PT784483E

PT784483E - Composicao que compreende um virus recombinante que exprime um antigenio e um virus recombinante que exprime uma molecula imunoestimuladora

Info

Publication number: PT784483E
Application number: PT95935264T
Authority: PT
Inventors: Jeffrey Schlom; Judith Kantor; James W Hodge
Original assignee: Us Gov Health & Human Serv
Priority date: 1994-10-03
Filing date: 1995-10-02
Publication date: 2001-05-31
Also published as: AU688606B2; US6548068B1; ES2154738T3; EP1016418B1; JPH10506902A; EP0784483B1; JP4078319B2; US7368116B2; EP0784483A2; DK0784483T3; JP2004222726A; ATE197765T1; DE69519521D1; WO1996010419A2; JP3907698B2; US20050063993A1; EP1016418A2; JP4160612B2; EP1016418A3; CA2201587A1

Description

Descrição “Composição que compreende um vírus recombinante que exprime um antigénio e um vírus recombinante que exprime uma molécula imunoestimuladora” [0001] A presente invenção diz respeito a uma composição de vacinas de vectores virais recombinantes para prevenir ou tratar estados patogénicos e cancro. Mais particularmente, diz respeito a uma composição de vectores virais recombinantes que compreendem genes que codificam um ou vários antigénios e vectores virais recombinantes que compreendem um ou mios genes que codificam (a) determinadas moléculas imunoestimuladoras. Tais genes podem ser inseridos num vector recombinante ou em vectores virais independentes. Outro aspecto da presente invenção diz respeito ao reforço de tuna resposta imunitária contra células patogénicas (tais como as células tumorais) num mamífero mediante a infecção de tais células com um vector recombinante que contenha um ou vários genes imunoestimuladores, quer in situ quer in vitro, e à reintrodução das células infectadas no hospedeiro.

[0002] As tentativas feitas até ao momento presente para fazer aparecer respostas imunitárias activas em pacientes com cancro podem ser classificadas em “não específicas” (isto é, a utilização da BCG) ou “específicas”, isto é, a utilização de células tumorais, de extractos de células tumorais, de misturas de antigénios provenientes dos fluídos dos sobrenadantes de culturas celulares ou de oncolisados de células tumorais. A grande maioria destes esforços teve lugar em pacientes com melanoma metastático. O desenvolvimento de uma vacina recombinante implica a utilização de produtos gémeos específicos e definidos ou de epítopos de um imunogemo ou uma molécula imunoestiinuladui a. As vacinas recombinantes também podem ser utilizadas para a “terapia gémea” na medida em que esta ultima forma de resolver a questão exige a utilização de células de um dado paciente e a inserção de um gene para uma molécula imunoestimuladoia, tal como B7.1, B7.2, IL-2 ou FEC-MG (o meano que GM-CSF), dentro dessas células, quer in situ quer para se readministrar ao paciente as células criadas em cultura.

[0003] As vacinas recombinantes podem assumir inúmeras formas. As proteínas recombinantes podem ser sintetizadas por vectores tais como os baculovírus (um vector de insectos) ou em células eucarióticas. Os péptidos sintéticos também podem servir de imunogénios. As vacinas peptídicas, possuindo entre 9 e várias dezenas de aminoácidos, podem assumir duas formas. Podem ser misturadas com um adjuvante ou podem ser utilizadas para estimular células do sangue periférico, enquanto células possuidoras de antigénios (CPA) para reinfusão no paciente. Também é possível construir vacinas recombinantes inserindo num vector o gene que codifica um dado antigénio associado ao tumor. Alguns dos vectores vulgares utilizados são os vírus de vaccinia, os avipoxvírus, tais como os avipoxvírus das galinhas ou dos canário^ o BCG, os adenovírus e os microrganismos Sdmonella. Estes vectores, cada um com as suas vantagens e inconvenientes, são utilizados vulgannente devido à imunogenicidade das suas proteínas constitutivas, fazendo pois com que a proteína ou o epítopo do gene inserido seja mais imunogénico. As vacinas recombinantes também podem assumir a forma do anticorpo anti-idiotípico que é dirigido contra um anticorpo monoclonal preparado contra um determinado antigénio associado a um tumor. Mais recentemente foram preparadas vacinas polinucleotídicas constituídas por ADN, não associado a proteínas, de um gene associado ao tumor num plasmídeo que contém um promotor. Embora todos os casos anteriormente referidos tenham sido analisados em modelos com animais, há muitíssimo poucos estudos que tenham comparado as eficiências relativas entre uma solução e outra. Algumas destas soluções para resolver estes problemas começaram agora a ser utilizadas em experiências clinicas no tratamento do cancro da mama e noutros pacientes com carcinoma e há outras experiências que muito provavelmente irão ser iniciadas num futuro breve.

[0004] Há vários antigénios que foram agora identificados para uma utilização potencial em vacinas recombinantes para as terapias do cancro. O primeiro destes antigénios é o oncogene c-erbB/2 para o qual se concluiu que é expresso excessivamente em cerca de 20% a 30% dos tumores da mama (Pietras RJ et aL Oncogene 9: 1829-1838, 1994). Demonstrou-se (Bemards R. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:6854-6858,1987) que o oncogene c-erbB/2 mutacionado pontualmente nos ratos, quando inserido em vírus de vaccinia, é imunogénico e pode desencadear efeitos antitumorais. No entanto, o oncogene c-erbB/2 humano não é mutacionado. Recentemente demonstrou-se (Disis ML et al., Câncer Res. 54:1071-1076, 1994) que este gene codifica vários epítopos sobre os quais se presume que gerem respostas das células T humanas in vitro. Comprovou-se que o oncogene p53 mutacionado pontualmente, também existente em muitos tumores da mama das mulheres, é um alvo potencial para as células T citotóxicas (Yanuck M et al. Câncer Res. 53:3257-3261, 1993). Estão agora a começar estudos clínicos em que péptidos que reflectem mutações pontuais específicas estão a ser estimulados com linfócitos do sangue periférico humano (LSP) e são depois readministrados aos pacientes. A mucina do cancro da mama, MUC-1 ou DF3, representa um antigénio de diferenciação da mama (Abe M e Kufe D, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:282-286, 1993). Embora a mucina MUC-1 seja expressa num conjunto de tecidos epiteliais normais, parece ser exclusivamente glicosilada no tecido do cancro da mama. Foi já assinalado que a repetição sequencial, em tandem, da proteína do núcleo da mucina MUC-1 era imunogénica nos seres humanos (Bamd DL et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 86:7159-7163,1989), na medida em que os nodos linfáticos de pacientes com cancro da mama contêm células T que podem ser activadas pelos péptidos da MUC-1 de uma forma restrita de tipo independente do CHP (o mesmo que ‘non-MHC’). Também foi demonstrado (Rnghetti A et al., Câncer Res. 53:2457-2459, 1993) que as pacientes com cancro dos ovários podem produzir respostas de anticorpos para esta região. Foram já descritos modelos de animais em que o gene da mucina MUC-1 foi inserido em vírus de vaccinia (Hareuveni M et al, Proc. Natl. Acad. Sd. USA 87:9498-9502,1990; Hareuveni et cd., Vaccine 9:618-626, 1991). Presentemente está a decorrer uma experiência clinica em que o péptido MUC-1 está a ser estimulado com os LSP humanos, em paciente com cancro da mama. Uma outra mucina que constitui um alvo potencial para a terapia do cancro é a TAG-72 existente em cerca de 70% a 80% dos cancros da mama das mulheres (Thor A et d., Câncer Res. 46:3118--3124,1986).

[0005] Na maior parte das experiências para a imunização activa contra os antigénios do cancro foram utilizadas células tumorais intactas ou fragmentos de células tumorais, embora tivesse sido mais desejável efectuar a imunização especificamente contra antigénios tumorais únicos em que houvesse distinção entre as células malignas e as células normais. A natureza molecular dos antigénios associados a tumores, reconhecidos pelos linfócitos T, não está perfeitamente esclarecida. Ao contrário dos anticorpos que reconhecem epítopos ou proteínas intactas, as células T reconhecem fragmentos peptídicos curtos (8 a 18 aminoácidos) que são apresentados sobre a superfície celular por moléculas de classe I ou Π do complexo da histo-compatibilidade principal (CHP), presumindo-se que os antigénios associados aos tumores sejam provavelmente apresentados e reconhecidos desta maneira pelas células T.

[0006] Foram já identificados diversos genes que codificam os antigénios tumorais do melanoma reconhecidos por TIL no contexto da molécula ALH-A2 (o mesmo que HLA-A2) de classe I (Kawakami Y. et d. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:3515-3519,1994; Kawakami Y. et d. J. Exp. Med. 180:347-352,1994; Kawakami Y. et d. Câncer Res. 54:3124-3126, 1994).

[0007] O antigénio carcinoembriónico humano (ACE, o mesmo que CEA) é uma molécula que constitui um alvo potencial para a imunoterapia de um conjunto de carcinomas dos seres humanos, incluindo os carcinomas colorrectais, gástricos, pancreáticos, mamários e das células não pequenas (Robbins PF et d., Int. J. Câncer 53:892-897, 1993; Esteban JM et d., Câncer 74:1575-1583, 1994). Estudos experimentais vieram comprovar que os anticorpos anti-idiotípicos dirigidos contra anticorpos monoclonais anti-ACE podem fazer aparecer respostas imunitárias nos murganhos (Bhattacharya-Chatterjee M et d., Int. Rev. Immuno. 7:289-302, 1991). Presentemente estão a ser realizados estudos clínicos em que são utilizados estes anticorpos anti-idiotípicos. Também foi já desenvolvida uma vacina recombinante em que o gene ACE foi inserido num vírus de vaccinia (Kantor J. et d., J. Natl. Câncer Inst. 84:1084--1091, 1992). Recentemente acabou de ser completado um estudo clínico de fase I em que esteve envolvida esta vacina.

[0008] A identificação de um péptido imunodominante que represente um antigénio tumoral exclusivo abriu novas possibilidades no domínio da imunização contra o cancro. Em modelos com animais foram obtidos resultados importantes que permitem concluir que a imunização com péptidos virais imunodominantes pode induzir os LTC (o mesmo que CTL) virais específicos que podem conferir protecção contra infecções virais. Embora o péptido puro por si só seja ineficaz para estimular as respostas das células T, os péptidos emulsionados em adjuvantes ou formando misturas complexas com lípidos são capazes de tomar os murganhos octivos contra estímulos com vírus recentes e podem induzir LTC específicos de vírus que protejam os murganhos contra inóculos virais letais (Kast, W.M. et ai Proc. Nad. Acad. Sei. U.S.A. 88:2283-2287, 1991; Deres, K. et al. Nature 342:561-564, 1989; Gao, X.M. et ai l hnmunol. 147:3268-3273, 1991; Aichele, P. J. Exp. Med. 171:1815-1820,1990; Collins, D.S. et ai J, Immunol. 148:3336-3341, 1992). A imunização de murganhos contra esplenócitos recobertos com epitopos peptídicos de Listeria monocytogenes também teve como consequência a geração de LTC específicos de Listeria que podem ser multiplicados em cultura. A transferência adoptiva destes LTC pode proteger os murganhos contra um estimulo bacteriano letal (Harty, J.T. et al. J, Exit Med. 175:1531-1538, 1992). Os péptidos representativos de epitopos antigénicos das glicoproteínas gpl20 e gpl60 do V1H, emulsionados em adjuvante de Freund completo, também podem activar respostas específicas dos LTC (Takahashi, H. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:3105-3109, 1988; Hart, M.K. et ai Proc. Nat’l Acad. Sei. U.S.A. 88:9448-9452, 1991).

[0009] Embora a imunização com péptidos em adjuvantes ou formando misturas complexas com lípidos dê origem a respostas das células T nos murganhos, raramente as reacções são suficientemente fortes para induzirem células T reactivas em esplenócitos primários. A detecção de linfócitos sensibilizados exige quase invariavelmente uma estimulação secundária in vitro.

[0010] Demonstrou-se que a expressão da família de genes B7 é um mecanismo importante das respostas antitumorais quer nos murganhos quer nos seres humanos. Começa agora a ser evidente que são necessários pelo menos dois sinais para a activação das células T naturais pelas células destinatárias portadoras dos antigénios: um sinal específico do antigénio, fornecido através do receptor das células T, e um sinal independente do antigénio ou co--estimulador que conduz a produtos de linfoquinas (Hcllstrom, K.E. et al. Armais NY Acad 7

Sei. 690:225-230,1993). Duas moléculas co-estimuladoras importantes são a B7-1, que é um ligando para os antigénios CD28 e CTLA4 da superfície das células T (Schwartz, R.H. Cell 71:1065-1068, 1992; Chen, L. eted. Cell 71:1093-1102, 1992; Freeman, GJ. et d. J. Immunol. 143:2714-2722, 1989; Freeman, G.J. et d. J. Exp. Med. 174:625-631, 1991), e a B7-2, que é um ligando alternativo para as CTLA4 (Freeman, GJ. et d. Science 262:907-909, 1993) Até ao momento presente foram já descritas quer as B7-1 e B7-2 dos murinos (Freeman, GJ. et d. J. Exp. Med. 174:625-631. 1991; Freeman, GJ. et d. Science 262:907-909,1993) quer as B7-1 e B7-2 dos seres humanos (Freeman, G.J. et d. J. Immunol. 143:2714-2722, 1989; Freeman, G.J. et dScience 262:909-911, 1993). Até ao momento ainda não está esclarecido se os sinais co-estimuladores gerados pelas B7-1 e B7-2 são mecanismos funcionalmente distintos ou redundantes para a activação das células T (Hathcock, K.S. et d. J. Exp. Med. 180:631-640, 1994). A maior parte dos tumores dos murinos e dos seres humanos não exprimem as B7-1 ou as B7-2, implicando isso que mesmo quando um tumor exprime um antigénio de rejeição potencial, é improvável que active respostas antitumorais das células T (Hellstrom, K.E. et d.

Annals NY Acad. Sei. 690:225-230, 1993; Hellstrom, I. et d. Annals NY Acad. Sei. 690:24-31, 1993). Em termos essenciais, a anergia pode resultar do facto de apenas haver um sinal recebido pelas células T (Hellstrom, K.E. et d. Annals NY Acad. Sei. 690:225-230, 1993). Comprovou-se que a transfecção das B7 para dentro de células de melanomas induz a rejeição de um melanoma dos murinos in vivo (Townsend, S.E. et d. Science 259:368-370,1993).

[0011] Os vírus de vaccinia têm sido utilizados exaustivamente nos seres humanos e a utilização de uma vacina à base dos vírus de vaccinia contra a varíola levou à irradicação universal desta doença (estudo recapitulativo na obra de Moss, B. Science 252:1662-1667, 1991). Os vírus de vaccinia tem a vantagem de serem baratos, termicamente estáveis e de ser 8 simples o método para a sua administração. Foram feitas experiências para o desenvolvimento de vectores de vírus de vaccinia para a prevenção de outras doenças.

[0012] O vírus de vaccima é um elemento da família dos poxvírus que são viras de ADN citoplásmico. A recombinação do ADN ocorre durante a replicação dos poxvírus e este fenómeno tem sido utilizado para se inserir ADN no genuína virai. Os vectores de expressão dos vírus de vaccinia recombinantes foram já descritos exaustivamente. Estes vectores podem conferir imunidade celular contra um grande número de produtos génicos exógenos e podem φ proteger contra doenças infecciosas em diversos modelos com animais. Os vírus de vaccinia recombinantes também têm sido utilizados em experiências clínicas com seres humanos. Cooney et al. imunizaram 35 homens saudáveis seronegativos ao VIH com um vírus de vaccinia recombinante que exprime o gene do invólucro da gpl60 do VIH (Cooney, E. et al. The Lancet 337:567-572, 1991). Graham et al. distribuíram aleatoriamente 36 voluntários que receberam quer o vírus de vaccinia recombinante que continha a proteína do invólucro da gpl60 do VIH quer o vírus de vaccinia de contraprova (Graham, B.S. et al. J. Infect. Dis. 166:244-252, 1992). Foram iá iniciados estudos de Fase I utilizando vírus de vaccima recombinantes em pacientes com melanoma metastátreo, utilizando um vírus recombinante que exprime o antigénio de melanoma p97 (Estin, C.D. etal, Proc. Nafl Acad. Sei. USA 85:1052-1056,1988), e foram já completados estudos de Fase 1 utilizando vírus de vaccinia recombinantes que exprimem o antigénio carcinoembriónico humano em pacientes com carcinoma da mama, do pulmão ou coloirectal em estado avançado. Nestas experiências, o vírus de vaccinia foi administrado por escarificação intrademial e os efeitos secundários foram mínimos, incluindo a irritação local da pele, a linfoadenopatia e os sintomas transitórios análogos aos da gripe.

[UU13]

Na obra ‘Ccll. Mol. Biol.’ (1994) 40, págs. 49-59, vem descrito um vírus de vaccinia recombinante em cujo genoraa está incorporada a sequência que codifica um antigénio (Muc-1) associado ao cancro e um gene que codifica uma citoquina.

[0014] Na obra ‘Repr. Fert Develop. 6 (Setembro de 1994), págs. 389-392’ vem descrito um outro vírus de vaccinia recombinante que contém o gene que codifica a glicoproteína hemaglutinina do vírus da gripe e o gene que codifica a IL-5 ou a IL-6 dos murinos.

[0015] O documento WO 91/02805 divulga retrovíms recombinantes que contêm um gene que codifica um antigénio e um gene que codifica uma proteína do CHP, responsáveis por uma resposta imunitária correcta.

[0016] O documento WO 92/19266 divulga um vírus de vaccinia/ÀCE recombinante que desencadeia uma resposta imunitária in vivo contra o ACE ou contra células que exprimam o ACE e explica a sua utilização conjuntamente com uma molécula imunoestimuladora exógena [0017] Os avipoxvírus das galinhas e dos canários são membros da família dos poxvírus (genes de avipoxvírus). Estes vírus replicam-se apenas em células de aves e não são capazes de se replicarem nas células dos seres humanos. São vírus citoplásinicos que não se integram realmente no genoma hospedeiro mas que são capazes de exprimir um grande número de genes recombinantes em células eucarióticas.

[0018] O avipoxvírus recombinante que exprime a ghcoproteína da hidrofobia tem sido utilizado para proteger murganhos, gatos e cães contra estímulos de vírus vivos da hidrofobia. A imunização de galinhas e perus com um avipoxvírus recombinante que exprime o antigénio HA da gripe conferiu protecção contra um estímulo letal com o vírus da gripe (Taylor et al, Vaccine 6:504-508, 1982). Voluntários para experiências com o avipoxvírus dos canários receberam doses da ordem de 1035 unidades infecciosas (Cadoz M et al., The Lancet 339:1429--1432, 1992). Num estudo recente patrocinado pelo NI AID (Protocol 012A: A Phase I safety and immunogenicity trial of live recombinant canarypox-gp 160 MN (ALVAC VCP125II1V-lgplóOMNO in HIV-1 unmfected adults). os pacientes receberam o avipoxvírus recombinante dos canários que continha o gene da gpl60 do VIH por injecçâo intramuscular em doses da ordem de 1055 u.f.p. com fraca ou nenhuma toxicidade (comunicação pessoal, P.Fast, NIA1D).

[0019] Os avipoxvírus representam pois veículos atractívos para efeitos de imunização, uma vez que podem estimular tanto a imunidade humoral como a celular, podem ser produzidos economicamente com titulações elevadas (109 u.f.p./mL) e ainda devido ao facto de a sua incapacidade para infectarem de forma multiplicativa as células humanas aumentar imenso a segurança da sua utilização.

[0020] Outra vantagem considerável dos avipoxvírus reside no facto de serem pouco ou mesmo nada interreactivos com os vinis de vaccinia e por isso os seres humanos já vacinados poderem não ter reactividade imunitária preexistente às proteínas dos avipoxvírus das galinhas.

[0021] A presente invenção refere-se a uma composição de vacinas de vectores virais recombinantes para a prevenção ou para o tratamento de estados patogénicos e cancro. Mais particularmente, diz respeito a uma composição de vectores virais recombinantes que contêm genes que codificam um ou vários antigénios e vectores virais recombinantes que contêm um ou vários genes que codificam uma ou várias moléculas imunoestimuladoras determinadas. Estes genes podem ser inseridos num único vector recombinante ou em vectores virais independentes. Um outro aspecto da presente invenção diz respeito ao reforço da resposta imunitária contra células doentes (tais como as células tumorais) num mamífero, mediante a infecção de tais células com um vector recombinante que contenha um ou vários genes imunoestimuladores, quer in situ quer in vitro, e subsequente reintrodução das células infectadas no hospedeiro. DESCRIÇÃO ABREVIADA DOS DESENHOS [0022] Estes c outros objectivos, particularidades e muitas outras vantagens previsíveis da invenção serão melhor compreendidas após a leitura da memória descritiva minuciosa subsequente.

As figuras 1A-1D correspondem a análises por fluorescência de células BSC-1 que exprimem proteínas Vr-B7 (o mesmo que rV-B7). As células BSC-1 foram contrastadas para qualquer das proteínas superficiais B7-1 ou B7-2 antes da infecção (figura IA), após infecção com um valor de MDI (o mesmo que MOI) igual a 10 de V-Wyeth (figura 1B) ou Vr-B7-1 (figura 1C) ou Vr-B7-2 (figura 1D). As figuras IA e 1B são representativas da contrastação com B7 sobre células BSC-1 normais ou sobre células infectadas com a estirpe de vaccinia primitiva utilizada para construir Vr-B7-1 e Vr-B7-2, ao passo que as figuras 1C e 1D ilustram a expressão forte de proteínas B7 recombinantes após a infecção ccan Vr-B7-1 ou Vr-B7-2, utilizando anticorpos monoclonais específicos para cada uma destas moléculas.

As figuras 2A-2D ilustram o crescimento de células de adenocarcinoma de murganho transplantadas que exprimem as proteínas Vr-B7. Foram organizados grupos de 5 murganhos C57BL/6 que foram injectados com 3 x IO3 células MC38 que não estavam infectadas (figura 2A), que estavam infectadas com um valor de MDI igual a 0,25 de V-Wueth (figura 2B), Vr-B7-1 (figura 2C) ou Vr-B7-2 (figura 2D). As figuras 2A e 2B ilustram as velocidades de crescimento normais das células MC38. As figuras 2C e 2D ilustram as velocidades de crescimento de células MC38 que exprimem proteínas B7 recombinantes. Os tumores foram medidos a duas dimensões. Estas experiências lòram repetidas mais 3 vezes com resultados idênticos. * Animal onde cresceu um tumor intraperitoneal que não foi possível medir.

Figuras 3A-3C. A figura 3 A ilustra o crescimento de tumores MC38 não infectados em murganhos C57BL/6 genuínos. A figura 3B ilustra o crescimento de tumores MC38 em murganhos aos quais se havia administrado previamente (409 dia) células MC38 infectadas com Vr-B7-1 e que haviam sido estimuladas com 3 x 105 células MC38. A figura 3C ilustra o crescimento de tumores MC38 em murganhos aos quais se havia administrado previamente (402 dia) células MC38 infectadas com Vr-B7-2 e que haviam sido estimulados com 3 x IO3 células MC38. A figura 4 corresponde a cada grupo de tratamento de 5 murganhos C5 7BL/6 imunizados com vírus de vaccinia recombinantes que contêm os genes que codificam quer o gene antigénico carcinoembríónico humano (Vr-ACE, o mesmo que Rv-CEA), o gene B7-2 (Vr-B7) dos murinos ou a estirpe de viras de vaccinia (V-Wyeth) de tipo natural. Administrou-se a cada murganho 1 x 10 unidades formadoras de placas por escarificação da cauda nas proporções seguintes: 1:1 de Vr-ACE/Vr-B7 (5 x 106 u.f.p. de Vr-ACE + 5x 106 ufp. de Vr-B7); 1:1 de V-Wyeth/Vr-B7 (5 x 106 u.f p. de V-Wyefli + 5 x 106 u.fp. de Vr-B7); ou 1:1 de Vr-ACE/V-Wyeth (5 x 106 u.f.p. de Vr-ACE + 5 x 106 u.f.p. de V--Wyeth). De cada grupo de tratamento foram retirados 3 baços e reunidos 14 dias após a imunização e realizou-se um ensaio convencional linfoproliferativo de 5 dias conforme já anteriormente descrito (Kantor et al. INCE 84:1084, 1992). Efectuou-se um teste de células T purificadas para investigar a sua capacidade proliferativa em presença de um baculovírus que produziu o ACE recombinante, à razão de 100 pg/mL. Calculou-se o índice de estimulação pela relação entre a reactividade das células e a dos meios (reactivtdade espontânea). A figura 5 corresponde a cada grupo de tratamento de 5 murganhos C57BL/6 imunizados com vírus de vaccinia recombin antes que codificam os genes, quer para o gene antigénico carcinoembriónico humano (Vr-ACE), o gene B7-2 (Vr-B7) dos muiinos ou a estirpe de vírus de vaccinia (V-Wyeth) de tipo natural. Administrou-se a cada murganho 1 x 107 unidades formadoras de placas por esoarifkação da cauda nas proporções seguintes: 1:3 de Vr-ACE/Vr-B7 (2,5 x 106 u.f.p. de Vr-ACE + 7,5 x 106 u.f.p. de Vr-B7); 1:3 de V-Wyeth/Vr-B7 (2,5 x 106 u.f.p. de V-Wyeth + 7,5 x 106 u.f.p. de Vr-B7); ou 1:3 de Vr-ACE/V-Wyeth (2,5 x 106 u.f.p. de Vr-ACE + 7,5 x 106 u.f.p. de V-Wyeth). Foram retirados 3 baços e reunidos 14 dias após a imunização e realizou-se um ensaio convencional linfoproliferativo de 5 dias, conforme já anteriormente descrito (Kantor et al. INCl 84:1084, 1992). Efectuou-se um teste às células T purificadas para investigar a sua capacidade proliferativa em presença de um baculovírus que produziu o ACE recombin ante, à razão de 100 pg/riíL. Calculou-se o índice de estimulação pela relação entre a reactividade das células e a dos meios (reactividade espontânea).

As figuras 6A-6D ilustram a análise por fluorescência de células BSC-1 co-infectadas com Vr-ACE e Vr-B7. As células BSC-1 foram co-infectadas com vírus segundo um valor de MDI igual a 5 nas proporções seguintes: 6A) V-Wyeth; 6B) Vr-ACE:V-Wyeth (3:1); 6C) Wyeth:Vr-B7 (3:1); ou 6D) Vr-ACE:Vr-B7 (3:1) e contrastadas com os Acm PE-B7-1 e com ITFC-COL-1 (o mesmo que FITC-COL-1). Os eixos dos X e dos Y representam respectivamente a fluorescência do ACE e do B7-1, ao passo que o eixo dos Z representa o número de células. As percentagens de células positivas em cada quadrante estão indicadas nos painéis inclusos. A figura 6A ilustra a contrastação de células BSC-1 normais infectadas com a estirpe de vaccinia original. As figuras 6B e 6C ilustram a expressão de ACE ou de B7-1 durante infecções angulares, ao passo que a figura 6D ilustra a co-expressão das duas moléculas recombinantes a seguir à infecção com Vr-ACE e Vr-B7. A figura 7 mostra o aumento de actividade dos LTC (o mesmo que CTL) primários a seguir à imunização com Vr-ACE e/ou Vr-B7. Analisou-se a actividade citotóxica específica para os ACE ao fim de 10 dias após a imunização com um total de 1 x IO7 u.f.p. com Vr-ACE:V-Wyeth (3:1; triângulos) ou Vr-ACE:Vr-B7 (3:1; círculos). As células T esplénicas de cada grupo foram incubadas quer com células MC38 (negativas ao ACE; símbolos a cheio) quer com células MC-38-ACE-2 (positivas ao ACE; símbolos em branco) num ensaio citotóxico de 16 horas. A actividade dos LTC anti-V-Wyeth foi >50% em todas as amostras (dados não representados).

As figuras 8A-8D ilustram o crescimento de células de adenocarcinoma de murganho transplantado que exprimem os ACE em muiganhos imunizados com Vr-ACE e Vr-B7. Efectuou-se a imunização de murganhos C57BL/6, à razão de 10 animais por grupo, uma vez com um total de 107 u.f.p. quer de 8A) V-Wyeth; 8B) Vr-ACE: V-Wyeth (3.1); ou 8C) V-Wyeth:Vr-B7 (3:1); ou 8D) Vr-ACE:Vr-B7 (3:1), tendo os animais sido injectados 14 dias mais tarde, por via subcutânea, com 3 x 105 células MC-38-ACE-2. As figuras 9A-9B ilustram a imunidade antitumoral em murganhos que haviam recebido previamente uma mistura de Vr-B7 e Vr-ACE. A figura 9A ilustra o crescimento de tumores MC-38-ACE-2 em murganhos C57BL/6 genuínos e ilustra também o crescimento tumoral em muiganhos sobreviventes a um estímulo tumoral prévio (figura 9B). Os muiganhos foram imunizados com Vr-ACE.Vr-B7 (3:1) e estimulados com tumores 14 dias mais tarde. Os murganhos que continuavam isentos de tumores ao fim de 60 dias (figura 8D) foram novamente estimulados no flanco oposto (figura 9B). A figura 10 ilustra o aumento da actividade dos LTC primários a seguir à imunização com Vr-AEP e Vr-B7-1. Estudou-se a actividade citotóxica específica para o AEP ao fim de 10 dias após a imunização com um total de 1 x 107 u.f.p. de Vr-AEP, Vr-AEP: Vr-B7-1 ou Vr-ACE:Vr-B7-l. As células T esplénicas dc cada grupo foram incubadas quer com células MC38 quer com células MC38-AEP num ensaio dtotóxico de 16 horas.

[0023] A presente invenção é uma composição que compreende um novo viras recombinante que exprime um ou vários antigénios de um agente causador de uma doença ou de um estado patológico e um vírus recombinante que exprime (a) determinadas moléculas imunoestimuladoras ou genes que codifiquem as duas moléculas inseridas no mesmo vector. A composição é capaz de desencadear e/ou estabelecer correctamente uma resposta imunitária num mamífero contra antigénios ou anticorpos dependentes das células T, com a finalidade de se evitar ou tratar uma doença. A composição da presente invenção é particularmente importante para regular perfeitamente a imunidade mediada pelas células e anticorpos.

[0024] A imunidade mediada pelas células é crucial nos casos de doenças resistentes originadas por cancro e por microrganismos patogénicos, em particular os vírus e outros microrganismos intracelulares. A composição da presente invenção contém um primeiro vírus recombinante que possui incorporado num genoma virai ou numa parte sua um ou vários genes ou partes suas, codificadores de um antigénio de um estado patológico, e um segundo vírus recombinante que tem incorporado no seu genoma virai, ou numa parte sua, um ou vários genes ou partes suas, codificadores das moléculas imunoestimuladoras B7.1, B7.2 ou B7.1 e B7.2, por si sós ou em combinação com uma molécula imunoestimuladora exógena, 16 com um fármaco quimioterapêutico, um antibiótico, um fármaco antiviral ou ainda com um fármaco antifúngico, sendo essa composição capaz de co-infectar uma célula hospedeira para daí resultar a co-expressão de genes codificadores de um antigénio de um estado patológico e de genes codificadores das moléculas B7.1, B7.2, ou B7.1 e B7.2.

[0025] Uma célula hospedeira infectada com os dois vírus recombinantes exprime simultaneamente o(s) antigénio(s) de um agente causador da doença e também exprime as moléculas imunocstimuladoras. 0 antigénio pode ser expresso à superfície celular da célula hospedeira infectada. A molécula imunoestimuladora pode ser expressa à superfície celular ou pode ser segregada activamente pela célula hospedeira.

[0026] A expressão tanto do antigénio como da molécula imunoestimuladora proporciona o necessário péptido restrito do CHP para as células T específicas e o sinal adequado para que as células T colaborem no reconhecimento do antigénio e na proliferação ou na expansão clonal de células T específicas do antigénio. O resultado global é uma regulação perfeita do sistema imunitário. De acordo com uma variante preferencial, a regulação perfeita da resposta imunitária é um aumento de linfócitos auxiliares T específicos do antigénio e/ou de linfócitos citotóxicos, os quais são capazes de aniquilar o agente causador de uma doença ou uma célula infectada com o agente causador de uma doença ou de inibir o crescimento desse agente ou dessa célula.

[0027] De acordo com uma variante, a composição contém um vírus recombinante que compreende o genoma virai, ou partes suas, e uma sequência de um ácido nucleico que codifica um antigénio proveniente de um microrganismo patogénico, e contém também um vírus recombinante que compreende uma ou várias sequências de ácidos nucleicos que codificam uma ou várias das moléculas ímunoestimuladoras anteriomienle referidas.

[0028] De acordo com outra variante, a composição contém um vírus recombinante que compreende o genoma virai, ou partes suas, e a sequência de um ácido nucleico que codifica um antigénio associado a um tumor, e contém também um vírus recombinante que compreende uma ou várias sequências de ácidos nucleicos que codificam uma ou várias moléculas imunoestimuladoras referidas antes.

[0029] Ainda de acordo com outras variantes, os vírus recombinantes são construídos de modo a exprimirem citoquinas (F-αΝΤ (o mesmo que TNF-a), IL-6, FEC-MG (o mesmo que GM-CSF) e IL-2) e moléculas co-estimuladoras e acessórias (B7-1, B7-2) por si sós e em diversas combinações. A produção simultânea de uma molécula imunoestimuladora e do modelo de AAT (o mesmo que TAA) no local de replicação/infecção virai (em qualquer caso, o local de produção de AAT) aumenta a geração de efectores específicos. Consoante sejam as moléculas imunoestimuladoras específicas, assim pode haver diferentes mecanismos responsáveis pela maior imunogenicidade e aumento do sinal auxiliar (IL-2), mobilização de ‘APG’ aniquiladores e digestores (profissionais) (FEC-MG), aumento da frequência dos LTC (IL-2), efeito sobre o circuito de transformação dos antigénios e expressão do CHP (EFN-γ e F-ctNT), e não só. A co-expressão de um antigénio modelar conjuntamente com uma molécula imunoestimuladora eventualmente única é eficaz num modelo de animais para se demonstrar os efeitos antitumorais.

[0030] Em alguns casos pode ser benéfico produzir um vírus recombinante que contenha mais do que um antigénio relevante, com a finalidade de se obter uma vacina multivalente. Por exemplo, o vírus recombinante pode conter o genoma virai, ou partes suas, a sequência de ácido nucleico que codifica a gpl20 (do VIH) e a sequência de ácido nucleico que codifica o antigénio da superfície das Hep B.

[0031] De acordo cora uma variante, a composição contém um vírus recombinante que compreende uni genoma virai dc vaccinia, ou partes suas, a sequência de ácido nucleico que codifica o ACE e contém também um vírus recombinante que compreende a sequência de ácido nucleico que codifica a molécula imunoestimuladora B7.1 por si só ou em combinação com a sequência de ácido nucleico que codifica a molécula imunoestimuladora B7.2, ou contém um vírus recombinante que possui simultaneamente os genes para um antigénio tumoral e para uma molécula imunoestimuladora.

[0032] A presente invenção também diz respeito a um vírus recombinante que compreende o genoma virai, ou uma parte sua, e uma ou várias sequências de ácidos nucleicos que codificam uma ou várias moléculas B7, de preferência um vírus de vaccinia recombinante que exprima as moléculas B7-1 dou B7-2. A infecção rápida de células tumorais com estes vinis recombinantes demonstra que o vírus de vaccinia pode exprimir com autenticidade estas proteínas e que estas são moléculas funcionais. Os tumores singénicos fiacamente imunogénicos que exprimem estas moléculas recombinantes são rejeitados pelos hospedeiros imunocompetentes.

[0033] De acordo com um caso específico, o vírus recombinante é um vírus de vaccinia recombinante que contém a molécula B7.1 ou é um vírus de vaccinia recombinante que contém a molécula B7.2 (designados respectivamente por Vr-B7-1 e Vr-B7-2).

[0034] De acordo com uma variante, a composição compreende os Vr-B7-1 e/ou os Vr-B7-2 em combinação com os Vr-ACE. A molécula B7 designa, sem que isso constitua qualquer limitação, as moléculas B7-1, B7-2 c outras que tais e seus análogos. O gene das B7 pode ser clonado a partir de fontes obtidas de mamíferos, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, tecidos de mamíferos, bancos de dados genómicos ou bancos de dados de ADNc, de preferência a partir de fontes de murinos ou de seres humanos. 19

Vectores de vírus [0035] Os vírus utilizáveis na presente invenção são aqueles em que uma parte do seu genoma pode ser suprimida para a introdução de novos genes sem que haja destruição da infecciosidade do vírus. O vector virai da presente invenção é um vírus não patogénico. De acordo com uma variante, o vector virai possui um tropismo para um tipo de células especificas num mamífero. De acordo com outra variante, o vector virai da presente invenção é capaz de infectar células que possuam antigénios profissionais, tais como as células dendríticas e os φ macrófagos. Ainda de acordo com outra variante da presente invenção, o vector virai é capaz de infectar qualquer célula de um mamífero. O vector virai também pode infectar células tumorais.

[0036] O vírus da presente invenção é seleccionado, mas sem que isso constitua qualquer limitação, entre os poxvírus, tais como os vírus de vaccinia, os poxvírus das galinhas e os vírus de vaccinia altamente atenuados (MVA), os adenovírus, os baculovírus e outros que tais.

[0037] O genoma do vírus de vaccima é conhecido na especialidade. É constituído por uma região F13L de H1ND, uma região TK e uma região HA. O vírus de vaccinia recombinante tem sido utilizado na especialidade para incorporar um gene exógeno para a expressão do produto génico exógeno (Perlais et al, Science 229:981-984, 1985; Kaufinan et cd., ínt. J. Câncer 48:900-907,1991; Moss Science 252:1662,1991).

[0038] Um gene codificador de um antigénio de um estado patológico ou de um agente causador de uma doença pode ser incorporado na região F13L de HIND ou em alternativa pode ser incorporado na região TK do vector do vírus de vaccima recombinante ou noutras regiões não essenciais do genoma do vírus de vaccima. De igual modo, um gene codificador de uma molécula imunoestimuladora pode ser incorporado na região f 13L de HIND ou na região TK do vector de vírus de vaccinia recombinante.

[0039] Suttcr e Moss IProc. Nafl. Acad. Sei, U.S.A.. 89:10847-10851, 1992) e Sutter ei al. (Virology. 1994) descrevem a construção e a utilização, como vector, do vírus Ankara recombinante não replicativo (MVA, vírus de vaccinia Ankara modificado) que pode ser utilizado como vector virai na presente invenção.

[0040] Baxby e Paoletti (Vaccine 10:8-9,1992) descrevem a construção e a utilização, como vector, do poxvírus não replicativo, incluindo os avipoxvírus dos canários, os avipoxvírus das galinhas e de outras espécies de aves, que podem ser utilizados como vectores virais na presente invenção.

[0041] Os vectores de expressão adequados para saem utilizados na presente invenção compreendem pelo menos um elemento de controlo da expressão funcionalmente ligado à sequência de ácidos nucleicos. Os elementos de controlo da expressão são inseridos no vector para controlarem e regularem a expressão da sequência de ácidos nucleicos. Como exemplos de elementos de controlo da expressão refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, o sistema lac, as regiões do operador e do promotor do bacteriófago lambda, os promotores de leveduras e os promotores obtidos a partir de poliomas, adenovírus, retrovírus ou o SV40. Como outros exemplos preferidos ou necessários de elementos funcionais refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a sequência líder, os codões de terminação, os sinais de poliadenilaçâo e outras sequências necessárias ou preferidas para a transcrição adequada e para α subsequente tradução da sequência de ácidos nucleicos no sistema hospedeiro. Faz-se observar aos especialistas na matéria que a combinação coirecta dos elementos de controlo de expressão necessários ou preferidos irá depender do sistema hospedeiro escolhido. Também se láz observar que o vector de expressão deve conter outros 21 elementos necessários para a transferência e a subsequente replicação do vector de expressão que contenha a sequência de ácidos nucleicos no sistema hospedeiro. Como exemplos de tais elementos refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, as origens de replicação e os marcadores seleccionáveis. Também se faz observar aos especialistas na matéria que tais vedores são construídos facilmente recorrendo a métodos convencionais, (Ausubel et ai. (1987) em “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, Nova Iorque, Nova Iorque), ou que estão comercialmente disponíveis.

Agentes causadores de doenças [0042] O vírus recombinante da presente invenção é eficaz para tratar ou evitar doenças provocadas por agentes causadores de doenças. A cada agente causador de uma doença ou de um estado patológico está associado um antigénio ou um epítopo imunodominante no antigénio que é crucial no reconhecimento imunitário e na eliminação final ou no combate ao agente causador da doença ou do estado patológico num hospedeiro, por vezes designado na especialidade como antigénio protector. O sistema imunitário do hospedeiro tem de ficar em contacto com o antigénio ou com o epítopo imunodominante no antigénio para construir uma resposta imunitária humoral e/ou celular contra o agente causador da doença correspondente.

[0043] A composição da presente invenção compreende um vírus recombinante que possui uma ou várias sequências de ácidos nucleicos que codificam um ou vários antigénios isolados ou epítopos imunodominantes e um segundo vírus recombinante que possui uma ou várias sequências de ácidos nucleicos que codificam uma ou várias moléculas imuno-estimuladoras.

[0044]

Tais agentes causadores de doenças incluem, mas sem que isso constitua qualquer 22 limitação, os microrganismos patogénicos e os provocadores de cancro. Os cancros que é possível tratar utilizando os vírus recorabinantes da presente invenção são, sem que isso constitua qualquer limitação, os melanomas primários ou metastáticos, timomas, linfomas, sarcomas, cancro do pulmão, cancro do fígado, linfomas de tipo Hodgkins, linfomas sem serem de tipo Hodgkins, leucemias, cancros uterinos e adenocareiiiumas, tais como o cancro da mama, o cancro da próstata, o cancro dos ovários, o cancro pancreático e outros que tais.

[0045] Os cancros anteriormente referidos podem ser verificados ou tratados pelos φ métodos descritos na presente memória descritiva. Em caso de cancro, utiliza-se um gene codificador de um antigénio associado ao cancro que é incorporado no genoma do vírus recombinante ou numa parcela sua conjuntamente com (a) um ou vários genes codificadores de uma ou várias moléculas imunoestimuladoras. Em alternativa, o gene codificador de um antigénio associado ao cancro e os mios genes codificadores de uma ou várias moléculas imunoestimuladoras são incorporados em vírus recombinantes separados. O antigénio associado ao cancro pode ser expresso sobre a superfície de uma célula cancerosa ou pode ser um antigénio ^ interno. De acordo com uma variante, o antigénio associado ao cancro é o antigénio associado a um tumor (AAT) ou uma parcela sua Como exemplos de diversos AAT que é possível utilizar na presente invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os AAT dos melanomas entre os quais se refere, mas sem que isso constitua qualquer limitação, o MART-1 (Kawakami et d., J. Bxp. Med. 180:347-352,1994), MAGE-1, MAGE-3, GP-100 (Kawakami et d., Proc. Nat’1. Acad. Sei. U S A. 91:6458-6462, 1994), ACE e tirosinase (Brichaid et d. X Em Med. 178:489, 1993).

[0046] De acordo com outra variante, os AAT são os MUC-1, MUC-2, o oncogene do rato mutacionado pontualmente, os oncogenes p53 mutacionados pontualmente (cana-o pancreático), o CA-125 (cancro do ovário), o AEP (o mesmo que PSA) (cancro da próstata), o c-erb/B2 (cancro da mama) e outros que tais (Boon et al., Ann. Rev. ímmunol. 12:337, 1994).

[0047] A presente invenção não fica de forma alguma limitada aos genes codificadores dos AAT anteriormente enumerados. É possível identificar outros AAT, isolá-los e cloná-los por métodos conhecidos na especialidade, tais como os descritos na patente de invenção norte-americana nu 4 514 506.

[0048] Os genes codificadores de um antigénio de um agente causador de uma doença, em que o agente é um microrganismo patogénico, incluem os vírus tais como o VTH (os anti-génios da gp-120, da p!7 e da gp-160), os vírus da gripe (antigénio NP e HA), o vírus do herpes simplex (antigénio HSVdD), o vírus do papiloma humano, o vírus da encefalite dos equinos, o viras da hepatite (antigénio superficial Hep B) e não só. As bactérias patogénicas são, mas sem que isso constitua qualquer limitação, as seleccionadas entre Chlamydia, Mycobacteria, Legionella e outras que tais. Os protozoários patogénicos são, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os provocadores de malária, Bábesia, Schistosomiasis e outros que tais. As leveduras patogénicas são seleccionadas entre Aspergillvs, cândidas invasivas e não só. De acordo com uma variante preferencial, o microrganismo patogénico é um organismo intracelular.

Moléculas imunoestimuladoras: moléculas de co-estimulação acessórias e citoquinas [0049] O gene proveniente da molécula de co-estimulação/acessóiia e/ou o gene codificador de uma citoquina é incorporado no genoma de um vírus recombinante. Como exemplos de moléculas de co-estimulação refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, as moléculas B7-1, B7-2, M-1AIC (o mesmo que ICAM-1), LFA-3, CD72 e outras que tais. Como exemplos de citoquinas abrangidas pela presente invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, as selcccionadas entre IL-2, FEC-GM, FctNT, IFN-γ, IL-12, RANTES c não só.

Arquétipo IL-2 [0050] O gene de IL-2 utilizado na presente invenção é produzido conforme descrito por Taniguchi et al (Nature 302.305,1983).

Arquétipo B7 [0051] As moléculas co-estimuladoras da família B7 (designadamente as B7.1, B7.2 e eventualmente a B7.3) representam um grupo de moléculas descobertas recentemente mas muito importantes. Tanto a B7.1 como a B7.2 são membros da superfamília de genes de Ig. Estas moléculas encontram-se presentes nos macrófagos, nas células dendríticas e nos monócitos, isto é, células possuidoras de antigénios (CPA). Se um lmfócito encontrar um antigénio sozinho, sem co-estimulação pelas B7.1, irá responder quer com anergia quer com apoptose (morte celular programada); se o sinal co-estimulador estiver presente, irá responder com expansão clonal contra o antigénio visado. Não ocorre nenhuma amplificação significativa da resposta imunitária contra um dado antigénio sem co-estimulação (June et al. Immunology Today 15:321-331, 1994; Chen et al. (Immunology Today 14:483-486); Townsend et al (Science 259:368-370)). Freeman et al (J. Immunol. 143 :2714-2722,1989) descrevem a clonagem e a sequenciação do gene das B7.1. Azuma et al. (Nature 366:76-79,1993) descrevem a clonagem e a sequenciação do gene de R7.2 De acordo com uma variante, inseriu-se o gene de B7.1 ou um gene de B7.2 em vírus de vaccima. De acordo com outra variante, inseriu-se quer o gene de ACE quer o gene de IL-2 num único vírus de vaccima. Os arquétipos Vr-ACE/IL-2 (o mesmo que iVCEA/IL-2, com α designação VR n° 2480 da ATCO), Vr-ACE-T108 (o mesmo que rV-CEA- -Τ108, com a designação VR n° 2481 da ATCC), Vr-B7-2 (o mesmo que rV-B7-2, com a designação VR n° 2482 da ATCC) e Vr-JB7-1 (o mesmo que rV-,nB7-l, com a designação VR n° 2483 da ATCC) foram depositados na Colecção Americana de Culturas Tipo [American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland] a 3 de Outubro de iyy4 nos termos do Tratado de Budapeste.

[0052] A presente invenção também diz respeito a composições farmacêuticas para tratar ou para evitar uma doença provocada por agentes causadores de doenças ou os estados patológicos aqui descritos.

[0053] Nos casos de tratamento, a administração do vírus recombinante da presente invenção ou de uma composição que contenha os vírus recombinantes pode ter uma finalidade ‘"profiláctica” ou “terapêutica”. Quando administrado com fins profilácticos, o vírus recombinante ou a composição de vírus recombinantes da presente invenção são administrados antes de terem surgido quaisquer sintomas. A administração profiláctica do vírus recombinante ou da composição de vírus recombinante tem por finalidade evitar ou atenuar qualquer infecção ou doença subsequentes. Quando a administração visar fins terapêuticos, o vírus recombinante ou a composição de mais do que um vírus recombinante será administrada no momento de manifestação de um sintoma de infecção ou de doença ou imediatamente a seguir. Assim, as variantes da presente invenção podem ser aplicadas quer antes da exposição a um agente causador de doenças quer antes de um estado patológico quer após o início da infecção ou da doença [0054] A definição genética de antigénios específicos de tumores permite o desenvolvimento de vacinas específicas de antigénios relevantes para a terapia do cancro. A inserção de um gene antigémeo tumoral no genoma de vinis em combinação com um vírus recombinante que contenha uma molécula imunoestixnuladora constitui um sistema poderoso para fazer aparecer uma resposta imunitária específica, em termos de preveução, num paciente com um risco acrescido de desenvolvimento de cancro (imunização preventiva), ou para a prevenção de recorrência patológica a seguir a uma intervenção cirúrgica primária (vacinação antimetastática) ou ainda como ferramenta para fazer aumentar o número dos LTC in vivo, melhorando assim a sua eficácia na irradicação de tumores difusos (tratamento de doenças já instaladas). Finalmente, os vírus recombinontes ou as composições da presente invenção podem fazer aparecer uma resposta imunitária num paciente, ou seja, reforçados ex vivo, antes de serem novamente transferidos para o portador do tumor (imunoterapia adoptiva).

[0055] A expressão “dose unitária” quando associada ao inoculo designa unidades fisicamente discretas que são adequadas como doses unitárias para os mamíferos, contendo cada unidade uma quantidade predeterminada do vírus recombinante, calculada para produzir o efeito imunogénico desejado em associação com o diluente necessário. As especificações para a nova dose unitária de um inoculo da presente invenção dependem das características exclusivas do vírus recombinante e do efeito imunológico particular que se pretende alcançar.

[0056] O inoculo é preparado tipicamente sob a forma de uma solução num diluente tolerável (aceitável), tal como um soluto salino, um soluto salino tamponado com fosfato ou qualquer outro diluente fisiologicamente tolerável ou quaisquer outras substâncias congéneres para a preparação de uma composição farmacêutica aquosa.

[0057] A via de inoculação pode ser intravenosa (I.V.), intramuscular (LM.), subcutânea (S.C.), intradermal (I.D.) e não só, daí resultando o aparecimento de uma resposta protectora contra o agente causador da doença. A dose é administrada pelo menos uma vez. Podem ser administradas doses subsequentes, conforme indicado.

[0058] Ao administrar a um mamífero o vírus recombinante da presente invenção, de preferência a um ser humano, o regime de dosagem do vírus recombinante administrado irá variar em função de factores tais como a idade do mamífero e o seu peso, altura, sexo, estado médico geral, historial médico anterior, evolução da doença, cargatumoral e quejandos.

[0059] Em geral, é desejável administrar ao mamífero uma dose de cada vírus recom-binante na composição no intervalo compreendido entre cerca de 105 e cerca de IO10 unidades formadoras de placas/mg para cada mamífero, embora seja possível administrar doses inferiores ou superiores.

[0060] A composição de vectores virais recombinantes pode ser introduzida num mamífero antes de haver quaisquer sinais de cancros, tais como o melanoma, ou então para mediar a regressão da doença num mamífero que padeça de um cancro tal como um melanoma. Como exemplos de métodos para a administração da composição aos mamíferos refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a exposição de células aos vírus recombinantes ex vivo, ou a injecção da composição nos tecidos afectados ou ainda a administração dos vinis por via intravenosa, S.C., I.D. ou I.M.. Em alternativa, o vector virai recombinante ou a composição de vectores virais recombinantes podem ser administrados localmente por injecção directa na lesão cancerosa ou por aplicação tópica num veículo farmaceuticamentie aceitável. A quantidade de vector virai recombinante, portador da sequência de ácidos nucleicos de um ou vários AAT que se pretende administrar, tem por base a titulação das partículas de vírus. Um domínio de variação preferido do imunogénio que se pretende administrar está compreendido entre 105 e IO10 partículas de vírus por mamífero, de preferência um ser humano.

[0061] No caso de se utilizar uma combinação de um primeiro vector virai recombinante portador de uma sequência de ácidos nucleicos de um ou vários AAT e de um segundo vector virai recombinante portador da sequência de ácidos nucleicos de uma ou várias moléculas imunoestimuladoras, então o mamífero pode ser imunizado com proporções diferentes entre o 28— primeiro e o segundo vectores virais recombinantes. De acordo com uma variante, a proporção entre o primeiro vector e o segundo vector é de cerca de 1:1 ou de cerca de 1:3 ou de cerca de 1:5. As proporções óptimas entre o primeiro vector e o segundo vector podem ser tituladas facilmente recorrendo aos métodos aqui descritos.

[0062] Após a imunização é possível estimar a eficácia da vacina pela produção de anticorpos ou de células imunitárias que reconheçam o antigénio, conforme avaliado pela actividade lítica especifica ou pela produção de citoquinas específicas ou por uma regressão do tumor. Qualquer especialista na matéria conhece os métodos convencionais para avaliação dos parâmetros anteriormente referidos. Se o mamífero que se pretende imunizar estiver já a padecer de um cancro ou de cancro metastático, a vacina pode ser administrada em conjunto com os outros tratamentos terapêuticos.

[0063] De acordo com um método de tratamento, é possível obter linfòcitos dtotóxicos autólogos ou linfòcitos infiltrantes tumorais a partir de um paciente com cancro. Os linfòcitos desenvolvem-se em cultura e aumenta-se o número de linfòcitos específicos dos antigénios numa cultura na presença do antigénio específico e da citoquina. Os linfòcitos específicos do antigénio são depois infundidos novamente no paciente.

[0064] A presente invenção compreende os métodos para reforçar as respostas das células T específicas de antigénios mediante a administração de uma quantidade eficaz de um antigénio num vírus recombinante em combinação com uma molécula imunoestimuladora, tal como a B7, num vírus recombinante, a um mamífero. Esta via imimizante aumenta ou reforça as respostas imunitárias geradas pelo antigénio com co-estimulação pela molécula co-estimuladora B7. O método de administração de um vírus recombinante, contendo um antigénio, e de um vírus recombinante, contendo uma molécula B7, tem como consequência uma maior linfoproliferação específica de antigémos. uma actividade citolítica reforçada e uma imunidade de longa duração contra o antigénio, comparativamente com a utilização de qualquer vírus recombinante por si só. De acordo com uma variante do método de reforçar as respostas das células T especificas dos antigénios, efectua-se a imunização de mamíferos, de preferência seres humanos, com Vr-AAT e Vr-B7. É possível fazer variar a proporção entre Vr-AAT e Vi-B7 para maximizar a resposta das células T específica dos antigénios. As proporções entre Vr-AAT e Vr-B7 são, sem que isso constitua qualquer limitação, 1:1,2:1, 3:1,4:1 e não só. A eficácia do tratamento pode ser verificada in vitro e/ou in vivo por determinação da Iinfoproliferação específica dos antigénios, da resposta citolítica específica dos antigénios, da regressão tumoral e não só.

[0065] A adição de qualquer quantidade de Vr-B7 a um antigénio, independentemente da proporção, tem como resultado uma melhor imunidade celular. No entanto, é possível determinar uma proporção óptima entre antigénio e Vr-B7 para cada antigénio relevante. De acordo com uma variante, utilizando uma combinação de Vr-ACE e de Vr-B7, o melhor aumento das respostas linfoproliferativas específicas do antigénio, citotóxicas e antitumorais, específicas para o ACE, foi conseguido com uma proporção respectiva de 3:1.

[0066] O método para reforçar as respostas das células T específicas dos antigénios pode ser utilizado para qualquer antigénio. São particulaimente interessantes os antigénios associados a tumores e os antigénios de agentes infecciosos. De acordo com um método para reforçar as respostas das células T específicas dos antigénios, administra-se Vr-ACE e Vr-B7-1 humana a um paciente portador dc um carcinoma positivo ao ACE numa proporção óptima para estimular as respostas das células T específicas do ACE, daí resultando a redução ou a eliminação do carcinoma positivo ao ACE. De acordo com outro método para reforçar as respostas das células T específicas dos antigémos, administra-se Vr-gpl20 ou partes suas e Vr-B7-1 humana a um paciente portador de células positivas à gpl20 numa proporção para estimular os respostas das células T específicas das gpl20, daí resultando uma redução ou a eliminação das células positivas às gpl20.

[0067] Λ presente invenção compreende também uma terapia em regime combinado. A expressão ‘ terapia em regime combinado’ significa que a composição de um vúus rccombinante, que contém um ou vários genes codificadores de um ou vários antigénios associados a um ou vários agentes patológicos e de um vírus recombinante que possua um ou vários genes codificadores de uma ou várias moléculas imunoestimuladoras ou então os dois tipos de genes incorporados no mesmo vector, é administrada ao paciente em combinação com outras moléculas imunoestimuladoras ou imunomoduladoras exógenas, com farmacos quimioterapêuticos, com antibióticos, com fármacos antifúngicos, com farmacos antivirais e outros que tais, por si sós ou combinados entre si. Como exemplos de outros agentes acrescentados exogenamente refere-se as substâncias exógenas IL-2, IL-6, interferões, factores de necrose tumoral, ciclo-fosfamida e cisplatina, ganciclovir, anfotericina B e quejandos. Outro aspecto da presente invenção diz respeito a uma composição utilizável no tratamento do cancro, em que as células cancerosas são infectadas com o vírus rccombinante ou com uma combinação de vírus recombinantes in situ ou in vitro. As células tumorais que exprimam simultaneamente o antigénio associado ao tumor e uma molécula imunoestimuladora são administradas a um mamífero numa quantidade eficaz, de forma a obter-se uma redução do tumor ou a sua eliminação no mamífero que padeça de um cancro.

[0068] A presente invenção compreende também um ou vários anticorpos que surgem por imunização com o vírus rccombinante da presente invenção. O anticorpo possui especificidade para o antigémo relevante e reage com ele ou liga-sc a ele. Nesta variante da invenção, os 31 - anticorpos são de origem monoclonal ou policlonal.

[0069J Como exemplos de moléculas de anticorpos refere-se as moléculas de imuno-globulina intactas, as moléculas de imunoglobulina praticainente intactas ou as parcelas de uma molécula de imunoglobulina que contenha o local de ligação do antigénio, incluindo as parcelas da molécula de imunoglobulina conhecidas na especialidade pelas designações seguintes: F(ac), F(ac’), F(ac)2 e F(v) (o mesmo que F(ab), F(ab’), F(ab)2 e F(v)). Os anticorpos policlonais ou monoclonais pode ser produzidos por métodos conhecidos na especialidade. (Kõhler e φ Milstein (1975) Nature 256, 495-497; Campbell “Monoclonal Antibody Technology, the Production and Chaiacterization of Rodent and Human Hybridomas” em Burdon et al. (Eds.) (1985) “Laboratory Techniques in Biochemistiy and Molecular Biology”, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdão). Os anticorpos ou os fragmentos de ligação aos antigénios também podem ser produzidos por meio de técnicas da engenharia genética. A tecnologia para a expressão dos genes de cadeia pesada e de cadeia leve em E. coli é o assunto dos pedidos de patentes de invenção PCT publicados com os n- WO 901443, WO 901443 e WO 9014424 ^ descritos por Huse et al. (1989) em Science 246:1275-1281.

[0070] De acordo com uma variante, os anticorpos da presente invenção são úteis em imunoensaios para a detecção de novos antigénios relevantes em amostras biológicas.

[0071] De acordo com uma variante, os anticorpos ACE da presente invenção, gerados por imunização com uma composição que contenha um vírus de vaccinia recombinante que exprima um ACE e um vírus de vaccinia recombinante que exprima a molécula B7.1, são utilizados para se estimar a presença do antigénio ACE num tecido obtido por biópsia a partir de um mamífero que padeça de um cancro que exprima o ACE, recorrendo à imunocitoquímica. Tal avaliação da delineação do antigénio ACE num tecido patologicamente afectado pode ser 32 utilizada para prognóstico da evolução da doença num mamífero que padeça dessa doença ou para se conhecer a eficácia da imunoterapia. Os métodos convencionais da histoquímica imunitária estão descritos na edição de ‘Harlow and Lane’ (eds.) (1988) na obra “Antibodies, A Laboratory Manual”, Cold Spring Haibor Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, e no trabalho de Ausubel et al. (Eds.) (1987) em ‘Cunent Protocols in Molecular Biology’, John Wiley & Sons (Nova Iorque, Nova Iorque).

[0072] De acordo com outra variante, os anticorpos da presente invenção são utilizados para imunoterapia. Os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados em imunoterapia passiva.

[0073] Ao administrar-se a um paciente anticorpos ou fragmentos que se liguem a antigénios, se o paciente for um mamífero, de preferência um ser humano, o regime de dosagem em termos de anticorpos administrados ou de fragmentos que se liguem aos antigénios irá variar em função de factores tais como a idade do mamífero e o seu peso, altura, sexo, estado médico geral, historial médico anterior e outros factores semelhantes.

[0074] Os anticorpos ou os fragmentos que se ligam a antigénios da presente invenção irão ser administrados ao paciente em causa numa quantidade suficiente para evitar, mitigar ou atenuar a gravidade, a intensidade ou a duração da doença ou da infecção.

[0075] No decurso de respostas imunitárias aparecem normalmente anticorpos anti-idiotípicos e há uma parte dos anticorpos anti-idiotípicos em que estes se assemelham ao epítopo que induziu a resposta imunitária original. Na presente invenção, o gene de imuno-globulina, ou uma parcela correspondente de um anticorpo cujo local de ligação reflicta um antigénio de um estado patológico, é incorporado no genoma ou na correspondente parcela de um vírus, por si só ou em combinação com um gene ou com a correspondente parcela de uma molécula imunoestimuladora, sendo o vírus recombinante resultante capaz de fazer aparecer respostas imunitárias celulares e humorais contra o antigénio.

Exemplo 1

Construção e caracterização dos arnuétinos ΥΓ-Β7-1 e ΥΓ-Β7-2

MATERIAIS E MÉTODOS Vírus de vaccinia recombinante [0076] Amplificou-se um fragmento de ADN de 1125 pb que codifica todo o bloco de leitura ininterrupta da B7-1 dos murinos e amplificou-se um fragmento de ADN de 942 pb que codifica todo o bloco de leitura ininterrupta da B7-2 dos murinos, tendo a amplificação sido feita por RCP de transcriptase reversa (GeneAmp RNA PCR Kit, Peridn Etmer, Norwalk, CT) a partir de ARN total extraído da linhagem de células B dos murinos A20 (ΤΊΒ 208, ATCC, Rockville, MD). Comprovou-se que as sequências dos fragmentos intercalares de B7 eram idênticas às sequências publicadas (Ffeeman, G.J. et al J. Exp. Med. 174:625-631, 1991; Freeman, G.J. et al. Science 262:907-909, 1993). Os fragmentos de ADN foram ligados separadamente dentro dos locais das enzimas de restrição Kpn-l/Xho-1 do vector PT116 de transferência do vírus de vaccinia, fornecido por ‘Therion Biologics’ (Cambridge, MA) que contém o gene Lac Z de Escherichia coli para a selecção dos vírus recombinantes. Os vírus recombinantes foram obtidos conforme já anterioimente descrito (Kaufinan, H. et al., Int, J. Of Câncer 48:900-907, 1991). Os clones recombinantes foram seleccionados por crescimento sobre células BSC-1 (CC126, ATCC) na presença de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-P-D-galacto-sidase (X-Gal). Os clones recombinantes azuis adequados foram purificados em 5 ensaios de purificação de placas e depois ficaram a crescer num lisado de titulação mais elevada Os vírus para a inoculação cresceram em culturas centrífugas de células HeLa reunidas directamente por cenuifugação e foram purificados sobre gradientes de sacarose a 20%-40% (Moss, B. Current Protocols in Molecular Biology 2.16.15.1 -16. 18. 9, 1993).

Caracterização de vírus recombinantes Análise à Southern da recombinação do ADN

[0077] Os genomas dos vírus de vaccinia recombinantes foram analisados por extracção φ do ADN viraL por digestão das endonucleases de restrição com Hind ΠΙ e pelas autorradiografias de Southern, conforme já anterionnente descrito (Kaufinan, H. et al Int. J. Câncer 48:900--907, 1991).

Análise à Western da expressão das proteínas

[0078] Produziu-se a infecção de células BSC-1 confluentes, quer com o vírus de vaccinia de tipo natural quer com vírus de vaccinia recombinante, que continham os genes de B7-1 ou B7-2 dos murinos (designados por V-Wyeth, Vr-B7-1 ou Vr-B7-2), segundo um valor de MDI φ igual a 10 durante 4 horas. Realizou-se a extracção das proteínas e efectuou-se a sua análise conforme já anterionnente descrito (Kantor, J. et al. J. Nat’l. Câncer Inst. 84: 1084-1091, 1992). A proteína recombinante B7-1 ou B7-2 foi detectada por incubação das autorradiografias de Western com anticorpos monoclonais anti-B7-l (anti-B7/BBl purificado de murganho, conjugado no rato) ou anti-B7-2 (anti-B7-2 do murganho, conjugado no rato (GL-1)) (Pharmingen, San Diegp, CA), seguindo-se a incubação com anti-anticorpos do ralo conjugados na cabra com peroxidase de Armoracia rusticana (PAR, o mesmo que HRP, Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD), tendo a revelação sido efectuada em conformidade com as instruções do fabricante.

Análise da expressão das proteínas por fluorescência [0079] Realizou-se a infecção de células BSC-1 confluentes, quer com V-Wyeth ou Vr-B7-1 ou Vr-B7-2, para um valor de MDI igual a 10 durante 2 horas. As células foram colhidas 3 a 6 horas após a infecção e foram imunocontrastadas com anticorpos monoclonais ITCF-anti-B7/BB 1 (o mesmo que FITC-aiUi-B7/BBl) purificado de murganho, conjugado no rato, ou com anticorpos monoclonais ITCF-anti-B7-2 de murganho, conjugado no rato. Efectuou--se a análise das células por citoinetria de fluxo (FACSCAN, Becton Dickinson, San Jose, CA).

Experiências in vivo [0080] A linhagem de células MC38 do adenocarcinoma do cólon dos murinos (Fox, B.A. et al J, Biol. Response Modifiers 9:499-511,1990) foi fornecida pelo laboratório do Dr. Steve Rosenberg (National Câncer Institute, Bethesda, MD). Realizou-se a infecção das células MC38 quer com V-Wyeth ou Vr-B7-1 ou Vr-B7-2 para um valor de MDI igual a 0,25 durante 1 hora, tendo sido lavadas e colocadas em suspensão em SSHE (o mesmo que HBSS), segundo uma concentração de 3 x 106 célulasfaiL. As fêmeas de murganho da estirpe C57BL/6 foram obtidas em ‘Taconic Famas’ (Germantown, NY). Aos animais com uma idade entre 6 e 8 semanas foi aplicada uma injecção subcutânea de 100 pL (3 x IO3 células infectadas) no flanco direito. Os murganhos de contraprova foram injectados com células MC38 não infectadas. Os murganhos que permaneceram sem tumores durante pelo menos 40 dias foram estimulados no flanco oposto com 3 x 105 células não infectadas. Numa experiência paralela submeteu-se murganhos da estirpe C57BL/6 a radiação gama (γ) (500 rad), tendo estes animais sido injectados 24 horas mais tarde quer com células MC38 não infectadas quer com células infectadas com V-Wyeth ou Vr-B7-1 ou Vr-B7-2 para um valor de MDI igual a 0,25. Mediu-se os tumores com uma craveira segundo duas dimensões c cfcctuou se o cálculo dos seus vohimes conforme já antenormeníe descrito (Kantor, J. et al, J. Nat'l, Câncer Instit, 84:1084-1091, 1992).

Exemplo 2

Geração e caracterização de vírus recombinantes [0081] Os fragmentos de ADNc que codificam os blocos de leitura ininterrupta das B7-1 e B7-2 dos murinos foram obtidos por RCP de transcriptase reversa utilizando os iniciadores oligonucleotídicos específicos da B7-1 de sequência 5’-GGTACCATGGCXrGCAATTGTCAGTTfr -3’ (SEQ ID NO.l) e 5 ’-CTCGAGCTAAAGGAAGACGGTCTG-3 ’ (SEQID NO:2) e os iniciadores específicos da B7-2 de sequência 5’-GGTACCGAAGCACCCACGATGGAC-3’ (SEQ ID NO:3) e 5’-CTCGAGTCACTCTGCAmGGTTTTGC-3’ (SEQ ID NO:4), tendo sido ligados dentro do yector PT116 de transferência do vírus de vaccirãa. Este vector contém um vírus de vaccinia forte logo a seguir ao promotor cuja expressão ocorre em primeiro lugar (antecipativa) (designado por P40) a montante do local de clonagem múltipla para comandar a síntese do produto génico inserido. A ligação e a orientação dos fragmentos de ADN da B7 e também a posição do promotor foram verificados por RCP e por sequenciação. O arquétipo vectorial quimérico foi inserido no local M de Hind ΠΙ genómico do vírus de vaccirãa por recombinação homóloga, conforme já anteriormente descrito (Kaufinan, H. et aL Int J. Câncer 48:900-907,1991) e foi confirmado por análises à Southern em que foi utilizada como sonda o ADN das B7-1 ou B7-2 radiomarcado com P (dados não apresentados). Comprovou-se que as sequências completas do ADNc das B7-1 e B7-2 nos clones dos viras de vaccirãa eram idênticas a sequências já publicadas (Freeman, G.J. et al. J. Exp. Med. 174:625-631, 1991; Freeman, G.J. et ai Science 262:909-911,1993).

[0082] A expressão da proteína recombinante foi confirmada por análise à Western de exlrdclos proteínicos provenientes de células BSC-1 infectadas com Vr-B7-1 ou com Vr-B7-2.

Estas células são utilizadas vulgarmente para a avaliação de produtos de vaccima recombinantes (Moss, B. Cuiicnt Protocols in Molecular Biology 2.16 15.1-16.18.9, 1993). A incubação das autorradiografias de extractos proteínicos provenientes de células infectadas com Vr-B7-1 conjuntamente com o anti-anticorpo B7-BB1 monoclonal do murganho, conjugado no rato, revelou uma banda larga de 50-90 kDa. Dc igual modo, a incubação de airtoiradiografias de extractos proteínicos provenientes de células infectadas com Vr-B7-2 conjuntamente com o anti-anticorpo B7-2 monoclonal do murganho, conjugado no rato (GL-1), revelou uma banda variável entre 65 e 100 kDa (dados não apresentados). Isto é consistente com relatórios que indicam a massa molecular aparente destas moléculas, presumindo-se que sejam glicoproteínas que são heterogéneas devido à glicosilação ligada a N (Schwartz, R.H. Cell 71:1065-1068, 1992; Freeman, G.J. et ai J. Exp, Med. 174: 625-631, 1991; Freeman, G.J. et al. Science 262:907-909, 1993). As células não infectadas ou infectadas com V-Wyeth foram negativas em termos de expressão de qualquer das B7-1 e B7-2.

[0083] Examinou-se por citometria de fluxo a expressão de proteínas recombinantes B7-1 ou B7-2 da superfície celular. A figura IA permite concluir que as células BSC-1 não infectadas (figura 1 A) não reagem nem com os anticorpos B7 (BB1) nem com os anticorpos B7-2 (Gl-1) (98,5% das células são negativas com uma fluorescência média de 5,22). De igual modo, as células infectadas com o vírus de vaccinia de tipo natural (V-Wyeth, figura 1B) não conseguiram reagir com nenhum destes dois anticorpos (97,7% das células são negativas com uma fluorescência média de 5,43). As células BSC-1 infectadas com Vr-B7-1 (figura 1C) reagiram fortemente com o anticorpos B7/BR1 (97,5% das células são positivas com uma fluorescência média de 2513,68). As células infectadas com Vr-B7-2 reagiram fortemente com o anticorpo B7-2 (figura 1D) (98,8% das células são positivas com uma fluorescência média de 1802,30). Não houve nenhuma reactividade entre o anticorpo B7/BB1 e as células infectadas com Vr-B7-2 e não houve nenhuma reactividade do anticorpo GL-1 com as células infectadas com Vr-B7-1. Estes estudos demonstram pois que um vírus de vaccinia recombinante pode exprimir as moléculas B7-1 e B7-2 sobre a superfície celular ao fim de 3 a 6 horas após a infecção. A lise de células infectadas normalmente não ocorre durante 24 a 48 horas (Moss, B. Current Protocolsin Molecular Biology 2.16.15.1-16.18.9, 1993).

[0084] Foi já anteriormente demonstrado que a injecção de 3 x 105 células MC38 do adenocarcinoma dos murinos por via subcutânea em murganhos singénicos da estirpe C57BL/6 dá origem vulgaimente a tumores palpáveis ao fim de 7 a 14 dias, seguindo-se um crescimento rápido com um desfecho fatal (Kantor, J. et al. J. Nat’l. Câncer Inst. 84:1084-1091, 1992). Também se demonstrou já que estas células tumorais são negativas para a expressão da molécula B7 (Chen, L. et d. J. Exp. Med. 179:523-532,1992). Para se testar os arquétipos de vírus de vaccinia recombinantes para a pesquisa da expressão funcional da molécula B7, comparou-se o crescimento das células MC38 tumorais com o crescimento de células MC38 infectadas com Vr-B7-1, Vr-B7-2 e V-Wyeth de tipo natural (figuras 2A-2D). A injecção de células MC38 não infectadas (figura 2A) deu origem a tumores palpáveis em todos os animais em menos de 7 dias. O crescimento dos tumores foi progressivo ao longo de todo o período desta experiência. Os animais foram sacrificados em todas as experiências no momento em que as medições tumorais (comprimento ou largura) foram superiores a 20 mm. A injecção de células MC38 infectadas durante 1 hora com V-Wyeth, ao valor de MDI igual a 0,25 (figura 2B), teve como consequência um atraso ligeiro do aparecimento de um tumor palpável e todos os animais ficaram eventualmente positivos aos tumores (num animal na figura 2B cresceu um tumor intraperitoneal que não foi possível medir). Escolheu-se o valor de MDI igual a 0,25 para todos os grupos porque as infecções para quantidades superiores a essa tiveram como consequência níveis mais elevados de morte celular não específica, daí tendo resultado um menor crescimento tumoral. A ínjecção de células MC38 infectadas, ao valor de MDI igual a 0,25, com Vr-B7-1 (figura 2C) ou Vr-B7-2 (figura 2D) não conseguiu induzir tumores em nenhum dos murganhos, os quais se mantiveram isentos de tanores durante o período desta experiência.

[0085] A expressão de proteínas rccombinantes de células infectadas, para este valor de MDI, foi confirmada por citometría de fluxo. Após a infecção com vírus recombinantes, ao valor de MDI igual a 0,25, aproximadamente 35% das células MC38 eram positivas para qualquer das moléculas recombinantes B7-1 ou B7-2 com uma fluorescência média variando entre 417 e 585. As células MC38 não infectadas ou então infectadas, ao valor de MDI igual a 0,25, com V-Wyeth permaneceram negativas para a expressão das moléculas B7-1 ou B7-2. Estas células MC38 foram positivas para a expressão do antigénio de classe I do CPH (o mesmo que MHC), tanto antes como depois da infecção. Não foram observados efeitos tóxicos intensos em nenhum destes animais durante o período de observação de 40 dias. Os pesos dos animais permaneceram dentro dos valores e desvios normais no pressuposto de um ajustamento em função da idade normal dos murganhos. Estas experiências foram repetidas mais 3 vezes com resultados idênticos.

[0086] Foram efectuados estudos para se determinar se a rejeição tumoral depende de um sistema imunitário intacto. Nesses estudos, os murganhos foram imunossuprimidos por irradiação (ver materiais e métodos, exemplo 1) e foram-lhes administradas células MC38 tumorais infectadas (quadro 1). Nos murganhos irradiados e infectados com V-Wyeth, Vr-B7-1 ou Vr-B7-2 foram observados tumores mensuráveis 14 dias após o transplante dos tumores e não foram observadas nenhumas diferenças nos volumes tumorais, significando isso que é necessário um sistema imunitário intacto para responder às moléculas B7 recombinantes.

Crescimento de tumores MC38 infectados em murganhos irradiados (14 dias após o transplante dos tumores)

Infecção n° de animais com tumores Volumes médios dos tumores (mm3 ± D.P.) MC38 (Wyeth) 5/5 369,9 ±141,8 MC38 (Vr-B7-1) 5/5 441,9 ± 204,2 MC38 (Vr-B7-2) 5/5 404,0 ±237,3

Crescimento de tumores MC38 em animais imunocomprometidos. Os murganhos foram irradiados com radiação gama (γ) e foram injectados com células MC38 que haviam sido infectadas durante 1 hora ao valor MDI igual a 0,25 com qualquer dos infectantes V-Wyeth, Vr-B7-1 ou Vr-B7-2 [0087] Nos sistemas em que são utilizados vectores retrovirais para a introdução dos genes de B7 demonstrou-se que administrando simultaneamente aos murganhos, num flanco, as células tumorais que exprimem a B7, e no outro flanco, as células tumorais negativas à B7, isso iria impedir o crescimento das duas populações tumorais (Chen, L. et d. Cell 71:1093-1102, 1992). Noutros estudos, a actividade antitumoral das células negativas às B7 foi demonstrada pelas injecções intraperitoneais múltiplas de células tumorais que exprimem as B7 ao fim de 10 dias a seguir à administração subcutânea de tumores primários negativos à B7 (Li, Y. et al. J. Immunol. 153:421428, 1994). O estudo aqui descrito foi concebido para se determinar se poderia ser induzida imunidade de longa duração contra as células tumorais por imunização com células tumorais infectadas com Vr-B7. Os murganhos aos quais se administrou células MC38 infectadas com Vr-B7-1 ou Vr-B7-2 permaneceram isentos de tumores pelo menos durante 40 dias (figuras 2C e 2D) e foram depois estimulados no flanco oposto com 3 x 105 células MC38 não infectadas (negativas às B7) (figuras 3B e 3C). A injccção destas células MC38 em murganhos genuínos (figura 3A) teve como consequência a formação de tumores palpáveis em todos os animais cm menos de 7 dias, com crescimento tumoral progressivo durante todo o período desta experiência. O volume tumoral médio neste grupo de contraprova ao 21s dia após o transplante tumoral foi de 2436 ± 858 mm3. Os murganhos aos quais haviam sido administrados 40 dias antes tumores infectados com Vr-B7-1 também foram estimulados com células MC38 não infectadas (figura 3B). A formação destes tumores foi retardada e a velocidade de crescimento foi bastante reduzida, sendo o volume médio dos tumores de 372 ± 106 mm3 ao 232 dia. De igual modo, os murganhos aos quais haviam sido administrados tumores infectados com Vr-B7-2, quando estimulados com células MC38, revelaram uma redução substancial no crescimento de células tumorais. O volume médio dos tumores neste grupo foi de 197 ±161 mm3 ao 21° dia. Assim, o crescimento tumoral foi reduzido em mais de 90% nos animais que haviam previamente recebido tumores que exprimem as B7-1 ou B7-2, por infecção com vírus de vaccinia recombinantes. Isto foi importante na medida em que apenas foi administrada uma imunização 40 dias antes do estímulo tumoral e tendo em conta que os murganhos foram estimulados com uma carga tumoral relativamente grande. Isto significa que há uma resposta imunitária reproduzível contra um antigénio rejeitável nas células tumorais MC38 que está ser induzida pela injecção de células tumorais infectadas com Vr-B7. O método de tratamento anterionnente descrito pode ser modificado de modo a conter múltiplas inoculações com células tumorais que exprimam as B7 e com reforço da activação das células T com moléculas imunoestimuladoras que contenham citoquinas tais como a IL-2.

[0088] Estudos anteriores demonstraram que a introdução de moléculas B7 em células tumorais por transdução com vectores retrovirais, tais como PLNSX, PLNCX ou PLXSN, pode conferir imunogenicidade para esses tumores (Chen L. et al. J, Exp. Med. 179:523-532, 1994; Dohring, C. et al Int. J, Câncer 57:754-759. 1994). Estes métodos de introdução de 42 moléculas B7 têm uma limitação potencial para aplicações clínicas, devido a uma eficiência relativamente diminuta da infecção de vectores retrovirais e devido ao consequente intervalo de tempo prolongado que é necessário para seleccionar o fáimaco e expandir o número de células tumorais positivas às B7. Como alternativa, os estudos aqui assinalados demonstraram o desenvolvimento de vírus de vaccmía recombinantes que exprimem os genes para as moléculas co-estimuladoras B7-1 e B7-2. Estes arquétipos de vírus de vaccinia recombinantes infectam as células tumorais rapidamente (1 a 4 horas) e exprimem as proteínas recombinantes φ com elevada eficiência (mais de 97% das célula, figuras 1C e 1D respectivamente). Demonstrou--se que as células infectadas sintetizavam de forma autêntica as proteínas recombinantes, originando efeitos anbtumorais. Estes estudos apresentam pois dados de um sistema experimental para a inserção de genes de B7 em vectores de vírus de vaccinia com implicações para potenciais aplicações imunoterapêuticas.

Exemplo 3

Indução de uma melhor resposta imunitária das células T a um antigénio associado a tumores dos seres humanos, misturando um vírus de vaccinia reeombinante que exprima o antigénio associado ao tumor com um vírus de vaccinia recombinante que exprima a molécula co--estimuladora B7 [0089] A presente invenção compreende uma composição de Vr-B7 em combinação com um vírus de vaccinia recombinante que exprima um antigénio associado a um tumor dos seres humanos. A composição da presente invenção, quando co-inoculada num hospedeiro, reforça a resposta imunitária sistémica das células T a esse antigénio associado ao tumor dos seres humanos. 43 [0090]

Foram agora identificados vários antigénios associados a tumores dos seres humanos. Um deles é o antigénio carduueuibriónico dos seres humanos (ACE) que é expresso em diversos carcinomas humanos, incluindo os cancros colorrectais, gástricos, pancreáticos, da mama e os cancros do pulmão das células não pequenas. Foi já anteriormente demonstrado que há um arquétipo de ACE de vaccinia recombinante, designado por Vr-ACE, que pode sei administrado quer a murganhos quer aos macacos Rkesus e que pode induzir respostas das células T específicas para o ACE nos dois sistemas modelares (Kantor, J. et al. J. Natl. Câncer φ Inst. 84:1084-1091, 1992; Kantor, J. et al. Câncer Res. 52:6917-6925, 1992). Além disso, não foi observada nenhuma toxicidade em nenhum dos sistemas. Recentemente foi concluída uma experiência clínica em que o Vr-ACE foi administrado a pacientes com carcinomas metastáticos gastrointestinais, da mama ou do pulmão. Neste estudo de fase I, não foi observada nenhuma toxicidade para além daquela que seria observada com a administração da vacina da varíola.

[0091] Uma variante consiste na inserção de genes da B7 e do ACE no mesmo arquétipo de vaccinia recombinante, uma vez que é necessário que as duas moléculas sejam expressas na mesma célula ao mesmo tempo. Outra variante consiste em misturar um Vr-ACE com um Vr-B7 para reforçar de forma específica a resposta imunitária das células T ao ACE. As vantagens desta última forma de resolver o problema são diversas: (a) é possível testar proporções diferentes entre Vr-ACE e Vr-B7 para se determinar a proporção para uma resposta imunitária óptima, (b) é possível alterar o programa de administração de Vr-ACE e Vr-B7, (c) apenas é necessário produzir um arquétipo de Vr-B7, isto é, o Vr-B7 utilizado com o Vr-ACE também pode ser utilizado com um arquétipo de Vr que codifique outros antigénios associados a tumores e pode ser utilizado realmente com qualquer outro antigénio associado com um agente patológico, 44 para reforçar uma resposta imunitária.

[0092] Dc acordo com uma variante, demonstrou-se que misturando simplesmente 0

Vr-ACE com o Vr-B7 e realizando a co-administração ao hospedeiro se obtém um reforço da resposta imunitária das células T, específica para o ACE. Além disso, as proporções entre Vr-ACE e Vr-B7 foram factores importantes que influenciaram a intensidade da resposta imunitária.

[0093] No primeiro estudo misturou-se o Vr-ACE e o Vr-B7 na proporção de 1:1, isto

é, misturou-se 5 x 10“ u.f.p de Vr-B7 e 5 x 106 u.fp. de Vr-ACE, e realizou-se a co-administração a um grupo de 3 murganhos por escarificação da cauda. Realizou-se a remoção dos baços 14 dias após a imunização, os quais serviram de fonte de linfócitos. Como contraprovas foram utilizados três grupos diferentes de murganhos: (a) murganhos não vacinados, (b) murganhos que receberam 5 x 106 u.f.p. de Vr-ACE e 5 x 106 u.f.p. de vírus de vaccinia de tipo natural (designado por V-Wyeth) e (c) murganhos que receberam 5 x 106 u.f.p. de V-Wyeth e 5 x 106 u f.p. de Vr-B7. Assim, todos os murganhos vacinados receberam um total de 107 u.f.p. de

vírus de vaccinia e na totalidade dos três grupos as proporções de vírus de vaccinia foram de 1:1. Conforme se pode observar na figura 4, a seguir a uma administração de Vr-ACE + V-Wyeth, os murganhos desencadearam realmente uma resposta imunitária especifica dos ACE, embora diminuta. O ensaio imunitário praticado foi o ensaio Iinfoproliferativo que já havia sido descrito anteriormente (Kantor et al. J. Nafl. Câncer Inst. 84:1084-1092, 1992) e o antigénio relevante utilizado foi o ACE recombinante obtido a partir de baculovírus. Conforme se pode observar na figura 4, a adição de Vr-B7 ao Vr-ACE reforçou várias vezes a resposta imunitária específica. Pelo contrário, a adição de Vr-B7 ao grupo de contraprova tratado com V-Wyeth não teve nenhum efeito sobre o reforço da resposta imunitária específica do ACE.

[0094] No estudo subsequente alterou-se a proporção entre o Vr-ACE e o Vr-B7 para 1 para 3. Conforme se obsta va na figura 5, a administração de Vr-ACE mais Vr-R7 na proporção de 1:3 reforçou a resposta das células T específica para o ACE, comparativamente com o Vr-ACE mais o V-Wyeth e com uma intensidade muito maior do que quando os dois arquétipos (Vr-B7 mais Vr-ACE) foram misturados numa proporção de 1:1. Repetindo mais uma vez, os dois grupos de contraprova, isto é, o grupo que não foi vacinado e aquele que foi vacinado com Vr-B7 misturado com V-Wyeth não revelaram nenhuma resposta imunitária contra o ACE.

[0095] Estes resultados significam que misturando simplesmente um Vr, que contenha um gene humano associado, com o Vr-B7 se pode conseguir a co-infecção e a co-expressão em células possuidoras de antigénios, de modo a reforçar as respostas específicas das células T aos antigénios associados aos tumores dos seres humanos. Além disso, admite-se que as proporções entre Vr-B7 e o Vr que contém o gene humano associado que aqui foi utilizado pode ser um factor importante para optimizar a activação das células T contra um produto gémeo associado a tumores dos seres humanos ou realmente contra qualquer outro produto génico contra o qual se pretenda induzir imunidade ou reforçá-la.

Exemplo 4

Respostas linfoproliferativas de células T dos murganhos aos ACE após a imunização com Vr-ACE+ Vr-B7

Respostas linfnpmliferativas [0096] Efectuou-se a imunização de murganhos C57BL/6 com vinis num total de 1 x 107 u.f.p. segundo diversas proporções dos arquétipos seguintes: V-Wyeth; Vr-ACE:V-Wyeth; V-Wyeth:Vr-B7; ou Vr-ACE:Vr-B7 e efectuou-se a análise da lmfoproliferação específica dos ACE conforme já anteriormente descrito (Kantor, J. et al. J. Nati. Câncer Inst. 84:1084--1091, 1992). Dito de forma abreviada, efectuou-se a remoção dos baços 14 dias após a imunização e efectuou-se a dispersão mecânica através de coadores de células de 70 pm (Falcon, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) para se isolar suspensões celulares singulares. Efectuou--se a remoção dos eritrócitos e das células mortas por centrifugação sobre um gradiente dc ‘Ficoll-Hypaque’ (densidade = 1,119 g/mL) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). As populações constituídas por cerca de 95% de células T foram obtidas fazendo passar as células mononucleares esplénicas sobre colunas de lã de ‘nylon’ (Robbins Scientific Coip., Stmnyvale, CA). Para se avaliar a linfoproliferação específica dos ACE acrescentou-se as células T à razão de 107cavidade em placas de 96 cavidades de fundo plano (Costar, Cambridge, MA). As células possuidoras de antigénios foram esplenócitos smgénicos genuínos irradiados (200 rad) acrescentados à razão de 5 x 107cavidade. As cavidades estimuladas receberam os ACE humanos purificados (100-12,5 pg/mL) (Vitro Diagnostics, Denver, CO); ovalbumina enquanto contraprova negativa (100 pg/mL); V-Wyeth mactivado pelos UV (2 x 107 u.f.p./mL), como antigénio auxiliar de prova, ou Con-A (2 pg/mL) como contraprova positiva das células T. As cavidades de contraprova receberam células T, CPA e apenas meios. As células de todas as cavidades foram criadas em cultura num volume total de 200 pL de meios completos (MC), [ RPM11640 com soro fetal de vitelo (10%); glutamma (2 mM), piruvato de sódio (1 mM), Hepes (7 mM), gentamicina (50 pgmL), 2-mercaptoetanol (50 pM) e aminoácidos não essenciais (0,1 mM) (Biofluids, Rockville, MD)] durante 5 dias. As células foram marcadas para o período final de 12-18 horas de incubação com [^TJ-timidina a 1 pCi/cavidade (New England Nuclear, Wilmington, DE) e foram colhidas com um dispositivo de colheita de células PHD (Cambridge

Technology, Cambridge, MA). Mediu-se a radioactividade incorporada por contagem da cintilação em meio liquido (LS 6000IC; Beckman, Duarte, CA). Calculou-se a média dos resultados obtidos em triplicado nas cavidades e com eles se construiu um índice de estimulação (IE) calculado do modo seguinte: IE = [CPM (cavidades estimuladas)]/[CPM (cavidades de contraprova)]

Análise linfoproliferativa [0097] Para se determinar se a imunização com uma mistura de Vr-ACE e Vr-B7 poderia reforçar as respostas linfoproliferativas específicas dos ACE, efectuou-se a imunização de murganhos C57BL/6 uma vez com um total de 107 u,f.p. de Vr-ACE: V-Wyeth, V-Wyeth: Vr-B7 ou Vr-ACE:Vr-B7, para qualquer das proporções 1:1, 1:3 ou 3:1 (ver o quadro 2) e depois efectuou-se a análise das respostas linfoproliferativas ao fim de 14 dias. O quadro 2 permite concluir que as células T dos murganhos que não foram objecto de nenhuma imunização não conseguiram responder aos ACE purificados, ao passo que as células T de murganhos imunizados com Vr-ACE: V-Wyeth responderam de um modo fraco (índice de estimulação [IE] entre 1,9 e 2,5). A resposta aos ACE parece estar relacionada com a dose de Vr-ACE administrada durante a imunização As células T dos murganhos imunizados com todas as proporções de V-Wyeth:Vr-B7 não foram capazes de responder aos ACE. Pelo contrário, as células T dos murganhos imunizados com todas as proporções de Vr-ACE:Vr-B7 parece que tiveram uma resposta acrescida aos ACE em comparação com os grupos que não receberam nenhum Vr-B7 com a sua imunização (quadro 2). A imunização de Vr-ACE: Vr-B7 (3:1) foi óptima para a indução da linfoproliferação nesta experiência (BE = 12,3). Foram realizadas quatro vezes experiências em que se alterou as proporções entre Vr-ACE:Vr-B7 (3:1, 1:1, 1:3) e em qualquer dos casos a proporção de 3:1 proporcionou o maior acréscimo nas respostas das células T específicas do ACE. Para se examinar melhor a intensidade das respostas imunitárias celulares específicas dos ACE efectuou-se a imunização dos murganhos uma vez com Vr-ACE: V-Wyeth (3:1); V-Wyeth:Vr-B7 (3:1) ou Vr-ACE-Vr-B7 (3.1) e efectuou-se a análise das respostas linfoproliferativas conforme descrito antes.

Quadro 2

Respostas linfoproliferativas das células T dos murganhos aos ACE após imunização com diversas proporções de Vr-ACE + Vr-B7 Antigénio0 Imunogénioa Proporção (lxlO7 total) Con-A Oval. ACE Sem imunização NAC 359 1,0 1,4 Vr-ACE/V-Wyeth 1:1 312 1,7 2,1 Vr-ACE/V-Wyeth 1:3 284 0,9 1,9 Vr-ACE/V-Wyeth 3:1 442 1,0 2,5 V-Wyeth/Vr-B7 1:1 359 1,0 1,7 V-Wyeth/Vr-B7 1:3 412 1,9 1,6 V-Wyeth/Vr-B7 3:1 387 1,8 0,4 Vr-ACE/Vr-B7 1:1 403 1,4 7,0a Vr-ACE/Vr-B7 1:3 394 1,0 4,0 Vr-ACE/Vr-B7 3:1 345 1,8 12,3 * Efectuou-se a imunização de 5 murganhos C57BL/6 conforme indicado. Efectuou-se a análise das respostas linfoproliferativas das células T esplénicas agrupadas, 14 dias a seguir à imunização. b As concentrações de antigénio foram: Con-A (2 pg/mL); ovalbumina (100 pg/mL), e ACE (100 pg/mL). Cada valor representa o índice de estimulação da CPM média de amostras em triplicado comparativamente com os meios. O desvio padrão nunca foi superior a 10%. c NA, não aplicável d Os valores a negrito são significativos quando comparados com os seus respectivos valores de contraprova do meio (p<0,001).

[0098] O quadro 3 permite concluir que as células T de murganhos que não foram objecto de nenhuma imunização não foram capazes de responder aos ACE purificados em nenhuma concentração nem aos V-Wyeth inactivados pelos UV. As células T de murganhos imunizados com V-Wyeth responderam aos V-Wyeth inactivados com os UV com um forte índice de estimulação (31,7), não sendo no entanto capazes de proliferar em resposta aos ACE. Pelo contrário, as células T de murganhos imunizados com Vr-ACE:V-Wyeth (3:1) proliferaram ao serem criadas em cultura com os ACE, de uma forma dependente da dose (índice de estimulação entre 4.5-1,6). As células T de murganhos imunizados apenas com o Vr-B7 (Vr-B7: :V-Wyeth) não foram capazes de responder aos ACE. Finalmente, as célula T de murganhos imunizados com a combinação de Vr-ACE e Vr-B7 (3.1) proliferaram em resposta ao antigénio ACE, de uma maneira dependente da dose (IE = 18,6-3,0). Este índice de estimulação representa um acréscimo superior a 4 vezes nas respostas proliferativas específicas dos ACE a seguir à adição do Vr-B7. As células T de cada grupo responderam ao Con-A mitogénico linfocítico de contraprova e não conseguiram reagir com a ovalbumina do antigénio de contraprova negativa.

Quadro 3. Respostas linfoproliferativas das células T dos murganhos aos ACE após imunização com uma proporção a 3:1 de Vr-ACE + Vr-B7

Aníigcnio1' ACE(jJg/mL) imunogénio3 ftoporção (I\10'total) Ccn-A OvaL V-Wyeth sujeitos ausUV 100 50 25 12,5 Sem imunização NAC 456 1,0 U 22 1,4 0,9 0,6 V-W\cth/V-W\Oh NA 471 U 31,7 22 2,8 22 1,9 Vr-ACEA-W>tíh 3.1 451 1,0 35,4 4,5 3,6 25 1,6 V-Wyeth/Vr-B7 3:1 345 1,8 42,0 1,4 0,4 0,0 0,0 Vr-ACE/Vr-B7 3.1 395 1,9 40 ta/»- 12 6£ 3^0 * Efectuou-se a imunização de 5 murganhos C57BL/6 conforme indicado. Efectuou-se a análise das respostas linfoproliferativas das células T esplénicas agrupadas, 14 dias a seguir à imunização. b As concentrações de antigénio foram: Con-A (2 pg/mL); ovalbumina (100 pg/mL); Wyeth sujeitos aos UV (2xl07 u.f.p./mL) e ACE (100-12,5 pg/mL). Cada valor representa o índice de estimulação da CPM média de amostras em triplicado comparativamente com os meios. O desvio padrão nunca foi superior a 10%. c NA, não aplicável d Os valores a negrito são significativos quando comparados com os seus respectivos valores de contraprova do meio (p<0,001).

Exemplo 5

Expressão dual de ACE e B7-1 sobre células infectadas com Vr-ACE e Vr-B7 Métodos de citometria de fluxo [0099] Recorreu-se à citometria de fluxo bicolor para se demonstrar a infecção dual de células in vitro com Vr-ACE e Vr-B7. Foram utilizadas células BSC-1 confluentes (CCI26, ATCC, Rockville, MD) que foram infectadas durante 2 horas com uma mistura a 3:1 quer de Vr-ACE:Vr-B7, Vr-ACE:V-Wyeth ou V-Wyeth:Vr-B7 ou apenas com V-Wyeth, para um valor de MDI igual a 5. Efectuou-se a colheita das células 18 horas após a infecção, tendo então sido contrastadas com uma combinação de Acm anti-B7-l de murganho, conjugado no rato com PE (Pharmingen, San Dicgo, CA), e de Acm COT.-l anti-ACE, conjugado com ITCF (36) ou Acm de contraprova ajustado ao isótipo e conjugado com ITFC e PE (37) (Phamiiiigcn). O Acm COL-1 foi conjugado com ITFC, tendo para tal sido utilizado um método convencional (37). Analisou-se a fluorescência das células utilizando um aparelho de classificação de células ‘FACSCAN’ (Becton Dickinson, Mountain View, CA) a trabalhar com a aplicação informática ‘Lysis li .

Análise por atoniema Je Jluxo: expressão dual deACE e B7 recombinante [0100] Uma vez que foi já sugerido que tanto o antigénio como a molécula B7-1 têm de ser expressos na estreita vizinhança um do outro para se acoplarem adequada e conjuntamente às células T e aos receptores CD28 (Jenkins, M.K. et al. Current Opinion in Immunol. 5:361--367, 1993; Hathcock, K.S. et al. J. Exp, Med. 180:631-640, 1994; Hellstrom, K.E. et al. Ann. NY Acad. Sei. 690:225-230, 1993; Harding, F.A et al. J. Exp. Med. 177:1791-1796, 1993), efectuou-se um ensaio para se determinar se a infecção de células com uma mistura de Vr-ACE e Vr-B7 poderia originar a expressão dual de ACE e B7-1 sobre a superfície das células. Para se determinar a expressão dual, realizou-se a infecção de células BSC-1 com uma mistura a 3:1 de Vr-ACE: V-Wyeth, V-Wyeth: Vr-B7 ou Vr-ACE:Vr-B7 ou apenas V-Wyeth e analisou-se por citometria de fluxo bicolor. Nas células infectadas com V-Wyeth apenas foram observados níveis espontâneos de contrastaçao (figura 6A), ao passo que as células infectadas com Vr-ACE:V-Wyeth revelaram ser positivas, principalmente ao ACE (figura 6B). De igual modo, as células infectadas com a mistura de V-Wyeth:Vr-B7 revelaram ser positivas, principalmente à molécula Vr-B7-1 (figura 6C). No entanto, as células co-infectadas com Vr-ACE: Vr-B7 revelaram ser positivas quer ao ACE quer à B7 1 (figura 6D).

Exemplo 6

Aumento da citotnxieidade específica dos ACE a seguir à imunização com Vr-ACE: Vr-B7 Métodos de resposta citolíticos [0101] F.fectuou-se a imunização de murganhos conforme descrito no exemplo 4 e analisou-se a actividade citolítica específica dos ACE conforme já anteriormente descrito (Kantor, J. et al. J, Naf 1, Câncer Inst. 84:1084-1091,1992). Dito de forma abreviada, realizou-se a remoção dos baços 14 dias a seguir à imunização e com eles se preparou uma dispersão em suspensões de células singulares e depois efectuou-se uma análise em gradientes de ‘Ficoll--Hypaque’. A linhagem de células MC38 do adenocarcinoma do cólon dos murinos (Fox, B.A. et al. J, Biol. Response Modifiers 9:499-511, 1990) foi fornecida pelo laboratório do Dr. Steve Rosenberg (National Câncer Institute, Bethesda, MD). A linhagem celular daí resultante e que exprime os ACE humanos, designada por MC-38-ACE-2, foi já descrita (Robbins P.F. et al., Câncer Res. 51:3657-3662, 1991). Estas células tumorais foram preparadas para serem utilizadas como alvos no ensaio citolitico convencional (Wunderlich, J. et al. Current Protocols in Immunol Colhgan, J.E. et al. (Eds.) 3.11.1-3.11.14, 1994), utilizando inIn. Dito de forma resumida, efectuou-se a radiomarcação das células tumorais (1-2 x 106) com 50 pCi de inIn em solução de oxiquinolina (Amersham, Arlington Heights, IL) durante 20 minutos a 37°C, seguindo-se uma lavagem perfeita para se remover os radionuclídeos não incorporados. Com os linfócitos esplénicos e com as células destinatárias (5 x 103 células/cavidade) preparou-se uma suspensão em meio de LTC (o mesmo que CTL) (meio completo com RPMI-1640:EHAA a 50:50, Biowhitaker, Walkersville, MD, utilizado em vez do meio RPMI-1640) e efectuou-se a combinação em proporções entre células efectoras e células destinatárias compreendidas entre 100:1 e 12,5:1 em placas de 96 cavidades de fundo em forma de U (Costar), tendo a incubação decorrido durante 16 horas a 37°C com 5% de CO* A seguir à incubação efectuou-se a colheita dos sobrenadantes, tendo para tal sido utilizado um sistema de colheita de sobrenadantes (Skantron, Sterling, VA), e depois quantificou-se a radioactividade recorrendo a um contador de radiação gama (γ) (Cobra Autogamma, Packard, Downers Grove, IL). Determinou-se a percentagem de libertação específica de lllIn recorrendo à equação convencional seguinte: % de lise específica — [(experimental - espontânea)/(máximo - espontâneo)] x 100.

Análise das células T citoíóxicas: aumento da citotoxicidade especifica dos ACE a seguir à imunização com Vr-ACE:Vr-B7 [0102] Para se analisar o efeito da adição de Vr-B7 ou Vr-ACE sobre a actividade citotóxica específica dos ACE, efectuou-se um teste com linfócitos esplénicos de murganhos imunizados com a mistura de Vr-B7 e Vr-ACE para pesquisa da actividade lítica com células do adenocarcinoma dos murinos que revelaram ser negativas aos ACE (células MC38) ou com as mesmas células em que foi efectuada a transdução com os ACE, utilizando para tal um vector retroviral para exprimir o ACE humano (MC-38-ACE-2). A figura 7 permite concluir que as células T de murganhos imunizados uma vez com Vr-ACE:V-Wyeth (3:1) não realizaram a lise das células destinatárias MC38 negativas aos ACE (triângulos a cheio), mas efectuaram a lise dos alvos MC-38-ACE-2 positivos aos ACE (triângulos em branco), embora com um nível diminuto. Esta lise específica dos ACE revelou ser dependente da proporção E:T, decaindo a lise para 10% para uma proporção E:T igual a 12,5:1. A adição de Vr-B7 ao imunogénio Vr-ACE (Vr-ACE:Vr-B7,3:1) não teve nenhum efeito sobre a lise das células MC38 (círculos a cheio), mas teve um efeito importante sobre a lise dos alvos MC-38-ACE-2 por acção dos ACE. Com base na conversão dos dados em unidades líticas, a actividade dos LTC de murganhos imunizados com Vr-ACe:Vr-B7 (3:1) foi 32,8 vezes maior quando comparada com murganhos imunizados apenas com Vr-ACE.

Exemplo 7

Efeitos antitumorais de Vr-B7 misturado com Vr-ACE Método [0103] Efectuou-se a imunização de 10 murganhos da estirpe C57BL/6 com vírus num total de 1 x 107 u.f.p.. Decorridos 14 dias após a imunização, administrou-se aos murganhos uma injecção subcutânea de 3 x IO5 células do imunogénio MC-38-ACE-2 no flanco direito. Os murganhos do grupo tratado com Vr-ACE:Vr-B7 (3:1), que permaneceram sem tumores pelo menos durante 60 dias, foram estimulados no flanco oposto com 3 x IO3 células MC-38--ACE-2. Efectuou-se a medição dos tumores segundo duas dimensões, utilizando para tal uma craveira, e efectuou-se o cálculo dos volumes conforme já anteriormente descrito (Kantor, J. et ai. J. Nat’1. Câncer Inst. 84: 1084-1091, 1992). Os animais foram sacrificados em todas as experiências a partir do momento em que as medições tumorais (comprimento ou largura) excederam 20 mm.

Efeitos antitumorais de Vr-B7 misturado com Vr-ACE

[0104] Foi já anteriormente demonstrado que a administração de 3 x 105 células MC-38-ACE-2 do adenocarcinoma dos murinos por via subcutânea a murganhos singénicos da estirpe C57BL/6 origina tumores palpáveis ao fim 7 a 14 dias, seguindo-se um crescimento rápido dos tumores que acabam por ser fatais (Kantor, J. et al. J, Nat’l. Câncer Inst. 84: 1084- :ο -1091, 1992). Também foi já comprovado que são necessárias 3 imunizações com Vr-ACE num total de 1 x 107 u.f.p. para proteger a totalidade (100%) dos murganhos contra este estímulo tumoral (Kantor, J. et al. J. Nat’l. Câncer Inst. 84: 1084-1091, 1992). Para se determinar se a imunização com uma proporção a 3:1 entre Vr-ACE e Vr-B7 poderia proteger os animais contra o estímulo tumoral, etèctuou-se a comparaçáo do crescimento dc cclulas tumorais MC-38-ACE-2 em murganhos C57BL/6 imunizados apenas uma vez com um total de 10 u.f.p. de qualquer das substâncias V-Wyeth, Vr-ACE:V-Wyeth(3:l); V-Wyeth:Vr-B7 (3:1) ou Vr-ACE:Vr-B7 φ (3:1). A injecção de células MC-38-ACE-2 (figura 8A) teve como resultado a formação de tumores palpáveis na totalidade dos 10 animais imunizados com V-Wyeth em menos de 14 dias. O crescimento dos tumores foi progressivo e regular durante todo o período desta experiência. A injecção de células MC-38-ACE-2 aos animais imunizados com Vr-ACE: V-Wyeth (3:1; figura 8B) teve como resultado um atraso ligeiro da formação de tumores palpáveis e 70% dos animais ficaram eventualmente positivos aos tumores. A injecção de células MC-38-ACE-2 aos animais imunizados com V-Wyeth: Vr-B7 (3:1; figura 8C) teve como resultado a formação de tumores palpáveis em menos de 14 dias, com o crescimento dos tumores bastante parecido ao observado no grupo de contraprova imunizado com V-Wyeth (figura 8A). Pelo contrário, não houve desenvolvimento de tumores em 80% dos murganhos imunizados uma vez com Vr-ACE: Vr-B7 (3:1; figura 8D). Os murganhos negativos aos tumores (n=8) continuaram sem tumores durante todo o período da experiência (60 dias). Não foram observados nenhuns efeitos tóxicos significativos em nenhum dos animais durante o período de observação. Os pesos dos animais mantiveram-se dentro dos valores normais tendo em conta o desvio padrão e o seu ajustamento em função das idades. Estas experiências foram repetidas mais três vezes com resultados idênticos. [0105] Para se determinar sc seria possível induzir imunidade de longa duração contra 56 as células tumorais por imunização com esta combinação de Vr-ACE: Vr-B7 (3.1), os murganhos imunizados com esta proporção de vírus recombinantes e que se mantiverem sem tumores pelo menos durante 60 dias (figura 8D) foram então novamente estimulados no flanco oposto com 3 x 103 células MC-38-ACE-2 (figura 9B). A injecção de células MC-38-ACE-2 em murganhos genuínos de contraprova (figura 9A) deu origem à formação de tumores palpáveis em todos os animais em menos de 14 dias, havendo um crescimento tumoral progressivo e regular durante todo o período desta experiência, ao passo que os murganhos aos quais se havia administrado previamente Vr-ACE:Vr-B7 (3:1) não desenvolveram tumores durante os outros 49 dias do período de observação (figura 9B).

Exemplo 8

Construção e caracterização de Vr-AEP Vírus de vaccinia recombinanie [0106] Por RCP de transcriptase reversa efectuou-se a amplificação de um fragmento φ de ADN de 786 ph que codifica todo o bloco de leitura ininterrupta do antigénio específico da próstata do homem (AEP, o mesmo que PSA) (GeneAmp RNA PCR Kit, Peridn Elmer, Norwalk, CT), a partir de ARN total extraído da linhagem celular do adenocarcinoma metastático da próstata humana, designada por LNCaPFGC (CRL 1740, Colecção Americana de Culturas Tipo (o mesmo que ATCC), Rockville, MD). Demonstrou-se que a sequência prevista de aminoácidos obtida a partir da sequência codificadora do AEP era quase idêntica à sequência já publicada (Lundwall et al., FEBS Letters 214:317-322, 1987), diferindo apenas por uma troca de tirosina por asparagina na posição 220. O fragmento de ADN do AEP, contendo toda a sequência codificadora do AEP, 41 nucleótidos da região não traduzida de 5’ e 520 nucleótidos da 57 região não traduzida de 3’, foi ligado dentro do local da enzima de restrição Xba I do vector PT116 de transferência do vírus de vaccinia O plasmídeo resultante, designado por PT1001, continha o gene do AEP sob o controlo do promotor 40K do vírus de vaccmia (Grifz et ai, Virology 64:5948:5957, 1990) e o gene Lac Z de Escherichia coli sob o controlo do promotor Cl do avipoxvírus das galinhas (Jenkins et al. AIDS Research and Iluman Rctroviruses 7:991-998, 1991). Os genes exógenos estavam flanqueados pelas sequências de ADN da região M de Hind ΙΠ do genoma de vaccinia. Na construção do vírus de vaccmia recombinante utilizou-φ -se como vírus original um isolado da estirpe Wyeth (New York City Board of Health) de vaccinia purificado das placas. A geração do viras recombinante foi conseguida por recombinação homóloga entre as sequências de vaccinia no genoma de vaccinia da estirpe Wyeth e as correspondentes sequências no pTlOOl em células RK!3 infectadas com vaccinia (CCL 37, ATCC) transfectadas com o pTlOOl. Os clones recombinantes foram identificados e seleccionados pelo crescimento sobre células RKi3 (CCL 37, ATCC) na presença de 5-bromo-4--cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosido (X-Gal), conforme já anteriormente descrito (Panicali ^ et al.. Gene 47:193-199, 1986; Kaufinan et al., Int. J, Câncer 48:900-907, 1991). Os clones recombinantes azuis adequados foram purificados em 4 ensaios de purificação de placas. As reservas virais foram preparadas purificando lisados de células RKu infectadas e efectuando a subsequente centrifugação através de uma almofada amortecedora com 36% de sacarose.

Análise à Southern da recombinação de ADN

[0107] Analisou-se o genoma de vaccinia recombinante por extracção do ADN virai, por digestão com as endonucleases de restrição Hind Et e Cia I e pelas autorradiografias de Southern, conforme já antenormente descrito (Kaufinan et al., M, J, Câncer 48:900-907,1991).

5S

Análise à Western da expressão das proteínas doAEP

[0108] lnfcctou-sc células BSC-10 confluentes, quer com o vírus de vaccinia primitivo de tipo natural (designado por V-Wyeth) quer com o vírus de vaccinia recombinante-AEP (designado por Vr-AEP), para um valor de MDI igual alem Meio de Eagle Modificado por Dulbecco contendo 2% de soro fetal de bovino. Depois dc se ter deixado decorrer a infecção de um dia para o outro, removeu-se o meio das células e fez-se precipitar uma aliquota com metanol para se pesquisar a presença do AEP segregado. As células infectadas foram desmembradas (Usadas) em tampão de lise hipotónico (NaCl 150 mM, 0,05% de EDTA, KC110 mM, PMSF 1 mM) e depois foram tratadas com ultra-sons. Estes lisados e os meios de cultura foram submetidos a processos de electroforese sobre um gel de acrilamida com 10% de DSS (o mesmo que SDS). As proteínas foram autorradiografícamente transferidas para nitrocelulose e a forma obtida foi incubada com um anticorpo de coelho específico para o AEP (P0798, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) durante 4 horas à temperatura ambiente e a seguir efectuou-se a lavagem e a incubação com o anti-anticorpo secundário de coelho, marcado com fosfatase e conjugado na cabra (AP, Kirkegaard & Peny Laboratories, Gaithersburg, MD), tendo a revelação sido efectuada em conformidade com as instruções do fabricante.

Caracterização dos vírus recombinantes (Vr-AEP) [0109] O fragmento de ADNc que codifica o bloco de leitura ininterrupta do AEP humano foi obtido por RCP com transcnpta.se reversa, tendo para tal sido utilizados os iniciadores oligo-nucleotídicos específicos do AEP com as sequências 5 ’-TCTAG AAGCCCCAAGCTTACE ACCTGCA-3’ (SEQ ID NO:5) e 5’-TCTAGATCAGGGGTTGGCCACGATGGTGTCCTTGATCCACT-3’ (SEQ ID N0:6) que foram ligados dentro do vector pTl 16 de transferência do vírus de vaccinia. Este vcctor contém um forte promotor antedpativo/postedpativo de vírus de vaccinia (designado por 40K) a montante do local de clonagem múltipla para comandar a síntese do produto génico inserido. A ligação e a orientação do fragmento de ADN do AEP e também a posição do promotor foram verificadas por RCP e por sequenciação. O arquétipo vectorial quimérico foi inserido no genoma do vírus de vaccinia no local M de Hind ΠΙ por recombinação homóloga, conforme já anteriormente descrito (Kaufman, H. ei al Tnt J Câncer 48:900-907, 1991) e foi confirmado por análise à Southern, mediante sondagem com ADN radiomarcado com P correspondente às sequências do AEP e às sequências do vírus de vaccinia na região M de Hind ΙΠ (dados não apresentados).

[0110] A expressão da proteína do AEP recombinante foi confirmada por análise das autorradiografias de Western feitas aos fluídos sobrenadardes e aos extractos proteínicos de células BSC-40 infectadas com Vr-AEP. Estas células são vulgarmente utilizadas para a avaliação de produtos de vaccinia recombinantes (Earl et al., Current Protocols in Molecular Biology 2.16.15.1-16.18.9, 1993). A incubação das autorradiografias dos sobrenadantes provenientes de células infectadas com Vr-AEP, conjuntamente com o anti-anti corpo AEP do coelho, revelou a existência de um único polipeptido imunorreactivo que possui aproximadaxnente 33000 Da (dados não apresentados). De igual modo, a incubação das autoiradiografias do extracto proteínico proveniente de células infectadas com Vr-AEP revelou a existência de uma única banda com o mesmo peso molecular (dados não apresentados). Isto é consistente com o tamanho previsto para a molécula de AEP (Armbruster et al., Clin. Chem. 39:181-195, 1993; Wang etal. Methods in Câncer Research, 19:179.197,1982). As autorradiografias dos sobrenadantes celulares ou as autorradiografias dos extractos proteínicos provenientes de células infectadas com a estirpe primitiva de V-Wyeth permaneceram negativas em termos de expressão do AEP. Estes resultados demonstram pois que um vírus de vaccinia recombinante pode exprimir fielmente o produto génico AEP humano.

Exemplo 9

Aumento da citotoxícidade específica dn AF.P a seguir à rmuniracãn com Vr-AEP:vR-B7 Linhagens celulares [0111] A linhagem celular MC-38 do adenocarcinoma do cólon dos murinos (Fox, B. A. et al. J. Biol. Response Mod. 9:499-511,1990) foi fornecida pelo Dr. Bemard Fox (National Câncer Institute, National Institutes of Health., Bethesda, MD). A linhagem celular LNCaP do adenocarcinoma da próstata dos seres humanos (Horoszewicz, J.S. et cã. Em: Murphy, G.P. (ed.) Models for Prostate Câncer, págs. 115-132, Nova Iorque: A.R. Liss, 1980) foi obtida na Colecção Americana de Culturas Tipo (Rockville, MD). O vector retroviral pLNSC do vírus do sarcoma de murinos Maloney (Miller, A.D. et al. Biotechniques 7:980-990, 1989) foi fornecido pelo Dr. Dusty Miller (Fred Hutchinson Câncer Research Center, Seattle, WA). A linhagem celular GP+E-86 de acondicionamento ecotrópico dos murinos (Hesdorfifer, C. Hematol. Oncol, Clin. Norih Am. 5(3):423-432, 1991) e as células MC-.38, AEP/MC-38 e pLNSX/MC-38 foram mantidas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (MEMD) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) com 10% de soro fetal de bovino (SFB) (Gibco BRL). As linhagens celulares AEP/MC-38 e pLNSX/MC-38 foram mantidas sob uma pressão selectiva contínua em 1 mg de sulfato G418/mL (Gibco BRL). As células LNCaP foram mantidas em meio RPMI-1640 (Gibco BRL) contendo 10% de SFB.

Clonagem do ADNc de AEP

[0112] Sintetizou-se ADN complementar (ADNc) a partir de ARN total proveniente da linhagem celular LNCaP do adenocarcinoma da próstata dos seres humanos, utilizando para tal o estojo de reacção em cadeia com polimerase (RCP) “GeneAmp RNA’ (Perkin Elmer 61

Corp., Norwalk, CT). Os iniciadores oligonucleotídicos específicos do AEP humano foram seleccionados com base na sequência de ARNm humano (n° de acesso X07730 do GenBank), trabalhando com o programa informático ‘Macvector 4.1.4’ (Kodak Co., Rochester, ΝΎ). Foram utilizados os iniciadores 5’-(5’-AGA GAG AGC CTC AAG CTT CAG CCC CAA GCT TAC CAC CTG CA-3’) (SEQID NO:7) e 3’-(5’-AGA GAG AGC AAG CTT AGT CCC TCT CCT TAC TTC AT-3’) (SEQ ID NO:8), que contêm os locais da enzima de restrição Hind III, para sintetizar por RCP o ADNc de comprimento completo do AEP. Ligou-se o gene do AEP de 1,5 kb ao ADN de pLNSX digerido com a endonuclease de restrição Hind III e depois utilizou-se para transformar as células qualificadas (competitivas) CH5a de Escherichia coli (Gibco BRL). As colónias resistentes à ampicilina foram testadas para se pesquisar a orientação do fragmento intercalar de ADNc por RCP, utilizando para tal um iniciador oligonucleotídico em 5’específico do vector (5’-TTT GGA GGC CTA GGC TTT TGC AAA-3’) (SEQ ID NO.9) e também o iniciador em 3’ específico do AEP, descrito supra. Os transformantes foram seleccionados com ADNc do AEP com a orientação do sentido natural de recombinação, caracterizada pela digestão com a endonuclease de restrição, e foram sequenciados pelo método do didesoxi utilizando ‘Sequenase’ (United States Biochemical Corp., Cleveland, OH). A análise da sequência do gene, obtida por RCP, confirmou que esta sequência do gene era idêntica à sequência do gene do AEP humano existente no GenBank.

Transfecção e tradução de ADN para dentro de células destinatários MC-38 [0113] Efectuou-se a transfecção dc 5 pg de plasmídeo ΑΕΡ/pLNSX para dentro de células MC-38 utilizando para tal o reagente de transfecção DOTAP (Boehringer Mannheim Biochemica, Indianapolis, IN), em conformidade com as instruções do fabricante. Decorridas 24 horas, juntou-se às células meio de selecção que continha G418 na concentração de 100 pg/mL (p/v). Manteve-se a pressão selectiva por cultura contínua em MEMD que continha 10% de SFB e aumentando as concentrações de G418 (até 1 mg/mL). As células resistentes aos fánnacos foram clonadas por diluição limitante. O meio condicionado proveniente das cavidades de clonagem foi testado por meio do ensaio imunonadioméfrtco em fase sólida bideterminante de AEP em ‘Tandem-R’ (Hybritech Inc., San Diego, CA). As células produtoras do AEP segregado que mais produziram foram clonadas duas vezes por diluição limitante. Um clone, designado por AEP-MC-38, produziu aproximadamente 10 ng de AEP/mL.

[0114] As células MC-38 negativas ao AEP, cuja transdução foi feita vectorialmente, foram reveladas do modo a seguir descrito. Efectuou-se a transíecção de células GP+E+86, que constituem uma linhagem celular ecotrópica de acondicionamento de murinos, com 2 pg de ADN do vector pLNSX utilizando para tal o reagente de transfecção DOTAP, conforme descrito supra. Decorridas 24 horas, as células transfectadas foram novamente aplicadas em lamelas e ficaram a crescer em meio de selecção (1,0 mg de G418/mL). As células que sobreviveram à selecção de G418 e que continham o vector pLNSX ficaram a crescer em meio sem G418 e juntou-se este meio às células MC38 na presença de polibreno na concentração de 8 pg/mL (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). As células MC-38 em que havia sido feita a transdução ficaram a crescer na presença de G418 durante 3 semanas. As colónias individuais resistentes aos fármacos foram isoladas por meio de anéis de clonagem estéreis e caracterizadas por RCP para a pesquisa da presença do pLNSX. Para um estudo subsequente utilizou-se um clone, designado por pLNSX/MC-38. Métodos de resposta citolítica [0115] Efectuou-se a imunização de murganhos com Vr-AEP, utilizando para tal o protocolo elementar descrito no exemplo 6. A fonte de Vr-AEP, produzida conforme descrito no exemplo 8, foi a instituição ‘Therion Biologics Corporation, Cambridge, MA’. Como alvo específico para o antigénio foi utilizada a linhagem de células MC38 do adenocarcinoma do cólon dos murinos que exprime o AEP humano (MC38-AEP), conforme descrito supra, e também conforme descrito por Karr, J.F. et al. (Câncer Research, no prelo).

Análise das células T citotóxicas: aumento da citotoxicidade específica do AEP a seguir à imunização com Vr-AEP: lr-B7 [0116] Para se analisar o efeito da adição de Vr-B7 a Vr-AEP sohre a actividade citotóxica específica do AEP efectuou-se um teste com linfócitos esplénicos retirados de murganhos imunizados com a mistura de Vr-B7 e Vr-AEP para pesquisa da actividade lítica com células do adenocarcinoma dos murinos que revelaram ser negativas ao AEP (MC-38) ou com as mesmas células cuja transdução havia sido feita com os AEP (MC-38-AEP). A figura 10 demonstra que as células T de murganhos imunizados tuna vez com Vr-AEP não realizaram a lise dos alvos MC-38 negativos aos AEP, mas efectuaram a lise dos alvos MC--38-AEP positivos aos AEP. A adição de Vr-B7 ao imunogénio Vr-AEP não teve nenhum efeito sobre a lise das células MC-38, mas teve um efeito importante sobre a lise dos alvos MC-38-AEP, específicos dos AEP (figura 10). A especificidade da lise ainda foi melhor demonstrada na medida em que as células T de murganhos imunizados com um antigénio diferente, o Vr-CE-B7-1, não efectuaram a lise dos alvos MC-38-AEP.

Exemplo 10

Utilização de linfócitos sintetizados para péptidos imunogénicos obtidos a partir de antigémos ACE para o tratamento terapêutico de mamíferos que padeçam de cancro [0117] Os linfócitos T pré-sensibilizados contra o antigénio ACE podem ser eficazes terapeuticamente para tratar mamíferos que padeçam de cancro. Os linfócitos T do sangue periférico ou de suspensões de tumores foram criados em culturas in vitro (Kawakami, Y. et al. (1988) J. Exp Med. 168:2183-2191). Os linfócitos T são expostos às células infectadas com o vírus recombinante que exprime um antigénio associado ao ACE e/ou com o vírus recombinante que exprime as B7.1 e/ou as B7.2 durante um período de cerca de 1 a 16 horas, com uma concentração da MDI entre 1 e 10. Os linfócitos T expostos ao antigénio irão ser administrados ao mamífero, de preferência um ser humano, na quantidade de cerca de IO7 a 1012 linfócitos. Os linfócitos podem ser administrados por quaisquer das vias intravenosa, intraperitoneal ou intralesi onal. Este tratamento pode ser administrado em simultaneidade com outros tratamentos terapêuticos, por exemplo, naqueles em que se utiliza citoquinas, radioterapia, excisão cirúrgica de lesões tumor ais e fármacos quimioterapêuticos e ainda na terapia com linfócitos T adoptivos.

[0118] Embora a presente invenção tenha sido descrita supra a propósito de determinadas variantes específicas, faz-se observar que são possíveis muitas variações e que é possível utilizar materiais e reagentes alternativos sem que haja afastamento da invenção. Em alguns casos, tais variações e substituições podem impor uma certa experimentação, mas isso irá exigir apenas ensaios de rotina.

[0119] A descrição anterior das variantes específicas divulga tão perfeitamente a natureza geral da invenção que é possível a outras pessoas, aplicando conhecimento vulgares, modificar e/ou adaptar facilmente a invenção para diversas aplicações, tais como casos específicos, sem que haja afastamento do conceito genérico, e por tal motivo essas adaptações e modificações devem ser consideradas como estando abrangidas no âmbito e no espírito de casos equivalentes das variantes aqui descritas.

[0120] Considera-se aqui incorporadas por referência todas as obras literárias e patentes de invenção anterioimente referidas.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL:

(i) REQUERENTES: GOVERNO DOS ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA REPRESENTADO PELO SECRETÁRIO, DEPARTAMENTO DE SAÚDE E SERVIÇOS HUMANOS (ii) TITULO DA INVENÇÃO: “Reforço de uma resposta imunitária a um antígénio por acçào dc uma composição de um vírus recombinante que exprime um antigémo com um urus recombinante que exprime uma molécula imunoestimuladora” (iii) NUMERO DF. SEQUÊNCIAS: 9

(iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA (A) ENDEREÇO: MORGAN & FINNEGAN, L.L.P.

(B) RUA: 345 PARK AVENUE

(C) CIDADE: NOVA IORQUE

(D) ESTADO: NOVA IORQUE (E) PAÍS: E.U.A. (F) CÓDIGO POSTAL: 10154 (v) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) SUPORTE: 3,50 POLEGADAS, CAPACIDADE DE 1,44 Mb

(B) COMPUTADOR: CP COMPATÍVEL COM IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA INFORMÁTICO: WORDPERFECT 5.1 (vi) DADOS ACTUAIS DO PEDIDO: (A) DATA DE DEPÓSITO: 02-OUT-1995 (vii) DADOS ANTERIORES DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 08/317 268 (B) DATA DE DEPÓSITO: 03-OUT-1994 (vii) DADOS ANTERIORES DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 08/483 316 (B) DATA DE DEPÓSITO: 07-JUN-1995 (viii) INFORMAÇÃO SOBRE O REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: BROWN, KATHRYN M. (B) NÚMERO DO PEDIDO: 34 556

(C) REFERÊNCIA/NÚMERO DO PROCESSO: 2026-4176PCT (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (212) 758-4800 (B) TELEFAX: (212) 751-6849 (C) TELEX: 421792 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (iii) HIPOTÉTICA: Sim (iv) ANTI-SENTIDO: Não

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: GGTACCATGG CTTGCAATTG TCAGTTG (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases 67 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (iii) HIPOTÉTICA: Sim (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: Não (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2: CTCGAGCTAA AGGAAGACGG TCTG 24 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (iii) HIPOTÉTICA: Sim (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3: GGTACCGAAG CACCCACGAT GGAC 24 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear 68 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (iii) HIPOTÉTICA: Sim (iv) ANTI-SENTIDO: Não (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4: CTCGAGTCAC TCTGCATTTG GTTTTGC 27 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (iii) HIPOTÉTICA: Sim (iv) ANTI-SENTIDO: Não (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5: TCTAGAAGCC CCAAGCTTAC CACCTGCA 28 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 41 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico 69 (iii) HIPOTÉTICA: Sim (iv) ANTI-SENTIDO: Não (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ED NO:6: TCTAGATCAG GGGTTGGCCA CGATGGTGTC CTTGATCCAC T 41 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO;7: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 41 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (iii) HIPOTÉTICA: Sim (iv) ANTI-SENTIDO: Não (v) TIPO DE FRAGMENTO: (R) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7: AGAGAGAGCC TCAAGCTTCA GCCCCAAGCT TACCACCTGC A 41 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:8: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico 70 * (iii) HIPOTÉTICA: Sim (iv) ANTI-SENTIDO: Não 35

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCLA: SEQ ID NO.S: AGAGAGAGCA AGCTTAGTCC CTCTCCTTAC TTCAT (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:9: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases

(B) TIPO acido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA; linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (iii) HIPOTÉTICA: Sim (iv) ANTI-SENTIDO: Não

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9: TTTGGAGGCC TAGGCTTTTG CAAA 24

Lisboa, 28 de Fevereiro de 2001

Claims

Reivindicações Composição que compreende um primeiro vírus recombinante em cujo genoma virai, ou numa parte sua, está incorporado um ou vários genes ou partes suas que codificam um antigcnio dc um estado patológico, e compreende também um segundo vírus recombinante em cujo genoma virai, ou numa parte sua, está incorporado um ou vários genes ou partes suas que codificam as moléculas B7-1, B7-2 ou B7-1 e B7-2 por si sós ou em combinação com uma molécula imunoestimuladora exógena, com um fármaco quimioterapêutico, com um antibiótico, com um fármaco antivirai ou com um fármaco antifungico, sendo a composição capaz de co-infectar uma célula hospedeira, daí resultando a co-expressão de genes que codificam um antigénio de um estado patológico e a expressão de genes que codificam as moléculas B7-1, B7-2 ou B7-1 e B7-2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o primeiro vírus recombinante, o segundo vírus recombinante ou o primeiro e o segundo vírus recombinantes são seleccionados entre o conjunto constituído por retrovírus, avipoxvírus das galinhas, avipoxvírus dos canários, poxvírus dos suínos, adenovirus, vírus de vaccinia e poliovírus. Composição de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2, em que o estado patológico é um cancro ou um microrganismo palogémco. Composição de acordo com a reivindicação 3, em que o cancro é primário ou metastático. Composição de acordo com a reivindicação 4, em que o cancro é seleccionado entre o ' ‘ 2 conjunto constituído por linfoma sem ser de Hodgkin, leucemia, linfoma de Hodgkin, cancro do pulmão, cancro do fígado, melanoma, adenocarcinoma, tirnoma e sarcoma.
6. Composição de acordo com a reivindicação 3, em que o microrganismo patogénico é seleccionado entre virus, bactérias, protozoários ou leveduras.
7. Composição de acordo com a reivindicação 6, em que o vírus patogénico é seleccionado entre VIH. víms da hepatite, papilomavírus humano, vírus da encefalite dos equinos, vírus do herpes siniplex ou vírus da gripe.
8. Composição de acordo com a reivindicação 4, em que o antigénio é um antigénio associado a um tumor.
9. Composição de acordo com a reivindicação 8, em que o antigénio associado a um tumor é seleccionado entre o conjunto constituído por antigénios oncofetais, MART-1, Mage-1, Mage-3, gplOO, tirosinase, ACE, AEP, CA-125, erb-2, Muc-1, Muc-2, oncogenes ras mutacionados pontualmente, oncogenes p53 mutacionados pontualmente e TAG-72.
10. Composição de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 9, em que o segundo vinis recombinante possui também um ou vários genes ou partes suas que codificam uma molécula imunoestimuladora, sendo a molécula imunoestunuladora seleccionada entre o conjunto constituído por IL-2, M-1AIC, A-3FL, CD72, FEC-MG, FaNT, INFy, IL-12,1L-6 e suas combinações. .:- 2·
11. Composição de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 10, em que a célula hospedeira é uma célula possuidora de antigénios.
12. Composição farmacêutica que compreende a composição de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 11 e um veículo aceitável sob o ponto dc vista farmacêutico.
13. Utilização da composição de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 11 para a preparação de uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar um estado patogénico ou um cancro.
14. Utilização da composição de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 11 para a preparação de uma composição farmacêutica para reforçar uma resposta imunitária contra as células de um estado patológico num mamífero, sendo esse reforço conseguido quer infectando in vitro células de um estado patológico, com a composição de uma qualquer das reivindicações 1 a 11 e subsequente administração dessas células infectadas a um mamífero que tenha essas células desse estado patológico, quer infectando directamente in vivo as células de um estado patológico, com uma quantidade eficaz da composição de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 11.
15. Utilização de acordo com a reivindicação 14, em que as células são células tumorais, células geneticamente deficientes ou células infectadas com um microrganismo patogénico. 16. Vírus recombinante em cujo genoma ou numa parte sua está incorporado um ou vários genes, ou partes suas, que codificam um antigénio de um estado patológico e onde está 4 incorporado também um gene, ou uma parte sua, que codifica as moléculas B7-1, B7-2 ouB7-l e B7-2. 17. Vírus recombinante de acordo com a reivindicação 16, em que o antigémo é um antigémo associado a um rumor. 18. Vírus recombinante de acordo com a reivindicação 17, em que o antigémo associado a um tumor é seleccionado entre o conjunto constituído por antigéníos oncofetais, MART-1, Mage-1, Mage-3, gplOO, tirosinase, ACE, AEP, CA-125, eib-2, Muc-1, Muc-2, oncogenes ras mutacionados pontualmente, oncogenes p53 mutacionados pontualmente e TAG-72. 19. Vírus recombinante de acordo com uma qualquer das reivindicações 6 a 18, o qual compreende também um ou vários genes, ou partes suas, que codificam uma molécula imunoestimuladora, sendo a molécula imunoestimuladora seleccionada entre o conjunto constituído por IL-2, M-1AIC, A-3FL, CD72, FEC-MG, FaNT, INFy, IL-12, IL-6 e suas combinações. 20. Vírus recombinante em cujo genoma, ou numa parte sua, está incorporado um ou vários genes, ou partes suas, que codificam um antigénio de um estado patológico, sendo o antigémo desse estado patológico seleccionado entre o conjunto constituído por antigéníos oncofetais, MART-1, Mage-1, Mage-3, gplOO, tirosinase, ACE, AEP, CA-125, erb-2, Muc-1, Muc-2, oncogenes ras mutacionados pontualmente, oncogenes p53 mutacionados pontualmente e TAG-72, antigéníos do VIH, antigéníos do vírus da hepatite, antigenios do papilomavirus dos seres humanos, antigénios do vírus da encefalite dos equinos, antigénios do vírus do herpes simplex, antigénios do vírus da gripe, um antigénio de linfoma sem ser de Hodgkin, um antigénio da leucemia, um antigénio do linfoma de Hodgkin, um antigénio do cancro do pulmão, um antigénio do cancro do fígado, um antigénio do melanoma, um antigénio do adeiiucarcinoma, um antigénio do timoma e um antigénio do sarcoma e um ou vários genes, ou partes suas, que codificam as moléculas B7-1, B7-2 ou B7-1 e B7-2 por si sós ou em combinação com um ou vários genes, ou partes suas, que codificam uma molécula imunoestimuladora seleccionada entre o conjunto constituído por IL-2, M-1AIC, A-3FL, CD72, FEC-MG, FaNT, INFy, IL-12, IL-6 e suas combinações.
21. Composição farmacêutica que compreende o vírus recambinante de acordo com uma qualquer das reivindicações 16 a 20, por si só ou em combinação com uma molécula imunoestimuladora exógena, com um fármaco quimioterapêutico, com um antibiótico, com um fármaco antiviral ou com um fánnaco antifungico e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
22. Composição que compreende um primeiro vírus recombinante em cujo genoma virai, ou numa parte sua, está incorporado um ou vários genes, ou partes suas, que codificam um anticorpo cujo local de ligação do antigénio se assemelha a um antigénio de um estado patológico, e um segundo vírus recombinante em cujo genoma virai, ou numa parte sua, está incorporado um ou vários genes, ou partes suas, que codificam as moléculas B7-1, B7-2 ou B7-1 e B7-2, por si sós ou em combinação com uma molécula imunoestimuladora 6 exógena, com um fármaco quimioterapêutico, com um antibiótico, com um fármaco antiviral ou com um fármaco antifungico, sendo a composição capaz de co-infectar uma célula hospedeira, daí resultando a co-expressão de genes que codificam um anticorpo cujo local de ligação se assemelha a um antigénio de um estado patológico, e ainda genes que codificam as moléculas B7-1, B7-2 ou B7-1 e B7-2. 23. Vírus recombinante em cujo genoma virai, ou numa parte sua, está incorporado um ou vários genes, ou partes suas, que codificam um anticorpo cujo local de ligação do antigénio se assemelha a um antigénio de um estado patológico, e um ou vários genes, ou partes suas, que codificam as moléculas B7-1, B7-2 ou B7-1 e B7-2.
24. Composição farmacêutica que compreende o vírus recombinante da reivindicação 23, por si só ou em combinação com uma molécula imunoestimuladora exógena, com um fármaco quimioterapêutico, com um antibiótico, com um fármaco antiviral ou com um fármaco antifungico e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Lisboa, 28 de Fevereiro de 2001 // η v