JPH07502493A

JPH07502493A - Ｈｔｌｖの抗原決定基に対応するペプチド

Info

Publication number: JPH07502493A
Application number: JP5507082A
Authority: JP
Inventors: パルカー、トーマス・ジェイ; ヘイネス、バートン・エフ
Original assignee: デューク・ユニバーシテイ
Priority date: 1991-10-08
Filing date: 1992-10-08
Publication date: 1995-03-16
Also published as: EP0618804A1; EP0618804A4; WO1993006843A1; AU2879292A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＨＴＬＶの抗原決定基に対応するペプチド〔発明の背景〕１、技術分野本発明は、一般的には免疫性調整物に関し、より具体的には、Ｉ型または■型ヒトＴ細胞白血病ウィルス（ＢＴＬＶ）のエンベロープ蛋白の抗原決定基に対応するアミノ酸配列を具備した合成ペプチド及びこれを含む免疫性組成物に関する。

２、背景情報）ＩＴＬＶ−１，オヨび）ＩＴＬＶ−１１は、胸腺由来（７）　（Ｔ）リンパ球に選択的に感染する、外因性かつ天然に存在するヒトレトロウィルスである。ＨＴＬＶ−１，およびＩＩＴＬＶ−１１は、成人Ｔ細胞白血病およびリンパ腫（ＡＴＬＬ）　ｆＰｏｉｃｓｘ　ｒｌ　ａｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａ口、Ａｃｘｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７：７４１５．　１９８０：　Ｋａｌｙａｎａ＋ａｍａｎ　ｓｆ　ａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ２１８：５７１．　１９８２）（７）原因物質である。人間におけル１１ＴＬＶ−１感染には“ｌ接状態”の前白血病状態が伴っている。その状態は明かな進行性ＡＴＬＬに進むが、あるいは、何年も変化しないままでいる（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ　ｅｌ　ａｌ、Ｂｌｏｏｄ　６２：　７５８．　１９８３）。ＡＴＬＬ発病前のみかけ上の潜伏期間が長いことは、健康なりＴＬＶ−１陽性キヤリアによる感染の拡大、並びにウィルスに接触したキャリアの確認を含む疫学上の重要な問題を提示する。ＩＩＴＬＶ−１は性交、静脈内薬物投与器具の共同使用、乳房ミルクおよび子宮内もしくは分娩時（ｐｒｒｉｐａｒｌｕｍ）の接触によって伝染され得る（Ｗｏｎｇ−５…Ｉ　ａｎｄ　Ｇａ１ｌｏ　Ｎａｊｕｒｅ　３１７：３９５．　１９８５）　ｏ現在のところ、感染したヒトからＩＩＴＬＶ−１を排除する方法、またはウィルス感染あるいは疾病の進展を防御する方法はない。ＡＴＬＬに加えて、）ＩＴＬＶ−１は熱帯性症ψ性不全対麻痺（Ｇｅｓｓａｉｎｅｌａｌ、Ｌａｎｃｅｔ　ＩＩ：６９８．　１９８６）、慢性進行性を髄障害（Ｏｓａｍ＊　ｅｌａｌ、　Ａｎｎ、　Ｎｅｕ＋ｏ１．２１；１１７．　１９８７）　、多発性硬化症（Ｘｏｐ＋ｏｗｓｋｉ　ｅｌ　ａｔ、ＮａｔｕＩｅ　３］８：　１５４１９８５）　、非ホジキンリンパ腫、１９８７）にも関連している。ＩＩＴＬＶ−１１はまた、ヘアリー〇セル白血病のＴ細胞変種と呼ばれる珍しい形態の慢性白血病（Ｋａｌｙａｎａｒａｍａｎｒｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ、２１８：４７１．　１９８２）にも関連している。

ＨＴＬＶ−１は世界的な分布を有しているが、局在した風土病的１３４・２１５．　１９８４）、および他の領域で確認されている。ＨＴＬＶ−１１の血清学的陽性の広かりは増大しているか（Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔｅｌ　ａｔ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、Ｊ、　Ｍｅｄ、３１５＋３７２．　１９８６）　、ＨＴＬＶ−１ｆ　（７）疫学はあまり知られていない。同様に、）ＩＴＬＶ−１の血清学的陽性の割合は、ニューヨーク（９％、　Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｆｆ　ｅｆ　ａｌ、Ｊ、　Ａｍ。

Ｍｅｄ、Ａｓ５ｏｃ、２５５：　３Ｎ３．　１９８６）　、及びニューオーリンズ（４９％、　ｔＷｅｉｓｓ　ｅｌ　ａｌ、Ｐｔｏｃ、Ａｍ、Ｓｏｃ、Ｃｌ１ｎ、Ｏｎｅ、６：５．　１９８７））では静脈内への薬物乱用者において増加しており、また二ニーヨーク（９％、Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｌｌ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、　Ａｍ、　Ｍａｄ、　Ａｓ５ｏｃ、２５５；３１３３、　１９８６）、チャペルヒル、ノースキャロライナ（１３％（Ｈａｙｎｅｓ　ｒｌ　ａｌ、　Ｃｌ１ｎ　Ｒｅｓ、　３３：３４２Ａ、１９８５））では血液製剤の輸血を受けている患者において増加している。

最近、Ｒａｌｅｉｇｈ、　ＮＣからの６人の集団について、ＩＩＴＬＶ−１に対する抗体を保持していることが確認された　ｆＷｅｉｎｂｅｒｇ　ｅｔ前白血病徴候を示唆する異常な循環リンパ球を保持していた。

その後、−人の患者が成人Ｔ細胞白血病で死去しており、６人全員がＨＩＶについては血清学的陰性であった。ニューヨークおよびニューオーリンズにおける血清学的陽性率の増加と共に、この集団での知見は、ＨＴＬＶ−１についての信頼できる診断試験、並びに未感染個体のための防御ワクチンが緊急に必要であることを強調している。

生産物を含むワクチンが防御的に有用であろうことが指摘されているが、現在のところ、ＨＴＬＶ−１に対して使用可能なワクチンは存在しない。ＩＩＴＬＶ− １エンベロープ遺伝子は、６３〜６７キロダルトン（ｋｄ）の糖蛋白前駆体をコードしており、該前駆体は蛋白加水分解により加工されて、成熟ｇｐ４６外部エンベロープ糖蛋白および２１ｋｄのトランスメンブラン蛋白を生じる（Ｌｅｃｅｌ　ａｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８１：３８５６．　１９８４）。

Ｋｉｙｏｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａ１１．　＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８１：６２０２゜１９８４）は、ＨＴＬＶ−１（７）全ｇｐ６３エンヘローフ前駆体分子ヲ、ｇｐ４６外部エンベロープ糖蛋白分子の１２アミノ酸以外の全てを含むＮ末端部と、ｇｐ２１　）ランスメンプラン分子のほとんど全てからなるＣ末端部との二つの断片として、大腸菌中で発現させた。Ｋｉｙｏｋａｗａらは、ウサギＩＩＴＬＶ−１ｇｐ６３−？−ンベローブ前駆体のＮ末端およびＣ末端部に対する抗血清を使用して、アメリカおよび日本のＢＴＬＶ−１の色性型（ｐｓｅｕｄｏ１７ｐｅｓ）の両方を中和した。Ｂｏｓｈｉｎｏら　（ｌｎ１．　Ｊ、　Ｃｘｎｃｅ＋　３６；７６］、　１９８５）は、この発見を抗−ｇｐ２１抗血清によって確認した。要約すると、これらのデータは、ＩＩＴＬＶ−１のエンベロープ上には少なくとも２つの中和部位がある事、即ち、第一は外部ｇｐ４６エンベロープ糖蛋白に関連し、第二はｇｐ２１　トランスメンブラン糖蛋白に関連することを示している。さらに、大腸菌中で生産されるこれらＢＴＬ’ ／−１の組換蛋白はグルコシル化されていないので、糖鎖はこれらの中和部位の必須成分ではない。

従って、グリコジル化されていない構築物としての合成ペプチドが、ＢＴＬＶ− １のエンベロープに対する中和抗血清の産生に適しているように思える。日本およびアメリカのＢＴＬＶ−１エンベロープに対するヒトまたは動物の抗血清は、色性型分析において交差的に中和（ｃｒｏｓｓ−ｎｅｕｌ＋ａｌｉｘｅ）するであろうから１１１１ＴＬＶ−１のエンベロープ抗原もまた世界的に単一血清型を示すと思われる（Ｎａｇｙ　ｅｔ　ａｌ、Ｉｎ１．　Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　３２＋３２１．　１９８３）。

このように、ＨＩ　Ｖの単離された特異的中和エピトープとは異なり、一つのＩＩＴＬＶ−Ｉ　Ｌｌ離物に対する合成ワクチンは、他のＨＴＬＶ−１単離物に対しても防御性を示すであろう。実際に、抗体または特異抗体を１（ＴＬＶ−１陽性リンパ球の培養物に加えると、ウィルス抗原の発現を抑制できる事を実証し、抗１１１ＴＬＶ−１抗体が１ｎ−ｖｉｖｏで防御を達成し得るメカニズムを示唆した。

これらのデータは、ＨＴＬＶ−１エンベロープ糖蛋白の一部分がヒトにおけるＨＴＬＶ−１への防御的な抗体価を誘導するワクチンとして使用され得るとの提案を強力に支持するが、これらの研究では、重要なエピトープの配列は確認されていない。

■ＴＬＶ−１とＩＩＴＬＶ−１１のエンベロープ糖蛋白間には配列の相同性か存在するから、該配列を解明することはまた、ＨＴＬＶ−１１に対するワクチンに含める重要なりＴＬＶ−１１エンベロープ糖蛋白のエピトープの確認を容易にするであろう。

〔発明の目的〕

本発明の目的は、吐乳動物において、ＢＴＬＶ−１及びｌｌＴｌ、Ｖ−１１に対する高力価中和抗体の産生を誘発することができる合成ペプチドであって、単独もしくはキャリア分子に連結させた形で、および／またはポリマー化により形成された分子凝集物の形で上記抗体の産生を誘発できる合成ポリペプチドを提供することである。

本発明のもう一つの目的は、哺乳類において■ＴＬＶ−１に対する防御的免疫を誘発できるＩＩＴＬＶ−１エンベロープ蛋白の抗原決定基に対応したアミノ酸配列を有するペプチドを含んだ、免疫原複合体を提供することである。

本発明の更なる目的は、哺乳類においてＴＩＴＬＶ−１１に対する防御的免疫を誘発できるＨＴＬＶ−１１エンベロープ蛋白の抗原決定基に対応したアミノ酸配列を有するペプチドを含んだ、免疫原調合体を提供するものである。

本発明の付加的な目的は、生物学的テスト試料中において、抗１１ＴＬＶ−１抗体および抗）ＩＴＬｖ−１１抗体の存在を検出する方法を提供することである。

これらのｌ」的、並びに以下の詳細な説明から当業者に明らかな他の目的は、ウィルス性原因物質ＩＩＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−１１にに・１する免疫反応を生み出すのに有用な合成ペプチドを提供することによって達成された。

〔発明の概要〕

本発明は、免疫原製剤および該製剤から作成されるワクチンに関する。ＩＩＴＬＶ−１または）ＩＴＬＶ−１１の何れかのエンベロープ蛋白の抗原決定基に対応するアミノ酸配列を持つ合成ペプチドは、直接またはスペーサ分子を介して適切なキャリア分子に共有結合されることにより、免疫原１夏合体を形成する。−以上のこれら複合体を合釘するワクチンか開示される。

−ツ（７）　ＱＱ　様１：　！６　Ｌ　’　で、本発明ハ、）ＩＴＬＶ−１（マタハ１ｌＴＬＶ−！ｌ）のエンベロブ糖蛋白の抗原決定基に対応したアミノ酸配列をもった合成ペプチドを具備し、該ペプチドは、単独またはキャリア分子と共有結合した形で、哺乳類において、ＩＩＴｔＶ−１（またはＨＴＬＶ−１１）に対する高力価の防御性抗体を誘発することカできる。本発明のペプチドは、ＨＴＬＶ−Ｉ（Ｓｅｉｋｉ　ｅｆ　ａｌ。

（Ｓｏｄｒｏｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ　２２５：４２１．　＋９８４）におけるエンベＢｉｏ１．　１５７：１０５．　１９８２）に存在する抗原決定基に対応する。

もう一つの態様において、本発明は削孔類中でＨＴＬＶ−１またはＩＩＴＬＶ− １１対する高力価の防御性抗体を誘発することができる免疫原調合体を具備し、該１夏合体は、（ｉ）キャリア分子と、（１１）該キャリア分子に共有結合された、ＩＩＴＬＶ−１（またはＩＩＴＬＶ−１１）のエンベロープ糖蛋白の抗原決定基に対応したアミノ酸配列をもつ合成ペプチドとを具備する。

更に別の態様において、本発明は、上記ｎｒｔｖ−＋　（または１１ＴＬＶ−１１）特異的複合体を免疫学的有効量で哺乳類に投与することを具備した、ＩＩＴＬＶ−１（またはＨＴＬＶ−１１）に対する免疫生じさせる方法を包含する。

他の態様において、本発明は、生物学的テスト試料中における抗ＨＴＬＶ−１（抗ＨＴＬＶ−１１＞抗体の存在を検出する方法であって、該試料と本発明のペプチドとを接触させることと、前記試料中の抗体と該ペプチドとの複合体を形成させることと、該複合体の形成を測定することとを具備した方法を包含する。

〔図面の簡単な説明〕

図１　：　）ＩＴＬＶ−１陽性患者から１すた抗体の、ｇＮ６ｅｎｖにコードされた合成ペプチドに対する反応性。

図２　：　ＨＴＬＶ−１のエンベロープ糖蛋白ｇｐ４６およびｇｐ６３に対する抗合成ペプチド抗血清の、イムノプロット分析における反応性。

図３：　イムノプロット分析における、抗ペプチド抗体のＢＴＬＶ−Ｉ　ｇｐ４６に対する反応性の特異的阻害。

図４Ａおよび４Ｂ　熱帯痙章性不全対麻痺（丁ＳＰ）に付随してＢＴＬＶ−１をもつ患者ＡからｆｊられたＦＩＬＤ−ＤＲ２制限細胞障害性Ｔ細胞系Ｐ−１０にヨッテ認識すレル、ＢＴＬＶ−１ｇｐ４６（７）エピトープのマツピング。

図５＝　合成ペプチド５Ｐ−２を用いた、中和性抗ペプチド抗血清の吸収。

図６　ＨＴＬＶ−１に対する中和抗体のペプチド吸収図７　１１ＴＬＶ−ＩＴ細胞／Ｂ細胞ペプチド〔発明の詳細な説明〕本発明は、ＢＴＬＶ−１の免疫原性エピトープに対応するペプチド、ＨＴＬＶ− １１の免疫原性エピトープに対応するペプチド、並びに、それらから作成されるＩＩＴＬＶ−１およびＢＴＬＶ−１１の夫々にり・１する合成ワクチンに関する。これらの新規な免疫原製剤は、ＢＴＬＶ−１またはＩＩＴＬＶ−１１のｇｐ４６エンベローブ蛋白と共通の抗原決定基を有するペプチドを化学的に合成することにより製造される。該ペプチドはキャリア分子に連結されて、免疫原性複合体を形成（および／または高分子化される）することによって、ワクチンとして適切なものになる。これらのワクチンは、例えば非経口的な投与経路で、その免疫学的有効量が哺乳類に投与された場合に、ＢＴＬＶ−１またはＩＩＴＬＶ−１１に関係した疾病に対して免疫感作を行なうために有効である。

免疫原能を研究すべきペプチドには、ＩＩＴＬＶ−１およびＩＩＴＬＶ−１１ｇｐ４６エンベロープ糖蛋白の親水性荷電領域に対応したペプチドが含まれることが確定された。更に、これらのペプチドのうち、βターンをもっと推定されるペプチドが特に重要であることがわかった。ペプチド内ジスルフィド結合の形成が、本来の構造的決定因子を確立するのに有用であることが認められた。また、鏡開ジスルフィド結合の形成は、ペプチドをポリマー化し、より大きく且つより免疫原性の高いペプチド凝集物を形成するために有用であることが分かった。

ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−１１エンベロープ蛋白の推定アミノ酸配列をコンピュータ分析することにより、親水性領域の二次構造および位置が決定された。

二次構造は、Ｃｈｏｕ　ａｎｄ　Ｆｇｓｍａｎ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１３：２１１　ａｎｄ　１３：２２２．　１９７４；＾ｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ＥｎＢｍｏｌｏｇＦ　４７＋４５．　１９７８）の方法を使用したコンピュータ分析で決定された。βターンの可能性がありそうな領域の位置は、Ｒｏｓｅの方法　（Ｎａｔｕｒｅ　２７２：５８６．　１９７８）を使用して決定された。

エンベロープ蛋白の親水性領域は、Ｒｏｓｅ及びＲｏ７　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｊｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　？？＋４６４３．　１９８０）の技術、並びにＫｙ”＋ｅ及びＤｏｏｌｉｊｌｌｒ　（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１５７：１０５−１３２．　１９８２）の技術によって決定された。

本発明のペプチドには、ＦＩＴＬＹ−１のｇｐ４６エンベローブ糖蛋白内に存在するＢ細胞エピトープに対応するか、またはこれと相同であるペプチドが含まれる。これらペプチドは、長さが約２５以下のアミノ酸（単位）であり、且つ親水性である。該ペプチドは適当なキャリア分子と結合されると、哺乳類において、ＨＴＩＶ−１の天然のｇｐ４６エンベロープ糖蛋白と反応できる高力価＋１＋１０００）の抗ペプチド抗体の産生を喚起する。本発明の他のペプチドは、）ＩＴＬＶ−１１のｇｐ４６エンベロープ糖蛋白内に存在するＢ細胞エピトープに対応するか、またはこれに対して相同性を有する。これらペプチドは、長さか約２５以下のアミノ酸（中位）であり、且つ親水性である。また、適当なキャリア分子と結合されると、哺乳類において、ＨＴＬＶ−１１の天然のｇｐ４６エンベロープ糖蛋白と反応できる高力価（１＋１０００）の抗ペプチド抗体の産生を喚起する。

本発明の合成ペプチドは、表１に示すアミノ酸配列、或いは、表に掲載された特異的配列で表されるエピトープと結合する抗体によって同様に扱われるように、表１に示す配列の一つと充分に近似した配列（即ち、免疫学的に同等の配列）ヲ＃　Ｌ　ｉ！％　ル。カカル同等ノ配列ノー例ハ、ＷＴＨＰＮＲＮＧＧＧ　（ＨＴＬＶ−１エンベロープのアミノ酸番号８８−９８：　ｓｐ　２Ｌ−］　と記す）である。以下、このような合成ペプチドを、ＢＴＬＶ−１特異性ペプチドという。

表１診断に使用される合成ペプチドおよび！（ＴＬＶ−１に対するワクチン１　３３−４７　ＶＳＳＹＨ５ＫＰＣＮＰＡＱＰＶ２　８６−１０７　（Ｃ）ＰＩＩＷＴＫＫＰＮＲＮＧＧＧＹＹＳＡＳＹＳＤＰ３　１７６−１８９　ＦＣ）ＬＮＴＥＰＳＱＬＰＰＴＡＰＰ（Ｙ）４　１２９−１４９　５ＳＰＹＷＫＦＱＨＤＶＮＦＴＱＥＶＳＲＬＮ（Ｃ）４Ａ　１９０−２０９　（Ｃ）ＬＬＰＢＳＮＬＤＢＩＬＥＰＳＩＰＷＩＳＸ（Ｙ）５　２６９−２８０　（Ｙ）ＬＰＦＮＷＴＨＣＦＤＰＱ（Ｃ）６　２９６−３１２　（Ｃ）ＰＰＦＳＬＳＰＶＰＴＬＧＳＲＳＲＲ７３７４−３９２ＹＡＡＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬ（Ｃ）８　４００ −４］５　ＧＲＦＰＮＩＴＮＳＨＶＰＩＬＱＥ９　４１１−４２２　（Ｃ）ＰＩＬＱＥＲｆ’ＰＬＥＮＲ１０４６２−４８０ＣＩＬＲＱＬＲＢＩＰＳＲＶＲＹＰＩＩＩＹＳ３６１８−３６２２．　１９８３に従い、リーダー配列のＮ−末端メチオニン＝１゜２、合成ペプチドの配列１−１１は、ペプチド４を除き、ＨＴＩＶ　−Ｉ　Ｈ１６３エンベロープ前駆分子のＮ末端からＣ末端へ順に掲載されている。ペプチド７−１１の配列は、ｇｐ２＋のトランスメンブラン糖蛋白由来であるが、ペプチド１−６の配列はｇｐ４６の外部エンベロープ糖蛋白由来である。アミノ酸番号は、開始メチオニン−１で始まる（Ｐａｌｋｅｒ　ｅＩａｌ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ　（１９８９）　Ｖｏｌ、　１４２Ｆｔｂ、１．参照）。

３、括弧内のアミノ酸は、キャリア蛋白（Ｃ）　とのカップリングおよびペプチドのヨード化（Ｙｌ　を促進するために添加された。ＣｙｓはＮ末端またはＣ末端の何れかである。

４、−文字コードによって表示される各アミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、リジン（Ｋ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）および千ロジン（Ｙ）を除いて、その名前の頭文字である。

同様に、本願の他の合成ペプチドは、表２に示されるようなアミノ酸配列、または、表に掲載された特異的配列で表されるエピトープと結合する抗体によって同様に扱われるように、表２に示される配列の一つと充分に近似した配列（即ち、免疫学的に同等の配列）を有し得る。このような同等の配列の一例は、ＰＨＷＩＫＫＰＮＲＱＧＬＧＹＹＳ（Ｃ）　（ＩＩＴＬＶ−１１エンベロープのアミノ酸番号８２−９７．　ＤＰ−９０と記す）である。以下、このような合成ペプチドを、ＢＴＬＶ−１１特異性ペプチドと言う。

嚢２診断に使用される合成ペプチドおよびＢＴＬＶ−１１に対する予防接種１　３０−４４　５ＳＹＨＳＳＰＣ５ＰＴＱＰＶＣ２４４−６３ＣＴＷＮＬＤＬＮＳＬＴＴＤＱＲＬＩＩＰＰＣ３８３−１０４ＢＷＩ［ＰＮＲＱＧＬＧＹＹＳＰＳＹＮＤＰＣ４１２５−１４０（Ｃ）ＳＳＰＳＷＫＦＩＩＳＤＶＮＦＴＱＥ５　１７４−１９４　ＦＣ）ＳＥＰＴＱＰＰＰＴＳＰＰＬＶＨＤＳＤＬＥＨる。リーダー配列のメチオニン＝１゜２、括弧内のアミノ酸が、キャリア蛋白（ｃ）とのカップリングおよびペプチドのヨード（Ｙ）を促進するためニ添加された。ＣｙｓはＮ末端またはＣ末端の何れがであり得る。

３、−文字コードによって表示される各アミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、リジン（Ｋ）、フェニルアラニン（Ｆ）　、Ｉ−リプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）を除いて、その名前の頭文字である。

本発明のペプチドか共有結合する（複合体を形成する）キャリア分子は、無毒で、薬学的に使用可能であり、哺乳類において免疫反応を生じるのに十分な大きさであるのが有利である。適切なキャリア分子の例としては、破傷風トキソイド及びキーホールカサガイヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍ。

ｃｙａｎｉｎ　；　ＫＬ）ｌ）がある。）ＩＴＬＶ−１特異性ペプチド及びＨＴＬＶ−１！特異性ペプチドが結合し得る他のキャリア分子には、ＨＴＬＶ−１またはＢＴＬＶ−１１ｇｐ６３エンベロープ糖蛋白またはＭａｒｇａＩｉｔ　ｅｌａｌ、　（１，Ｉｍｍｕｎｏ１．　１３８：２２１３．　１９８７）のアルゴリズムによって推定される螺旋構造をもったＰ５５　ｇｊｇポリ蛋白の、Ｔ細胞エピトープに対応する配列を有するペプチドが含まれる。その具体例が表３に掲載されている。アミノ酸ＬＡＳＧＸＳＬをｌ−ＴｌのＮ末端への付加すると、マウスＴヘルパー細胞によって確二ごされるペプチドとなる。

表３ＥＴＬＶ−１，ＩＩＴＬＶ−１１（７）Ｔ細胞エピトープウィルス　遺伝子　アミノ酸　記号　配列ＦＩＴＬＹ−１ｘンベローブ　３４７−３６３　１−ＴＩ　ＬＩＩＥＶＤＫＤＩＳＱＬＴＱＩＶＫＨＴＬＶ−１エンベロづ　６４−７４　１ −Ｔ２　ＱＰＰＣＰＮＬＶＳＹＳＧａｇ　１８４−２００　Ｉ−Ｔ３　ＤＬＱＤＬＬＱＹＬＣ３ＳＬＶＡＳＬＧａｇ　７９−８７　１−Ｔ４　ＲＶＮＥＩＬＨＩＬ）ＩＴＬＶ−１１エンベロープ　３４８−３６９’　ＩＩ−Ｔ４　ＫＤＩＳＢＬＴＱＡＩＶＫＮ）ＩＱＮＩＬＲＶｌ、両親媒性の螺旋二次構造を含むアミノ酸配列を保護するために使用される、ＭａｒｇａＩｉｔ　ｅｔ　ａｔ、（Ｊ、１ｍｍｕｎｏｌ。

＋３８：２２１３．　１９８７）のアルゴリズム２、５ｅｉｋｉ　ｅｔ　ａｌｅ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｉｔｓ＾８０：３６１８゜１９８３からの）ＩＴＬＶ−］推定アミノ酸配列ＨＴＬＶ−１特異性ペプチドおよびＢＴＬＶ−１１特異性ペプチドはまた、薬学的に使用可能なアジュバント（例えば明春）と共に、または破傷風トキソイドよりも免疫原性の高い他のキャリア分子に結合して投与され１する。

キャリア分子と本発明のＨＴＬＹ−１またはＩＩＴＬＶ−１１特異性ペプチドとの連結は、直接またはスペーサ分子を介してなされる。

スペーサ分子は、無毒性で且つ反応性であるのが有利である。

１１ＴＬＶ−１又は［１Ｖ−１１特異性ペプヂドのアミノ末端に付加される二つのグリシン残基は、ペプチドとキャリア分子を連結するのに適切なスペーサ分子を与える；或いは、ＨＴＬＶ−１または１１ＴＬＶ−１１特異性ペプチドは、例えば表３に表示されている配列（またはその部分）のような他の免疫原性）ＩＴＬＶ−１，若しくはＢＴＬＶ−１１工ンベロープ配列に隣接して、直接合成することができる。キャリア分子と結合させるために、ＩＩＩＴＬＶ−１，またはＨＴＬＶ−１１特異的ペプチドのＮ末端またはＣ末端の何れかにシスティンを付加するか、或いは、ジスルフィド結合の形成を介しての鏡開ポリメリゼーションを促進し、より大きな分子凝集物を形成するために、システィンを両末端に付加することができる。

ＩＩＴＬＶ−１，またはＩＩＴＬＶ−１１特異性ペプチドに対するキャリア分子の結合は、カップリング剤を用いて行なわれる。Ｇｒｅｅｎｅｌ　ａｌ、（Ｃｅｌｌ　２８＋４７７、　１９８２）、およびＰａ１ｋｅ＋　ｅｌ　ａｌ、　（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８４：２４７９．　１９８７＞に記載されているように、ヘテロ官能性のカップリング剤であるトマレイミドベンゾ・イルーＮ−ヒドロキジサクシンイミドナエステル（ＭＢＳ）、または、水溶性化合物である０−マレイミドーベンゾイルスルフォサクシンイミド・エステ（Ｓｕｌｌｏ−Ｍ　Ｂ　Ｓ　）を使用するのが有利である。

本発明のワクチン（哺乳類に投与されると、１１ＴＬＶ−１に対して防御的免疫反応を誘発する）は、一つ以上の免疫原複合体を合釘する。この夫々の複合体はＩ’１ＴＬＶ−１特異性ペプチドを含ンでオリ、各１１ＴＬＶ−１特異性ペプチドは、ＨＴＬＶ−１ｇｐ４６−ｒ−ンベロープ蛋白の異なる部分に対応している。表１に掲載した一以上のＨＴＬＶ−１特異的ペプチドを、例えば表３に表示したＨＴＬＶ−１エンベロープまたはｇａｇ蛋白の推定Ｔ細胞エピトープと結合するか、或いはこれと共に合成するのが有利である。

このようなキメラの一例は、ＬＰＰＴＡＰＰＬＬＰＩＩＳＮＬＤＩＩＩＬＥＰＳＩＰＷＫＳＫＷＴＫＷＰＮＲＮＧＧＧ　（ＨＴＬＶ−１エンベロープ蛋白のアミノ酸岳号１８３−２０９／８８−９８；　ＤＰ−９１と記す）である。

同様に、）ＩＴＬＶ−１１対して防御的免疫反応を誘発てきる本発明のワクチンは、−以上の免疫原複合体を具倫する。その各々抱合体は、ＨＴＬＶ−１１特異性ペプチドを含み、各ペプチドはＨＴＬＶ−Ｉｔ　ｇｐ４６エンベローブ蛋白の異なる部分に対応する。表２に掲載されている一つ以上のＨＴＬＶ−１１特異性ペプチドは、例えば表３に表示される推定Ｔ細胞エピトープと結合され、またはこれと共に合成されることが有利である。

更に、哺乳類によってＩＩＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−１１に対する防御抗体が同時に生じるように、）ＩＴＬＶ−１および）ＩＴＬＶ−１１のエンベロープ蛋白由来の合成ペプチドを含む上記の免疫原複合体を混合し、単一の接種物とすることによって、二価のワクチンを構築することかできる。

１（ＴＬＶ−１およびＩＩＴＬＶ・１１エンベロープの一部を反映する合成ペプチド、又はヘルパーＴ細胞によって認識される２８２分子をキャリア分子として使用することによって、破傷風トキソイド等の他のキャリア分子を用いる必要がなくなり、加えてＩＩＴＬＶ−１または）ＩＴＬＶ−１１に対するＢ細胞およびＴ細胞の反応が特異的になるという利点か得られる。ＢＴＬＶ−１およびＨＴＩ、Ｖ−１１特異性ペプチドは、単独または対応するＴ細胞エピトープと共に合成されたものの何れであっても、酸化剤で処理してペプチド鎖のシスチン間におけるジスルフィド結合形成を誘導され、高分子化されることによって、高い免疫原性をもつ抗原となる。

本発明のＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−１１特異性ペプチドか、免疫感作に続いて中和抗体を産生ずる能力は、Ｎａｇｙ　ｅｌ　ａｌ、　（Ｉｎｌ、　Ｊ。

Ｃａｎｃｅｒ　３２：３２１．　１９８３）に記載されているようにして決定される。

ＨＴＬＶ−１およびＩ（ＴＬＶ−１１特異性ペプチドをワクチンまたはワクチン成分として使用することに加えて、これらのペプチドはまた、診断のためにも使用することができる。生物学的試料中のＢＴＬＶ−１または）ＩＴＬＶ−１１エンベロープ蛋白に対する抗体の存在および力価は、固相ラジオインムノアッセイ（ＲＩＡ）において）ＩＴＬＶ−１および）ＩＴＬＶ−１１特異性ペプチドを用いることにより検出することができる（Ｐａｌｋｅｒ　ｅｔ　ａｔ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１３６・２３９３．　１９８６−この報文の全内容が本明細書に参照として組み込まれる；　１ｂｉｄ、　Ｉ’ｒｏｃ、　Ｎａ１１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：２４７９、＋９８７＋　、本発明）ＨＴＬＶ−１オヨびＦＩＴＬＹ− Ｉ＋特異性ペプチトハまた、標準の酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）において、生物学的試料中のＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−１１エンベロープ糖蛋白に対する抗体の存在を検出するためにの使用され１）る。

本発明のＩＩＴＬ’／−１診断試験の一つの態様においては、ＩＩＴＬＶ−１ｇｐ４６エンベロープ由来の合成ペプチドとＩＩＴＬｖ−１ｐ１９　ｇａｇ蛋白との混合物が用いられる。好ましくは、表１のペプチド４Ａと、下％Ｆ３（７）　ｔｌＴＬＶ−１ｐ１９　ノｈルボキシル末端配列：　Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ− Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈ＋−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕを含むペプチドが使用される。組み合せにおいて、これらの二つのペプチドは、ｐ１９またはｇｐ４６に対する抗体を有する）ＩＴＬＶ−１陽性被検者由来の血清の抗体によって９５％で認識される（　Ｐａ１ｋｅｒ　ｅｌａｌ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３６：２３９３．　１９８６．　および表１）。これら二つのペプチドの組み合わせは、ＥＬＩＳＡまたは旧Ａにおいて、１（ＴＬＶ−１陽性患者由来の血清中の抗体を検出するために使用することができる。

以上述べたところを考慮すれば、ＥＬＩＳＡ　５ＲＩＡ　、間接蛍光イムノアッセイ、およびウェスタンプロット分析等の検出手段を使用して、生物学的試料中のＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−１１に対する抗体を検出するためにの、ＨＴＬＶ−１およびＨＴ［、Ｖ−１１特異性テストキツトが構築できるということが当業者には明らかであろう。

本発明のＢＴＬＶ−１またはＩＩＴＬＶ−１１特異的ペプチドによる免疫感作に反応して産生される抗体が、標準的な技術を使用して、抗原診１１ｆｒ試験に使用されるということもまた、当業者には明らかであろう。

以下、実施例に従って本発明をより詳細に説明するが、これら実施例は本発明を制限するものではない。

実施例ＩＢＴＬＶ−１ｇｐ４６　（Ｓｅｉｋｉ　ｅｌ　ｘｉ；、Ｐｒｏｃ、Ｎｘ口、＾ｃ！ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８０：３６１８−３６２２．１９８３）およびＢＴＬＶ− １ｔ　ｇｐ４６（Ｓｏｄｏｒｓｋｉ　ｅｔａｌ；、５ｃｉｅｎｃｅ、２２５：４２１−４２４．１９８４）由来の親水性アミノ酸配列を含む本質的に純粋な合成ペプチドが、デュポン２１００　ペプチド合成機を用い、製造者により供給された化学剤およびプログラムサイクルを使用して合成された。配列は表１および２に掲載されている。

Ｇｒｅｅｎ　ｅｌ　ａｌ、（Ｃｒｌｌ　２８：４７７、１９８２）およびＰｇｌｋ！ｒ　ｃｌ　ａｌ。

（？ｏｃ、　Ｎａ１ｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：２４７９．　１９８７）に記載されているようにして、ペプチドは、ＭＢＳを用いてキャリア分子である破傷風トキソイド（ＴＴ）に結合された。カップリングの手順は次の通りである。まず、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７，２）０．５ｍｌ中の２４　ｍｇの破傷風トキソイドを、ジメチルホルムアミド１００μｍ中に溶解させたｌ　ｍｇのＭＢＳと共に、２３℃で１時間インキュベートした。次に、このＭＢＳで処理した破傷風トキソイド（ＴＴ−ＭＢＳ）をＰＤ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上での選別クロマトグラフィーにかけ、ＴＴ−ＭＢＳから未反応のＭＢＳを除去すると共に、ＴＴ−ＭＢＳを含む分画が、光学密度２８０　ｎｍでのスペクトロフォトメトリック分析で定量されたカラム空間容量で回収された。ＴＴ −ＭＢＳは、ＰＢＳ中の６−９ｍｇの合成ペプチド（カルボキン末端またはアミノ末端に還元されたシスチンを含む）と共に、２３℃で３時間、で振盪しながらインキュベートされた（ペプチド：キャリア蛋白の分子比率は３０：１）。こうして得られたＴＴ−ペプチド複合体は、４°Ｃで一晩、ＰＢＳで透析されるか又はＰＤ−１０カラム上で再び脱塩され、免疫原として使用された。

ペプチドのキャリア分子トキソイドへの結合は、複合体を５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（５ＤＳ−ＰＡＧＥ）に供すして、キャリア分子ポリアクリルアミドゲル電気泳動の分子量を越える見掛の分子量の増加を測定することにより、およびＭＢＳ処理されたキャリア分子の分子量を凌ぐ見掛けの分子量増加を測定することによりモニターされた。カップリング効率もまたペプチドの微量ヨウ素化によってモニターされたが、この効率はペプチドによって１０−３０％の範囲で変化した。

実施例２ＢＴＬＶ−１七ロポジティブ者由来の抗体のＨＴＬＶ−１ｇｐ４６合成ペプチドに対する反応性１１１ＴＬ／Ｖ−１ｇｐ４６　ノ親水性領域由来の合成ペプチド（ＨＴＬＶ−１合成ペプチド）を、０．１Ｍ　Ｎａ）ＩｃＯ，ｐＨ９，６，の緩衝液中に溶解させるか懸濁させ、Ｉｍｍｕｌｏｎ　２マイクロタイタウエル（Ｄ７ｎｘｌｔｃｈ）を用いて、この溶液または懸濁液５０μｇ／ウェルを４℃で一晩インキユベートした。ウェルを空にした後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）巾の５％の無脂肪乾燥ミルク（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）２００μｍと、０．１％アジ化ナトリウムとをウェルに添加して２時間インキュベートした。ウェルを空にし、５％の無脂肪乾燥ミルクおよび０．０５％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）　２０　（洗浄緩衝液）を含むＰＢＳで一回洗浄し、更に、ＢＴＬＶ−１陽性患者または通常人由来の血清の洗浄緩衝液による稀釈液（１１５０）と共に１時間インキュベートした。ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄し、更にウサギ抗ヒトＩｇＧ　ｆＨ＆　Ｌ鎖特異性、Ｃｏｏｐｅｒ　Ｂｉｏｍｒｄｉｃａｌ。

Ｍａｌｖｅｒｎ、　ＰＡ）全血清の洗浄緩衝液にょる］／１５０希釈液（５０μ ｍ）と共に３０分間インキュベートし、前記のように洗浄し、続イテ、洗浄緩衝液５０μｍ中（７）　】２５Ｉ　標識ｍ白Ａ　（Ｓｉｇｍａ）１０５ｃｐｍと共に２３°Ｃで更に３０分間インキュベートした。ウェルを前記のように洗浄し、ウェルに結合された放射活性をガンマ−計測器で測定した。図１に、１（ＴＬＶ −１陽性患者の血清（Ｅ）および通常人血清対照（Ｃ）の実験で得られた　（Ｅ／Ｃ）の平均ｃｐｍ値（二つのウェル）を示す。２．０より大きい比は陽性とみなされた。

実施例３１’１ＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−１１に対する抗体の検出ｐ１９のＣ末端に由来した、ＩＩＴＬＶ−１にコードされる合成ペプチドである５Ｐ−７１（Ｐｒｏ −丁ｙｒ−ｖＢＩ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｂｒ−Ａｌｊ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ −Ｌｅｕ　）またはその部分と、表１に記載したｇｈ４６巾来の合成ペプチド５Ｐ−４＾とが混合され、上記２１人におけるマイクロタイタウエル（ウェル当たりの各ペプチド量は１０−５０Ｉｇ）に添加されて、ＨＴＬＶ−１に対する抗体を検出するために使用され１）る。また、ＨＴＬＶ−Ｉｉ　ｐ＋９のＣ末端に由来するアミノ酸配列を含むペプチド（？ｏ−Ｔｙｒ−Ｖａ　１−Ｇｌｕ−Ｐ＋ｏ −Ｔｈｒ−Ｔｈｅ−Ｔｈｅ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ　）またはその部分は、マイクロタイタウエル（ウェル当たり１０−５０Ｉｇ）に上記のように添加され、）ＩＴＬＶ−１１に対する抗体を検出するために使用され得る。

実施例４抗合成ペプチド抗血消の合成ペプチドおよび）ＩＴＬＶ−１エンベロープ糖蛋白に対する反応性ＢＴＬＶ−Ｉ　ｅｎｖにコードされた合成ペプチド（ＨＴＬＶ− １特異性ペプチド）が、上記のように破傷風トキソイド（ＴＴ）に共有結合され、ウサギを免疫感作するために使用された。フロイント完全アジュバント中のペプチド−ＴＴ複合体５　ｍｇで１回の免疫感作を行ない、続いて１週問おきにフロイント不完全アジュバント中の該複合体で２回の追加免疫を行なった後、血清が採集され、該血清の免疫感作ペプチドに対する反応性がテストされた（表４）。

点迭１１ＴＬＶ−１合成ペプチド（ＳＰ）　１−６１．：対するウサギ血清の反応性抗体　抗　原５Ｐ−Ｉ　５Ｐ−２５Ｐ−３５Ｐ−４５Ｐ−４Ａ　５Ｐ−５５Ｐ−６αｓｐ−］　５８．１　０．５　２．１　０．４　０．９　１．３　０．４抗ペプチド血清の合成ペプチドに対する反応性がラジオイムノアッセイ（２ウエル）で測定され、結果が免疫感作および免疫感作前の血清で得られた平均ｃｐｍ値の比として表された。抗ペプチド血清は、免疫感作ペプチド（下線値）に対する高度の特異性を持っていた。

ＥＴＬＶ−１合成ペプチドｉ６に対する抗血清は、ＲＩＡにおいて、１　：　２０００の最小力価を有する免疫感作ペプチドに対して高い特異性で反応した。イムノプロットで試験すると、ペプチドＩ、３．４．４＾１６に対する抗血清（夫々レーン２．４．　６．８、ＩＯ）はＨＴＬＶ−１ｇ９４６および／またはｇｐ６３と反応したが、免疫感作１１１ｊの血清（夫々レーン１．３．５．８．９　）では反応しなかった。陽性対照として使用された抗）ＩＴＬＶ−１工ンベロープモノクローナル抗体１ｃｌｌは、ｇ、４６およびｇｐ６３　（ライン１２）とも反応したが、陰性対照の腹水（Ｐ３Ｘ６３）は反応しなかった（レーン１１）；これらの結果は図２に示されている。イムノプロット分析において、ｇｐ４６に対する抗ペプチド抗血清の反応性は、対応するペプチドによって先にインキュベートした抗血清によって特異的に阻害された（図３）。また、ｇＭ６に結合する抗ペプチド抗体の特異性を評価するために、ＨＴＬＶ−１ｇｐ４６ペプチド５Ｐ−６に対する抗血清が、２００μｇの５Ｐ−６（レーン１）または５Ｐ−５（レーン２）の何れかと共に予めインキュベートされ、次いて、イムノプロット分析においてｇｐＪ６と反応された。合成ペプチド５Ｐ−６は、ｇｐ４６と結合する抗５Ｐ−６抗体を完全に阻害した（レーンｌ）が、５Ｐ−５は疎外しなかった（レーン２）。レーン３は、正常ウサギの血清抗体（プラスペプチド５Ｐ−６）にはｇｐ４６に対する反応性が欠如していることを示している。上記のデータによって、ＩＩＴＬＶ−１ｇｐ４６由来のペプチド（ＢＴＬＶ−１特異性ペプチド）は、キャリア分子と結合されると、１７Ｌ１／−１ｇｐ４６に対する抗体を産生ずるために使用され得ることが示される。

実施例５図４Ａおよび図４Ｂに示される結果は、Ｊａｃｏｂｓｏｎ　ｅｌ　ａｌ。

（Ｖｉｒａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　（１９８７／１９８８）　ｌ：１５３−１６２）の方法を使用して１１られたものである。

図４Ａ：　患者Ａから得たＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞が、ｔｌＴＬＶ−１ｅｎｖにコードされる合成ペプチド１−１１（表１）と共にインキュベートされ、５１Ｃ［て標識され、自己のクローン化細胞障害性Ｔ細胞系Ｐ−１０によるペプチド特異的殺生性を評価するためのターゲットとして使用された。ペプチド５Ｐ−４（ムーム）て被覆されたＢｌｌ胞、およびＦＩＴＬＹ−１（・−・）に感染した自己Ｔ細胞の両方が、患者へ由来の細胞障害性Ｔ細胞系Ｐ−１ｎによって殺生された。未処理の自己Ｂ細胞（○−○）または残りの１１ペプチドの何れかで被覆されたＢ細胞（Δ−Δ）は殺生されなかった。

図５　Ｂ　：　ＩＩＬＡ−ＤＲ２において細胞障害性のＴ細胞系Ｐ−１０と適合する二つの異種Ｂ細胞系（・−・、ムーム）と、ペプチド５Ｐ−４て被覆されて上記のように細胞障害性試験でターゲットとして使用される、）ＩＬＡ−ＤＲ２において不適合の一つのＢｍ　胞系（０−○）。ペプチド４Ａて被覆され１１つＩＬＡ−ＤＲ２Ｉ：おいて適合するＢ細胞は、Ｔ細胞系Ｐ−１０によって殺生された。

しかるに、ペプチド５Ｐ−４Ａて１皮覆され１１つ）ＩＬＡ−ＤＲ２において不適合のＢ細胞では、実質的に少しの殺生しか見られなかった。

これらの結果は、ペプチド５Ｐ−４八により規定されるＨＴＬＶ−１ｇｐ４６の領域（アミノ酸１９８−２０９）に、ＩＬＡ−ＤＲ２制限細胞障害性Ｔ細胞系てムｍ゛認されるエピトープが含まれることを示している。

実施例６Ａ、　合成ペプチド−破傷風トキソイド１９合体を用い、フロイント完全アジュバント中の該１夏合体５　ｍｇを皮下注射（１０）することにより、並びにフロイント不完全アジュ／〈シト中の該；夏合体を皮下注射（８，１５，２２，２９０）することにより、ウサギを免疫感作した。

ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｅｎｖ遺伝子にコードされる合成ペプチドのアミノ酸配列か、表１に掲載されている。

ＶＳＶ　（）ＩＴＬＶ−１）誘導プラーク形成のパーセント阻害を示すデータか与えられる。ｖＳｖゲノムおよび）ＩＴＬＶ−１エンベロープ糖蛋白を含む偽型パーティクルの力価が測定され、−回の分析で、＋５０−２００のプラークを与えた。この試験は、Ｃｌａｍｐｂａｍｅｔ　ａｔ　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８１：２８８６．　＋９８４の方法に従って、Ｄｒ、Ｐａｕｌ　Ｃｌａｐｈａｍによって行われた。この報文の全内容が、本明細書中に参照として組み込まれる。

疫感作回数　１　２　３　４　４Ａ　５　６　７　８　９　１０　１１免疫感作前の血清　００　０００　００００００　０４　５０５０　５００　０　０　０　ＮＤＮＤＮＤＮＤ　ＮＤＢ、　破傷風トキソイドに結合された合成ペプチド５Ｐ−２（ＥＴＬＶ−１１ンベロープアミノ酸８６−１０７を含む）および５Ｐ− ３／４Ａ　（ＩＩＴＬＶ−１エンベロープアミノ酸１７６−２０９を含む）に対する抗ペプチド抗血清を、二匹のヤギ（１２０，２＋）に産生させた。両方のヤギから得た抗血清（免疫感作前の血清ではなく）が、ＩＩＴＬＶ−１で感染された細胞の、非感染ヒトＴ細胞と融合する能力（シンシチウム形成）を阻害した。

どのペプチドが、ヤギ２０．　２１においてＨＴＬＶ−１中和抗体の誘発に関係しているかを確定するために、熱不活性化（５６°Ｃ１３０分）した抗血清が、１０億分の１モル量のペプチド５Ｐ−２，５Ｐ−３／４＾または陰性対照ジペプチド５Ｐ−７（ＨＴＩＪ−１エンベロープアミノ酸３７４−３９２を含む）の何れかと共に、２３°Ｃで１時間、予めインキュベートされた。１０％の熱不活性化した牛胎児の血清を含む９０１１１のＰＲＭ１１６４０培地中の、５　Ｋ　１０’のＩＩＴＬＶ−１感染Ｃ９１ＰＬ細胞および５　ｘ　１０’の非感染Ｃ８１６６ヒトＴ細胞を含んでいるマイクロタイタウエル内に、１０μｍの抗血清か添加された。このマイクロタイタブレートを、３７°Ｃで一晩、５％ＣＯ２の湿潤室内でインキュベートされた。次に、シンシテイア（ｓｙｎｃｙｔｉａ）の存在について、オリンパス０Ｍ−２逆光顕微鏡を用い、２００倍の倍率でマイクロタイタウエルを調べた。その結果、抗体プラス５Ｐ−２ペプチドをａむウェル中でシンシテイアが増加していることに）ミされるように、ペプチド５Ｐ−２（ＳＰ −３／４＾、または５Ｐ−７ではない）が、投−′ｊ、ｆｉ！Ｌに依存して、＃２０および２１抗血請由来の中和抗体の９０％以上を吸収した。ペプチド５Ｐ− ２自身は、Ｃ８１６６またはＣ９］ＰＬ細胞によるシンシティラム影成を誘導しなかった（表示せず）。上記の結果は、＃２０および２１抗血清中の中和抗体が、ペプチド５Ｐ−２に対して作用することを示している（図５参照）。

ＨＴＬＶ−１ペプチド５Ｐ−２（エンベロープアミノ酸８６−１０７　＞の部分アミノ酸配列を含む短縮ペプチドか合成され、上記のような吸収実験に用いられた。）ＩＴＬＶ−１エンベロープアミノ酸８６−９８．８８−９８．　９０−９８を含むペプチドのみが、ヤギの抗血清＃２０および２１中の中和抗体を吸収することができた。

コノ研究によって、ＢＴＩ、Ｖ−１エンベロープアミノ酸９０−９８への中和部位かマツピングされた（表６参照）。

表６ＳＰ−２ペプチドを用いた、ＩＩＴＬＶ−１に対する中和抗体の吸収吸収されアミノ酸配列　（ａａ８６−１０７）　た中和＾ｂＰＨＷＴＫＫＰＮＲＮＧＧＧＹＹＳＡＳＹＳＤＰ　十ＧＧＧＹＹＳＡＳＹＳＤＰ　− ＰＨＷ、ＴＫＫＰＮＲＮＧＧＧ　十ＷＴＫＫＰＮＲＮＧＧＧ　＋ＫＫＰＮＲＮＧＧＧ　＋ＫＰＮＲＮＧＧＧ　−ｔｏ± 実施例７アミノ末端１１ＴＬＶ−１中和ドメインの変異分析ＨＴＬＶ−１のエンベロープアミノ酸８８−９８内のどのアミノ酸が、ＨＴＬＶ−１に対する中和抗ペプチド抗体の吸収に必要とされるかを確定するために、配列アミノ酸の夫々をアラニンで置換した１１のペプチド（２Ｌ１．１から２Ｌ１．１１）が合成された。これらの１１種の変異アミノ酸、および生のＢＴＬＶ−１配列を持つペプチド２Ｌ− １が、実施例６．Ｂ、で説明したようにして、３つのヤギの抗−５Ｐ−２血清（＃２０．　２＋および１２８）内の中和抗体を吸収するために使用された。表７に示すように、９１位および９３位のアスパラギンをアラニンに置換したペプチド（ペプチド１．６および１．８）は、３つの血清の全てにおいてＢＴＬＶ−１に対する中和抗体を吸収できなかった。

また、９０位をアラニン置換したペプチド１．３は、血清＃２１および１２Ｂで抗体を吸収できず、一方、ベプグード１．５　（９２位がアラニン）は血清＃２０中の中和抗体を吸収できなかった。

これらの結果によって、ＢＴＬＶ−１エンベロープアミノ酸のうちで、１９０（Ｋ）、　＃９２（Ｐ）、　＄９３（Ｎ）、および１９５（Ｎ）がＩＩＴＬＶ−１の中和に重要であることか確認された。

図６に掲載されているのは、これが抗血清１２０．２１および１２８の各ペプチド吸収に対して得られたＨＴＬＶ−１誘導シンジチアの数を示している点を除き、表７に要約しであるのと同じ実験の結果である。これらの結果は、１１２０．２］抗血清で３回、＃１２８抗血請で２回行われた典型的な実験である。

表７！！ＴＬＶ−１ペプチド変異中和＾ｂ吸収２ＬＩ　ＷＴＫＫＰＮＲＮＧＧＧ　＋　＋　＋２Ｌ−１，１ＡＴＫＫＰＮＲＮＧＧＣ＋　＋　＋１．２　ＷＡＫＫＰＮＲＮＧＧＧ　十　十　＋１．３　ＷＴＡＫＰＮＲＮＧＧＧ　＋　−−１，４、ＷＴＫＡＰＮＲＮＧＧＧ　＋　＋　＋１．５　ＷＴＫＫＡＮＲＮＧＧＧ　−＋　＋１．６　ＷＴＫＫＰＡＲＮＧＧＧ　−−− １，７ＷＴＫＫＰＮＡＮＧＧＧ　＋　＋　＋１．８　ＷＴＫＫＰＮＲＡＧＧＧ　 −−−１，９ＷＴＫＫＰＮＲＮＡＧＧ　±　＋　＋］、１０　ＷＴＫＫＰＮＲＮＧＡＧ　±　＋　＋１．１１　ＷＴＫＫＰＮＲＮＧＧＡ　±　＋　＋１、重要なアミノ酸は、全３血清についてＮ　（９３）およびＮ　（９５＞である。

２、吸収に必要な他のアミノ酸は、血清１２１および＃１２８ではＫ　（９０）、血清＃２０ではＰ　（９２）である。

３、Ｇ　（９６−９８）は、血清＃２０の吸収では重要な働きはしない。

実施例８抗ペプチド抗血清によるＨＴＬＶ−１の中和上記で確定されたＩＩＴＬＶ−１エンベロープの中和領域に対して相同な、ＨＴＬＶ−１１エンベロープのアミノ酸配列（アミノ酸８２−９７）をもったペプチドに対する抗血清が、２匹のヤギで産生された。このＨＴＬＶ−＋１ペプチド（ＤＰ−９０と称する）は破傷風トキソイドに結合され、該複合体がヤギ＃１２０および１３５の免疫感作に使用された（表８参照）。ＩＩＴＬｖ−１感染Ｃ９１ＰＬ細胞をＢＴＬＶ−１１感染Ｍｏ −Ｔ細胞に置き換えた点を除き、実施例６、Ｂ、に記載したシンシチウム試験によって７１ＰＩ定すると、これら両方のヤギから得た血清（予め免疫感作された血清ではなイ）ハ、ＨＴＬＶ−１１を中和した。ＩＩＴＬＶ−１１ペプチドＤＰ −９０に対する抗体は、ＨＴＬＶ−１を中和しなかった。これは、ＢＴＬＶ−Ｉ＋エンベロープのアミノ酸配列８２−９７が、ＨＴＬＶ−１１型に特異的な中和部位を含んでいることを示している。

表８１１ＴＬＶ−１＋ペプチド（ａａ　８２−９７）ＤＰ−９０ＰＨＷＩＫＫＰＮＲＱＧＬＧＹＹＳ　（Ｃ）ａ；シンシチウム阻害分析で実施ｂ；９０％以上阻害された最終の血ｆｔ希釈実施例９先の研究（Ｐａｌｋｅｔ　ｅｔ　ａｌ、１．　Ｉ＋ｔ＋ｍｕｎｏ！、１４２：３６１２−３６１９゜１９８９；　Ｈａｒｔ　ｅｔ　ａｌ、　Ｉ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４５：２６７？　−２６８５，１９９０）において、Ｔヘルパー細胞によって認識される部位およびヒト免疫不全ウィルス１型（ＨＩＶ−１）の（Ｂ細胞）中和部位を含む合成ペプチドが、ペプチドを破傷風トキソイド等のキャリア分子に結合させる必要なくして、ＨＩＶ−１単離物に対する中和抗体を誘発てきることが実証された。ＩＩＴＬＶ−１ペプチドを破傷風トキソイド等のキャリア分子に結合させる必要を回避することを目的として、ＨＴＬＶ−１エンベロープアミノ酸＋８３−２０９に対してアミノ末端に合成された、ＨＴＬＶ−１エンベロープペプチドアミノ酸＋８３−２０９を含むキメラＨＴＩＶ−１ペプチドは、ネズミＴヘルパー細胞によって認識される部位（アミノ酸１９０−２０９、　Ｋｕ＋ａｌａ　ｅｌ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４３：２０２４−２０３０．　１９８９）と、中和モノクローナル抗体０．５アルフアによって認識される部位（アミノ酸１８６−１９５．　Ｒａ１ｓｔｏｎｅｔ　ａｌ、１．　Ｂｏｉｌ、Ｃｂｅｍ、２６４：１６３４３−１６３４６．　１９８９　）及び中＋１＋ネズミモノクローナル抗体によって認識される部位（アミノ酸１９０−１９９．　Ｔａｎａｋａ　ｅｔ　ａｌ、ｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４７：３５４−３６０　）と、更にＣＤ４＋、ヒト細胞障害性Ｔ細胞（Ｊａｃｏｂｓｏｎ　ｅｌ　ａｌ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４６１１５５〜１１６２．　１９９１　）によって認識される部位（アミノ酸１９６−２０９　）とを含んでいる（図６を参照のこと）。二匹のヤギを免疫感作するために用いると、）ＩＴＬＶ−１（力価＝　］／２０）を中和する抗血清か得られた。中ｔｏ抗体はペプチド５Ｐ−２（アミノ酸８６− １０７）で吸収され１するか、ペプチド５Ｐ−３／４＾　（アミノ酸１７６−２０９　）では吸収されなかった。これは、キャリア分子とカップリングさせる必要なくして、該キメラペプチドか中ＦＩＪ抗体を誘発し１することを示している。更に、このペプチドによって誘発される全てのＩＩＴＬＶ−１に対する中和抗体は、上記の中和ドメインに肘して作用し、該ペプチド内に含まれる先に定義した他の中和部位に対しては作用しなかった。

以上、明瞭化と理解を計る目的で、上述の発明を実施例に従って詳細に説明した。当業者であれは、ここに開示した内容を読むことによって、）ＩＴＬＶ−１のワクチンが更に、ＩＩＴＬＶ−１の膜通過蛋白の親水性エンベロープ領域に対応する少なくとも一ツノ合成ヘフチド、好ましくは、ＹＡＡＱＩＩＲＲＧＩＤＬＩＦＷＥＱＧＧＦＬＣ（アミノ酸３７４−３８８　）　；　ＣＲＦＰＮＩＴＮＳ）ｌＶＰＩｔＱＥ　（７ミ／Ｍ　３９９−４１５）　１ＣＰＩＬＱＥＲＰＰＬＥＮＲ（アミノ酸４１１−４２２）　、　ＣＩＬＲＱＬＲＩ’ＩＬＰＳＲＶＲＹＰＩＩＹＳ　（７ミ／酸４６２−４８０）を具備し１７ることは明らかてあろう。また、本発明の範囲を逸脱することなく、形式および詳細における種々の組み合わせがなされ得ることも明かであろう。

上記に引用した全文献の内容は、その全体が参考として本明細書に組み込まれ、根拠とされる。

ＦＩＧ、ＩＣ”ｌ／！　ｆｆＦＩＧ、２ｍｌ　リ、Ｏく廿シンシティア＃Ｆ　Ｉ　Ｇ、　６Ａアラニンに変化したアミノ酸アラニンに変化したアミノ酸アラニンに変化したアミノ酸フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｖ　８３１０−２Ｊ３３１５７４　Ｃ９０１５−２ＪＩ

Claims

【特許請求の範囲】（ｉ）請求項３に記載のペプチドを、前記サンプルに接触させる工程と、（ｉｉ）前記サンプル中の抗ＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を、前記ペプチドと結合させる工程と、（ｉｉｉ）前記ペプチドと前記抗体との間の複合体の形成を測定する工程とを具備した方法。２０．哺乳類血清中において、ＨＴＬＶ−ＩＩに対する抗体の存在または力価を測定する方法であって、（ｉ）ペプチドである【配列があります】またはその免疫反応性の部分を、前記血清に接触させる工程と、（ｉｉ）前記抗体と前記ペプチドとの間の複合体を形成させる工程と、（ｉｉｉ）前記ペプチドと前記抗体との問の複合体の形成を、放射免疫試験または酵素結合免疫吸肴試験によって測定する工程とを具備した方法。２１．請求項４に記載のペプチドであって、前記アミノ酸配列が、【配列があります】であるペプチド。２２．請求項３に記載のペプチドであって、前記アミノ酸配列が、【配列があります】であるペプチド。２３．請求項７に記載の複合体であって、前記キャリア分子が、【配列があります】のアミノ酸配列を有する複合体。