crescimento mais rápido, tais como os tumores de Madison e de Lewis do pulmão, o melanoma B16 e a sua sublinha FIO, foram medidos entre os Dias 12 e 16; os tumores de crescimento mais lento foram medidos mais tarde - 17 dias para o sarcoma M5076, 16 ou 19 dias para o adenocarcinoma da mama ló/c, 19 dias para o plasmocitoma ADJ-PC6 e o carcinoma do cólon 26, 24 dias para o adenocarcinoma do cólon 51, e 31 dias para o adenocar cinoma do cólon 38. Os pontos finais para actividade são o volume médio do tumor, percentagem de inibição do crescimento do tjj mor em relação aos controlos não tratados e o número de animais sem tumores palpáveis no dia da medição. Uma droga é considerada activa nestes modelos de tumores se produz inibição do crescimento do tumor ^-70%, na ou abaixo da dose máxima tolerada.

Para tumores altamente metastáticos incluindo: tumores de Lewis e de Madison do pulmão, carcinoma do cólon 26, e melanoma B16 e a sua sublinha FIO, os ratinhos portadores de tumores são também monitorizados para o tempo de sobrevivência. Para os mod_e los de tumores menos metastáticos, os ratinhos portadores de turno res são mortos após a medição dos tumores. Nesta situação, um ajj mento da expectativa de vida .>30% é considerado como sendo prova da actividade da droga.

11. Síntese de compostos de fórmula (i)

Nos seguintes exemplos de síntese, as temperaturas estão em graus centígrados (9C). A não ser quando indicado de outro m_o do, todos os materiais de partida foram obtidos a partir de origens comerciais.

EXEMPLO 1

Preparação de (20 S) 1,2,6,7-tetra-hidrocamptotecina

Camptotecina (32,0 g, 0,092 mol) obtida de Tainjain-SKiF Ltd., Tainjain, China, foi combinada com Pt° /~preparado por pré68 443

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-redução de 8,0 g de PtO_ amorfo em 800 ml de HOAc durante 1,5 horas, sob 1,013 x 10 Pa de H„_/ e HOAc (1,6 1). A redução foi ^z realizada sob 1,013 x 10 Pa de durante 8,5 h, enquanto a mistura era vigorosamente agitada. Ao fim deste tempo, a quantidade teórica de H? tinha sido absorvida (um pouco mais que 4,1 1) e a apreensão de tinha abrandado consideravelmente. A reacção foi desgaseificada com uma corrente de Ar durante aproximadamente 10 minutos (min.), e foi, em seguida, filtrada através duma almofada de celite que foi lavada com HOAc (200 ml).

A solução resultante foi imediatamente utilizada na reacção seguinte descrita no Exemplo 2.

EXEMPLO 2

Preparação de (20 5) 10-hidroxicamptotecina

A solução vigorosamente agitada de 1,2,6,7-tetra-hidrocamptotecina, preparada tal como acima descrito no Exemplo 1, foi adicionado Pb(OAc)^ (64 g, 0,144 mol) numa porção. A reacção foi agitada sob Ar durante 30 min., e todo o PbfOAc)^ se dissolveu. A concentração originou um resíduo gomoso que foi triturado com H^0 gelada (1 1) originando um sólido castanho claro que foi separado por filtração, lavado com mais H₂0 gelada (200 ml), prensado a seco com um bloco de borracha e seco ao ar durante toda a noite. 0 produto resultante parcialmente húmido continha 44,3% de 10-hidroxicamptotecina, 26,9% de 10-acetoxicamptotecina e 23,1% de camptotecina, baseado na análise por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) (Whatman Partisil 5 ODS3 Rac II 60% ch₃oh/h₂o).

A mistura em bruto foi combinada com 1,7 1 de HOAc aquoso a 50% e colocada sob refluxo toda a noite. A reacção foi arrefecida e concentrada até, aproximadamente, 50-100 ml. H₂0 gelada (1 1) foi adicionada e o precipitado foi separado por filtração, lavado com mais H₂0 gelada (200 ml), prensado a seco com um bloco de borracha, e seco sob vácuo elevado durante 2 dias, originando 21,16 g de material que continha 70,9% de 10-hidroxicamptotecina, l.,2% de 10-acetoxicamptotecina, e 21,3% de camptotecina, baseado na análise por HPLC.

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-48EXEMPLO 3

Preparação do sal acetato de (20 S) 9-dimetilaniinometil-lO-hidrDcamptotec ina

10-Hidroxicamptotecina (20 g, analisado em 62% de 10-hidroxicamptotecina e, portanto, continha 12,4 g, 34,1 mmol de 10-hidroxicamptotecina), preparada como descrito no Exemplo 2, foi combinada com HOAc (620 ml), CH^O aquoso a 37% (12,4 ml, aproxima damente 149 mmol) e dimetilamina aquosa a 40% (12,4 ml, aproximadamente, 109 mmol), e agitada durante, aproximadamente, 18 h, e a cromatografia de camada fina (tlc) indicou algum material de partida restante (tlc em 9 : 1 CH₂C1₂/ CH^OH em gel de sílica). Este sistema foi adequado para acompanhar o desaparecimento de 10-hidroxicamptotecina mas não para monitorizar a formação do produto. Foi adicionado mais CH₂0 aquoso a 37% (6 ml, aproximadamente 72 mmol), e dimetilamina aquosa a 40% (6 ml, aproximadamente 53 mmol), e a agitação continuou durante mais 24 h. A reacção foi concentra da até à secura, triturada com HOAc aquoso a 0,5% (1 1), filtrada e o sólido foi lavado com mais HOAc aquoso a 0,5% (500 ml). 0 sjó lido seco pesava 6,3 g e era 94% de camptotecina recuperável por HPLC (Whatman Partisil 10 ODS 3 50% CH^OH/H^, tempo de retenção 9 min.). Os filtrados aquosos combinados foram extraídos com EtOAc (3 x 600 ml) e éter de petróleo (600 ml) e em seguida liofi lizados.

A cromatografia do resíduo em bruto foi obtida por injecção do material num solvente A (solvente A = 99% de H₂0, 1% de HOAc) (600 ml) e eluição a 350 ml/min. através duma coluna de aço 50 mm x 600 mm carregada com 680 g de Whatman Partisil 40 ODS 3, com um gradiente linear a 34 min. de solvente A a 100% a solvente B a 40% (solvente B = 99% de CH-^OH, 1% de HOAc). A cromatografia foi monitorizada a 410 nm e recolheram-se fracções de 1 1 e as que eram ^-99% puras por HPLC analítica (Whatman Partisil 10 ODS 3 50% CH^0H/H₂0, tempo de retenção 9 min.) foram reunidas, concentradas e redissolvidas num mínimo de HOAc aquoso a 0,5% e liofilizadas originando 10,58 g (62%) do produto indicado.

IV (KBr) 3400, 2960, 1740, 1650, 1590 cm¹. ^ΣΗ RMN (CDClj/CD-jOO) 1,04 (t, 3, J=7Hz , C18 ) , 1,96 (q , 2,3= 7Hz , C19) , 2,01(s,

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SKB 14346-1 **’**5J^'

-493,CH₃C0₂) 2,50(s,6,(CH₃)₂NH), 4,20(s ,2 ,ΑγΟΗ^Ν) , 5,28 (d,l,3=19Hz, C17), 5,29(s , 2 , C5 ) , 5,50(d,1,J = 19Hz,C17), 7,42(d,3 = 9Hz,Cll) , 7,67 (s,l,C14), 8,05(d,3 = 9Hz,C12), 8,51(s,C7). Calculado para ^C23^H23^N3°5 ^{1 H}°^{Ac 1 H}2° ^^{pm = 515}’⁵^ ^{: C}’⁵⁸'^2ZU H 5,67; N 8,15. Encontrado: C,5B,55; H 5,22; N 8,54. Análise de Pb < 14,5 ppm.

Material do produto indicado adicional que era >90% puro por HPLC (ver acima) foi concentrado até à secura e posteriormente novamente submetido a cromatogra fia com material semelhante isolado a partir de outras passagens.

EXEMPLO 4

Preparação do sal acetato de (20 S) 9-morfolinometil-10-hidroxicamptotecina

10-Hidroxicamptotecina (100 mg, 0,27 mmol) preparada como descrito no Exemplo 2, CH₂0 aquoso a 37% (0,5 ml), morfolina (0,1 ml) e HOAc/EtOH 2:1 (10 ml) foram combinados e agitados durante toda a noite. A 10-hidroxicamptotecina tinha reagido (tlc, gel de sílica, CH₂C1₂/CH₃OH 9:1) e a reacção foi concentrada até a sja cura, dissolvida em cerca de 5 ml de H₂0 contendo várias gotas de HOAc, e o material insolúvel foi separado por filtração. 0 filtrado foi liofilizado e o liofilizado foi submetido a cromatografia (cromatografia líquida de pressão média (MPLC) em sílica, 15 mm x 250 mm, eluindo com CH₂C1₂ contendo 0-2% CH^OH) originando um resíduo que foi dissolvido em HOAc aquoso diluído e liofilizado originando 53 mg (38%) do composto do título.

IV (KBr) 3400, 3100, 2960, 2920, 2Θ40, 1740, 1650, 1590 cm¹ H RMN (CDCl^/CD^OD)

1,94 (q,2,J=7Hz,C19), 2,73(m,4,morfilino-CH₂N), 3,83 (m,4,morfilino-CH₂0) 4,19 (s,2,A_rCH₂N), 5,26(s,2,C5), 5,25(d,1,3 = 16Hz, C17), 576(dl,3 = 16Hz,017), 7,27(s,1,C14), 7,40(d,1,3 = ΘΗζ , Cll) , 8,07(dl, 3 = BHz,C12), 8,36 (s , 1, C7). Calculado para C^H^N^O^ CH₃C0₂H (pm=525,6): C 61,71; H 5,95; N 8,00. Encontrado: C 61,30; H 5,44; N 8,35.

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EXEMPLO 5

Preparação do sal acetato de (20 S) 9-N-metilpiperazinilmetil-l0-hidroxicamptotecina

10-Hidroxicamptotecina (100 mg, 0,27 mmol), preparada tal como descrito no Exemplo 2, HOAc/EtOH 2:1 (10 ml), CH^O aquoso a 37% (0,5 ml) e N-metilpiperazina (0,1 ml) foram combinados e agitados durante 20 h. A 10-hidroxicamptotecina reagiu (tlc CHjC^/ /CHjOH 9:1) e a mistura reaccional foi concentrada, dissolvida em F^O (50 ml) e lavada com EtOAc (5 x 20 ml) e éter de petróleo (20 ml) e a fase aquosa foi liofilizada. 0 resíduo foi redissolvido em HOAc aq. diluído e submetido a cromatografia por MPLC (Whatman Partisil 40 ODS 3, coluna de 9 mm x 250), eluíndo com 0-20% de CH^OH em H^O contendo HOAc a 0,02%. 0 material desejado foi reunido e concentrado, e o resíduo foi liofilizado originando 67 mg (46%) do composto do título.

IV (KBr) 3400, 2960, 2910, 1740, 1650, 1590 cm^-1. ¹H RMN (C0Cl₃/CD₃0D) 81,03 (t,3,3=7Hz,C18), 1,89(q,2,3=7Hz), 2,02(s,>3, 0Η₃00₂Η), 2,37(s,3,NCH₃), 2,65(m,8, piperazino-CH₂), 4,21(s,2,ArCH?), 5,26(s , 2,C5), 5,30(d,l,J = 16Hz,C17), 5,71(d,1,0=16Hz,Cl 7), 7,45(d, 1,3=7Hz,Cll), Θ,05(d,1,3=7Hz,C12), 8,47(s,1,C7).

Calculado para ^C ₂6^H28^H4°5 ^{1 X}/^{2 H0Ac H}2° (Pi⁼⁵²⁸>l); ^c 61,41;

H 6,01, N 10,61. Encontrado: C 61,62; H 5,74; N 10,93.

EXEMPLO 6

Preparação do sal acetato de (20 S) 9-(4¹-piperidinopiperidinil) metil-10-hidroxicamptotecina

10-Hidroxicamptotecina (100 mg, 0,27 mmol), preparada como descrito no Exemplo 2, 4-piperidinopiperidina (100 mg, 0,60 mmol), CH2O aquoso a 37% (0,5 ml) e HOAc/EtOH 2:1 (10 ml) foram agitados durante 20 h. A 10-hidroxicamptotecina reagiu (tlc, gel de sílica, CH2CI2/CH3OH 9:1), e a mistura reaccional foi concentrada, dissolvida em ácido acético aquoso a 1%, filtrada e liofilizada.A MPLC (Whatman Partisil 40 0DS3, coluna de 9 mm x 250 mm), eluindo com H2O (100 ml) e depois com 0-B0% de CH^OH em HOAc aquoso a 0,02% □•riginou 44 mg (30%) do composto do título após liofilização. IV (KBr) 3400, 2940, 1745, 1660, 1590 cm^-1. ¹H RMN (CDCl^/CD^DD)

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SKB 14346-1

(t,3,3=7Hz,C18), 1,3-3,3 (m,19, piperidina, C19), 4,11 (s,2, CH₂N), 5,21 (s,2,C5), 5,25 (d,l,3=16Hz, C17), 5,70 (d,l,J=16Hz, C17), 7,85 (d,1,0 = 7Hz,011), 7,59 (s,1,014), 8,00 (d,1,3=7Hz,C12), 8,35 (s,l,C7). Calculado para N^O^ 1 1/2 H₂0 (pm=6 31,7) : C ,

58,94; H 6,22; N 8,81. Encontrado C 59,02; H 6,44; N 8,53.

EXEMPLO 7

Preparação do sal acetato de (20 S) 9-(2^l-hidroxietilamino)metil-10-hidroxicamptotecina

10-Hidroxicamptotecina (200 mg, 0,55 mol), preparada como descrito no Exemplo 2, para-formaldeido (16 mg, 0,55 mmol), etanolamina (61 mg, 1,1 mmol), e HOAc (6 ml) foram agitados durante 48 h, após o que a maior parte da 10-hidroxicamptotecina tinha rea gido. A mistura reaccional foi concentrada, redissolvida em HOAc diluído (200 ml) e lavada com EtOAc (4 x 30 ml) e éter de petróleo (30 ml) e a solução aquosa resultante foi liofilizada. 0 li_o filizado em bruto foi dissolvido em H₂0 (50 ml). A MPLC (Whatman Partisil 40 0DS3, coluna de 15 mm x 250 mm) eluindo com H^O (100 ml), seguida por 0-10% de CH^OH em HOAc a 0,02% em U^O, originou 88 mg (33%) do composto do título após liofilização. IV (KBr) 3400, 2980, 2940, 1750, 1570 cm¹. ¹H RMN (C0C1^/CD^OD) £1,03 (t,3,3=7Hz,C18), l,B9(q,2,3=7Hz,C19), 2,00(s,3,HOAc), 3,03(m,2, CH₂NH), 3,75 (m,2,CH₂0H), 4,49(s ,A rCH^H) , 5,24 (s , 2 , C5 ) , 5,30(d, 1,J=16,C17), 5,70(d,l,J = 16Hz,C17), 7,41(d,1,3 = 8Hz,Cll), 7,61(s,l, C14), 8,00 (d,1,3=BHz,C12), 8,48(s , 1, C7). Calculado para ^C23^H23^N3°6 ^{H0Ac 1 7//θ H}2° ÍP^m=531»³)^{: C} 56,52 ; H 5,83; N 7,91. Encontrado: C 56,07; H 5,40; N,8,27.

EXEMPLO 8

Preparação do sal metanossulfonato de (20 S) 9-trimetilamoniometil-10-hidroxicamptotecina

Sal acetato de 9-dimetilaminometil-10-hidroxicamptotecina (65 mg, 0,14 mmol), preparado como descrito no Exemplo 3, foi dis solvido em CH₂C1₂ (cerca de 70 ml) e filtrado. 0 filtrado foi combinado com metanossul fonato de metilo (1 ml), arrefecido e par; cialmente concentrado sob uma corrente de árgon (Ar). Após 4 h o solvente foi concentrado até 1/2 volume e arrefecido. 0 preci

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SKB 14346-1

..Λα

-52pitado foi filtrado, dissolvido em H^O (10 ml), lavado com EtOAç (3 x 10 ml) e, em seguida, com éter de petróleo (10 ml), e liofilizado, originando 50 mg (60%) do composto do título. IV (KBr) 3400, 2950, 2900, 1760, 1660, 1600 cm^-1. ¹H RMN (CDC1^/CD^OD) Sl,03 (d,3,3=7Hz,C18) , 2,01 (q , 2,3=7H_Z , C19) , 2,78 (s , >3 , CH^S 0₃) , 2,94(s,9,N(CH₃)₃), 4,72(s,2,ArCH₂N), 5,20(s,2,C5 ) , 5,22(d,l,3= = 16Hz,C17), 5,67(d,1,3=16Hz,C17), 7,62(d,3 = 7Hz,Cll) , 7,71(s,C14), 8,16 ( d, 1,3=7Hz , C12 ) , 8,89(s , 1, C7). Calculado para C^H^I^O CH₃S0₃H.2H₂0 (pm=615,7): C 49,74; H 5,72; N 6,B2. Encontrado: C,49,36 ; H 5,15 ; N 7,53.

EXEMPLO 9

Preparação de (20 S) 9-formil-10-hidroxicamptoteci na

10-Hidroxicamptotecina (100 mg, 0,27 mmol), preparada como descrito no Exemplo 2, hexametilenotetraamina (0,80 g, 5,5 mmol) e ácido trifluoroacético (TFA) (15 ml) foram colocados em refluxo sob árgon durante 20 h. A mistura reaccional foi concentrada, combinada com F^O (15 ml) e agitada durante 1 h. Adicionou-se H^O (75 ml) e o pH foi ajustado até 8,4 por adição de NaHC0₃· A fase aq. foi lavada com EtOAc (3 x 75 ml), acidificada até pH 1,5 com HC1 3 N e depois extraída com EtOAc (5 x 75 ml). 0s extractos orgânicos combinados foram lavados com HC1 IN (5 x 75 ml), H₂0 (75 ml), e NaCl aquoso saturado (25 ml), e concentrados. 0 resíduo foi então purificado por cromatografia flash (sílica 1 cm x 15 cm, com o material em bruto pré-absorvido num tampão 1 cm x 1 cm de Na^O^). 0 produto foi eluído com 1% de CH₃0H em CH₂C1_2> originando 50 mg (47%) do composto do título. Uma amostra analiticamente pura foi obtida por precipitação fraccionada em, aproximadamente, 25% de CH₃0H em por arrefecimento ler) to e concentração sob corrente de azoto. IV (KBr) 3400, 3100, 2950, 1755, 1660, 1600 cm'¹, 1H RMN (CC13D/CD30D) £ 1,04 (t,3, 3=7Hz,C18), 1,96 (d,2,3 = 7Hz,Cl 9), 5,32 (d,l,3 = 14Hz, C17), 5,33 (s,2,C5), 5,68 (d,l,3=14Hz, C17), 7,50 (d, 1,3=9Hz,Cll) , 7,67 (s,l,C14), 8,33 (d,l,3=9Hz,C12), 9,34 (s,l,C7), 10,85 (s,l,CH0), Calculado para ^C2i^Hi6^N2°6¹ H20 (pm = 410,38): C 61,46; H 4,42;

IV· 6,83. Encontrado: C 61,09; H 4,17; N 6,52.

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SKB 14346-1 ·'/ l_r

-53EXEMPLO 10

Preparação do sal cloridrato de (20 S) 9-ciclopropilaminometil-lO-hidroxicamptotecina

Uma mistura de 10-hidroxicamptotecina (254 mg, 0,7 mmol), preparada como descrito no Exemplo 2, formaldeído aquoso a 37% (1,0 ml), ciclopropilamina (400 mg, 0,7 mmol) em ácido acético glacial (16 ml) e etanol (8 ml) foi agitada durante toda a noite à temperatura ambiente e concentrada in vacuo até à secura. 0 resíduo foi triturado com água, filtrado e seco, originando 260 mg (rendimento de 75%) do composto indicado como um sal acetato que foi convertido no sal cloridrato indicado por trituração com HC1 0,1 N. Anal. (H₂ -jN-jO . HC1.3H₂ 0) . Calculado: C 55,01; H 5,57; N 8,02. Encontrado: C 54,94; Η 5,1B, N 8,18. ^XH RMN (D₂0) 8 0,96 (m,7), 2,1 (m,2), 2,8 (m, 1), 4,6 (s, 2), 4,8 (s, 2), 5,2 (s, 2) ,

7,2 (s, 1), 7,5 (q, 2), 8,6 (s, 1).

EXEMPLO 11

Preparação de (20 S) 9-etoximetil-10-hidroxicamptotecina

Uma mistura de 10-hidroxicamptotecina (364 mg, 1,0 mmol), preparada como descrito no Exemplo 2, cloridrato de dimetilamina (90 mg, 1,1 mmol) e formaldeído aquoso a 37% (1,5 ml) foi colocada sob refluxo em etanol a 95% (25 ml) durante 5 1/2 h. A mistura reaccional foi concentrada até um pequeno volume, e o produto precipitado foi recolhido e seco. A purificação por cromatografia em gel de sílica eluindo com 3% de MeOH em CH₂C1₂ originou 85 mg (rendimento de 20%) do composto indicado. Anal. (C-..H N 0 ). Calculado: C 62,08; H 5,27; N 6,29. Encontrado: C 61,80; H 5,22; N 6,12. Espectro de massa FAB: m/e 423 (MH⁺). RMN (DMSO) 8

0,85 (t, 3), 1,1 (t, 3), 1,9 (m, 2), 3,5 (s, 2), 4,8 (s, 2), 5,2 (s, 2), 5,4 (s, 2), 7,2 (s, 1), 7,7 (m, 2), 8,6 (s, 1).

EXEMPLO 12

Preparação de (20 S) 9-(N-metilanilinometil)-10-hidroxicamptotecina

Uma mistura de 10-hidroxicamptotecina (254 mg, 0,7 mmol), preparada como descrito no Exemplo 2, formaldeído aquoso a 37%

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SKB 14346-1 rr-.—W·-

-54(1,0 ml), N-metilanílina (0,75 ml, 0,7 mmol) em ácida acético gl.a ciai (16 ml) e etanol (8 ml) foi agitada à temperatura ambiente durante 40 h. Após concentração até um óleo, obteve-se a purificação parcial por cromatografia em gel de sílica eluindo com 1,2% e 3% de MeOH em CH^Cl^. As fracçães do produto ainda continham N-metil anilina. Obteve-se uma purificação adicional usando uma coluna para MPLC de gel de sílica, e o produto foi eluído com 2% de MeOH em CH2CI2. As fracçães do produto foram combinadas e con centradas in vacuo originando 77 mg (24%) do composto indicado sob a forma de um sólido amarelo. Anal. (Ο^θΗ^^Ν^Ο^.1,2 H2O). Calculado: C 66,5Θ ; H 5,47; N 8,32. Encontrado: C 66,97; H 5,69; N 7,91. Espectro de massa DCI: m/e 484 (MH⁺). RMN (CDCl^) 8

1,0 (t, 3), 1,9 (m, 2), 2,8 (s, 3), 5,0 (s, 2), 5,2 (s, 2), 5,5 (q, 2), 6,9 (m, 5), 7,5 (s, 1), 7,9 (q, 2), 8,4 (s, 1).

EXEMPLO 13

Preparação do sal cloridrato de (20 S) 9-ciclo-hexilaminometil-10-hidroxicamptotecina

Uma mistura de 10-hidroxicamptotecina (364 mg, 1,0 mmol), preparada como descrito no Exemplo 2, formaldeído aquoso a 37% (1,5 ml), ciclo-hexilamina (1,3 ml, 10 mmol) em ácido acético gla. ciai (25 ml) e etanol (12 ml) foi agitada durante toda a noite à temperatura ambiente e concentrada in vacuo até à secura. 0 res_í duo foi purificado numa coluna de fase invertida (MPLC) eluindo com MeOH aq. a 15% contendo ácido acético glacial a 0,02%. 0 composto indicado, como um sal acetato, foi obtido após concentração até um pequeno volume e liofilização (250 mg, 47%). 0 sal acetato foi convertido no sal cloridrato indicado por adição de HC1 0,1 N, e o sal foi recolhido por filtração. Anal. (^C27^H29^N3°5* .HC1.1 1/8 H20). Calculado: C 60,93; H 6,11; N, 7,89. Encontrado: C 60,83; H 5,98; N 7,75. ¹H RMN (DMSO) $0,9 (t, 3), 1,0-2,0 (m, 10), 3,1 (s, 1), 4,5 (s, 2), 5,2 (s, 2), 5,4 (s, 2), 7,2 (s, 1), 7,9 (q, 2), 8,9 (s, 1).

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SKB 14346-1 . ./ «λ* xJSÍ* ./- .jr·'*.^ y · ?·'·»* s' d

-t ,

-55EXEMPLO 14

Preparação do sal cloridrato de (20 3) 9-N,N-dimetilaminoetiloxlmetil-10-hidroxicamptotecina

Uma mistura de base livre de 9-dimetilaminometil-10-hidrq xicamptotecina (100 mg, 0,2 mmol), preparada como descrito no Exemplo 21, em 2-dimetilaminoetanol (4 ml) contendo 3 gotas de HC1 3N foi aquecida sob árgon a 809C durante 24 h. A mistura reaccional semi-sólida foi tratada com h^O (5 ml) e isopropanol (10 ml), agitada e filtrada, originando 60 mg (59%) do composto do título. Anal. (C^^H^^N^O^.HCl.OjS H^O). Calculado: C 5Θ,77 ;

H 5,72; N 8,25. Encontrado: C 58,94, H 4,92; N 7,90. ^XH RMN (DMSO) 8 0,9 (t,3), 1,85 (m,2), 2,3 (s,6), 3,3 (s,2), 4,1 (s,2),

5.2 (s,2), 5,4 (s,2), 7,3 (s,l), 7,4 (d,l), 8,0 (d,l), B,7 (s,l).

EXEMPLO 15

Preparação do sal cloridrato de (20 S) 9-N,N-dimetilaminoetiltiometil-10-hidroxicamptotecina

Uma mistura do sal cloridrato de 9-dimetilaminometil-l0-hidroxicamptotecina (100 mg, 0,2 mmol), preparada substancialmejn te como descrito no Exemplo 1Θ, e 2-dimetilaminoetanotiol (13 ml) foi aquecida a 853C sob árgon durante 5 h. 0 sólido insolúvel (tiol em excesso) foi removido por filtração e o filtrado foi cojn centrado in vacuo até um resíduo oleoso que foi purificado utilizando MPLC de fase invertida. 0 produto foi eluído usando 5% e 10% de MeOH em H^O originando 45 mg (41%) do composto do título sob a forma de um sólido amarelo. Anal. (C H _ON D S.HC1.3H.O). Calculado: C 49,34; H 5,79; N 6,90. Encontrado: C 48,98; H 5,82 ; N 6,54. ^XH RMN (θ_?θ) 81,0 (t,3), 1,9 (m,2), 2,8 (s,6), 4,4 (s,2),

5.3 (s,2), 7,1 (d,l), 7,2 (s,l), 7,6 (d,l), 8,2 (s,l).

EXEMPLO 16

Preparação do sal dicloridrato de (20 S) 9-N,N-dimetilaminoetilaminometil-10-hidroxicamptotecina

Uma mistura de 10-hidroxicamptotecina (364 mg, 1,0 mmol), preparada como descrito no Exemplo 2, N,N-dimetiletilenodiamina (100 mg, 1,1 mmol), formaldeído aquoso a 37% (1,5 ml) em ácido

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SKB 14346-1 ' Ml , s .·*!*

L- ⁵-^-’

-56acético glacial (25 ml) e etanol (100 ml), foi agitada à temperatura ambiente durante 64 h. Os solventes foram removidos in vaçuo e o resíduo sólido foi tratado com água (10 ml) e isopropanol (10 ml) contendo HC1 3N (3 ml). 0 sólido precipitado final foi recolhido, lavado com isopropanol e seco, originando 213 mg (rendimeji to de 40%) do composto do título. Anal. (0^.2HC1). Calculado: C 55,87; H 5,63; N 10,42. Encontrado: C 55,91; H 5,72;

N 9,86. ¹H RMN (CD^OD) 61,0 (t,3), 1,9 (m,2), 2,9 (s,6), 4,5 (s,2), 5,1 (m,4), 5,4 (q,2), 7,3 (d,l), 7,5 (s,l), 7,8 (d,l), 8,4 (s ,1) .

EXEMPLO 17

Preparação do sal acetato de (20 R,S) 9-dimetilaminometil-10-hidroxicamptotecina composto do título é preparado como descrito no Exemplo com excepção do material de partida ser 10-hidroxicamptotecina racémica preparada de acordo com o método de Wani e colab. , 0. Med. Chem., 23, 554 (1980).

EXEMPLO 18

Preparação do sal monocloridrato de (20 S) 9-dimetilaminoetil-10-10-hidroxicamptotecina sal acetato de 9-dimetilaminometil-10-hidroxicamptoteci na, preparado como descrito no Exemplo 3, analisado com 2,5 equivalentes de ácido acético e 0,75 equivalentes de água (8,5 g, 14,5 mmol, baseado num peso molecular de 585), foi dissolvido em ácido clorídrico 0,1 hl (170 ml, 17 mmol), liofilizado e bombeado sob vá cuo elevado durante três dias, originando 8,3 g do composto do tj. tulo. ^ΧΗ RMN (CDCl3/CD30D) ^1,05 (t, 3, 3 = 7,5), 1,98 (q, 2, 3 = 7,5), 2,95 (s, 6), 4,77 (s, 2), 5,33 (s, 2), 5,36 (d, 1, 3 = 16), 5,62 (d, 1, 3 = 16), 7,59 (d, 1, 3 = 9), 7,66 (s, 1), 8,20 (d, 1, 3 = 9), 8,86 (s, 1). Anal. ( ^c2 3^H2 3^N 3°5‘^1HC1 * ³ Η_?0). Calculado: C 53,96; H 5,91; N 8,21; Cl 6,92. Encontrado: C 53,68; H 5,61; N 8,16; Cl 6,84.

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SKB 14346-1

-57EXEMPLO 19

Preparação do sal dicloridrato de (20 S) 9-dimetilaminoetil-10-hidroxicamptotecina sal acetato de 9-dimetilaminometil-l O-hidroxicamptotecj. na (0,389 g, 1,07 mmol por análise de HPLC), preparado como descrito no Exemplo 3, foi dissolvido em HC1 0,4 _N (6 ml, 2,4 mmol), liofilizado e bombeado sob vácuo elevado durante 40 h, originando 0,269 g do composto do título. RMN (CDC1^/CD^OD) 6 1,05 (t,

3, 3 = 7,5), 1,92 (q, 2 3 = 7,5), 3,01 (s, 6), 4,B5 (s, 2), 5,31 (d, 1, 3 = 16), 5,36 (s, 2), 5,65 (d, 1, 3 = 16), 7,64 (d, 1, = 9), 7,73 (s, 1), 8,23 (d, 1, 3 = 9), 9,07 (s, 1). Anal. ^^C23^H23^N3⁰5’^2HC1·^{* 3 H}2°)· Calculado: C 50,37; H 5,70; N 7,66; Cl 12,93. Encontrado: C 50,76; H 5,64; N 7,57; Cl 12,61.

EXEMPLO 20

Preparação do sal de sódio de (20 S) 9-dimetilaminoetil-10-hidroxicamptotecina sal acetato de 9-dimetilaminometil-10-hidroxicamptoteci na (100 mg, 0,2 mmol), preparado como descrito no Exemplo 3, foi tratado com hidróxido de sódio 0,1 JN (4,5 ml, 0,45 mmol) e a solu ção foi passada através de uma coluna de resina HP-20 (2 x 22 cm). A resina foi lavada com água (250 ml) e o produto foi eluído com uma mistura de 1:1 de água e metanol. As fracções contendo o prp duto foram combinadas, concentradas até um pequeno volume e liofi lizadas, originando 98 mg (98%) do composto do título. IV (nujol) 1600 cm^_i (carboxilato). RMN (0₂0) 6 0,65 (m, 3), 1,8 (m, 2),

2,8 (s, 6), 3,0 (m, 2), 4,21 (s, 2 )J 4,5 (s, 2), 7,1 (q, 2), 7,2 (s, 1), 7,8 (s, 1). Anal. (C_? ^H^N^Na. 1,5 H₂0). Calculado: C 56,55; H 5,57; N 8,60. Encontrado: C 56,21; H 5,65; N 8,44.

EXEMPLO 21

Preparação da base livre de (20 S) 9-dimetilaminometil-10-hidroxicamptoteci na

Uma mistura de 10-hidroxicamptotecina (728 mg, 2,0 mmol), p-reparada como descrito no Exemplo 2, em ácido acético glacial (50 ml), etanol (20 ml), formaldeído aquoso a 37% (3 ml) e dimetil

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-5«

-58amina aquosa a 40% (3 ml) foi agitada à temperatura ambiente durante 20 h. Os solventes foram removidos sob pressão reduzida; o resíduo foi aquecido a 50QC sob vácuo elevado durante 2 h e triturado com isopropanol (10 ml) para precipitar o composto do título (561 mg, 64%) sob a forma dum ácido amarelo. Espectro de massa FAB: m/e 422 (MH⁺). RMN (CDC1 /CD 0D) 61,0 (t, 3),

1,9 (m, 2), 2,5 (s, 6), 4,3 (s, 2), 5,2 (s, 2), 5,4 (q, 2), 7,6 (s, 1), 7,7 (q, 2), 8,5 (s, 1).

EXEMPLO 22

Preparação do tri fluorometilsul fonato (¹¹ tri flato ) de (20 S) 10-hidroxicamptotecina

A uma mistura de 10-hidroxicampto teci na , preparada como descrito no Exemplo 2 (1,44 g, 4,0 mmol) em DMF (40 ml), foi adicionada trietilamina (1,2 g, 12 mmol) seguida pela adição de N-fe nil-trifluorometanosulfonimida (2,0 g, 6 mmol). A reacção foi aquecida a 502C durante 3 horas. 0 solvente foi removido in vacuo e o resíduo foi triturado com água, filtrado e seco. Obteve-se um rendimento teórico do produto em bruto essencialmente como uma única mancha na cromatografia de camada fina (TLC) mostrando uma pequena impureza de origem. Uma pequena amostra foi purificada por cromatografia flash em coluna de gel de sílica por eluição do produto com 2% MeOH em CH^Cl^.

Anal. (C₂₁H₁₅N₂0₇SF₃). Calculado: C 50,81; H 3,05; N 564. Encontrado: C 51,38; H 3,42; N 4,99.

^ΧΗ RMN (CDCIj) 8 1,0 (t,3), 1,9 (m,2), 5,3 (s,2), 5,4 (q,2), 7,7 (s,l), 7,6-7,9 (m,2), 8,2 (d,2), 8,5 (s,l) Espectro de massa FAB m/e 497 (MH⁺), 495 (Μ-H)

EXEMPLO 23

Preparação de (20 5) 9-dimetilaminometilcamptotecina trifluorometanosulfonato de sal acetato de (20 S) 9-dimetilaminometil-10-hidroxicamptotecina foi produzido in situ como se segue. Uma mistura do sal acetato de 9-dimetilaminometil-10-hidroxicamptotecina, preparado como descrito no Exemplo 3, (482 mg, 1 mmol) em N,N-dimetilformamida (DMF) sob árgon (40 ml) foi tratada com 2,6-lutidina (268 mg, 2,5 mmol) e N-feniltrifluorome—

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SKB 14346-1 </. --=«£» • ' J-59tanos sul fo nimida (0,54 g, 1,5 mmol). A mistura reaccional foi agitada durante toda a noite à temperatura ambiente. Em seguida, ao triflato formado acima foi adicionada trietilamina (0,4 ml, 3,0 mmol), acetato de paládio (8 mg, 0,04 mmol), trifenilfosfina (20 mg, 0,08 mmol) e ácido fórmico concentrado (0,08 ml, 2 mmol). A reacção foi aquecida a 609C durante 8 horas. 0 solvente foi re movido in vacuo e o resíduo foi triturado com uma pequena quantidade de H^O e filtrado. 0 sólido insolúvel em bruto, seco, pesava 550 mg. Foi purificado por cromatografia flash em coluna de gel de sílica, eluindo algum triflato de partida com trifenilfosfato, originando 25 mg (7%) de 9-metilcamptotecina, 88 mg (20%) do composto do título como base livre (4% MeOH em , e algum trifluorometilsulfonato de 10-hidroxicamptotecina com 10% de MeOH em CH₂C1₂. Algum do composto do título foi convertido no sal ace tato por tratamento com ácido acético diluído.

Anal. ^25^2 7^3^6 . 2,5H₂ 0). Calculado: C 58,81; H 6,12; N 8,23.

Encontrado: C 58,60; H 5,88; N 7,88; ¹HRMN (CDCl-j) 6 0,9 (t,3),

1,8 (m,2), 2,2 (s,6), 3,7 (s,2), 5,2 (s,2), 5,4 (q,2), 7,3 (d,l),

7,5 (d, 1) 7,6 (2,1), 8,0 (d,l), 3,3 (S,l)

Espectro de massa m/e 406 (MH⁺)

EXEMPLO 24

Preparação de 10-cianocamptotecina

Uma solução de cianeto de tributilestanho (444 mg, 1,4 mmol) e tetraquistrifenilfos fina paládio (276 mg, 0,6 mmol) em 1 ,2-dicloroetano (20 ml), foi aquecida até refluxo sob argon durari te 2 horas, formando um complexo de paládio-estanho-cianeto. Em seguida, o trifluorometilsulfonato de 10-hidroxicamptotecina, pre parado como descrito no Exemplo 22 (266 mg, 0,6 mmol) foi adicionado e o refluxo continuou durante mais 3,5 horas. A reacção foi concentrada até 1/3 do seu volume original e triturada com um volume igual de éter dietílico. 0 sólido amarelo precipitado foi colectado e seco. 0 composto do título foi obtido com um rendimento bruto de 82%, 183 mg. Após purificação por cromatografia flash, 0 composto do título foi eluído com 2% MeOH em CH₂C1₂ e fo ram obtidos 115 mg (67%).

44 3

SKB 14346-1

-60Anal. (^C21^H15^N3°4 ’ ^J/^2H2° ^{Calculado: c} 65,96; H 4,22; N 10,99. Encontrado: C 65,89; H 4,06; N 10,66. ¹HRMN (CDC1 -MeOD^) 81,0 (t, 3) , 1,9 (m,2), 5,4 (s , 2) , 5,5 (q , 2) , 7,7 (s , 1) , 7,7-8,4 ( m, 3 ) ,

8,6 (s,l).

Espectro de massa m/e 374(MH⁺).

EXEMPLO 25

Preparação de (20 S) 10-formilcampto teci na

Um frasco seco à chama foi carregado com o trifluorometil_ sulfonato de 10-hidroxicamptotecina, preparado como descrito no Exemplo 22 (100 mg, 0,22 mmol), tetra-hidrofurano (THF) destilado de fresco (10 ml) e tetraquis-trifenilfosfina paládio (10 mg, 9 mmol). Fez-se borbulhar monóxido de carbono (C0) na reacção durante 3 min., e então a mistura reaccional foi rolhada com um balão de 00 e imersa num banho de óleo a 50SC. Enquanto era agitada, e utilizando uma bomba de seringa, uma solução de Bu^SnH (0,73 ml) em THF seco (3 ml) foi adicionada gota a gota durante um período de 4 horas. Após este tempo, o solvente foi removido in vacuo e o resíduo foi purificado por cromatografia flash (1-2% CH^OH, CH₂C1₂), seguida por purificação final utilizando um Chromatotron (Harrison Research, Paio Alto, Califórnia). 0 composto do título foi eluído com 2% MeOH em CH₂C1_2> 20 mg (24%).

Anal. (C₂₁, Η_χ6, ^N ₂°5'l-l/3 ^Η2°^* ^Calculado: C 61,84; H 4,69; N 6,86. Encontrado: C 61,83; H 4,53; N 6,37. RMN (CDCl^) 8

0,9 (t, 3), 1,9 (m, 2), 5,3 (s cindido, 2), 5,4 (q, 2), 7,7 (d, 1), 7,8-8,3 (m, 3), 8,5 (s, 1), 9,9 (s, 1). Espectro de massa m/e 377 (MH⁺).

EXEMPLO 26

Preparação do sal acetato de (20 S) 10-aminometilcamptotecina

Uma solução de 10-cianocamptotecina, preparada como descrito no Exemplo 24 (160 mg, 0,4 mmol) em ácido acético glacial (45 ml), foi tratada com níquel Raney activado e hidrogenada a

6,9 x 10⁴ Pa (1 785,8 g/cm) durante 7 horas. 0 catalisador foi removido por filtração através de supercel e o filtrado foi concentrado in vacuo. 0 resíduo sólido foi purificado por cromatografia de pressão média em coluna de fase inversa por eluição do

443

SKB 14346-1 . ,τ,-ι £ O

-61produto com 10% MeOH em água. Após secagem por congelação, foram obtidos 25 mg (15%) do composto do título higroscópico.

Anal.: ^23^23^3^6’6 Calculado: C 50,63; H 6,46; N 7,73.

Encontrado: C 50,11; H 6,57; N 7,64. ^ΣΗ RMN (0₂0) 61,0 (t, 3),

1,9 (m, 2), 4,3 (s, 2), 5,2 (s, 2), 5,4 (s, 2), 7,5 (s, 1), 7,7-8,1 (m, 3), 8,6 (s, 1).

EXEMPLO 27

Preparação do sal acetato de (20 S) 10-aminometilcamptotecina

Uma solução de 10-cianocamptotecina, preparada como descrito no Exemplo 24 (160 mg, 0,42 mmol) em ácido acático glacial (r) (45 ml) foi tratada com níquel Raney^⁷ actiuado e hidrogenado a

6,9 x 10 Pa (1785,8 g/cm) durante 7 horas. 0 catalisador foi filtrado através de supercel (95% SiO^), concentrado in vacuo e purificado numa coluna de fase inversa. 0 produto foi eluído em 10% MeOH H^O (contendo 0,02% de ácido acético). Após agrupamento das fracçães, concentração até um pequeno volume e liofilização, □ composto do título foi obtido, 26 mg (14%).

Anal.; (C^H^N^.ÓH 0).

Encontrado: C 50,11; H 6,57

Calculado: C 50,53; H 6,46;

N 7,64. ¹HRMN (D^/MeOD^) (t,3), 2,0(m,2), 4,3(s,2), 5,2(s,2), 5,5(s,2), 7,5(s,l),

N 7,73.

81,0

8,0(m,3),

8,6(s,l).

EXEMPLO 28

Preparação de (20 5) 9-morfolinometilcamptotecina

Uma solução de 1 mmol de trifluorometil sulfonato de 10-hidroxi-9-morfolinometilcamptotecina, preparado como descrito no Exemplo 23, em DMF seco (25 ml), foi tratada com trietilamina (0,4 ml), Pd (ácido acético)₂ (8 mg, 0,04 mmol), φ-jP (20 mg, 0,08 mmol) e ácido fórmico a 99% (0,08 ml, 2 mmol). A reacção foi aquecida sob árgon a 603C durante 6 horas, concentrada in vacuo e tratada com água. Ambos, o composto do título desejado e o principal subproduto, 9-metilcamptotecina, precipitaram (300 mg) e fo ram colectados por filtração e purificados por cromatografia flash s.Dbre sílica gel. A 9-metilcamptotecina foi isolada por eluição em 1% MeOH em CH₂C1₂ (45 mg, 13%).A eluição com 2% MeOH em CH₂C1₂ originou o composto do título (93 mg, 20%).

443

SKB 14346-1

J' ..

sr

-62Anal.; (C H 1^0 .1/2 H₂D) Calculado: C 65,78; H 5,74; N 9,20.

Encontrado: C 65,87; H 5,96; N 9,00. Espectro de massa m/e 448 (MH⁺) ¹HRMN (CDC1₃/MeOD₄) 61,0 (t,3), 2,0 (m,2), 2,5 (m,4), 3,7 (m,4), 4,0 (s,2), 5,3 (3,2), 5,6 (q,2), 7,5 (d,l), 7,6 (s,l), 7,7 (d,l), B,2 (d,l), 9,0 (s,l).

EXEMPLO 29

Preparação de (20 S) lO-hidroxi-9-cianometilcamptotecina

Uma mistura do sal metanossulfonato de 9-trimetilamoniometil-10-hidroxicamptotecina, preparado como descrito no Exemplo 8 (0,42 g, 0,8 mmol) em 95% EtOH (35 ml) e cianeto de sódio (1,26 g, 25 mmol) Foi colocada sob refluxo sob árgon durante 3 horas. 0 solvente foi removido in vacuo, foi adicionada água (20 ml) e o pH ajustado até 1,5 com HC1 3N. 0 sólido em bruto precipitado foi colectado e seco. A purificação realizou-se por cromatografia flash em coluna de sílica gel. 0 produto foi eluído com 4% e 5% MeOH em Ch^C^, originando 110 mg (33%) do composto do título. Anal. (C₂₂H₁₇N₃0₅.l 3/4 H₂0). Calculado: C 60,75; H 4,58; N 9,66. Encontrado: C 60,63; H 4,64; N 9,60. ¹HRMN (CDC1^/MeOD^) 8 0,9 (t,3), 1,8 (m,2), 4,2 (s,2), 5,2 (s,2), 5,3 (q,2), 7,5 (d,l), 7,6 (s , 1), 7,9 (d,1), Θ,4 (s , 1).

EXEMPLO 30

Preparação do sal acetato de (20 5) 10-hidroxi-9-aminometilcampto~ tecina

Uma solução de 60 mg (0,15 mmol) de 1O-hidroxi-9-cianometilcamptotecina, preparada como descrito no Exemplo 29, em ácido acético glacial (30 ml), foi tratada com, aproximadamente, 1 g (peso húmido) de níquel Raney activado/hidrogenada a 6,9 x 10⁴ Pa (1785,8 g/cm) durante 6 horas. 0 catalisador foi removido por filtração e o filtrado foi concentrado in vacuo até produzir um resíduo sólido. 0 filtrado concentrado foi em seguida dissolvido com água e purificado por cromatografia de coluna de fase inversa por eluição do produto com 10% MeOH em água (contendo 0,02% de ácido acético glacial). As fracçães apropriadas foram colectadas, concentradas até um pequeno volume e liofilizadas durante a noite, produzindo 23 mg (33%) do composto do título

443

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-63Anal.: ^C24^H25^N3°7*¹⁰ H₂0) Calculado: C 43,90; H 6,90; N 6,38.

Encontrado: C 43,82; H 6,89; N 5,79. ^XH RMN (DMS0-d₆) S 0,9 (t,3), 1,9 (m,2), 3,2 (s,2), 5,0(3,2), 5,l(s,2), 5,4(s,2), 7,2(s,l), 7,5(q,2), 8,4(s,l).

III. Exemplos de composiçães farmacêuticas

EXEMPLO A

Composição parentérica

Para preparar uma composição farmacêutica parentérica des_ te invento adequada para administração por injecção, 100 mg de um sal hidrossolúvel dum composto de fórmula (i) são misturados com 10 ml de solução salina a 0,9%, estéril, e a mistura é incorporada numa forma de unidade de dosagem adequada para administração por injecção.

EXEMPLO B

Composição oral

Para preparar uma composição oral farmacêutica deste inveri to, 100 mg dum composto de fórmula (i) são misturados com 750 mg de lactose e a mistura é incorporada numa forma de unidade de dosagem oral, tal como um cápsula de gelatina dura, a qual é adequa da para administração oral.

443

SKB 14346-1

Claims (17)

1. REIVINDICAÇflES

   1 - Processo de preparação de composto de fórmula:

   em que:

   X é hidroxi, hidrogénio, ciano, ou formilo;

   R é hidrogénio quando X é ciano, -CH NH_? ou formilo; ou

   1 ^{z z}

   R é -CHO ou -CH^R quando X é hidrogénio ou hidroxi;

   R^ é -O-R^, -S-R^, -N-R^fR^), _ou _N ⁺ -R^ (R^) (R^) , com a con dição de, quando R^ é -N⁺-R^(R^)(R^), o composto está associado com um anião farmaceuticamente aceitável;
2. 2 3 4

   R , R e R são iguais ou diferentes, e são seleccionados de entre H, alquilo , hidroxialquilo dialquilamino dialquilamino ^(alquilo ^), alquilamino ^(alquilo C? 0’ aminoalquilo C? & ou um anel carbocíclico não substituído ou subs tituído com 3-7 membros; e

   12 3 2 3 quando R é -N-R (R ), os grupos R e R podem ser combinados, em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados, pá ra formar um anel heterocíclico substituído ou não substituído, o qual pode conter heteroátomos adicionais;

   ou de um seu sal, hidrato ou solvato farmaceuticamente aceitável, caracterizado por compreender:

   (a) a condensação de 10-hidroxicamptotecina com formaldeído e a amina primária ou secundária apropriada, para originar todos os compostos de fórmula (i) excepto o composto onde X é hi6Θ 443

   SKB 14346-1

   -651 2 3 2 3 drogénio, ciano ou formilo e R é —i\J—R (R ) e R e R são iguais e são H; ou (b) formilação ds 10-hidroxicamptotecina para produzir

   9-formil-10-hidroxicamptotecina qua é, em seguida, submetida a condensação com as aminas apropriadas, seguida pela redução com cianoboro-hidreto de sódio ou por redução catalítica; ou (c) tratamento dos compostos apropriados de fórmula (i), ί 23 em que R é -N-R (R ), com um agente alquilante para obter os cor respondentes compostos de fórmula (I), em que R é -N⁺-R^(R )(R^) 2 34 e R , R e R não são H; ou (d) aquecimento da 9-dimetilaminometil-lO-hidroxicamptotecina ou de um seu sal com o. álcool ou tiol apropriado num sol-

   Ã2 uente inerte para formar compostos de fórmula (i) em que R^-1 é 0-R , ou (e) submeter o trifluorometilsulfonato de 10-hidroxicampto tecina a carbonilação catalisada por paládio.

   2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza. do por X ser hidroxi e R ser dimetilaminometilo, N-morfolinometilo, N-metilpiperazinilmetilo, (4'-piperidina)N-piperidinilmetilo, (2 '-hidroxietil) aminometilo , trimetilamoniometilo, ciclo-hexilam_i nometilo, N-metilanilinometilo, etoximetilo, ciclopropilaminometilo, Ν,Ν-dimetilaminoetiloximetilo, N,N-dimetilaminoetiltiometilo, N,N-dimeti1aminoetilaminometilo, cianometilo, aminoetilo ou formilo; ou por R ser hidrogénio e X ser ciano; formilo ou aminometilo; ou por X ser hidrogénio e R ser dimetilaminometilo ou N-morfolinometilo.
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizja do por o composto estar sob a forma de isómero S.
4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriz_a do por o composto estar sob a forma de mistura racémica.
5. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteriza do por X ser hidroxi e R ser dimetilaminometilo.
6. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteriza do por X ser hidroxi e R ser trimetilamoniometilo.

   6Θ 443

   SKB 14346-1
7. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteriza. do por X ser hidroxi e R ser N-metilpiperazinometilo.

   Θ - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteriza do por X ser hidroxi e R ser N-metil anilinometil o.
8. 9 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteriza do por X ser hidroxi e R ser ciclo-hexilaminome til o.
9. 10 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteriza do por X ser hidroxi e R ser N,N-dimetilaminoetiloximetilo·
10. 11 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteriza do por X ser hidroxi e R ser N-cianometilo.
11. 12 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteriza do por X ser hidroxi e R ser mor foiinometilo.
12. 13 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteriza do por X ser hidroxi e R ser N-aminometilo.
13. 14 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteriza. do por X ser hidroxi e R ser N-ciclopropilaminometilo.
14. 15 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracteriza do por o composto estar sob a forma de sal de acetato.
15. 16 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracteriza^ do por o composto estar sob a forma de mono-hidrocloreto, di-hi drocloreto ou sal de sódio.
16. 17 - Processo de preparação duma mistura farmacêutica compreendendo uma quantidade de ingrediente activo, eficaz na inibição do crescimento de células tumorais, e um veículo ou diluente inerte farmaceuticamente aceitável, caracterizado por compreender a mistura de tal ingrediente activo e de tal veículo ou diluente inerte farmaceuticamente aceitável, sendo a referida mistura útil para a inibição do crescimento de células tumorais de animal, sen síveis ao ingrediente activo, em que o ingrediente activo é um composto de fórmula

    68 443

    SKB 14346-1 em que:

    X é hidroxi, hidrogénio, ciano, -CH₂NH₂ ou formilo;

    R é hidrogénio quando ,X é ciano, -CH NH ou formilo; ou

    1 ²²

    R é -CHD ou -CH₂R quando X é hidrogénio ou hidroxi;

    R¹ é -0-R², -S-R², -N-R²(R³), ou -N ⁺ -R²(R³)(R^Zt) , com a condição de, quando R^ é -N⁺-R²(R³)(R^), o composto está associado com um anião farmaceuticamente aceitável;

    R², R³ e R^ são iguais ou diferentes e são seleccionados a partir de H, alquilo hidroxialquilo C? dialquilamino dialquilamino ^(alquilo C₂ alquilamino ^(alquilo C ); aminoalquilo C ou um anel carbocíclico com 3-7 mem2-6 2—6 bros não substituído ou substituído; e

    1 2 3 2 3 quando R é -N-R (R ), os grupos R e R podem ser combinados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados, para formar um anel heterocíclico substituído ou não substituído, o qual pode conter heteroátomos adicionais ;

    ou um seu sal, hidrato ou solvato farmaceuticamente aceitável.
17. 18 - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por X ser hidroxi e R ser dimetilaminometilo, N-morfol inometi. lo, N-metilpiperazinilmetilo, (4'-piperidina)N-piperidinilmetilo, (2'-hidroxietilo)aminometilo, trimetilamoniometilo, ciclo-hexilaminometilo, N-metilanilinometilo, etoximetilo, ciclopropilaminometilo, Ν,Ν-dimetilaminoetiloximetilo, N,N-dimetilaminoetiltiometilo, N,N-dimetilaminoetilaminometilo, cianometilo, aminoetilo ou formilo; ou por R ser hidrogénio e X ser ciano, formilo ou aminçj etilo; ou por X ser hidrogénio e R ser dimetilaminometilo ou N68 443

    SKB 14346-1