PT643835E - Ensaio e metodo para htlv-i/htlv-ii - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

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"ENSAIO E MÉTODO PARA HTLV-l/HTLV-II" 1· Campo da Invenção A presente invenção refere-se a anticorpos e antigénios peptídicos úteis na detecção de uma discriminação entre as infecções com HTLV-I e com HTLV-II. A invenção também se refere a métodos de profilaxia e tratamento de infecções com HTLV-I e HTLV-II. 2· Referências

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Os vírus da leucemia humana de células T (HTLV) representam uma família de retrovírus de células T com três membros conhecidos. O tipo I de HTLV (HTLV-I) possui actividade transformadora in vitro e está etiologicamente ligado a leucemia de células T em adultos, que é conhecida como sendo endémica em várias partes do Mundo. O HTLV-II é outro retrovírus possuindo capacidade de transformação in vitro, e foi isolado de um doente com uma variante de células T de reticuloendoteliose leucémica. O HTLV-III, que também foi denominado vírus associado à linfadenopatia e é agora conhecido como o vírus da imunodeficiência adquirida (HIV), é lítico para certos tipos de células T e foi associado à etiologia do síndroma da 2

imunodeficiência adquirida (SIDA). Contrariamente aos vírus HTLV-I e -II, no HTLV-III não é conhecida actividade de transformação in vitro. 0 diagnóstico da infecção por HTLV-I está normalmente baseado na resposta dos anticorpos do soro a antigénios peptídicos de HTLV-I. Isto envolve normalmente um ensaio de pesquisa inicial para identificar anticorpos de HTLV-I, baseados num imunoensaio enzimático (EIA) com péptidos de viriões HTLV-I. Os ensaios presentemente utilizados para pesquisa de sangue detectam cerca de 0,5 até 0,05% de HTLV-I e HTLV-II positivos; destes, cerca de 4 em cada 5 são falsos positivos. Por isso, os soros positivos devem ser ainda testados num ensaio de confirmação, utilizando transferência de Western ou ensaios de radioimunoprecipitação que detectam a reacção de anticorpos a antigénios peptídicos específicos de HTLV-I.

Os procedimentos de testes sanguíneos correntes requerem testes de confirmação baseados na imunorreacção com a proteína p24 de gag de HTLV-I e pelo menos uma das proteínas de envelope gp46, gp21, ou gp68. Quando os antigénios de teste são preparados a partir de proteínas de virião, apenas a gp46 produz uma taxa elevada de reacção de anticorpo com os seropositivos de HTLV-I verdadeiros. Mesmo nessa situação, a reacção com gp46 pode ser detectada apenas através de testes de antigénios adicionais com um ensaio de radioimunoprecipitação mais sensível. A pesquisa acima e os testes de confirmação identificam os HTLV-I e HTLV-II positivos, mas não distinguem entre os dois vírus de HTLV. A diferenciação inequívoca entre a infecção com HTLV-I e HTLV-II presentemente apenas pode ser realizada através do isolamento do vírus, seguido por análise de transferência de Southern ou amplificação selectiva de ácido nucleico virai através da reacção da polimerase em cadeia (PCR); contudo, devido ao nível baixo de linfócitos infectados em indivíduos infectados com HTLV, nem todas as amostras seropositivas para HTLV apresentarão resultados de teste 3

L-^ positivos quando analisadas através da PCR (Williams). Adicionalmente, estas técnicas não são adequadas para a pesquisa de volume elevado de soros nas utilizações clinicas. 0 Pedido de Patente Internacional W090/10231 propõe um método de discriminação entre anticorpos específicos em soros contendo anticorpos que surgem de infecção com HTLV-I ou com HTLV-II ou com retrovírus relacionados. 0 método envolve pelo menos quatro imunoensaios, dois com antigénios de HTLV-1 e dois com antigénios de HTLV-II. Além disso, W090/10231 constata que os antigénios de HTLV-I e HTLV-II devem ser combinados de modo a alcançar um teste fiável e a evitar o seu enfraquecimento através de falsos positivos resultantes de uma reacção cruzada de anticorpos de HTLV-II com antigénios de HTLV-I e vice versa.

Seria por isso desejável proporcionar um método melhorado para a detecção e diferenciação de soros positivos para HTLV-I e HTLV-II. Em particular, o teste melhorado deve ser capaz de detectar todos os soros positivos para HTLV-I e HTLV-II, com um número mínimo de falsos positivos, e também deve ser capaz de distinguir entre soros positivos para HTLV-I e HTLV-II. 4. Sumário da Invenção

Um aspecto da invenção é um "kit" de ensaio para utilização \ na identificação positiva de infecção com HTLV-I num doente humano, a partir de uma amostra de soro. 0 "kit" inclui um suporte sólido no qual estão imobilizados (a) um antigénio do péptido pl9-C27 de HTLV-I possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, e (b) um antigénio do péptido gp46-MTA-l de HTLV-I possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4. Está também incluído no "kit" um reagente de detecção para detectar a presença de anticorpos humanos ligados imunoespecificamente a cada um dos antigénios peptídicos imobilizados.

Numa realização geral, os dois antigénios peptídicos de HTLV-I são imobilizados em regiões separadas de um suporte sólido. 4 I— ^^

Também numa realização geral, o reagente de detecção inclui os antigénios pl9-C27 de HTLV-I e gp46-MTA-l de HTLV-I possuindo as sequências de aminoácidos SEQ ID NOS: 1 e 4, respectivamente, em que cada antigénio é marcado com um repórter detectável. Nos casos em que os dois péptidos no sistema de detecção estejam marcados com repórteres distinguíveis, os antigénios peptídicos imobilizados podem ser aplicados numa região comum do suporte sólido. 0 "kit" também pode ser concebido para a identificação positiva de HTLV-II. Nesta realização, o suporte sólido tem ainda nele imobilizado, (c) um antigénio do péptido p21-C27 de HTLV-II possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3, e (d), um antigénio do péptido gp46-K55 de HTLV-II possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5. 0 meio de detecção nesta realização é eficaz para detectar a presença de anticorpos humanos ligados imunoespecificamente a cada um dos antigénios peptídicos (a)-(d) imobilizados no suporte sólido.

Num aspecto relacionado, a invenção inclui um método para a identificação positiva da infecção com HTLV-I num doente humano a partir de uma amostra de soro. 0 método inclui fazer reagir a amostra de soro com o suporte sólido acima, e detectar a ligação de anticorpos de soro humano a cada um dos antigénios peptídicos separadamente. A partir do padrão de ligação, a identificação positiva de infecção com HTLV-I ou com HTLV-II pode ser realizada se e apenas se a ligação dos anticorpos do soro contra os antigénios peptídicos gag e env de HTLV-I de gag ou env de HTLV-II, respectivamente, se realize.

Noutro aspecto da invenção está incluído um "kit" para identificar positivamente a infecção de HTLV-II num doente humano a partir de uma amostra de soro. 0 "kit" inclui um suporte sólido no qual estão imobilizados (a) um antigénio do péptido p21-C27 de HTLV-II possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3, e (b) um antigénio do péptido gp46-K55 de HTLV-II possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5. 0 "kit" 5 também inclui um reagente de detecção capaz de detectar a presença de anticorpos humanos ligados imunoespecificamente a cada um dos antigénios peptidicos imobilizados no suporte sólido.

Também é descrito um "kit" para a pesquisa de soros humanos quanto à evidência de infecção com HTLV-I ou HTLV-II. 0 "kit" inclui um suporte sólido no qual estão imobilizados: (a) um antigénio peptidico derivado da proteína p24 de gag de HTLV-I e definindo um epitopo que é imunorreactivo com o anticorpo monoclonal humano WA10/3E4 ou o anticorpo monoclonal WA07/2G3 ou um antigénio peptidico derivado da proteína gp21 de env de HTLV-I e definindo um epitopo que é imunorreactivo com o anticorpo monoclonal humano WA07/1E4; e um dos seguintes pares de antigénios peptidicos: (b) um antigénio do péptido pl9-C27 de HTLV-I possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, um antigénio do péptido p21-C27 de HTLV-II possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3, ou (c) um antigénio do péptido gp46-MTA-l de HTLV-I possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4, e um antigénio do péptido gp46-K55 de HTLV-II possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5. A invenção também contempla um método e composição para profilaxia de HTLV-I. A composição para a profilaxia de HTLV-I inclui um ou mais dos seguintes anticorpos monoclonais humanos cuja ligação a células infectadas é consistente com a actividade de anticorpo neutralizante: (a) WA07/2F7, WA08/2E9, WA07/2G3, WA11/2E2, WA04/2B10, WA07/1G7, WA07/2D3, Wa07/2F9, WA11/1F5, e WA11/2F3. É também descrita uma composição de vacina peptídica para utilização na imunização de um humano contra a infecção com HTLV-I ou HTLV-II. A vacina é composta por um péptido de HTLV-I ou de HTLV-II que é imunorreactivo com um dos anticorpos neutralizantes anti-HTLV-I acima. Um antigénio peptidico é 6

transportado num adjuvante adequado e/ou derivado para um transportador que potência imunologicamente uma proteína transportadora.

Uma tal composição de vacina pode ser utilizada num método para evitar ou tratar infecção com HEV num indivíduo, através da administração, p. ex., por injecção intramuscular, da composição de vacina acima.

Estes e outros objectivos e características da invenção serão mais evidentes quando for lida a seguinte descrição detalhada da invenção em conjunção com as figuras acompanhantes, como se segue:

As Figuras 1A-1C apresentam o arranjo de genes nos genomas de HTLV-I e de HTLV-II (IA), e os correspondentes produtos genómicos de HTLV-I (1B) e de HTLV-II (1C);

As Figuras 2A-2C apresentam as localizações relativas e as sequências de antigénios dos péptidos pl9-C27 (SEQ ID NO: 1) (2A), p21-C27 (SEQ ID NO: 3) (2B), e gp46-MTA-l (SEQ ID NO: 4) e gp46-K55 (SEQ ID NO: 5) (2C);

As Figuras 3A-3C apresentam um gráfico de hidrofilicidade da proteína pl9 de gag de HTLV-I (A) , as regiões da pl9 utilizadas para produzir antigénios de proteína de fusão (3B), e sequências das regiões de pl9 de dois destes antigénios, pl9-R45 (pl9-C45; SEQ ID NO: 2) e pl9-LB27 (pl9-C27; SEQ ID NO: 1) (3C); A Figura 4 apresenta os oligonucleótidos iniciadores GHlpl9-Fl (SEQ ID NO: 9), GHIP19-F2 (SEQ ID NO: 10), GH1P19-F3 (SEQ ID NO: 11), GHIP19-F4 (SEQ ID NO: 12), GH1P-R1 (SEQ ID NO: 13), GH1P91-R2 (SEQ ID NO. 14), e GH1P19-R3 (SEQ ID NO: 15) utilizados na produção de sequências que codificam para péptidos de fusão de antigénios peptídicos derivados de p21 utilizados na invenção e oligonucleótidos iniciadores utilizados na amplificação da sequência codificante para o antigénio do péptido gp46-K55, K55-1 (SEQ ID NO: 16) e K55-2 (SEQ ID NO: 17); A Figura 5 apresenta análises de transferência de Western 7 r de incubações de soros anti-transferase S da glutationa produzidos em coelhos, diluídos de 1/1000, em transferências de nitrocelulose de lisados totais de células da estirpe de E. coli JM101 isoladamente (pista a), E. coli expressando transferase S da glutationa não recombinante (26,5 kdal; pista b) , e (pistas e-h) lisados totais de células de bactérias recombinantes expressando as proteínas de fusão pl9-FL130 (42,2 kdal; pista c) , pl9-F86 (36, 9 kdal; pista d), pl9-F44 (31,8 kdal; pista e) , pl9-M44 (31,8 kdal; pista f), pl9-R45 incluindo a sequência de pl9-C45 (32 kdal; pista g), e pl9-LB27 incluindo de sequência de pl9-C27 (29,8 kdal; pista h); A Figura 6 apresenta análises de transferência de Western de incubações de sobrenadante de cultura de tecidos diluída ½ derivado da linha celular de HMAb IH-9, em que as pistas (a)-(h) são como na Figura 5; A Figura 7 apresenta análises de transferências de Western de incubações de anti-soro J254 diluído 1/100, derivado de um indivíduo infectado com HTLV-I, em que as pistas (a) - (h) são como na Figura 5 acima; A Figura 8 apresenta análises de transferência de Western de incubações de anti-soro J376 diluído 1/100, derivado de um indivíduo negativo para HTLV, em que as pistas (a) - (h) são como na Figura 5 acima; A Figura 9 apresenta transferências de Western nas quais os anti-soros humanos para HTLV-I e HTLV-II, o anticorpo monoclonal IH-9, e os anti-soros de controlo foram testados quanto à reactividade com lisados virais a partir de células infectadas com HTLV-I e HTLV-II. A Figura 10 apresenta, na linha superior uma porção do genoma de HTLV-I contendo a sequência que codifica para a proteína do envelope gp46; A Figura 11 apresenta uma porção da região que codifica para a gp4 6 contendo as sequências que codificam para as zonas de sobreposição dos antigénios peptídicos designados MTA-4, MTA- 8 Γ 1, e ΜΤΑ-5 de HTLV-I; A Figura 12 apresenta sequências de aminoácidos de regiões homólogas de gp4 6 de HTLV-I (SEQ ID NO: 7) e gp4 6 de HTLV-II (SEQ ID NO: 8) e dos péptidos derivados gp46-MTA-l (SEQ ID NO: 4), GH2-K15 (SEQ ID NO: 6) e gp46-K55 (SEQ ID NO: 5);

As Figuras 13A-13C ilustram os passos num método para

pesquisar soro humano em relação à presença de infecção com HTLV de acordo com uma realização da invenção;

As Figuras 14A-14C ilustram os passos num método para identificar positivamente a infecção com HTLV-I a partir de soro humano, de acordo com outra realização da invenção;

As Figuras 15A e 15B ilustram um formato de ensaio de fase sólida para a pesquisa de identificação positiva de infecção com HTLV-I ou HTLV-II, de acordo com outra realização da invenção, e A Figura 16 apresenta um formato de fase sólida num teste de ensaio para identificar positivamente a infecção com HTLV-I e HTLV-II. I. Definições 0 termo "anticorpo" como aqui utilizado, e particularmente como utilizado no contexto de uma terapêutica, descreve uma molécula de proteína derivada de quaisquer das principais classes de imunoglobulina de vertebrado, tais como IgA, IgD, IgE, IgG, ou IgM. 0 termo "anticorpo" é entendido como compreendendo fragmentos de anticorpos nativos, tais como fragmentos FAB2 e fragmentos Fc. Os anticorpos da invenção podem ser isolados a partir do soro de um vertebrado, de uma célula de hibridoma, de uma célula recombinante eucariota, procariota, incluindo uma célula vegetal, liquido ascítico, leite de bovino, ou afins. O termo "anticorpo monoclonal" refere-se a anticorpos isolados a partir de uma célula de hibridoma isolada ou de uma linha celular clonal. Tais anticorpos partilham uma especificidade de reconhecimento imunogénico comum. 0 termo "antigénio" refere-se a uma molécula que é 9

reconhecida especificamente e está ligada por um anticorpo. Um antigénio que promove uma resposta imunitária num organismo, como evidenciado pela produção de anticorpos específicos num organismo é denominado como um "imunogénio". Os termos "região imunogénica" ou "epitopo" são aqui utilizados indiferentemente para indicar essa região de um antigénio que é reconhecida especificamente por um anticorpo. 0 "anticorpo formado por" uma dada sequência de aminoácidos é o epitopo produzido através da estrutura secundária/terciária dessa sequência em solução aquosa. 0 "sítio de ligação ao antigénio" é a região da molécula de anticorpo contida dentro das regiões variáveis que participam directamente na ligação ao antigénio.

Um "antigénio peptídico" especificado "contendo o epitopo formado por" uma sequência de aminoácidos especificada inclui a própria sequência especificada ou uma porção desta, que é suficiente para definir o presente epitopo na sequência especificada, como evidenciado por imunorreactividade em relação a um dado anticorpo. 0 antigénio peptídico especificado pode incluir substituições de aminoácidos que preservem o epitopo. II. Preparação de Anticorpos Monoclonais Humanos

Esta secção descreve a preparação de vários anticorpos monoclonais humanos utilizados na invenção. Os anticorpos são obtidos a partir de hibridomas são formados por fusão de um linfócito humano activado produzindo um anticorpo anti-HTLV, tal como um linfócito transformado com vírus Epstein-Barr, com um parceiro de fusão estável, tal como uma célula de heteromieloma murganho-humano, descrita abaixo.

A. Isolamento de células produtoras de Anticorpo a partir de indivíduos positivos para HTLV

Os indivíduos infectados com HTLV-I podem ser identificados por procedimentos convencionais, incluindo reactividade dos seus 10 J~ u >—ΐ soros com o antigénio p24 e as proteínas gp46 e gp68 de HTLV, de acordo com protocolos convencionais conhecidos na técnica. A confirmação da infecção é realizada através de análise pela reacção da polimerase em cadeia (PCR) utilizando iniciadores e sondas específicos para HTLV-I, de acordo com os métodos conhecidos na técnica. De igual modo, os indivíduos infectados com HTLV-II são identificados por PCR utilizando iniciadores e sondas específicos para HTLV-II (Lipka 1990). Adicionalmente, os indivíduos infectados com HTLV-II podem ser identificados através da imunorreactividade dos seus soros com o epitopo recombinante específico para HTLV-II contido no antigénio gp46-K55 (Lipka, 1992).

Embora quaisquer células de primata, ou particularmente, células de humano que expressem ou produzam um anticorpo específico anti-HTLV possam ser utilizadas na produção de uma linha celular de hibridoma útil na invenção, os linfócitos B, tais como os que podem ser isolados a partir do baço ou a partir da circulação periférica, são fontes preferidas de células produtoras de anticorpo para a produção de hibridoma. Pode ser isolada uma fracção de células de linfócito B de sangue periférico (PBL) a partir de amostras de sangue total de indivíduos positivos para HTLV, como detalhado no Exemplo 1. As células produtoras de anticorpo anti-HTLV são então seleccionadas e imortalizadas, como descrito abaixo, para formar uma linha celular de hibridoma para a produção de anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a epitopos únicos de antigénios de HTLV-I ou HTLV-II. B. Produção de Hibridomas a partir de Linfócitos Periféricos 1. Activação de Linfócitos

Antes da selecção, são activados os linfócitos B segregadores de anticorpos isolados como descrito acima. A activação é realizada utilizando um vírus de transformação, tal como o vírus Epstein-Barr, como descrito no Exemplo 1, ou pode 11 Γ alternativamente ser realizada por exposição das células a outros activadores de células B conhecidos na técnica, tais como o mitogénio de erva daninha, ou ao antigénio especifico reconhecido pelas células.

Após a activação, as células são cultivadas em cultura, e depois examinadas para a produção de actividade especifica anti-HTLV, utilizando um ensaio de detecção de anticorpo anti-HTLV apropriado, tal como os imunoensaios baseados em enzimas em lisados virais de HTLV-I e HTLV-II, descritos no Exemplo 2. As células apresentando actividade num desses ensaios são seleccionadas para imortalização, através da fusão com um parceiro de fusão de heteromieloma, como descrito abaixo. 2. Fusão com o Parceiro de Fusão de Heteromieloma A formação de um hibridoma estável que segrega um anticorpo humano anti-HTLV é obtida através da fusão de um linfócito B activado com uma célula de heteromieloma tal como a linha celular K6H6-B5 (Carroll) ou a linha celular H73C11 (Perkins, 1991), originalmente produzida através da fusão de linfócitos humanos activados com um parceiro de fusão de mieloma de murganho, como descrito no Exemplo 3. Esta fusão pode ser alcançada através de um número de métodos conhecidos na técnica (Harlow) incluindo a exposição de células mistas a polietilenoglicol e exposição de células a um campo eléctrico forte (electrofusão), detalhados no Exemplo 3. Os hibridomas são seleccionados através do crescimento em meio selectivo, e posteriormente são testados em relação à estirpe de HTLV e especificidade de antigénio em um ou mais ensaios, cõmo descrito abaixo e no Exemplo 2. III. Identificação de Especificidade para o Antigénio dos Anticorpos Monoclonais A. Determinação da Estirpe de HTLV e da Especificidade para o 12

L-L

Antigénio

Os genomas de HTLV-I e de HTLV-II foram sequenciados e os produtos dos genes foram identificados. As estirpes partilham pelo menos 65% de homologia dos ácidos nucleicos e 70% de homologia de aminoácidos (Cann). A Figura 1 apresenta um diagrama dos genomas e dos produtos genéticos proteicos conhecidos de HTLV-I e de HTLV-II. Em particular, os produtos do gene gag incluem as proteínas do núcleo de 19 e 24 quilodaltons (p21 e p24) em HTLV-I e 21 e 24 quilodaltons em HTLV-II (p21 e p24). De forma semelhante, os produtos do gene env são proteínas de 46 quilodaltons e 21 quilodaltons (gp46 e gp21). A proteína gp46 é uma proteína de superfície celular que é segregada a partir das células, enquanto que a gp21 é uma proteína transmembranar. Foram observados soros humanos que reagem com estes e com outros antigénios de HTLV. A estirpe de HTLV e a especificidade do antigénio de um anticorpo monoclonal particular podem ser determinados utilizando um ou mais de entre uma variedade de ensaios de ligação de anticorpo conhecidos na técnica (Harlow). Esses ensaios incluem ensaios de ELISA, tais como o imunoensaio de lisado virai detalhado no Exemplo 2A, no qual a reactividade de um anticorpo pode ser determinada com base na sua capacidade para se ligar a um antigénio ou mistura de antigénios imobilizados numa fase sólida. Nesses ensaios, os antigénios imobilizados são seleccionados para distinguir a reactividade de anticorpo para diferentes estirpes de vírus, ou, a um nível mais específico, para antigénios virais diferentes.

As transferências de Western de antigénios a partir de uma fonte comum separados por electroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS PAGE), tais como o ensaio de transferência de Western descrito no Exemplo 2B, são particularmente úteis na distinção de especificidade de antigénio. A Figura 5 apresenta uma transferência de Western na qual os anti-soros humanos e o anticorpo monoclonal IH-9 são 13

testados para a reactividade com antigénio de HTLV-I e de HTLV-II presentes num lisado virai. A especificidade para HTLV-I do anticorpo IH-9 é evidente a partir desta transferência. 0 anticorpo liga-se a pl9 no lisado de HTLV-I, bem como a vários dos percursores de gag maiores, incluindo p55 e p28, mas não se liga detectavelmente a proteínas no lisado de HTLV-II. Para comparação, o soro de humano infectado com HTLV-I testado contra os mesmos perfis de antigénio revela a presença de quantidades significativas dos produtos de gene virai p24 e gp46. A Tabela 1 sumariza os resultados de reactividades de um número de sobrenadantes de hibridoma humano com células infectadas e antigénios de HTLV-I e de HTLV-II. A reactividade positiva nos ensaios de imunofluorescência de ligação a células MT-2 infectadas com HTLV-I e com células MO-T infectadas com HTLV-II foi avaliada através de ligação de um anticorpo de cabra anti-IgG humana marcado com fluorescência em células que foram pré-incubadas com sobrenadante de hibridomas, como detalhado no Exemplo 2C.

Neste ensaio, embora muitos dos anticorpos monoclonais exibissem reactividade cruzada com células de HTLV-I e de HTLV-II, muitos destes hibridomas, nomeadamente WA04/2B10, WA11/2E2, WA07/2D3, WA07/2B10, WA11/1F5, WA11/2C2, WA08/2E9, e IH-9, produzem anticorpos que são selectivos para HTLV-I. Quando a ligação foi avaliada num ensaio em célula viva, no qual foram expostas ao anticorpo células totais não fixadas (Exemplo 2D), foi evidente um padrão ligeiramente diferente (Tabela 1) . Um nivel elevado de fluorescência (maior do que cerca de 50%), indicando um nivel elevado de ligação ao anticorpo, foi observado para WA08/2E9, WA04/2B10, WA07/2F7, WA07/2G3, WA11/2E2, WA07/1G7, WA07/2D3, WA07/2F9, WA11/1F5, e WA11/2F3. A especificidade para o antigénio foi avaliada através de ensaio de transferência de Western para cada um dos sobrenadantes do hibridoma, como indicado na Tabela 1. Um resultado negativo neste ensaio pode indicar especificidade do 14

L-Cj anticorpo para uma proteína não desnaturada; isto é, pode indicar que é necessária uma conformação proteica a 3 dimensões para o reconhecimento pelo anticorpo. 15

TABELA I

Anticorpo Imuno- fluorescência MT-2 MO-T Ensaio em Célula Viva1 (%) Transferência de Western2 IgG μg/mL WAIO/3E4 + + 6 p24 0,2 WA07/2F7 + + 97 0 52 WA07/1E4 + + 5 gp21 79 WA08/2E9 + 94 gp21 3 WAO7/2B10 + - 51 gp4 6 3 WA07/2G3 + + 87 p24 0, 6 WA11/2E2 + - 85 0 9,4 WAO4/2B10 + 99 0 35 WA07/1G7 + + 99 0 18 WA07/2D3 + - 98 0 63 WA07/2F9 + + 90 0 16 WA11/1F5 + - 88 0 6 WA11/2C2 + + 14 0 66 WA11/2F3 + + 95 0 30 IH9 + + pl9

Anotações: 16 1 % de fluorescência máxima. Os valores são médias de determinações utilizando sobrenadantes de células parentais em cultura e consumindo sobrenadantes de células parentais em cultura. 2

Reactividade positiva com a proteína indicada; 0 = ausência de ligação a proteínas de HTLV; n.d. = não determinado

As linhas celulares de hibridoma que produzem estes anticorpos foram depositadas no Stanford University Blood Bank Virai Immunology Repository, 800 Welch Road, Paio Alto, CA 94304. Às linhas celulares foram atribuídos os mesmos números de repositório que foram atribuídos aos anticorpos monoclonais u >—* Γ produzidos. Assim, por exemplo, a linha celular depositada que produz o anticorpo WA08/2E9 é designada como linha celular WA08/2E9. B. Mapeamento Detalhado da Especificidade para o Antigénio de Anticorpos Monoclonais

Esta secção descreve experiências realizadas para identificar as regiões da proteína ou dos péptidos que são imunorreactivas com os anticorpos monoclonais anti-HTLV humanos da invenção. De um modo geral, para determinar a especificidade epitópica, ou realizar o "mapa detalhado" da especificidade para o antigénio, de um anticorpo, é necessário sintetizar ou expressar de forma recombinante porções peptídicas específicas do antigénio. Esses péptidos podem então ser empregues em ensaios de competição em fase sólida ou líquida, tais como ELISA ou RIA, para determinar a especificidade para a ligação. 1. Produção de Antigénios Peptídicos

Os antigénios peptídicos que são úteis na determinação de especificidade epitópica de um anticorpo monoclonal são formados através de qualquer um de vários métodos que são eficazes para produzir porções pequenas, definidas da proteína antigénica parental. Assim, a proteólise limitada de uma proteína virai, seguida por separação e purificação de fragmentos, ou síntese química ou recombinante de tais fragmentos definidos, para utilização como componentes de uma proteína de fusão ou isoladamente, são todos meios de produção de antigénios peptídicos úteis no mapeamento detalhado da especificidade epitópica de um anticorpo. la. Produção recombinante de antigénios peptídicos

Os péptidos a ser utilizados na determinação da especificidade de anticorpo monoclonal podem ser produzidos através de uma variedade de técnicas recombinantes conhecidas na 17 técnica. Os métodos preferidos de produção de péptidos recombinantes incluem aqueles nos quais o produto peptidico resultante é expresso numa forma e localização que pode ser reconhecida e alcançada através de uma molécula de anticorpo. Assim, os antigénios peptidicos podem ser expressos como proteínas de fusão virais, tal como é produzido pelo sistema de expressão do fago filamentoso fUSE5, ou como proteínas de epitopo de fusão bacterianas, como descrito no Exemplo 4 para expressão de porções seleccionadas da proteína pl9 de gag HTLV-I. Foi utilizado um método semelhante na identificação de antigénios peptidicos de HTLV-II da proteína do envelope de gp46 de HTLV-II. Este método é descrito no Pedido de Patente U.S, co-pendente, em co-autoria 07/653 091 correspondendo a W09213946.

No método recombinante detalhado no Exemplo 4, as porções seleccionadas de pl9 de HTLV-I foram construídas para pesquisa antigénica utilizando o anticorpo IH-9. A Figura 3A apresenta um gráfico da hidrofilicidade da sequência de aminoácidos de pl9 de HTLV-I. A informação desse gráfico pode ser utilizada para determinar sequências candidatas para o primeiro ciclo de pesquisa antigénica. A Figura 3B apresenta as localizações relativas dos fragmentos peptidicos construídos. A Figura 3C apresenta as sequências de aminoácidos de dois dos péptidos imunorreactivos expressos no sistema de expressão de proteína de fusão bacteriano.

As sequências dos iniciadores para os sentidos directo e reverso utilizados na construção das regiões que codificam para a pl9 são apresentadas na Figura 4. É incorporado um sítio de ligação específico para a endonuclease em cada um dos iniciadores na extremidade 5', e neste caso um sítio de ligação Eco RI para facilitar a clonagem das moléculas de ADN amplificadas. Os iniciadores são adicionalmente concebidos e construídos para facilitar a recuperação da grelha de leitura aberta da pl9 de HTLV-I como uma inserção em grelha nos sistemas de vector de expressão. Os iniciadores apresentados na figura 4 18

foram concebidos para utilização com o sistema de expressão pGEX (Pharmacia).

Na formação desses vectores, a reacção da polimerase em cadeia (PCR) é realizada utilizando um ADN molde apropriado. No caso da pl9, o clone sp65 MT-2 de HTLV-I pode ser utilizado como molde. Os ADNs amplificados são então purificados e digeridos durante a noite com uma enzima de restrição apropriada. Os ADNs digeridos são então ligados no sitio de restrição do vector de expressão seleccionado. No caso da pl9, o vector de expressão é pGEX-2.

As moléculas de ADN ligadas resultantes são utilizadas para transformar bactérias competentes, de acordo com técnicas convencionais (Sambrook). Os ADNs dos plasmideos das colónias transformadas podem então ser analisados quanto à presença do ADN inserido através de digestão com endonuclease de restrição com uma enzima de restrição apropriada.

As bactérias transformadas com um plasmideo contendo inserção são pesquisadas quanto à orientação correcta e à produção de proteína através de análise por transferência de Western dos lisados brutos preparados a partir de culturas das bactérias transformadas, como detalhado no Exemplo 4 para E. coli transformadas contendo inserções do péptido pl9. As amostras de lisado são fraccionadas, neste caso por SDS-PAGE, e as proteínas fraccionadas são então transferidas para papel de filtro de nitrocelulose para análise por transferência de Western. As transferências de Western são pesquisadas com o(s) anticorpo (s) de teste, neste caso o HMAb IH-9, bem como os vários anti-soros de indivíduos infectados e não infectados com HTLV-I. a produção de proteínas recombinantes contendo regiões não imunogénicas de pl9 de HTLV-I é confirmada através da utilização de um anti-soro de coelho contendo anticorpos dirigidos contra a transferase S da glutationa não recombinante, uma proteína marcadora que faz parte do vector pGEX. A produção de proteínas de fusão pelas bactérias 19 p Lc, ^ transformadas pode ser induzida através de condições de crescimento selectivas, tal como através da exposição a tiogalactósido de isopropilo (IPTG). Após um período de crescimento apropriado, as bactérias são lisadas e solubilizadas, se necessário, através da adição de agentes tensioactivos, bem como de inibidores de ADNase I e protease. A proteína de fusão presente na fracção solubilizada é então passada através de uma coluna contendo um ligando de afinidade apropriado para a porção constante da proteína de fusão. No caso do péptido pl9 as proteínas de fusão produzidas como descrito no Exemplo 4, a porção constante da proteína de fusão, contribuída pelo vector pGEX, é a transferase de glutationa. Uma matriz de afinidade apropriada para capturar a proteína de fusão é por isso uma agarose de glutationa.

Outro sistema de expressão de proteína de fusão apropriado é o sistema de expressão de fago filamentoso fUSE5, como descrito por Cwirla. Neste sistema, um péptido estranho inserido é expresso como uma proteína de fusão no revestimento proteico do fago. Adicionalmente, este sistema pode ser utilizado para produzir uma biblioteca aleatória ou aleatória dirigida de péptidos para pesquisa em grande escala de epitopos peptídicos curtos (5-10 aminoácidos) (Cwirla, Scott). 0 antigénio peptídico de HTLV-II gp46-K55 utilizado na invenção é preparado como se segue. Foi utilizado um plasmídeo pM04 (Pedido de Patente U.S. para "Antigénios Peptídicos de HTLV-I e HTLV-II e Métodos", N° de série 07/653 091, submetido em 8 de Fevereiro de 1991) como fonte da sequência que codifica para a gp46. Este plasmídeo contém cerca de 95% do genoma completo de HTLV-II. A região desejada que codifica para K55 é amplificada por amplificação do ADN plasmídico através da reacção da polimerase em cadeia (PCR), utilizando como iniciadores da PCR, os iniciadores K55-1 e K55-2 apresentados no fundo da Figura 4. Os dois iniciadores K55 são concebidos para produzir a região codificante de K55 amplificada com sítios de 20 V ^^

restrição Ncol/Bamtil em extremidades opostas.

Os fragmentos amplificados são tratados com Ncol e Bamtil, e inseridos nos sítios NcoI/BamHI de um plasmídeo pGEX-GLI. Este plasmídeo é um plasmídeo pGEX-1 modificado no qual o sítio EcoRI normal foi substituído por sítios Ncol e BamHl afastados por curtos espaços.

Após a inserção do fragmento, o plasmídeo pGEX-GLI com a inserção que codifica para K55 é introduzido num hospedeiro bacteriano adequado para a expressão da proteína de fusão K55 desej ada. lb. Produção Sintética de Péptidos

Os péptidos com menos do que cerca de 50 resíduos de aminoácidos também podem ser sintetizados utilizando métodos de síntese química em fase sólida, tal como são utilizados em sintetizadores de péptidos disponíveis comercialmente. Estes métodos são particularmente aplicáveis quando a sequência de aminoácidos completa é conhecida, quer directamente, através de sequenciação de aminoácidos, ou através da dedução baseada na sequência do ácido nucleico.

Após a produção a granel, através de métodos de síntese química, os péptidos purificados podem ser obtidos através de técnicas de purificação convencionais, tais como cromatografia líquida de elevado desempenho (HPLC). 2. Ligação de Anticorpos Monoclonais a Antigénios Peptídicos

Após a produção dos antigénios peptídicos, de acordo com a invenção, os anticorpos são testados quanto à sua capacidade para se ligarem a esses antigénios. Os ensaios para a ligação anticorpo-antigénio são bem conhecidos na técnica (Harlow). Os ensaios em fase sólida, tais como ensaios de ligação por ELISA, são particularmente adequados para a medição de ligação anticorpo-péptido. Esses ensaios podem ser realizados num 21

t formato de ensaio directo ou de ligação competitiva. No método directo, o péptido de teste é adsorvido a uma fase sólida. 0 anticorpo humano de teste anti-HTLV é adicionado ao péptido e a ligação do anticorpo humano ao péptido é medida, por exemplo, no imunoensaio em fase sólida baseado em enzima do lisado de HTLV-I descrito no Exemplo 2A.

Alternativamente, quando os péptidos são expressos como proteínas de fusão de tamanho suficiente para serem retidos por uma SDS-PAGE, as transferências de Western podem ser utilizadas para determinar a ligação da porção do péptido da proteína de fusão a uma preparação de anticorpo específico. 3. Teste de proteínas de epitopo de fusão expressas para a imunorreactividade com o HMAb IH-9 A localização do epitopo reconhecido pelo HMAb IH-9 foi determinada expressando vários segmentos de pl9 de HTLV-I num sistema de expressão de proteína de fusão bacteriano e testando as proteínas expressas para imunorreactividade com o anticorpo monoclonal humano IH-9 num ensaio de transferência de Western. Os lisados celulares bacterianos totais derivados de bactérias que expressam os antigénios de pl9 de HTLV-I apresentados nas Figuras 5-8 foram preparados como descrito no Exemplo 4. As proteínas foram fraccionadas por SDS-PAGE e transferidas para nitrocelulose. Como apresentado na figura 6, as transferências foram incubadas com o sobrenadante de culturas de tecidos derivadas de cultura de hibridomas produzindo activamente HMAb IH-9, e o anticorpo ligado foi detectado como descrito no Exemplo 5. Como controlo, a figura 5 apresenta as mesmas transferências que reagiram com anti-soros policlonais de coelho dirigidos contra a transferase S de glutationa. A presença de bandas fortes a cerca de 26,5 quilodaltons em todas as pistas menos uma indica a presença de transferase S de glutationa nestas pistas, e por isso, confirma a expressão de uma proteína de fusão. As Figuras 7 e 8 apresentam as reactividades de soro 22

infectado com HTLV-I policlonal humano e de soro humano não infectado, respectivamente. É evidente a partir destes resultados que o IH-9 e o soro anti-HTLV-I contêm cada um anticorpos que reagem com as proteínas de fusão pl9-R45 (32 kdal; pista g) e pl9-LB27 (29,8 kdal; pista h) . A proteína de fusão pl9-LB27 contém o péptido derivado de pl9 de HTLV-I pl9-C27, aqui identificado por SEQ ID NO: 1. A proteína de fusão pl9-R45 contém pl9-C45, aqui identificado como SEQ ID NO: 2. Foi também observada uma imunorreactividade fraca no HMAb IH-9 em relação ao recombinante de pl9 de HTLV-I de comprimento total pl9-FL130 (pista c) . Não foi observada nenhuma imunorreactividade em relação a qualquer uma das outras proteínas recombinantes pl9 de HTLV-I (Figura 6). A Tabela 2 sumariza os resultados de experiências semelhantes nas quais a proteína de fusão pl9-R45 foi testada em relação à reactividade com soros infectados, indeterminados e não infectados com HTLV.

Tabela 2

Imunorreactividade da proteína de fusão pl9-R45

Anti-soros N Reactivo com R45 % Infectado com HTLV-I 32 32 100 Infectado com HTLV-II 32 1 3,1 Indeterminado para HTLV, 18 12 66,7 reactivo com pl9 Indeterminado para HTLV13, 14 0 0 outro Negativo para HTLV 32 0 0

IV. Antigénios Peptídicos para Ensaios de HTLV-I/HTLV-II

Esta secção descreve os antigénios peptídicos que são empregues no "kit" de ensaio e no método descritos na Secção IV abaixo. De um modo geral, os péptidos incluem três pares de antigénios, como descrito abaixo. 23

V Γ

A. Antigénios Peptídicos Específicos para HTLV-I e HTLV-II

0 primeiro par de antigénios inclui o péptido do terminal C de pl9 especifico para HTLV-I discutido acima denominado pl9-C27 (SEQ ID NO: 1), e o péptido especifico para HTLV-II correspondente a partir da proteína do núcleo de HTLV-II p21 denominado p21-C-27 (SEQ ID NO: 3). As sequências destes péptidos são apresentadas nas Figuras 2A e 2B, respectivamente.

Estes antigénios peptídicos podem ser preparados de forma recombinante, quer como proteínas de fusão quer como péptidos recombinantes pequenos, de acordo com os métodos descritos acima, e no Exemplo 4. Alternativamente, os antigénios peptídicos podem ser preparados através de métodos de síntese em fase sólida convencionais.

Os estudos realizados em suporte da presente invenção, discutidos acima, demonstraram que os antigénios peptídicos pl9-C27 e pl9-C45 são específicos para HTLV-I, i.e., os antigénios imunorreagem com os anticorpos presentes nos indivíduos infectados com HTLV-II, embora os dois antigénios possam não detectar todos os positivos para HTLV-I, e possam identificar alguns falsos positivos, i.e., indivíduos não infectados. Como descrito acima, os antigénios dos péptidos pl9-C27 e pl9-C45 são derivados da porção C-terminal da proteína pl9 de HTLV-I e reagem com o anticorpo monoclonal humano IH-9 caracterizado acima. De modo semelhante, pode esperar-se que o antigénio peptídico derivado de p21 de HTLV-II p21-C27 detecte especificamente infecção com HTLV-II, mas possa não identificar alguns verdadeiros positivos para HTLV-II e possa seleccionar alguns falsos positivos.

B. Péptidos de Confirmação para HTLV-I e HTLV-II 0 segundo par de antigénios peptídicos são derivados da região interna das proteínas gp46 de env de HTLV-I e de HTLV-II, e foram caracterizados na Patente U.S. de co-autoria No. 5 066 579, e no Pedido de Patente U.S. de co-autoria para "Antigénios 24 p ^^

Peptídicos para HTLV-I e HTLV-II e Métodos", No. de Série 07/653 091, arquivado em 8 de Fevereiro de 1991, sendo ambos aqui incorporados por referência. A Figura 10 apresenta, na linha superior, uma porção do genoma de HTLV-I contendo a sequência que codifica para a proteína do envelope gp46, e na linha inferior, uma porção da região que codifica para a gp46 contendo as sequências que codificam a região sobreponível dos antigénios peptídicos de HTLV-I formados de acordo com a invenção. Estes péptidos são designados MTA-4, MTA-1, e MTA-5 na Figura 11. A Figura 12 apresenta a sequência de aminoácidos do péptido MTA-1, que foi designado péptido gp46-MTA-l (SEQ ID NO: 4) derivado da proteína p46 de HTLV-I. As sequências correspondentes a regiões semelhantes da proteína p46 de HTLV-II, designadas GH2-K15 (SEQ ID NO: 6) e gp46-K55 (SEQ ID NO: 5) são também apresentadas na figura.

Os antigénios do péptido gp46 de HTLV-I e HTLV-II são produzidos de forma recombinante como proteínas de fusão da β-galactosidase a partir de bibliotecas genómicas de HTLV-I e HTLV-II, como descrito na PCT de co-autoria com o Número de Publicação WO 89/06543, publicada em 27 de Julho de 1989. Alternativamente, os péptidos podem ser produzidos como péptidos de fusão utilizando os vectores e os métodos detalhados para a produção do antigénio do péptido pl9 no Exemplo 4. Os péptidos também podem ser produzidos por métodos de síntese química em fase sólida, como discutido acima.

Presentemente, nos E.U.A., os critérios convencionais para infecção com HTLV incluem reactividade com a proteína do envelope gp46 de HTLV-I ou a proteína percursora gp68 em conjunção com a reactividade com o antigénio p24. Este teste, contudo, não distingue entre infecção com HTLV-I e com HTLV-II. Certos péptidos derivados da proteína do envelope p46 de HTLV-I demonstraram ser úteis na confirmação da infecção de um doente com HTLV-I, em conjunção com a reactividade de p24 presente no 25 t r soro, no Pedido de Patente U.S. em co-autoria previamente citado 07/653 091 para "Antigénios Peptidicos de HTLV-I e HTLV-II e Métodos" e na Patente U.S. No. 5 066 579. Estes péptidos são caracterizados como imunorreactivos com o monoclonal 0,5a produzido pela linha celular de hibridoma ATCC Número HC8755 (Matsushita). Além disso, foi demonstrado que a imunorreactividade do soro com estes péptidos derivados de gp46 são indicadores da infecção do soro com HTLV-I.

De modo semelhante, como revelado no Pedido de Patente U.S. 07/653 091, um péptido GH-K15 derivado de uma porção da molécula de gp46 de HTLV-II homóloga à região do péptido gp46-MTA-l de HTLV-I descrita acima, pode ser utilizada para confirmar a infecção de soros humanos com HTLV-II. Os péptidos gp-46-MTA-l e gp46-K15 foram previamente relatados em Pedidos de Patente em co-autoria e não fazem parte, eles próprios, da presente invenção. Contudo, o péptido gp46-K55 acima descrito, que permite níveis de expressão elevados da porção específica recombinante de HTLV-II da proteína gp46, faz parte da presente invenção.

De acordo com a presente invenção, a reactividade de anticorpos num soro de teste com o antigénio de pl9 (p. ex., pl9-C27 ou pl9-C45) ou com a região antigénica análoga de p21 de HTLV-II (p. ex., p21-C27), em conjunção com a reactividade o péptido gp46-MTA-I derivado de gp46 de HTLV-I ou com os péptidos correspondentes gp46-K55 ou GH2-K15 de gp46 específica para HTLV-II, aumenta significativamente a fiabilidade do diagnóstico de infecção com HTLV-I ou HTLV-II. C. Antigénios de HTLV-I/HTLV-II Imunodominantes

Os produtos de genes dos viriões HTLV-I e HTLV-II incluem o produto do gene gag p24, uma proteína do núcleo, e o produto gp21 do gene env, uma proteína transmembranar do envelope que são razoavelmente bem conservadas entre as duas estirpes. De acordo com os actuais critérios de diagnóstico, a 26 Γ imunorreactividade com ρ24 e uma das proteínas do envelope (normalmente a gp46) é considerada como diagnóstico de infecção com HTLV-I ou HTLV-II; contudo, este padrão de imunorreactividade resulta numa proporção significativa de falsos positivos e não distingue entre as duas estirpes. Mais recentemente, a proteína do envelope recombinante p21e derivada da gp21 de HTLV-I foi incluída como um elemento de diagnóstico do envelope no diagnóstico de infecção com HTLV (Lillehoj). Esta proteína, utilizada isoladamente ou em combinação com a p24, não distingue entre HTLV-I e HTLV-II.

Os anticorpos monoclonais desenvolvidos para apoio à presente invenção reconhecem epitopos específicos de p24, gp21/p21e, como listados na Tabela 1. Estes epitopos específicos podem ser identificados através de métodos semelhantes aos acima descritos para identificação da porção da pl9 de gag de HTLV-I que é imunorreactiva com o anticorpo IH-9. V. "Kits" de Ensaio e Métodos

Esta secção descreve formatos de "kit" representativos, úteis na pesquisa de soros humanos em relação à presença de infecção com HTLV-I ou HTLV-II e em diagnóstico diferencial entre infecções com HTLV-I e HTLV-II, utilizando os antigénios peptídicos acima descritos. A. "Kit" de Pesquisa e Ensaio A Figura 13A apresenta um "kit" de teste em fase sólida representativo, útil na pesquisa da presença de infecção com HTLV-I ou HTLV-II. Uma tira 20 de suporte sólido no "kit" inclui um apoio 22 e uma região de reacção 24 à qual estão ligados os antigénios peptídicos de HTLV-I e HTLV-II, como abaixo descrito. O apoio 22 é formado preferencialmente por um material de plástico rígido opticamente transparente não permeável. A região de reacção 24 é formada por um material aderente ao péptido, tal como polietileno ou cloreto de polivinilo, como é normalmente 27 t t utilizado em placas de ELISA, ao qual os antigénios peptidicos podem ser adsorvidos convenientemente. Alternativamente, a região 24 pode ser uma membrana, tal como uma membrana de nitrocelulose, uma membrana de nylon activado ou outra membrana derivada adequada para ligação a proteínas ou péptidos.

Após a imobilização do antigénio da região de reacção, tal como por absorção ao antigénio, a proteína restante/sítios de ligação são bloqueados por incubação com péptido não reactivo ou reagente de proteína em excesso, tal como reagente BLOTTO ou albumina de soro bovino, de acordo com métodos conhecidos na técnica.

Ainda em referência à Figura 13A, o método de detecção da presença de infecção com HTLV-I ou HTLV-II, como realizado no "kit" de teste ilustrado, inclui a presença de pelo menos três antigénios peptidicos distintos imobilizados na região de reacção, representados na figura através de símbolos diferentes, 26, 28, e 30. Qualquer um dos antigénios da proteína p24 de gag ou proteína gp21 de env, ou os seus respectivos epitopos de péptido específicos definidos através da imunorreactividade com o anticorpo monoclonal humano WA07/2G3 (p24) e o anticorpo monoclonal humano WA07/2F7 ou WA07/1E4 (gp21) descritos na

Secção III acima, está presente na região de reacção, como indicado em 26 na Figura 13A. Como descrito acima, estes antigénios são antigénios de HTLV imunodominantes e reactivos com soros de pessoas possuindo infecções com HTLV-I ou HTLV-II, mas não conseguem reconhecer todos os indivíduos seropositivos e podem também seleccionar falsos positivos. A região de reacção inclui adicionalmente antigénios peptidicos específicos para os viriões HTLV-I e HTLV-II, que se demonstrou, de acordo com a invenção que detectam indivíduos seropositivos adicionais. Como ilustrado na Figura 13A, o antigénio peptídico 28 representa um ou ambos os antigénios peptidicos pl9-C27 e gp46-MTA-l específicos para HTLV-I. O antigénio peptídico 30 representa um ou ambos os antigénios 28 p Lc, peptidicos p21-C27 e gp46-K55 específicos para HTLV-II. Isto é, a região de reacção inclui pelo menos um dos antigénios peptidicos p24 ou gp21 (ou porções imunorreactivas destes) e pelo menos um dos seguintes pares de antigénios: (1) pl9-C27 e p21-C27 ou (2) gp46-MTA-l e gp46-K55.

De acordo com a invenção, e como ilustrado na Figura 13, o soro de teste é aplicado ao "kit" de teste de modo a ficar em contacto com a zona de reacção 24. Aí, os anticorpos do soro de teste direccionados contra um ou mais dos antigénios 26, 28, 30 presentes na zona de reacção ligam-se ao antigénio. Como ilustrado na Figura 13B, o anticorpo 32 presente num soro de teste de um indivíduo infectado com HTLV-I liga-se a um ou mais dos três péptidos diferentes imobilizados na região de reacção da tira de teste. Completando a sequência de utilização do "kit" de teste como ilustrado, a tira é lavada para remover o anticorpo ligado não especificamente à zona de reacção, e um reagente de detecção, ou meios, tais como um reagente de imunoglobulina de cabra anti-humano marcado radioactivamente ou com fluorescência, no "kit", é adicionado à zona para produzir um sinal 34, como ilustrado na Figura 13C para a detecção de anticorpo ligado. O reagente de detecção pode incluir alternativamente antigénios marcados com um repórter que são imunorreactivos com os anticorpos do soro, num formato de ensaio de sanduíche do tipo descrito abaixo.

Como pode ser observado, o "kit" de pesquisa detecta todos os soros contendo os anticorpos contra p24 ou gp21 imunodominantes e, adicionalmente, os soros que não possuem anticorpo imunodominante, mas que possuem um anticorpo específico contra HTLV-I (para qualquer dos antigénios peptidicos pl9-C27 ou gp46-MTA-l) ou um anticorpo específico contra HTLV-II (para o antigénio peptídico p21-C17 ou gp46-K55).

Uma reacção positiva no "kit" de teste de pesquisa descrito não distingue entre a infecção com HTLV-I ou HTLV-I. Pode ser utilizada uma modificação do "kit" de teste de pesquisa, na qual 29

V Γ as moléculas repórter utilizadas no passo de detecção podem ser distinguidas uma da outra, com base na imunorreactividade especifica com um epitopo de HTLV-I ou HTLV-II, para discriminar entre as duas infecções. Essas moléculas repórter imunoespecificas são descritas em conjunção com uma das realizações dos "kits" de teste de confirmação de HTLV, abaixo. B. "Kits" de Confirmação e Ensaios

As Figuras 14A-14D ilustram um "kit" de teste e ensaio para a identificação positiva de infecção com HTLV-I num soro humano seropositivo para HTLV. 0 "kit" de teste inclui uma tira de suporte sólido 34 possuindo um apoio 36 e zonas de reacção 38 e 40 nas quais são imobilizados antigénios das regiões especificas de HTLV-I da proteína pl9 de gag (indicado em 42 na região 38) e da proteína p46 de env (indicado em 44 na região 40) . Como ilustrado numa realização preferida, o antigénio 42 de pl9 contém o epitopo formado pela sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, que é imunorreactivo com o anticorpo monoclonal humano IH-9, e o antigénio p46 contém o epitopo formado pelas sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4.

De acordo com o método de ensaio e o "kit" de teste ilustrado nas Figuras 14A-14C, um soro de teste humano é colocado em contacto com as zonas de reacção 38 e 40, e os anticorpos 46, 48 presentes no soro ligam-se aos antigénios 42 e 44, respectivamente. A detecção de imunoglobulinas humanas ligadas é realizada através da adição de um reagente de detecção, ou meios, tais como um anticorpo de cabra anti-humano marcado, para produzir os sinais de detecção 50, 52 ilustrados na Figura 14C. A confirmação da imunorreactividade de HTLV-I com ambos os antigénios serve como identificação positiva de infecção com HTLV-I de dador humano do soro de teste.

Alternativamente, o reagente de detecção pode incluir um antigénio do péptido pl9 de HTLV-I contendo o epitopo formado pela sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, e marcado com um 30

V

u

t repórter detectável, e (b) um antigénio do péptido gp46 de HTLV-I contendo o epitopo formado pela sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4 e marcado com um repórter detectável.

Um "kit" semelhante para a identificação positiva de infecção com HTLV-II inclui, como o antigénio identificado em 42 nas Figuras 14A-C, um antigénio p21-C27 de HTLV-II contendo o epitopo formado pela sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3; e como o antigénio identificado em 44 nas figuras, um antigénio do péptido gp46-K55 de HTLV-II contendo o epitopo formado pela sequência de aminoácidos SEQ ID NO:5.

Pode ainda ser considerado que os antigénios específicos de HTLV-II, descritos em relação à Figura 14 acima, podem estar ambos presentes numa única zona de reacção 58 integrada num apoio 56 numa tira 54 como ilustrado na Figura 15A. Nesta realização, o antigénio 62 representa o antigénio do péptido pl9 específico para HTLV-I descrito acima, e o antigénio 64 representa um péptido derivado de p46 específico para HTLV-I também descrito acima. Alternativamente, os antigénios de teste 62, 64 podem ser os antigénios correspondentes de p21 e gp46 de HTLV-II, como acima. A Figura 15B apresenta uma vista lateral ampliada da zona de reacção 58, com os antigénios de pl9 e p46 ligados, e os anticorpos de soro humano 66, 68 ligados, após o contacto da tira de reacção com soro de teste humano positivo para HTLV-I. Após fazer reagir os anticorpos com uma região de reacção na tira, a tira de teste é feita reagir com um reagente de detecção, ou por meios incluídos no "kit". 0 reagente de detecção inclui um antigénio do péptido pl9 de HTLV-I contendo o epitopo formado pela sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, e marcado com um repórter detectável, e (b) um antigénio de péptido gp46 de HTLV-I contendo o epitopo formado pela sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4 e marcado com um repórter detectável. A molécula de detecção pl9, indicada em 70, inclui um repórter (*) indicado em 72, e a molécula de 31

t detecção de MTA-1, indicada em 74, inclui um repórter (#) indicado em 76. Os dois repórteres são distinguíveis quando ligados a uma região comum. Repórteres exemplificativos incluem dois repórteres fluorescentes distinguíveis possuindo picos diferentes de absorção/emissão, tais como utilizados normalmente em sequenciação de ADN. A Figura 16 ilustra um "kit" 78 para a identificação positiva de infecção com HTLV-I e HTLV-II numa amostra de soro humano. Aqui, o suporte sólido 80 inclui quatro zonas de reacção 82, 84, 86, 88. Cada zona de reacção contém, nela imobilizada, um dos antigénios específicos de HTLV-I ou de HTLV-II discutidos acima. Como ilustrado, a zona de reacção 82 contém o antigénio de pl9 90, a zona de reacção 84 contém o antigénio do péptido p2i*** 92, a zona de reacção 86 contém o antigénio do péptido MTA-1 94, e a zona de reacção 8 8 contém o antigénio do péptido K55 96. Os métodos para colocar em contacto os soros de teste humano e as moléculas repórter com o "kit" de teste são como descrito para os "kits" de teste ilustrados nas Figuras 13-15, acima. A confirmação positiva de infecção com HTLV-I é realizada quando um sinal detectável específico para imunoglobulina é detectado nas regiões 90 e 94; a identificação positiva de infecção com HTLV-II pode ser realizada quando é detectado um sinal positivo nas regiões 92 e 96. V. Composição de Vacina e Método

Esta secção descreve a utilização dos anticorpos monoclonais (MAbs) de humano anti-HTLV-I descritos na Secção II para utilização em imunoprofilaxia e para identificar antigénios peptídicos que são eficazes em composições de vacina para imunizar humanos contra infecção com HTLV-I. A. Imunoprofilaxia É ainda descrita uma composição de vacina de anticorpo eficaz na neutralização de infecção com HTLV-I, como evidenciado 32 I . I--

« pela capacidade dos anticorpos da composição se ligarem a células de cultura infectadas com HTLV-I. Nesta abordagem, os MAbs humanos específicos contra antigénios de HTLV-I que são expressos na superfície das infectadas com HTLV-I são administrados na corrente sanguínea de um indivíduo infectado. A ligação destes anticorpos a células infectadas com HTLV-I provocam então uma resposta imunitária humoral na qual os macrófagos destroem os linfócitos B possuindo anticorpos anti-HTLV-I.

Os anticorpos na composição incluem um ou mais dos descritos acima que se demonstrou possuírem níveis elevados de ligação a células em cultura infectadas com HTLV-I como descrito acima (Tabela I) . Estes incluem os anticorpos monoclonais designados como WA07/2F7, WA08/2E9, WA07,2G3, WA04/2B10,

Wa07/1G7, WA07/2D3, WA07/2F9, WA11/1F5, e WA11/2F3. Os anticorpos são obtidos como anticorpos monoclonais humanos, como detalhado acima.

Os anticorpos anti-HTLV-I são formulados numa solução adequada para injecção, tipicamente através de via parentérica, para formar a composição de vacina. A vacinação pode ser anterior a uma infecção esperada, ou no tratamento de uma infecção existente. Numa aplicação geral, crianças cujas mães sejam diagnosticadas como possuindo HTLV-I são injectadas com a composição de anticorpo, para evitar o desenvolvimento da infecção virai, particularmente quando a criança é amamentada durante um período extenso. Os anticorpos podem ser administrados parentericamente, p. ex., intramuscularmente, subcutaneamente, ou intravenosamente, ou no caso de crianças, também através de administração oral, num método para tratamento ou prevenção de HTLV-I através de profilaxia por imunização. B. Composição de Vacina de Antigénio Peptídico É também descrita uma composição de vacina de antigénio peptídico para utilização na imunização de um indivíduo contra 33

infecção com HTLV-I. A composição de vacina inclui antigénio(s) peptídico(s) que são imunorreactivos com um ou mais dos anticorpos neutralizantes WA07/2F7, WA08/2E9, WA07,2G3, WA11/2E2, WA04/2B10, WA07/1G7, WA07/2D3, WA07/2F9, WA11/1F5, e WA11/2F3 descritos acima. Um destes péptidos imunorreactivos é o antigénio peptidico pl9-C27 ou pl9-C45 acima, derivado da região C-terminal da proteína pl9 de gag de HTLV-I.

Os antigénios peptídicos imunorreactivos adequados para os anticorpos monoclonais humanos acima podem ser substancialmente identificados como descrito para o antigénio de pl9. Resumidamente, é formada uma biblioteca de fragmentos genómicos de HTLV-I capazes de se expressarem num sistema de hospedeiro adequado, péptidos de HTLV-I, preferencialmente dentro do intervalo de cerca de 30-100 aminoácidos. Um sistema de expressão preferido é o vector de biblioteca gtll que produz uma proteína de fusão com inserções genómicas. A biblioteca é pesquisada com cada um dos MAbs acima para identificar os vectores de expressão cujos fragmentos genómicos expressos são imunorreactivos com os péptidos. Após a subclonagem para isolar os clones da biblioteca que sintetizam péptidos imunorreactivos, o fragmento genómico clonado pode ser ainda fragmentado para realizar um mapa detalhado do antigénio peptidico que contém o epitopo imunorreactivo.

Os péptidos antigénicos, uma vez identificados, podem ser ligados covalentemente a uma proteína transportadora, tal como uma hemocianina de lapa, e injectados ou numa forma de solução ou em combinação com um adjuvante. Alternativamente, nos casos em que o antigénio de HTLV-I é preparado como parte de uma proteína de fusão, a parte não HTLV da proteína pode servir como proteína transportadora. A proteína de fusão derivada é transportada num veículo farmaceuticamente aceitável, tal como em solução ou num adjuvante, tal como um alúmen convertido.

Alternativamente, o próprio antigénio peptidico livre pode ser formulado em alúmen ou utilizado sem adjuvante. Uma vacina 34

jJUK com adjuvante adequada possui uma concentração de antigénio preferida de cerca de 1 mg de antigénio peptidico/mg de alúmen, mas não excedendo 80 μ de alúmen por injecção.

Uma tal composição de vacina pode ser utilizada num método de inibição de infecção de um indivíduo com o vírus HTLV-I, através da administração ao sujeito, por injecção parentérica, da composição de vacina do antigénio peptídico descrita acima.

Uma composição de vacina preferida, para utilização no método é aquela em que o antigénio de HTLV-I inclui a sequência nos péptidos identificada como a Sequência ID No. 1.

Os exemplos seguintes ilustram a presente invenção.

Materiais e Métodos Materiais Células e Meios: (FONTES, Condições de crescimento) Meios de cultura de células (PFHM, RPMI, IMDM) foram obtidos de Gibco Laboratories (Grand Island, Nova Iorque). As células B activadas com EBV, o heteromieloma de murganho-humano H72C11 (gentilmente fornecido por J. Larrick, GLI, Redwood City, CA, EUA), e os hibridomas foram cultivados numa incubadora a 37°C com CO2 a 6-6½% em Meio de Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM, Gibco, Grand Island, NY, EUA) . Para a activação de células B, foram isolados linfócitos de sangue periférico por centrifugação em gradiente de Hypaque-Ficoll (Boyum, 1968). As células B foram separadas das células T por formação de roseta com células de glóbulos vermelhos sanguíneos de carneiro tratadas com AET (Saxon et al., 1976) e activadas com EBV a partir da linha celular de sagui B95-8, como previamente descrito (Perkins et al., 1989).

Os meios de fusão continham 1 mg/mL de albumina do soro bovino pura (Serva Biochemicals, Westbury, NY, EUA), acetato de Mg2+ a 0,5 mM (E. M. Science). Foi utilizado sorbitol (E. M. Science) num intervalo de concentrações para variar a 35 Γ osmolaridade. 0 meio isoosmolar (300 L3) contém sorbitol a 280 mM para uma osmolaridade final de 300 mOsmol. O meio hipoosmolar (75 L3 e 100 L3) contém sorbitol a 70 e a 93 mM para osmolaridades finais de 75 e 100 mOsmol, respectivamente.

As células MT-2 (Miwoshi) são infectadas com o vírus HTLV-I.

As células MO-T são uma linha celular infectada com HTLV-II descrita por Chen. A construção de células de heteromieloma de murganho-humano K6H6-B5 é descrita por Carroll; estas células foram obtidas do Dr. Ronald Levy, Departamento de Medicina, Stanford University Medicai School, CA 94305.

Os anti-soros isolados em experiências de apoio à invenção incluíram um painel bem caracterizado de soros de 32 indivíduos infectados com HTLV-I e 32 infectados com HTLV-II, como descrito por Lipka. Todos os soros HTLV-I e a maior parte dos HTLV-II possuem perfis de anticorpo que vão ao encontro dos critérios convencionais para infecção com HTLV (anticorpos para as proteínas de p24 de gag e gp46 e/ou gp68 de env) . Adicionalmente, os soros foram tipados como estando infectados com HTLV-I tanto através de reactividade positiva em relação ao antigénio de HTLV-I recombinante MTA-1, um antigénio recombinante contendo os aminoácidos 163-209 da proteína gp46 de HTLV-I (Lipka) como através de análise por PCR utilizando iniciadores de oligonucleótidos e sondas específicos para HTLV-I.

De forma semelhante, 32 indivíduos infectados com HTLV-II foram identificados pela sua reactividade em relação ao antigénio recombinante de HTLV-II K55 e através de PCR utilizando iniciadores e sondas específicos para HTLV-II. Os antigénios recombinantes contendo o epitopo reconhecido pelo HMAb IH-9 também foram testados em relação à sua reactividade com soros negativos para HTLV e amostras de soro indeterminadas para HTLV. Todos os soros indeterminados foram reactivos com 36

V

u testes de pesquisa de HTLV comercialmente disponíveis, mas foram negativos para ADN de HTLV quando testados por PCR utilizando iniciadores e sondas específicos para HTLV-I e HTLV-II (Kwok, Lipka, 1991). Estes soros incluíram soros com anticorpos dirigidos para p24 de HTLV-I, antigénio recombinante p21E, e 18 soros que reagiram com HTLV-I, quando testado com o antigénio (Lipka, 1991). Foram obtidos soros de indivíduos infectados com HTLV-I e HTLV-II de várias fontes, incluindo o Stanford University Blood Bank, assim como de outros bancos de sangue dos EUA. Todas as amostras de soro indeterminadas para HTLV-I e não infectadas foram do Stanford University Blood Bank. 0 anti-soro de coelho anti-transferase da glutationa foi produzido em coelhos brancos da Nova Zelândia. Este anti-soro foi produzido por encomenda por Joslyn Laboratories, Santa Rosa, CA, utilizando transferase de glutationa não recombinante (Sigma) como antigénio.

Exemplo 1

Isolamento e Activaçâo de Linfócitos B Periféricos de Indivíduos Infectados com HTLV-I com Epstein-Barr

Foram isolados linfócitos do sangue periférico (PBL) de um indivíduo não sintomático infectado com HTLV-I e activados com o vírus Epstein-Barr (EBV) essencialmente como descrito por Foung e Perkins como abaixo descrito. A. Isolamento de Linfócitos

Amostras de sangue total (15 mL) foram centrifugadas a 2000 rpm durante 5 minutos numa centrífuga clínica. O plasma sobrenadante foi removido, e as células compactadas (5-10 mL de volume compacto) foram ressuspendidas em 35 mL de meio RPMI. A suspensão de células foi coberta com 13 mL de Histopaque (Sigma), e então centrifugada a 2500 rpm durante 25 minutos. As células presentes numa camada de interface túrbida (entre Histopaque e tampão) foram recolhidas, suspendidas em RPMI, e 37 τ

V Γ centrifugadas (1000 rpm, 10 min). As células centrifugadas (PBL) foram então ressuspendidas em RPMI contendo soro de vitela fetal a 10% (FCS) para uma concentração final de células de cerca de 3xl06 células/mL. B. Isolamento de PBLs empobrecidos em monócitos

Os monócitos presentes na fracção PBL foram subtraídos da fracção por incubação da suspensão de PBL em vários frascos T de cultura grandes a 37°C durante 60 minutos. As células não aderentes foram recolhidas por aspiração, depois centrifugadas (1000 rpm, 10 min). Os sedimentos de células, foram suspendidos em RPMI + FCS a 10% a uma concentração de aproximadamente 5xl06 células/mL. C. Empobrecimento de linfócitos T de PBLs por formação de roseta

Uma fracção de glóbulos vermelhos de carneiro (SRBC) foi adquirida a Colorado Serum Company. Cinco mililitros de SRBC tratados com AET foram adicionados a PBLs suspendidos em RPMI + FCS a 10%, como acima descrito, e a mistura foi centrifugada a 200 rpm durante 5 minutos numa centrífuga clínica, depois colocada em gelo durante 30 minutos. O sedimento foi suavemente misturado, com o sobrenadante, depois coberto com uma camada de Histopaque, seguido por centrifugação a 2500 rpm durante 30 minutos. Os linfócitos E (linfócitos B) foram recolhidos da interface entre a Histopaque e o tampão e foram suspendidos em RPMI. A suspensão de células B foi centrifugada (1000 rpm, 10 minutos) e o sedimento de células resultante foi suspendido para uma concentração de aproximadamente 5xl06 células/mL em IMDM + FCS a 30%. D. Activação de Linfócitos B com Vírus Epstein-Barr (EBV)

Os linfócitos B foram suspendidos em IMDM + FCS a 30%, depois misturados com 1 mL de sobrenadante de cultura de uma cultura de células de sagui (B958) infectadas com EBV (Perkins 1989). 38 r

As células activadas foram plaqueadas a uma densidade de 104 células por poço numa placa de cultura de células de 96 poços (Corning, Corning, NY) num meio consistindo de IMDM, soro de vitela fetal a 30%, e mercaptoetanol a 2%. Após 17 dias em cultura, a actividade de IgG anti-HTLV-1 especifica foi avaliada utilizando um imunoensaio baseado em enzimas num lisado virai de HTLV-I, descrito no Exemplo 2.

Exemplo 2

Ensaio de Imunoglobulinas anti-HTLV-I e anti-HTLV-II

A. Imunoensaio baseado em Enzima de lisados de HTLV-I e HTLV-II

Os imunoensaios baseados em enzima de lisados virais de HTLV-I foram obtidos de fontes comerciais (ou Abbott Laboratories, North Chicago, II ou Dupont, Wilmington, DE) e os ensaios foram efectuados seguindo as instruções dos fabricantes.

B. Análise de Transferência de Western de Anticorpos anti-HTLV-I

A especificidade antigénica de anticorpos monoclonais anti-HTLV-I foi determinada utilizando um lisado virai de HTLV-I baseado em Transferência de Western (WB). 0 lisado virai de HTLV-I foi derivado de uma linha celular MT-2 infectada com HTLV-I e o lisado virai de HTLV-II da linha de células MoT foi obtido de Hillcrest Biologicals (Cypress, CA).

Após electroforese (SDS-PAGE), as proteinas separadas no gel foram transferidas para papel de filtro de nitrocelulose (Schleicher and Schuell), essencialmente como descrito por Lipka. A transferência para nitrocelulose foi incubada durante a noite à temperatura ambiente com o sobrenadante da cultura de hibridoma ou com anti-soros infectados com HTLV-I ou de controlo diluídos em blotto (Tris-HCl a 10 mM, pH 7,4, leite em pó magro a 5%, soros de cabra normais a 2,5%, e Tween-20 a 0,5%). As tiras da transferência em nitrocelulose foram lavadas 3 vezes 39

u >>—Ç com tampão de lavagem (TRIS-HC1 a 10 mM pH 7,4, Tween-20 a 0,05%) durante 5 minutos cada. A imunoglobulina G humana ligada (IgG) foi detectada através de incubação de 1 hora com IgG de cabra anti-humana conjugada com fosfatase alcalina (Immun-Blot, Bio-Rad), durante 1 hora. Isto foi seguido por mais três lavagens de cinco minutos. O segundo anticorpo ligado foi detectado por incubação das tiras numa solução de substrato contendo fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP) e Nitroblue tetrazólio (NBT) em TRIS-HC1 a 100 mM, pH 9,5, e MgCl2 a 50 mM. C. Detecção da ligação de anticorpo a células infectadas com HTLV-I e HTLV-II por imunofluorescência

As células MT-2 são uma linha de células infectada com HTLV-I descrita por Miyoshi. As células MO-T são uma linha de células infectada com HTLV-II descrita por Chen.

Imunofluorescência de MT-2. Células MT-2 foram co-cultivadas com células H-9 a uma proporção de 1:3 (MT-2:H-9) em lâminas de microscópio em meio RPMI suplementado com soro de vitela fetal a 10% até à confluência, depois armazenadas congeladas a -72°C até utilização. As lâminas foram secas ao ar, depois fixadas com 90% de acetona e água.

Os anticorpos controlo (0,5α, ΤΟ/χ, e 1B4) foram diluídos a uma concentração de 1 μg/mL em salino tamponado com fosfato, misturados uns com os outros, e a mistura adicionada a sobrenadantes de hibridomas de teste. Os sobrenadantes de hibridomas de teste (35 μΤ) incluindo a mistura de anticorpos controlo foram então adicionados para separar áreas de células em lâminas. As lâminas foram incubadas a 37°C durante 30 minutos numa câmara húmida. Após incubação, a solução em excesso foi aspirada das células. As lâminas foram lavadas por imersão durante 5 minutos num prato de lâminas de PBS, com agitação, depois secas ao ar. 40

0 segundo anticorpo (anti-humano de cabra específico para cadeia γ de IgG conjugado com FITC; TAGO, Burlingame, CA) foi diluído 1:1000 em corante azul de Evan, e 25 μΙ, foram adicionados a cada área de células. As lâminas foram então incubadas a 37°C durante 30 minutos numa câmara húmida escura. O excesso de solução de segundo anticorpo foi aspirado e as lâminas foram lavadas em PBS como antes, depois secas ao ar. As lamelas foram montadas sobre as lâminas em glicerol a 90%, utilizando 4 μύ de meio de montagem por área de células. As lamelas foram seladas com verniz das unhas transparente.

As células foram examinadas num microscópio de fluorescência quanto à presença de anticorpo anti-HTLV-I humano, como relatado por marcação por fluorescência.

Imunofluorescência de MO-T. A detecção de imunofluorescência de anticorpos anti-HTLV-II humanos ligados a células MO-T foi efectuada essencialmente como descrito acima para as células MT-2.

Os resultados dos ensaios de imunofluorescência estão tabulados na Tabela 1. D. Ensaio de HTLV-I em Células Vivas Células MT-2 infectadas com HTLV-I foram cultivadas num frasco de cultura de tecidos em meio RPMI suplementado com soro de vitela fetal a 10%. As células foram retiradas do frasco e recolhidas por centrifugação a 2000 rpm durante 10 minutos numa centrífuga clínica. As células foram suspendidas em meio de coloração (PBS + soro de vitela fetal a 1% + azida de sódio a 0,1%). As células foram de novo centrifugadas, ressuspendidas a 1 x 106 células/100 μι de meio de coloração, e fraccionadas a uma densidade de 1 x 106 células por tubo de teste. Foram adicionados sobrenadantes de hibridoma contendo anticorpos monoclonais humanos de teste a cada tubo de teste (100 μL/tubo) . Os tubos foram incubados em gelo durante 45 minutos, diluídos então com 0,8 mL/tubo de meio de coloração, e centrifugados 41 r L-Cj durante 10 minutos a 2000 rpm numa centrífuga clínica. Os sobrenadantes foram aspirados, as células foram ressuspendidas em 100 pL de meio de coloração, e foi adicionado anticorpo anti-humano de cabra conjugado com FITC (diluição de 1:32, TAGO) a cada tubo. A incubação foi efectuada durante 45 minutos num banho de gelo. Um mL de solução de coloração foi então adicionado a cada tubo, como lavagem, e os tubos foram centrifugados a 2000 rpm durante 10 minutos como acima. As células foram então ressuspendidas em 1 mL de fixador (formaldeído) e analisadas quanto a marcador fluorescente ligado por citometria de fluxo.

Exemplo 3

Produção de células de Hibridoma A. Produção de Parceiros de Fusão para Heteromieloma

As células de heteromieloma foram produzidas por fusão de linfócitos humanos activados com EBV, segregando IgG aleatoriamente (i.e. linfócitos isolados a partir de dador não infectado) com células NS-1 de murganho, utilizando um paradigma de fusão com polietilenoglicol bem conhecido na técnica (Mishell) . As células NS-1 são uma linha celular de mieloma de murganho não secretoras, tal como ATCC TIB18. A fusão dos linfócitos humanos activados com células NS-1 resultam numa linha celular de heteromieloma de parceiro de fusão estável, denominada H73C11 (Perkins, 1991) fornecido por J. Larrick, GeneLabs Inc., Redwood City, CA. B. Electrofusão de células parceiras de heteromieloma com linfócitos activados.

As células activadas e cultivadas como descrito no Exemplo 1 que exibiram actividade anti-HTLV-I no imunoensaio baseado em enzima do lisado de HTLV-I (Exemplo 2) foram utilizadas para a produção de hibridomas. Aproximadamente 105 células B activadas com EBV foram combinadas com 2 x 105 células de heteromieloma de 42 Γ u murganho-humano K6H6-B5. A fusão de cerca de 105 células activadas com EBV com células de heteromieloma foi alcançada através de fusão de células induzida por campo eléctrico utilizando condições hipoosmolares, essencialmente como descrito por Perkins (1991) como delineado abaixo.

Todos os passos foram realizados à temperatura ambiente. A corrente eléctrica foi aplicada ou com um Z1000 Zimmermann Cell Fusion System (GCA) ou com um Bioject CF (Biomed, Theres, FRG) . Foi primeiro determinado um intervalo aproximado de parâmetros de fusão através da observação do processo de fusão microscopicamente numa câmara de fusão aberta. A câmara aberta consiste em dois eléctrodos de platina paralelos de 200 μιη de diâmetro e afastados em 200 μιη fixos a uma lâmina de vidro (GCA/Precision Science Group, Chicago, IL, EUA, e câmaras fabricadas na oficina de mecânica do Instituto de Biotecnologia da Universidade de Wurzburg) (Perkins et al., 1987).

Com base nos resultados observados na câmara aberta, as fusões foram realizadas em condições estéreis em câmaras de fusão helicoidais. Estas câmaras são compostas por um sistema de eléctrodos contendo os mesmos eléctrodos de platina enrolados numa hélice, e um receptáculo para suportar as células (GCA, e fabricado na oficina de mecânica do Instituto de Biotecnologia, Universidade de Wurzburg). O heteromieloma K6H6 e as células activadas por EBV foram reunidas, centrifugadas e lavadas uma vez em meio de fusão isoosmolar (300 L3) a 106 células/mL cobertas por uma camada de igual volume de 300 L3. As células foram ressuspendidas em meio de fusão hipoosmolar e colocadas nas câmaras helicoidais (170- até 250-μΕ de volume, dependendo da câmara especifica utilizada). Após 5-15 minutos no meio hipoosmolar, foi aplicada uma corrente eléctrica. As células foram primeiro alinhadas durante 30 s num campo alternado não uniforme de 1 MHz a 300 V/cm; então foi aplicada corrente directa de alta intensidade e duração curta (10-15 μβ) para promover a fusão; e finalmente o alinhamento foi gradualmente 43 j~ ^ ^^ afunilado até ao limite durante 30 s após fusão. As células foram retiradas da câmara por lavagem 10-15 minutos após fusão, e plaqueadas em placas de microtitulação de 96 poços em meio de pré-selecção contendo IMDM completo sem indicador de pH (Gibco), soro de vitela fetal a 15%, hipoxantina a 100 μΜ (Sigma, St. Louis, MO, EUA) , e timidina a 15 μΜ (Sigma) . Cada população de células isoladamente, bem como as células misturadas passadas através de alterações de meio mas não fundidas foram plaqueadas como controlo. Após 24 h, as células foram alimentadas com meio de selecção consistindo em meio de pré-selecção contendo vermelho de fenol como um indicador de pH com a adição de aminopterina a 0,8 μΜ (Sigma) e ouabaina a 0,1 μΜ (Sigma). Os híbridos foram cultivados durante 2 semanas em meio de selecção, e depois regressaram ao meio de pré-selecção contendo o indicador de pH.

Após não aparecerem novos híbridos nos poços novos (aproximadamente 5 semanas), o número de poços com crescimento e o intervalo no número de colónias/poço foram determinados. A eficiência da formação de hibridomas foi calculada através da multiplicação do número de poços e colónias e do potencial para contar erros. Este intervalo relativo tenta incorporar alguma da incerteza e variação inerentes na contagem de grande número de poços com grande número de colónias que nem sempre eram claramente delineados.

Os hibridomas humanos cresceram em 57/60 poços com uma eficiência de formação de hibridomas de 114-285 por entrada de 105 células B. As culturas foram testadas em relação à actividade anti-HTLV-I utilizando o imunoensaio baseado em enzima do lisado de HTLV-I (Exemplo 2) . Um dos poços contendo crescimento de hibridoma foi positivo para a presença de imunoglobulina anti-HTLV-I no meio de cultura. Esta cultura foi clonada por diluição limite para assegurar a monoclonalidade (Mishell). 44 Γ

Exemplo 4

Produção de Epitopos Recombinantes A. Construção de proteínas de epitopo de fusão bacterianas

Os iniciadores de oligonucleótidos foram concebidos para amplificar porções seleccionadas de pl9 de HTLV-I (Figura 4) . Sete destes iniciadores foram sintetizados num sintetizador de ADN automático (Applied Biosystems, Foster City, CA) , seguindo as instruções do fabricante. Cada um dos iniciadores continha um sítio de EcoRI localizado na sua extremidade 5' para facilitar a clonagem das moléculas de ADN amplificadas. Os iniciadores foram construídos para facilitar a recuperação da grelha de leitura aberta da pl9 de HTLV-I como na inserção em grelha no sistema de expressão de pGEX (Pharmacia) (Smith).

As extremidades 5' e 3' das sequências de ADN de HTLV-I dos vários antigénios recombinantes de pl9 de HTLV-I foram seleccionados com base nos perfis de hidrofilicidade da pl9 de HTLV-I como determinado pelo conjunto de programas informáticos PC-Gene (Intelligenetics, Mountain View, CA). A reacção da polimerase em cadeia (PCR) foi realizada de acordo com as instruções do fabricante (Perkin-Elmer/Cetus). Cada reacção de PCR continha 2 ng do clone de HTLV-I sp65 MT-2, um clone molecular de comprimento total da estirpe Seiki de HTLV-I clonado num vector plasmídico PSP65 (fornecido pelo Dr. F. Wong-Staal, NIH; ProMega, Madison, WI) como molde e 1,0 μΜ do iniciador oligonucleotídico apropriado. A amplificação por PCR foi realizada durante 25 ciclos de desnaturação do molde (1 minuto a 94°C), emparelhamento do iniciador (2 minutos a 50°C), e extensão do iniciador (2 minutos a 72°C). Os ADNs amplificados foram purificados e digeridos durante a noite com EcoRI. Os ADNs digeridos foram ligados no sítio EcoRI do vector pGEX-2 (Pharmacia), utilizando ligase de ADN (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN).

As moléculas de ADN ligadas resultantes foram utilizadas 45 Γ u

para transformar a estirpe de E. coli competente JM-101 (Messing) utilizando técnicas convencionais (Sambrook). Os ADNs plasmidicos de colónias transformadas foram analisados quanto à presença de inserções por digestão quer com Eco RI (que liberta a inserção clonada) e/ou Sca I. A Sca I corta os vectores pGEX em dois sítios localizados 111 pares de bases (pb) a jusante e 720 pb a montante do sítio de Eco RI único e facilita a identificação de clones que contêm inserções pequenas 150 pb) .

As bactérias transformadas com um plasmídeo contendo uma inserção foram pesquisadas em relação à orientação correcta e à produção de proteína através de análise por transferência de Western de lisados de células totais preparados a partir de culturas de 2 mL das E. coli transformadas. Os lisados de células totais foram preparados como se segue: Uma cultura realizada durante a noite cultivada em Caldo de Luria (LB) suplementado com ampicilina a 100 μg/mL foi diluída 1/10 em 2 mL de LB fresco suplementado com ampicilina e cultivada durante 1 hora a 37°C. A expressão da proteína de fusão recombinante foi induzida através da adição de 5 μL de tiogalactósido de isopropilo a 0,1 M (IPTG) a cada cultura. As células foram cultivadas a 37°C durante mais 3-4 horas após as quais foram sedimentadas por centrifugação em microcentrífuga fracções de 2 mL das culturas. As células sedimentadas foram ressuspendidas em 100 μί de MTBS (NaCl a 150 mM, Fosfato de Sódio a 20 mM, pH 8,0), ao qual foi adicionado 100 μι de SB a 2X (β-mercaptoetanol a 10%, glicerol a 20%, dodecilsulfato de sódio a 4,6% (SDS) , e Tris-HCl a 125 mM pH 6,8). As amostras foram fervidas durante 5 minutos e os resíduos foram sedimentados por centrifugação durante 5 minutos numa microcentrífuga. As fracções das amostras fervidas foram subsequentemente fraccionadas por electroforese em gel de Poliacrilamida na presença de dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE, 23) utilizando géis de acrilamida a 12%. As proteínas fraccionadas ou foram coradas com azul de Coomassie ou 46 p U ^-ξ· transferidas para papel de filtro de nitrocelulose (Schleicher and Schuell) para transferência de Western. As transferências de Western foram pesquisadas com o HMAb IH-9 e/ou uma variedade de snti-soros de indivíduos infectados e não infectados com HTLV-I. A produção de proteínas recombinantes não contendo regiões imunogénicas de pl9 de HTLV-I foi confirmada através da utilização de um anti-soro de coelho contendo anticorpos dirigidos contra a transferase S da glutationa (produzido em Coelhos Brancos New Zealand utilizando transferase S da glutationa como antigénio; Joslyn laboratories, Santa Rosa, CA). B. Purificação de epitopos de antigénio de proteína de fusão recombinante A purificação de proteína de fusão recombinante foi realizada essencialmente como descrito por Smith. Resumidamente, uma cultura de 10 mL realizada durante a noite de bactérias contendo o plasmídeo recombinante de interesse foi diluída 1/100 em frascos contendo 500 mL de meio NZYDT (Sambrook) contendo 100 μg/mL de ampicilina. As culturas foram cultivadas até que a absorvência a 600 nm medida no sobrenadante não diluído fosse aproximadamente de 0,5. A produção de proteína de fusão foi induzida através da adição de tiogalactosidase de isopropilo (IPTG) para uma concentração final de 0,2 mM. As culturas foram incubadas durante mais 3 a 4 horas, depois as bactérias foram

sedimentadas por centrifugação a 5000 x g durante 10 minutos. As células bacterianas foram ressuspendidas em 20 mililitros de tampão isotónico frio (MTBS) por cada litro de cultura. As bactérias foram lisadas por 2 passos através de uma Prensa Francesa (Amicon) a uma pressão de 1200. Após a lise, as proteínas foram solubilizadas através da adição de Triton-X100 (Sigma) para uma concentração final de 1,0%. Foram também adicionadas ADNase I e aprotinina desta vez para atingir as concentrações finais de 1 pg/mL e 1,0%, respectivamente. A fracção de sobrenadante foi então incubada durante 5 minutos a 47

25°C, e os resíduos celulares insolúveis foram sedimentados por centrifugação duas vezes a 10 000 x g durante 10 minutos. O sobrenadante foi reservado, e o sedimento foi ressuspendido em 20 mL de MTBS por cada litro de cultura original. Foram analisadas alíquotas tanto da fracção do sedimento como da do sobrenadante por SDS-PAGE para determinar se as proteínas recombinantes foram solubilizadas pelo procedimento acima. Foram encontradas quantidades significativas da proteína recombinante pR45 na fracção do sobrenadante. O sobrenadante foi então passado através de uma coluna contendo 0,8 mL de agarose de glutationa (Pharmacia), que foi pré-tratada como recomendado pelo fabricante. A coluna foi lavada com 10 mL de MTBS contendo Triton a 1% e aprotinina a 1%. Seguiu-se uma lavagem de 3 mL com MTBS isolado. As proteínas ligadas foram eluídas com tampão contendo glutationa a 5 mM em Tris a 50 mM pH 8,0. Foram recolhidas dez fracções (aproximadamente 1 mL cada). A localização do pico da proteína eluída foi determinado por medição da absorvência a 280 nm de cada fracção. Adicionalmente, foi realizada análise de SDS-PAGE em alíquotas de cada fracção. As fracções contendo quantidades significativas de proteína foram recolhidas, e alíquotas deste conjunto foram congeladas a -70°C para análise subsequente.

Exemplo 5

Localização de Epitopo de Antigénio Específico para o Anticorpo

Monoclonal humano IH-9

Foram construídos seis clones recombinantes contendo várias porções de pl9 de HTLV-I expressas como proteínas de fusão com transferase S de glutationa utilizando métodos descritos no Exemplo 4. Os lisados de células totais de bactérias transformadas com cada uma das proteínas recombinantes de pl9 de HTLV-I foram preparados como descrito no Exemplo 4 e fraccionados por SDS PAGE. Os géis resultantes foram 48 j- L·, ^—ç. transferidos para nitrocelulose utilizando uma unidades Transphor da Hoefer (Hoefer Scientific Instruments, São

Francisco, CA). As transferências para nitrocelulose resultantes foram bloqueadas através de uma incubação de 4 horas em BLOTTO (TRIS-HC1 a 10 mM, pH 7,5, Tween-20 a 0,05%). As transferências de Western foram incubadas durante a noite a 25°C com o sobrenadante de uma cultura activa das células secretoras IH-9 diluídas 1:2 em BLOTTO. As transferências de Western foram removidas do sobrenadante de IH-9 e lavadas três vezes a 25°C durante 5 minutos cada. As transferências foram incubadas durante uma hora a 25°C com IgG de cabra anti-humana conjugada com fosfatase alcalina (ProMega) diluída 1/7500 em BLOTTO. Seguiu-se outro conjunto de 4 lavagens de 5 minutos do substrato com salino tamponado com Tris. O segundo anticorpo ligado foi detectado através da incubação das tiras numa solução de substrato contendo fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP) e Nitroblue tetrazólio (NBT) em Tris-HCl a 100 mM, pH 9,5 e MgCl2 a 50 mM. Os antigénios de proteína de fusão recombinantes pl9-R45 e pl9-LB27 foram claramente identificados através do sobrenadante do anticorpo monoclonal IH-9 (Figura 6) . Foi também observada uma imunorreactividade fraca do HMAb IH-9 em relação ao recombinante de pl9 de HTLV-I pl9-FL130 (pista c) . Não foi observada imunorreactividade em relação a qualquer das outras proteínas recombinantes de pl9 de HTLV-I. 49 Γ LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: GENELABS TECHNOLOGIES, INC. (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Ensaio e Método para HTLV-

I/HTLV-II (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 17 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) REMETENTE: R G C JENKINS & CO. (B) RUA: 2 6 Caxton Street (C) CIDADE: Londres (D) ESTADO: (E) PAÍS: Reino Unido

(F) CÓDIGO POSTAL: SW1H ORJ

(v) FORMA DE LEITURA POR COMPUTADOR (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA INFORMÁTICO: Patentln Release #1.0, versão #1.25 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DE PEDIDO: PCT/US93/01498 (B) DATA DE ARQUIVO: 19 DE FEVEREIRO DE 1993 (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DE PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DE PEDIDO: US 07/840 906 (B) DATA DE ARQUIVO: 24-FEV-1992 50 Γ (viii) ADVOGADO/AGENTE DE INFORMAÇÃO: (A) NOME: WEST, Alan H. (B) NÚMERO DE REGISTO: 374905 (C) REFERÊNCIA/NÚMERO DE DOCUMENTO: J.22654 (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (0171) 931-7141 (B) TELEFAX: (1071) 222-4660 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (vi)FONTE ORIGINAL: (C) ISOLADO INDIVIDUAL: Figura 2A, pl9-C27 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1:

Ser Ser Pro Thr His Asp Pro Pro Asp Ser Asp Pro Gin Ile 15 10

Pro Pro Pro Tyr Vai Glu Pro Thr Ala Pro Gin Vai Leu 15 20 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 45 aminoácidos 51

(B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 30 TIPO DE MOLÉCULA: proteína

30 HIPOTÉTICA: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (C) ISOLADO INDIVIDUAL: Figura 3, pl9-R45, pl9-C45 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

Ile Leu Ile Gin Thr Gin Ala Gin Ile Pro Ser Arg Pro Ala 15 10

Pro Pro Pro Pro Ser Ser Pro Thr His Asp Pro Pro Asp Ser 15 20 25

Asp Pro Gin Ile Pro Pro Pro Tyr Vai Glu Pro Thr Ala Pro 30 35 40

Gin Vai Leu 45 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (C) ISOLADO INDIVIDUAL: Figura 2B, p21-C27 52 f- Lc, ^—& (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3:

Thr Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ser Pro Glu Ala His Vai 15 10

Pro Pro Pro Tyr Vai Glu Pro Thr Thr Thr Gin Cys Phe 15 20 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 48 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (C) ISOLADO INDIVIDUAL: Figura 2C, gp46-MTA-l (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4:

Ser Leu Leu Vai Asp Ala Pro Gly Tyr Asp Pro Ile Trp Phe 1 5 10 Leu Asn Thr Glu Por Ser Gin Leu Pro Pro Thr Ala Pro Pro 15 20 25 Leu Leu Pro His Ser Asn Leu Asp His Ile Leu Glu Pro Ser 30 35 40 Ile Pro Trp Lys Ser Lys 45 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:5: 53

Γ (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 4 4 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (C) ISOLADO INDIVIDUAL: Figura 2C, gp46-K55 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5:

Asp Ala Pro Gly Tyr Asp Pro Leu Trp Phe Ile Thr Ser Glu 15 10

Pro Thr Gin Pro Pro Pro Thr Ser Pro Pro Leu Vai His Asp 15 20 25

Ser Asp Leu Glu His Vai Leu Thr Pro Ser Thr Ser Trp Thr 30 35 40

Thr Lys (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 49 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: 54 u, Γ t (C) ISOLADO INDIVIDUAL: Figura 12, GH2-K15 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6:

Met Thr Leu Leu Vai Asp Ala Pro Gly Tyr Asp Pro Leu Trp 15 10

Phe Ile Thr Ser Glu Pro Thr Gin Pro Pro Pro Thr Ser Pro 15 20 25

Pro Leu Vai His Asp Ser Asp Leu Glu His Vai Leu Thr Pro 30 35 40

Ser Thr Ser Trp Thr Thr Lys 45 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 85 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL:

(C) ISOLADO INDIVIDUAL: Figura 12, gp46 de HTLV-I (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7:

Cys Gly Phe Pro Phe Ser Leu Leu Vai Asp Ala Pro Gly Tyr 15 10

Asp Pro Ile Trp Phe Leu Asn Thr Glu Pro Ser Gin Leu Pro 15 20 25 55

Pro Thr Ala Pro Pro Leu Leu Pro His Ser Asn Leu Asp His 30 35 40 Ile Leu Glu Pro Ser Ile Pro Trp Lys Ser Lys Leu Leu Thr 45 50 55 Leu Vai Gin Leu Thr Leu Gin Ser Thr Asn Tyr Tyr Cys Ile 60 65 70 i—1 > Cys Ile Asp Arg Ala Ser Leu Ser Thr Trp His Vai Leu 75 80

Tyr 85 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 85 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL:

(C) ISOLADO INDIVIDUAL: Figura 12, gp46 de HTLV-II (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8:

Cys Gly Ser Ser Met Thr Leu Leu Vai Asp Ala Pro Gly Tyr 15 10

Asp Pro Leu Trp Phe Ile Thr Ser Glu Pro Thr Gin Pro Pro 15 20 25

Pro Thr Ser Pro Pro Leu Vai His Asp Ser Asp Leu Glu His 30 35 40 56

Vai Leu Thr Pro Ser Thr Ser Trp Thr Thr Lys Ile Leu Lys 45 50 55 Phe Ile Gin Leu Thr Leu Gin Ser Thr Asn Tyr Ser Cys Met 60 65 70 Vai Cys Vai Asp Arg Ser Ser Leu Ser Ser Trp His Vai Leu 75 80 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (C) ISOLADO INDIVIDUAL: Figura 4, GHlpl9-Fl (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9: GCGAATTCAT GGGCCAAATC TTTTCCCGT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples 57

(D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (C) ISOLADO INDIVIDUAL: Figura 4, GHlpl9-F2 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10: GCGAATTCTT CCACCAGTTA AAGAAATTTC TT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (C) ISOLADO INDIVIDUAL: Figura 4, GHlp-F3 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11: GCGAATTCAT ACTCATCCAA ACCCAAGCC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:12: 58 L^i (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (C) ISOLADO INDIVIDUAL: Figura 4, GHlp-F4 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12: GCGAATTCTC ATCCCCCACC CACGACCCC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (C) ISOLADO INDIVIDUAL: Figura 4, GHlp-Rl (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13: 59 u, t GCGAATTCAA GGACTTGGGG GGCCGTAGG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (C) ISOLADO INDIVIDUAL: Figura 4, GHlpl9-R2 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14: GCGAATTCTA TGTGTAAAAT TTCATTCAC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: 60 Γ u

(C) ISOLADO INDIVIDUAL: Figura 4, GHlpl9-R3 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 15: GCGAATTCGT GGAAATCGTA ACTGGAGGG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (C) ISOLADO INDIVIDUAL: Figura 4, antigénio peptídico K55-1 de gp46-K55GHlp-Rl (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16:

TTCCATGGAT GCCCCTGGAT ATGATCC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 61 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (C) ISOLADO INDIVIDUAL: Figura 4, K55-2 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 17:

CCGGATCCTA TTATTTGGTC GTCCAGGACG T

Lisboa, 13 de Julho de 2001

O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

62

Claims (16)

1. U REIVINDICAÇÕES 1. "Kit" para identificação positiva de infecção com HTLV-I numa amostra de soro humano compreendendo um suporte sólido no qual são imobilizados (a) um antigénio peptidico de HTLV-I possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 e (b) um antigénio peptidico de HTLV-I possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4, e meios para detectar a presença de anticorpos humanos ligados imunoespecificamente a cada um dos antigénios peptidicos ligados ao suporte sólido.
2. 2. "Kit" de acordo com a reivindicação 1, em que os dois antigénios peptidicos são transportados em regiões separadas do suporte sólido.
3. 3. "Kit" de acordo com a reivindicação 2, em que os meios de detecção incluem (a) um antigénio peptidico de HTLV-I possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, e marcado com um repórter detectável, e (b) um antigénio peptidico possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4 e marcado com um repórter detectável.
4. 4. "Kit" de acordo com a reivindicação 1 e reivindicação 3, em que os dois antigénios peptidicos imobilizados estão ligados à mesma região do suporte sólido, e o repórter num dos antigénios peptidicos marcado pode ser distinguível do repórter no outro antigénio peptidico marcado.
5. 5. "Kit" de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, para utilização na identificação positiva de infecção com HTLV-I e HTLV-II numa amostra de soro humano, em que o suporte sólido possui ainda nele imobilizado, (c) um antigénio 1 j-' ^ ^ΐ peptídico de HTLV-II possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3, e (d) um antigénio peptídico de HTLV-II possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5, e o meio de detecção é eficaz para detectar a presença de anticorpos humanos ligados imunoespecificamente a cada um dos antigénios peptidicos (a)-(d) imobilizados no suporte sólido.
6. 6. "Kit" de acordo com a reivindicação 5, em que o meio de detecção inclui ainda (c) um antigénio peptídico de HTLV-II possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3, e marcado com um repórter detectável, e (d) um antigénio peptídico de HTLV-II possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5 e marcado com um repórter detectável.
7. 7. Método para a identificação positiva de infecção com HTLV-I numa amostra de soro humano, compreendendo fazer reagir a amostra de soro com um suporte sólido no qual estão imobilizados (a) um antigénio peptídico de HTLV-I possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3 e (b) um antigénio peptídico de HTLV-I possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4, detectar a ligação de anticorpos de soro humano a cada um dos antigénios peptidicos separadamente, e realizar uma identificação positiva de infecção com HTLV-I se e apenas se for observada a ligação de anticorpos do soro a ambos os antigénios peptidicos.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o passo de detecção inclui colocar em contacto o suporte sólido e os anticorpos de soro humano a ele ligados com (a) um antigénio peptídico de HTLV-I possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, e marcado com um repórter detectável e (b) um antigénio peptídico de HTLV-I possuindo 2

   a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4, e marcado com um repórter detectável, para ligar os antigénios peptidicos marcados ao suporte sólido, lavar o suporte para remover péptidos marcados ligados não especificamente, e detectar a presença dos repórteres marcados ligados ao suporte sólido.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que os dois antigénios peptidicos imobilizados são ligados à mesma região do suporte sólido, e o repórter num dos antigénios peptidicos marcado pode ser distinguível do repórter no outro antigénio peptídico marcado.
10. 10. Método de acordo com qualquer das reivindicações 7 a 9, para utilização na identificação positiva de infecção com HTLV-I e HTLV-II numa amostra de soro humano, em que o suporte sólido possui ainda nele imobilizado, (c) um antigénio peptídico de HTLV-II possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3, e (d) um antigénio peptídico de HTLV-II possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5, e o meio de detecção é eficaz para detectar a presença de anticorpos humanos ligados imunoespecificamente a cada um dos péptidos antigénicos (a)-(d) imobilizados no suporte sólido, e o passo de detecção inclui detectar a ligação de anticorpos do soro humano a cada um dos antigénios peptidicos imobilizados (a)-(d).
11. 11. "Kit" para identificar positivamente infecção com HTLV-II numa amostra de soro humano, compreendendo um suporte sólido no qual são imobilizados (a) um antigénio peptídico de HTLV-II possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3 e (b) um antigénio peptídico de HTLV-II possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5, e 3 meios para detectar a presença de anticorpos humanos ligados imunoespecificamente a cada um dos antigénios peptidicos ligados ao suporte sólido.
12. 12. "Kit" de acordo com a reivindicação 11, em que os dois antigénios peptidicos de HTLV-II são transportados em regiões separadas do suporte sólido.
13. 13. "Kit" de acordo com a reivindicação 11 ou reivindicação 12, em que o meio de detecção inclui (a) um antigénio peptidico de HTLV-II possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3, e marcado com um repórter detectável, e (b) um antigénio peptidico de HTLV-II possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5 e marcado com um repórter detectável.
14. 14. "Kit" de acordo com a reivindicação 11 e reivindicação 13, em que os dois antigénios peptidicos são ligados à mesma região do suporte sólido, e o repórter num dos antigénios peptidicos marcados pode ser distinguível do repórter no outro antigénio peptidico marcado.
15. 15. Antigénio de péptido gp46-K55 possuindo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 5.
16. 16. "Kit" para detectar a presença de infecção com HTLV-II num soro humano compreendendo um suporte sólido com um antigénio de péptido gp46-K55 imobilizado possuindo a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 5, e construído para permitir 4 que os anticorpos do soro contactem com o antigénio peptídico, quando esse soro é aplicado ao suporte sólido, e meios para detectar a presença de anticorpos humanos ligados ao suporte. Lisboa, 13 de Julho de 2001 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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