FI87044B - Foerfarande foer framstaellning av ett medel med vilket man kan behandla hemofili a, som aer resistent mot faktor viii. - Google Patents

Description

87044

Menetelmä aineen valmistamiseksi, jolla voidaan hoitaa tekijälle VIII resistenttiä hemofilia A:ta

Keksintö koskee menetelmää aineen valmistamiseksi, 5 jolla voidaan hoitaa hemofilia A:ta, johon ei tehoa hoito tekijällä VIII ja jonka koostumus on seurauksena plas-maattisten hyytymistekijöiden vuorovaikutuksesta anti-trombiinin III kanssa fosfolipidien ja kalsiumionien läsnäollessa ja jossa ei ole amidolyyttistä tai proteo-10 lyyttistä aktiivisuutta, joka muuttaa fibrinogeenin fib-riiniksi.

Jopa noin neljännekselle hemofilia A -potilaista, joita hoidetaan tekijä VIII-konsentraateilla, kehittyy nk. estoainehemofilioita. Näille on ominaista, että poti-15 laan veressä kiertää saostumattomia tekijä VIII -molekyylin hyytymisaktiivisuuden omaavan alayksikön (F VIII:C) isovasta-aineita. Nämä vasta-aineet, joita on hemofiliaa sairastavan plasmassa jopa hyvin suuria määriä, nimittäin 100 - joitakin tuhansia E/ml, neutraloivat vastaavia F 20 VIII:n aktiivisuuksia, jos näitä infusoidaan korvaaviksi aineiksi potilaisiin, joilla tekijää VIII ei syntetisoitu ollenkaan tai ei riittävässä määrin. Tavallisesti inhiboivien vasta-aineiden määrä on niin suuri, että suurten- ‘ -kaan tekijä VIII määrien lisäys ei johda terapeuttiseen 25 tulokseen.

Hoidettaessa vaikeita verenvuotoja, jotka ovat yleisiä hemofilia A -potilailla, joilla on kehittynyt vasta-aineita, on kokeiltu joukkoa toimenpiteitä, mutta ne ovat kuitenkin johtaneet vain osittain tuloksiin. Näi-30 hin toimenpiteisiin kuuluu tekijöitä II, VII, IX ja X sisältävien protrombiinikompleksikonsentraattien (PCC) in-fusointi. Hätätapauksissa on käytetty jopa eläinplasman, etupäässä naudan- tai sianplasman, tekijä VIII huolimatta vieraan valkuaisaineen lisäyksen riskistä. Aiemmin käy-35 tettiin myös aktivoituja hyytymistekijöitä tietyllä me- 87044 2 nestyksellä. Sellaiset aineet sisältävät aktivoituja hyy-tymisentsyymejä, joiden vaikutus on huonosti säädeltävissä, niin että veritulppariskiä ei voida sulkea täysin pois.

5 Lisäksi on yritetty poistaa näitä vasta-aineita immunoadsorptioperiaatteella liukenemattomaan tekijä VIII:aan potilaan plasmasta. Tämän lisäksi on käytetty myös plasman vaihtoa vasta-aineiden poistamiseksi. Lisäksi yritetään estää F VIII:C:n vasta-aineiden muodostumi-10 nen terapeuttisesti.

Aiemmin on otettu tarkasteltavaksi myös F VIII:n fosfolipidien kanssa muodostamat kompleksit estoainehemo-filian hoitoa varten (J. Lab. Clin. Med. 101, 34 - 43, 1983). Tämä lähestymistapa perustuu tietoon, että F VIII 15 sitoo fosfolipidejä ja että juuri nämä sitomiskohdat ovat niitä, joita vastaan hemofiliapotilaiden isovasta-aineet ovat suuntautuneet. Tämän kanssa yhtäpitävästi F VIII -fosfolipidikompleksit on suojattu iso- ja autovasta-aineiden tyyppisiltä estoaineilta. Vastaavia komplekseja 20 pidetään aktivoitujen entsyymien lisäksi myös FEIBA:n (Factor VIII Inhibitor Bypass Activity) aktiivisena periaatteena (Thrombosis Research 21, 181 - 186, 1981). : F VIII -fosfolipidikompleksien teho on kokeellisesti osoitettu hyvin. Esim. julkaisussa J. Lab. Clin.

25 Med. 101, 34 - 43 (1983) esitetään, että tällainen kompleksi lisättynä tekijän F IX a kanssa estoaineplasmaan saa aikaan trombiinin muodostumisen ja siten myös hyytymisen heti kun kalsiumioneja lisätään. Vaikkakin tämä te- : rapeuttinen käsitys näyttää lupaavalta, sillä on kuiten-30 kin se haittapuoli, että aktivoituja tekijöitä on vaikea käsitellä valmistusprosessissa ja myöskään niiden in vivo -vaikutus ei ole arvioitavissa. . " Näillä kaikilla menetelmillä on haittoja.

Tämän keksinnön tehtävänä on löytää käyttöön ai-35 ne, jolla voidaan hoitaa tekijä VIII -resistenttiä hemo- 3 87044 filiaa.

Keksinnön mukaisesti valmistetaan aine, jolla voidaan hoitaa hemofilia A:ta, johon ei tehoa hoito tekijällä VIII.

5 Menetelmälle on tunnusomaista, että vesipitoista seosta, jossa on polyolia ja 4 IE:tä tekijää VIII kohti: 0,5-1 E:tä antitrombiinia III, vähintään 25 Mg fosfo-lipidiä sekä 0,6 - 0,9 mmol/1 CaCl2, inkuboidaan lämpötilassa 1 - 45 °C vähintään yksi minuutti, ennenkuin lisä-10 tään tekijää IX, edullisesti 0,5-2 IE:tä, ja liuosta pidetään lämpötilassa 1 - 45 °C niin kauan, kunnes näyte tätä liuosta lisättynä tekijä VIII-estoaineplasmaan lyhentää patologisesti pidennetyn osittaisen tromboplas-tiiniajan (PTZ) 15 - 30 sekuntiin ja tätä vaikuttavaa ai-15 netta sisältävä liuos mahdollisesti lyofilisoidaan mahdollisesti lisäten aminohappoa. Edullisesti seos pidetään vähintään yksi minuutti lämpötilassa 37 °C, lisätään tekijää IX ja liuosta pidetään edullisesti lämpötilassa 20 °C, kunnes näyte tätä liuosta lisättynä estoaineplas-20 maan antaa osittaisen tromboplastiiniajän (PTZ) 15 - 30 sekuntia.

Inkuboinnin aikana syntyy tekijöiden ja fosfolipi-dien ja Ca-ionien vuorovaikutuksen tuloksena aktivointi-kompleksi, joka pystyy myös F Villin isovasta-aineiden 25 läsnä ollessa aktivoimaan endogeenisen hyytymisreitin.

Tämän edellytyksenä on, että aktivointierän aineet ovat tietyssä suhteessa, edullisesti 4 E F Villin suhteen las-kettuna 0,5 - 2 E F IX, 0,5 - 1 E AT III käytettäessä vähintään 25 μq fosfolipidiä CaCl2-konsentraation vastates-30 sa 0,75 mmol/1.

Yllättävää oli, että keksinnön mukainen menetelmä johtaa aineeseen, jolla ei ole amidolyyttistä eikä pro-teolyyttistä aktiivisuutta, kuten havaittiin testattaessa Kabin valmistamia kromogeenisiä substraatteja S-2238 ja 35 S-2222 eikä myöskään fibrinogeeni muutu fibriiniksi. Sen 4 87044 vuoksi tämä aine ei voi sisältää aktivoituja entsyymejä. Lisäksi pätee myös se, että se muodostuu aktivointierässä AT III:n läsnä ollessa eikä tämä myöskään vaikuta sen tehoon, mikä voidaan havaita estoaineiden patologisesti pi-5 dentämän osittaisen tromboplastiiniajan (PTZ) lyhentymisestä .

Tällä menetelmällä valmistettu aine pysyy stabiilina useita päiviä lämpötilassa 4 °C. Tämä on yllättävää, koska on tunnettua, että aktivointikompleksit, jollaisia 10 muodostuu kehossa tekijän X tai protrombiiniaktivaattorin muodossa, ovat epästabiileja.

Yllättävää oli myös, että tämän menetelmän mukaan valmistetun aineen teho häviää, jos se pakastetaan vesi-liuoksessa ja taas sulatetaan tai pakastekuivataan. Aine 15 saa kuitenkin aktiivisuutensa takaisin, jos se lämmitetään sulatuksen jälkeen, edullisesti lämpötilaan 30 -37 °C. Uudelleenaktivointi vastaa kuvan mukaista aktiivisuutta. Pakastamalla ja pakastekuivaamalla suoritetun inaktivoinnin suhteen oli yllättävää, että lisäämällä 20 hiilihydraatteja, edullisesti sakkaroosi-disakkaridia, inaktivoituminen voitiin estää.

Yllättävää oli myös, että suoritettaessa frak- ' tiointi sefaroosi CL 6B:llä keksinnön mukaisesti valmistetun aineen estoainetta neutralisoiva aktiivisuus esiin- ·· 25 tyi poistohuipussa ("Ausschlusspeak"). Aktiviteettia si sältävistä tekijöistä löydettiin myös lisätty fosfolipidi kokonaisuudessaan. "ImmunoblottingM-tekniikalla (sen jäi- ' keen kun ensin oli suoritettu erotus SDS-polyakryyliami-di-geeli-elektroforeesilla) voitiin näistä fraktioista 30 todeta tekijöiden F VIII, F IX ja AT III johdannaisia ja komponentti, jonka molekyylipaino oli 100 kD, joita ei sisältynyt mihinkään lisätyistä tekijäkonsentraateista sinänsä. Tämän havainnon perusteella on ymmärrettävissä, että valmistettu aine on identtinen modifioiduista teki-35 joista F VIII ja F IX muodostuvan kompleksin kanssa, joka κ 87044

D

muodostuu AT III:n suojaamana fosfolipidien ja Ca-ionien kanssa.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

Aineet, joita käytetään keksinnön mukaisesti ai-5 neen valmistukseen ja karakterisointiin seuraavissa esimerkeissä:

Tekijä VIII: kaikki kauppatavarana saatavat tekijä VIII -konsentraatit mukaan lukien F VIII -valmisteet, myös bioteknistä alkuperää olevat, erityisesti pastöroi-10 dut valmisteet; edullisesti RHaemate P, tekijä VIII -kon-sentraatti, valmistaja Behringwerke AG Marburg (Saksa) 50 IE/ml, dialysoitu natriumasetaattipuskurilla, 0,02 raol/1, pH 7,0, sisältää 0,06 mol/1 NaCl ja 1 % glysiiniä;

Tekijä IX: tekijä IX -konsentraatti HS, Behring-15 werke, ei sisällä hepariinia eikä sitraatti-ioneja, dialysoitu edellä mainitulla natriumasetaattipuskurilla (120 IE/ml F IX);

Fosfolipidiliuos: verettömiksi pestyistä ja kuivatuista istukoista saatu tetrahydrofuraaniuute, emulgoitu 20 250 mg 50 ml:aan tislattua vettä, steriilisuodatettu ja käsitelty jäähauteessa lämpötilassa 0 °C 20 minuuttia ultraäänellä käyttäen taajuutta 50 000 Hz, sen jälkeen sentrifugoitu (100 000'g) yksi tunti lämpötilassa 4 °C. Käytetään ylempi, kirkas kerros. Se sisältää seuraavien 25 fosfolipidien seosta: fosfatidyylietanoliamiini (PE), fosfatidyyliseriini (PS), fosfatidyylikoliini (PC), fos-fatidyyli-inositoli (PJ), sfingomyeliini (Sph) ja lysoyh-disteet (L).

0,1 mol/1 vesipitoinen kalsiumkloridiliuos 30 Antitrombiini III -liuos: RKybernin HS 500 (Beh ringwerke AG). Yksi erä, jossa 500 E, määritetty heparii- .. nikofaktorina liuotettuna 10 ml:aan tislattua vettä;

Sakkaroosi: laatu "reinst·· (Merck, Darmstadt,

Saksa); 87044 6

Puskuri: a) 20 mmol/1 Na-asetaattia, 20 mmol/1 NaCl, pH 7,5 (johtokyky 3,8 mS/cm 25 °C) b) 50 mmol/1 imidatsolia, 20 mmol/1 NaCl, pH 7,5 5 (johtokyky 3,7 mS/cm 25 °C).

Esimerkki 1 1. Aineen valmistus keksinnön mukaisesti 1,4 ml tekijä VIII -konsentraattia laimennettiin 14,5 ml:11a puskuria a ja lisättiin 175 μΐ antitrombiini 10 III -liuosta, 80 μΐ fosfolipidiliuosta, 120 μΐ kalsium-kloridiliuosta ja 0,32 g sakkaroosia ja seos pidettiin 30 minuuttia lämpötilassa 37 °C. Sen jälkeen lisättiin pipetoimalla 70 μΐ tekijä IX -liuosta. Seos pidettiin kolme tuntia lämpötilassa 20 °C, otettiin tietyin aikavä-15 lein (kuvio) yhtä suuria määriä ja suoritettiin osittaisen tromboplastiiniajan (PTZ) määritys "estoaineplas-massa" eli plasmassa, joka sisältää tekijä VIII:n vasta-aineita. Vertailuna käytettiin eriä, jotka eivät sisältäneet fosfolipidiä eivätkä kalsiumkloridia. Koe suori-20 tettiin niin, että lämpötilassa 37 °C 0,1 ml:aan esto- aineplasmaa, jossa oli 80 Bu/ml (Bu = Bethesda-yksikkö), lisättiin 0,1 ml edellä valmistettua seosta, 0,1 ml PTZ-reagenssia, esimerkiksi RPathromtin ja kuuden minuutin kuluttua vielä 0,1 ml kaisiumkloridiliuosta (0,025 25 mol/1). ".

Tulokset on esitetty kuviossa: x on keksinnön mukaisesti valmistettu aine; + on tämä aine ilman kalsium-ioneja; o on tämä aine ilman fosfolipidejä.

2. Keksinnön mukaisesti valmistetun aineen karak- 30 terisointi hemofilia A -plasmoilla, jotka sisältä- : vät F VIII:C:n estoaineita

Kohdassa 1 valmistettua ainetta kokeiltiin esto-aineplasmoilla, jotka sisälsivät erilaisia määriä vasta-aineita.

35 Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa.

7 87044

Taulukko l

Estoaineen tiitteri 80 Bu 160 Bu 320 Bu 640 Bu PTZ (s) 29,3 30,5 31,3 35,8 29,6 30,5 31,6 35,0 5 Tuloksista havaitaan, että estoaineplasmojen, joi den vasta-ainemäärät vastaavat arvoja 80 - 640 Bu/ml, patologisesti pidentynyt PTZ normalisoituu keksinnön mukaisen aineen avulla. Sekä estoaineplasmalla, jossa on 80 Bu, että plasmalla, jossa on 640 Bu, PTZ-arvot olivat 10 noin 120 s ilman tällaisen aineen lisäystä, eivätkä ajat lyhentyneet myöskään tekijä VIII:n lisäyksen jälkeen. Sen vuoksi taulukon 1 tulokset osoittavat selvästi, että keksinnön mukaisesti valmistettu aine ei tartu estoaineisiin eikä neutraloidu - päin vastoin kuin tekijä VIII. Sen 15 vuoksi tämä aine sopii hyvin sellaisten hemofiliapotilai-den, joilla on tekijä VIII:n estoaineita, esim. isovasta-ainetyyppiä, hoitoon.

Tässä valmistetun aineen teho voidaan osoittaa myös trombielastografisesti (TEG) käyttäen ihmisen sit-20 raattitäysverta.

Kun sitraattitäysverta (230 μΐ) sekoitettiin esto- aineplasmaan (20 μΐ, jossa 1 400 Bu/ml), trombielasto-grammissa pidentyi odotusten mukaisesti r- ja k-aika. Li- . ; sättäessä esimerkissä 1 valmistettua keksinnön mukaista .···. 25 ainetta (10 μΐ) pidentyneet r- ja k-arvot normalisoitui- ’· vat.

3. Keksinnön mukaisen aineen stabiilisuus sitraat- tiplasmassa

Keksinnön mukaisen aineen stabiilisuuden testaami-30 seksi ihmissitraattiplasmassa tätä inkuboitiin ihmissit- raattiplasman kanssa suhteessa 1+1 tai 1+7. Tietyin aikavälein otettiin 0,2 ml:n suuruiset määrät seosta, in-kuboitiin 0,1 ml:n kanssa PTZ-reagenssia ja lisättiin kuuden minuutin kuluttua lämpötilassa 37 °C 0,1 ml CaCl?- 87044 δ liuosta (0,025 mol/1). Tiettyjen inkubointiaikojen kuluttua saadut PTZ-arvot on esitetty seuraavassa taulukossa 2.

Taulukko 2 5 Aktivaattorikompleksin stabiilisuus sitraattiplas- massa lämpötilassa 37 °C (PTZ-arvot sekunteina) Inkubointiajat (min)

Kontrolli* 0-arvo 7 15 60 150

Aine + sitraat- 41,6 21,6 24,4 25,2 26,0 29,5 10 triplasma (1:1) 41,5 22,1 24,6 25,0 26,1 29,2

Aine + sitraat- 40,1 31,4 33,6 34,2 34,9 tiplasma (1:7) 39,1 31,1 33,1 34,2 35,1 * keksinnön mukaisesti valmistettu aine korvattu puskurilla a 15 Tuloksista voidaan havaita, että aine on sitraat- tiplasmassa stabiili yli tunnin ja tehokas vielä 2,5 tunnin kuluttua.

Kuten PTZ:n lyheneminen puskurilla suoritettuun kontrolliin nähden osoittaa, aineella on voimakas esikoa-20 guloiva vaikutus sitraattiplasmaan. Koska vaikutus ei häviä myöskään sitraattiplasman kanssa suoritetun inku-boinnin aikana, se ei voi olla sidottu hyytymisentsyy-miin; sillä sitraattiplasma sisältää antitrombiinia III, joka neutraloi kaikki hyytymisentsyymit.

25 Esimerkki 2

Aineen valmistamiseksi keksinnön mukaisesti sekoitettiin 80 ml F VIII -konsentraattia 920 ml:n kanssa pus- : kuria b; siitä saatiin 1 000 ml F VIII -liuosta, joka si- ; sälsi 4 E/ml ja joka sekoitettiin seuraaviin aineisiin: 30 10,1 ml AT III -konsentraattia, jossa on 50 E/ml, 5 ml fosfolipidiä (0,5-%:inen) (g/100 ml), 7,6 ml CaCl2-liuos- - ta (0,1 mol/1) ja 20 g sakkaroosia.

Tätä seosta inkuboitiin 30 minuuttia lämpötilassa 37 °C, sen jälkeen lisättiin 4,2 ml F IX -konsentraattia 35 (120 E F IX/ml) ja inkuboitiin kolme tuntia lämpötilassa 9 87044 20 °C. Tämän ajan kuluessa oli estoaineplasmassa sillä mitattu PTZ-arvo lyhentynyt 25 s:iin. Liuos steriilisuo-datettiin, pakattiin 10 ml:n eriin ja lyofilisoitiin.

Tämä lyofilisaatti liuotettiin alkuperäiseen tilavuuteen 5 ja liuosta injektoitiin kaniineihin i.v. määrä, joka vastasi 4 ml/kg ruumiinpainoa. Plasebona eläimet saivat liuosta, joka oli edellisen kanssa muuten samanlainen, mutta ei sisältänyt kalsiumkloridia. 5, 10, 15 ja 30 minuutin kuluttua otettiin molemmista eläinryhmistä, jotka 10 koostuivat kukin kolmesta kaniinista, verta ja siitä erotetusta plasmasta määritettiin PTZ kerran ilman lisäystä ja toisen kerran lisäämällä hemofilia A -potilaan esto-aineplasmaa. Taulukossa ilmoitetuista tuloksista voidaan havaita, että plaseboa saaneiden kaniinien PTZ oli lyhen-15 tynyt vähän vain viiden minuutin kuluttua, mutta niiden eläinten, joihin oli injektoitu keksinnön mukaisesti valmistettua ainetta (taulukko 3 a) PTZ oli alentunut selvästi enemmän.

Tämän eläinryhmän plasma lyhensi myös estoaineita 20 lisäämällä keinotekoisesti pidennettyä PTZ (taulukko 3 a) .

. . Tämä osoittaa, että tässä valmistettu aine kiertää ...

eläimessä aktiivisessa muodossa. :

Taulukko 3 a .···.

25 PTZ-määritys ilman estoaineplasman lisäystä .. :

Alussa Antamisen jälkeen 5 min 15 min 30 min

Keksinnön mukaisesti valmistettu aine 30 (3 kaniinia) 41,7 34,7 37,9 42,2

Plasebo (3 kaniinia) 42,4 38,5 46,6 42,0 [ PZT-määritys: 0,1 ml kaniinin plasmaa, 0,1 ml dietyyli- .* : barbituraatti-asetaattipuskuria, pH 7,6, 0,1 ml RPathrom- : .

tinia, 120 sekuntia lämpötilassa 37 °C, 0,1 ml CaCl2 35 (0,025 mol/1).

ίο 8 704 4

Taulukko 3 b PTZ-määritys lisättäessä estoaineplasmaa

Alussa Antamisen jälkeen 5 min 15 min 30 min 5 Keksinnön mukaisesti valmistettu aine (3 kaniinia) 50,2 45,1 45,2 47,2

Plasebo (3 kaniinia) 61,0 60,2 61,5 61,0 PTZ-määritys: 0,1 ml kaniinin plasmaa, 0,1 ml estoaine-10 plasmaa 80 Bu/ml, 0,1 ml RPathromtinia, 360 sekuntia lämpötilassa 37 °C, 0,1 ml CaCl2 (0,025 rool/1) .

Suoritettaessa keksinnön mukaisesti valmistetun aineen fraktiointi sefaroosi CL 6B:llä kaiken estoainetta neutraloivan aktiivisuuden havaittiin olevan poistotila-15 vuudessa ("Ausschlussvolumen"). Samoista fraktioista voi tiin myös identifioida fosfolipidit ja analysoimalla näytteet "immunoblotting"-tekniikalla käyttämällä F VIII:n, F IX:n ja antitrombiini III:n antiseerumeja myös seuraavat komponentit: von Willebrand-tekijän ohella F 20 VIII:C:n modifioitu L-ketju dublettina molekyylipainojen ollessa 70 - 75 kD, F IX, antitrombiini III sekä komponentti, jonka molekyylipaino oli 100 kD.

Claims (5)

11 87044

1. Menetelmä aineen valmistamiseksi, jolla voidaan hoitaa hemofilia A:ta, johon ei tehoa hoito tekijällä

5 VIII ja jonka koostumus on seurauksena plasmaattisten hyytymistekijöiden vuorovaikutuksesta antitrombiinin III kanssa fosfolipidien ja kalsiumionien läsnäollessa ja jossa ei ole amidolyyttistä tai proteolyyttistä aktiivisuutta, joka muuttaa fibrinogeenin fibriiniksi, t u n -10 n e t t u siitä, että vesipitoista seosta, jossa on po-lyolia ja 4 IE:tä tekijää VIII kohti: 0,5 - 1 E:tä anti-trombiinia III, vähintään 25 μq fosfolipidiä sekä 0,6 -0,9 mmol/1 CaCl2, inkuboidaan lämpötilassa 1-45 °C:ssa vähintään yksi minuutti, ennenkuin lisätään tekijää IX, 15 edullisesti 0,5-2 IE:tä, ja liuosta pidetään lämpötilassa 1 - 45 °C niin kauan, kunnes näyte tätä liuosta lisättynä tekijä VIII-estoaineplasmaan lyhentää patologisesti pidennetyn osittaisen tromboplastiiniajän (PTZ) 15-30 sekuntiin ja tätä vaikuttavaa ainetta sisältävä 20 liuos mahdollisesti lyofilisoidaan mahdollisesti lisäten aminohappoa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että inkubaatioseos sisältää po-lyolina sakkaroosia. .25

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuos sisältää aminohappoa, edullisesti glysiiniä.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuos lyofilisoidaan.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aineella on seuraavat ominaisuudet: - voimakas esikoaguloiva vaikutus, mutta se ei si-säilä aktivoituja hyytymistekijöitä, jotka muuttavat fib-35 rinogeenin fibriiniksi ja lohkaisevat kromogeeniset pep- 12 87044 tidit, jotka ovat spesifisiä tekijälle Ha ja tekijälle Xa - stabiili ihmisen sitraattiplasmassa - lyhentää ihmisen normaalin sitraattiplasman ja 5 tekijän VIII estoaineita sisältävän plasman osittaista tromboplastiiniaikaa PTZ - tekijän IX vastaiset vasta-aineet eivät vaikuta sen tehoon - kromatografisessa erotuksessa sefaroosi CL 10 6B:llä tekijän VIII-estoaine-by-pass-aktiivisuus esiintyy poistotilavuudessa - estoaine-by-pass-aktiivisuutta sisältävät fraktiot sisältävät von Willebrand -antigeeniä, fosfolipidiä, tekijän VIII:C modifioidun L-ketjun (molekyylipaino 70 - 15 75 kDa), tekijää IX, komponenttia, jonka molekyylipaino on 100 kDa ja antitrombiinia III. 13 87044