PT825443E - Processo para a quantificacao de glicosaminoglicanos em solucoes contendo antitrombina iii - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A QUANTIFICAÇÃO DE GLICOSAMINOGLICANOS EM SOLUÇÕES CONTENDO ANTITRGMBINA III"

Descreve-se um processo que permite a determinação quantitativa de glicosaminoglicanos (GAG), por exemplo heparina, em soluções que contêm antitrombina III e em soluções que contêm outras proteínas que se ligam a GAG. A antitrombina III é uma proteína que pertence à família dos inibidores das serina-proteases. Através da formação de complexos com proteases, como trombina, factor de coagulação Xa, etc., a AT III inibe as actividades proteolíticas deste enzima. A AT III contribui através do espectro em proteases inibidoras para a regulação da hemostase. No caso, por exemplo, de uma lesão dos vasos este inibidor permite estancar um sangramento através do modo progressivo de inibição de factores de coagulação; a inibição completa das proteases de coagulação activadas só está contudo concluída quando a ferida fecha (fibrina, plaquetas).

Por outro lado a AT III está ligada por exemplo ao endotélio dos vasos através dos glicosaminoglicanos (GAGs) e impede por isso uma formação incontrolada de fibrina / trombos na parede dos vasos. Aí, os GAGs servem não só como receptores, mas também como aceleradores da reacção da AT III com proteases. Através desta interacção não covalente da AT II e de, por exemplo, heparina ou sulfato de heparano, ocorre uma alteração de configuração da molécula de inibidor, de modo que é possível uma r ^ ^—t \ formação de complexo acelerada com a protease. Este efeito designa-se simplificadamente como "activação".

Este efeito acelerador é aproveitado do ponto de vista terapêutico, administrando por exemplo heparina para a profilaxia da trombose, que é adicionada aos GAGs. Por activação da cascata de coagulação, como por exemplo se verifica frequentemente durante ou após as operações, inibem-se algumas das proteases geradas pela AT III/heparina efectiva e rapidamente, reduzindo-se assim o risco de formação de um trombo.

Uma vez que, pelo contrário, no caso de uma sobredosagem de heparina podem ocorrer sangramentos, a concentração de heparina no plasma do paciente deve ser vigiada e, quando necessário, devem tomar-se medidas como uma neutralização com protamina.

Empregam-se desde há muito métodos para a avaliação da concentração de heparina no plasma. Estes baseiam-se por exemplo no facto de a heparina, parcialmente ligada a AT III ou a outras proteína de ligação a GAG, ser removida da ligação por meio de sulfato de dextrano (DXS). Os sistemas de detecção posteriores, ao contrário da heparina, já não são apreciavelmente influenciáveis pelo DXS a estas concentrações. Estes sistemas de detecção baseiam-se mais uma vez na reacção da heparina libertada pelo DXS com uma determinada quantidade de AT III que é adicionada à solução. A quantidade das proteases adicionadas não inibida por AT III/heparina, por exemplo factor Xa, determina-se fotometricamente com o auxílio de um substrato cromogénico. Também se empregam métodos coagulométricos. A quantidade de heparina das amostras calcula-se por meio de uma curva padrão que é construída a partir de quantidades crescentes 2

de heparina. Conforme as concentrações de heparina mais importantes e significativas do ponto de vista terapêutico, encontram-se disponíveis testes com uma sensibilidade de apenas 0,5 ou 0,1 IU/ml.

Pelo contrário, os concentrados de antitrombina III administram-se terapeuticamente por exemplo a pacientes que sofrem de uma deficiência nativa ou adquirida de AT III. Uma vez que uma série destes preparados se purificam por exemplo a partir de fracções do plasma utilizando heparina imobilizada, é de todo o interesse a quantificação da heparina nestes concentrados. Para efeitos de teste, estes concentrados devem empregar-se numa forma tão concentrada quanto possível, para ser possível identificar ou quantificar as quantidades de heparina existentes na maior parte dos casos apenas como vestígios. Uma vez que se trata neste caso de concentrações de AT III frequentemente de 20 IU/ml e mais (correspondentes a 3 mg/ml de AT III e mais), os sistemas de teste convencionais são perturbados logo pelo potencial inibitório progressivo da AT III, o que leva a resultados falseados. Por esta razão, o concentrado deve ser diluído de modo que esta progressividade seja desprezável. Isto significa que muitas vezes os vestígios de heparina não podem ser detectados com os testes convencionais. Um sistema de teste comercial contém para comparação 1 IU/ml de AT III, por meio da qual se pode quantificar a concentração de heparina numa amostra. O objectivo desta invenção é por isso disponibilizar um processo para a quantificação de heparina em soluções contendo AT III, que seja independente da concentração de AT III nessas soluções. 0 objectivo atinge-se do seguinte modo: 3

! | <ί 1. A força iónica da solução contendo AT III aumenta-se de modo que o efeito de troca entre a AT III e a heparina seja impedido ou a heparina seja quantitativamente libertada da ligação não covalente. Empregam-se forças iónicas entre 15 e 250 mS, de preferência entre 25 e 150 mS. Estas conseguem-se por exemplo por adição de quantidades adequadas de sais, por exemplo NaCl ou volumes adequados de soluções padrão de alta concentração.

Este processo tem a vantagem em relação aos convencionais de se poder evitar a adição de DXS. Isto é vantajoso em especial no caso de concentrações de AT III muito elevadas, uma vez que nestes casos se teriam de adicionar quantidades extremas de DXS, que iriam perturbar o sistema de identificação que se segue. 2. A AT III remove-se desta solução, por exemplo com a ajuda de anticorpos contra AT III acoplados a uma matriz. Num modo processual preferencial precipita-se a AT III a partir da solução e separa-se por exemplo por centrifugação ou filtração. A heparina fica assim quantitativamente no sobrenadante. As precipitações podem efectuar-se por exemplo com quantidades adequadas de sulfato de amónio. Utiliza-se de preferência um ácido, muito em especial ácido tricloroacético (0,05 M a saturado, de preferência 0,5 a 2 M) para desnaturação e subsequente separação. 3. O excesso de ácido ou de sal remove-se por exemplo por diálise, devendo evitar-se uma demasiada diluição da amostra, para garantir a detectabilidade dos vestígios de heparina. Empregam-se de preferência, por serem económicas em tempo e fáceis de padronizar, as chamadas colunas de dessalinização ou de permuta, que são conhecidas do 4 j— U, especialista como filtrações de gel. O efeito de diluição da amostra é pequeno. 4. A solução contendo heparina assim obtida é quantificada em sistemas de teste adequados. Por tal entendem-se por exemplo testes coagulométricos ou cromogénicos/fluorogènicos, que se baseiam em geral na actividade de cofactor dos GAGs (ver acima). Podem também empregar-se testes imunoquímicos, como ELISA, com anticorpos dirigidos contra os GAGs a determinar. Como outros métodos encontram-se técnicas cromatográficas, como HPLC, ou electroforeses quantitativas. 0 processo descrito não está limitado à heparina, mas abrange também outros GAGs, como sulfato de heparano, sulfato de dermatano, sulfato de condroitina, etc.

Por outro lado, pode ser também utilizado para a determinação de GAGs que se ligam a outras proteínas que não a AT III. Estas são por exemplo heparina-cofactor II, Tissue Factor Pathway

Inhibitor, inibidor de proteína C ou factor de plaquetas 4. 0 processo é ilustrado pelo exemplo seguinte:

Exemplo:

Misturou-se concentrado de AT III com diferentes quantidades de heparina. Após incubação de uma hora tratou-se a solução do modo seguinte: 1. Libertou-se a heparina ligada do complexo com AT III por adição de NaCl; 5

I (~ ^^ \Ι 2. Removeu-se a AT III por adição de ácido tricloroacético e centrifugação; 3. Dessalinizou-se o sobrenadante por filtração de gel em NAP-5 e removeu-se o TCA (ácido tricloroacético); 4. Testou-se o eluido num ensaio cromogénico; quantificou-se a concentração de heparina por meio de uma curva padrão. 0 concentrado de antitrombina III (Kybernin®P, Centeon Pharma GmbH) dissolveu-se até 50 IU/ml e adicionaram-se aliquotas com 0, 20, 50 e 80 mIU/ml de heparina. Após incubação de uma hora misturaram-se 0,4 ml de cada uma destas soluções com 0,1 ml de NaCl 5 M e incubaram-se durante 30 minutos a 25°C.

Em seguida adicionaram-se a cada solução 0,3 ml de ácido tricloroacético 1 M e incubaram-se as misturas durante 5 minutos em banho de gelo. Após 2 minutos de centrifugação eluiram-se os sobrenadantes (0,5 ml de cada) através de uma coluna de NAP-5 (firma Pharmacia Biotech GmbH) e recolheram-se os eluidos. A quantificação da heparina efectuou-se do modo seguinte: 0,05 ml de amostra ou de padrão (heparina) 0,05 ml de reagente de AT III (0,25 IU/ml de AT III, diluída em 100 mM de Tris/HCl, pH 7,5, 50 mM de NaCl)

10 min. de incubação a 25°C 0,05 ml de reagente Fxa (Behring Diagnostics; OWLG)

3 min. de incubação a 25°C 0,05 ml de substrato Fxa (Behring Diagnostics; OWLH) 25 min. de incubação a 25°C 0,05 ml de ácido acético a 50%. 6

Medição da DOíosnm e interpretação com base na curva padrão de heparina anexa:

Traçou-se a curva padrão de heparina numa gama de concentrações de 0 a 200 mIU/ml (0/3,125/6,25/12,5/25/50/100/200 mIU/ml de heparina). Representaram-se as concentrações em função de ΔϋΟ e calcularam-se as concentrações de heparina com base nesta curva. Estas determinações efectuaram-se em cada caso em três dias consecutivos.

Resultado:

Heparina (mIU/ml) valor médio ± desvio padrão AT III controle (não imobilizada) < 10 AT III + 20 mIU/ml de heparina 24,4 ± 6,3 AT III + 50 mIU/ml de heparina 49,5 ± 5,3 AT III + 80 mIU/ml de heparina 82,9 ± 3,8

Lisboa, 25 de Maio de 2001

O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a determinação de glicosaminoglicanos em soluções contendo antitrombina III, caracterizado por a) se aumentar a força iónica da solução contendo AT III de modo que o efeito de troca entre a AT III e a heparina seja impedido, b) a AT III libertada pelos glicosaminoglicanos ser removida da solução, c) o glicosaminoglicano remanescente na solução ser dessalinizado e identificado.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se ajustar a força iónica entre 15 mS e 250 mS.
3. 3. Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se remover a AT III por precipitação com ácido.
4. 4. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado por se efectuar a dessalinização por meio de filtração de gel.
5. 5. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado por o glicosaminoglicano ser a heparina. Lisboa, 25 de Maio de 2001 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE JKDUSTRIAL