PT88881B

PT88881B - Processo para a preparacao de analogos dissulfureto de agentes antitumor ll- -e33288

Info

Publication number: PT88881B
Application number: PT88881A
Authority: PT
Inventors: George A Ellestad; William James Mcgahren; Martin Leon Sassiver
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1987-10-30
Filing date: 1988-10-28
Publication date: 1993-01-29
Also published as: IE883261L; IE883262L; JPH01193282A; KR890006245A; FI884983A; DE3851682T2; AR246083A1; NO176480B; ES2061586T3; FI884983A0; DK602488D0; DE3889063D1; IL87946A; ZA888123B; DE3889063T2; EP0313873B1; AU618763B2; ZA888127B; AU2449488A; DK174739B1

Description

Como antecedente, a família de agentes antibacterianos e antitumor, conhecidos colectivamente como o complexo LL-E33288 são descritos e reivindicados no pedido copendente da patente dos E.U.A. No de Série 009321, de 30 de Janeiro de 1987, e são usados para preparar os agentes dissulfureto antitumor do nosso invento. A aplicação descreve o complexo LL-E33288, os seus componentes, nomeadamente, LL-E33288^-Br, LL-E33288 ^-1, LL-E33288 ^-Br, LL-E33288 oc-g-1, LL-E33288 o^-Br, LL-E33288otg-1, LL-E33288 ^-Br, LL-E33288p_i-Br, LL-E33288β_χ-1, LL-E33288p₂-Br, LL-Ε33288^₂-1, LL-E33288y₁-Br, LL-E33288-I e LL-E33288-1, e métodos para a sua produção por fermentação aeróbica utilizando uma nova estirpe de Micromonospora echinospora ssp calichensis ou seus mutantes derivados ou naturais. A Série No.009321 também divulga estruturas propostas para alguns dos componen. tes acima designados. Estas estruturas propostas são reproduzidas na Tabela I a seguir, em que W ê o resto da molécula ligada a CHgSSS-,

-5Tabela 1: Estruturas Propostas para CHg-SSS-W (em que W ê o substituinte ligado a CHg-SSS- a seguir)

X.

Aq x

R₄O r₂.«

ORj

ÇH, O

OCH,

Oeslgnatlon	«1	r₂	r₃	r₄	Rg	«6	«7	X
LL-E33288a₂ ^l	^Af1	^R2·	H	H	^C2^H5			I
LL-E33288a₃ ^l	^Ari	H	H	^R4‘				I
LL-E33288P,¹	^Ari	r₂.	H	^R4*	(CHJ.CH			I
LL-E332887·,¹	^Ari	r₂.	H	^R4·	^C2^H5			1
LL-E332885₁ ^I	^Ari	r₂.	H	^R4·	^CH3			1
LL-E332880,^Br	^ΑΓ1	r₂.	H	^R4·	(CH₃)₂CH			Br
LL-E33288y, ^Br	^ΑΓ1	r₂.	H	^R4·	^C2^H5			Br
LL-E33288a₂ ^Br	^Ari	r₂.	H	H	^C2^H5			Br
LL-E33288a₃ ^Br	^ΑΓ1	H	H	r₄.				Br
EsparamlcinaA^ EsparamlclnaA₂	^CH3	r₂.	^R3·		(CH^CH	H	^ΑΓ2
<=«3	r₂.	^R3·		(ch₃)₂ch	^ΑΓ2	H
EsperamlcInSA^ &	^CH3	r₂.	^R3·		ch₃ch₂	H	^ΑΓ2

Os análogos dissulfureto do invento são também preparados a partir de ceros outros antibióticos, nomeadamente:

1) Esperamicina BBM-1675, uma nova classe de antitumor potente I. Dados fisico-quimicos e estrutura parcial. M. Konishi,

et al., J. Antibiotics, 38, 1605 ( 1985). Um novo complexo antibiótico antitumor. M. Konishi, et al., pedido de Patente do R.U. GB 2 141 425A de 15 de Maio de 1984.

2) Novos antibióticos antitumor, FR-900405 e FR-900406.1 . Taxonomia da estirpe produzida. M. Iwami, et al., J. antibiotics 38, 535 ( 1985). Novos antibióticos antitumor FR-900405 e FR-900406. II. Produção, isolamento, caracterização e actividade antitumor. S. Kiyoto, et ah., J. Antibiotics, 38, 340 (1985).

3) PD 114759 e PD 115028, novos antibióticos antitumor com potência fenomenal.I. Isolamento e caracterização R. H.

Bunge, et al., J. Antibiotics, 3_7_, 1566 ( 1984). Actividades biológicas e bioquímicas do novo antibiótico antitumor

PD 114759 e derivados relacionados. D. W. Fry et al., Investigational New Drugs, 4, 3(1986).

4) Novo complexo antibiótico CL-1577A, CL-1577B produzido por Streptomyces sp. ATCC 39363. Pedido de Patente Europeia 0 132 082, A2.

5) Compostos antibiótico antitumor CL-1577D e CL-1577E, sua produção e uso. Patente U.S. 4 539 203.

6) Compostos antibiótico CL-1724, sua produção e uso. Patente dos E.U.A. 4 554 162.

Toda a informação respeitante a BBM-1675, FR-900405, FR-900406, PD 114759, PD 115028, CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D, CL-1577E e CL-1724 contida nas citações anteriores ê aqui incorporada para referência.

Como se pode ver das estruturas

-Ί divulgadas na Tabela I, os componentes » ^4» Pp β₂, y e 5 do complexo LL-E33288, bem como os antibióticos BBM-1675, FR-900405, FR-900406, PD-114759, PD 115028, CL-1577A, CL-1577B, CL-1577D, CL-1577E e CL-1724 cada um contendo um grupo trissulfureto alilico nas suas estruturas.

Foi agora descoberto que a reacção de qualquer dos antibióticos acima citados com um alquil ou aril mercaptan não substituido ou substituido origina 0 deslocamento do anião pertiolato de metil da metade trissuj. fureto provocando a formação de um análogo dissulfureto estável (Esquema I), a seguir.

CH₃-SSS-W

Q-Sp-SH

V

Q-sp-ss-w

Esquema I

Os compostos da Tabela I são transformados com moléculas orgânicas contendo tiol de acordo com 0 Esquema I para produzir novas composições úteis como agentes antibacterianos e anticancro no seu direito próprio, em que W, R_p R₂, R₃, R_p Rg, Rg, R_y, R_g' , R₃ ¹ , R4¹ , Arp Ar₂ e X são como acima definidos na Tabela I, Sp é radicais (CpCig) divalentes de cadeia linear ou ramificada, radicais divalentes aril ou hetero'aril, radicais (C₃-C₁₈) divalentes

cicloalquil ou heterocicloalqui1, radicais divalentes (Cj-C^g) aril- ou (Cj ^C18⁾ heteroarilalqui1, radicais divalentes (Cj-Cjg) cicloalquil- ou heterocicloalqui1-alqui1, ou radicais divalentes alquil insaturados. Q ê hidrogénio, halogéneo, amino, alquilamino, dialquilamino, piperidino, pirrolidino, piperazino, carboxil, carboxaldeido; alcoxi inferior, hidroxi, tiol, alquildicarboxi1 inferior, ou um grupo escolhido entre: -CONHNl·^, -NHCONHNl·^» -NHCSNHNl·^, ou -0NH₂; com a condição de que quando Sp ê etilideno, Q não pode ser hidrogénio.

Como um exemplo, a reacção de LL-E33288 γj-I com metil mercaptan em acetonitrilo produz LL-E33288^2I> um novo composto antitumor, o qual ê também produzido pelas condições de fermentação aerôbica descritas nas aplicações da patente acima citada.

A reacção anterior não está limitada aos derivados iodo dos antibióticos LL-E33288. Se, por exemplo, usarmos o LL-E33288 Vj-Br, o produto será LL-E33288Y₂-Br e de facto o análogo alquil dissulfureto de bromo de qualquer antibiótico Ε-33288-bromo será realizado sob condições análogas.

As estruturas propostas dos antibióticos acima mencionados, apôs reacção com metil mercaptan, são apresentadas a seguir.

R = CHj, X = I = LL3328aYj'

R = CH„ X a Br = LL3328a_T2^,r

A transformação do análogo dissulfureto não estã de qualquer modo restringida âs reacções dos compostos listados na Tabela I com metil mercaptan, mas pode ser usado com uma grande variedade de moléculas orgânicas contendo tiol para obtermos novos agentes antitumor e antibac terianos. Além disso, os produtos da própria reacção são susceptiveis de transformações posteriores dentro da cadeia lateral novamente introduzida para produzir ainda mais novos compostos com actividades biológicas.

Os compostos deste invento além do seu uso como agentes antitumor e antibacterianos, são úteis para avaliar novos modos de actividade anticancro a um nível celular. Os antibióticos naturalmente derivados descritos pelas aplicações e patentes acima designadas não contêm unidades cromofóricas suficientemente fortes de tal

modo que a sua localização intracelular pode ser adequadameii te delineada. Quando os derivados tritioretil nativos reagem com as moléculas contendo tiol as quais contêm adicionalmente uma unidade cromofôrica que absorve ou emite luz em áreas do espectro electromagnético não obscurecidas por cromoforos celulares, ferramentas bioquímicas úteis para o estudo de fracturas DNA de margem dupla e a localização celular desta classe de compostos pode ser gerada. Análogamente, a introdução de radioetiquetas por esta reacção está dentro do âmbito do nosso invento. Assim, por exemplo, quando E33288 j-I reagiu com 7-(2-tioetilamino)-4-metilcoumarin, obtemos um derivado o qual fluoresce intensamente após irradiação com luz ultravioleta, permitindo a localização do composto dentro dos compartimentos celulares.

Nesta execução deste invento, os compostos da Tabela I são transformados com moléculas orgânicas contendo tiol de acordo com o Esquema 1 para produzir novas composições adicionalmente úteis como sondas

R,

Rr, Rmoleculares, em que W, Rp R₂, Rp Rp Rg, .χθ,

Rg¹, R4‘, Arp Ar?, e X são como antes definidos na Tabela I, Sp ê radicais (CpC^g) divalentes de cadeia linear ou ramificada, radicais divalentes aril ou heteroaril, radicais divalentes (Cg-Cjgjcicloalqui 1 ou heterocicloalqui 1, radicais divalentes (C^ ^G18⁾ aril ou heteroari1-alqui1, radicais divalentes (CpCjg) cicloalquil ou heterocicloalqui1-alqui 1, e radicais divalentes (C2-C|_g) alquil insaturados; Q ê o núcleo fluorescente de dibenzooxazina não substituído ou substituído, rodamina, carbostitil, comarina, fluoroceina, acridina, ou um substituinte contendo uma radioet iqueta 3h,

32

S, ou P como parte da sua estrutura.

ou

14,

Os compostos deste invento são activos como agentes antibacterianos. A sua actividade antibacteriana in vitro foi determinada contra um espectro da

bactéria gram-positivo e gram-negativo pelo método de diluição agar padrão. 0 agar Mueller-Hinton contendo concentrações decrescentes duplas dos antibióticos foi deitado em pratos petri. As superfícies agar foram inoculadas com 1 a 5 x 10^ colónias formadoras de unidades de bactérias por meio de um meio repetido ou duplicado de Steers. A concentra ção mais baixa do composto que inibe o crescimento de uma estirpe de bactérias apôs cerca de 18 horas de incubação a 36°C foi registada como a concentração inibidora minima (MIC) para aquela estirpe. Os resultados são resumidos na Tabela II.

-12Tabela II

Actividade Antibacteriana In Vitro

Organismo

Concentração Inibidora Minima(mcg/ml)

LL-E33288γ?-I éster p-nitro fenil de LL-E33288_Y2-I

Escherichia coli	CMC 84-11 '	0.25	0.5
Escherichia coli	No. 311	0.25	0.5
Escherichia coli	ATCC 25922	0.12	0.5
Klebsiella pneumoniae	CMC 84-5	0.25	1
Klebsiella pneumoniae	AD (MP)	0.12	0.25
Enterobacter cloacae	CMC 84-4	0.5	2
Enterobacter aeroqenes	10 83-44	0.5	1
Serratia marcescens	CMC 83-27	0.25	1
Serratia marcescens	F-35 (MP)	0.25	1
Morqanella morqanii	10 83-18	0.5	2
Providencia stuartii	CMC 83-82	1	2
Citrobacter diversus	K 82-24	0.5	1
Citrobacter freundii	10 83-13	0.5	0.5
Acinetobacter sp.	CMC 83-89	0.25	0.5
Acinetobacter sp.	10 83-49	0.25	1
Pseudomonas aeruqinosa	12-4-4 (MP)	0.25	1
Pseudomonas aeruqinosa	ATCC 27853	0.12	0.5
Staphvlococcus aureus	Smith	0.001	0.002
Staphvlococcus aureus	SSC 82-21	0.0005	0.004
Staphvlococcus aureus	ATCC 25923	0.0005	0.004
Staphvlococcus aureus	ATCC 29213	0.001	0.004
Staphvlococcus aureus	SSC 82-23	0.001	0.002
Staphvlococcus aureus	VGH 84-41	0.001	0.002
Staphvlococcus aureus	VGH 84-47	0.001	0.004

Tabela II (Continuação)

Actividade Antibacteriana In Vitro

Organismo Concentração Inibidora Minima (mcg/ml)

LL-E33288y₂-I éster p-nitro fenil de LL-E33288 _r2-I

Staphvlococcus

epidermidis	CMC 83-133	0.001	0.002
Staphvlococcus epidermidis	ATCC 12228	0.001	0.004
Streptococcus faecalis	ATCC 29212	0.002	0.004
Streptococcus faecalis	VGH 84-65	0.004	0.004
Streptococcus faecalis	CMC 83-53	0.004	0.004
Streptococcus faecalis	UCI 85-20	0.002	0.004
Streptococcus faecalis	IO 83-28	0.004	0.004

Os análogos dissu lfuretos acima descritos são agentes antitumor activos.

Certos sistemas e protocolos de teste in vivo foram desenvolvidos pelo Instituto Nacional do Cancro para testar compostos para determinar a sua aptidão como agentes antineoplasticos. Estes foram assinalados em Câncer Chemotherapy Reports, Part III, Vol. 3, No.2 (1972), Geran, et al. Estes protocolos estabeleceram testes de triagem padronizados os quais são geralmente seguidos no campo do teste para agentes antitumor. Destes sistemas, a leucemia linfocitica P388, melanoma melanótico B16, leucemia L1210 e colon 26 adenocarcinoma são particularmente significantes para o presente invento. Estes neoplasmas são utilizados para teste como tumores transplantáveis em ratos. Geralmente, actividade antitumor significante, evideji ciada nestes protocolos por uma percentagem de aumento dos tempos médios de sobrevivência dos animais tratados (T) sobre os animais de control (C) ê indicativo de resultados análogos em leucemias humanas e tumores sólidos.

Teste de Leucemia Linfocitica P388

Os animais usados foram ratos fêmea BDF

j. Havia 5 ou 6 ratos por grupo de teste. 0 transplante do tumor foi por injecção intraperitoneal de 0,5 ml de fluido ascitico diluido contendo 1 x 10^ células de leucemia linfocitica P388 no dia zero. Os compostos de teste foram administrados intraperitonealmente com um volume de 0,5 ml em solução salina, estéril, sem pirogen, nos dias

1,5 e 9 (em relação ao tumor de inoculação) com as doses indicadas. Os ratos foram pesados e os sobreviventes registados numa base regular de 30 dias. Calculamos o terpo médio de sobrevivência e o quociente entre o tempo de sobrevivência para os animais tratados (T)/ control(C). Os resultados aparecem na Tabela III.

-15Tabela III

Teste de Leucemia Linfocitica P388 composto

Dose ,(mg/kg),

Sobrevivência média (Dias)

T/CX100 %

LL-E332887₂-I	0.02	19.5	•177
(analogo metildissulfureto	0.0125	21	191
de LL-E332887 -I)	0.01	19	173
	0.0063	26	236
	0.005	21	191
	0.003	20.5	178
	0.0025	18.5	168
	0.0015	17	154
	0.00125	15.5	141
Controlo		11.0
Analogo Propildissulfureto_	0.01	27.5	250
de LL-E332887 -I	0.005	21.5	195
	0.0025	16	145
	0.00125	14.5	131
Controlo		11.0	—

Teste de Melanoma Melanótica B16

Os animais usados eram fêmeas de ratos BDF1. Havia 5 ou 6 ratos por grupo de teste. Uma porção de uma grama do tumor de melanoma melanótica B15 foi homogeneizada em 10 ml de solução salina fria balanceada e uma aliquota de 0,5 ml do homogenado foi implantada intra peritonealmente em cada um dos ratos em teste. Os compostos em teste foram administrados intraperitonealmente nos dias 1 atê 9 (em relação â inoculação do tumor) com as doses indicadas. Os ratos foram pesados e cs sobreviventes registados com uma base regular de 60 dias. Calculamos o tempo

-16de sobrevivência médio e a relação entre o tempo de sobrevivência para os animais tratados (T)/ e os animais de control (C). Os resultados aparecem na Tabela IV.

Tabela IV

Teste de Melanoma Melanótica B16

Composto

Dose Sobrevi- T/C x 100 (mg/kg) vência média (%) (Dias)

LL-E332887₂-I

LL-E332887 -I)

0.005	34	162
0.0025	38	181
0.00125	33.5	160
0.0006	28.5	13 6
0.0003	26	124

Controlo invento serã adicionalmente descrito em conjunção com os exemplos seguintes.

-17Exemplo 1

Análogo metiIdisulfureto de LL-E33288 γ-I (LL-E33288_Í2-I)

Um reagente tiol foi preparado fazen do borbulhar gás metil mercaptan em 10 ml de acetonitrilo até estar essencialmente saturado. Juntamos uma porção de 108 mg de LL-E33288yj-I ao tiol reagente, a suspensão resultante foi a seguir agitada para produzir uma solução a qual foi colocada num congelador a -20°C durante a noite, e a seguir o solvente foi evaporado. 0 residuo foi processado num pequeno volume de acetato de etilo e esta solução foi deitada em 25 ml de hexano agitado originando um precipitado quase branco que foi seco, obtendo-se 82 mg de LL-33288y₂-1 parcialmente purificado.

As 82 mg anteriores foram tratadas com 0,1 ml de metanol e a seguir juntamos 1 ml de cloreto de metileno. Esta solução foi passada através de 18 g de silica gel numa pequena coluna. 0 eluente usado era 5% de metanol em cloreto de metileno. As fracções foram vigiadas por cromatografia de camada fina sobre silica gel usando o sistema 10% de isopropanol em acetato de etil saturado com fosfato tampão. Juntamos as fracções 4-11, contendo

LL-E33288y₂-I e evaporamos. 0 residuo foi processado em 0,5 ml de acetato de etil e deitado em 20 ml de hexano agitado. 0 precipitado foi recolhido e seco, originando 37 mg de LL-E33288y₂-I, tendo espectro ultravioleta como se mostra na Figura I, um espectro de ressonância magnético protônico como se mostra na Figura II, um espectro infravermelho como se mostra na Figura III, e um espectro de massa como se mostra na Figura IV.

-18Exemplo 2

Análogo Eti ldissulfureto de LL-E33288 y-I

Repetimos a reacção descrita no Exemplo 1, usando um reagente tiol composto de etil mercaptan em acetonitrilo, originando o desejado análogo dissulfureto de etil de LL-E33288 Ypl.

Exemplo 3

Análogo propildissulfureto de LL-E33288 γ^ -1

Uma porção de 60 mg de LL-E33288Y|-I foi dissolvida em 6 ml de acetonitrilo e juntamos 5 ml de uma solução 1 pmol/ml de propil mercaptan em acetonitrilo. Apôs 3 horas, a reacção estava essencialmente completa e o solvente foi evaporado. 0 residuo foi processado em 3 ml de acetato de etil, filtrado e o filtrado deitado em 40 ml de hexano agitado. 0 precipitado foi recolhido e seco, originaig do 39 mg de análogo dissulfureto de propil de LL-E33288yj-I, tendo um espsztro de ressonância magnético protônico como se mostra na Figura V e um espectro de massa como se mostra na Figura VI.

Exemplo 4

Análogo dissulfureto de 1-meti1-1-propi1 de

LL-E33288y₁-1

Uma solução de 150 pg de

LL-E33288yj-I em 1 ml de acetonitrilo foi tratada com 50 /j!

W

-19de uma solução 1 jumole/ml de 1-metil-l-propil mercaptan. Após 2 horas, a reacção estava completa, originando o desejado análogo dissulfureto de 1-metil-l-propil de

LL-E33288 Y|-I.

) Exemplo 5

Análogo dissulfureto t-butil de LL-E33288y^-I

Uma porção de 150 pg de LL-E33238/j-I em 1 ml de acetonitrilo foi tratada com 50 ml de uma solução jumole/ml de mercaptan de t-butil em acetonitrilo. Apôs ¹/4 horas, a reacção estava completa, originando o análogo dissulfureto t-butil de LL-E33288-I.

Exemplo 6

Análogo dissulfureto de t-butoxicarboni1 t-butil cisteinil de LL-E33288Yj-I éster t-butoxicarboni1-cisteina-t-butil foi dissolvido em acetonitrilo a uma concentração de 10 mg/ml. Uma porção de 230 jug de LL-33288yj-I em acetonitrilo foi tratada com 100 pl de amino ácido reagente.

Após 1 hora, a reacção estava completa, originando o desejado análogo dissulfureto de LL-E33288^-I.

Exemplo 7

Análogo dissulfureto de ácido 3-mercaptopropiônico de LL-E33288γ”!-1

A uma solução de 90 mg de

LL-E33288-1 em 90 ml de acetonitrilo juntamos 10,6 mg de ácido 3-mercaptopropiónico em 1 ml de acetonitrilo. A solução foi agitada e a seguir armazenada a -20°C durante 6 dias 0 solvente foi removido in vacuo e o residuo cromatografado sobre 10 ml de silica gel em cloreto de metileno. A coluna foi desenvolvida com 50 ml de cloreto de metileno, 50 ml de metanol a 4% em cloreto de metileno e finalmente 100 ml de 8% de metanol em cloreto de metileno. A evaporação desta última fraeção originou um residuo o qual foi processado em acetato de etil com a ajuda de um pouco de acetona e adicionado gota a gota a um excesso de h&ano.

precipitado foi recolhido e seco, originando 39 mg do produto desejado (FEBMS, M+H 1394).

Exemplo 8

Reacção de LL-E33288-1 com o éster p-nitrofenil de ácido 3-mercaptopropiónico (A) Preparação de éster p-nitrofenil de ácido 3-mercaptopropiónico ácido 3-mercaptopropiónico comercial em cloreto de metileno contendo uma quantidade catalítica de ácido sulfúrico concentrado foi tratado com isobutileno durante 2 0 minutos.A solução foi a seguir ex-21

traída com solução de bicarbonato de sódio IN apôs o que a solução de cloreto de metileno foi seca usando sulfato de magnésio anidro. A solução foi a seguir evaporada atê um liquido móvel incolor cujo NMR e dados do espectro de massa indicaram que era o ácido t-butil de ácido 3-t-butil mercaptopropiónico.

Uma parte aliquota deste éster foi refluxada com ácido cloridrico 6N em dioxano durante 2,5 horas. 0 solvente foi evaporado, juntamos acetato de etil e esta solução foi extraída com carbonato de sódio. 0 extracto de carbonato de sódio foi tratado com ácido cloridrico 6N até o pH da suspensão ser 2,0. A suspensão foi a seguir extraída com acetato de etil, o extracto seco sobre sulfato de magnésio anidro e o solvente evaporado atê um liquido incolor cujo NMR e cbdos do espectro de massa indicaram que era ácido 3-t-butil mercaptopropiónico.

Este composto foi convertido oo éster p-nitrofenol por tratamento com quantidades equimolares de £-nitrofenol e diciclohexilcarbodiimida em tetrahidrofurano durante 4 horas. 0 sub-produto diciclohexil ureia foi removido por filtração e o filtrado foi evaporado num ôleo o qual foi purificado por passagem sobre silica gel neutra usando o sistema solvente hexano: cloreto de metileno (50:50).0 derivado de éster p-nitrofenil puro era um ôleo levemente amarelo, instável.

mercaptan livre foi desmascarado pelo processo seguinte. 0 ester p-nitrofenil de ácido 3-t-butil mercaptopropiónico foi dissolvido em ácido trifluoroacêtico e juntamos um ligeiro excesso (10%) de acetato mercúrio. A mistura foi agitada durante 30 minutos, e a seguir o ácido trifluoroacético foi evaporado e oresiduo processado em dimetilformamida. Esta solução foi tratada com gás sul-

-22fidrico durante 15 minutos, e a seguir o sulfureto mercúrio preto foi retirado por filtração e o filtrado evaporado sob pressão reduzida para eliminar até 99% da dimetilformamida.

liquido instável levemente acastanhado resultante foi purificado sobre silica gel neutra usando hexano: cloreto de metileno (50:50). 0 componente principal foi observado por

NMR conter uma pequena quantidade do derivado t-butil mercapto. A análise HPLC sobre duas colunas C^ Perkin-Elmer Pecosphere em tandem /”4,6 x 33 mm e 4,6 x 83 mmj usando um sistema gradiente de 37,5/62,5 a 47,5/52,5 de acetonitrilo e acetato de amónio 0,1M tampão a pH 6,5 (ácido acético) durante um período de 12 minutos indicam que o produto era 88% do éster p-nitrofenil de ácido 3-mercaptopropiónico e 10% do éster p-nitrofenil de.ácido 3-t-butil mercaptopropiónico menos polar. Havia também presente uma pequena quantidade de p-nitrofenol presente.

(B) Reacção de éster p-nitrofenil de ácido 3-mercaptopropiónico com LL-E33288/j-I

Uma porção de 100 mg de

LL-E33288 γj-I foi dissolvida em 50 ml de acetonitrilo. A este juntamos uma solução de 25,7 mg de éster p-nitrofenil de ácido 3-mercaptopropiónico em 1 ml de acetonitrilo. A reacção foi deixada a -20°C durante 48 horas. HPLC indicou que a reacção estava completa. A solução foi evaporada à secura e o residuo processado em 45 ml de acetato de etil usando sonicação para efectuar a solução. A mistura foi filtrada, e o filtrado deitado em 45 ml de hexano agitado.0 sólido resultante levemente amarelo foi recolhido e seco sob pressão reduzida, originando 93 mg de ester p-nitrofenil de ácido propiónico derivado de LL-E33288γ*₂-1, como estabelecj. do por NMR. Por FABMS o ião /M+Hj apareceu a M/Z=1515.

-23Exemplo 9

Análogo dissulfureto de 7-(2-mercaptoetilamino)-4-metil-coumarin de LL-£33288^-1

A 10 mg de LL-E33288Y^-I 70% puro em 9 ml de acetonitrilo juntamos 1,2 mg de 7-(2-tioetilamino) -4-meti1-coumarin em 1 ml de acetonitrilo. Apôs agitação durante 36 horas a 0°C o solvente foi vaporizado e o produto foi cromatográfado sobre silica gel com 5% de metanol em clorofórmio para obtermos 5 mg do produto desejado. Tempo de retenção uma coluna HPLC C-18 de fase inversa: 5,4 min com 56% de acetonitrilo, cloreto de amónio aquoso 10,1M. (Tempo de retenção LL-E33288^-I no mesmo sistema ê 5,5 min).

Exemplo 10

Análogo dissulfureto de 3-mercaptopropioni1 hidrazida de LL-E33288^-₁ I

A 5,4 ml (3 eq.) de hidrazina anidra em 100 ml de tetrahidrof urano refluxante sob argon, junta^ mos gota a gota 9,2 ml (83 mmol) de 3-mercaptopropionato de metil em 50 ml de tetrahidrofurano durante 2 horas. A solução foi refluxada mais 2 horas, evaporada, e a seguir diluida e evaporada duas vezes a partir de 300 ml de tolueno.0 produto foi aplicado a um tampão de silica gel com 5% de acetato de eti1/clorofórmio e eluido a partir do tampão com 20% de metanol/clorofórmio. A 3-mercaptopropioni1 hidrazida resultante era um ôleo levemente cor de rosa o qual solidificou quando arrefecido mas fundiu à temperatura ambiente.

A 50 mg de LL-E33288-qrj I em 50 ml de acetonitrilo a -15° juntamos 6,6 mg de 3-mercaptopropioni1

-24hidrazida em 1 ml de tetrahidrofurano. Juntamos como catalisador 1 equivalente de trietilamina e/ou 1 equivalente de ácido acético. A reacçpo foi deixada a agitar a 0°C durante 1 hora e o solvente foi a seguir evaporado. 0 residuo foi cromatografado sobre silica gel com 10-15% de metanol em gradiente de clorofórmio para obtermos 26 mg do produto desejado. Tempo de retenção de HPLC ^C18 de fase inversa:

5,0 min em 41% de acetonitrilo/cloreto de amónio aquoso 0,1M.

Exemplo 11

Análogo dissulfureto de N-£Z'(4-meti l-coumarin-7-i 1 )amino7 aceti 1/cisteina hidrazida de LL-E33288-$j I

Uma mistura de 1,0 g (5,7 mmol) de 4-metil-7-aminocoumarin, 3,0 ml de bromoacetato de etil (5 eq.), 90 mg (0,1 eq) de iodeto de sódio, e 30 ml de dimetilformamida foi aquecida sob argon a 80°C durante 5 horas. A mistura foi arrefecida, diluída com éter etilico, lavada três vezes com 50% de ãgua salgada, seca sobre sulfato de magnésio, e evaporada à secura. 0 produto em bruto foi dissolvido em clorofórmio contendo 1% de acetato de etil e filtrado através de um tampão de silica gel. A recristalização a partir de éter dietilico contendo um traço de cloroformio originou acetato de etil N-/T(4-meti 1-coumarin-7-il) amino/acetato puro.

A 1,96 g (7,5 mmol) do éster anterior em 15 ml de metanol e 15 ml de tetrahidrofurano juntamos 10 ml de hidróxido de sódio aquoso IN. Após 30 minutos, juntamos 4 ml de ácido clorídrico aquoso a 10%.Os solventes orgânicos foram evaporados e o produto cristalino resultante foi filtrado e lavado com etanol frio e a se-25-

guir éter. Este material foi dissolvido em 20 ml de tetrahidrofurano e 4 ml de dimetilformamida. Juntamos dicíclo« hexilcarbonildiimidazol (1,3 g; 2,2 eq) e a reacção deixou-se a agitar durante 15 minutos. Juntamos então cloreto de éster etilico cisteina (1,6 g; 2,5 eq.) e trietilamina (1,2 ml). Após mais 3 horas, a reacção foi diluida com éter etilico contendo 5% de cloreto de metileno e lavamos uma vez com ácido clorídrico aquoso a, 10% e duas \ees com água salgada. Após secagem com sulfato de magnésio e evaporação dos solventes, o produto em bruto foi cristalizado por dissolução em cloroformio contendo uma quantidade mínima de etanol e a seguir juntamos um excesso de éter. Os cristais foram filtrados e secos para obtermos ester N-/T(4-metil-coumarin-7-il)amino7acetiljcisteina etilico puro.

Uma mistura de 5 ml de clorofórmio, 20 ml de metanol, e 0,4 ml de hidrazina hidratada foi aquecida a refluxo sob argon. A este juntamos 550 mg de ester N-/T(4-meti 1 -coumarin-7-i l7amino_7aoeti17cisteina etilico. Após refluxo durante 9 horas a mistura foi arrefecida e o produto sólido foi filtrado e lavado com clorofórmio e a seguir com éter etilico. 0 produto em bruto (o qual continha tiol e dissulfureto) foi dissolvido em dimetilformamida contendo ditiotreitol e trietil amina. Apôs 30 minutos o produto foi precipitado com excesso de éter etilico e recolhido por filtração. Este material foi purificado ainda por recristalização a partir de acetonitrilo desgasifiçado contendo ditiotreitol e um traço de trietil amina para obtermos N-Zy(4-meti1-coumarin-7-il)amino7aceti17cisteina hidrazida pura.

A 12 mg de LL-E33288_ri ¹ 70% puro em 12 ml de acetonitrilo a 0°C juntamos 4 mg de N-/T(4-metil-coumarin-7-i1)amino7aceti IJcisteina hidrazida em 1,2 ml de dimetilformamida. Após agitação durante a noite juntamos

mais 2 mg de ^-/T(4-meti1-coumarin-7-i1)aminojcisteina hidrazida em 0,6 ml de dimetilformamida. A reacção foi agitada durante 3 dias a 0°C e filtrada. 0 acetonitrilo foi evaporado e a solução de dimetilformamida resultante foi diluída com um excesso de 1:1 hexanos/êter. 0 produto foi isolado por filtração e de novo purificado por cromatografia sobre sílica gel com um gradiente 15-20% de metanol em clorofórmio para obtermos 3 mg do produto desejado. Tempo de retenção em HPLC Cjg de fase inversa: 3,5 minutos usando 45% de acetonitri lo/cloreto de amónio aquoso O,1M.

Exemplo 12

Análogo dissulfureto 3-mercaptopropioni1 hidrazida de

LL-E33288o<₃ ¹

A 10 mg de LL-E33288«₃^ em ml de acetonitrilo a -15°C juntamos 6,6 mg de 3-mercaptopropio jii 1 hidrazida em 1 ml de acetonitrilo. Um equivalente de trietilamina e/ou 1 equivalente de ácido acético foram adicionados como um catalisador. Deixamos agitar a reacção a 0°C durante 1 hora e o solvente foi a seguir evaporado. 0 residuo foi cranatografado sobre sílica gel com um gradiente de 10-15% de metanol em clorofórmio para obtermos o produto desejado. Tempo de retenção em HPLC C₁₈ em fase inversa: 3,5 min. em sistema de 45% de acetonitrilo: cloreto de amónio aquoso

Claims

REIVINDICAÇÕES

1-. - Processo para a preparação do agente anti-tumor LL-E 33288 γ₂ ^_Ι tendo

a) espectro ultravioleta como se mostra na Figura I: