HU197757B

HU197757B - Process for producing chromogen compounds

Info

Publication number: HU197757B
Application number: HU873779A
Authority: HU
Inventors: Werner Stueber; Dieter Schnaitmann
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1986-08-28
Filing date: 1987-08-27
Publication date: 1989-05-29
Also published as: AU602527B2; EP0258784B1; PT85588A; CA1323726C; ATE83245T1; ES2052529T3; EP0258784A2; DE3629175A1; US5097014A; DE3782988D1; JP2561928B2; AU7762787A; DD279485A5; US5334506A; JPS6368600A; ZA876393B; EP0258784A3; HUT45269A; PT85588B

Description

A találmány új kromogén vegyületek előállítására vonatkozik. Az új vegyületek diagnosztikai célokra enzim-szubsztrátumként alkalmazhatók, például proteolitikus. enzimek kimutatására, főleg endoproteázok mennyiségi meghatározására, különösen olyan endoproteázoké, amelyek peptideket és proteineket aminosavak, így arginin, lizin vagy aromás oldalláncú aminosavak után hasítanak. A kromogén vegyületek tehát minden olyan reakció kvantitatív meghatározására alkalmazhatók, ahol a fenti enzimek keletkeznek, elfogynak vagy inhibitálódnak.

A fenti célokra — a technika állása szerint — aminkötéssel peptidekhez vagy peptidszármazékokhoz kapcsolt, proteolitikus enzimekkel lehasítható kromofórok használatosak. így például olyan peptidszubsztrátumok ismeretesek, amelyekről az említett enzimek fotometriásan vagy fluorimetriásan mennyiségileg meghatározható csoportokat hasítanak le (0046 742 számú közzétett európai szabadalmi bejelentés, 32 440 30 számú NSZK-beli közrebocsátási irat). Enzimek fotometriás meghatározására mindezidáig többnyire a paranitranilin peptidszáramazékait alkalmazták. Az enzimmel lehasított para-nitranilin 405 nm hullámhosszon mérhető. A kromogén szubsztrátummal szemben támasztott követelmények egyike az, hogy a teszt-közegben jól oldódjék, továbbá hogy nagy érzékenységű, specifitású, valamint könnyen kezelhető és detektálható legyen. Az eddig alkalmazott szubsztrátumok esetében ezek a feltételek nem kielégítő módon teljesülnek, ezért igény mutatkozik jobb szubsztrátumok iránt.

A para-nitranilin, illetve származékai esetén főleg a fotometriás kiértékelés hátrányos, mert a 405 nm-nél történő mérést plazma-alkotók és egyéb testnedvek zavarhatják. Az 580 nm-nél történő mennyiségi meghatározás céljára már ismertek olyan anyagok, amelyek a szubsztrátum hasítása után kémiai reakciók eredményeként elszíneződnek, de ezek a reakciók csak a végpont felismerését teszik lehetővé, tekintettel arra, hogy a' szerves vagy szervetlen vegyszerek adagolása az enzimes reakció kinetikai követését gyakran zavarja vagy lehetetlenné teszi (76 042 számú, közzétett szabadalmi leírás; H.C. Kwaan et al., Thromb. Rés. 13, 5—13, 1978).

A találmány feladata jól oldódó, előnyös specifitású kromogén vegyületek felkutatása volt, amelyekkel vér, plazma-alkotók vagy egyéb testnedvek jelenlétében proteolitikus enzimek minőségileg és mennyiségileg meghatározhatók.

A fenti célra alkalmasnak az (I) általános képletü vegyületeket találtuk. Az (I) általános képletben

X jelentése hidrogénatom, 2—5 szénatomos alkoxikarbonil-, benziloxikarbonil- vagy p-toluol-szulfonil-védöcsoport,

A és B jelentése az L-Ala kivételével eltérőek és

A jelentése Gly, L-Ala, D-Ala, D-Val, D-Leu, D-Ile, D-Phe, D-Pro, L-Glp, B jelentése Gly, L-Ala, L-Leu, L-Phe, L-Tyr, L-Pro, L-Pip, L-Glu-Gly, L-Leu-L-Pro,

C jelentése L-Arg, L-Phe vagy L-Lys,

R⁷ jelentése metil- vagy metoxicsoport, és

An~ jelentése acetát-, klorid- vagy egy egyenértéknyi ZnCIjüon.

Az (I) általános képletü vegyületek lényeges eleme a heteroaromás kromofór, amely a technika állását meghaladó előnyöket biztosít. Meglepő módon azt találtuk, hogy ha a (II) általános képletü kromofórhoz — a (II) általános képletben R⁷ jelentése a fenti — aminosavat kapcsolunk, legalább 70 nm-nyi hipszokróm eltolódás jön létre. Ez azt jelenti, hogy az eredetileg kék színezék peptidkötésben piros színt mutat. A fentiek szerint a találmány (I) általános képletü vegyületek előállítására vonatkozik. Az (I) általános képletü vegyületek a (II) általános képletü színezéket kovalens kötéssel kötve tartalmazzák; a szabad és a kötött színezék abszorpciós hullámhossza között legalább 70 nm eltérés van, és a szabad kromofór abszorpciós hullámhossza 550 nm-nél hosszabb. Tekintettel arra, hogy az abszorpciós maximum hosszabb hullámok felé tolódott el, a tesztcsíkok fotodióda-technikával vagy reflektometriás úton is kiértékelhetők; ez a rövid hullámú tartományban, például 405 nm-nél nem lehetséges. A kedvező spektrális tulajdonságok lehetővé teszik az enzim aktivitás testnedvek, például vér jelenlétében történő mérését, mert a színezék, rendszer abszorpciós hullámhossza a hemoglobin abszorciós hullámhosszától eléggé távol van. Előnyös a hagyományos fotométer-rendszerekkel történő kiértékelés lehetősége. A (II) általános képletü színezékek morális extinkciós együtthatója a para-nitranilinét a 6—10szeresen meghaladja.

Előnyös továbbá, hogy az (I) általános képletü vegyületek igen jól oldódnak és szubsztrátumként igen kedvező specifitást mutatnak.

Az (I) általános képletü vegyületeket a peptidkémiában szokásos módszerekkel állítjuk elő. Az alkalmazott aminosavak — amennyiben másképp nem tüntetjük fel — előnyösen L-konfigurációjúak. Az aminosav kifejezés itt többnyire természetes aminosavat jelent.

Az új kromogén vegyületek a dibenzo-1,4oxazmtól (fémoxazin) leszármaztatható kromofór csoportot tartalmaznak. Amint a (II) általános képlet mutatja, az ilyen színezék auxokróm csoportot, különösen dialkil-amino-csoportot, és a dialkil-amino-csoporthoz képest tükörszimmetrikusan elhelyezkedő aminocsoportot tartalmaz. Az aromás váz primer aminocsoportja képes aminosavakkal, illetve peptidekkel amidkötés kialakulása közben reagálni.

-2197757

A találmány tehát eljárás (I) általános képletű, kromogén szubsztrátumok előállítására. A találmány szerinti eljárásra jellemző, hogy egy (11) általános képletű fenoxazinszárazékot védett aminosawal, aminosavszármazékkal vagy pepiiddel reagáltatunk. Azokat a csoportokat, amelyeket a C-terminális aminosavnak a színezék primer aminocsoportjához történő kapcsolása közben nem kívánunk reagáltatni, reaktivitásuknak megfelelően védeni kell Ideiglenes védőcsoportként előnyösen uretántípusú, védőcsoportot, például a terc-butiloxikarbonil-csoportot, a benziloxikarbonilcsoportot vagy a bifenil-propiloxikarbonil-csoportot alkalmazzuk. Az aminosavak, illetve peptidek reakcióképes oldalláncait a további peptidszintézis miatt is elláthatjuk védőcsoportokkal. így az arginin guanidinocsoportját nitrocsoporttal tozilcsoporttal vagy protonálás útján védhetjük, az aszparaginsav és glutaminsav karboxil csoportját észterezhetjük, az ornitin és a lizin aminocsoportját uretán típusú védőcsoporttal védhetjük, és a tirozin fenolos csoportját éterezhetjük. A védőcsoport-kombinációt a peptidkémia szokásos, ismert technikáinak az adottságaitól függően választjuk meg, a fenti felsorolás csak példaképpen szerepel.

Az amid-, illetve peptidkötések kialakítását a peptidkémiában szokásos módszerek szerint végezzük. Általában a védett aminosav, illetve pepiid karboxilcsoportját aktiváljuk és a reakciópartner aminocsoportjával reagáltatjuk. A karboxilcsoportok aktiválása például karbodiimid-, azid-, anhidrid-, savklorid- vagy aktívészter-módszer szerint történhet; a komponensek kapcsolását a szokásos oldószerek, így dimetil-íormamid, diklór-metán, kloroform, piridin, dimetil-szulfoxid vagy hexametilén-foszforsav-triamid jelenlétében végezzük, adott esetben bázis adagolása mellett. A találmány szerinti eljárás keretében a kiindulási anyagként alkalmazott fenoxinszármazékokat a megfelelő izocianátokká is alakíthatjuk, majd ezeket az N-terminálisan védett aminosavval reagáltatjuk.

Kromofórként a (III), illetve a (IV) képletű színezéket (Colour Index Basic Blue 49 és Colour Index Basic Blue 124) alkalmazzuk. Ezek mélykék kromofór vegyületek, DCC/ /HOBt-eljárással védett aminosawal reagáltatva piros vegyületet kapunk. Aminosavként arginint alkalmazva az N^-csoportot Boc-, Zvagy -Fmoc-csoporttal, az N^s -csoportot nitro-, Di-Z- vagy Mtr--csoporttal védjük, míg lizin alkalmazása esetén a Boc/Z kombinációt választjuk.

A (III) és a (IV) képletű kromofór felhasználásával kapott (I) általános képletű vegyületek a spektrális tulajdonságaikban alig különböznek egymástól, az abszorpciós maximumok között 5 nm-nél kisebb a különbség. Fiziológiás puffer-rendszerben a színezékek abszorciója 625 nm-nél van, míg a peptidkötéssel kötött színezék abszorciója 545 nm-nél jelentkezik.

A di-, tri-, tetrapeptid-szubsztrátumok felépítése lépcsőzetesen, tehát védett, aktivált aminosavak bevitelével történhet. Előnyösen azonban védett, aktivált oligo-peptideket alkalmazunk. Az N-terminális aminosavak előnyösen D-formájúak, vagy pedig védőcsoporttal vagy az N-terminálist irreverzibilis módon blokkoló csoporttal, például tozil-, benzoil, acetil-, benzoiloxi-karbonil-csoporttal rendelkeznek.

Az adott esetben lehasítani kívánt permanens védőcsoport lehasítását előnyösen a szintézis végén végezzük. Acidolitikusan eltávolítható védőcsoportokat 1—2 π HC1, ecetsav vagy trifluorecetsav segítségével hasítunk le. Hidrogenolitikúsan eltávolítható védőcsoportokat palládium csontszén katalizátor jelenlétében végzett hidrogénezéssel távolítjuk el; eközben a kromofór színe ideiglenesen eltűnik. Az N^s-védőcsoport minél kíméletesebb eltávolítása érdekében előnyösen olyan csoporttot választunk, amely enyhén savas körülmények között már lehasad. Különösen előnyös nek az N^G-Mtr-csoport bizonyult.

A találmányt az alábbi példákkal közelebbről ismertetjük. (Lásd alkalmazott rövidítések).

1. példa

7- (D-feniialanil-L-propil-L-arginilamino) -3-dieitlamino-8-metiI-íenoxazónium-triacetát

A lépés

7- (N*-Boc-N-Mtr-L-arginiIamino) -3-dietilamino-8-metil-fenoxazónium-triacetát-hemitetraklórcinkát

4,3 g N-Boc-N^e-Mtr-L-arginin, 2,54 g 7-amino-3-dietilamino-8-metil-fenoxazónium-hemitetraklórcinkát és 1,22 g HOBt 100 ml dimetil -formamiddal készített oldatához 1,1 ml N-metil-morfoIint adunk, az elegyet jeges fürdőn hütjük, majd 2,1 g diciklohexif-karbodiimidet adunk hozzá. Két óra elteltével a reakcióhelyet szobahőmérsékletre melegítjük és ezen a hőfokon 6 órán át állni hagyjuk. A kivált diciklohexil-karbamidot kiszűrjük, és az oldószert vákuumban bepároljuk. A maradékhoz butanolt adunk, az oldatot vízzel háromszor extraháljuk, majd vákuumban kis térfogatra betöményítjük. A terméket etil-acetáttal kicsapjuk, a kristályokat kiszűrjük és nagyvákuumban szárítjuk. Hozam: 4,7 g; vékonyréteg-kromatográfiásan meghatározott R,-értékek: A-oldószerelegyben Rf = 0,15; B-oldószerelegyben R, = 0,39.

β lépés

7-N^G-Mtr-arginilamino-3-dimetilamino-8-metil-fenoxazónium-hidroklorid

Az A-lépés szerint kapott termék 1,2 g-ját 50 ml saveleggyel (1,2 n HCl/ecetsav) 30 percen keresztül kezeljük. A hídrólizálószert vákuumban elpárologtatjuk, kétszer toluolt adva az elegyhez. Liofilizálás után 950 mg piros kristályport kapunk. Vékonyréteg-kromatográfia: az A-oldószerelegyben R/ = 0,17 3

-3197757

C-lépés

7-(N°^c-Boc-D-fenilalariil-L-propil-N^G-Mtr-arginilamino)-3-dietilamino-8-metil-fenoxazónium-hidroklorid

A B-lépés szerint előállított termék 720 mg-ját 135 mg hidroxi-benzo-triazolla! és 362 mg Boc-D-Phe-Pro-OH-val együtt 25 ml dimetil-formamidban oldjuk, és az oldatot jeges fürdőn 4°C-ra hütjük. 215 mg diciklohexil-karbodiimid hozzáadása után az elegyet 4°C-on még két órán át, majd szobahőmérsékleten 12 órán át keverjük. A kivált diciklohexil-karbamidot kiszűrjük. Az oldószer elpárologtatósa után kapott olajos maradékot Kíeselgélen (lOOg Kieselgél 60, szemcseméret 40—63 μΐπ) a D-oldószereleggyel karomatografáljuk. A kapott termék további tisztítása Sephadex⁸LH20 adszorbensen metanollal történik. Hozam: 290 mg

Vékonyréteg-kromatográfia: D-oldószerelegyben R/ = 0,48

D-lépés

7-(D-fenilalanil-L-propil-L-arginilamino)-3-dietilamino-8-metil-fenoxazónium-triacetát A C-lépésben kapott szubsztrátum 200 mg-ját alaposan megszárítjuk, majd 40°C-on 4,5 ml trifluorecetsav és 0,5 ml anizol elegyével 4 órán át kezeljük. A savat vákuumban ledesztilláljuk és a maradékot CM-cellulózon (Whatman CM 32, ammónium-acetát gradiens 0,01 M (pH 4,5 és 0,3 M (pH 6,8) között tisztítjuk. Az eluáláshoz használt puffért többszörös liofilizá 1 ássál eltávolítjuk.

Hozam: 135 mg piros por

Vékonyréteg-kromatográfia: E-oldószerelegyben R/ = 0,27 aminosavelemzés: Pbe = 0,98 Pro = 1,04 Arg = 1,00 peptidtartalom: 96%

2. példa

7- (L-alanil-L-alanil-L-fenilalanil-amino) -2-dietilamino-8-metil-fenoxazóníum-díacetát

I-lépés

7- (Boc-L-fenilalanil-amino) -3-dietilamino-8-metil-fenoxazónium-hemitetraklórcinkát 1,33 g Boc-L-Phe, 1,41 g 7-amino-3-dietilamino-8-metil-fenoxazónium-hemitetraklórcinkát és 0,76 g hidroxi-benzo-triazol 50 ml dimetil-formamiddal készített oldatát 0°C-ra hütjük, majd 0,55 g N-metil-morfolint és 1,05 g diciklohexil-karobodiimidet adunk hozzá. A reakcióelegyet 2 órán át jeges fürdó'n, 3 órán át szobahőmérsékleten keverjük, utána a kivált diciklohexil-karbamidot kiszűrjük és a maradékot metanolban oldjuk. A terméket éter hozzáadásával kicsapjuk, a kristályokat leszivat6 juk és nagyvákuumban szárítjuk.

Hozam: 1,95 g

Vékonyréteg-kromatográfia: C-oldószerelegyben R> = 0,77

2. lépés

7-L-fenilalanil-amino-3-dietilamino-8-metil-fenoxazónium-dihidroklorid

Az 1. lépés szerint kapott termék 1,8 g-ját a Boc-csoport eltávolítása céljából 50 ml saveleggyel (1,2 n HCI/jégecetet) 25 percen át kezeljük. A reagenst vákuumban ledesztilláljuk, és az olajos terméket kétszer toluollal lepároljuk. A maradékot vízben oldjuk és az oldatot butanol és etil-acetát 1:2 térfogatarányú elegyével kétszer extraháljuk. A vizes fázist liofilizá lj uk.

Hozam: 1,65 g

Vékonyrétegkr.: D-oldószerelegyben Rf = 0,26

3- lépés

7- (Boc-L-alanil-L-alanil-L-fenilalanil-amino-3-dietilamino-8-metil-íenoxazonium-hidroklorid g Boc-Ala-Ala-OH, 0,58 g hidroxi-benzo-diazol és a 2. lépésben előállított termék 1,6 g-ját 50 ml dimetiiíormamidban oldjuk és az oldatot jeges fürdőn hűtjük. 0,8 g diciklohexil-karbodiimid és 420 μΐ N-metil-morfolin hozzáadása után az elegyet jeges fürdőn 1 órán keresztül, majd szobahőmérsékleten 4 órán keresztül keverjük, utána szűrjük. A szűrletet vákuumban bepároljuk. Az olajos maradékot Kíeselgélen (100 g Kieselgél, szemcseméret 40—63 μτη) a D-oldószereleggyel kromatografáljuk. A termék további tisztítása Sephadex^R LH20 adszorbensen metanollal történik. Hozam: 820 g

Vékonyréteg-kromatográfia: D-oldószerelegyben R, = 0,45

4- lépés

7- (L-alanil-L-alanil-L-feni la lanil-amino-. -3-dietil-amino-8-metil-fenoxazónium-diacetát

A 3. lépés szerint kapott termék 3 g-ját 20 ml savelegyben (1,2 n HCl/jégecet) 25 percen át keverjük. A savat vákuumban ledesztilláljuk, még megmaradt savnyomokat úgy tüntetjük ei, hogy a termék felől kétszer toluolt desztillálunk el. A maradékot ioncserélő kromatográfia segítségével (Whatman CM 32, ammóniumacetát gradiens 0,01 M (pH 4,5) és 0,3 M (pH 6,8) között) tisztítjuk. A tiszta termék liofilizá Sásakor kristályosán keletkezik. Hozam: 160 mg

Vékonyréteg-kromatográfia: E-oldószerelegyben R, = 0,53

Aminosavelemzés: Alá 2,06 Phe 1,00 peptidtartalom: 89%

Hasonló módon az alábbi táblázatban öszszefoglalt szubsztrátumokat állítjuk elő.

-4197757

1. táblázat

Szubszt rátum	kiindulási anyag
piro-Glu-Pro-Arg-Blue 49	pyro-Glu-Pro-Arg(Mtr)-Blue 49		0,04
Z-D-Leu-Gly-Arg-Blue 49	Z-D-Leu-Gly + H-Arg-Blue 49 x 3 TFÁ	0,4
Tos-Gly-Pro-Arg-Blue 49	Tos-Gly-Pro-Arg(Mtr,-Blue 49		0,04
D-Leu-Pro-Arg-Blue 49	Boc-D-Leu-Prc-Arg(Mtr)-Blue 49		0,07
D-Phe-Tyr-Arg-Blue 49	Boc-D-Phe-Tyr-Arg(Mtr)-Blue 49		0,15
D-Val-Leu-Lys-Blue 49	Boc-D-Val-Leu-Lys(Boc)-Blue 49		0,08
Z-D-Leu-Glu-Gly-Arg-Blue 49	Z-D-Leu-Glu(tBu)-Gly-Arg-Blue 49		0,42
D-Phe-Pro-Arg-Blue 124	Boc-D-Phe-Pró-Arg(Mtr)-Blue 124		0,09
D-Pro-Phe-Arg-Blue 49	Boc-D-Pro-Phe-Arg(Mtr)-Blue 49		0,08
D-Pro-Phe-Arg-Blue 124	Boc-D-Pro-Phe-Arg(Mtr)-Blue 124		0,07
D-Ile-Leu-Pro-Arg-Blue 49	Z-D-Ile-Leu-Pro-Arg(NOj)-Blue 49		0,1
D-Phe-Pip-Arg-Blue 49	Z-D-Phe-Pip-Arg(NO^)-Blue 49		0,09
D-Ala-Gly-Arg-Blue 49	Boc-D-Ala-Gly-Arg(NO₂)-Blue 49		0,08
D-Val-Tyr-Arg-Blue 49	Boc-D-Val-Tyr(tBu)-Arg(Mtr)-Blue	49	0,12
A szubsztrátum R^-értékét butanol,	jégecet és víz 3:1:1 tf-arányú elegyével	határoztuk

ioncserélő kromatográfia

A szubsztrátumok vizsgálata

800 μΐ 8,0 pH-jú pufferoldathoz (trisz-hidroxi-amino-metán 50 mmól/1) 37°C-on az enzimoldat 100 μΐ szubsztrátumoldatot (koncentráció: 2 mmól/1) adunk. A lehasított para-nitranilint 405 nm hullámhosszon, a Blue 49, illetve Blue 121 színezéket viszont 623 nm-nél. Az enzimes hasítás sebességét az optikai sűrűség percenkénti változásaként határozzuk meg. A (II) táblázatban néhány szubsztrátum és enzim relatív hasítási sebességét, azaz a szubsztrátum specifitását adjuk meg.

II. táblázat

Szintetikus szubsztrátum_urokináz

H-D-Phe-Pip-Arg-pNA

H-D-Phe-Pro-Arg-Blue 49 pyro-Glu-Pro-Arg-pNA

H-D-Leu-Pro-Arg-Blue 49 pyro-Glu-Pro-Arg-Blúe 49 1,0 pyro-Glu-Gly-Arg-pNA

Tos-Gly-Pro-Arg-Blue 49

Az alkalmazott rövidítések

Blue 49	7-amino-3-dietilamino-8-metil-fen- oxazónium-hemitetraklórcinkát
Blue 124	7-amino -3 -dietilamino -8 -metoxi-fenoxazónium-hemitetraklórc inkát
N	az arginin guanidinnocsoportjának nitrogéncsoportja
Mtr	4-metoxi-2,3,6-trimetilfenil-szul- fát
Boc	terc-butiloxikarbonil-csoport
HOBt	hidroxibenzotriazol
R/	retenciós tényező
Z	benziloxikarbonil-csoport
Fmoc	9-floureniloxikarbonil-csoport.

-protein	tromDiri	□lazmin	F Xc	kallikrein
C,075	0,41	0,035	0,025	0,11
Pt03	0,395	0,00	0,01	0,00
C , 40	0,41	0,53	0,04	0,51
C,47	0,09	0,015	0,035	0,015
C ,22	0,015	0,03	0,02	0,015
0,30	0,00	0,01	0,01	0,01
0,7S	0,15	0,02	0,095	0,02

A vékonyréteg-kromatográfiához használt oldószerelegyek összetétele:

A) butanol (jégecet) víz 3:1:1 térfogatarányú elegye

B) kloroform(metanol)jégecet 50:10:5 térfogatarányú elegye

C) kloroform (metanol) jégecet 50:10:2,5 tf-arányú elegye θθ D) kloroform (metanol) jégecet 50:15:3 tf-arányú elegye

E) kloroform(metanol/jégecet)víz 20:10:2:1 tf-arányú elegye

Az aminosavak rövidítései az IUPACIUB szabályozásának (Biochem. J. 219, 345—373, ⁶⁵ 1984) felelnek meg.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONT

Eljárás (I) általános képletű vegyületek, tetraklórcinkátjainak, acetátjainak és kloridjainak előállítására — az (I) általános képletben

X jelentése hidrogénatom, 2—5 szénatomos alkoxikarbonil-, benziloxikarbonil- vagy p-toluol-szulfonil-védőcsoport,

A és B jelentése az L-Ala kivételével eltérőek, és

A jelentése Gly, L-Ala, D-Ala, D-Val, D-Leu, D-Iie, D-Phe, D-Pro, L-Glp, B jelentése Gly, L-Ala, L-Leu, L-Phe, L-Tyr, L-Pro, L-Pip, L-Glu-Gly, L-Leu-L-Pro,

C jelentése L-Arg, L-Phe vagy L-Lys,

R⁷ jelentése metil- vagy meloxicsoport, és

An~ jelentése acetát-, klorid- vagy egy egyenértéknyi ZnCljj-ion —
5 azzal jellemezve, hogy egy (ΪΪ) általános képletü fenoxazinszármazékot — a (II) általános képletben C, R⁷ és An~ jelentése a fenti — egy (V) általános képletű oligopeptiddel — az (V) általános képletben A és B jelentése a fenti és
10 X uretán- vagy szulfonamid bázisú csoportot, előnyösen terc-butoxikarbonil-, benziloxikarbonil- vagy p-toluol-szulfonil-védőcsoportot jelent — vagy (megfelelő sorrendben) a két (VI) általános képletű védett aminosavval —
15 a (VI) általános képletben A és B jelentése a fenti és X jelentése a fent említett védőcsoportok egyike — kondenzálunk, majd kívánt esetben a védőcsoportot lehasítjuk.