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PT658585E - Derivados de amidinofenilalanina processo para a sua preparacao sua utilizacao e composicoes que contem estes compostos como anticoagulantes - Google Patents

Derivados de amidinofenilalanina processo para a sua preparacao sua utilizacao e composicoes que contem estes compostos como anticoagulantes Download PDF

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PT658585E
PT658585E PT94118551T PT94118551T PT658585E PT 658585 E PT658585 E PT 658585E PT 94118551 T PT94118551 T PT 94118551T PT 94118551 T PT94118551 T PT 94118551T PT 658585 E PT658585 E PT 658585E
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PT
Portugal
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group
carbon atoms
compound according
polymer
formula
Prior art date
Application number
PT94118551T
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English (en)
Inventor
Werner Stuber
Rainer Di Koschinsky
Original Assignee
Werner Stueber
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Publication date
Application filed by Werner Stueber filed Critical Werner Stueber
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Description

DESCRIÇÃO “DERIVADOS DE AMIDINOFENILALANINA, PROCESSO PARA A SUA' PREPARAÇÃO, SUA UTILIZAÇÃO E COMPOSIÇÕES QUE CONTÊM ESTES COMPOSTOS COMO ANTICOAGULANTES” A presente invenção refere-se a derivados de amidinofenilalanina, à síntese destes compostos, à sua utilização, assim como a composições farmacêuticas que contêm estes compostos activos como agentes inibidores de trombina.
Como se mostra nas Patentes EP-A 0 508 220 e 0 513 543, os derivados de amidinofenilalanina, através da inibição da trombina, podem servir para actuárem favoravelmente sobre o processo patológico de uma trombose. Para uma utilização destes compostos em medicina é, no entanto, muitas vezes, desejável prolongar o seu tempo de residência no corpo humano. A presente invenção resulta, por conseguinte, do problema de se descobrirem novos derivados de amidinofenilalanina que possuam um tempo de residência mais prolongado no organismo dos animais de sangue quente.
Surpreendentemente, foi agora possível solucionar este problema ligando-se os derivados de amidinofenilalanina a substâncias poliméricas do grupo dos polietilenoglicois. 2
Os derivados apropriados da amidinofenilalanina são, por exemplo, aqueles que são descritos nas Patentes EP-A 0 508 220 e 0 513 543.
Como polímeros do grupo dos polietilenoglicois interessam substâncias fisiologicamente aceitáveis que estão ligadas por covalência às substâncias com actividade inibitória. Estes polímeros de polietilenoglicol (PEG) têm massas molares até 75000, de preferência de cerca de 750-30000, de preferência de 750-20000.
A invenção refere-se, por consequência, a substâncias de fórmula I
o ,-S- na qual 3
R’ representa um anel naftalino ligado na posição alfa ou beta, que tem eventualmente como derivados grupos alquilo que contêm até 3 átomos de carbono, e/ou grupos alcoxi tendo cada um até 3 átomos de carbono, ou representa um anel tetralino ligado na posição alfa ou beta, que tem eventualmente como derivados grupos alquilo que contêm até 3 átomos de carbono, e/ou grupos alcoxi tendo cada um até 3 átomos de carbono, ou representa um anel fenilo que contém eventualmente como substituintes grupos alquilo que contêm até 4 átomos de carbono, e/ou tendo até 3 grupos de estrutura O-X, na qual O representa oxigénio ou enxofre e X representa hidrogénio, me tilo, etilo, n-propilo, isopropilo ou t-butilo, ou representa um sistema de cromano, que contém como derivados de preferência até 5 grupos alquilo que contêm até 3 átomos de carbono, RI representa um grupo de estrutura A-B-poli, em que A representa -(CH2)n-, n representa um número inteiro de 1 até 7, B representa uma ligação -CO-NH-, -N(Y)-CO- em que Y = H, CH3 ou C2H5, -CO-O-, -O-CO-, -SO2-NH-, -S-S-, -S-, -O-, ou -N(Y)- em que Ϋ = H, CH3 ou C2H5, e poli representa um polímero do grupo dos polietilenoglicois, e este polímero tem uma massa molar até 75 000, e R2 e R3 podem ser iguais ou diferentes e representam um grupo alquilo tendo até 4 átomos de carbono, ou em conjunto formam um anel, e eventualmente podem ter como derivados um grupo hidroxilo ou um grupo hidroxialquilo, em que o grupo hidroxialquilo contém até 3 átomos de carbono, e estes grupos hidroxilo eventualmente
também estão presentes esterificados, sendo os ácidos correspondentes ácidos carboxilicos que contêm de preferência até 17 átomos de carbono, assim como os seus sais fisiologicamente aceitáveis, e C* está presente numa estrutura R ou S, mas de preferência na estrutura R.
Num sentido mais restrito e sem limitação aos exemplos adiante, prestam-se como R' de preferência os seguintes grupos: 6,7-dimetoxinaftil- (β-Dmn) 5-metoxinaftil- (β-Mns) 2,2,5,7,8-pentametilcromanil- (Pmc) (Thn) (Tmn) (Phl) (Mtr) (Pme) (Mte) e (Htr). 5.6.7.8- tetrahidronaftil- 5.6.7.8- tetrametilnaftil-fenil- 4 -me toxi- 2,3,6-trimetilfenil-2,3,4,5,6-pen tametilfenil-4-metoxi-2,3,5,6-tetrametilfenil-4-hidroxi-2,3,6-trimetilfenil-n tem de preferência os valores 1, 2 ou 3. São utilizados como polímeros polietilenoglicois (PEG). B representa de preferência -CO-NH-. Isto significa que no grupo RI está acoplado com -CH2-COOH um polímero com uma função amina. Estas reacções dè acoplamento sào conhecidas da literatura. Por exemplo, serve para o efeito uma reacção de acoplamento com uma carbodiirxlida. Polímeros que contêm grupos amino, por exemplo, amino-PEG de estrutura NH2-CH2-CH2-PEG-OCH3 (MM 750-20000) são ,2 5 susceptíveis de obtenção comercial (RAPP POLYMERE, TLJBINGEN). Por outro lado, também é possível ligar um polímero, através de um grupo carboxilo, a um grupo amino do resíduo da molécula (grupo B = -NH-CO-). Serve para esse efeito, por exemplo, um polímero com a estrutura CH3O-PEG-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-COOH ligado na cadeia lateral RI - -(CH2)n-N(Y)H, em que n e Y têm 0 significado indicado acima. Para além disso, podem ser levados a reagir com compostos de fórmula I polímeros com a estrutura CH30-PEG-CH2-CH2-Br ou CH3O-PEG-CH2-CH2-SH, èm .que RI representa W-(CH2)n-, com W = SH, OH ou NH(Y), e n é definido como foi indicado para a fórmula I, aos compostos de acordo com a invenção em que B representa S, O ou N(Y) com Y = H, CH3 ou C2H5 ou S-S.
Se nos radicais R2 ou R3 existirem funções hidroxilo, estas poderão então estar eventualmente esterificadas com ácidos carboxílicos. Estes ácidos carboxílicos são, por exemplo, ácido acético, ácido succínico, ácido hexanocarboxílio, ácido octanocarboxílico, ácido decano-carboxílico, ácido dodecanocarboxílico ou ácido hexadecanocarboxílico.
Como a função amidino, em virtude da sua acção básica, está em regra presente na forma de sal, os inibidores de trombina de acordo com a invenção podem também ocorrer em diversas formas salinas. A forma salina tem neste caso uma influência decisiva sobre a solubilidade dos compostos, assim como sobre a ressorvibilidade no caso da sua utilização' terapêutica. Como formas salinas citam-se formiatos, acetatos, ;caproatos ou óleatos, isto é, ácidos carboxílicos tendo até 16 átomos de carbono, cloretos, brometos, iodetos, alcanossulfonatos tendo até 10 átomos de carbono, ou sais de ácidos dicarboxílicos ou tricarboxílicos, tais como citratos ou tartaratos. 6
Pertence também ao objecto da presente invenção a preparação dos compostos ligados a polímeros. Faz-se, de preferência, reagir um derivado de aminoácido de fórmula II
O
W
na qual R'en têm os significados dados anteriormente e R4 representa um grupp de bloqueio comum na química dos aminoácidos, por exemplo, um grupo benzilo, um grupo t-butilo ou um grupo metilo, e Rs representa um grupo carboxilo ou um grupo amino, um grupo hidroxilo, um grupo SO3H ou um grupo sulfidrilo (-SH), com um polímero do grupo dos polietileno-glicois, acima citado. A preparação é realizada de acordo com vias reactivas conhecidas por si, e conduz, depois da dissociação do grupo de bloqueio R4, a um derivado de aminoácido ligado a um polímero, de fórmula II, na qual R5 representa um grupo polímero-B, R4 representa hidrogénio e R', n e B têm os significados citados anteriormente. Este aminoácido ligado a um polímero é ligado, de acordo com métodos de acoplamento conhecidos, por exemplo, com diciclohexilcarbodiimida no dissolvente dimetilformamida, ao grupo amino primário de um composto de fórmula III ‘ 7 í'· 7
e deste modo é obtida uma substância de acordo com a invenção.
As substâncias de acordo com a invenção são importantes inibidores de trombina, que se distinguem em especial pelo facto de possuírem um longo tempo de semi-vida no plasma. Estas substâncias são também muito importantes pelo facto de, por exemplo, no caso de uma administração sub-cutãnea, exibirem uma subida lenta da sua concentração no plasma. Em combinação com um período de semi-vida mais longo, consegue-se globalmente uma acção antitrombótica nitidamente mais prolongada.
Em conformidade com a doutrina expressa em PEPTIDE RESEARCH Vol. 6,; n.° 3, 140-146 (1993), seria de esperar por parte dos especialistas, relativamente a estes compostos suportados por polímeros, que a sua capacidade de ligação em relação à trombina, expressa pelo valor Ki, fosse mais reduzida. Surpreendentemente, no entanto, a potência dos inibidores é significativamente aumentada por ligação aos suportes poliméricos. É igualmente surpreendente o facto de a inocuidade dos compostos de acordo com a invenção ser melhorada através da ligação aos polímeros.
Os inibidores de acordo com a invenção, para a avaliação da sua eficácia, foram ensaiados de harmonia com diversos critérios, tendo estes sido, de preferência, a determinação do valor Ki, do valor IC50 e do tempo parcial de tromboplastina (PTT) in vivo e in r/itro. Para o ensaio da especificidade foram determinados os valores IC50 e valores Ki contra diversas proteases do soro, em especial trombina e tripsina. A estabilidade das substâncias de acordo com a invenção foi determinada incubando-se uma amostra de substância com um enzima puro, de preferência tripsina, quimotripsina ou papaína, assim como com homogeneizados de fígado ou intestino, foram tomadas amostras das soluções a intervalos de tempo regulares e estas foram medidas de preferência com HPLC.
Quanto aos compostos reivindicados, trata-se de inibidores de trombina específicos e altamente activos, com um potencial antitrombótico considerável, que corresponde, no que se refere à duração da acção e à eficácia, aos inibidores de baixo peso molecular conhecidos até ao presente.
Abreviaturas:
Aph amidinofenilalanina NAPAP. 3-naftilsulfonil-glicil-D,L-p-amidinofenilalanil- piperidida Asp ácido aspárgico Asn asparagina Glu ácido glutâmico
Cys(S03H): ácido cisteíno-sulfónico β-Dmn 6,7-dimetoxifenilo β-Mns 5-metoxinaftilo Pmc 2,2,5,7,8-pentametilcromanilo Thn 5,6,7,8-tetrahidronaftilo Tmn 5,6,7,8-tetrametilnaftilo Phl fenilo Mtr 4-metoxi-2,3,6-trimetilfenilo Pme 2,3,4,5,6-pen tametilfenilo Mte 4-metoxi-2,3,5,6-tetrametilfenilo Htr 4-hidroxi-2,3,6-trimetilfenilo Cph 4-carboxifenilo Z (Cbo) benziloxicarbonilo Boc t-butiloxicarbonilo Fmoc fluorenilmetiloxicarbonilo Pip piperidina OtBu éster t-butílico Ome éster metílico Oet éster etílico OiBu éster isobutílico (éster s-butílico) OiPr éster isopropílico DC cromatografia em camada fina DCCI diciclohexilcarbodiimida DMF dimetilformamida FAB-MS fast atom bombardment mass spectrometry [espectrometria de massa por bombardeamento atómico rápido] TOTU tetrafluorborato de 0-[(ciano-(etoxicarbonil)-metilideno)amino]-1,1,3,3-tetrametilurónio DIPEA N-etildiisopropilamina
Os exemplos que se seguem descrevem mais pormenorizadamente a invenção:
Exemplo 1: 4-metoxi-2,3,6-trimetilfenilsulfonil-L-Asp(PEG5000)-D-p- amidinofenilalanil-pipêridida
1) 4-metoxi-2,3,6-trimetilfenilsulfonil-L-Asp(PEG5000)-OH A) 4 g de éter amino-PEG5000-monometílico foram dissolvidos em 200 ml de DMF, conjuntamente com 400 mg (1 mmol) de éster α-t-butílico de 4-metoxi-2,3,6-trimetilsulfonil-L-Asp. Paira o efeito foram adicionados 328 mg (1 mmol) de TOTU como substância gorda e em seguida 0,2 ml de DIPEA, mediante agitação e arrefecimento a 0°C. O preparado foi agitado 1 hora a 0°C e 15 horas à temperatura ambiente. Depois da extracção do dissolvente por destilação em evaporador rotativo o resíduo que ficou foi extraído várias vezes por agitação com acetato de etilo, foi dissolvido em metanol tépido e recristalizado com éter dietílico. Depois da filtração por vácuo e secagem a substância foi utilizada nesta forma na reacção seguinte. B) O éster α-t-butílico de 4-metoxi-2,3,6-trimetilfenilsulfonil-L-Asp(PEG5000) preparado em A) foi agitado em 100 ml de uma solução de HC1 2N em ácido acético, formando-se uma solução límpida. Em seguida o dissolvente foi extraído em vácuo e os vestígios de ácido ainda presentes foram eliminados por evaporação em vácuo por meio de 11
tolueno. Recristalizou-se de metanol-/éter dietílico e depois da secagem obteve-se um sólido branco.
Rendimento: 2,8 g controle de pureza: DC
Rf = 0,7 (butanol/ácido acético glacial/piridina/água 4/1/1/2)
Poder rotatório: [a]20D -1,8 (c = 1, metanol) p.f.: 57°C 2) 4-metoxi-2,3,6-trimetilfenilsulfonil-L-Asp(PEG5000)--D^-amidinofenilalanil-piperidida 1,5 g de 4-metoxi-2,3,5-trimetilfenilsulfonil-L-Asp(PEG5000)-OH foram dissolvidos em 50 ml de DMF conjuntamente com 100 mg de D-4-amidinofenil-alanilpiperidida. À solução arrefecida a 0°C foram adicionados, mediante agitação, 100 mg de TOTU seguidos por 0,11 ml de DIPEA. Após uma hora a 0°C o preparado foi mantido à temperatura ambiente e em seguida o dissolvente foi extraído em evaporador rotativo. O resíduo foi dissolvido em água e foi extraído três vezes com acetato dê etilo, a fase aquosa foi liofílizada e o liofilizado foi cromatografado com metanol através de Sephadex® LH20.
Rendimento: 1,2 g controle de pureza: DC
Rf = 0,5 (clorofórmio/metanol/ácido acético glacial 50/10/2,5) 13C-RMN: (CD3OD): 12,3; 18,4; 25,3; 26,6; 27,4; 30,5; 39,2; 40,4; 44,4; 51,1; 54,5; 56,3; 57,8; 71,6 (grande); 113,47; 126,3; 128,0; 129,1; 130,5; 131;,8; 140,2; 145,1; 160,9; 167,9; 169,6; 171,71. 8 12
Determinação das constantes de inibição para trombina
As constantes de inibição (Ki) para as substâncias foram determinadas por cinética enzimática de acordo com processos conhecidos. A trombina humana utilizada foi determinada como sendo 87% pura, com auxilio da técnica "active site titratiori'. A solução de ensaio para a determinação de Ki consistia em tampão (50 mM tris-HCl, 75 mM NaCl, pH 7,8, 37°C), 100 pM de trombina, 0,1 nM de substrato S2238 (Kabi) e inibidor, que abrangia um intervalo de 0 até 0,2 nM. O inibidor e o enzima foram incubados previamente durante 60 minutos e a reacção foi iniciada por adição do substrato cromogéneo S2238. Para a avaliação das cinéticas foi utilizado o algoritmo matemático para "tight-binding" que, com o auxílio da regressão não linear forneceu os valores Ki (quadro) e o tipo de inibição. O tipo de inibição para todos os inibidores foi avaliado como sendo competitivo. QUADRO SUBSTÂNCIA Ki [nM] trombina Ki [nM] tripsina t* β [min] Mtr-Asp(PEG5000)Aph-Pip (1) 0,3 387 * Mtr-Asp(PEG5000)Aph-Pip (2) ' 0,4 585 33 Mtr-Asp(PEG 10000)Aph-Pip (3) 0,6 1500 63 Mtr-Asp(PEG20000)Aph-Pip (4) 0,6 941 74 Mtr-Asp-Aph-Pip (5) 2,5 j 312 19 * não ensaiado
13
L
Determinação da especificidade dos inibidores A especificidade dos inibidores foi determinada em relação à trombina e à tripsina. A especificidade é definida como a relação dos valores Ki para tripsina e trombina (quadro).
Determinação dos tempos de semi-vida de eliminação ty, β
Os inibidores de trombina (2)-(5) no Quadro foram aplicados por via intravenosa numa dose de 5 mg/kg em ratos (5 por cada grupo). Foram retiradas amostras de sangue e foram determinadas as concentrações em função do tempo dos inibidores de trombina no plasma. A eliminação foi realizada em duas fases. Os tempos de semi-vida de eliminação ty2 β calculados são apresentados no Quadro.
Determinação da absorção subcutânea das substâncias (2) e (5)
As substâncias foram administradas a coelhos por via subcutânea, numa dose de 2 mg/kg. A concentração máxima no plasma da substância (5) foi alcançada após 5 minutos. A concentração máxima no plasma da substância (2) foi alcançada após 80 minutos. A substância (2) exibiu um nível eficaz no plasma ao longo de 6 horas e (5) ao longo de 3 horas.
Usboa, 13 OUT. 2000
Dt. Américo da Silva Carvalho
Agenle Ofkk! i R. Castilho, 201-
í LISBOA
Teleís. 213 8513SS - 213 824 613

Claims (11)

1
REIVINDICAÇÕES 1. Compostos de fórmula !
o na qual R' representa um anel naftalino ligado na posição alfa ou beta, que tem eventualmente como derivados grupos alquilo que contêm até 3 átomos de carbono, e/ou grupos alcoxi tendo cada um até 3 átomos de carbono, ou representa um anel tetralino ligado na posição alfa ou beta, que tem eventualmente como derivados grupos alquilo que contêm até 3 átomos de carbono, e/ou grupos alcoxi tendo cada um até 3 átomos de carbono, ou representa um anel fenilo que contém eventualmente como 2
substituintes grupos alquilo que contêm até 4 átomos de carbono, e/ou tendo até 3 grupos de estrutura O-X, na qual O representa oxigénio ou enxofre e X representa hidrogénio, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo ou t-butilo, ou representa um sistema de cromano, que contém como derivados de preferência até 5 grupos alquilo que contêm até 3 átomos de carbono, RI representa um grupo de estrutura A-B-poli, em que A representa -(CH2)n-, n representa um número inteiro de 1 até 7, B representa uma ligação -CO-NH-, -N(Y)-CO- em que Y = H, CH3 ou C2H5, -CO-O-, -O-CO-, -SO2-NH-, -S-S-, -S-, -O-, ou -N(Y)- em que Y = H, CH3 ou C2H5, e poli representa um polímero do grupo dos polietilenoglicois, e este polímero tem uma massa molar até 75 000, e R2 e R3 podem ser iguais ou diferentes e representam um grupo alquilo tendo até 4 átomos de carbono, ou em conjunto formam um anel, e eventualmente podem ter como derivados um grupo hidroxilo ou um grupo hidroxialquilo, em que o grupo hidroxialquilo contém até 3 átomos de carbono, e estes grupos hidroxilo eventualmente também estão presentes esterificados, sendo os ácidos correspondentes ácidos carboxílicos que contêm de preferência até 17 átomos de carbono, assim corrio os seus sais fisiologicamente aceitáveis, e C* está presente numa estrutura R ou S, mas de preferência na estrutura R. 3
2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por C* estar presente na estrutura R.
3. Composto de acordo com a reivindicação 1, no qual R' representa β-naftilo, A = -CH2-, B = -CO-NH-, e poli representa um polietilenoglicol com uma massa molar de 750 a 20000, e R2 e R3 em conjunto representam piperidina.
4. Composto de acordo com a reivindicação 1, no qual R' representa 3- 6,7-dimetoxinaftilo, A = -CH2-, B = -CO-NH-, e poli representa um polietilenoglicol com uma massa molar de 750 a 20000, e R2 e R3 em conjunto representam piperidina.
5. Composto de acordo com a reivindicação 1, no qual R’ representa β-tetralinilo.
6. Composto de acordo com a reivindicação 1, no qual R’ representa 4- metoxi-2,3,6-trimetilfenilo.
7. Composto de acordo com a reivindicação 1, no qual R' representa 2,2,5,7,8-pentametilcromanilo.
8. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por B representar -N(Y)-CO- em que Y representa H, CH3, ou C2H5.
9. Processo para a preparação de um composto de fórmula I, caracterizado por se fazer reagir um composto de fórmula II 4
na qual R’ e n têm os significados dados anteriormente e R4 representa um grupo de bloqueio comum na química dos aminoácidos, por exemplo, um grupo benzilo, um grupo t-butilo ou um grupo metilo, e R5 representa um grupo carboxilo ou um grupo amino, um grupo hidroxilo, um grupo SO3H ou um grupo sulfidrilo (-SH), com um polímero do grupo dos polietilenoglicois, acima citado, se eliminar o grupo de bloqueio R4, formando-se um derivado de aminoácido ligado a um polímero, de fórmula II, na qual R5 representa um grupo polímero-B, R4 representa hidrogénio e R', n e B têm os significados citados anteriormente, e por este derivado ser ligado, de acordo com métodos de acoplamento conhecidos, ao grupo amino primário de um composto de fórmula III
e se òbter deste modo um composto de fórmula I de acordo com a reivindicação 1.
10. Agentes de diagnóstico ou terapêuticos contendo um composto de acordo com a reivindicação 1.
11. Utilização de um composto de acordo com a reivindicação 1 para a preparação de um agente de diagnóstico ou de um medicamento com acção antitrombótica. Lisboa, 13 OUT. 2000 Dr. Américo da Silva Carvalho Agente Oí.c:::!·:·'; Idusíríal R. Castilho, 201-3-1: ICLOOLj LISBOA Telefs. 213851339-213854613 A— - Ár Ia, ]^----
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