PT85588B

PT85588B - Processo para a preparacao de compostos cromogenicos

Info

Publication number: PT85588B
Application number: PT85588A
Authority: PT
Inventors: Dieter Schnaitmann; Werner Stuber
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1986-08-28
Filing date: 1987-08-26
Publication date: 1990-05-31
Also published as: AU602527B2; HU197757B; EP0258784B1; PT85588A; CA1323726C; ATE83245T1; ES2052529T3; EP0258784A2; DE3629175A1; US5097014A; DE3782988D1; JP2561928B2; AU7762787A; DD279485A5; US5334506A; JPS6368600A; ZA876393B; EP0258784A3; HUT45269A

Description

Memória descritiva referente à patente de invenção de BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial,com sede em D-3550 Marburg, República Federal Alemã, (inventores: Dr. Werner Sttiber e Dr. Dieter Schnaitmann, residentes na República Federal Alemã), para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSTOS CROMOGENICOS .

MEMÓRIA DESCRITIVA

A invenção descreve novos compostos cromogéni cos. Estes compostos são apropriados como substratos enzimáti cos para fins de diagnóstico por meio da identificação de enzimas proteolíticos. Os novos compostos de acordo com a inven ção destinam-se principalmente à determinação quantitativa de end oproteases, especialmente daquelas que provocam a cisão de péptidos e de proteínas antes de aminoácidos como arginina, lisina ou aminoácidos com grupos laterais aromáticos. Estes compostos cromogénicos podem por isso utilizar-se para a quan tificação de reacções em que se formam, se consomem ou se ini bem os enzimas acima mencionados.

No estado actual do conhecimento, servem para este fim, os cromóforos ligados através de ligações amida a péptidos ou derivados pepíidicos, que podem ser cindidos por meio de enzimas proteolíticos. Conhecem-se em particular subs tratos peptídicos a partir dos quais os enzimas mencionados

N.

ϊ podem cindir grupos quantificáveis fotométrica ou fluorimêtri camente (EPA 0046 7^2, DE 32 44o 30 Al). Para a determinação fotométrica de enzimas utilizam-se até ao momento, de preferência, derivados peptídicos da p-nitroanilina. A p-nitroanilina libertada por via enzimática mede-se a um comprimento de onda de 405 ^nm· Os substratos cromogénicos têm como requisitos importantes uma boa solubilidade nas condições do ensaio, alta especificidade e sensibilidade na identificação, bem como facilidade de manejo e detecção. No caso dos substratos até agora utilizados estes requisitos estão insufucientemente preenchidos e como tal necessitam de ser melhorados.

È particularmente desvantajosa a determinação fotométrica da p-nitroanilina ou dos seus derivados, uma vez que a medição a 4 05 nm é afectada ou impossibilitada por exem pio pela presença de componentes do plasma ou de outros líqui dos corporais. Para a quantificação fotométrica acima de 580 nm encontram-se já substâncias descritas, nas quais se verifi ca uma formação de corantes por reacções químicas após a cisão do substrato. Estas reacções permitem, contudo, apenas uma determinação no ponto final, uma vez que o decurso cinéti oo da reacção enzimática é muitas vezes afectado ou pelo menos dificultado pela adição de compostos químicos orgânicos ou inorgânicos (EPA 00 76 0^2; H. C. Kwaan et al., Thromb. Res. 1£, 5-13, 1978).

propósito desta invenção é o de obter compostos cromogénicos de elevada solubilidade e especificidade, que permitam determinar, de forma qualitativa e quantitativa, enzimas proteolíticos na presença de sangue, componentes do plasma e outros líquidos corporais.

objectivo da invenção são por isso os compostos de fórmula geral (i) (I) x-a-b-c-n

na qual

X significa um átomo de hidrogénio, um grupo que bloqueia de forma irreversível um grupo amino terminal, ou um grupo de protecção habitual em química de péptidos, como por exemplo Boc-, Z- ou Fmoc-,

A e B podem ser iguais ou diferentes, e significam um aminoácido alfa, beta ou gama, constituído por 2 a 15 átomos de carbono, com até 4 átomos de azoto, 2 átomos de enxofre e 6 átomos de oxigénio, cujas cadeias la terais podem ser substituídas, e B significa, conforme o caso, um dipéptido formado a partir destes aminoácidos,

C significa arginina, lisina, tirosina, fenilalanina ou triptofano, bem como os seus homólogos,

R^ e Rg são iguais ou diferentes, e significam um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo com até 4 átomos de carbono,

significam hidrogénio, um grupo alquilo, um grupo alquiloxi ou um halogéneo,

Y significa oxigénio

An significa um anião, por exemplo cloreto ou acetato, bem como os respectivos sais solúveis em água, como por exemplo formiato, acetato ou cloreto.

Nos compostos de acordo com a invenção está presente um cromóforo heteroaromático. Com isso obtêm-se vanta gens apreciáveis em relação aos compostos até agora utilizados. Descobriu-se surpreendentemente que, por acoplamento de um aminoácido a um cromoforo do tipo da formula (li).

	Γ⁸	?5
•	R?
H-	—NH	XX		XX
		T		t	1 * An (li)
		^r6		Rg	k
em que
^R1 - ®8	e Y	possuem	os	significados acima mencionados, se ob-

tém um desvio hipsodrómico de 7θ ^nm ou mais. Isto significa que compostos azuis isoladamente, apresentam na forma peptídi ca ligada uma cor vermelha. 0 objectivo da invenção são por isso substâncias de fórmula I, que contêm o corante ligado de forma covalente de acordo com a formula II e que se caracteri zam por os máximos de absorpção do corante livre e do corante ligado apresentarem uma diferença de 7θ ^{nm ou} mais e por o comprimento de onda de absorpção do cromoforo livre ser superior a 550 nm. Devido a esta absorpção a elevado comprimento de onda é possível, entre outras, a determinação pela técnica de fotodiodo ou a determinação ref1ectométrica de tiras teste. Uma determinação deste tipo a baixos comprimentos de onda,por exemplo a 405 nm, não é possível. As propriedades espectrais favoráveis possibilitam a medição das actividades enzimáticas na presença de líquidos corporais, por exemplo no sangue, uma vez que o comprimento de onda de absorpção do sistema corante está suficientemente afastado do comprimento de onda de absor pção da hemoglobina. Também é vantajosa a possibilidade de fa zer a determinação com sistemas fotométricos tradicionais. Os coeficientes de extinção molar dos corantes (fórmula II) são superiores cerca de 6 a 10 vezes ao da p-nitroanilina.

As vantagens mencionadas em relação aos com postos habitualmente utilizados, são ainda reforçadas pelo facto de os compostos de acordo com a invenção serem extremamente solúveis e de os substratos apresentarem uma especifici dade superior.

Os compostos de acordo com a invenção prepaiam -se de acordo com os métodos habituais da química dos péptidos. Os aminoácidos empregues existem, salvo indicação em contrário, de preferência na forma-L. A expressão aminoácidos aplica-se a aminoácidos alfa, beta ou gama, constituídos por 2 a 15 átomos de carbono com até 4 átomos de azoto, 2 átomos de enxofre e 6 átomos de oxigénio.

Os aminoácidos definidos em A e B, são não só os que ocorrem naturalmente mas também podem ser aminoácidos como por exemplo ácido pipecolínico, ácido azetidinocarboxíli co ou fenilglicina.

Os novos compostos cromogénicos contêm, de acordo com a invenção, um grupo cromóforo derivado da dibenzo -1,4-oxazina(fenoxazina). Como se representa na fórmula II, estes sistemas corantes possuem um grupo auxocrómico, especâal mente um grupo dialquilamino, e um grupo amino colocado sime tricamente em relação ao grupo dialquilamino. Os grupos R^-Rq representados na fórmula II, podem ser iguais ou diferentes e significar átomos de hidrogénio, átomos de halogéneo, grupos alquilo com até 3 átomos de carbono e 7 átomos de hidrogénio ou grupos alquiloxi com até 3 átomos de carbono e 7 átomos de hidrogénio. 0 grupo amino primário do sistema aromá tico é capaz de, de acordo com a invenção, formar ligações amida com aminoácidos ou com péptidos.

Por isso, é também um objectivo da invenção , um processo para a preparação dos substratos cromogénicos de acordo com a invenção, caracterizado por se fazerem reagir de rivados da fenoxazina de acordo com a fórmula II com aminoáci • dos, derivados de aminoácidos ou péptidos protegidos. Os gruι pos reactivos, que não devem reagir durante a preparação dos aminoácidos C-terminais nos grupos amino primários do corante, devem proteger-se em relação à sua reactividade. Como grupos de protecção temporários utilizam-se de preferência grupos protectores do tipo uretano. Entre estes contam-se por exemplo o grupo ter-butoxicarbonilo, o grupo benziloxicarbonilo ou o grupo bifenililpropiloxicarbonilo» Os grupos laterais reactivos dos aminoácidos ou dos péptidos podem também conter grupos protectores com vista à continuação da síntese peptídica, que, se necessário, só se removem no fim da síntese. Pode assim proteger-se, por exemplo, o grupo guanidino da arginina com o grupo nitro, o grupo tosilo ou por protonação, os grupos carboxilo do ácido asparagínico e do ácido glutâmico por esterif icação, os grupos amino da omitiria e da lisina por grupos protectores do tipo uretano e o grupo fenólico da tiro sina por esterificação. A escolha da combinação dos grupos protectores depende dos casos específicos das técnicas conhecidas habituais na química dos péptidos, de modo que os grupos protectores acima mencionados são apenas exemplos, uma vez que a sua variedade é consideravelmente maior.

A formação das ligações amida ou peptídicas efectua-se de acordo com os métodos usuais na química dos péptidos. Normalmente activam-se os grupos carboxilo dos aminoá eidos ou péptidos protegidos e fazem-se reagir com os grupos amino dos parceiros reaocionais. A activação dos grupos carbo xilo faz-se por exemplo pela técnica da carbodiimida, da azida, do anidrido, do cloreto de acilo ou do éster activo, ocor rendo as reacções de acoplamento entre os reagentes.nos solventes habituais, como por exemplo dimetilformamida, cloreto de metileno, clorofórmio, piridina, sulfóxido dimetílico ou hexametilenofosfotriamida, ou nos seus derivados, conforme o caso na presença de bases. No ânibito do processo de acordo com a invenção, os derivados da fenoxazina utilizados como reagentes de partida, podem ainda transformar-se nos isociana tos correspondentes, que reagem com aminoácidos N-protegidos.

Utilizam-se de preferência, como cromóforos, f

os derivados da fenoxazina, com as seguintes estruturas:

CH^
3
		N-CH_oCH_q+ 23
		ch₂ch₃

ou

ch₂ch₃

Colour índex Basic Blue x(ZnClJ)/2

Colour índex Basic Blue 124 x(ZnClJ“)/2

Estes cromóforos de cor azul escura fazem-se reagir de preferência com aminoácidos protegidos de acordo com o processo DCC/HOBt para se obterem compostos de cor vermelha. No caso de se utilizar o aminoácido arginina, protege, Q.

-se o grupo -Ν'* com o grupo Boc-, Z-, ou Fmoc- e o grupo -N com o grupo nitro-, Di-Z-, ou Mtr-. No caso da lisina, escolhe-se a combinação de grupos protectores Boc/Z.

Para ambos os cromóforos, tanto o Colour índex Basic Blue 49 como o Colour índex Basic Blue 124, obtiveram-se compostos análogos do ponto de vista das suas propriedades espectrais, cujos máximos de absorção diferiam de menos de 5 nm, Assim estes córantes, num sistema fisiológico tamponizado, apresentam uma absorção a cerca de 625 nm, enquanto os compostos ligados a péptidos absorviam a 545 nm.

A formação dos substratos di-, tri- ou tetra-peptídeos pode processar-se por passos, isto é, introduzindo aminoácidos protegidos activados ou, com vantagem, por inclusão de oligopéptidos protegidos activados. Os aminoácidos N-terminais existem de preferência na forma-D ou possuem um grupo protector ou um grupo que fecha o N-terminal, como por exemplo to silo, benzoilo, acetilo, benzoiloxicarbonilo.

A remoção dos grupos protectores permanentes,

- 7 eventualmente a separar, efectua-se de preferência no fim da síntese. Os grupos protectores hidrolisáveis em meio ácido re movem-se com HC1 l,2N/AcOH ou com ácido trifluoroacético. Os grupos protectores separáveis por hidrogenolise removem-se com passagem de hidrogénio com paládio sobre carvão activado, desaparecendo as propriedades corantes do cromáforo de modo reversível.

Do ponto de vista da facilidade de remoção dos grupos de protecção de N -, os grupos hidrolisáveis em condições ácidas moderadas, mostram-se como os mais convenien

G ~~ tes. Em particular, o grupo N -Mtr teçi, nestas condições, um comportamento vantajoso.

Nos exemplos seguintes ilustra-se a preparação dos substratos peptídicos. (Para as abreviaturas utilizadas veja-se a pág. 18).

Exemplo 1

Triacetato de 7~(D-fenilalanil-L-prolil-L-arginilamino)-3-dietilamino-8-metilfenoxazónio

Passo A: Hemitetraclorozincato de triacetato de 7-(N^-Boc-Νθ-Mtr-arginilamino)-3-dietilamino-8-metilfenoxazónio . G

Dissolvem-se 4,3 g de N-Boc-N -Mtr-L-arginina, 2,5^ g de hemitetraclorozincato de 7-amino-3-dietilamino-8-me tilfenoxiazónio e 1,22 g de HOBt em 100 ml de DMF e adiciona-se 1,1 ml de NMM. Arrefece-se a mistura reaccional num banho de gelo e adiciona-se 2,1 g de DCC. Apás 2 horas aquece-se à temperatura ambiente e continua a processar-se a reacção de acoplamento durante 6 horas. Separa-se o DCU precipitado por filtração e evapora-se o solvente em vácuo. Toma-se o resíduo etn butanol, extrai-se três vezes com água e concentra-se em vácuo até um volume pequeno. Precipita-se o produto com aceta to de etilo, filtram-se os cristais e seca-se em alto vácuo.

Rendimento» 4,7 g

Caracterização 5 DC Rf = 0,15 (b)

Rf - 0,39 (A)

G

Passo B» Dicloridrato de 7~N -Mtr-arginilamino-3~dietilamino-8-metilfenoxiazónio

Trata-se 1,2 g do produto obtido no passo A com 5θ ml de HCl/AcOH 1,2N durante 3θ minutos. Evapora-se o reagente hidrolisante em vácuo e arrasta-se duas vezes com to lueno. Após liofilização obtém-se 950 mg de um pó cristalino vermelho.

Controle de pureza» DC Rf - 0,17 (a)

Gr Passo Cí Cloridrato de 7-(N^K-Boc-D-fenilalanil-L-prolil-N -Mtr-arginilamino)~3~dietilamino-8~metílfenoxazónio

Dissolvem-se 720 mg do produto obtido no passo B, juntamente com 135 mg de HOBt e 362 mg de Boc-D-Phe-OH em 25 ml de DMF e arrefece-se a 4°C em banho de gelo. Adiciona-se 45 mg de DCC e agita-se durante 2 horas a 4 C e durante 12 horas à temperatura ambiente. Separa-se o DCU precipitado por filtração e evapora-se o solvente. Cromatografa-se o resí duo oleoso sobre sílica gel (100 g de sílica gel 60, 40-63 /um, eluente D). Para posterior purificação cromatografa-se o produto em (^S%ephadex LH20 (MeOH).

Rendimento » 290 mg

Controle de pureza» DC Rf =s 0,48 (d)

Passo D: Triacetato de 7“(D-fenilalanil-L-prolil-L-arginilamino)-3~dietilamino-8-metilfenoxazónio

Tratam-se 200 mg do substrato obtido no passo C, após secagem simples, com 4,5 ml de ácido trifluoroacético e 0,5 ml de anisole durante 4 horas a 4o°C. Destila-se o áci- 9 Λ do em vácuo e purifica-se o resíduo por cromatografia de permuta iónica em celulose CM (Whatman CM 32, gradiente de aceta to de amónio de 0,01 M a pH 4,5 a 0,3 M a pH 6,8). Remove-se o tampão de eluiçao por liofilização repetida.

Rendimentos 135 mg de pó vermelho

Controle de pureza: DC Rf = 0,27 (20/10/2/1)

Análise de aminoácidos; Phe = 0,98

Pro = 1,04

Arg = 1,00 Teor peptícico = 96%

Exemplo 2

Diacetato de 7~(L~alanil-L-alanil-L-fenilalanil)-2-dietilamiηο-8-metil-fenoxazónio

Passo 1 Hemitetraclorozincato de 7~(Boc-L-fenilalanil)-3~dietilamino-8-metil-f enoxazónio

Dissolvem-se 1,33 g de Boc-L-Phe, 1,41 g de hemitetraclorozincato de 7~amino-3“dietilamino-8-metil-fenoxa zónio e 0,76 g de HOBt em 5θ ml de DNF e arrefece-se a 0°C. Adicionam-se 0,55 ml de NMM e 1,05 g de DCC. Agita-se a mistu ra reaccional em banho de gelo durante 2 horas e à temperatura ambiente durante 3 horas. Filtra-se o DCU precipitado, con centra-se o filtrado e dissolve-se o resíduo em MeOH. Precipi ta-se o produto por adição de éter. Filtram-se os cristais e secam-se em alto vácuo.

Rendimento: 1,95 g

Controle de pureza; DC Rf = 0,77 (c)

Passo 2 Dicloridrato de 7-L-fenilalanil-3~dietilamino-8-metil-fenoxazónio

Agita-se 1,8 g do produto obtido no passo 1, após remoção do grupo Boc, com 50 ml de HCl/AcOH, durante 25 minutos. Destila-se o reagente hidrolisante em vácuo e arrasta-se duas vezes o produto oleoso com tolueno. Toma-se o resí duo em água e extrai-se duas vezes com uma mistura de butanol/ acetato de etilo (l:2/razão volumétrica). Liofiliza-se a fase aquosa.

Rendimento: 1,65 g

Controle de pureza: DC Rf = O,2ó (d)

Passo 3 Cloridrato de y-Boc-L-alanil-L-alanil-L-fenilalanil-3~dietilamino-8-metil-fenoxazonio

Dissolve-se 1 g de Boc-Ala-Ala-OH, 0,58 g de HOBt e 1,6 g do produto obtido no passo 2 em 5θ ml de DMF e arrefece-se em banho de gelo. Adiciona-se 0,8 g de DCC e 420 pl de NMM e agita-se uma hora em banho de gelo e 4 horasâtem peratura ambiente. Filtra-se a parte insolúvel e evapora-se o solvente em vácuo. Cromatografa-se o resíduo oleoso sobre sílica gel (100 g de sílica gel, 4o-63 pm, eluente D). Para purificação posterior cromatografa-se o produto sobre ^^Sephadex LH20 (MeOH).

Rendimento: 820 mg

Controle de pureza: DC Rf = 0,45 (d)

Passo 4 Diacetato de 7-L-alanil-L-alanil-L-fenilalanil-3-dietilamino-8-met ilf eno xazónio

Agita-se 300 mg do produto obtido no passo 3 ein 20 ml de HCl/AcOH durante 25 minutos. Destila-se o ácido em vácuo e removem-se os vestígios ácidos por destilação com tolueno (duas vezes). Purifica-se o resíduo por cromatografia de permuta iónica (Whatman CM 32, gradiente de acetato de amo nio de 0,01 M a pH 4,5 a 0,3 M a pH 6,8). Obtém-se o produto puro cristalino por liofilização.

Rendimento: 160 mg

Controle de pureza: DC Rf = 0,53 (20/10/2/1)

Análise de aminoácidosj Ala 2,00

Phe 1,00

Teor peptídico: 0,89

De modo análogo preparam-se os compostos/substractos apresentados na Tabela I

TABELA

•H


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py ro-Glu-Gly-Arg-pNA - 0,30 0,00 0,01 0,01 0,01

Tos-Gly-Pro-Arg-Blue 49 - 0,76 0,15 0,02 0,095 0,02

Abreviaturas

pNA	p-nitroanilina (para-nitroanilina)
Blue	49 hemitetraclorozincato (ou -acetato) de 7~amino-3-die tilamino-8-metilfenoxazónio
Blue	124 hemitetraclorozincato (ou -acetato) de 7~amino-3-die
n^g	tilamino-8-metoxifenoxazónio grupo azotado da função guanidino da arginina
Mtr	4-metoxi-2,3,ó-trimetilfenilsulfonilo
Boc	t er-butiloxicarbonilo
HOBt	hid ro xib enzo t riazol e
DMF	dimetilformamida
NMM	N-metilmorfolina
DCC	diciclohexilcarbodiimida
DCU	diciclohexilureia
DC	cromatografia em camada fina
^F Ac OH	factor de retenção ácido acético
Me OH	metanol
OD	densidade óptica
Z	carbobenzoxi-
Fmoc	9-fluoreniloxicarbonilo

Fluentes para a cromatografia em camada fina:

A butanol/ácido acético/água 3:1:1 (partes em volume)

B clorofórmio/metanol/ácido acético 50:10:5(partes em volume)

C clorofórmio/metanol/ácido acético 50:10: 2,5(partes em volume) D clorofórmio/metanol/ácido acético 50:15í3(partes em volume)

As abreviaturas dos aminoácidos estão de acor do com as regras IUPACIUB (Biochem. J. 219» 3^5-373, 1984).

Claims

- 15 REIVINDICAÇÃO

Processo para a preparação de um composto de fórmula (l) *7 (I) na qual

X significa um átomo de hidrogénio, um grupo que bloqueia de forma irreversível um grupo amino terminal, ou um grupo de protecção habitual em química de péptidos, como por exemplo Boc-, Z- ou Fmoc-,

A e B podem ser iguais ou diferentes e significam um aminoácido alfa, beta ou gama, constituído por 2 a 15 átomos de carbono, com até 4 átomos de azoto, 2 átomos de enxofre e 6 átomos de oxigénio, cujas cadeias la terais podem ser substituidas, e B significa, conforme o caso, um dipéptido formado a partir destes aminoácidos,

C significa arginina, lisina, tirosina, fenilalanina ou triptofano, bem como os seus homólogos,

R^ e Rg são iguais ou diferentes e significam um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo com até 4 átomos de carbono,

R„ até Rg são iguais ou diferentes e significam hidrogénio, um grupo alquilo, um grupo alquiloxi ou um halogéneo, • Y significa oxigénio e

An significa um anião, bem como dos seus sais solúveis em agua, caracterizado por se condensar um derivado de aminoácido de fórmula (li)

Rg ^R5 1 A H - C - NH T _ ⁽ⁱⁱ⁾ • I * An ^Ró ^R3 R₂ na qual R^ a Rg, An , Ύ e C possuem os mesmos significados que na fór

mula (i), podendo contudo ainda os grupos reactivos dos amino ácidos estarem bloqueados por grupos protectores, com um oligopéptido de fórmula geral (lll)

X - A - B - OH (III) em que

X, A e B têm os significados acima mencionados, mas X não è hidrogénio e sim um grupo protector ou um grupo que fecha de forma irreversível o N-terminal, ou com um aminoácido protegi do, correspondente â fórmula geral (iv)

X - A - OH (IV)

X - B - OH em que X, A e B possuem os significados acima mencionados.

A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alemã em 28 de Agosto de 1986, sob o n^ P 36 29 175.7.

Lisboa

26 de Agosto de 19θ7

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSTOS CROMOGÉNTCOS

RESUMO paração

A invenção refere-se a um processo para a pre de um composto de fórmula (i)

X - A - B - C (I) e dos seus sais solúveis em água, que compreende condensar-se um derivado de aminoácido de fórmula (li) (II) com um oligopéptido de fórmula geral (ill)

X - A - B - OH (III) ou com um aminoácido protegido, correspondente à fórmula geral (IV)