PT85386B

PT85386B - Processo para a preparacao de um agente para a terapia da hemofilia a resistente ao factor viii

Info

Publication number: PT85386B
Application number: PT85386A
Authority: PT
Inventors: Norbert Heimburger; Karl-Heinz Wenz; Wilfried Wormsbacher
Original assignee: Aventis Behring Gmbh
Priority date: 1986-07-24
Filing date: 1987-07-23
Publication date: 2001-05-31
Also published as: ES2037035T3; DK384687A; ATE73673T1; FI87044B; DK166652B1; FI873222A; DE3777482D1; FI873222A0; JP2535547B2; AU607924B2; DE3625090A1; US5091363A; EP0255651B1; PT85386A; GR3004868T3; EP0255651A2; JPS6345224A; CA1321139C; AU7604987A; DK384687D0

Description

Memória descritiva referente à patente de invenção de BEHRING¥ ERKE AKTIENGE SELLSCHAFT,ale mã, industrial e comercial,co□ sede em D-3550 Marburg, República Federal Alemã# (inventores: Prof. Dr. Norbert Heimbur ger» Karlheinz Uenz e XfLlfried Uormsbâcher, residentes na República Federal Alemã)» para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM AGENTE PARA A TERAPIA DA HE MOFILIA A RESISTENTE AO FACTOR VIII.

memória descritiva

A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de um agente para o tratamento de pacientes com hemofilia A que não reagem ao tratamento habitual com fac tor VIII.

Cerca de ura quarto dos pacientes com hemofilia A que são tratados com concentrados de factor VIII desen- | volvem a chamada hemofilia de corpos de inibição. Esta é cara cterizada pelo facto de no sangue dos pacientes circularem isoanticorpos não precipitantes contra a sub-unidade da molécula do factor VIII que transporta a actividade coagulante (F VIIIsC). Estes anticorpos, que se encontram no plasma de hemo fílicos em concentrações que podem chegar a ser muito eleva•j das, nomeadamente de 100 até vários 1000 U/ml, neutralizam a .! actividade correspondente do F VIII quando este é administra

N.

?

I do, como terapia de substituição, a pacientes que não sinteti zam o F VIII ou que não o sintetizam em quantidade suficiente. A quantidade de anticorpos inibidores é tão elevada que mesmo a administração de quantidades superiores de Factor VIII não conduz a resultados terapêuticos.

Para o tratamento das hemorragias graves que ocorrem frequentemente nos pacientes com hemofilia A que desenvolveram anticorpos, tem-se investigado uma série de medidas, as quais, no entanto, apenas em parte têm conduzido a re sultados positivos. A infusão de concentrados de complexo de protrombina (CCP) contendo os facto res II, VII, IX e X é uma dessas medidas. Em situações de emergência tem sido usado mes mo factor VIII de plasma de animais, principalmente de plasma de bovino ou de suino, apesar do risco da administração de pro teina estranha. Lais recentemente têm sido usados também factores de coagulação activados com resultados positivos. Estes preparados contêm enzimas de coagulação activadas de activida de difícil de regular, não se podendo excluir o perigo de ocor rência de tromboses.

Também se investigou a eliminação destes anti corpos do plasma de pacientes de acordo com o princípio de imunoadsorção em factor VIII insalubilizado. Segundo uma técnica relacionada, também se aplicou a permuta de plasma para eliminação dos anticorpos. Finalmente tentou-se também inibir por via terapêutica a formação de anticorpos contra o F VHE:C.

Recentemente foram também considerados para a terapia de hemofilia de corpos de inibição complexos de F VIU com fosfolípidos (j. Lab. Clin. Med. 101, 34-43, 1983)· Este modo de abordagem do problema baseia-se no conhecimento de que o F VIII se liga a fosfolípidos, sendo contra estes locais de ligação que se dirigem exactamente os isoanticorpos dos pacientes com hemofilia. Em concordância com este facto í verificou-se que os complexos F VlII-fosfolípidos estão prote i gidos do ataque de corpos de inibição do tipo dos isoanticor pos e dós autoanticorpos. Foram discutidos complexos semelhan tes relacionados com as enzimas activadas e também com o prin cípio activo do FEIBA (Factor VIII Inhibitor Bypass Activity) (Thrombosis Research 21, 181-186, 1981).

A actividade dos complexos F VlII-fosfolípidos está bem demonstrada experimentalmente. Deste modo, detnons trou-se, por exemplo em J. Lab. Clin. Med · 101, 34-43 (1.983), que um complexo como este, quando é adicionado a um plasma com corpos de inibição em conjunto com F IXa, desencadeia a formação de trombina e, em consequência, também a coagulação, logo que se adicionam iões cálcio. Se bem que este conceito terapêutico pareça aparentemente vantajoso, tem no entanto o inconveniente de que os factores activados são dificilmente manuseáveis durante o processo de produção e além disso não se pode avaliar a respectiva actividade in vivo.

Todos estes métodos apresentam desvantagens.

A presente invenção tem, em consequência, por objecto o estabelecimento dutn processo para a preparação dum i agente para o tratamento da hemõfilia resistente ao factor VIII.

Mais especificamente o objecto da presente in venção consiste num processo para a preparação dum agente para a terapia da hemõfilia A resistente ao tratamento com factor VIII caracterizado por se conservar uma mistura de factor ! VIII, antitrombina III, um fosfolípido e de iões cálcio numa : solução aquosa durante um período mínimo de 1 minuto a uma ! temperatura entre 1 e 45°C, de preferência à temperatura de i 37°θ· por se adicionar factor IX e por se conservar a solução a unia temperatura entre 1 e 45°C , de preferência à temperatura de 20°C durante o tempo necessário para que uma amostra desta solução adicionada a urr. plasma com corpos de inibição apresente um tempo parcial de tromboplastina (TPT) de 15 a 20 segundos, por se adicionar eventualmente um poliol e um ácido aminado e por se levar eventualmente a solução à secura.

• .....D

Durante a incubação resulta, através da actividade de permuta dos factores cora fosfolípidos e com iões cálcio, um complexo de activação, o qual pode provocar a acti vaçao da via endogénea de coagulação mesmo na presença de iso anticorpos contra o F VIII. É uma condição indispensável para este fim que no preparado de activação os factores se encontrem em proporções determinadas, de preferência na proporção de 4 U de F VIII, 0,5 a 2 U de F IX e 0,5 a 1 U de AT III com pelo menos 25 jug de um fosfolípido e uma concentração de CaGL^ correspondente a 0,75 mmol/1.

Descobriu-se de modo inesperado que o processo da presente invenção dá origem a um agente isento de actividade amidolxtica e proteolítica, o que foi verificado por meio de ensaios usando os substratos cromogénicos S-2238 e S-2222 da companhia Kabi, além de não transformar o fibrinogé nio em fibrina. Em consequência, este agente não pode conter qualquer enzima activadora. Além disso verifica-se que esta se forma no meio de activação na presença de AT III e que tara bém nao é prejudicada na sua actividade por esta, como é evidente em consequência do encurtamento do tempo parcial de trombopiastina (TPT) prolongado patologicamente pelos corpos de inibição.

!

agente preparado de acordo com este processo conserva-se estável a 4^oC durante vários dias. Este facto foi surpreendente pois é sabido que os complexos de activação, I como os que se formam no corpo sob a forma de activador do fa ctor X ou da protrombina, são instáveis.

!

Também foi surpreendente o facto de que a actividade deste agente se perdesse quando ele é congelado ou liofilizado. 0 agente recupera no entanto a sua actividade quando, apos ser descongelado, é aquecido, de preferência a uma temperatura de 30 a 37°C · A reactivação corresponde à activação de acordo com o representado na figura. Tendo em con• sideração a inactivação por congelação ou por liofilização, foi surpreendente verificar-se que e possível evitar a inacti vação por adição de hidratos de carbono, de preferência do dissacarídeo sacarose.

Finalmente foi surpreendente verificar-se que a actividade de neutralização dos corpos de inibição do agente preparado de acordo com o processo da presente invenção se concentra no pico final após separação em Sepharose CL 0B. Nos factores que contêm a actividade encontraram-se também os fosfolípidos adicionados. Poi’ meio da técnica de imunocoagula ção (após separação por electroforese em gel de poliacrilamida SJDS) foi possível detectar nestas fracções derivados dos P VIII, F IX e AT III e um componente com um peso molecular de 100 kD, os quais não estavam contidos em qualquer dos próprios concentrados dos factores adicionados. Com base nesta constatação è de supor que o agente obtido de acordo com o processo da presente invenção é idêntico a um complexo de F VIII e F IX modificados formado com fosfolípidos e ioes cálcio sob a protecção de AT III.

Os exemplos que se seguem elucidam a invenção:

Materiais utilizados para a preparação e para a caracterização do agente obtido de acordo com o processo da presente invenção nos exemplos que se seguem:

Factor VIII: todos os concentrados de factor VIII comerciais, incluindo preparações de F VIII e também de proveniência bioi tecnológica, especialmente preparados pasteurizados, sendo preferido o concentrado de factor VIII Haemate P, de Behring werke AG, Marburg (República Federal Alemã) 50 Ul/ml, dialisa do contra tampão de acetato de sódio, 0,02 mol/1, pH 7,0, con tendo 0,06 mol/1 de NaCl e 1¾ de glicina;

Factor IX: concentrado de factor IX HS da Behringwerke, isen to de heparina e isento de iões cálcio por diálise contra o mesmo tampão de acetato de sódio (120 Ul/ml de F IX);

Solução de fosfolípidos: um extrato em tetra-hidrofurano obtido a partir de plaquetas lavadas e secas, isentas de sangue em emulsão de 250 mg em 5θ ml de água destilada, esterilizado por filtração, submetido a ultrassons a 50 000 Hz em banho de gelo a 0°G durante 20 minutos e por fim centrifugado durante 1 hora a 100 000 x g a 4°C. Utilizou-se o sobrenadante límpido. Continha uma mistura dos seguintes fosfolípidos; fosfotidiletanolamina (FE), fosfatidil-serina (FS), fosfatidil-colina (FC), fosfatidil-inositol (Fl), esfingomielina (sph) e coe postos de lisogenação (L);

Solução aquosa de cloreto de cálcio a 0,1 inol/lj

Solução de antitrombina III: %b emin HS 500 (Behringwerke AG). 1 embalagem com 5θ0 U expressas em cofactor de heparina dissolvida em 10 ml de água destilada;

Sacarose: sacarose puríssima (Merck, Darrnstadt, Republica Fe deral Alemã);

Tampões:

a) acetato de sódio a 20 mmol/1, NaCl a 20 mmol/1, pH 7,5 (condutividade 3,8 mS/cm a 25°C)

b) imidazol a 50 mmol/1, NaCl a 20 mmol/1, pH 7,5 (condutividade 3,7 mS/cm a 25°C)

Exemplo 1

1. Preparação do agente

Diluiu-se 1,4 ml de concentrado de factor VITT com 14,5 ml de tampão a e adicionaram-se 175 Ml de solução de antitrombina III, 80 /11 de solução de fosfolípidos, 120 /11 de solução de cloreto de cálcio e 0,32 g de sacarose e conservou -se durante 30 minutos a 37 C. Juntaram-se em seguida com uma V micropipeta 70 P^L de solução de factor IX. Conservou-se a mis tura durante 3 horas a 20^JC , retirando quantidades aliquotas a intervalos regulares (ver figura) e ensaiando estas amostras por determinação do tempo parcial de trombo pias tina (ΤΡΤ) num plasma de cornos de inibição, isto é, um plasma contendo an ticorpos contra o factor VIII. Para comparação usaram-se amos tras não contendo qualquer fosfolípido ou não contendo iões cálcio. Para a realização do ensaio adicionaram-se a 37° C a 0,1 ml de plasma de corpos de inibição com 80 Bu/ml (Bu = uni dades Bethesda) 0,1 da mistura acima preparada, 0,1 ml dum re agente de TPT, por exemplo ^athromtin, e 6 minutos mais tarde 0,1 ml de solução de cloreto de cálcio a 0,025 niol/1.

A figura contém os resultados:

agente preparado de acordo com o processo da presente invenção o mesmo agente sem iões cálcio o mesmo agente sem fosfolípidos

2. Caracterização do agente preparado de acordo com o processo da presente invenção em plasmas de hemofilia A em corpos de inibição contra J? VIIIíC.

agente preparado em 1. foi ensaiado em pias mas com corpos de inibição com diferentes títulos de anticorpos.

No quadro seguinte apresentam-se os resultadas.

Títulos dos cor pos de inibição	80 Bu	160 Bu	320 Bu	64o Bu
TPT (s)	29,3	30,5	31 »3	35,8
	29,6	30,5	31,6	35,0

Pelos resultados constacta-se que o TPT pro longado patologicamente de plasmas com corpos de inibição com títulos de anticorpos correspondentes a 80 a ό4θ Bu/ml foi normalizado por meio do agente preparado de acordo com o processo da presente invenção. Tanto o plasma com corpos de inibição com 80 Bu como o com 64θ Bu apresentam sem adição do agente um valor de TPT de cerca de 120 s, constatando-se que este valor não é encurtado por adição de factor VIII. Por con sequência, os valores apresentados no Quadro 1 mostram distin tamente que o agente obtido de acordo com o processo da presente invenção não é afectado nem neutralizado pelos corpos de inibição ao contrário do que se passa com o factor VIII. Portanto este agente é perfeitamente apropriado para a terapia de hemofílicos com corpos de inibição contra o factor VIII, por exemplo do tipo de isoanticorpos.

A actividade do agente preparado de acordo com o processo da presente invenção também pode ser demonstra da por tromboelastografia (TEG) com sangue integral humano com citrato.

Quando se misturou sangue integral com citratocom plasma com corpos de inibição (20 /11 com 1400

Bu/ml), os tempos r e k do trombo elastograma foram prolongados conforme era de esperar. Por adição do agente preparado de acordo com o exemplo 1 da presente invenção (10 /11) normalizaram-se os valores de r e de k.

3. Estabilidade em plasma de citrato do agente preparado de acordo com o processo da presente invenção.

A fim de ensaiar a estabilidade do agente em plasma humano de citrato, incubou-se aquele nas proporções de l+loudel+7 com plasma humano de citrato. A tempos determinados retiraram-se aliquotas de 0,2 ml da mistura, incubaram-se com reagente de TPT e apos 6 minutos a 3?³C adicionou-se 0,1 ml de solução de CaCl^ a 0,025 . Os valores de TPT

obtidos após tempos de incubação determinados estão reunidos no quadro seguinte.

Quad ro 2

Estabilidade do complexo activador em plasma de citrato a 37°C (valores TPT em segundos)

Tempo de incubação em minutos

Comparação	Valor 0	7	15	60	150
Agente +	41,6	21,6	24,4	25,2	26,0	29,5
plasma de	41,5	22,1	24,6	223,0	26,1	29,2
citrato (1:1)
Agente +	4 o, 1	31,4	33,6	34,2	34,9
plasma de	39,1	31,1	33,1	34,2	35,1
citrato (1:7)
0 agente da	presente	invenção	foi	substituído	por	tampão

Dos resultados deduz-se que o agente é estável no plasma de citrato durante mais de uma hora e ainda é activo após 2 1/2 horas. Como se pode verificar pela redução do TPT em relação à amostra de comparação com tampão, o agen- j te possui uma forte acção de indução da coagulação com plasma j de citrato. Uma vez que a actividade também não se reduz du- ^!rante a incubação com plasma de citrato, não pode estar rela- I cionada com uma enzima de coagulação pois o plasma de citrato ; contém antitrombina III, que neutraliza todas as enzimas de coagulação.

Exemplo 2

Para a preparação do agente misturam-se:

ml de concentrado de F VIII com

920 ml de tampao b; resultam 1000 ml de solução de F VIII com 4 U/ml, a qual se adicionam: 10,1 ml de concentrado de AT III com 50 U/ml, ml de fosfolípidos a 0,5> (g/1000 ml), 7,6 ml de solução de CaCl^ a 0,1 mol/1 e 20 g de sacarose.

Incubou-se esta mistura a 37°C durante 30 minutos, adicionaram-se em seguida 4,2 ml de concentrado de FIX (120 U de F IX/ml) e incubou-se a 20°C durante 3 horas. Duran te este tempo reduziu-se a 25 s o TFI determinado num plasma com corpos de inibição. Esterilizou-se a solução por filtração, preencheu-se o volume a 10 ml e liofilizou-se. Este liofilizado foi dissolvido no volume original e injectaram-se quantidades correspondentes a 4 ml/kg de peso corporal em coe lhos por via i.v., Como placebo administrou-se a coelhos uma solução de preparação idêntica à descrita mas sem adição de cloreto de cálcio. Aos 5, 10 15 e 30 minutos colheu-se sangue aos dois grupos de animais formados cada um por 3 coelhos e determinou-se o TPT do plasma obtido a partir das amostras co Ihidas, uma vez sem adição e outra vez com adição de plasma com corpos de inibição de paciente de hemofilia Λ. A partir dos resultados reunidos no quadro seguinte conclui-se que o TFI dos coelhos que tinham recebido o placebo apenas foi encurtado um pouco após 5 minutos, mas que o TPT dos animais in jectados com o agente preparado de acordo com o processo da presente invenção (Quadro 3a) fora nitidamente mais encurtado.

plasma deste grupo de animais também provoca a redução do TPT prolongado artificialmente por adição de corpos de inibição (Quadro 3b)·

Este facto prova que o agente preparado de acordo com o processo da presente invenção se mantinha sob forma activa nos animais.

i

Quadro 3a

Determinação do TPT ção	sem adição de plasma cora corpos de inibi-
antes	depois de aplicação
5 min	15 min 30 min
Agente de acordo
com a invenção	41,7		34,7	37,9 42,2
(3 coelhos)
Plac ebo
(3 coelhos)	42,4		38,5	46,6 42,0
Determinação do TPT	·. 0,1	ml	de plasma	de coelho
	0,1	ml	de tampão	de dietilbarbiturato
			-ac etato
	pH	7,6
	0,1	ml	de ®Pathromtin
	120	s a	37°0
	0,1	ml	de CaClg,	0,025 mo1/1

Quadro 3b

Determinação do TPT com adição de plasma com corpos de inibição antes depois da aplicação min 15 min 30 min

Agente de acordo com a invenção (3 coelhos)	5'0,2	45,1	45,2	47,2
Plac ebo (3 coelhos)	61,0	60,2	61,5	61,0

Det erminação do TPT

0,1	ml	de plasma de coelho
0,1	ml	de plasma com corpos de inibi
		ção a 80 Bu/ml
0,1	ml	d e 'Pa t h r o uit in
36 o	s	a 37°c
0,1	ml	de CaCl_r., 0,025 mol/1

Por separação do agente obtido de acoi^do com a invenção em Sepharose CL 6B reuniu-se a actividade conjunta de neutralização dos corpos de inibição no volume de exclusão Nas mesmas fracções foi possível ainda identificar os fosfoli pidos e, por análise das amostras por meio da técnica imunolo gica de mancha usando anti-soros contra F VIII, F IX e antitrombina III, ainda os seguintes componentes: juntamente com o factor von-Willebrand a cadeia L modificada do F VIII:C sob a forma de doblete com os pesos moleculares de 70 a 75 ID, F IX, antitrombina III e um componente com o peso molecular de 100 1<D.

Claims

REIVINDICAÇÕES

- 19 Processo para a preparação de um agente parei a terapia da hemofilia A resistente ao tratamento com factor VIII caracterizado por se conservar uma mistura de factor VEH, antitrombina III, um fosfolípido e iões cálcio numa solução aquosa pelo menos durante um minuto a uma temperatura entre 1 e 45°C, por se adicionar factor IX e por se conservar a soluÇ ção a uma temperatura entre 1 e 4_5°C durante o tempo necessá.^! rio para que uma amostra desta solução adicionada a um plasma com corpos de inibição provoque tina (TPT) de 15 a 30 segundos, te um poliol e eventualmente um mente se secar a solução.

um tempo parcial de t rombo pias | por se adicionar eventualmenácido aminado e oor eventualProcesso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se incorporarem os factores nas proporções de concentração seguintes: factor VIII 4 U, factor IX 0,p a 2 U, antitrombina III 0,5 a 1 U, por se activarem e por se adicionarem pelo menos 25 /ig de um fosfolipido de iões cálcio.

e 0,6 a 0,9 mmol/1 ₃s racterizado por racterizado po r racterizado por

Processo de acordo com a se adicionar um poliol

4s

Processo de acordo com a se adicionar um ácido aminado.

reivindicação

Processo de acordo com a reivindicação se secar a solução.