PT773943E - Compostos uteis como agentes antiproliferativos e inibidores de garft - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "COMPOSTOS ÚTEIS COMO AGENTES ANTIPROLIFERATIVOS E INIBIDORES DE GARPT"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se com compostos de Fórmula I definida adiante, que inibem a enzima glicinamido ribonucleotido formil transferase (GARFT) . A invenção também se relaciona com composições farmacêuticas contendo os compostos de Fórmula I, com a sua utilização para a inibição de GARFT e com a sua utilização para a inibição do crescimento e da proliferação das células de organismos superiores ou de microrganismos tais como bactérias, leveduras e fungos. A invenção também se relaciona com a preparação destes compostos, e com intermediários utilizados na sua preparação. A GARFT é uma enzima dependente de folato na via biossintética de novo da purina. Esta via é crítica para a divisão e proliferação celulares. Sabe-se que fechando esta via tem um efeito antiproliferativo, em particular, um efeito antitumoral. Assim, foram sintetizados vários análogos de folato e estudados quanto à sua aptidão para inibir a GARFT. Foi descrito que um inibidor prototípico de forte ligação específica a GARFT, o ácido 5,10-didesazatetrahidrofólico (DDATHF) , apresenta actividade antitumoral. Ver F. M. Muggia, "Folate antimetabolites inhibitor to de novo purine synthesis", New Drugs, Concepts and Results in Câncer Chemotherapy, Kluwer Academic Publishers, Boston (1992), 65-87. A grande classe de agentes antiproliferativos inclui compostos antimetabolitos. Uma subclasse particular de antimetabolitos conhecidos como antifolatos ou antifolos são 1

antagonistas da vitamina ácido fólico. Tipicamente, os antifolatos têm uma estrutura muito semelhante à do ácido lólico e incorporam a unidade p-benzo£l glutamato do ácido fólico. A unidade de glutamato do ácido fólico fica com uma carga negativa dupla ao pH fisiológico, e assim este composto e os seus análogos têm um sistema de transporte activo movido a energia para atravessar a membrana celular e exercer um efeito metabólico. A investigação por vários investigadores mostrou que o ácido fólico nas suas formas tanto reduzida como oxidada e os seus análogos são transportados activamente no seio das células por pelo menos dois mecanismos de transporte distintos. Estas proteínas de transporte são designadas como a proteína de transporte de folato reduzido, que tem preferência pelos folatos reduzidos mas que transportará diversos derivados do ácido fólico. O metotrexato (MTX) é transportado através do sistema de transporte de folato reduzido. A outra proteína de transporte de folato é designada como a proteína de ligação de folato à membrana ou mFBP, que tem preferência pelo ácido fólico. Ver A. C. Anthony, "The Biological Chemistry of Folate Receptors", Blood, The Journal of the American Society of Hematology, vol. 79 (1992), 2807-2820.

Os antifolatos contendo glutamato anticancerígenos utilizados clinicamente até ao presente, incluindo MTX, penetram nas células através do sistema de transporte de folato reduzido com uma excepção assinalável. 0 ácido 5,10-disesaza-tetrahidrofólico (DDATHF) é um inibidor de GARFT antitumoral presentemente em estudo clínico. Demonstrou-se que o DDATHF é transportado para o interior das células através do sistema de transporte de folato reduzido e da mFBP. Ver G. Pizzorno et al., "5,10-Dideazatetrahydrofolic Acid (DDATHF) Transport in CCRF-CEKM and MA104 Cell Lines", The Journal of Biolocrical Chemistry, vol. 268 (1993), 1017-1023.

Fo sugerido que a toxicidade indesejada, particularmente em mamíferos deficitários em folato, está relacionada com o 2

facto de que o DDATHF, um inibidor de GARFT do estado da técnica, tem uma afinidade elevada para a mFBP, que fica desrregulada durante os períodos de deficiência de folato. Foi adicionalmente sugerido que o ácido fólico e outras moléculas que impedem a mFBP de transportar outros inibidores de GARFT podem atenuar a toxicidade desses inibidores. Ver, e.g., T. Alati et al. , "Evaluation of the Mechanism(s) of Inhibition of the Toxicity, But Not the Antitumor Activity of Lometrexol (DDATHF) by Folie Acid", Proceedings of the American Association for Câncer Research, vol. 33 (1992), Abstract 2432, 407; L. L. Habeck et al., "A Novel Class of Monoglutamated Antifolates Exhibits Tight-binding Inhibition of Human Glycinamide Ribonucleotide Formyltransferase and Potent Activity against Solid Tumors", Câncer Research, vol. 54 (1994), 1021-1026; e Patente U.S. 5.217.974 de Grindey et al.. 0 EP-A2-0 343 801 relaciona-se com derivados do ácido N-(5,6,7,8-tetrahidropirido (2,3-d)pirimidin-6-il-alcanoíl) -glutâmico. Os compostos são descritos como possuindo actividade inibidora sobre enzimas que utilizam ácido fólico. A WO 94/13295 relaciona-se com compostos de 5-tiapirimidona e 5-selenopirimidona substituídos anti-proliferativos. Os compostos descritos são derivados monocíclicos de pirimidona. Ο EP-A1-0 109 381 relaciona-se com derivados do ácido tiofeno-2-carboxílico e com métodos para a sua preparação. É referido que os compostos possuem um efeito inibidor forte sobre a tromboxano sintetase. K. Clarke et al. , J. Chem. Soc. , Perkin Transactions 1 (1980), 1029-1037 relaciona-se com tieno [2,3-d] isotiazoles e tieno[3,2-d] isotiazoles e com métodos para a sua preparação. 3

Nemec efc al., Collection Czechoslovak Chem. Commun. 39 (1974), 3577-3531 relaciona 3e com a síntese de ácidos 2-tiofenocarboxílicos 4-substituídos e com métodos para a sua preparação.

Sumário da Invenção

Assim, um objecto da presente invenção é proporcionar compostos que são inibidores potentes de GARFT com toxicidade reduzida. Este objectivo foi conseguido através dos agentes proliferativos de Fórmula I adiante que são inibidores potentes de GARFT mas não têm ligação forte à mFBP. Estes compostos preferencialmente têm constantes de ligação à mFBP de pelo menos um factor de 1000 menos do que a DDATHF, mas retêm ainda as propriedades vantajosas de inibição de GARFT e transporte de folato reduzido para actividade antitumoral.

Tal como indicado acima, os compostos da invenção possuem actividade antiproliferativa, uma propriedade que se pode exprimir na forma de actividade antitumoral. Um composto da invenção pode ser activo per se, ou pode ser um precursor que é convertido in vivo num composto activo. Os compostos preferidos da invenção são especialmente activos na inibição da enzima GARFT. Os compostos particularmente preferidos são activos na inibição do crescimento da linha celular L1210, uma linha celular de leucemia do murganho que pode ser cultivada por cultura de tecidos. Os compostos da invenção também devem ser activos na inibição do crescimento de bactérias tais como bactérias gram negativas Escherichia coli que podem ser cultivadas em cultura.

Os compostos de acordo com a invenção, bem como os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, podem ser incorporados em formas de dosagem adequadas tais como cápsulas, comprimidos, ou preparações injectáveis. Também podem ser utilizados veículos sólidos ou líquidos farmaceuticamente aceitáveis. 4

Os veículos sólidos incluem amido, lactose, dihidrato de sulfato de cálcio, terra alba, sacarose, talco, gelatina, agar, pectina, acácia, estearato de magnésio e ácido esteárico. Os veículos líquidos incluem xarope, óleo de amendoim, azeite, soro fisiológico e água. O veículo ou diluente pode incluir qualquer material de libertação prolongada, tal como monoestearato de glicerilo ou diestearato de glicerilo, só ou com cera. Quando se utiliza um veículo líquido, a preparação pode estar na forma de um xarope, elixir, emulsão, cápsula de gelatina mole, líquido injectável estéril {e.g. solução) ou suspensão líquida não-aquosa ou aquosa.

As preparações farmacêuticas são preparadas seguindo técnicas convencionais do químico farmacêutico envolvendo passos tais como mistura, granulação, e compressão quando necessário para formas em comprimidos, ou mistura, enchimento e dissolução dos componentes consoante apropriado para dar os produtos desejados para administração oral, parentérica, tópica, intravaginal, intranasal, intrabronquial, intraocular, intra-auricular ou rectal.

As composições da invenção podem compreender adicionalmente um ou mais outros compostos farmaceuticamente activos. Por exemplo, na composição pode estar incluído um dos seguintes agentes antitumorais: inibidores mitóticos (e.g., vinblastina) ; agentes alquilantes; inibidores de dihidrofolato redutase ou inibidores de TS; antimetabolitos (por exemplo, 5-fluoro-uracilo, citosinoarabinosido) ; antibióticos intercalantes (por exemplo, adriamicina, bleomicina) ,- enzimas (por exemplo, asparaginase) ; inibidores de topoisomerases (por exemplo, etoposido); e modificadores da resposta biológica (por exemplo, interferão) . Os compostos da invenção também podem ser utilizados em combinação com um ou mais agentes antiproliferativos ou inibidores de GARFT, tais como um composto 5 descrito na Publicação internacional N2 WO 94/13295, dos mesmos requerentes, publi cada. em 2 de Abril de 1992, cujas descrições aqui são dadas como incorporadas por citação. As composições da invenção também podem compreender um ou mais outros compostos incluindo agentes antibacterianos, antifúngicos, anti-parasí ticos, antivirais, antipsoriáticos ou anticoccídeos. Agente anLibacterianos exemplificativos incluem: sulfonamidas, tais como sulf ametoxazole, sulf adiazina, sulfameter e sulfadoxina; inibidores de redutase dihidrofólica, tais como trimetoprim, bromo diaprim, ou trimetrexato; penicilinas; cefalosporinas; e os ácidos quinolono carboxílicos e os seus análgos de isotiazole fundidos.

Outro aspecto da invenção relaciona-se com um método terapêutico para a inibição do crescimento e da proliferação de células de organismos superiores ou de microrganismos, que compreende a administração a um hospedeiro de uma quantidade eficaz de um composto de acordo com a presente invenção. Os compostos da invenção são particularmente úteis no tratamento de hospedeiros mamíferos, tais como hospedeiros humanos, e no tratamento de hospedeiros aves. Um processo terapêutico particularmente preferido compreende a administração a um hospedeiro de uma quantidade eficaz de um composto de acordo com a presente invenção para a inibição de GARFT.

Muitos dos compostos antiproliferativos aqui descritos ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser utilizados no processo terapêutico da invenção. Os compostos podem ser administrados na forma de uma composição farmaceuticamente aceitável compreendendo um diluente ou veículo como os que foram descritos acima. A dose de uma composição contém pelo menos uma quantidade eficaz do composto activo e preferencialmente é constituída por uma ou mais unidades de dosagem farmacêuticas. Uma "quantidade eficaz" significa uma quantidade suficiente para inibir as vias 6 metabólicas de folato e daí obter os efeitos vantajosos, e.g., através da administração de uma ou mais das unidades de dosagem farmacêuticas.

Uma dose unitária diária exemplif icativa para um hospedeiro vertebrado compreende uma quantidade até um grama de composto autivo por quilograma do hospedeiro, preferencialmente meio grama, mais preferencialmente 100 miligramas, e mais preferencialmente ainda, cerca de 50 miligramas ou menos, por quilograma de peso corporal do hospedeiro. A dose seleccionada pode ser administrada a um animal de sangue quente ou a um mamífero, por exemplo, um doente humano necessitado de tratamento mediado pela inibição das vias metabólicas de folato, por qualquer método de administração conhecido da dose incluindo: topicamente, por exemplo, como uma pomada ou creme; oralmente; rectalmente, por exemplo, como um supositório; parentericamente por injecção; ou continuamente por infusão intravaginal, intranasal, intrabronquial, intra-auricular ou intra-ocular.

Os compostos de acordo com a invenção produzem qualquer um ou mais de um efeito antiproliferativo, um efeito antibacteriano, um efeito antiparasítico, um efeito antiviral, um efeito antipsoriático, um efeito antiprotozoário, um efeito anticoccídio, um efeito anti-inflamatório, um efeito imunos supres sor e um efeito antifúngico. Os compostos são especialmente úteis na produção de um efeito antitumoral num hospedeiro vertebrado que alberga um tumor.

Descrição Pormenorizada da Invenção e Formas de Realização Preferidas

Em particular, a invenção relaciona-se com compostos de Fórmula I: 7 η2ν

COoRa Ν Η (I) em que A é enxofre, CH2 ou selénio; Z é um grupo C1-C3 alquilo, um grupo C2-C3 alcenilo, um grupo C2-C3 alcinilo, NH, NCH3, enxofre ou oxigénio; X é um grupo C1-C6 alquilo; um grupo C2-C6 alcenilo; um grupo C2-C6 alcinilo

Rl e R2 são cada um independentemente hidrogénio ou uma unidade que forma (conjuntamente com o CO2 ligado) um grupo éster prontamente hidrolizável. A invenção também se relaciona com os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos de Fórmula I.

Embora os compostos de Fórmula I estejam ilustrados na forma 4-oxo e sejam referidos como tal ao longo desta descrição, o grupo oxo existe em equilíbrio tautomérico com o correspondente grupo 4-hidroxilo. Entender-se-á pois que os compostos de Fórmula I incluem as formas 4-oxo estruturalmente ilustrada e 4-hidroxi tautomérica. Assim, a invenção também se relaciona com sais farmaceuticamente aceitáveis dos tautómeros 4-hidroxi dos compostos ilustrados pela fórmula I.

Os compostos de Fórmula I estão na forma de misturas diastereoméricas. Entender-se-á salvo indicação em contrário, 8 que os compostos que têm centros quirais estão na forma de misturas de diaGtcrcómeros.

Preferencialmente, A é enxofre ou CH2.

Preferencialmente, Z é CH2, CH2CH2, NH, oxigénio, enxofre, CH(CH20H) ou JMCH3 · Mais preterencialmente, Z é CH2.

Preferencialmente, X é um grupo C1-C6 alquilo. Mais preferencialmente X é metilo ou etilo.

Preferencialmente, Ri e R2 são cada um independentemente hidrogénio, C1-C6 alquilo, hidroxialquilo, alquilarilo ou aralquilo. Mais preferencialmente, Ri e R2 são cada um independentemente hidrogénio ou C1-C2 alquilo.

Em formas de realização particularmente preferidas, A é enxofre ou CH2, Z é CH2, e X é metilo.

Exemplos preferidos de compostos de Fórmula I incluem: ácido N- (5- [2- (2-amino-4 (3H) -oxo-5,6,7,8-tetrahidropirido[2,3-d] -pirimidin-6-il)etil]-4-metiltien-2-il)-L-glutâmico; ácido N- (5- [2 - (2-amino-4-oxo-4,6,7,8-tetrahidro-3H-pirimido[5,4-6][1,4]-tiazin-6-il)etil]-4-metiltien-2-il)-L-glutâmico, éster dietílico; e ácido N-(5- [2- (2-amino-4-oxo-4,6,7,8-tetrahidro-3H-pirimido[5,4-6][1,4]-tiazin-6-il)etil]-4-metiltien-2-il)-L-glutâmico.

Os compostos de Fórmula I são úteis como inibidores de GARFT. Os compostos de Fórmula I em que cada um de Rl e R2 é hidrogénio são agentes antitumorais e antiproliferativos especialmente activos. Os compostos de Fórmula I em que Ri e R2 são cada um uma unidade que forma um grupo éster prontamente hidrolizável com o grupo carboxilo ligado, preferencialmente um grupo etilo, são intermediários úteis para a formação das formas 9 livres de ácido glutâmico dos compostos e também podem ser hidrolizados in vivo e por isso actuar como pró-fármaeos.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis da invenção incluem, por exemplo, sais de metais alcalinos, metais alcalino-terrosos, outros metais não-tóxicos, amónio e amónio substituído dos compostos dti ácido glutâmico da invenção. Sais exemplificativos incluem sais de sódio, potássio, lítio, cálcio, magnésio, piridínio e piridínio substituído dos compostos ácidos livres.

Os compostos de Fórmula I podem ser preparados tal como descrito a seguir.

Para preparar compostos de Fórmula I em que Z é CH2, um material de partida útil é um composto de Fórmula II:

em que: R é um halogéneo, preferencialmente bromo; X é como definido acima; e B é OH ou um amino ácido, preferencialmente glutamato de dietilo, ligado através da porção amino para formar uma amida, ou um C1-C6 álcool, preferencialmente um álcool metílico ou etílico, ligado através da porção álcool para formar um éster.

Faz-se reagir o composto de Fórmula II com um composto de Fórmula III:

Y

(III) em que: Y é CH2OH ou uma piridopirimidina protegida de Fórmula IV: 10

A síntese pode então seguir uma de duas vias, dependendo de se Y é uma piridopirimidina protegida ou CH2OH.

Quando Y é uma piridopirimidina protegida ou CH2OH de Fórmula IV, a reacção de acoplamento dos compostos de Fórmulas II e III preferencialmente é realizada na presença de um catalisador metal de tansição, preferencialmente paládio ou níquel, na presença de uma base, preferencialmente uma base auxiliar não-nucleófila, num solvente em que pelo menos um dos reagentes é pelo menos parcialmente solúvel. Os solventes preferidos para a reacção de acoplamento dos compostos de Fórmulas II e III são dietilamina, acetonitrilo, dimetilformamida, dimetilacetamida e trietilamina. 0 meio básico para a reacção de acoplamento é preferencialmente proporcionado através de uma base auxiliar não-nucleófila, que é uma base capaz de neutralizar o halogeneto de hidrogénio ácido produzido pela reacção de acoplamento. A base é preferencialmente uma di-ou tri-alquilamina, tal como dietilamina, trietilamina ou diisopropiletilamina. Quando apropriado, pode utilizar-se um solvente básico em vez de um solvente e base separados.

Quando Y é a piridopirimidina a reacção de acoplamento dos compostos de Fórmulas II e III produz um composto de Fórmula V: 11

em que X, Ri e R2 são como definidos acima.

Faz-se reagir o composto de Fórmula V com hidrogénio gasoso, preferencialmente a 45-1000 psi, na presença de um catalisador metal de tansição, preferencialmente platina, paládio ou ródio metálicos sobre carvão ou outro suporte adequado, num solvente adequado, preferencialmente ácido acético ou ácido trifluoroacético, para se obter um composto de Fórmula VI:

CO2R2 (VI) em que X, Ri e R2 são como definidos acima.

Finalmente, o composto de Fórmula VI é hidrolizado para formar um ácido glutâmico livre (Ri e R2 são cada um H) de Fórmula I.

Quando Y é CH20H, a reacção dos compostos de Fórmulas II e III produz um composto de Fórmula VII: 12 (VII)

em que X e B são como definidos acima.

Faz-se reagir o composto de Fórmula VII com hidrogénio gasoso na presença de um catalisador metal adequado, preferencialmente paládio ou platina, para se obter um composto de Fórmula VIII:

(VIII) em que X e B são como definidos acima.

Faz-se reagir o composto de Fórmula VIII com um agente oxidante, preferencialmente perrutenato de tetrapropilamónio, para se obter um composto de Fórmula IX:

0 (IX) em que X e B são como definidos acima.

Faz-se reagir o composto de Fórmula IX com um agente de transferência de metileno, preferencialmente metileno 13 trifenilfosforano, num solvente adequado, preferencialmente tetrahidrofurano, para se obter um composto de Fórmula X:

(X) em que X e B são como definidos acima.

Faz-se reagir o composto de Fórmula X com um agente dihidroxilante, preferencialmente tetróxido de ósmio, na presença de um agente oxidante adequado, preferencialmente N-óxido de N-metilmorfolina, para se obter um composto de Fórmula XI:

HO

OH (XI) em que X e B são como definidos acima. 0 composto de Fórmula XI é convertido num composto de Fórmula I utilizando qualquer dos quatro processos descritos adiante.

Num primeiro processo de conversão, faz-se reagir o composto de Fórmula XI com um agente sulfonante, preferencialmente cloreto de p-toluenossulfonilo ou cloreto de metanossulfonilo, na presença de uma base não-nucleóf ila, preferencialmente trietilamina ou diisopropiletilamina, para dar um composto intermediário mono-sulfonado. Faz-se então reagir este intermediário com uma base forte, preferencialmente hidreto de sódio, para se obter um composto de Fórmula XII: 14 (XII)

em que X e R sãn como definidos acima.

Faz-se reagir o epóxido de Fórmula XII com um nucleófilo contendo azoto, preferencialmente azida de sódio, na presença de um catalisador ácido de Lewis suave, preferencialmente perclorato de lítio ou perclorato de magnésio, para se obter uma álcool azida intermediária. A redução da álcool azida, preferencialmente com hidrogénio gasoso na presença de um catalisador de metal, e protecção subsequente com um grupo protector de azoto adequado, preferencialmente t-butoxicarbonilo, benziloxicarbonilo ou benzilo, produz um composto de Fórmula XIII:

em que X e B são como definidos acima, e R4 e R5 são cada um independentemente hidrogénio ou um grupo protector de azoto adequado. Os grupos protectores preferidos são t-butoxicarbonilo, benziloxicarbonilo e benzilo.

Faz-se reagir o composto de Fórmula XIII com um agente acilante ou sulfonante, preferencialmente cloreto de metanossulfonilo ou cloreto de p-toluenossulfonilo, na presença de uma base não-nucleófila, preferencialmente trietilamina ou diisopropiletilamina, num solvente adequado em que pelo menos um dos reagentes é pelo menos parcialmente solúvel, para se obter 15 um grupo hidroxilo activado. 0 grupo hidroxilo activado é substituído por um nucleófilo adequado, preítiiencialmente um sal de um tioácido, mais preferencialmente tioacetato de potássio, para se obter um composto de Fórmula XIV:

(XIV) em que A, X, B, e R4 e R5 são como definidos acima, e Ac é um grupo acilo. Preferencialmente, Ac é acetilo.

Alternativamente, o composto de Fórmula XIII pode ser convertido no composto de Fórmula XIV num procedimento químico utilizando trifenilfosfina, azadicarboxilato de dietilo ou de dimetilo, e um nucleófilo ácido, preferencialmente ácido tioacético, num solvente adequado. 0 composto de Fórmula XIV é tratado com uma base nucleófila, preferencialmente carbonato de potássio, carbonato de sódio, hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio, num solvente alcoólico, preferencialmente metanol, etanol ou isopropanol, na presença de um agente alquilante, preferencialmente cloromalonato de dimetilo ou de dietilo, para se obter um composto de Fórmula XV:

16 em que A, X, B, e R4 e R5 são como definidos acima, e cada Rg é independentemente hidrogénio ou uma unidade que forma com o grupo C02 ligado um grupo éster prontamente hidrolizável. Preferencialmente, Rg é C1-C6 alquilo, hidroxialquilo, alquilarilo ou aralquilo. Mais preferencialmente, Rç é C1-C2 alquilo. 0 composto de Fórmula XV é tratado em condições adequadas para remover R4 ou R5, ou ambos os grupos protectores, para se obter um composto de Fórmula XVI:

H em que A, X, B e Rç são como definidos acima. Quando se utiliza t-butoxicarbonilo como um grupo protector, condições adequadas são tratamento com ácido trif luoroacético, seguido por neutralização.

Faz-se reagir o composto de Fórmula XVI com um agente alquilante, preferencialmente tetrafluoroborato de trimetil ou trietil oxónio, num solvente adequado, preferencialmente diclorometano, para formar um éter lactim intermediário. Faz-se reagir o éter lactim intermediário com guanidina num solvente alcoólico, preferencialmente metanol, etanol ou isopropanol, para formar um composto de Fórmula XVII:

B N H

H2N 17 (XVII) em que A, X e B são como definidos acima.

Alternativamente, o composto de Fórmula XVI pode ser convertido no composto de Fórmula XVII por reacção do composto de Fórmula XVI com um agente tiolante, preferencialmente P2S5 ou 2.4-bis (4-metoxifenil) -1,3-ditia-2,4-difosfetano-2,4-dissulfureto, para formar o intermediário tiolactama. Este intermediário é então alquilado com um agente alquilante, preferencialmente iodeto de metilo ou tetrafluoroborato de trimetil ou tritil oxónio, e depois com guanidina num solvente alcoólico, preferencialmente metanol, etanol ou isopropanol, para se obter o composto de Fórmula XVII.

Quando B é uma função álcool - i.e., quando o grupo ligado com B forma um grupo éster - o composto de fórmula XVII é hidrolisado em condições básicas para formar um composto de Fórmula XVIII:

H (XVIII) em que A e X são como definidos acima. 0 composto de Fórmula XVIII é acoplado a um péptido, por meios bem conhecidos pelos especialistas na matéria, com um cloridrato de um diéster do ácido glutâmico, para formar um diéster de Fórmula XIX: 18

em que A, X, Ri e R2 são definidos como acima, excepto que nem Rl nem R2 é hidrogénio.

Finalmente, se for desejada a forma livre de ácido glutâmico, o composto de Fórmula XX é hidrolisado para formar um composto de Fórmula I.

No segundo processo de conversão, prepara-se um composto de Fórmula XIV tal como descrito acima. Este composto é tratado com ácido, preferencialmente ácido trifluoroacético, clorídrico ou p-toluenossulfónico, para remover todos os grupos protectores (R4, R5 e Ac) para se obter um composto de Fórmula XX:

(XX) em que A, X e B são como definidos acima.

Faz-se reagir o composto de Fórmula XX em condições tamponadas fracamente básicas, preferencialmente utilizando um tampão fosfato com pH 7, num solvente adequado, preferencialmente etanol ou metanol, com um composto de Fórmula XXI: 19 (XXI) ο η2ν

,Br

Cl para se obter um composto de Fórmula XVII. o restante do segundo processo, decorrendo desde o composto de Fórmula XVII até ura composto de Fórmula I, é realizado de forma análoga à descrita acima.

No terceiro processo de conversão, faz-se reagir o composto de Fórmula XI com um grupo protector de hidroxilo adequado, preferencialmente um grupo trialquilsililo, mais preferencialmente um cloreto de t-butildimetilsililo, na presença de uma base não-nucleófila fraca, preferencialmente trietilamina, para se obter um composto de Fórmula XXII:

(XXII) era que X e B são como definidos acima, e R7 é um grupo protector de hidroxilo adequado, preferencialmente um grupo trialquilsililo.

Faz-se então reagir o composto de Fórmula XXII com vim agente acilante ou sulfonante, preferencialmente cloreto de metanossulfonilo ou cloreto de p-toluenossulfonilo, na presença de uma base não-nucleóf ila, preferencialmente trietilamina ou diisopropiletilamina, num solvente adequado em que pelo menos um dos reagentes é pelo menos parcialmente solúvel, para se obter um grupo hidroxilo activado. 0 grupo hidroxilo activado é substituído por um nucleófilo adequado, preferencialmente um sal 20

de um tioácido, mais preferencialmente tioacetato de potássio, para rp obter um composto dc Fórmula XXIII:

(XXIII) em que A, X, B, R7 e Ac são como definidos acima.

Alternativamente, o composto de Fórmula XXII pode ser convertido no composto de Fórmula XXIII num procedimento químico utilizando trifenilfosfina, azadicarboxilato de dietilo ou de dimetilo, e um nucleófilo ácido, preferencialmente ácido tioacético, num solvente adequado.

Faz-se reagir o composto de Fórmula XXIII com uma base nucleófila ou um ácido suave para remover selectivamente o grupo acilo na unidade A. Faz-se reagir o intermediário resultante com um composto de Fórmula XXIV:

Br

HN

(XXIV) na presença de uma base não-nucleóf ila, preferencialmente trietilamina, diisopropiletilamina ou carbonato de potássio, para se obter um composto de Fórmula XXV:

21 em que A, X, B e R7 são como definidos acima. O grupo protector R7 no composto de Fórmula XXV é removido por tratamento com um reagente adequado para se obter um composto de Fórmula XXVI:

(XXVI) em que A, X e B são como definidos acima. Quando R7 é trialquilsililo, o reagente é preferencialmente um sal fluoreto, mais preferencialmente fluoreto de potássio, fluoreto de tetrabutilamónio ou fluoreto de césio. O composto de Fórmula XXVI é ciclizado para se obter o composto de Fórmula XVII por activação do grupo hidroxilo com m agente activante, preferencialmente cloreto de metanossulfonilo, seguido por tratamento com uma base. Alternativamente, o azoto da pirimidinona é primeiramente protegido com um grupo protector adequado, preferencialmente t-butoxicarbonilo, seguido por ciclização e remoção subsequente do grupo protector em condições ácidas. 0 remanescente do processo decorre a partir do composto de Fórmula XVII até um composto de Fórmula I de modo análogo ao descrito acima.

No quarto processo de conversão, que é o preferido, prepara-se um composto álcool de Fórmula XXVI tal como descrito acima. Faz-se reagir este álcool com um agente oxidante adequado para produzir uma funcionalidade aldeído que cicliza ao composto de Fórmula XXVII: 22

em que A, X e B são como definidos acima.

Faz-se reagir o composto de Fórmula XXVII com um agente redutor, preferencialmente cianoborohidreto de sódio, na presença de um ácido de Lewis, preferencialmente eterato de trifluoreto de boro, para se obter um composto de Fórmula XVII definido acima. O restante do processo decorre a partir do composto de Fórmula XVII até um composto de Fórmula I de modo análogo ao descrito acima.

Os compostos de Fórmula I em que Z é diferente de 0¾ podem ser preparados de forma análoga à daqueles em que Z é CH2. Em particular, os compostos de Fórmula I em que Z é diferente de CH2 podem ser preparados utilizando uma olefina de Fórmula XXXIV:

(XXXIV) em que X e R6 são como definidos acima, e Z é como definido acima para a Fórmula I excepto que é diferente de CH2.

Quando Z é enxofre, oxigénio, ou NH, NCH3, um composto de Fórmula XXXV: 23

(XXXV) X HZ

C02R5 em que X e Rg são como definidos acima, e Z é enxofre, oxigénio, ou NH, NCH3 , é alquilado. A alquilação pode ser realizada utilizando um halogeneto de alilo, preferencialmente brometo de alilo, na presença de uma base não-nucleófila, preferencialmente trietilamina ou diisopropiletilamina, para se obter o composto de Fórmula XXXIV.

Quando Z é um C1-C2 alquilo diferente de CH2, C2-C3 alcenilo ou C2-C3 alcinilo, o composto de Fórmula XXXIV é preparado por olefinação de um aldeído de Fórmula XXXVI:

X

0 (XXXVI) em que X e R6 são como definidos acima, e Z é um C1-C2 alquilo diferente de CH2, C2-C3 alcenilo ou C2-C3 alcinilo. 0 aldeído de Fórmula XXXVI pode ser preparado de modo análogo ao descrito por Chuan Shih et al., Journal of Medicinal Chemistry, vol. 35 (1992), 1109-1116. A olefinação do aldeído pode ser realizada utilizando um agente de transferência de metileno, preferencialmente metileno-trifenilfosforano.

Faz-se reagir o composto de Fórmula XXXIV com um agente dihidroxilante, preferencialmente tetróxido de ósmio, na presença de um agente oxidante adequado, preferencialmente N-óxido de N-metilmorfolina, para se obter um composto de Fórmula XXXVII: 24 r\

em que X e Rê são como definidos acima; e Z é como definido acima para a Fórmula I, excepto que é diferente de CH2.

Faz-se reagir o composto de Fórmula XXXVII com um agente sulfonante, preferencialmente cloreto de p-toluenossulfonilo ou cloreto de metanossulfonilo, na presença de uma base não-nucleófila, preferencialmente trietilamina ou diisopropil-etilamina, para dar um composto monos sul fonado intermediário. Fa-ze reagir este intermediário com uma base forte, preferencialmente hidreto de sódio, para produzir um composto de Fórmula XXXVIII:

(XXXVIII) em que X e Rç são como definidos acima; e Z é como definido acima para a Fórmula I, excepto que é diferente de CH2.

Faz-se reagir o epóxido de Fórmula XXXVIII com um nucleólilo contendo azoto, preferencialmente azida de sódio, na presença de um catalisador ácido de Lewis suave, preferencialmente perclorato de lítio ou de magnésio, para se obter uma álcool azida intermediária. Este intermediário é 25

reduzido, preferencialmente com hidrogénio gasoso na presença de um catalisador de metal, o a protecção subsequente com um grupo protector de azoto adequado, preferencialmente t-butoxicarbonilo, benziloxicarbonilo ou benzilo, produz um composto de Fórmula XVII':

em que X, R6, e R4 e R5 são como definidos acima, e Z é como definido acima para a Fórmula I, excepto que é diferente de CH2.

Faz-se então reagir 0 composto de Fórmula XVII' com vim agente acilante ou sulfonante, preferencialmente cloreto de metanossulfonilo ou cloreto de p-toluenossulfonilo, na presença de uma base não-nucleófila, preferencialmente trietilamina ou diisopropiletilamina, num solvente adequado em que pelo menos um dos reagentes é pelo menos parcialmente solúvel, para se obter um grupo hidroxilo activado. O grupo hidroxilo activado é substituído por um nucleófilo adequado, preferencialmente um sal de um tioácido, mais preferencialmente tioacetato de potássio, para se obter um composto de Fórmula XVIII' :

X

C02R6 26 (XVIII’) em que A, X, Rç, R4 e R5, e Ac são como definidos acima, e Z é como definido acima para a Fórmula I, excepto que é diferente de CH2.

Alternativamente, o composto de Fórmula XVII' é convertido no composto de Fórmula XVIII1 num procedimento químico utilizando trifenilfosfina, azadicarboxilato de dietilo ou de dimetilo, e um nucleófilo ácido, preferencialmente ácido tioacético, num solvente adequado. 0 composto de Fórmula XVIII' é tratado com uma base nucleófila, preferencialmente carbonato de potássio, carbonato de sódio, hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio, num solvente alcoólico, preferencialmente metanol, etanol ou isopropanol, na presença de um agente alquilante, preferencialmente cloromalonato de dimetilo ou de dietilo, para se obter um composto de Fórmula XIX' :

em que A, X, R6, e R4 e R5 são como definidos acima, e Z é como definido acima para a Fórmula I excepto que é diferente de CH2. 0 composto de Fórmula XIX’ é tratado em condições adequadas para remover ou um ou ambos dos grupos protectores R4 e Rb para produzir um composto de Fórmula XX1 : 27

em que A, X e R6 são como definidos acima, e Z é como definido acima para a Fórmula I excepto que é diferente de CH2. Quando t-butoxicarbonilo é um grupo protector, condições para a remoção deste grupo são preferencialmente tratamento com ácido trifluoroacético, seguido por neutralização para dar o composto de Fórmula XX'.

Faz-se reagir o composto de Fórmula XX' com um agente alquilante, preferencialmente tetrafluoroborato de trimetil ou trietil oxónio, num solvente adequado, preferencialmente diclorometano, para formar um éter lactim intermediário. Faz-se reagir o éter lactim intermediário com guanidina num solvente alcoólico, preferencialmente metanol, etanol ou isopropanol, para formar um composto de Fórmula XXI’ :

(XXI1) em que A, X e Rg são como definidos acima, e Z é como definido acima para a Fórmula I excepto que é diferente de 0¾. 28 f\

Alternativamente, o composto de Fórmula XX' é convertido nu cuiupusLu de Fóxmula. XXI' por reacy3o do composto de Fórmula X' com um agente tiolante, preferencialmente P2S5 ou 2.4-bis(4-metoxifenil) - l,3-ditia-2,4-difosfetano-2,4-dissulfureto, para formar o intermediário tiolactama. Esta pode ser então alquilado com um agente alquilante, preferencialmente iodeto de meti lo ou tetrafluoroborato de trimetil ou tritil oxónio, e depois com guanidina num solvente alcoólico, preferencialmente metanol, etanol ou isopropanol, para se obter o composto de Fórmula XXI'. 0 composto de Fórmula XXI' é hidrolisado em condições básicas para formar um composto de Fórmula XXII' :

em que A e X são como definidos acima, e Z é como definido acima para a Fórmula I excepto que é diferente de CH2. Quando R.6 é hidrogénio no composto de Fórmula XXI ’, então não é necessária a reacção de hidrólise, e o composto de Fórmula XXI' é acoplado a um péptido tal como descrito adiante. O composto de Fórmula XXII' (ou o composto de Fórmula XXI' em que R6 é hidrogénio) , que está na forma livre de ácido carboxílico, pode ser acoplado a um péptido, por meios bem conhecidos pelos especialistas na matéria, com um cloridrato de um diéster do ácido glutâmico, para formar um dióoter dc Fórmula XXIII’ 29

X

X

CO2R2 (XXIII') Ν Η η2ν em que A, X e são como definidos para a Fórmula XXII', e Rl 6 R.2 são cada um independentemente uma unidade que forma com o C02 ligado um grupo éster prontamente hidrolisável, tal como Cl-C6 alquilo, hidroxialquilo, alquilarilo ou arilalquilo.

Finalmente, se for desejada a forma livre de ácido glutâmico, o composto de Fórmula XXIII' é hidrolisado para produzir compostos de Fórmula I em que Ri e R2 são cada um H. A seguir é apresentado um exemplo pormenorizado da preparação de um composto de Fórmula I. EXEMPLO 1 Ácido N- (5- [2- (2-amíno-4 (3H) -oxo-5,6,7,8-tetrahidropirido [2,3-d] -pirimidin-6-il) etil] -4-metiltien-2-il) -L-glutâmico (Composto 1) -

H Síntese 0 composto 1 foi sintetizado pelo processo seguinte. 30 a. ácido S-bromo-4-metiltiofeno-2-carbox£lico:

Este composto foi preparado de acordo com M. Nemec, Collection Czechoslov. Chem. Coirnun., vol. 39 (1974), 3527. b. 6-etinil-2- (pivaloílamino) -4 (3H) -oxopirido[2,3-d]pirimidina:

Este composto foi preparado de acordo com E. C. Taylor & G. S. K. Wong, J. Org. Chem., vol. 54 (1989), 3618. c. N- (5-Bromo-4-metiltien-2-il)-L-glutamato de dietilo:

A uma solução com agitação de ácido 5-bromo-4-metil-tiofeno-2-carboxílico (3,32 g, 15 mmol), 1-hidroxibenzotriazole (2,24 g, 16,6 mmol), cloridrato do éster dietílico do ácido L-glutâmico (3,98 g, 16,6 mmol) e diisopropiletilamina (2,9 mL, 2,15 g, 16,6 mmol) em dimetilformamida (DMF) (40 mL) adicionou-se cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (3,18 g, 16,6 mmol). A solução resultante foi agitada sob árgon à temperatura ambiente durante 18 horas, vertida em solução saturada de cloreto de sódio (300 mL) , diluída com água (100 mL) e extraída com éter (3 x 120 mL) . Os extractos orgânicos 31 combinados foram lavados com água (150 mL), secos sobre MgS04 e concentrados aob vácuo para dar uma goma castanha, que foi purificada por cromatografia "flash". A eluição com hexano:EtOAc (2:1) deu o produto como um óleo cor de laranja (5,05 g, 83% de rendimento) . As análises indicaram que o produto era N-(5-bromo-4-metiltien-2-il) -L-glutamato de dietilo. RMN (CDCI3) δ: 7,22 (1H, s), 5,86 (1H, d, J=7,5 Hz), 4,69 (1H, ddd, J=4,8, 7,5, 9,4 Hz), 4,23 (2H, q, J=7,l Hz), 4,12 (2H, q, J=7,l Hz), 2,55-2,39 (2H, m), 2,35-2,22 (1H, m) , 2,19 (3H, s) , 2,17-2,04 (1H, m) , 1,29 (3H, t, J=7,1 Hz), 1,23 (3H, t, J=7,l Hz). Anal. (Cl5H20NO5SBr) C, Η, N, S, Br. d. N-(5-[(2- [pivaloí lamino] - 4 (3H) -oxopirido [2,3-d]pirimidin-6-il) etinil]-4-metiltien-2-il) glutamato de dietilo:

H A uma solução de N- (5-bromo-4-metiltien-2-il) -L-glutamato de dietilo (4,21 g, 10,4 mmol) em acetonitrilo (55 mL) sob atmosfera de árgon adicionou-se cloreto de bis (trifenilfosfina)-paládio (702 mg, 1,0 mmol), iodeto cuproso (200 mg, 1,1 mmol), trietilamina (1,5 mL, 1,09 g, 10,8 mmol) e 6-etinil-2-(pivaloílamino)-4 (3H)-oxopirido [2,3-d]pirimidina (5,68 g, 21 mmol) . A suspensão resultante foi aquecida a refluxo durante 6 horas. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, a mistura reaccional em bruto foi filtrada e o precipitado foi lavado com acetonitrilo (50 mL) e acetato de etilo (EtOAc) (2 x 50 mL) . Os filtrados combinados foram concentrados sob vácuo para dar uma resina castanha, que foi purificada por cromatograf ia "flash". A eluição com CH2Cl2:CH30H (49:1) deu o produto como um sólido cor de laranja (4,16 g, 67% de rendimento). As análises indicaram que o produto era N- (5-[ (2-[pivaloílamino] -4 (3H) -oxopirido [2,3- 32

\ d]pirimidin-6-il) etinil] -4-metiltien-2-il) glutamato de dietilo. BMN (CDCI3) δ: 8,95 (1H, d, J=2,2 Hs) , 8,59 (III, d, J=2,2 Hz), 7,33 (1H, s), 7,03 (1H, d, J=7,4 Hz), 4,73 (1H, ddd, J=4,8, 7,4, 9,5 Hz), 4,24 (2H, q, J=7,l Hz), 4,13 (2H, q, J=7,l Hz), 2,55-2,41 (2H, m) , 2,38 (3H, s) , 2,35-2,24 (1H, m) , 2,19-2,05 (1H, m) , 1,34 (9H, s), 1,30 (3H, t, J=7,l Hz), 1,24 (3H, t, J=7,l Hz). Anal. (C29H33N5O7S.0,75H20) C, Η, N, S. e. N-(5-[(2 [pivaloílamino]-4 (3H)-oxopirido [2,3-d]pirimidin-6-il) etil]-4-metiltien-2-il) glutamato de dietilo:

Uma suspensão de N- (5-[ (2-[pivaloílamino] -4 (3H) -oxopirido-[2,3-d] pirimidin-6-il) etinil] -4-metiltien-2-il) -glutamato de dietilo (959 mg, 1,5 mmol) e Pd a 10% sobre carvão (1,5 g, 150% equivalentes em peso) em ácido trifluoroacético (30 mL) foi agitada sob 50 psi de H2 durante 22 horas. A mistura reaccional em bruto foi diluída com CH2CI2# filtrada através de uma camada de Celite (terra de diatomáceas) e concentrada sob vácuo. O resíduo obtido foi dissolvido em CH2CI2 (120 mL) , lavado com NaHC03 saturado (2 x 100 mL), seco sobre Na2S04 e concentrado sob vácuo para dar uma goma castanha, que foi purificada por cromatografia "flash". A eluição com CH2Cl2:CH30H (49:1) deu o produto como um sólido amarelo (772 mg, 80% de rendimento) . As análises indicaram que o produto era N-(5-[ (2-[pivaloílamino]-4 (3H) -oxopirido[2,3-d]pirimidin-6-il)etil] -4-metiltien-2-il)-glutamato de dietilo. KMN (CDCI3) δ: 8,60 (1H, d, J=2,2 Hz), 8,49 (1H, largo), 8,32 (1H, d, J=2,2 Hz), 7,22 (1H, s) , 6,78 (1H, d, J=7,5 Hz), 4,72 (1H, ddd, J=4,8, 7,5, 9,5 Hz), 4,23 (2H, q, J=7,1 Hz), 4,11 (2H, q, J=7,l Hz), 3,12-3,00 (4H, m) , 2,52-2,41 (2H, m) , 2,37-2,22 (1H, m) , 2,16-2,04 (1H, m) , 2,02 (3H, s) , 33

1,33 (9Η, s), 1,29 (3H, t, J=7,l Hz), 1,23 (3H, t, J=7,1 Hz).

Anal. (C29H37N5O7G.0,51120) C, Η, N, 5. f. N- (5- [ (2- [pivaloílamino] -4 (3H) -oxo-5,6,7,8-tetrahidropirido-[2,3-d]pirimidin-6-il) etil] -4-metiltien-2-il) glutamato de dietilo: (CH3)3

Uma suspensão de N- (5- [ (2- [pivaloiland.no] -4 (3H) -oxopirido-[2,3-d]pirimidin-6-il) etil] - 4-metiltien-2-il) -glutamato de dietilo (2,98 g, 5 mmol) , Pd a 10% sobre carvão (1,5 g, 50% equivalentes em peso) em ácido trifluoroacético (170 mL) foi agitada sob 800 psi de H2 durante 40 horas. A mistura reaccional em bruto foi diluída com CH2CI2/ filtrada através de uma camada de Celite, e concentrada sob vácuo. O resíduo obtido foi dissolvido em CH2CI2 (150 mL) , lavado com NaHCC>3 saturado (2 x 150 mL) , seco sobre Na2S04 e concentrado sob vácuo para dar uma goma castanha, que foi purificada por cromatografia "flash". A eluição com CH2Cl2:CH30H (24:1) deu inicialmente substrato que não reagiu (1,42 g, 48% de rendimento) e depois o produto como um sólido amarelo (293 mg, 10% de rendimento) . As análises indicaram que o produto era N-(5-[ (2-[pivaloílamino]-4 (3H)-oxo-5,6,7,8-tetrahidropirido- [2,3-d]pirimidin-6-il) etil] -4-metil-tien-2-il)glutamato de dietilo. RMN (CDCI3) δ: 7,24 (1H, s) , 6,75 (1H, d, J=7,6 Hz), 5,57 (1H, largo), 4,72 (1H, ddd, J=4,8, 7,6, 12,6 Hz), 4,22 (2H, q, J=7,l Hz), 4,11 (2H, q, J=7,l Hz), 3,43-3,36 (1H, m) , 3,06-2,98 (1H, m), 2,89-2,68 (3H, m) , 2,52-2,40 (3H, m), 2,37-2,23 (1H, m), 2,15 (3H, s) , 2,14-2,03 (1H, m), 1,94-1,83 (1H, m), 1,73-1,63 (2H, m) , 1,32 (9H, s), 1,29 (3H, t, J=7,1 Hz), 1,23 (3H, t, J=7,l Hz). Anal. (C29H41N5O7S. 0,5H20) C, Η, N, S. 34 g. Ácido N (5 [2 (2-omino-4 (311) -oxo-5, 6, 7,8-tetrahidropii.ido-{2,3-d] -pirimidin-6-il) etil] -4-metiltien-2-il) -L-glutâmico (Composto 1):

Uma solução de N-(5-[(2-[pivaloílamino]-4 (3H)-oxo-5,6,7,8-tetrahidropirido- [2,3-d]pirimidin-6-il) etil] -4-metil-tien-2-iDglutamato de dietilo (293 mg, 0,5 mmol) em NaOH 1 N (25 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 90 horas, depois foi neutralizada com HC1 6 N. 0 precipitado que formou foi recolhido por filtração e lavado com água (4 x 10 mL) para dar o produto como um sólido amarelo (63 mg, 28% de rendimento) . As análises indicaram que o produto era ácido N-(5-[2-<2-amino-4(3H)-oxo-5,6,7,8-tetrahidropirido- [2,3-d] -pirimidin-6-il) etil] -4-metiltien-2-il)-L-glutâmico. RMN (DMSO-dg) δ: 12,44 (2H, largo), 9,89 (1H, largo), 8,42 (1H, d, J=7,8 Hz), 7,57 (1H, s) , 6,39 (1H s largo), 6,12 (2H, s largo), 4,30 (1H, ddd, J=4,8, 7,8, 9,6

Hz), 3,26-3,18 (2H, m) , 2,83-2,74 (3H, m) , 2,31 (2H, t, J=7,4 Hz), 2,12 (3H, s), 2,09-2,01 (1H, m), 1,94-1,80 (2H, m), 1,68-1,47 (3H, m) . Anal. (C20H25N5O6S.I, IH2O) C, Η, N, S.

Avaliação Biológica e Bioquímica

Determinação de Constantes de Inibição para GAR Transformilase:

Modificou-se o método de ensaio de GAR-transformilase (GARFT) de Young et al. , Biochemistry 23 (1984), 3979-3986, e utilizou-se tal como descrito adiante. As misturas reaccionais continham o domínio catalítico da GARFT humana, 0-250 nM do composto de teste, 20 (M de glicinamida ribonucleotido (GAR), 10 ou 20 μΜ de -formil-5,8-didesazafolato (FDDF) , 50 mM de HEFES-KOH (pH 7,5), e 50 mM de KCl. A reacção foi iniciada pela adição de enzima a uma concentração final de 11 nM, seguida por monitorização do aumento de absorvência a 294 nm a 20°C (e294 = 18,9 mM-1 cm~l). 35 A constante de inibição de GARFT (Kj.) foi determinada a partir da dependência da velocidade catalítica no estado estacionário sobre o inibidor e concentração do substrato. Determinou-se que o tipo de inibição observada era competitiva em relação a FDDF pela dependência de Ki aparente (Kj^ap) em relação à concentração de FDDF e demonstrou-se que era descrita por Kirap = Ki + (Ki/Km) [FDDF]. A constante de Michaelis para FDDF, Km, foi determinada independentemente pela dependência da velocidade catalítica em relação à concentração de FDDF. Os resultados das determinações de Km e Ki foram adaptados por métodos não-lineares à equação de Michaelis, ou à equação de Michaelis para inibição competitiva, consoante apropriado. Analisou-se os resultados da inibição de ligação forte e determinou-se Ki por adaptação dos dados à equação de ligação forte de Morrison, Biochem. Biophys. Acta 185 (1969), 269-286, por métodos não lineares.

Determinação de Constantes de Dissocição para a Proteína de Ligação a Folato Humana: A constante de dissociação (Kd) para a proteína de ligação a folato (FBP) humana foi determinada num ensaio de ligação competitiva utilizando FBP associada a membranas preparada a partir de células KB cultivadas.

Preparação da Fracção de Membrana de Células KB: Células KB aderentes foram raspadas de balões, lavadas uma vez com PBS gelado, e centrifugadas a 5000 x g durante 5 minutos a 4°C. As células sedimentadas (2 x 10^ células) foram ressuspensas em 10 mL de tampão de suspensão (KH2PO4-KOH pH 7,4 : 10 mM de EDTA : 10 mM de 2-mercaptoetanol) , sonicadas brevemente para completar a lise das células e centrifugadas a 12000 x g durante 10 minutos a 4°C. O sedimento foi limpo de folato ligado endógeno por ressuspensão em 20 mL de tampão ácido (50 mM de KH2PO4-KOH pH 3,5 : 10 mM de EDTA : 10 mM de 2- 36 mercaptoetanol) e centrifugado como anteriormente. 0 sedimento foi então ressuspenso em 20 mb de tampão de suspensão a ph 7,4 e centrifugado como anteriormente. O sedimento foi ressuspenso em 5 mL de tampão de suspensão a pH 7,4 isento de EDTA. O teor de proteínas foi quantifdicado utilizando o método de Bradford com BSA como padrão. Os rendimentos típicos para este procedimento foram de 4-5 mg de proteína de membrana total por 2 x 10^ células. Esta suspensão final foi utilizada como uma fonte de FBP associada a membranas humana.

Ensaio de Ligação Competitiva a FBP:

Deixou-se que o inibidor competisse contra ácido ^H-fólico para a ligação a FBP. As misturas reaccionais continham 50-100 mg de protéinas de membranas celulares contendo 3-6 pmoles (3-6 nM) de FBP, 17,25 pmoles de ácido ^H-fólico (17,25 nM, 0,5 μθϊ), várias concentrações de competidor, em 1 mL de 50 mM de KH2PO4-KOH pH 7,4 : 10 mM de 2-mercaptoetanol. As reacções foram realizadas a 25°C. Devido à libertação muito lenta de ácido ^h-fólico ligado, o competidor foi pré-ligado durante 30 minutos na ausência de ácido fólico. Adicionou-se então o ácido ^H-fólico e deixou-se que as misturas equilibrassem durante 2,5 horas. As misturas reaccionais completas foram filtradas através de filtros de nitrocelulose sob vácuo para reter as membranas celulares com ácido -^H-fólico ligado. As membranas retidas foram então lavadas 4 vezes com 1 mL do tampão de reacção. A quantidade de ácido ^H-fólico ligado foi medida por contagem de cintilações da membrana de nitrocelulose. Os resultados obtidos foram adaptados não-linearmente tal como descrito acima. A Kd e FBP para o ácido 3n_fc>i:i.CO( utilizada para calcular a Kd do competidor, foi obtida por titulação directa de FBP com ^H-folato e subsequente adaptação não-linear dos resultados a uma equação de Kd de ligação forte.

Linhas celulares: 37

As linhas celulares utilizadas e a sua origem estão tabeladas 11a Tabela 1. As condições de cx escimento e os requisitos dos meios de cada linha celular estão sumariados na Tabela 2. Todas as culturas foram mantidas num incubador humidificado a 37°C, em ar com 5% de C02-

Inibição do crescimento in vitro

Preparou-se soluções-mãe dos inibidores em bicarbonato de sódio 10 mM em água e armazenou-se em alíquotas de 1 mL a -20°C para experiências de cultura de células. A inibição do crescimento celular foi medida por uma modificação do método de Mosmann, J. Immunol. Methods 65 (1983), 55-63.

As células de fase semi-log de cada linha celular foram diluídas paea 18.500 células/mL em meio de cultura RPMI fresco (Mediatech, Washington, DC) suplementado com soro fetal de vitelo dializado (Hyclone Laboratories Inc., Logan, UT), e depois colocadas em alíquotas nas colunas 2 até 12 de placas de microtitulação com 96 poços. A coluna 1 foi cheia com o mesmo volume, 135 mL, de meio fresco, em células, para utilização como um branco. As placas foram então colocadas num incubador humidificado a 37°C, em ar com 5% de CO2 - Após 1 até 4 horas, as placas foram retirados do incubador seguida pela adição do composto de teste a 10 x concentração final, 15 mL/poço em diluições binárias, às colunas 12 até 4. Para experiências de inversão, incluiu-se hipoxantina (1,75 mM) ou AICA (1,75 mM) em todas as soluções de fármaco (concentração final de 175 mM) . Os poços contendo cada concentração de composto de teste foram preparados em quadruplicado em cada placa. Adicionou-se quinze mililitros de meio, sem composto de teste, aos poços na columa 1 das placas. As células foram então recolocadas no incubador e deixadas sem serem perturbadas durante todo o período de incubação. Ao dia 3 para as células L1210 e L1210/CI920 ou ao dia 5 para as células CCRF-CEM, adicionou-se 50 mL de MTT (brometo de 4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-dif enil tetrazólio; 38

catálogo Sigma η2 M2128) a 0,8 mg/mL dissolvido em meio de cultura dc tccidoo, a cada poço de todas as placas, após o que as células foram retiradas do incubador e centrifugadas a 1200 rpm durante 7 minutos. Os meios foram retirados por sifonação e adicionou-se 150 mL de DMSO a cada poço de todas as placas. As placas foram então misturadas a baixa velocidade num misturador vortex durante 1 hora na ausência de luz à temperatura ambiente. A extensão de MTT metabolizado foi determinada espectrofotometricamente a 540 nm num leitor de microplacas cinético Vmax™ de Molecular Devices. A concentração de fármaco necessária para reduzir o crescimento celular em 50% determinado pelo metabolismo de MTT foi determinada por interpolação entre a O.D. (menos branco) imediatamente acima e abaixo de 50% da O.D. do controlo (menos branco) . TABELA 1

Tecido de Origem e Ponte das Linhas Celulares Utilizadas em

Estudos In Vitro

Linha Celular Fonte Origem L1210 ATCC# Murganho, leucemia linfocítica CCRF-CEM ATCC# Humana, leucemia linfoblástica aguda #ATCC = American l Type Culture Collection TABELA 2

Condições de Cultura, Densidades de Plaqueamento e Tempos de Incubação Utilizados em Ensaios de Micro titulação

Linha celular Meio Cone. de DFCS* (%) Densidade de Plaqueamento (células/poço) Tempo de Incubação (dias) L1210 RPMI-1640 5 2500 3 CCRF-CEM RPMI-1640 10 2500 5 * Cone. de DFCS = concentração de soro fetal de vitelo dializado. 39

TABELA 3

Resultados Comparativos para o Composto de Teste e 6R-DDATHF na Inibição do Crescimento Utilizando Exposição Contínua (72 horas)

Composto Kl de GARFT (nM) IC50 para L1210 em Cultura de Células (nM)a IC50 para CCRF-CEM em Cultura de Células (nM)a Kd de Proteína de Ligação a Folato Humana (nM) 1 1.4 13,5 6,1 28 DDATHFb 25 17,5 1,5 0,020 a: IC50 Médio ± desvio padrão; b: 6R-DDATHF, o diastereómero 6R do ácido 5,10-didesazatetra-hidrofólico (Lometrexol) (Ver F. M. Muggia, "Folate antimetabolite inhibitors to de novo purine synthesis", New Drugs, Concepts and Results in Câncer Chemotherapy, Kluwer Academic Publishers, Boston (1992), 65-87.

Tal como mostram os resultados comparativos acima, o Composto 1 tem um Kd da proteína de ligação a folato relativo que é cerca de 1400 vezes menos potente do que 6R-DDATHF. EXEMPLO 2 Ácido N- (5- [2- (2-amino-4-oxo-4,6,7,8-tetrahidro-3H-pirimido [5,4-6] [1,4] tiazin-6-il) etil]-4-metiltien-2-il)-L-glutâmico (Composto 2) .

O composto 2 loi preparado como se segue. a. 5-bromo-4-metiltiofeno-2-carboxilato de metilo: 40

Br

'C02CH3 A uma solução de ácido 5-bromo-4-metiltiofeno-2-carboxílico (20,32 g, 92 mmol) em CH3OH (450 mL) adicionou-se H2SO4 concentrado (4 mL) . A solução resultante foi aquecida a refluxo durante 18 horas. O solvente foi removido por concentração sob vácuo, e o resíduo obtido foi partilhado entre NaHC03 saturado (350 mL) e éter (350 mL) . As camadas foram separadas e a fase aquosa foi extraída com éter (3 x 150 mL) . Os extractos orgânicos combinados foram secos sobre MgS04 e concentrados sob vácuo para dar um óleo vermelho, que foi purificado por cromatografia “flash". A eluição com hexano:acetato de etilo (9:1) deu o produto como um óleo amarelo, que solificou em repouso (18,34 g, 85% de rendimento). As análises indicaram que o produto era 5-bromo-4-metiltiofeno-2-carboxilato de metilo. RMN (CDCI3) δ: 7,47 (1H, s) , 3,86 (3H, s), 2,20 (3H, s) . Anal. (C7H702SBr) C, Η, N, S, Br. b. 5-(3-hidroxipropinil)-4-metiltiofeno-2-carboxilato de metilo:

A uma solução com agitação de 5-bromo-4-metiltiofeno-2-carboxilato de metilo (5,18 g, 22 mmol) em dietilamina (60 mL) sob atmosfera de árgon adicionou-se cloreto de bis-(trifenilfosfina)paládio (77 mg, 0,11 mmol), iodeto cuproso (42 mg, 0,22 mmol), e álcool propargílico (1,5 mL, 1,44 g, 26 mmol). A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 18 horas. O solvente foi removido por concentração sob vácuo, e o resíduo obtido foi diluído com água (200 mL) e depois extraído com EtOAc (3 x 100 mL) . Os extractos orgânicos combinados foram lavados com HC1 0,5 N (100 mL) , secos sobre MgS04 e concentrados sob vácuo para dar vim óleo castanho, que 41 foi purificado por cromatografia “flash". A eluição com hexano:EtOAc (2:1) deu o produto como um óleo cor de laranja que solidificou em repouso (4,07 g, 88% de rendimento). As análises indicaram que o produto era 5-(3-hidroxipropini1)-4-metiltiofeno-2-carboxilato de metilo. KMN (CDCI3) δ: 7,52 (1H, s), 4,55 (2H, s), 3,87 (3H, s), 2,29 (3H, s) . Anal. (C10H10O3S) C, H, S. c. 5- (3-hidroxipropil) -4-metiltiofeno-2-carboxilato de metilo:

Uma suspensão de 5-(3-hidroxipropini 1) -4-metiltiofeno-2-carboxilato de metilo (3,86 g, 18 mmol) e Pd a 5% sobre carvão (0,72 g, 19% equivalentes em peso) em EtOAc (110 mL) foi agitada sob 50 psi de H2 durante 20 horas. A mistura reaccional em bruto foi filtrada através de uma camada de Celite, e o filtrado foi concentrado sob vácuo para dar o produto como um óleo amarelo (3,84 g, 98% de rendimento). As análises indicaram que o produto era 5-(3-hidroxipropil)-4-metiltiofeno-2-carboxilato de metilo. KMN (CDCI3) δ: 7,51 (1H, s) , 3,84 (3H, s) , 3,71 (2H, t, J=6,2 Hz) 2,86 (2H, t, J=7,6 Hz), 2,16 (3H, s), 1,92 (2H, tt, J=6,2, 7,6

Hz). Anal. (C10H14O3S) C, H, S. d. 4-metil-5-(3-oxopropil)-tiofeno-2-carboxilato de metilo:

A uma suspensão com agitação de 5-(3-hidroxipropil)-4-metiltiofeno-2-carboxilato de metilo (3,74 g, 17 mmol), N-óxido de N-metilmorfolina (3,00 g, 26 mmol) e crivos moleculares 4À pulverizados (4,5 g) em CH2CI2 (50 mL) adicionou-se perrutenato de tetrapropilamónio (300 mg, 0,85 mmol). A suspensão resultante 42 foi agitada à temperatura ambiente durante 40 minutos. 0 solvente foi removido por concentração sob vácuo, e o resíduo foi purificado por cromatografia "flash". A eluição com hexano:EtOAc (4:1) deu o produto como um óleo amarelo (1,82 g, 49% de rendimento) . As análises indicaram que o produto era 4-metil-5-( 3-oxopropil) -tiof eno-2-carboxilato de metilo. RMN (CDC13) ô: y,B3 (1H, t, J=0,8 Hz), 7,50 (1H, s) , 3,84 (3H, s) , 3,07 (2H, t, J=7,4 Hz) 2,83 (2H, dt, J=0,8, 7,4 Hz), 2,17 (3H, s). Anal. (C10H12O3S) C, H, S. e. 5-(3-butenil) -4-metiltiofeno-2-carboxilato de metilo:

A uma suspensão com agitação de brometo de metiltrifenilfosfónio (3,14 g, 8,8 mmol) em THF (30 mL) sob atmosfera de árgon a 0°C adicionou-se n-butil lítio 2,5 M em hexano (3,4 mL, 8,5 mmol). A suspensão resultante foi agitada durante 10 minutos a 0°C, durante 75 minutos à temperatura ambiente e depois foi arrefecida a -65°C antes da adição gota a gota de uma solução de 4-metil-5-(3-oxopropil)-tiof eno-2-carboxilato de metilo (1,71 g, 8,1 mmol) em THF (30 mL) . Retirou-se o banho de arrefecimento e a reacção foi agitada durante 90 minutos enquanto aquecia gradualmente até à temperatura ambiente. A mistura reaccional em bruto foi concentrada sob vácuo até um volume de 20 mL, diluída com éter (200 mL), e filtrada através de uma camada de Celite. 0 filtrado foi concentrado sob vácuo para dar um óleo cor de laranja, que foi purificado por cromatograf ia "flash". A eluição com hexano:EtOAc (95:5) deu o produto como um óleo amarelo (772 mg, 46%). As análises indicaram que o produto era 5-(3-butenil)-4-metiltiofeno-2-carboxilato de metilo. RMN (CDCI3) δ: 7,50 (1H, s), 5,84 (1H, ddt, J=10,2, 17,0, 6,6 Hz), 5,07 (1H, dd, J=l,6, 43

17,0 Hz), 5,02 (1H, dd, J=l,6, 10,2 Hz), 3,84 (3H, s) . Anal. (C11H14O2S) C, H, s. f. 5-(3,4-dihidroxibutil)-4-metiltiofeno-2-carboxilato de metilo:

OH A uma solução com agitação de N-óxido de N-rnetilmorfolina (735 mg, 6,3 mmol) e tetróxido de ósmio (5 mg, 0,02 mmol) em acetona (30 mL) adicionou-se uma solução de 5-(3-butenil)-4-metiltiofeno-2-carboxilato de metilo (701 mg, 3,3 mmol) em acetona (20 mL) . A solução resultante foi agitada sob atmosfera de árgon à temperatura ambiente durante 48 horas, depois foi filtrada através de uma camada de Celite. 0 filtrado foi acidificado por adição de H2SO4 0,5 M (10 mL), e a acetona foi removida por concentração sob vácuo. O resíduo aquoso foi diluído com água (20 mL) e extraído com EtOAc (3 x 25 mL) . Os extractos orgânicos combinados foram lavados com água (3 x 25 mL) , secos sobre Na2S04, e concentrados sob vácuo para dar uma goma castanha, que foi purificada por cromatografia "flash". A eluição com CH2CI2:EtOAc (2:3) deu o produto como um sólido esbranquiçado (577 mg, 71% de rendimento) . As análises indicaram que o produto era 5-(3,4-dihidroxibutil)-4-metiltiofeno-2-carboxilato de metilo. RMN (CDCI3) δ: 7,50 (1H, s), 3,84 (3H, s) , 3,79-3,72 (1H, m) , 3,86 (1H, dd, J=3,2, 10,9 Hz), 3,84 (1H, dd, J=7,4, 10,9 Hz), 3,00-2,80 (2H, m) . Anal. (C11H16O4S) C, H, S.

Os exemplos acima referidos são apresentados para ilustrar vários aspectos da invenção. Entender-se-á que modificações apropriadas estarão dentro das capacidades de uma pessoa com conhecimentos correntes da matéria à luz dos ensinamentos aqui contidos. 44

Quando quimicamente possível, os giupos químicos aqui descritos podem ser substituídos. Nalguns casos, esta possibilidade é explicitada pela descrição, e.g., grupo C1-C3 alquilo substituído ou não-substituído.

Quando é descrito mais do que um grupo R6 em qualquer Fórmula desta descrição, cada Rg pode ser seleccionado independentemente das possibilidades referidas.

Lisboa, 29 de Outubro de 2001

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Claims (28)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto de Fórmula I:

   em que A é enxofre, CH2 ou selénio; Z é um grupo C1-C3 alquilo, um grupo C2-C3 alcenilo, um grupo C2-C3 alcinilo, NH, NCH3, enxofre ou oxigénio; X é um grupo C1-C6 alquilo; um grupo C2-Cg alcenilo; um grupo C2-C6 alcinilo; Rl e R2 são cada um independentemente hidrogénio ou uma unidade que forma, conjuntamente com o CO2 ligado, um grupo éster prontamente hidrolizável; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
2. 2. Composto ou sal de acordo com a reivindicação 1, em que A é enxofre ou CH2.
3. 3. Composto ou sal de acordo com a reivindicação 1, em que Z é CH2, CH2CH2, NH, oxigénio, enxofre ou NCH3.
4. 4. Composto ou sal de acordo com a reivindicação 1, em que X é metilo ou etilo.
5. 5. Composto ou sal de acordo com a reivindicação 1, em que Rl e R2 são cada um independentemente hidrogénio, C1-C6 alquilo, hidroxialquilo, alquilarilo ou aralquilo. 1
6. 6. Composto ou sal de acordo com a reivindicação 5, em que Ri c R2 3ão cada um independentemente hidrogénio ou Ci~C2 alquilo.
7. 7. Composto ou sal de acordo com a reivindicação 6, em que Ri e R2 são cada um hidrogénio.
8. 8. Composto ou sal de acordo com a reivindicação 1, em que A é enxofre ou CH2, Z é CH2, e X é metilo.
9. 9. Composto ou sal de acordo com a reivindicação 1, seleccionado de: ácido N- (5 - (2 - (2-amino-4 (3H) -oxo-5,6,7,8-tetrahidropirido-[2,3-d]pirimidin-6-il) etil] -4-metiltien-2-il) -L-glutâmico e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis; ácido N- (5- [2- (2-amino-4-oxo-4,6,7,8-tetrahidro-3H-pirimido[5,4-6] [1,4] -tiazin-6-il) etil] -4-metiltien-2-il) -L-glutamico, éster dietílico e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis; e ácido N- (5- [2- (2-amino-4-oxo-4,6,7,8-tetrahidro-3H-pirimido[5,4-6] [1,4] -tiazin-6-il) etil] -4-metiltien-2-il) -L-glutâmico e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
10. 10. Ácido N-(5-[2-(2-amino-4 (3H)-oxo-5, 6,7,8-tetrahidropirido-[2,3-d]pirimidin-6-il) etil] -4-metiltien-2-il) -L-glutâmico.
11. 11. Composição farmacêutica compreendendo: (i) um composto de Fórmula I:

    2
12. #12.
13. 13.
14. 14.
15. 15.
16. 16.
17. 17. em que A é enxofre, CHg ou selónio; Z é um grupo C1-C3 alquilo, um grupo C2-C3 alcenilo, um grupo C2-C3 alcinilo, NH, NCH3, enxofre ou oxigénio; X é um grupo C1-C6 alquilo; um grupo C2-C6 alcenilo; um grupo C2-C6 alcinilo; Rl e R2 são cada um independentemente hidrogénio ou uma unidade que forma, conjuntamente com o CO2 ligado, um grupo éster prontamente hidrolizável; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; e (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, em que A é enxofre ou CH2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, em que Z é CH2, CH2CH2, NH, oxigénio, enxofre ou NCH3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, em que X é metilo ou etilo. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, em que Ri e R2 são cada um independentemente hidrogénio, Ci-Cç alquilo, hidroxialquilo, alquilarilo ou aralquilo. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15, em que Ri e R2 são cada um independentemente hidrogénio ou C1-C2 alquilo. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 16, em que Ri e R2 são cada um hidrogénio.
18. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, em que A é enxofre ou CH2, Z é CH2, e X é metilo. 3 18.
19. 19. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, pm que o referido composto de Fórmula I é ácido N-(5-[2-(2-amino-4 (3H) -oxo-5,6,7,8-tetrahidropirido[2,3-d] -pirimidin-6-il) etil] -4-metiltien-2-il) -L-glutâmico.
20. 20. Utilização de um composto de Fórmula I:

    (I) H em que: A é enxofre, CH2 ou selénio; Z é um grupo C1-C3 alquilo, um grupo C2-C3 alcenilo, um grupo C2-C3 alcinilo, NH, NCH3, enxofre ou oxigénio; X é um grupo C1-C6 alquilo; um grupo C2-C6 alcenilo; um grupo C2-C6 alcinilo; Rl e R2 são cada um independentemente hidrogénio ou uma unidade que forma, conjuntamente com o CO2 ligado, um grupo éster prontamente hidrolizável; ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável; para a preparação de um medicamento para a inibição do crescimento ou da proliferação de células de microrganismos ou de organismos superiores.
21. 21. Utilização de acordo com a reivindicação 20, em que A é enxofre ou CH2.
22. 22. Utilização de acordo com a reivindicação 20, em que Z é CH2, CH2CH2, NH, oxigénio, enxofre ou NCH3. 4
23. 23. Utilização de acordo com a reivindicação 20, em que X é metilo ou etilo.
24. 24. Utilização de acordo com a reivindicação 20, em que Ri e R2 são cada um independentemente hidrogénio, C1-C6 alquilo, hidroxialquilo, alquilarilo ou aralquilo.
25. 25. Utilização de acordo com a reivindicação 24, em que Ri e R2 são cada um independentemente hidrogénio ou C1-C2 alquilo.
26. 26. Utilização de acordo com a reivindicação 25, em que Ri e R2 são cada um hidrogénio.
27. 27. Utilização de acordo com a reivindicação 20, em que A é enxofre ou CH2, Z é CH2, e X é metilo.
28. 28. Utilização de acordo com a reivindicação 20, em que o referido composto de Fórmula I é ácido N- (5-[2-(2-amino-4 (3H) -oxo-5,6,7,8-tetrahidropirido[2,3-d] -pirimidin-6-il) -etil] -4-metiltien-2-il) -L-glutâmico. Lisboa, 29 de Outubro de 2001

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