PT2260055E - Anticorpos monoclonais contra a proteína rgm a e seus usos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "Anticorpos monoclonais contra a proteína RGM A e seus usos"

CAMPO TÉCNICO 0 presente pedido descreve anticorpos monoclonais que se ligam a RGM A e em particular com enxerto de CDR, suas versões humanizadas e que têm a capacidade de ligar RGM A e evitar a ligação de proteínas de RGM ao recetor de RGM A e a outras proteínas que ligam RGM A e consequentemente neutralizam a função de RGM A. Estes anticorpos podem ter utilidade no tratamento de vários estados incluindo esclerose múltipla, traumatismo craniano de mamífero, lesão da espinal medula, AVC, doenças neurodegenerativas e esquizofrenia, não se lhes limitando.

INFORMAÇÃO ANTERIOR A regeneração axonal após lesão ou após ataques inflamatórios ou após doenças neurodegenerativas intrínsecas ao sistema nervoso central (SNC) de mamíferos é praticamente sempre impossível; o resultado depende do equilíbrio entre a capacidade intrínseca de recrescimento das fibras de nervo do SNC e os fatores de inibição intrínsecos ao SNC, localizada no microambiente do local da lesão ou dano, que evitam ativamente o recrescimento e portanto a regeneração dos tratos de fibra lesionada.

Estabeleceu-se que a mielina do SNC, gerada por oligodendrócitos e a cicatriz proveniente da lesão, são as estruturas não-permissivas mais relevantes para crescimento axonal na fase inicial de uma lesão, causando colapso do cone de crescimento e inibição do crescimento de neurite in vitro assim como in vivo, resultando assim em inibição direta de recrescimento de axónios. Identificaram-se proteínas RGM, os principais fatores de inibição da mielina do SNC e de tecido de cicatriz (Monnier et ai., Nature 419: 392 - 395, 2002; Schwab et ai., Arch. Neurol.62: 1561-8, 2005a; Schwab et ai. Eur. J.

Neurosci. 21:1569-76, 2005 b; Hata et ai. J. Cell Biol. 173:47-58, 2006; para revisões consultar: Mueller et ai., Philos.

Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361: 1513-29, 2006; Yamashita et al. Curr. Opin. Neurobiol. 17: 29-34, 2007) . As proteínas RGM são reguladas positivamente em locais de dano ou lesão em humanos moribundos devido a traumatismo craniano ou insulto isquémico (Schwab et al., Arch. Neurol. 62: 1561-8, 2005a) e são reguladas positivamente nos locais da lesão em ratos com lesão da espinal medula (Schwab et al. Eur. J. Neurosci. 21:1569-76, 2005 b; Hata et al. J. Cell Biol.173:47-58, 2006 para revisões consultar: Mueller et al. , Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 361: 1513-29, 2006; Yamashita et al. Curr. Opin. Neurobiol. 17: 29-34, 2007). Além disso, os primeiros dados usando amostras clinicas de doentes de esclerose múltipla e de pessoas saudáveis sugeriram que RGM A humana é regulada positivamente no liquido cefalorraquidiano de doentes que sofrem de esclerose múltipla (dados não apresentados).

Para avaliar o potencial de promoção da regeneração de um anticorpo policlonal especifico de RGM A, administraram-se os anticorpos num modelo de lesão moderada a grave da espinal medula, no qual se efetuou transecção a 9/10 de aproximadamente 60% da espinal medula ao nivel torácico. A análise histológica revelou que tal lesão cortou todas as fibras dorsais e laterais do trato corticospinal. O anticorpo policlonal especifico de RGM A administrado localmente por bomba durante duas semanas induziu regeneração a longas distâncias de fibras nervosas lesionadas (Hata et al., J. Cell Biol. 173:47-58, 2006) .

Centenas de fibras nervosas apresentaram-se estendidas para além do local da lesão e as fibras mais longas regeneraram-se em mais de 10 mm para além da lesão, enquanto não se detetaram fibras em regeneração em posição distai à lesão em animais de controlo tratados com anticorpo. A recuperação funcional dos ratos tratados com o anti-RGM A foi significativamente melhorada comparativamente com ratos com lesão da espinal medula tratados com anticorpo de controlo, estabelecendo assim que RGM A é um potente inibidor de neurorregeneração e um alvo valioso para estimular a recuperação em indicações caracterizadas por danos axonais ou lesão de fibras nervosas (Hata et al., J. Cell Biol. 173:47-58, 2006; Kyoto et al. Brain Res. 1186: 74-86, 2007) . Além disso, neutralizar a proteína RGM A com um anticorpo policlonal bloqueador de funções estimulou não apenas o recrescimento das fibras nervosas danificadas em ratos com lesões da espinal medula como também aumentou a sua formação de sinapses permitindo assim a reformação ou restauração de circuitos neuronais danificados (Kyoto et al. Brain Res. 1186: 74-86, 2007) . A família de genes rgm abrange três genes diferentes, sendo dois deles, rgm a e b, expressos no SNC de mamífero e dando origem às proteínas RGM A e RGM B, enquanto o terceiro membro, rgm c, é expresso na periferia (Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sei. 361: 1513-29, 2006), em que RGM C desempenha um papel importante no metabolismo do ferro. In vitro, RGM A inibe o crescimento para o exterior de neurites por ligação a neogenina, que foi identificada como um recetor de RGM (Rajagopalan et al. Nat Cell Biol.: 6(8), 756-62, 2004). A neogenina foi inicialmente descrita como uma proteína de ligação a netrina (Keino-Masu et al. Cell, 87(2):175-85, 1996). Esta é uma constatação importante devido a se ter relatado que a ligação de netrina-1 a neogenina ou ao seu recetor intimamente relacionado DCC (eliminado em cancro colorretal), estimula e não inibe o crescimento de neurites (Braisted et al. J. Neurosci. 20: 5792-801, 2000) . Assim, bloquear RGM A liberta a inibição de crescimento mediada por RGM ao permitir que a neogenina se ligue à netrina, o seu ligando de estimulação de crescimento de neurites. Com base nestas observações, pode assumir-se que a neutralização de RGM A é superior à neutralização de neogenina em modelos de lesão da espinal medula humana. Além da ligação de RGM A a neogenina e da inibição do crescimento de neurites, a ligação de RGM A ou B às proteínas morfogenéticas ósseas BMP-2 e BMP-4 poderia representar outro obstáculo a neurorregeneração bem sucedida e à recuperação funcional (Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sei. 361: 1513-29, 2006) . Há necessidade na especialidade de anticorpos melhorados capazes de ligar RGM A, preferentemente um anticorpo monoclonal que bloqueia RGM A e evita a interação entre RGM A e o seu recetor e/ou proteínas de ligação, i.e. neogenina e BMP-2, BMP-4 . O presente pedido proporciona (a) a geração de um anticorpo monoclonal neutralizante contra RGM A, que inibe seletivamente a ligação de RGM A ao seu recetor neogenina e às proteínas morfogenéticas ósseas 2 e 4 (BMP-2, BMP-4) e (b) a geração de um anticorpo monoclonal neutralizante contra RGM A, que inibe seletivamente a ligação de RGM A às proteínas morfogenéticas ósseas 2 e 4 (BMP-2, BMP-4). Espera-se que os anticorpos monoclonais neutralizantes da presente invenção estimulem ο recrescimento de fibras nervosas lesionadas ou danificadas e formação de sinapses funcionais de regeneração de fibras nervosas dado que um dos anticorpos monoclonais neutralizantes da presente invenção parece transformar a natureza inibitória de RGM A numa condição na qual as células neuronais preferem migrar e crescer num substrato de RGM A e não num substrato permissivo tal como colagénio I. Além disso este anticorpo é capaz de induzir regeneração a longa distância num modelo de rato in vivo de lesão de nervo ótico e também melhora a remielinização de fibras nervosas lesionadas e em regeneração.

Por conseguinte, espera-se que os anticorpos monoclonais neutralizantes da presente invenção promovam regeneração neuronal e recrescimento de ligações neuronais danificadas ou partidas no SNC humano lesionado ou inflamado, por exemplo em esclerose múltipla, após lesão aguda da espinal medula, traumatismo craniano ou em doenças neurodegenerativas tais como por exemplo, coreia de Huntington, doença de Parkinson, doença de Alzheimer.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais isolados compreendendo um domínio de ligação de antigénio, em que o referido anticorpo é capaz de ligar um epítopo de uma molécula de RGM, em que o referido domínio de ligação de antigénio compreende um domínio variável da cadeia pesada com pelo menos três regiões determinantes de complementaridade e um domínio variável da cadeia leve com pelo menos três regiões determinantes de complementaridade, em que as regiões determinantes de complementaridade do domínio variável da cadeia pesada têm a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:57, SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 59 e as regiões determinantes de complementaridade do domínio variável da cadeia leve têm a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61 e SEQ ID NO:62.

De acordo com um aspeto, a presente invenção proporciona um anticorpo que se dissocia de RGM A humana (hRGM A) com uma Kd de 1 x 10~7 M ou menos e uma constante de velocidade k0ff de 1 x 10~2 s_1 ou menos, ambas determinadas por ressonância plasmónica de superfície.

De acordo com outro aspeto, a invenção refere-se a um anticorpo, como por exemplo um anticorpo que apresenta as características cinéticas anteriormente descritas, que se liga a RGM A humana e neutraliza a atividade de inibição do crescimento para o exterior de neurites de RGM A humana tal como determinado num ensaio in vitro padrão, como por exemplo o ensaio de crescimento para o exterior neuronal Ntera tal como exemplificado no exemplo 3, seguidamente. A invenção também se refere a um anticorpo tal como definido anteriormente, com pelo menos uma das seguintes características funcionais adicionais: ligação a RGM A de rato, ligação a RGM C humana e ligação a RGM C de rato.

Nomeadamente, o anticorpo tal como aqui descrito modula a capacidade de RGM se ligar a pelo menos um dos seus recetores.

Tal anticorpo, em particular, liga-se a um domínio de ligação a recetor de RGM A humana. Para RGM A identificaram-se domínios de ligação de recetor nos terminais N e C. As concretizações particulares dos anticorpos da invenção ligam-se ao terminal N do domínio de ligação de receptor de RGM A, tal como ilustrado pela inibição da ligação entre um fragmento do terminal N de hRGM A, tal como por exemplo 47-168 e moléculas de recetor, tal como neogenina e BMP-4. 0 referido fragmento do terminal N de hRGM A pode ter um comprimento total de cerca de 30 a cerca de 150 ou cerca de 30 a cerca de 122 resíduos de aminoácidos. Como um exemplo não limitativo pode mencionar-se o fragmento 0 (correspondente aos resíduos 47-168 do terminal N) de hRGM A tal como aqui descrito ou qualquer fragmento de ligação de recetor mais curto.

Nomeadamente o referido anticorpo modula, preferentemente inibe, pelo menos uma das seguintes interações: ligação de RGM A humana a BMP-4 humana. ligação de hRGM A a neogenina humana, ligação de hRGM C a neogenina humana, ligação de RGM A humana a BMP-2 humana.

De acordo com uma concretização especifica, o anticorpo tal como aqui definido é um anticorpo humanizado. 0 anticorpo descrito anteriormente tem um domínio de ligação de antigénio, em que a referida proteína de ligação é capaz de ligar um epítopo de uma molécula de RGM e compreende pelo menos dois conjuntos de CDR de domínio variável que são o conjunto de VH 5F9 e o conjunto de VL 5F9. 0 anticorpo de acordo com a invenção compreende adicionalmente um esqueleto de aceitador humano. 0 referido esqueleto de aceitador humano pode compreender pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 e 33. A proteína de ligação da invenção pode, em particular, compreender pelo menos um conjunto de sequências de esqueleto selecionadas do grupo que consiste dos conjuntos: (1) conjunto VH3-48 (Seq ID NO: 15, 16 e 17) conjunto VH3-33 (SEQ ID NO: 21, 22 e 23) conjunto VH3-23 (SEQ ID NO: 24, 25 e 26) sendo cada um dos conjuntos combinado com uma sequência de esqueleto adicional, selecionada de JH3 (SEQ ID NO:18), JH4 (SEQ ID NO:19), JH6 (SEQ ID NO :20) ; ou (2) selecionado do grupo que consiste dos conjuntos conjunto A18: (SEQ ID NO: 27, 28 e 29) conjunto A17: (SEQ ID NO: 31, 32 e 33) sendo cada um dos conjuntos combinado com uma sequência de esqueleto adicional, selecionada de JK2 (SEQ ID NO:2)

De acordo com concretizações específicas, o anticorpo da invenção compreende pelo menos um domínio variável da cadeia pesada com enxerto de CDR selecionado de SEQ ID NOs: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 e 43; e/ou pelo menos um domínio variável da cadeia leve com enxerto de CDR selecionada de SEQ ID NO: 44, 45 e 46.

Mais especificamente, o anticorpo da invenção compreende uma combinação de dois domínios variáveis em que os referidos dois domínios variáveis têm sequências de aminoácidos selecionadas de: SEQ ID NOs: 35 e 44; 36 e 44; 37 e 44; 38 e 44; 39 e 44; 40 e 44; 41 e 44; 42 e 44; 43 e 44; SEQ ID NOs: 35 e 45; 36 e 45; 37 e 45; 38 e 45; 39 e 45; 40 e 45; 41 e 45; 42 e 45; 43 e 45; SEQ ID NOs: 35 e 46; 36 e 46; 37 e 46; 38 e 46; 39 e 46; 40 e 46; 41 e 46; 42 e 46; 43 e 46.

Noutra concretização da invenção, o referido esqueleto de aceitador humano do anticorpo compreende pelo menos uma substituição de aminoácidos na região de esqueleto num resíduo chave, sendo o referido resíduo chave selecionado do grupo que consiste de: um resíduo adjacente a uma CDR; um resíduo num local de glicosilação; um resíduo raro; um resíduo capaz de interagir com um epítopo de RGM; um resíduo capaz de interagir com uma CDR; um resíduo canónico; um resíduo de contacto entre a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve; um resíduo no interior de uma zona de Vernier; um resíduo N-terminal capaz de formação de paraglutamato e um resíduo numa região que se sobrepõe entre uma CDR1 de cadeia pesada variável definida por Chothia e um primeiro esqueleto de cadeia pesada definido por Rabat

Nomeadamente, os referidos resíduos chave são selecionados do grupo que consiste de (posição de sequência de cadeia pesada): 1, 5, 37, 48, 49, 88, 98 (posição de sequência de cadeia leve): 2, 4, 41, 51.

Numa concretização específica, o anticorpo da invenção é ou compreende um domínio variável humano consensual.

De acordo com outra concretização do anticorpo da invenção, o referido esqueleto de aceitador humano compreende pelo menos uma substituição de aminoácidos na região de esqueleto, em que a sequência de aminoácidos do esqueleto é pelo menos 65%, tal como por exemplo pelo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntica à sequência do referido esqueleto de aceitador humano e compreende pelo menos 70 resíduos de aminoácidos, tal como por exemplo pelo menos 75, 80 ou 85 resíduos, idênticos ao referido esqueleto de aceitador humano.

De acordo com uma concretização específica, o anticorpo da invenção compreende pelo menos um domínio variável com mutações no esqueleto com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50; (domínio VH) e/ou selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID NO: 51, 52, 53 e 54 (domínio VL)

Nomeadamente, o referido anticorpo compreende dois domínios variáveis de esqueleto mutados opcionais, em que os referidos dois domínios variáveis têm sequências de aminoácidos selecionadas dos grupos que consistem de: SEQ ID NOs: 47 e 44; 47 e 45; 47 e 46; 47 e 51; 47 e 52; 47 e 53; 47 e 54; SEQ ID NOs: 48 e 44; 48 e 45; 48 e 46; 48 e 51; 48 e 52; 48 e 53; 48 e 54; SEQ ID NOs: 49 e 44; 49 e 45; 49 e 46; 49 e 51; 49 e 52; 49 e 53; 49 e 54; SEQ ID NOs: 50 e 44; 50 e 45; 50 e 46; 50 e 51; 50 e 52; 50 e 53; 50 e 54.

Os anticorpos da invenção tal como aqui descritos são capazes de ligação a pelo menos um alvo selecionado de moléculas de RGM.

Nomeadamente, são capazes de ligação a RGM A humana e opcionalmente a pelo menos uma molécula de RGM adicional de origem humana ou originária de macacos cinomólogos, rato, pinto, sapo e peixe.

Por exemplo, podem ligar-se adicionalmente a RGM A de rato, RGM C humana e/ou RGM C de rato.

Nomeadamente, o anticorpo da invenção é capaz de modular, em particular, é capaz de neutralizar ou inibir uma função biológica de um alvo selecionado de moléculas de RGM tal como definidas anteriormente.

Nomeadamente, o anticorpo da invenção modula, em particular inibe, a capacidade de RGM se ligar a pelo menos um dos seus recetores, tal como por exemplo neogenina e BMP, tal como BMP-2 e BMP-4 .

Por exemplo, o referido anticorpo modula, em particular diminui e preferentemente inibe pelo menos uma das seguintes interações: ligação de RGM A humana a BMP-4 humana, ligação de hRGM A a neogenina humana, ligação de hRGM C a neogenina humana, ligação de RGM A humana a BMP-2 humana.

Os anticorpos com diferentes combinações de características funcionais e consequentemente apresentando diferentes perfis funcionais, tal como aqui divulgado, estão também abrangidos pelo âmbito da invenção. Os exemplos não limitativos de tais perfis são listados seguidamente:

Por exemplo, o perfil 1 é verificado pelo anticorpo 5F9 tal com proporcionado pela presente invenção e os seus derivados aqui descritos.

Nomeadamente, um anticorpo da invenção é capaz de inibir pelo menos uma atividade biológica de RGM, em particular RGM A, em que a referida RGM A é selecionada de humanos, macacos cinomólogos, rato, pinto, sapo e peixe.

De acordo com outra concretização o anticorpo da invenção tem uma ou mais das seguintes características cinéticas: (a) uma constante de velocidade de ligação (kon) ao referido alvo selecionada do grupo que consiste de: pelo menos cerca de 102 M_1s_1; pelo menos cerca de 103 M_1s_1; pelo menos cerca de 104 M_1s_1; pelo menos cerca de 105 M_1s_1; pelo menos cerca de 106 M~ 4s_1 e pelo menos cerca de 107 M_1s_1, tal como medido por ressonância plasmónica de superfície; (b) uma constante de velocidade de dissociação (k0ff) do referido alvo selecionada do grupo que consiste de: no máximo cerca de 10~2 s~4, no máximo cerca de 10~3 s~4; no máximo cerca de ICh4 s~4; no máximo cerca de ICh5 s~4; e no máximo cerca de lCb6 s~ 4, tal como medido por ressonância plasmónica de superfície; ou (c) uma constante de dissociação (Kd) ao referido alvo selecionada do grupo que consiste de: no máximo cerca de lCb7 M; no máximo cerca de 10-8 M; no máximo cerca de 10-9 M; no máximo cerca de lCh10 M; no máximo cerca de lCh11 M; no máximo cerca de lCh12 M; e no máximo lCh13 M.

De acordo com um aspeto adicional, a presente invenção proporciona uma construção de anticorpo compreendendo um anticorpo descrito anteriormente, compreendendo adicionalmente a referida construção de anticorpo um ligante polipeptídico ou um domínio constante de imunoglobulina. A referida construção de anticorpo da invenção pode ser selecionada do grupo que consiste de: uma molécula de imunoglobulina, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo com enxerto de CDR, um anticorpo humanizado, um Fab, um Fab' , um F (ab' )2, um Fv, um Fv com ligação dissulfureto, um scFv, um anticorpo de domínio único, um diacorpo, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo com dupla especificidade, uma imunoglobulina com domínio variável duplo e um anticorpo biespecífico.

Numa construção de anticorpo de acordo com a invenção o referido anticorpo compreende um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina selecionado do grupo que consiste de: um domínio constante de IgM humano, um domínio constante de IgGl humano, um domínio constante de IgG2 humano, um domínio constante de IgG3 humano, um domínio constante de IgG4 humano, um domínio constante de IgE humano, um domínio constante de IgD humano, um domínio constante de IgAl humano, um domínio constante de IgA2 humano, um domínio constante de IgY humano e os domínio constantes mutados correspondentes.

Nomeadamente, uma construção de anticorpo de acordo com a invenção compreende um domínio constante de imunoglobulina com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID NO: 11, 12, 13 e 14.

De acordo com outro aspeto, a presente invenção proporciona um conjugado de anticorpo compreendendo uma construção de anticorpo aqui descrita, compreendendo adicionalmente o referido conjugado de anticorpo um agente selecionado do grupo que consiste de; uma molécula de imunoadesão, um agente de imagem, um agente terapêutico e um agente citotóxico, sendo cada um dos agentes conjugado, por exemplo ligado covalentemente à referida proteína de ligação.

Por exemplo, o referido agente é um agente de imagem selecionado do grupo que consiste de um marcado radioativo, uma enzima, um marcador fluorescente, um marcador luminescente, um marcador bioluminescente, um marcador magnético e biotina. Nomeadamente, o referido agente de imagem é um marcado radioativo selecionado do grupo que consiste de: 3H, 14C, 35S, 9oy, 99TC, 711In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho e 153Sm.

Por exemplo, o referido agente é um agente terapêutico ou citotóxico selecionado do grupo que consiste de; um antimetabolito, um agente alquilante, um antibiótico, um fator de crescimento, uma citocina, um agente antiangiogénico, um agente antimitótico, uma antraciclina, toxina e um agente apoptótico.

De acordo com outra concretização, o referido anticorpo da invenção tal como aqui descrito apresenta um padrão de glicosilação humano.

Além disso, os anticorpos, construções de anticorpos e conjugados de anticorpo de acordo com a invenção podem existir como um cristal (na forma cristalina), preferentemente mantendo a atividade biológica.

Nomeadamente, o referido cristal é um cristal de libertação controlada de fármaco isento de transportador. Tendo isto em conta, a forma cristalina do anticorpo, construção de anticorpo ou conjugado de anticorpo pode ter uma semivida mais longa in vivo de que o homólogo solúvel correspondente.

Noutro aspeto, a presente invenção proporciona um ácido nucleico isolado que codifica para uma sequência de aminoácidos de anticorpo, sequência de aminoácidos de construção de anticorpo e sequência de aminoácidos de conjugado de anticorpo tal como aqui descrito. A invenção também se refere a um vetor compreendendo um ácido nucleico isolado tal como aqui descrito. Nomeadamente, o vetor é selecionado do grupo que consiste de pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV e pBJ. A invenção também se refere a uma célula hospedeira compreendendo tal vetor. Nomeadamente, a referida célula hospedeira é uma célula procariótica, tal como por exemplo E.coli; ou é uma célula eucariótica e pode ser selecionada do grupo que consiste de célula protista, célula animal, célula vegetal e célula fúngica. Nomeadamente, a referida célula eucariótica é uma célula animal selecionada do grupo que consiste de; uma célula de mamífero, uma célula aviária e uma célula de inseto. Preferentemente a referida célula hospedeira é selecionada de células HEK, células CHO, células COS e célula de levedura. A célula de levedura pode ser Saccharomyces cerevisiae e a referida célula de inseto pode ser uma célula de Sf 9 . A invenção também proporciona um método de produzir uma proteína capaz de ligação a RGM, compreendendo cultivar uma célula hospedeira tal como aqui definida em meio de cultura em condições suficientes para produzir uma proteína de ligação capaz de ligação a RGM. A invenção também se refere a uma proteína produzida de acordo com o referido método. A invenção também proporciona uma composição para a libertação de um anticorpo, compreendendo a referida composição (a) uma formulação, em que a referida formulação compreende um produto de proteína cristalizada tal como aqui definido e um ingrediente; e (b) pelo menos um transportador polimérico. 0 referido transportador polimérico pode ser um polímero selecionado de um ou mais do grupo que consiste de: poli (ácido acrílico), policianoacrilatos, poliaminoácidos, polianidridos, poli(depsipéptido), poliésteres, poli (ácido láctico), poli (ácido láctico-co-glicólico) ou PLGA, poli(b- hidroxibutirato), poli(caprolactona), poli(dioxanona); polietilenoglicol, poli(hidroxipropil) metacrilamida, poli [ (organo)fosfazeno], poli(ortoésteres), poli (álcool vinílico), poli(vinilpirrolidona), copolímeros de anidrido maleico-alquilviniléter, polióis plurónicos, albumina, alginato, celulose e derivados de celulose, colagénio, fibrina, gelatina, ácido hialurónico, oligossacáridos, glicaminoglicanos, polissacáridos sulfatados, suas misturas e copolímeros. 0 referido ingrediente pode ser selecionado do grupo que consiste de albumina, sacarose, tre-halose, lactitol, gelatina, hidroxipropil-B-ciclodextrina, metoxipolietilenoglicol e polietilenoglicol.

De acordo com outro aspeto, a presente invenção proporciona uma composição tal como aqui definida para uso num método para tratar um mamífero compreendendo a etapa de administrar ao mamífero uma quantidade eficaz da composição tal como aqui definida.

De acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo o produto (em particular, um anticorpo, construção ou conjugado tal como aqui descrito anteriormente) e um transportador farmaceuticamente aceitável. 0 referido transportador farmaceuticamente aceitável pode funcionar como um adjuvante útil para aumentar a absorção ou dispersão do referido anticorpo.

Por exemplo o referido adjuvante é hialuronidase.

De acordo com outra concretização, a referida composição farmacêutica compreende adicionalmente pelo menos um agente terapêutico adicional para tratar uma doença na qual a atividade de RGM é nociva. Por exemplo, o referido agente é selecionado do grupo que consiste de: agente terapêutico, agente de imagem, agente citotóxico, inibidores de angiogénese; inibidores de cinase; bloqueadores de moléculas de coestimulação; bloqueadores de moléculas de adesão; anticorpo anti-citocina ou seu fragmento funcional; metotrexato; ciclosporina; rapamicina; FK506; marcador ou repórter detetável; um antagonista de TNF; um antirreumático; um relaxante muscular, um narcótico, um fármaco anti-inflamatório não esteroide, um analgésico, um anestésico, um sedativo, um analgésico local, um bloqueador neuromuscular, um antimicrobiano, um antipsoriático, um corticosteroide, um esteroide anabolizante; uma eritropoietina, uma imunização, uma imunoglobulina, um imunossupressor, uma hormona de crescimento, um fármaco de substituição hormonal, um radiofármaco, um antidepressivo, um antipsicótico, um estimulante, um medicamento contra a asma, um beta agonista, um esteroide inalável, uma epinefrina ou análogo, uma citocina e um antagonista de citocina. A presente invenção também se refere a um método para reduzir a atividade de RGM A humana compreendendo por em contacto RGM A humana com pelo menos um produto (em particular, uma proteína de ligação, construção ou conjugado tal como aqui anteriormente descrito), tal que pelo menos uma atividade de RGM A humana seja reduzida. A presente invenção também se refere a um produto da invenção (em particular, um anticorpo, construção ou conjugado tal como aqui anteriormente descrito) para uso num método para diminuir a ligação de hRGM A ao recetor de neogenina num indivíduo que dela necessite, compreendendo a etapa de administrar ao indivíduo um produto da invenção (em particular, um anticorpo, construção ou conjugado tal como aqui anteriormente descrito). A presente invenção também se refere a um produto da invenção (em particular, um anticorpo, construção ou conjugado tal como aqui anteriormente descrito) para uso num método para diminuir a ligação de hRGM A à proteína morfogenética óssea-2 e/ou proteína morfogenética óssea-4 (BMP-2 e BMP-4) num indivíduo que dela necessite, compreendendo a etapa de administrar ao indivíduo um produto da invenção (em particular, um anticorpo, construção ou conjugado tal como aqui anteriormente descrito). A presente invenção também se refere a um produto da invenção (em particular, um anticorpo, construção ou conjugado tal como aqui anteriormente descrito) para uso num método para tratar um indivíduo para uma doença associada com atividade de RGM A compreendendo a etapa de administrar um produto da invenção (em particular, um anticorpo, construção ou conjugado tal como aqui descrito) sozinho ou em combinação com outros agentes terapêuticos. A presente invenção também se refere a um produto da invenção (em particular, um anticorpo, construção ou conjugado tal como aqui anteriormente descrito) para uso num método para reduzir a atividade de RGM A num indivíduo que sofre de uma doença na qual a atividade de RGM A é nociva, compreendendo administrar ao indivíduo um produto da invenção (em particular, um anticorpo, construção ou conjugado tal como aqui anteriormente descrito), sozinho ou em combinação com outros agentes terapêuticos. A referida doença preferentemente compreende doenças neurológicas selecionadas do grupo compreendendo esclerose lateral amiotrófica, lesão do plexo braquial, lesão cerebral, incluindo lesão de traumatismo craniano, paralisia cerebral, Guillain Barre, leucodistrofias, esclerose múltipla, pós-pólio, espinha bífida, lesão da espinal medula, atrofia da espinal medula, tumores espinais, AVC, mielite transversa; demência, demência senil, dificuldades cognitivas moderadas, demência relacionada com Alzheimer, coreia de Huntington, discinesia tardia, hipercinesias, manias, doença de Parkinson, síndrome de

Steel-Richard, síndrome de Down, miastenia grave, traumatismo dos nervos, amiloidose vascular, hemorragia cerebral I com amiloidose, inflamação cerebral, doença de confusão aguda, esclerose lateral amiotrófica, glaucoma e doença de Alzheimer.

Descrevem-se adicionalmente seguidamente aspetos particulares adicionais da invenção:

Um anticorpo monoclonal isolado da invenção que interage especificamente com pelo menos um epítopo de uma proteína hRGM A; sendo o referido anticorpo um anticorpo monoclonal neutralizante ou seu fragmento de ligação a antigénio; compreendendo o referido fragmento de ligação a antigénio um domínio VH e um domínio VL; diminuindo o referido anticorpo neutralizante a capacidade de hRGM A se ligar ao seu recetor; sendo o referido anticorpo neutralizante capaz de inibir a atividade biológica de hRGM A; reconhecendo o referido anticorpo um recetor de RGM A selecionado de humano, macacos cinomólogos, rato, pinto, sapo e peixe; reconhecendo o referido anticorpo uma proteína RGM A que apresenta 90% de homologia com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2; o referido anticorpo em que a proteína RGM A é codificada por um ácido nucleico que apresenta 90% de homologia com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO:l; tendo o referido anticorpo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência compreendendo uma região variável da cadeia pesada (região VH) compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 9 ou 34 ou uma versão humanizada, opcionalmente adicionalmente mutada da referida região VH; tendo o referido anticorpo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência compreendendo uma região variável da cadeia leve (região VL) compreendendo a sequência de SEQ ID NO:10 ou uma versão humanizada, opcionalmente adicionalmente mutada da referida região VL. O referido anticorpo que se liga a hRGM A em que o anticorpo é glicosilado; o referido anticorpo ou fragmento de ligação de antigénio, em que o referido anticorpo ou fragmento de ligação de antigénio é um anticorpo de ratinho, um anticorpo humanizado, um completamente humano, um anticorpo quimérico, um fragmento de ligação de antigénio de um anticorpo humanizado ou um fragmento de ligação de antigénio de um anticorpo quimérico; o referido anticorpo ou fragmento de ligação de antigénio, em que o referido anticorpo ou fragmento de ligação de antigénio é um fragmento de ligação de antigénio selecionado do grupo que consiste de um fragmento Fab, um fragmento Fab' , um fragmento F (ab' i e um fragmento Fv; o referido anticorpo monoclonal que se liga especificamente a pelo menos um epítopo de hRGM A, em que o referido anticorpo monoclonal é o anticorpo monoclonal excretado pela linha celular de hibridoma tal como aqui descrita; o referido anticorpo monoclonal, em que a ligação resulta em inativação da interação de hRGM A com o seu recetor; a referida linha celular de hibridoma que produz o referido anticorpo monoclonal; a referida linha celular de hibridoma, em que o hibridoma é selecionado do grupo que consiste de hibridoma humano, de ratinho, rato, ovelha, porco, bovino, cabra e cavalo; o referido anticorpo monoclonal, em que a ligação resulta em inativação de hRGM A; a referida linha celular de hibridoma que produz o referido anticorpo monoclonal; a referida linha celular de hibridoma, em que o hibridoma é selecionado do grupo que consiste de hibridoma humano, de ratinho, rato, ovelha, porco, bovino, cabra e cavalo; o referido anticorpo monoclonal neutralizante ou seu fragmento de ligação de antigénio, com pelo menos uma caracteristica selecionado do grupo que consiste de: a) ligação a RGM A de mamífero com afinidade na gama do nM ou inferior; b) antagonização funcional in vitro da atividade de RGM A no ensaio de crescimento para o exterior de neurites com eficácia de μΜ, nM ou inferior; c) indução de germinação in vivo no modelo de esmagamento de nervo ótico; d) indução de germinação in vivo no modelo de lesão da espinal medula; e) alívio in vivo da lesão da espinal medula experimental por aumento do crescimento regenerativo das fibras nervosas lesionadas; ou f) alívio in vivo da lesão da espinal medula experimental por promoção da formação de sinapses; um ácido nucleico isolado que codifica para o referido anticorpo monoclonal neutralizante ou fragmento de ligação de antigénio; um vetor compreendendo o referido ácido nucleico isolado; o referido vetor selecionado do grupo que consiste de pcDNA; pTT; pTT3; pEFBOS; pBV; pJV; pHybE e pBJ; uma célula hospedeira transformada com o referido vetor de acordo com que a célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste de célula de protista, célula animal, célula vegetal e célula fúngica; a referida célula hospedeira, em que a célula animal é uma célula de mamífero selecionada do grupo compreendendo HEK293, CHO e COS; uma célula hospedeira transformada com o referido vetor, em que a célula hospedeira é uma célula eucariótica; um método de produzir o referido anticorpo, compreendendo cultivar a referida célula hospedeira num meio de cultura em condições suficientes para produzir o anticorpo; uma composição farmacêutica compreendendo o referido anticorpo monoclonal ou parte de ligação de antigénio e um transportador farmaceuticamente aceitável; o referido anticorpo para uso num método para diminuir a ligação de hRGM A ao recetor de neogenina num indivíduo que dele necessite, compreendendo a etapa de administrar ao indivíduo o referido anticorpo; o referido anticorpo para uso num método para diminuir a ligação de hRGM A à proteína morfogenética óssea-2 e à proteína morfogenética óssea-4 (BMP-2 e BMP-4) num indivíduo que dele necessite, compreendendo a etapa de administrar ao indivíduo o referido anticorpo; o referido anticorpo para uso num método para tratar um indivíduo para uma doença associada com atividade de RGM A compreendendo a etapa de administrar o referido anticorpo sozinho ou em combinação com outros agentes terapêuticos; o referido anticorpo para uso num método para reduzir a atividade de RGM A num indivíduo que sofre de uma doença na qual a atividade de RGM A é nociva, compreendendo administrar ao indivíduo o referido anticorpo sozinho ou em combinação com outros agentes terapêuticos; o referido anticorpo, compreendendo pelo menos uma região VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 e 43; o referido anticorpo, compreendendo pelo menos uma região VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NO: 44, 45 e 46; o referido anticorpo, modificado adicionalmente por 1 a 5 mutações numa sequência de VH ou de VL; e o referido anticorpo, em que as mutações são selecionadas a partir de retromutações do esqueleto e mutações de resíduos de Vernier e da interface de VH/VL.

Qualquer ensinamento ou referência a SEQ ID NO: 34 tal como aqui divulgado, aplica-se analogamente a SEQ ID NO:9.

DESCRIÇÃO SUCINTA DAS FIGURAS A figura IA mostra a ligação dos anticorpos monoclonais a hRGM A num ensaio de ELISA. A figura 1 B apresenta a ligação dos anticorpos monoclonais a hRGM A expressa em células HEK 293. A figura 1C apresenta a ligação dos anticorpos monoclonais a RGM A de rato expressa em células HEK 293. A figura 2 mostra a ligação a neogenina de RGM A completa. MAB 5F9 inibe a ligação a neogenina de hRGM A completa e acoplada a f c. A figura 3 representa a ligação a BMP-4 de RGM A completa. MAB 5F9 inibe a ligação a BMP-4 do fragmento (47- 422) de hRGM A completa e acoplada a fc. A figura 4 representa a ligação a BMP-4 do fragmento 0 de RGM A. MAB 5F9 inibe a ligação a BMP-4 do fragmento 0 (47-168) de hRGM A acoplada a fc A figura 5 mostra a ligação a BMP-2 de RGM A completa. MAB 5F9 inibe a ligação a BMP-2 do fragmento (47- 422) de hRGM A completa e acoplada a fc. A figura 6 é uma combinação de microfotografias que mostram a neutralização por mAb 5F9 do fragmento de RGM A no ensaio de crescimento para o exterior de neurites em células NTera. MAB 5F9 neutraliza a atividade de inibição do crescimento para o exterior de um fragmento de hRGM A conjugada a fc que é um inibidor potente nos ensaios de crescimento de neurites com agregados Ntera humanos. A. Cultura de controlo, crescimento de neurónios Ntera em laminina, B. Num substrato de laminina-fragmento (47 - 168) de hRGM A, C. - E. Num substrato de laminina- fragmento (47 - 168) de hRGM A na presença de MAB 5F9 a 0,1 pg/ml (C.), MAB 5F9 a 1 pg/ml (D.), MAB 5F9 a 10 pg/ml (E. ) . A figura 7 mostra a análise quantitativa dos resultados dos 2 ensaios de NTera. MAB 5F9 neutraliza de uma forma dependente da dose a atividade de inibição do crescimento para o exterior de um fragmento (fragmento 0, 47 - 168) de hRGM A conjugada a fc que é um inibidor potente nos ensaios de crescimento de neurites com agregados Ntera humanos. A figura 8 mostra a análise quantitativa do ensaio de riscas de SH-SY5Y. MAB 5F9 neutraliza a repulsão, induzida por riscas que consistem de RGM A humana completa de células neuronais humanas de SH-SY5Y em carpetes de riscas em membrana. Na ausência de MAB 5F9 (A) ou na presença de baixas concentrações de MAB, os neurónios SH-SY5Y preferem evitar as riscas de RGM A. Este comportamento é revertido pelo aumento das concentrações do MAB 5F9. (B a D) à concentração de MAB mais elevada (10 pg/ml) (E), os neurónios de SH-SY5Y apresentam uma forte preferência pelas riscas de RGM A comparativamente com as riscas de colagénio I. A figura 9 resume a análise quantitativa das características de ligação dos mAB 5F9 e 8D1. Avaliam-se os MAB 5F9 e 8D1 em ensaios de ligação hRGM A - neogenina, hRGM A - BMP-2 e hRGM A - BMP-4 a diferentes concentrações. A figura 10 mostra a atividade neutralizante da atividade quimiorrepulsiva das hRGM A de anticorpos 5F9 humanizados (h5F9.21, h5F9.23, h5F9.25) num ensaio de quimiotaxia de SH-SY5Y. A figura 11 mostra a atividade de neurorregeneração in vivo da aplicação local de 5F9 num modelo animal de lesão do nervo ótico. A aplicação local de MAB 5F9 neutraliza RGM A e estimula o crescimento regenerativo dos axónios danificados do nervo ótico num modelo animal de rato de esmagamento do nervo ótico. Nos animais tratados com 5F9 (A), muitas fibras positivas para GAP-43 estendem-se para além do local de esmagamento, contrariamente ao MAB 8D1 de controlo (B) que não se liga à RGM A de rato.

As figuras 12 A e as figuras 12 B apresentam a análise quantitativa da aplicação local de 5F9 num modelo animal de lesão do nervo ótico. (A) 5F9, mas não o MAB 8D1 de controlo aumentou significativamente o número de fibras positivas para GAP-43 em regeneração. Observaram-se significativamente mais fibras (p < 0,05) em animais tratados com 5F9 e apenas se encontram fibras a distâncias de 200 pm, 400 pm e 600 pm e a 1200 pm em animais tratados com 5F9, mas não em animais de controlo (B) 5F9 aumentou significativamente a área positiva para GAP-43 no local de lesão de nervo ótico comparativamente com o anticorpo 8D1 de controlo e com o controlo de veiculo de PBS. Mediu-se a área de crescimento regenerativo (área positiva para GAP-43) usando o utilitário Axiovision (Zeiss). A figura 13 apresenta a atividade neurorregenerativa in vivo da aplicação sistémica de 5F9 num modelo animal de lesão do nervo ótico. Trataram-se os animais com 5F9 ao dia 0 e dia 21 com 2 mg/kg e 10 mg/kg, respetivamente. O anticorpo ou o veiculo foram administrados intraperitonealmente ou intravenosamente. Imagens compostas dos nervos óticos de ratos. Nos animais tratados com 5F9 (A), existem muitas fibras positivas para GAP-43 que se estendem para além do local de esmagamento contrariamente aos animais de controlo tratados com PBS (B). O local de esmagamento localiza-se na margem esquerda e as fibras em regeneração estão coradas com um anticorpo contra GAP-43. Observam-se muitas fibras nas bordas superior e inferior do nervo ótico em animais tratados com 5F9, mas não em animais de PBS . A figura 14 A e a figura 14 B apresentam a análise quantitativa da aplicação sistémica de 5F9 num modelo animal de lesão do nervo ótico. A figura 15 mostra a atividade de remielinização in vivo da aplicação sistémica de 5F9 num modelo animal de lesão do nervo ótico. Trataram-se os animais com 5F9 no dia 0 e d21 com 2 mg/kg e 10 mg/kg, respetivamente. O anticorpo ou o veiculo foram administrados intraperitonealmente ou intravenosamente. Imagens compostas dos nervos óticos de ratos. Visualiza-se a mielinização usando um anticorpo dirigido contra o marcador de mielina, proteína básica de mielina MBP. Os locais de esmagamento localizam-se no meio dos nervos compósitos e a área está limpa nos animais de controlo tratados com veículo (A e B) . Nos animais tratados com 5F9 (C e D) , observam-se muitas estruturas positivas para MBP na área média (centro do esmagamento) dos nervos óticos. A figura 16 mostra o efeito quantitativo na remielinização da aplicação sistémica de 5F9 num modelo animal de lesão do nervo ótico.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Esta invenção descreve anticorpos monoclonais contra RGM A, especialmente anticorpos monoclonais humanizados contra RGM A ou suas partes de ligação a antigénio, que ligam RGM A. Vários aspetos deste pedido referem-se a anticorpos e fragmentos de anticorpo e suas composições farmacêuticas, assim como a ácidos nucleicos, vetores de expressão recombinantes e célula hospedeiras para produzir tais anticorpos e fragmentos. Estão também abrangidos pela invenção, métodos de usar os anticorpos deste pedido para detetar RGM A humano; para neutralizar RGM humana e/ou atividade de RGM A humana, in vivo ou in vitro e para regular expressão génica. 1. Definições gerais

Salvo indicação em contrário aqui, as expressões científicas e técnicas usadas em relação à presente invenção terão os significados que são habitualmente entendidos pelos peritos na especialidade. 0 significado e âmbito das expressões deve ser clara, contudo, no caso de qualquer ambiguidade latente, as definições aqui proporcionadas têm precedente sobre qualquer definição de dicionário ou extrínseca. Além disso, salvo requerido em contrário pelo contexto, as expressões no singular incluirão os plurais e as expressões no plural incluirão o singular. Neste pedido, o uso de "ou" significa "e/ou" salvo indicação em contrário. Além disso, o uso da expressão "incluindo" assim como outras formas, tal como "inclui" e "incluído", não é limitativo. Igualmente, as expressões tais como "elemento" ou "componente" abrangem tanto elementos como componentes compreendendo uma unidade e elementos e componentes que compreendem mais do que uma subunidade salvo indicação específica em contrário.

Geralmente, as nomenclaturas usadas relativamente a cultura de células e tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química de proteínas e de ácidos nucleicos e hibridação, assim como as respetivas técnicas aqui descritas são aquelas bem conhecidas e comummente usadas na especialidade. Os métodos e técnicas da presente invenção são geralmente efetuados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na especialidade e tal como descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo do presente fascículo salvo indicação em contrário. As reações enzimáticas e técnicas de purificação efetuam-se de acordo com as especificações do fabricante, tal como habitualmente efetuado na especialidade ou tal como aqui descrito. As nomenclaturas usadas e os procedimentos e técnicas laboratoriais de química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica, assim como as respetivas técnicas aqui descritas são aqueles bem conhecidos e habitualmente usados na especialidade. Usam-se técnicas padrão para sínteses químicas, análises químicas, preparação, formulação e entrega farmacêuticas e tratamento de doentes.

Para que a presente invenção possa ser mais facilmente entendida, definem-se seguidamente termos selecionados. A expressão "polipéptido" tal como aqui usada, refere-se a qualquer cadeia de aminoácidos polimérica. As expressões "péptido" e "proteína" usam-se indiferentemente com a expressão polipéptido e também se referem a uma cadeia de aminoácidos polimérica. A expressão "polipéptido" abrange proteínas nativas ou artificiais, fragmentos de proteína e análogos de polipéptido de uma sequência de proteína. Um polipéptido pode ser monomérico ou polimérico. A expressão "proteína isolada" ou "polipéptido isolado" é uma proteína ou polipéptido que devido à sua origem ou fonte da qual deriva não se encontra associada a componentes associados naturalmente que a acompanham no seu estado nativo; está substancialmente isenta de outras proteínas da mesma espécie; é expressa numa célula de uma espécie diferente; ou não ocorre na natureza. Assim, um polipéptido que é sintetizado quimicamente ou sintetizado num sistema celular diferente da célula da qual é naturalmente originário será "isolado" das suas componentes associadas naturalmente. Uma proteína pode tornar-se também substancialmente isenta de componentes associadas naturalmente por isolamento, usando técnicas de purificação de proteínas bem conhecidas na especialidade. A expressão "recuperar" tal como aqui usada, refere-se ao processo de tornar uma espécie química tal como um polipéptido substancialmente isento de componentes associadas naturalmente por isolamento, e.g., usando técnicas de purificação de proteínas bem conhecidas na especialidade. A expressão "RGM A humana" (aqui abreviada para hRGM A) , tal como aqui usada refere-se a uma glicoproteína ancorada a glicosilfosfatidilinositol (gpi) com 450 aminoácidos, que foi primeiramente descrita como um repelente do crescimento de neurites ou inibidor do crescimento de neurites durante o desenvolvimento de projeções topográficas (Stahl et ai. Neuron 5: 735-43, 1990; Mueller, em Molecular Basis of Axon Growth and Nerve Pattern Formation, editado por H. Fujisawa, Japan Scientific Societies Press, 215 - 229,1997). A família de genes rgm abrange três genes diferentes, sendo dois deles, rgm a e b, expressos no SNC de mamíferos, enquanto o terceiro membro, rgm c, é expresso na periferia (Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sei. 361: 1513-29, 2006), onde desempenha um papel importante no metabolismo do ferro. As proteínas RGM humanas têm uma identidade de sequência de 43% - 50%; a homologia de aminoácidos de RGM A humana e de rato é de 89%. As proteínas RGM humanas não partilham qualquer homologia de sequência significativa com qualquer outra proteína conhecida. São proteínas ricas em prolina contendo uma região RGD e têm homologia estrutural com o domínio do fator de Von-Willebrand e são clivados no aminoácido 168 do terminal N por uma protéase desconhecida para proporcionar uma proteína funcionalmente ativa (Mueller et al. , Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sei. 361: 1513-29, 2006) .

In vitro, a RGM A inibe o crescimento de neurites para o exterior a concentrações picomolares por ligação a neogenina, que foi identificada como um recetor de RGM (Rajagopalan et al. Nat Cell Biol.: 6(8),756-62,2004). A neogenina foi primeiramente descrita como uma proteína de ligação a netrina (Keino-Masu et al. Cell, 87(2):175-85, 1996), mas a sua afinidade para a netrina (Kd 2 nM) é uma ordem de grandeza inferior à de RGM (Kd 0,2 nM) (Rajagopalan et al. Nat Cell Biol.: 6(8),756-62,2004). Esta é uma revelação importante porque relatou-se que a ligação de netrina-1 a neogenina ou ao seu recetor intimamente relacionado DCC (deletado em cancro colorretal) estimula o crescimento de neurites em vez da sua inibição (Braisted et al. J. Neurosci. 20: 5792-801, 2000) .

Além da ligação de RGM A a neogenina e da indução da inibição do crescimento de neurites, a ligação de RGM A ou B às proteínas morfogenéticas ósseas BMP-2 e BMP-4 poderia representar outro obstáculo à neurorregeneração bem sucedida e à recuperação funcional (Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sei. 361: 1513-29, 2006) . Relatou-se que ambas as classes de proteínas (neogenina e as BMP) transduzem o sinal de inibição do crescimento de neurites de RGM A através de duas vias de transdução de sinal completamente diferentes e independentes. Relatou-se que, habitualmente, a expressão destas proteínas BMP é relativamente baixa na maioria das regiões do SNC de adultos, mas aumenta rapidamente quando algumas BMP (e.g. BMP-2, BMP-6, BMP-7) se expressam e acumulam em resposta a lesão e agressão (Lai et al. , Neuroreport 8: 2691 - 94, 1997; Martinez et al. Brain Res. 894: 1 - 11, 2001; Hall e Miller, J. Neurosci. Res. 76 : 1-8, 2004; Setoguchi et al., Exp. Neurol. 189 : 33-44, 2004). Além disso, num modelo de esclerose múltipla, o modelo de encefalomielite autoimune experimental (EAE), BMP-4, BMP-6 e BMP-7 foram reguladas positivamente na espinal medula de ratinho (Ara et al. , J. Neurosci. Res. 86: 125-35, 2008) . Relatou-se que BMP-2 inibe o crescimento de neurites por ligação à RGM A de superfície celular, recetores I e II de BMP e por ativação direta da cinase de LIM (Matsuura et al. Biochem Biophys Res Commun., 360: 868-73, 2007) e espera-se portanto que o bloqueio da interação RGM A-BMP-2 aumente adicionalmente a recuperação funcional após lesão do SNC.

Tal como mencionado anteriormente, ratos com lesão da espinal medula e humanos com lesão cerebral, apresentam uma acumulação massiva de RGM celular no local da lesão e o padrão de coloração de RGM A em ratos no local da lesão da espinal medula é muito semelhante à coloração com anticorpo pan RGM em humanos, o que sugere que a maioria da coloração com pan RGM em humanos está relacionada com a localização de RGM A mas não com a localização de RGM B (Schwab et al., Arch. Neurol.62: 1561-8, 2005a; Schwab et al. Eur. J. Neurosci. 21:1569-76, 2005 b; Hata et al. J. Cell Biol.173:47-58, 2006) . No cérebro humano saudável, a coloração com pan RGM (imunorreatividade para RGM A e B) foi detetada em fibras de matéria branca, oligodendrócitos, no pericário de alguns neurónios, em algum músculo liso vascular e em algumas células endoteliais. Não se observou qualquer coloração de astrócitos. O padrão de coloração de RGM em cérebro humano de adulto saudável é muito semelhante ao padrão de coloração observado em espinal medulas de ratos adultos (Schwab et al. Eur. J. Neurosci. 21:1569-76, 2005 b; Hata et al. J. Cell Biol. 173:47-58, 2006) .

Com base na acumulação de RGM A nos locais de lesão do cérebro e em lesão da espinal medula e devido à sua atividade de inibição de crescimento de neurites celulares, espera-se que a proteína exerça atividade de inibição de crescimento de neurites e a sua neutralização por anticorpos ou seus fragmentos de ligação de antigénio que se ligam a pelo menos um epítopo de RGM A humana, possa resultar em recrescimento melhorado de fibras nervosas lesionadas e numa melhoria de recuperação funcional em indicações caracterizadas por lesão de fibras nervosas e acumulação de RGM.

Salvo indicação em contrário, a expressão "RGM A" também abrange moléculas de RGM A isoladas ou obtidas a partir de outras espécies, tais como por exemplo, roedores, tal como ratinhos ou ratos; especificamente, a molécula derivada de rato é aqui designada como "RGM A de rato".

TABELA 1: LISTA DE SEQUÊNCIAS DE MOLÉCULAS RELACIONADAS COM RGM A

"Atividade biológica" tal como aqui usado, refere-se a todas as propriedades biológicas inerentes de RGM A tal como aqui definidas.

As expressões "ligação especifica" ou "ligado especificamente", tal como aqui usadas, em referência à interação de um anticorpo, uma proteína ou um péptido com uma segunda espécie química, significa que a interação é dependente da presença de uma estrutura específica (e.g., um "determinante antigénico" ou "epítopo" tal como definido seguidamente) na espécie química; por exemplo, um anticorpo reconhece e liga-se a uma estrutura de proteína específica e não a proteínas de um modo geral. Se um anticorpo é específicos para o epítopo "A", a presença de uma molécula contendo o epítopo A (ou A livre, não marcado) numa reação contendo "A" marcado e o anticorpo, reduzirá a quantidade de A marcado ligado ao anticorpo. A expressão "anticorpo", tal como aqui usada, refere-se de um modo geral a qualquer molécula de imunoglobulina (Ig) constituída por quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) ou quaisquer seus fragmentos, mutantes, variantes ou derivações funcionais, que retenham as características essenciais de ligação de epítopo de uma molécula de Ig. Tais formatos de anticorpo mutante, variante ou derivado são conhecidos na especialidade. As concretizações não limitativas destes são discutidas seguidamente. Diz-se que um anticorpo é "capaz de ligar" uma molécula se for capaz de reagir especificamente com a molécula para assim ligar a molécula ao anticorpo.

Pretende-se que um "anticorpo monoclonal" tal como aqui usado se refira a uma preparação de moléculas de anticorpo, que partilham uma sequência de aminoácidos comum para a cadeia pesada e para a cadeia leve, contrariamente às preparações de anticorpo "policlonal" que contêm uma mistura de anticorpos diferentes. Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos por várias tecnologias novas tais como exposição em fagos, bactérias, leveduras ou ribossomas, assim como métodos clássicos exemplificados por anticorpos derivados de hibridoma (e.g., um anticorpo excretado por um hibridoma preparado por tecnologia de hibridomas, tal como a metodologia padrão de hibridomas de Kohler e Milstein ((1975) Nature 256:495-497).

Num anticorpo completo, cada cadeia pesada é constituída por uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é constituída por três domínios, CHI, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é constituída por uma região variável da cadeia leve (aqui abreviada como LCVR ou VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve é constituída por um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), alternadas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de esqueleto (FR) . Cada VH e VL é composta por três CDR e quatro FR, dispostas do terminal amino para o terminal carboxilo na ordem seguinte: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As moléculas de imunoglobulina podem ser de qualquer tipo (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) , classe (e.g., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) ou subclasse.

A expressão "parte de ligação de antigénio" ou "fragmento de ligação de antigénio" de um anticorpo (ou simplesmente "parte de anticorpo" ou "fragmento de anticorpo"), tal como aqui usada, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de ligar especificamente um antigénio (e.g., hRGM A) . Provou-se que a função de ligação de antigénio de um anticorpo pode ser desempenhada por fragmentos de um anticorpo completo. Tais concretizações de anticorpo podem também ser formatos biespecificos, com especificidade dual ou multiespecíficos; ligando-se especificamente a dois ou mais antigénios diferentes. Os exemplos de fragmentos de ligação aqui abrangidos pela expressão "parte de ligação de antigénio" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente constituído pelos domínios VL, VH, CL e CHI; (ii) um fragmento F(ab' j, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfureto na região de dobra; (iii) um fragmento Fd constituído pelos domínios VH e CHI; (iv) um fragmento Fv constituído pelos domínios VL e VH de um anticorpo de braço único, (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546, Winter et al., publicação PCT WO 90/05144 Al aqui incorporada por referência), que compreende um único domínio variável; e (vi) uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada. Além disso, apesar dos dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, serem codificados por genes independentes, estes podem ser ligados usando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite que eles sejam preparados como uma cadeia de proteína única na qual as regiões VL e VH se emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv em cadeia simples (scFv); consultar e.g., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8_5:587 9-5883) . Pretende-se também que tais anticorpos de cadeia simples sejam abrangidos pelo âmbito da expressão "parte de ligação de antigénio" de um anticorpo. Abrangem-se também outras formas de anticorpos em cadeia simples, tais como diacorpos. Os diacorpos são anticorpos bivalentes e biespecificos nos quais os domínios VH e VL são expressos numa única cadeia de polipéptido, mas usando um ligante que é demasiado curto para permitir a ocorrência de emparelhamento entre os dois domínios da mesma cadeia, forçando assim os domínios a emparelhar com domínios complementares de outra cadeia e a criar dois locais de ligação de antigénio (consultar e.g., Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA _9_0:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2_: 1121-1123) . Tais partes de ligação de anticorpo são conhecidas na especialidade (Kontermann e Dubel ed., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 p. (ISBN 3-540-41354-5). A expressão "construção de anticorpo" tal como aqui usada refere-se a um polipéptido compreendendo uma ou mais partes de ligação de antigénio da invenção ligadas a um polipéptido ligante ou a um domínio constante de imunoglobulina. Os polipéptidos ligantes compreendem dois ou mais resíduos de aminoácidos ligados por ligações peptídicas e usam-se para ligar uma ou mais partes de ligação de antigénio. Tais polipéptidos ligantes são bem conhecidos na especialidade (consultar e.g., Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei, USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2_: 1121-1123) . Um domínio constante de imunoglobulina refere-se a um domínio constante de cadeia pesada ou leve. As sequências de aminoácidos de domínios constantes de cadeia pesada e de cadeia leve de IgG humano são conhecidas na especialidade e representam-se na tabela 2.

TABELA 2: SEQUÊNCIA DO DOMÍNIO CONSTANTE DE CADEIA PESADA

E DO DOMÍNIO CONSTANTE DE CADEIA LEVE DE IgG HUMANA

Ainda adicionalmente, um anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio pode ser parte de moléculas de imunoadesão maiores, formadas por associação covalente ou não covalente do anticorpo ou parte de anticorpo com uma ou mais outras proteínas ou péptidos. Os exemplos de tais moléculas de imunoadesão incluem o uso de uma região de núcleo de estreptavidina para criar uma molécula de scFv tetramérica (Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) e o uso de um resíduo de cisteína, um péptido marcador e um marcador de poli-histidinas no terminal C para produzir moléculas de scFv bivalentes e biotiniladas (Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 3_1:1047-1058) . As partes de anticorpo, tal como os fragmentos Fab e F (ab' } , podem ser preparadas a partir de anticorpos inteiros usando técnicas convencionais, tal como digestão com papaína ou pepsina, respetivamente, de anticorpos completos. Além disso, podem obter-se anticorpos, partes de anticorpo e moléculas de imunoadesão usando técnicas padrão de ADN recombinante, tal como aqui descrito.

Pretende-se que um "anticorpo isolado", tal como aqui usado, se refira a um anticorpo que está substancialmente isento de outros anticorpos com diferentes especificidades antigénicas (e.g., um anticorpo isolado que liga especificamente hRGM A está substancialmente isento de anticorpos que ligam especificamente antigénios diferentes de hRGM A). Um anticorpo isolado que liga especificamente hRGM A pode, contudo, ter reatividade cruzadas com outros antigénios, tais como moléculas de RGM A de outras espécies. Além disso, um anticorpo isolado pode estar substancialmente isento de outro material celular e/ou produtos químicos.

Pretende-se que a expressão "anticorpo humano", tal como aqui usada, inclua anticorpos com regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulinas de linha germinal humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos que não são codificados por sequências de imunoglobulinas de linha germinal humana (e.g., mutações introduzidas por mutagénese aleatória ou específica do local in vitro ou por mutações somáticas in vivo), por exemplo nas CDR e em particular na CDR3. Contudo, não se pretende que a expressão "anticorpo humano", tal como aqui usada, inclua anticorpos nos quais as sequências de CDR derivadas da linha germinal de outra espécie de mamíferos, tal como um ratinho, tenham sido enxertadas em sequências de esqueleto humanas.

Pretende-se que a expressão "anticorpo humano recombinante", tal como aqui usada, inclua todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tal como anticorpos expressos usando um vetor de expressão recombinante transfetado para uma célula hospedeira (descrita adicionalmente seguidamente) , anticorpos isolados de uma biblioteca combinatória e recombinante de anticorpos humanos (Hoogenboom H.R., (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H. e Highsmith W.E., (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J.V. e Larrick J.W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H. e Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378), os anticorpos isolados de um animal (e.g., um ratinho) que é transgénico para genes de imunoglobulina humana (consultar e.g., Taylor, L. D., et ai. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A. e Green L.L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. et al (2000) Immunology Today 21:364-370) ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvam splicing de sequências de genes de imunoglobulina humana para outras sequências de ADN. Tais anticorpos recombinantes humanos têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linha germinal humana. Em determinadas concretizações, contudo, tais anticorpos humanos recombinantes são submetidos a mutagénese in vitro (ou, quando se usa um animal transgénico para sequências de Ig humano, são submetidos a mutagénese somática in vivo) e portanto as sequências de aminoácidos das regiões de VH e de VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, apesar de serem derivadas e relacionada com sequências de VH e de VL de linha germinal humana, podem não existir naturalmente no interior do repertório de linha germinal de anticorpo humano in vivo. A expressão "anticorpo quimérico" refere-se a anticorpos que compreendem sequências das regiões variáveis das cadeias pesada e leve de uma espécie e sequências das regiões constantes de outra espécie, tal como os anticorpos com regiões variáveis das cadeias pesada e leve murinas ligadas a regiões constantes humanas. O anticorpo quimérico pode ser produzido através de técnicas de biologia molecular recombinante ou podem ser fisicamente conjugados conjuntamente. A expressão "anticorpo com enxerto de CDR" refere-se a anticorpos que compreendem sequências das regiões variáveis das cadeias pesada e leve de uma espécie mas nos quais as sequências de uma ou mais das regiões de CDR de VH e/ou de VL são substituídas por sequências de CDR de outra espécie, tal como anticorpos com sequências das regiões variáveis das cadeias pesada e leve nas quais uma ou mais das CDR murinas (e.g., CDR3) foi substituída por sequências de CDR humanas.

As expressões "numeração de Rabat", "definições de Rabat" e "marcação de Rabat" usam-se aqui indiferentemente. Estas expressões, que são reconhecidas na especialidade, referem-se a um sistema de numeração de resíduos de aminoácidos que são mais variáveis (i.e. hipervariáveis) do que outros resíduos de aminoácidos nas regiões variáveis das cadeias pesada e leve de um anticorpo ou de uma sua parte de ligação de antigénio (Rabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391 e Rabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, U.S. Department of Health and Human Services, publicação NIH n2 91-3242). Para a região variável da cadeia pesada, a região hipervariável vai desde as posições de aminoácidos 31 a 35 para CDR1, posições de aminoácidos 50 a 65 para CDR2 e posições de aminoácidos 95 a 102 para CDR3. Para a região variável da cadeia leve, a região hipervariável vai desde as posições de aminoácidos 24 a 34 para CDR1, posições de aminoácidos 50 a 56 para CDR2 e posições de aminoácidos 89 a 97 para CDR3.

Tal como aqui utilizadas, as expressões "aceitador" e "anticorpo aceitador" referem-se à sequência de anticorpo ou de ácido nucleico proporcionada ou codificada por pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou 100% das sequências de aminoácidos de uma ou mais das regiões de esqueleto. Em algumas concretizações, a expressão "aceitador" refere-se à sequência de aminoácidos ou de ácidos nucleicos do anticorpo proporcionada ou que codifica para as regiões constantes. Ainda noutra concretização, a expressão "aceitador" refere-se à sequência de aminoácidos ou de ácidos nucleicos do anticorpo proporcionada ou que codifica para uma ou mais das regiões de esqueleto e das regiões constantes. Numa concretização específica, a expressão "aceitador" refere-se à sequência de aminoácidos ou de ácidos nucleicos de um anticorpo humano proporcionada ou que codifica para pelo menos 80%, preferentemente, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou 100% das sequências de aminoácidos de uma ou mais das regiões de esqueleto. De acordo com esta concretização, um aceitador pode conter pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5 ou pelo menos 10 resíduos de aminoácido que não ocorrem numa ou em mais posições especificas de um anticorpo humano. Uma região de esqueleto de aceitador e/ou regiões constantes do aceitador podem ser, e.g., derivados ou obtidos de um gene de anticorpo de linha germinal, um gene de anticorpo maduro, um anticorpo funcional (e.g., anticorpos bem conhecidos na especialidade, anticorpos em desenvolvimento ou anticorpos disponíveis comercialmente).

Tal como aqui utilizada, a expressão "CDR" refere-se à região determinante de complementaridade no interior das sequências variáveis do anticorpo. Há três CDR em cada uma das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve, que se designam por CDR1, CDR2 e CDR3, para cada uma das regiões variáveis. A expressão "conjunto de CDR" tal como aqui utilizada, refere-se a um grupo de três CDR que ocorrem numa única região variável capaz de ligação de antigénio. Os limites exatos destas CDR têm sido definidos de forma diferente de acordo com sistemas diferentes. O sistema descrito por Rabat (Rabat et ai., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) e (1991)) proporciona não apenas um sistema de numeração de resíduos não ambíguo aplicável a qualquer região variável de um anticorpo, mas proporciona também limites de resíduo precisos que definem as três CDR. Podem referir-se estas CDR com as CDR de Rabat. Chothia e colaboradores (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196:901— 917 (1987) e Chothia et ai., Nature 342:877-883 (1989)) verificaram que determinadas subpartes no interior das CDR de Rabat adotam conformações de esqueleto de péptido praticamente idênticas, apesar de apresentarem grande diversidade ao nível da sequência de aminoácidos. Estas subpartes foram designadas como LI, L2 e L3 ou Hl, H2 e H3 em que o "L" e o "H" designam as regiões de cadeia leve e de cadeia pesada, respetivamente. Estas regiões podem referir-se como CDR de Chothia, que têm fronteiras que se sobrepõem com as CDR de Rabat. Padlan descreveu outras fronteiras que definem CDR sobreponíveis com as CDR de Rabat (FASEB J. 9:133-139 (1995)) e MacCallum (J Mol Biol 262(5):732-45 (1996)). Ainda outras definições de fronteiras de CDR podem não seguir estritamente um dos sistemas anteriores, mas contudo sobrepõem-se à das CDR de Rabat, apesar destas poderem ter sido encurtadas ou aumentadas tendo em conta as previsões ou as verificações experimentais de que resíduos ou grupos de resíduos específicos ou ainda CDR completas não têm impacto significativo na ligação de antigénio. Os métodos aqui usados podem utilizar as CDR definidas de acordo com qualquer destes sistemas, apesar de concretizações preferidas usarem CDR definidas por Rabat ou Chothia.

Tal como aqui utilizada, a expressão resíduo "canónico" refere-se a um resíduo numa CDR ou esqueleto que define uma estrutura de CDR canónica específica tal como definido por Chothia et ai. (J. Mol. Biol. 196:901-907 (1987); Chothia et ai., J. Mol. Biol. 227:799 (1992), ambas aqui incorporadas por referência). De acordo com Chothia et ai., as partes críticas das CDR de muitos anticorpos têm conformações de esqueleto peptídico praticamente idênticas apesar da grande diversidade ao nível da sequência de aminoácidos. Cada estrutura canónica especifica primeiramente um conjunto de ângulos de torção de esqueleto peptídico para um segmento contíguo de resíduos de aminoácido formando uma ansa.

Tal como aqui utilizadas, as expressões "dador" e "anticorpo dador" referem-se a um anticorpo proporcionando uma ou mais CDR. Numa concretização preferida, o anticorpo dador é um anticorpo de uma espécie diferente do anticorpo a partir do qual se obtêm ou se derivam as regiões de esqueleto. No contexto de um anticorpo humanizado, a expressão "anticorpo dador" refere-se a um anticorpo não humano proporcionando uma ou mais CDR.

Tal como aqui utilizada, a expressão "esqueleto" ou "sequência de esqueleto" refere-se às sequências remanescentes de uma região variável exceptuando as CDR. Devido à definição exata de uma sequência de CDR poder ser determinada por sistemas diferentes, o significado de uma sequência de esqueleto depende de interpretações correspondentemente diferentes. As seis CDR (CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 da cadeia leve e CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 da cadeia pesada) também dividem as regiões de esqueleto na cadeia leve e na cadeia pesada em quatro sub-regiões (FR1, FR2, FR3 e FR4) em cada cadeia, em que CDR1 está posicionada entre FR1 e FR2, CDR2 entre FR2 e FR3 e CDR3 entre FR3 e FR4. Sem especificar as subregiões específicas como FR1, FR2, FR3 ou FR4, uma região de esqueleto, tal como referido por outros, representa as FR combinadas no interior da região variável de uma cadeia única de imunoglobulina de ocorrência natural. Tal como aqui usada, uma FR representa uma das quatro subregiões e FR representa duas ou mais das quatro subregiões que constituem uma região de esqueleto.

As sequências de cadeia pesada e de cadeia leve aceitadoras humanas são conhecidas na especialidade. Numa concretização da invenção, as sequências de cadeia pesada e de cadeia leve aceitadoras humanas são selecionadas das sequências descritas na tabela 3 e na tabela 4. As referidas tabelas mencionam diferentes combinações para sequências de FR1 a FR4 de esqueleto humano.

Tal como aqui utilizada, a expressão "gene de anticorpo de linha germinal" ou "fragmento de gene" refere-se a uma sequência de imunoglobulina codificada por células não linfoides que não sofreram o processo de maturação que leva a rearranjo genético e mutação para expressão de uma imunoglobulina específica. (Consultar, e.g., Shapiro et al. , Crit. Rev. Immunol. 22(3) : 183-200 (2002); Marchalonis et al., Adv Exp Med Biol. 484:13-30 (2001)) . Uma das vantagens proporcionada por várias concretizações da presente invenção deriva do reconhecimento de que é mais provável que os genes de anticorpos de linha germinal conservem estruturas de sequências de aminoácidos essenciais características dos indivíduos da espécie do que os genes de anticorpo maduro e portanto existe menor probabilidade de serem reconhecidos como provenientes de uma fonte exógena quando usados terapeuticamente nessa espécie.

Tal como aqui utilizada, a expressão resíduos "chave" refere-se a determinados resíduos no interior da região variável que têm mais impacto na especificidade de ligação e/ou afinidade de um anticorpo, nomeadamente um anticorpo humanizado. Um resíduo chave inclui um ou mais dos seguintes: um resíduo que é adjacente a uma CDR, um local de glicosilação potencial (pode ser um local de glicosilação em N ou de glicosilação em O), um resíduo raro, um resíduo capaz de interatuar com o antigénio, um resíduo capaz de interatuar com uma CDR, um resíduo canónico, um resíduo de contacto entre a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve, um resíduo no interior da zona de Vernier e um resíduo na região que se sobrepõe entre a definição de Chothia de uma CDR1 de cadeia pesada variável e a definição de Rabat do primeiro esqueleto de cadeia pesada, não se lhes limitando. A expressão "anticorpo humanizado" refere-se na generalidade a anticorpos que compreendem sequências das regiões variáveis da cadeia pesada e leve de uma espécie não humana (e.g., um ratinho) mas na qual pelo menos uma parte da sequência VH e/ou VL foi alterada para ser mais "do tipo humano"; i.e., mais semelhante às sequências variáveis de linha germinal humana. Um tipo de anticorpo humanizado é um anticorpo com enxerto de CDR, no qual se introduzem sequências de CDR humanas em sequências VH e VL não humanas para substituir as sequências de CDR não humanas correspondentes.

Nomeadamente, a expressão "anticorpo humanizado" tal como aqui usada, é um anticorpo ou uma sua variante, um seu derivado, um seu análogo ou um seu fragmento que se liga imunoespecificamente a um antigénio de interesse e que compreende uma região de esqueleto (FR) apresentando substancialmente a sequência de aminoácidos de um anticorpo humano e uma região determinante de complementaridade (CDR) apresentando substancialmente a sequência de aminoácidos de um anticorpo não humano. Tal como aqui utilizada, a expressão "substancialmente" no contexto de uma CDR refere-se a uma CDR apresentando uma sequência de aminoácidos pelo menos 50, 55, 60, 65, 70, 75 ou 80%, preferentemente pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de uma CDR de um anticorpo não humano. Um anticorpo humanizado compreende substancialmente todos de pelo menos um e tipicamente dois domínios variáveis (Fab, Fab' , F (ab' )2, FabC, Fv) nos quais todas ou substancialmente todas as regiões de CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana (i.e., anticorpo dador) e todas ou substancialmente todas as regiões de esqueleto são as de uma sequência consensual de uma imunoglobulina humana. Preferentemente, um anticorpo humanizado compreende também pelo menos uma parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Em algumas concretizações, um anticorpo humanizado contém ambas as cadeias leves assim como pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada. O anticorpo podem também incluir as regiões de CHI, dobra, CH2, CH3 e CH4 da cadeia pesada. Em algumas concretizações, um anticorpo humanizado contém apenas uma cadeia leve humanizada. Em algumas concretizações, um anticorpo humanizado contém apenas uma cadeia pesada humanizada. Em concretizações específicas, um anticorpo humanizado contém apenas um domínio variável humanizado de uma cadeia leve e/ou cadeia pesada humanizada. 0 anticorpo humanizado pode ser selecionado de qualquer classe de imunoglobulinas, incluindo IgY, IgM, IgG, IgD, IgA e IgE e qualquer isotipo, incluindo IgAl, IgA2, IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, não se lhes limitando. 0 anticorpo humanizado pode compreender sequências de mais de uma classe ou isotipo e podem selecionar-se domínios constantes específicos para otimizar funções de efetor pretendidas usando técnicas bem conhecidas na especialidade.

As regiões de esqueleto e de CDR de um anticorpo humanizado não têm de corresponder precisamente às sequências parentais, e.g., a CDR do anticorpo dador ou o esqueleto consensual podem ser mutados por substituição, inserção e/ou deleção de pelo menos um resíduo de aminoácido de modo a que o resíduo de CDR ou de esqueleto nesse local não corresponda nem ao anticorpo dador nem ao esqueleto consensual. Numa concretização preferida, contudo, tais mutações não serão extensas. Habitualmente, pelo menos 50, 55, 60, 65, 70, 75 ou 80%, preferentemente pelo menos 85%, com maior preferência pelo menos 90% e com a maior preferência pelo menos 95% dos resíduos do anticorpo humanizado corresponderão aos das sequências de FR e de CDR parentais. Tal como aqui utilizada, a expressão "esqueleto consensual" refere-se à região de esqueleto na sequência de imunoglobulina consensual. Tal como aqui utilizada, a expressão "sequência de imunoglobulina consensual" refere-se à sequência formada a partir dos aminoácidos (ou nucleótidos) de ocorrência mais frequente numa família de sequências de imunoglobulina relacionadas (consultar e.g., Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemanha 1987) . Numa família de imunoglobulinas, cada posição na sequência consensual é ocupada pelo aminoácido que ocorre mais frequentemente nessa posição na família. Se dois aminoácidos ocorrerem com a mesma frequência, qualquer um deles pode ser incluído na sequência consensual.

Tal como aqui usada, zona de "Vernier" refere-se a um subconjunto de resíduos de esqueleto que podem ajustar a estrutura da CDR e regular finamente o ajuste ao antigénio tal como descrito por Foote e Winter (1992, J. Mol. Biol. 224:487-499, que é aqui incorporado por referência) . Os resíduos da zona de Vernier formam uma camada subjacente às CDR e podem ter impacto na estrutura das CDR e na afinidade do anticorpo. A expressão "inibição da ligação" de RGM a um dos seus recetores tal como aqui usada abrange redução parcial (tal como por exemplo em cerca de 20%, 40%, 60%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais) ou completa e redução da atividade de ligação ao referido recetor. A referida "inibição da ligação" pode ser determinada por qualquer método adequado disponível na especialidade, preferentemente por qualquer método tal como aqui exemplificado, tal como por exemplo ensaios de ligação baseados em ELISA.

Tal como aqui utilizada, a expressão "neutralizante" refere-se a neutralização da atividade biológica de uma proteína alvo quando a proteína de ligação se liga especificamente à proteína alvo. Neutralização pode também ser o resultado de diferentes formas de ligação da referida proteína de ligação ao alvo. Por exemplo, pode causar-se neutralização por ligação da proteína de ligação numa região do alvo que não afeta a ligação do recetor à molécula alvo. Alternativamente a ligação de uma proteína de ligação pode resultar no bloqueio da ligação do recetor ao alvo, cujo bloqueio neutraliza em última instância a atividade da proteína alvo. Cada um dos referidos mecanismos diferentes pode ocorrer de acordo com a invenção. Preferentemente uma proteína de ligação neutralizante é um anticorpo neutralizante cuja ligação a hRGM A resulta na neutralização de uma atividade biológica de hRGM A. Preferentemente a proteína de ligação neutralizante liga-se a hRGM A e diminui uma atividade biológica de hRGM A em pelo menos cerca de 20%, 40%, 60%, 80%, 85% ou mais. Pode avaliar-se a neutralização de uma atividade biológica de hRGM A por uma proteína de ligação neutralizante por medição de um ou mais indicadores da atividade biológica de hRGM A bem conhecidos na especialidade. Por exemplo a neutralização de hRGM A reverte a inibição num ensaio de crescimento para o exterior neuronal de Ntera (consultar exemplo 3, seguidamente). O ensaio de crescimento de neurites Ntera avalia a inibição do crescimento para o exterior de neurites. Na ausência de uma proteína RGM A inibidora ou fragmento e na presença do substrato de laminina que estimula o crescimento para o exterior, os agregados neuronais de NTera apresentam uma extensa e densa rede de neurites a crescer para o exterior. A RGM A ou os fragmentos de RGM A inibem o crescimento para o exterior de neurites, resultando em comprimento e número de neurites reduzidos. 0 bloqueio funcional dos antagonistas de RGM A ou do tipo MAB tal como mAb 5F9 neutralizaram a atividade inibidora do crescimento para o exterior de neurites do potente fragmento de cadeia leve de hRGM A conjugado com fc (aminoácidos 47 - 168) da proteína RGM A humana em ensaios de crescimento de neurites com agregados de neurónios NTera humanos diferenciados, resultando num forte aumento de comprimento e número de neurites.

Pretende-se que um "anticorpo neutralizante monoclonal" tal como aqui usado se refira a uma preparação de moléculas de anticorpo, que após ligação ao antigénio específico são capazes de competir e inibir a ligação do ligando natural para o referido antigénio. Numa concretização particular do presente pedido, os anticorpos neutralizantes da presente invenção são capazes de competir com RGM A para ligação a neogenina e/ou a BMP-2 e/ou BMP-4 e para evitar a atividade biológica ou função de RGM A. Nomeadamente, os anticorpos neutralizantes da presente invenção são capazes de ligação a RGM A e de evitar ligação a neogenina e/ou a BMP-2 e/ou BMP-4 e de evitar a atividade biológica ou função de RGM A. A expressão "atividade" inclui atividades tais como a especificidade/afinidade de ligação de um anticorpo para um antigénio, por exemplo, um anticorpo anti-hRGM A que se liga a um antigénio de RGM A e/ou a potência de neutralização de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo anti-hRGM A cuja ligação a hRGM A inibe a atividade biológica de hRGM A, e.g. tal como determinada num ensaio de ligação hRGM A-neogenina, ensaio de ligação hRGM A - BMP-2 ou ensaio de ligação hRGM A - BMP-4 tal como descrito seguidamente na secção experimental. A atividade biológica de RGM A pode ser descrita como regulação da migração celular. Um exemplo especial de migração celular é o crescimento de neurites, que é impedido ou inibido por proteínas de RGM A. Além disso, provou-se que as proteínas de RGM modulam a atividade de proteínas de BMP. Os exemplos aqui publicados descrevem, por um lado, uma atividade de sinergia e potenciadora das proteínas de RGM na via de BMP e por outro, uma atividade inibidora das proteínas de RGM na via de BMP, que é importante para regulação do metabolismo do ferro, regeneração de ossos e cartilagem e no SNC para remielinização e regeneração. A expressão "epítopo" ou "determinante antigénico" inclui quaisquer determinantes de polipéptido capazes de ligação específica a uma imunoglobulina ou recetor de célula T. Em determinadas concretizações, os determinantes de epítopo incluem agrupamentos de superfície de moléculas quimicamente ativas tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, fosforilo ou sulfonilo e em determinadas concretizações, pode ter características específicas de estrutura tridimensional e/ou características específicas de carga. Um epítopo é uma região de um antigénio que é ligada por um anticorpo. Em determinadas concretizações, diz-se que um anticorpo liga especificamente um antigénio quando reconhece preferentemente o seu antigénio alvo numa mistura complexa de proteínas e/ou macromoléculas. A expressão "ressonância plasmónica de superfície", tal como aqui usada, refere-se a um fenómeno ótico que permite analisar interações bioespecíficas em tempo real pela deteção de alterações nas concentrações de proteína no interior de uma matriz de biossensor, por exemplo usando o sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia e Piscataway, NJ) . Para descrições adicionais, consultar Jõnsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 5_1: 19-26; Jõnsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. _8:125-131; e Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.

Pretende-se que a expressão "kon", tal como aqui usada, se refira à constante de velocidade de ligação para associação de um anticorpo ao antigénio para formar o complexo anticorpo/antigénio tal como é conhecido na especialidade.

Pretende-se que a expressão "k0ff", tal como aqui usada, se refira à constante de velocidade de dissociação para a dissociação de um anticorpo do complexo anticorpo/antigénio tal como é conhecido na especialidade.

Pretende-se que a expressão "Kd", tal como aqui usada, se refira à constante de dissociação de uma interação anticorpo-antigénio específica tal como é conhecido na especialidade. A expressão "proteína de ligação marcada" tal como aqui usada, refere-se a uma proteína com um marcador incorporado que proporciona a identificação da proteína de ligação. Preferentemente, o marcador é um marcador detetável, e.g., incorporação de um aminoácido marcado radioativamente ou ligação a um polipéptido de partes de biotinilo que podem ser detetadas por avidina marcada (e.g., estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou atividade enzimática que pode ser detetadas por métodos óticos ou colorimétricos) . Os exemplos de marcadores para polipéptidos incluem os seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos (e.g., 3H, 14C, 35S, 90Y, "Tc, 711In, 1251 , 1311 , 177Lu, 166Ho ou 153Sm) ; marcadores fluorescentes (e.g., FITC, rodamina, fósforos de lantanídeos), marcadores enzimáticos (e.g., peroxidase de rábano, luciferase, fosfatase alcalina); marcadores quimioluminescentes; grupos biotinilo; epítopos de polipéptido predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (e.g., sequências de emparelhamento de cremalheira de leucina, locais de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, marcadores de epítopo); e agentes magnéticos, tal como quelatos de gadolínio, não se lhes limitando. A expressão "conjugado de anticorpo" refere-se a uma proteína de ligação, tal como um anticorpo, ligado quimicamente a uma segunda parte química, tal como um agente terapêutico ou citotóxico. A expressão "agente" é aqui usada para denominar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica ou um extrato produzido a partir de materiais biológicos. Preferentemente os agentes terapêuticos ou citotóxicos incluem toxina de pertussis, taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, di-hidroxiantracinodiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina e seus análogos ou homólogos, não se lhes limitando.

As expressões "cristal" e "cristalizado" tal como aqui usadas, referem-se a um anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio, que existe na forma de um cristal. Os cristais são uma forma do estado sólido da matéria, que é diferente de outras formas tais como o estado sólido amorfo ou o estado cristalino liquido. Os cristais são compostos de conjuntos tridimensionais regulares e repetidos de átomos, iões, moléculas (e.g., proteínas tais como anticorpos) ou conjuntos moleculares (e.g., complexos antigénio/anticorpo) . Estes conjuntos tridimensionais estão arranjados de acordo com relações matemáticas específicas que são bem compreendidas na área. A unidade fundamental ou bloco de construção que é repetido num cristal denomina-se unidade assimétrica. A repetição da unidade assimétrica num arranjo que está em conformidade com uma determinada simetria cristalográfica bem definida proporciona a "célula unitária" do cristal. A repetição da célula unitária por translações regulares em todas as três dimensões dá origem ao cristal. Consultar Giege, R. e Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2a ed., p. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999) . A expressão "polinucleótido" tal como aqui referida significa uma forma polimérica de dois ou mais nucleótidos, sendo ribonucleótidos ou desoxinucleótidos ou uma forma modificada de qualquer dos dois tipos de nucleótidos. A expressão inclui as formas de ADN em cadeia simples e em cadeia dupla mas de preferência é ADN em cadeia dupla. A expressão "polinucleótido isolado" tal como aqui usada significará um polinucleótido (e.g., de origem genómica, de ADNc ou de origem sintética ou alguma de suas combinações) que, devido à sua origem, o "polinucleótido isolado" não está associado com a totalidade ou parte de um polinucleótido com o qual o "polinucleótido isolado" se encontra na natureza; está ligado operacionalmente a um polinucleótido com o qual não está ligado na natureza; ou não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior.

Pretende-se que a expressão "vetor", tal como aqui usada, se refira a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico com o qual foi ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma ansa circular de ADN em cadeia dupla na qual se podem ligar segmentos de ADN adicionais. Outro tipo de vetor é um vetor virico em que se podem ligar segmentos de ADN adicionais ao genoma virico. Determinados vetores são capazes de replicação autónoma numa célula hospedeira na qual são introduzidos (e.g., vetores bacterianos apresentado uma origem de replicação bacteriana e vetores de mamífero epissómicos). Podem integrar-se outros vetores (e.g., vetores de mamífero não epissómicos) no genoma de uma célula hospedeira por introdução na célula hospedeira e são assim replicados conjuntamente com o genoma do hospedeiro. Além disso, determinados vetores são capazes de dirigir a expressão de genes aos quais estão ligados operacionalmente. Tais vetores são aqui referidos como "vetores de expressão recombinantes" (ou simplesmente, "vetores de expressão"). De um modo geral, os vetores de expressão úteis para técnicas de ADN recombinante estão muitas vezes na forma de plasmídeos. No presente fascículo, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados indiferentemente dado que o plasmídeo é a forma mais comummente usada de vetor. Contudo, pretende-se que a invenção inclua tais outras formas de vetores de expressão, tais como vetores víricos (e.g., retrovirus, adenovirus e vírus adenoassociados com replicação deficiente), que desempenham funções equivalentes. A expressão "ligado operacionalmente" refere-se a uma justaposição em que as componentes aqui descritas estão numa relação que lhes permite funcionar na sua forma pretendida. Uma sequência de controlo "ligada operacionalmente" a uma sequência de codificação está ligada de modo a que a expressão da sequência de codificação se obtenha em condições compatíveis com as sequências de controlo. As sequências "ligadas operacionalmente" incluem tanto sequências de controlo de expressão que são contíguas ao gene de interesse, como sequências de controlo de expressão que atuam em trans ou à distância para controlar o gene de interesse. A expressão "sequência de controlo de expressão" tal como aqui usada refere-se a sequências de polinucleótidos que são necessárias para efetuar a expressão e processamento de sequências de codificação às quais se encontram ligadas. As sequências de controlo de expressão incluem sequências adequadas de iniciação de transcrição, terminação, promotor e facilitador; sinais de processamento de ARN eficazes tais como sinais de splicing e de poliadenilação; sequências que estabilizam o ARNm citoplasmático; sequências que melhoram a eficiência de tradução (i.e., sequência consensual de Kozak); sequências que melhoram a estabilidade da proteína; e quando pretendido, sequências que melhoram a excreção da proteína. A natureza de tais sequências de controlo difere dependendo do organismo hospedeiro; em procariotas, tais sequências de controlo incluem geralmente promotor, local de ligação ribossómico e sequência de terminação de transcrição; em eucariotas, de um modo geral, tais sequências de controlo incluem promotores e sequência de terminação de transcrição. Pretende-se que a expressão "sequências de controlo" inclua componentes cuja presença é essencial para expressão e processamento e pode também incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, sequências líder e sequências de parceiro de fusão. "Transformação", tal como aqui definido, refere-se a qualquer processo pelo qual ADN exógeno entra numa célula hospedeira. A transformação pode ocorrer em condições naturais ou artificiais usando vários métodos bem conhecidos na especialidade. A transformação pode basear-se em qualquer método conhecido para inserção de sequências de ácido nucleico exógenas numa célula hospedeira procariótica ou eucariótica. 0 método é selecionado com base na célula hospedeira a ser transformada e pode incluir infeção vírica, eletroporação, lipofeção e bombardeamento de partículas, não se lhes limitando. Tais células "transformadas" incluem células com transformação estável nas quais o ADN inserido é capaz de replicação quer num plasmídeo com replicação autónoma, quer como parte do cromossoma do hospedeiro. Estas também incluem células que expressam transitoriamente o ADN ou ARN inseridos por períodos de tempo limitados.

Pretende-se que a expressão "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira") tal como aqui usada, se refira a uma célula na qual se introduziu ADN exógeno. Deve considerar-se que tais expressões pretendem referir-se não apenas à célula individual específica, mas também à descendência de tal célula. Devido a poderem ocorrer determinadas modificações em gerações sucessivas devido a mutações ou a influências ambientais, tal descendência pode, não ser de facto idêntica à célula parental, mas inclui-se ainda no âmbito da expressão "célula hospedeira" tal como aqui usada.

Preferentemente as célula hospedeiras incluem células procarióticas e eucarióticas selecionadas de qualquer dos reinos da vida. As células eucarióticas preferidas incluem células protistas, fúngicas, vegetais e animais. A maioria das células hospedeiras preferidas incluem a linha celular procariótica de E. coli; as linhas celulares de mamífero CHO, HEK 293 e COS; a linha celular de inseto Sf9; e a célula fúngica de Saccharomyces cerevisiae, não se lhes limitando.

Podem usar-se técnicas padrão para ADN recombinante, síntese de oligonucleótidos e cultura de tecidos e transformação (e.g., eletroporação, lipofeção) . Podem efetuar-se reações enzimáticas e técnicas de purificação de acordo com as especificações do fabricante ou tal como habitualmente efetuado na especialidade ou tal como aqui descrito. As técnicas e procedimentos anteriores podem ser efetuadas de um modo geral de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na especialidade e tal como descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo do presente fascículo. Consultar e.g., Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), que é aqui incorporada por referência para qualquer objetivo. "Organismo transgénico", tal como conhecido na especialidade e tal como aqui usado, refere-se a um organismo com células que contêm um transgene em que o transgene introduzido no organismo (ou num antepassado do organismo) expressa um polipéptido que não é naturalmente expresso no organismo. Um "transgene" é uma construção de ADN, que é integrada estável e operacionalmente no genoma de uma célula a partir da qual se desenvolve um organismo transgénico, dirigindo a expressão de um produto génico codificado em um ou mais tipos de células ou tecidos do organismo transgénico.

As expressões "regular" e "modular" usam-se indiferentemente e tal como aqui usadas, referem-se a uma modificação ou alteração na atividade de uma molécula de interesse (e.g., a atividade biológica de hRGM A). A modulação pode ser um aumento ou uma diminuição na grandeza de determinada atividade ou função da molécula de interesse. Os exemplos de atividades e funções de uma molécula incluem as características da ligação, atividade enzimática, ativação de recetor celular e transdução de sinal, não se lhes limitando.

Correspondentemente, a expressão "modulador" tal como aqui usada, é um composto capaz de mudar ou alterar uma atividade ou função de uma molécula de interesse (e.g., a atividade biológica de hRGM A). Por exemplo, um modulador pode provocar um aumento ou uma diminuição na grandeza de determinada atividade ou função de uma molécula comparativamente com a grandeza da atividade ou função observadas na ausência do modulador. A expressão "agonista", tal como aqui usada, refere-se a um modulador que, quando posto em contacto com uma molécula de interesse, provoca um aumento da grandeza de determinada atividade ou função da molécula comparativamente com a grandeza da atividade ou função observadas na ausência do agonista. Os agonistas específicos de interesse podem incluir polipéptidos de hRGM A ou polipéptidos, ácido nucleicos, hidratos de carbono ou quaisquer outras moléculas que se liguem a hRGM A não se lhes limitando. A expressão "antagonista" tal como aqui usada, refere-se a um modulador que, quando posto em contacto com uma molécula de interesse provoca uma diminuição na grandeza de determinada atividade ou função da molécula comparativamente com a grandeza da atividade ou função observadas na ausência do antagonista. Os exemplos de antagonistas incluem proteínas, péptidos, anticorpos, peptocorpos, hidratos de carbono ou moléculas orgânicas pequenas, não se lhes limitando. Descrevem-se peptocorpos em, e.g., WOOl/83525.

Os antagonistas específicos de interesse incluem os que bloqueiam ou modulam a atividade biológica ou imunológica de hRGM A. Os antagonistas de hRGM A podem incluir proteínas, ácido nucleicos, hidratos de carbono ou quaisquer outras moléculas, que se ligam a hRGM A, tal como anticorpos monoclonais que interagem com a molécula de RGM A, não se lhes limitando. Deve referir-se que a interação com RGM A pode resultar na ligação e neutralização de outros ligandos / componentes da membrana celular e pode ser útil para funcionar de modo aditivo ou sinérgico contra várias doenças.

Tal como aqui utilizada, a expressão "quantidade eficaz" refere-se à quantidade de uma terapia que é suficiente para reduzir ou melhorar a gravidade e/ou duração de uma doença ou um ou mais dos seus sintomas, evitar o avanço de uma doença, provocar regressão de uma doença, evitar a recorrência, desenvolvimento, arranque ou progressão de um ou mais sintomas associado com uma doença, detetar uma doença ou aumentar ou melhorar os efeitos profiláticos ou terapêuticos de outra terapia (e.g., agente profilático ou terapêutico). A expressão "amostra", tal como aqui usada, é usada no seu sentido mais lato. Uma "amostra biológica", tal como aqui usada, inclui qualquer quantidade de uma substância de um ser vivo ou de um ser que já esteve vivo, não se lhes limitando. Tais seres vivos incluem humanos, ratinhos, ratos, macacos, cães, coelhos e outros animais, não se lhes limitando. Tais substâncias incluem sangue, soro, urina, fluido sinovial, células, órgãos, tecidos, medula óssea, gânglios linfáticos e baço, não se lhes limitando.

2. Polipéptidos que ligam hRGM A A principal concretização do presente pedido compreende anticorpos monoclonais isolados que se ligam especificamente a pelo menos um epitopo de uma proteína de RGM A. Os anticorpos isolados que se ligam especificamente a pelo menos um epitopo de uma proteína de RGM A são capazes de inibir a ligação de RGM A ao seu recetor neogenina e/ou às proteínas morfogenéticas ósseas 2 e 4 (BMP-2, BMP-4). A concretização mais preferida do presente pedido compreende anticorpos que ligam RGM A ou suas partes de ligação de antigénio ou fragmentos.

Preferentemente, os anticorpos anti-RGM A da presente invenção, apresentam uma elevada capacidade de reduzir ou de neutralizar a atividade de RGM A, e.g., tal como avaliado por qualquer um dos vários ensaios in vitro e in vivo conhecidos na especialidade ou descritos seguidamente. 0 presente pedido compreende com a maior preferência, anticorpos neutralizantes monoclonais contra RGM A, que evitam seletivamente a ligação de RGM A ao seu recetor neogenina e às proteínas morfogenéticas ósseas 2 e 4 (BMP-2, BMP-4) e a geração de um anticorpo neutralizante monoclonal contra RGM A, que evita seletivamente ligação de RGM A aos seus correcetores proteínas morfogenéticas ósseas 2 e 4 (BMP-2, BMP-4).

Preferentemente, o anticorpo monoclonal neutralizante do presente pedido é um anticorpo humano ou anticorpo humanizado. A expressão "anticorpo humano" refere-se a anticorpos apresentando regiões variáveis e constantes correspondentes ou derivadas de sequências de imunoglobulinas de linha germinal humana (e.g., consultar Rabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, U.S. Department of Health and Human Services, publicação NIH n2 91-3242, 1991). Os anticorpos humanos do presente pedido, contudo, podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulinas de linha germinal humana (e.g., mutações introduzidas por mutagénese aleatória ou específica de local in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo, nas CDR e em particular, na CDR3.

Em várias concretizações o anticorpo é um anticorpo recombinante ou um anticorpo monoclonal. Pretende-se que sejam parte da presente invenção os anticorpos neutralizantes mais preferidos do presente pedido e aqui referidos como mAb5F9 e seus fragmentos de anticorpo funcional e outros anticorpos e fragmentos de anticorpo funcional com propriedades equivalentes a mAb5F9, tal como ligação de elevada afinidade a RGM A com uma cinética de dissociação lenta e elevada capacidade de neutralização. A afinidade de ligação e a velocidade de dissociação de um anticorpo anti-RGM A do presente pedido a um polipéptido de RGM A imunogénico ou seu fragmento, pode ser determinada por qualquer método conhecido na especialidade. Por exemplo, pode medir-se a afinidade de ligação por ELISA competitivas, RIA, tecnologia de BIAcore ou de KinExA. A velocidade de dissociação pode também ser medida por tecnologia BIAcore ou KinExA. Medem-se a afinidade de ligação e velocidade de dissociação por ressonância plasmónica de superfície usando, e.g., um BIAcore.

Um dos anticorpos monoclonais preferidos do presente pedido, o anticorpo mAb5F9, tem pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência compreendendo uma região variável da cadeia pesada (região VH) compreendendo a sequência de SEQ !D NO: 9 ou 34 e uma região variável da cadeia leve (região VL) compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 10.

Pretende-se também que os anticorpos monoclonais isolados que interagem com RGM A do presente pedido possam ser uma proteína de ligação glicosilada em que o anticorpo ou a sua parte de ligação a antigénio compreendem um ou mais resíduos de hidratos de carbono. A produção de proteína nascente in vivo pode sofrer processamento adicional, conhecido como modificação pós-tradução. Nomeadamente, podem adicionar-se enzimaticamente resíduos de açúcar (glicosilo) num processo conhecido como glicosilação. As proteínas resultantes apresentando cadeias laterais de oligossacáridos ligadas covalentemente são conhecidas como proteínas glicosiladas ou glicoproteínas. A glicosilação de proteínas depende da sequência de aminoácidos da proteína de interesse, assim como da célula hospedeira na qual a proteína é expressa. Organismos diferentes podem produzir enzimas de glicosilação diferentes (eg., glicosiltransferases e glicosidases) e têm substratos diferentes (açúcares de nucleótido) disponíveis. Devido a tais fatores, o padrão de glicosilação de proteína e a composição de resíduos de glicosilo, podem diferir dependendo do sistema de hospedeiro no qual se expressa a proteína específica. Os resíduos de glicosilo úteis na invenção podem incluir, glicose, galactose, manose, fucose, n-acetilglucosamina e ácido siálico, não se lhes limitando. Preferentemente a proteína de ligação glicosilada compreende resíduos glicosilo de modo a que o padrão de glicosilação seja humano.

Os anticorpos do presente pedido compreendem uma região constante de cadeia pesada, tal como uma região constante de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM, IgY ou IgD. Além disso, o anticorpo pode compreender uma região constante de cadeia leve, quer uma região constante de cadeia leve kapa, quer uma região constante de cadeia leve lambda. Preferentemente, o anticorpo compreende uma região constante de cadeia leve kapa. Alternativamente, a parte de anticorpo pode ser, por exemplo, um fragmento Fab ou fragmento de Fv de cadeia única. As substituições de resíduos de aminoácidos na parte de Fc para alterar a função de efetor do anticorpo são conhecidas na especialidade (Winter, et ai. patentes U.S. n2 5 648 260; 5 624 821) . A parte de Fc de um anticorpo medeia várias funções de efetor importantes e.g. indução de citocinas, ADCC, fagocitose, citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e semivida/taxa de depuração de anticorpo e de complexos antigénio-anticorpo.

Em alguns casos estas funções de efetor são pretendidas para anticorpos terapêuticos mas em outros casos podem ser desnecessárias ou mesmo prejudiciais, dependendo dos objetivos terapêuticos. Determinados isotipos de IgG humano, particularmente IgGl e IgG3, medeiam ADCC e CDC através da ligação a Fc Rs e Clq de complemento, respetivamente. Os recetores Fc neonatais (FcRn) são as componentes criticas que determinam a semivida de anticorpos em circulação. Ainda noutra concretização, pelo menos um resíduo de aminoácido é substituído na região constante do anticorpo, por exemplo a região Fc do anticorpo, de modo a que as funções de efetor do anticorpo sejam alteradas.

3. Geração de anticorpos anti-hRGM A 3.1. Geral

Podem gerar-se os anticorpos do pedido por imunização de um hospedeiro adequado (e.g., vertebrados, incluindo humanos, ratinhos, ratos, ovelhas, cabras, porcos, bovinos, cavalos, répteis, peixes, anfíbios e em ovos de pássaros, répteis e peixes). Para gerar os anticorpos do presente pedido, o hospedeiro é imunizado com um polipéptido de RGM A imunogénico ou seu fragmento da invenção. A expressão "imunização" refere-se aqui ao processo de apresentar um antigénio ao repertório imunitário quer esse repertório exista num organismo não alterado geneticamente e natural, quer exista num organismo transgénico, incluindo os modificados para apresentar um repertório imunitário humano artificial. De igual modo, uma "preparação imunogénica" é uma formulação de antigénio que contém adjuvantes ou outros aditivos que aumentariam a imunogenicidade do antigénio.

Pode efetuar-se a imunização de animais por qualquer método conhecido na especialidade. Consultar, e.g., Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Os métodos para imunizar animais não humanos tais como ratinhos, ratos, ovelhas, cabras, porcos, bovinos e cavalos são bem conhecidos na especialidade. Consultar, e.g., Harlow e

Lane e patente U.S. n2 5 994 619. Numa concretização preferida, o antigénio de RGM A é administrado com um adjuvante para estimular a resposta imunitária. Tais adjuvantes incluem adjuvante de Freund completo ou incompleto, RIBI (dipéptidos de muramilo) ou ISCOM (complexos imunoestimulantes). Tais adjuvantes podem proteger o polipéptido de dispersão rápida pela sua sequestração num depósito local ou podem conter substâncias que estimulam o hospedeiro a excretar fatores que são quimiotáticos para macrófagos e outras componentes do sistema imunitário. Preferentemente, se um polipéptido está a ser administrado, o calendário da imunização envolverá duas ou mais administrações do polipéptido espalhadas ao longo de várias semanas.

Considera-se que o animal hospedeiro está imunizado com o antigénio associado com a membrana celular de uma célula intacta ou partida e identificam-se anticorpos do presente pedido por ligação a um polipéptido imunogénico da invenção. Após imunização do animal hospedeiro com o antigénio, podem obter-se anticorpos do animal. Obtém-se o soro contendo anticorpo a partir do animal por sangramento ou sacrifício do animal. 0 soro pode ser usado tal como é obtido do animal, pode obter-se uma fração de imunoglobulina a partir do soro ou podem purificar-se os anticorpos a partir do soro. 0 soro ou as imunoglobulinas obtidas desta forma são policlonais e assim apresentam uma gama heterogénea de propriedades. 3.2 Anticorpos monoclonais anti-RGM A usando tecnologia de hibridoma

Podem preparar-se os anticorpos monoclonais usando uma grande variedade de técnicas conhecidas na especialidade incluindo o uso das tecnologias de hibridoma, recombinante e de exposição por fagos ou uma sua combinação. Por exemplo, podem produzir-se anticorpos monoclonais usando técnicas de hibridoma incluindo as conhecidas na especialidade e apresentadas, por exemplo, em Harlow et al. , Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling, et al., em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) (sendo as referidas referências incorporadas por referência na sua globalidade). A expressão "anticorpo monoclonal" tal como aqui usada corresponde a anticorpos produzidos através de tecnologia de hibridoma, não se lhes limitando. A expressão "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo que é derivado de um clone único, incluindo qualquer clone eucariótico, procariótico ou de fago e não ao método pelo qual é produzido.

Os métodos para produzir e rastrear anticorpos específicos usando tecnologia de hibridoma são rotineiros e bem conhecidos na especialidade. Numa concretização, a presente invenção proporciona métodos para gerar anticorpos monoclonais assim como anticorpos produzidos pelo método compreendendo cultivar uma célula de hibridoma que excreta um anticorpo da invenção em que, preferentemente, o hibridoma é gerado pela fusão de esplenócitos isolados de um ratinho imunizado com um antigénio da invenção com células de mieloma e seguidamente rastreio os hibridomas resultantes da fusão para clones de hibridoma que excretam um anticorpo capaz de se ligar a um polipéptido da invenção. Sucintamente, os ratinhos podem ser imunizados com um antigénio de RGM A. Numa concretização preferida, administra-se o antigénio de RGM A com um adjuvante para estimular a resposta imunitária. Tais adjuvantes incluem adjuvante de Freund completo ou incompleto, RIBI (dipéptidos de muramilo) ou ISCOM (complexos imunoestimulaantes). Tais adjuvantes podem proteger o polipéptido de dispersão rápida pela sua sequestração num depósito local ou podem conter substâncias que estimulam o hospedeiro a excretar fatores que são quimiotáticos para macrófagos e outras componentes do sistema imunitário. Preferentemente, se um polipéptido está a ser administrado, o calendário da imunização envolverá duas ou mais administrações do polipéptido espalhadas ao longo de várias semanas.

Uma vez detetada uma resposta imunitária, e.g., detetam-se anticorpos específicos para o antigénio RGM A no soro de ratinho, recolhe-se o baço do ratinho e isolam-se esplenócitos. Fundem-se então os esplenócitos por técnicas bem conhecidas com quaisquer células de mieloma adequadas, por exemplo células da linha celular SP20 disponível de ATCC. Selecionam-se hibridomas e clonam-se por diluição limitativa. Ensaiam-se então os clones de hibridoma por métodos conhecidos na especialidade para células que excretam anticorpos capazes de ligação a RGM A. Pode gerar-se fluido de ascites, que geralmente contém níveis elevados de anticorpos, por imunização de ratinhos com clones de hibridoma positivos.

Noutra concretização, podem preparar-se hibridomas imortalizados produtores de anticorpo a partir do animal imunizado. Após imunização, sacrifica-se o animal e fundem-se células B esplénicas com células de mieloma imortalizadas tal como é bem conhecido na especialidade. Consultar, e.g., Harlow e Lane, anteriormente. Numa concretização preferida, as células de mieloma não excretam polipéptidos de imunoglobulina (uma linha celular não excretora). Após fusão e seleção com antibióticos, rastreiam-se os hibridomas usando RGM A ou uma sua parte ou uma célula que expressa RGM A. Numa concretização preferida, o rastreio inicial é efectuado usando um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) ou um radioimunoensaio (RIA), preferentemente um ELISA. Um exemplo de rastreio com ELISA proporciona-se em WO 00/37504, aqui incorporado por referência.

Os hibridomas produtores de anticorpo anti-RGM são selecionados, clonados e adicionalmente rastreados para características pretendidas, incluindo crescimento de hibridoma robusto, elevada produção de anticorpo e características pretendidas do anticorpo, tal como discutido adicionalmente seguidamente. Os hibridomas podem ser cultivados e expandidos in vivo em animais singeneicos, em animais isentos de sistema imunitário, e.g., ratinhos nus ou em cultura de células in vitro. Os métodos de selecionar, clonar e expandir hibridomas são bem conhecidos dos peritos na especialidade.

Numa concretização preferida, os hibridomas são hibridomas de ratinho tal como descrito anteriormente. Noutra concretização preferida, os hibridomas são produzidos numa espécie não humana e não ratinho tal como ratos, ovelhas, porcos, cabras, bovinos ou cavalos. Noutra concretização, os hibridomas são hibridomas humanos, nos quais se funde um mieloma não excretor humano com uma célula humana que expressa um anticorpo anti-RGM A.

Os fragmentos de anticorpo que reconhecem epítopos específicos podem ser gerados por técnicas conhecidas. Por exemplo, podem produzir-se fragmentos de Fab e F(ab' )2 da invenção por clivagem proteolítica de moléculas de imunoglobulina, usando enzimas tais como papaina (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos de F(ab' )2) . Os fragmentos de F(ab' )2 contêm a região variável, a região constante da cadeia leve e o domínio CHI da cadeia pesada.

3.3 Anticorpos monoclonais anti-RGM A usando SLAM

Noutro aspeto da invenção, geram-se anticorpos recombinantes a partir de linfócitos únicos e isolados usando um procedimento referido na especialidade como o método de anticorpo de linfócito selecionado (SLAM), tal como descrito na patente U.S. n2 5 627 052, publicação PCT WO 92/02551 e Babcock, J.S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:7843-7848. Neste método, rastreiam-se células únicas que excretam anticorpos de interesse, e.g., linfócitos derivados de qualquer um dos animais imunizados descritos anteriormente, usando um ensaio de placa hemolítica específico de antigénio, em que o antigénio RGM A, uma subunidade de RGM A ou um seu fragmento, é acoplado a eritrócitos de ovelha usando um ligante tal como biotina e usado para identificar células únicas que excretam anticorpos com especificidade para RGM A. Após identificação de células de interesse que excretam anticorpo, salvam-se ADNc das regiões variáveis de cadeia leve e pesada a partir das células por PCR de transcritase reversa e estas regiões variáveis podem então ser expressas no contexto de regiões constantes de imunoglobulina apropriadas (e.g., regiões constantes humanas), em células hospedeiras de mamífero, tais como células COS ou CHO. As células hospedeiras transfetadas com as sequências de imunoglobulina amplificadas, derivadas de linfócitos selecionados in vivo, podem então ser adicionalmente submetidas a análise e seleção in vitro e por exemplo, por aplicação de ciclos de seleção às células transfetadas para isolar células que expressam anticorpos contra RGM A. As sequências de imunoglobulinas amplificadas podem ser adicionalmente manipuladas in vitro, tal como por métodos de maturação por afinidade in vitro tais como os descritos na publicação PCT WO 97/29131 e publicação PCT WO 00/56772. 3.4 Anticorpos monoclonais anti-RGM A usando animais transgénicos

Noutra concretização da presente invenção, produzem-se anticorpos por imunização de um animal não humano compreendendo alguns ou todos os locais de imunoglobulina humana com um antigénio de RGM A. Numa concretização preferida, o animal não humano é um ratinho transgénico XENOMOUSE, uma estirpe de ratinho concebida por engenharia genética que compreende fragmentos grandes dos locais de imunoglobulina humana e que é deficiente na produção de anticorpos de ratinho. Consultar, e.g.f Green et ai. Nature Genetics 7:13-21 (1994) e patentes dos Estados Unidos 5 916 771, 5 939 598, 5 985 615, 5 998 209, 6 075 181, 6 091 001, 6 114 598 e 6 130 364. Consultar igualmente WO 91/10741, publicada a 25 de julho de 1991, WO 94/02602, publicada a 3 de fevereiro de 1994, WO 96/34096 e WO 96/33735, ambas publicadas a 31 de outubro de 1996, WO 98/16654, publicada a 23 de abril de 1998, WO 98/24893, publicada a 11 de junho de 1998, WO 98/50433, publicada a 12 de novembro de 1998, WO 99/45031, publicada a 10 de setembro de 1999, WO 99/53049, publicada a 21 de outubro de 1999, WO 00 09560, publicada a 24 de fevereiro de 2000 e WO 00/037504, publicada a 29 de junho de 2000. O ratinho transgénico XENOMOUSE produz um repertório humano de tipo adulto de anticorpos completamente humanos e gera Mab humanos específicos de antigénio. O ratinho transgénico XENOMOUSE contém aproximadamente 80% do repertório de anticorpo humano através da introdução de fragmentos YAC com configuração de linha germinal com tamanho de megabases, de locais da cadeia pesada humana e x locais de cadeia leve. Consultar Mendez et al. , Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green e Jakobovits J.

Exp. Med. 188:483-495 (1998), cujas divulgações são aqui incorporadas por referência. 3.5 Anticorpos monoclonais anti-RGM A usando bibliotecas de anticorpos recombinantes

Os métodos in vitro podem também ser usados para produzir os anticorpos da invenção, em que se rastreia uma biblioteca de anticorpos para identificar um anticorpo com a especificidade de ligação pretendida. Os métodos para tal rastreio de bibliotecas de anticorpos recombinantes são bem conhecidos na especialidade e incluem métodos descritos em, por exemplo,

Ladner et al. patente U.S. η2 5 223 409; Kang et al. publicação PCT n2 WO 92/18619; Dower et al. publicação PCT n2 WO 91/17271; Winter et al. publicação PCT n2 WO 92/20791; Markland et al. publicação PCT n2 WO 92/15679; Breitling et al. publicação PCT n2 WO 93/01288; McCafferty et al. publicação PCT n2 WO 92/01047; Garrard et al publicação PCT n2 WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Blo/Technology _9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybrldomas 3g81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS _89:357 6-35 8 0; Garrad et al. (1991) Blo/Technology _9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 1_9:4133-4137; e Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982, publicação de pedido de patente US 20030186374, e publicação PCT n2 WO 97/29131, sendo os conteúdos de cada um aqui incorporados por referência. A biblioteca de anticorpos recombinantes pode ser de um indivíduo imunizado com RGM A ou uma parte de RGM A. Alternativamente, a biblioteca de anticorpos recombinantes pode ser de um indivíduo virgem, i.e., aquele que não foi imunizado com RGM A, tal como uma biblioteca de anticorpos humanos de um indivíduo humano que não foi imunizado com RGM A humana. Selecionam-se os anticorpos da invenção por rastreio da biblioteca de anticorpos recombinantes com o péptido compreendendo RGM A humana para assim selecionar os anticorpos que reconhecem RGM A. Os métodos para efetuar tal rastreio e seleção são bem conhecidos na especialidade, tal como descrito nas referências do parágrafo anterior. Para selecionar anticorpos da invenção com afinidades de ligação específicas para hRGM A, tal como os que se dissociam de RGM A humana com uma constante de velocidade k0ff específica, pode usar-se o método conhecido na especialidade de ressonância plasmónica de superfície para selecionar anticorpos com a constante de velocidade k0ff pretendida. Para selecionar anticorpos da invenção com uma atividade de neutralização específica para hRGM A, tal como aqueles com uma IC50 específica, podem usar-se métodos padrão conhecido na especialidade para avaliar a inibição da atividade de hRGM A.

Num aspeto a invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou a uma sua parte de ligação de antigénio, que liga RGM A humana. Preferentemente o anticorpo é um anticorpo neutralizante. Em várias concretizações o anticorpo é um anticorpo recombinante ou um anticorpo monoclonal.

Por exemplo, os anticorpos da presente invenção podem também gerar-se usando vários métodos de exposição em fagos conhecidos na especialidade. Nos métodos de exposição em fagos, expõem-se domínios funcionais de anticorpo à superfície de partículas de fagos que transportam as sequências de polinucleótidos que os codificam. Nomeadamente, tal fago pode ser utilizado para expor domínios de ligação de antigénio expressos a partir de um repertório ou de uma biblioteca de anticorpos combinatória (e. g., humana ou murina). 0 fago que expressa um domínio de ligação de antigénio que liga o antigénio de interesse pode ser selecionado ou identificado com antigénio, e.g., usando antigénio marcado ou antigénio ligado ou capturado por uma superfície sólida ou pérola. Os fagos usados nestes métodos são tipicamente fagos filamentosos incluindo domínios de ligação de fd e de M13 expressos a partir do fago com domínios de anticorpo Fab, Fv ou Fv estabilizados com dissulfureto e fundidos de forma recombinante à proteína do gene III ou do gene VIII de fago. Os exemplos de métodos de exposição em fagos que podem ser usados para produzir os anticorpos da presente invenção incluem os divulgados por Brinkman et ai., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et ai., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et ai., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et ai., Gene 187 9-18 (1997); Burton et ai., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); pedido PCT n2 PCT/GB91/01134; publicações PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; e patentes U.S. n2 5 698 426; 5 223 409; 5 403 484; 5 580 717; 5 427 908; 5 750 753; 5 821 047; 5 571 698; 5 427 908; 5 516 637; 5 780 225; 5 658 727; 5 733 743 e 5 969 108; sendo cada uma aqui incorporada por referência na sua globalidade.

Tal como descrito nas referências anteriores, após seleção dos fagos podem isolar-se as regiões de codificação de anticorpo dos fagos e usarem-se para gerar anticorpos completos incluindo anticorpos humanos ou qualquer outro fragmento de ligação de antigénio pretendido e expressar-se em qualquer hospedeiro pretendido, incluindo células de mamífero, células de inseto, células vegetais, leveduras e bactérias, e.g., tal como descrito detalhadamente seguidamente. Por exemplo, podem também utilizar-se técnicas para produzir de forma recombinante fragmentos de Fab, Fab' e F (abb(usando métodos conhecidos na especialidade tal como os revelados na publicação PCT WO 92/22324; Mullinax et ai., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); e Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); e Better et al., Science 240:1041-1043 (1988) (sendo as referidas referências incorporadas por referência na sua globalidade). Os exemplos de técnicas que podem ser usadas para produzir Fv em cadeia simples e anticorpos incluem os descritos em patente U.S. 4 946 778 e 5 258 498; Huston et al. , Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); e Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988).

Alternativamente ao rastreio de bibliotecas de anticorpos recombinantes por exposição em fagos, podem aplicar-se outras metodologias conhecidas na especialidade para rastrear bibliotecas combinatórias grandes para identificar anticorpos de especificidade dupla da invenção. Um tipo de sistema de expressão alternativo é aquele no qual se expressa uma biblioteca de anticorpos recombinantes como fusões ARN-proteina, tal como descrito na publicação PCT n2 WO 98/31700 por Szostak e Roberts e em Roberts, R.W. e Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 9j4:12297-12302. Neste sistema, cria-se uma fusão covalente entre um ARNm e o péptido ou proteína que este codifica pela tradução in vitro de ARNm sintéticos que contêm puromicina, um antibiótico aceitador peptídico, na sua extremidade 3' . Assim, pode enriquecer-se num ARNm específico a partir de uma mistura complexa de ARNm (e.g., uma biblioteca combinatória) com base nas propriedades do péptido ou proteína codificados, e.g., anticorpo ou sua parte, tal como ligação do anticorpo ou sua parte ao antigénio de especificidade dupla. As sequências de ácido nucleico que codificam anticorpos ou suas partes, recuperadas do rastreio de tais bibliotecas podem ser expressas por meios recombinantes tal como descrito anteriormente (e.g., em células hospedeiras de mamíferos) e além disso, podem ser sujeitas a maturação por afinidade adicional quer por ciclos adicionais de rastreio de fusões ARNm-péptido nas quais foram introduzidas mutações na(s) sequência (s) originalmente selecionada(s), quer por outros métodos para maturação por afinidade in vitro de anticorpos recombinantes, tal como descrito anteriormente.

Noutra abordagem, os anticorpos da presente invenção podem também ser gerados usando métodos de exposição em leveduras conhecidos na especialidade. Nos métodos de exposição em leveduras, usam-se métodos genéticos para acoplar domínios de anticorpo à parede da célula de levedura e expô-los à superfície da levedura. Nomeadamente, podem usar-se tais leveduras para expor domínios de ligação de antigénio expressos a partir de um repertório ou biblioteca de anticorpos combinatória (e. g., humana ou murina). Os exemplos de métodos de exposição em leveduras que podem ser usados para produzir os anticorpos da presente invenção incluem os revelados por Wittrup, et ai. patente U.S. n2 6 699 658 aqui incorporada por referência. 4. Produção de anticorpos anti-RGM A recombinantes específicos da invenção

Os anticorpos da presente invenção podem ser produzidos por quaisquer de várias técnicas conhecidas na especialidade. Por exemplo, expressão a partir de células hospedeiras, em que o(s) vetor (es) de expressão que codifica(m) para as cadeias pesada e leve é (são) transfetado(s) para uma célula hospedeira usando técnicas padrão. Pretende-se que as várias formas da expressão "transfeção" abranjam uma grande variedade de técnicas habitualmente utilizadas para a introdução de ADN exógeno numa célula hospedeira procariótica ou eucariótica, e.g., eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio, transfeção com DEAE-dextrano e semelhantes. Apesar de ser possível expressar os anticorpos da invenção em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, é preferível a expressão de anticorpos em células eucarióticas e com maior preferência em células hospedeiras de mamífero, porque é mais provável que tais células eucarióticas (e em particular células de mamífero) montem e excretem um anticorpo devidamente enrolado e ativo imunologicamente do que células procarióticas o façam.

As células hospedeiras de mamífero preferidas para expressar os anticorpos recombinantes da invenção incluem as do ovário de hamster chinês (células CHO) (incluindo células CHO dhfr-, descritas em Urlaub e Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad.

Sci. USA ΊΊ_: 4216-4220, usadas com um marcador selecionável de DHFR, e.g., tal como descrito em R.J. Kaufman e P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NSO, células COS e células SP2. Quando se introduzem vetores de expressão recombinantes que codificam para genes de anticorpo em células hospedeiras de mamífero, produzem-se os anticorpos por cultura das células hospedeiras durante um período de tempo suficiente para permitir expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou com maior preferência, excreção do anticorpo para o meio de cultura no qual se cultivam as células hospedeiras. Podem recuperar-se os anticorpos a partir do meio de cultura usando métodos padrão de purificação de proteína.

Podem também usar-se células hospedeiras para produzir fragmentos de anticorpo funcionais, tais como fragmentos de Fab ou moléculas de scFv. Considerar-se-á que as variações do procedimento anterior se encontram abrangidas pelo âmbito da presente invenção. Por exemplo, pode pretender-se transfetar uma célula hospedeira com ADN que codifique para fragmentos funcionais da cadeia leve e/ou da cadeia pesada de um anticorpo desta invenção. Pode também usar-se tecnologia de ADN recombinante para remover algum ou todo o ADN que codifica para a cadeia leve e/ou para a cadeia pesada, que não seja necessário para ligação aos antigénios de interesse. As moléculas expressas a partir de tais moléculas de ADN truncadas são também abrangidas pelos anticorpos da invenção. Além disso, podem produzir-se anticorpos bifuncionais nos quais uma cadeia pesada e uma cadeia leve são um anticorpo da invenção e a outra cadeia pesada e cadeia leve são específicas para um antigénio diferentes dos antigénios de interesse por reticulação de um anticorpo da invenção a um segundo anticorpo por métodos padrão de reticulação química.

Num sistema preferido para expressão recombinante de um anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio da invenção, introduz-se um vetor de expressão recombinante que codifica para a cadeia pesada de anticorpo e para a cadeia leve de anticorpo em células CHO dhfr- por transfeção mediada por fosfato de cálcio. No interior do vetor de expressão recombinante, os genes para as cadeias pesada e leve de anticorpo estão cada um ligados operacionalmente a elementos de regulação de facilitador de CMV / promotor de AdMLP para dirigir os elevados níveis de transcrição dos genes. 0 vetor de expressão recombinante também transporta um gene DHFR, que permite seleção de células CHO que foram transfetadas com o vetor usando seleção/amplificação com metotrexato. Cultivam-se as células hospedeiras transformadas selecionadas para permitir expressão das cadeias pesada e leve de anticorpo e recupera-se anticorpo intacto a partir do meio de cultura. Usam-se técnicas padrão de biologia molecular para preparar o vetor de expressão recombinante, transfetar as células hospedeiras, selecionar produtos de transformação, cultivar as células hospedeiras e recuperar o anticorpo a partir do meio de cultura. Ainda adicionalmente, a invenção proporciona um método para sintetizar um anticorpo recombinante da invenção por cultura de uma célula hospedeira da invenção num meio de cultura adequado até que se sintetize um anticorpo recombinante da invenção. 0 método pode compreender adicionalmente o isolamento do anticorpo recombinante a partir do meio de cultura.

4.1 Anticorpos anti-RGM A A tabela 5 é uma lista de sequências de aminoácidos das regiões VH e VL de anticorpos anti-hRGM A preferidos da invenção.

TABELA 5: LISTA DE SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DAS REGIÕES VH E VL DE ANTICORPOS 5F9 ANTI-hRGM A

As anteriores sequências isoladas de CDR de anticorpo anti-RGM A estabelecem uma nova família de proteínas de ligação a RGM A, isoladas de acordo com esta invenção. Para gerar e para selecionar as CDR da invenção com atividade preferida de ligação e/ou neutralização de RGM A relativamente a hRGM A, podem usar-se métodos padrão conhecidos na especialidade para gerar proteínas de ligação da presente invenção e avaliar as características de ligação e/ou neutralização de RGM A dessas proteínas de ligação, incluindo aquelas aqui descritos especificamente mas não se lhes limitando.

4.2 Anticorpos quiméricos anti-RGM A

Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual diferentes partes do anticorpo são derivadas de espécies animais diferentes, tais como anticorpos apresentando uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal murino e uma região constante de imunoglobulina humana. Os métodos para produzir anticorpos quiméricos são conhecidos na especialidade. Consultar e.g., Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et ai.,

BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et ai., (1989) J. Immunol.

Methods 125:191-202; patentes U.S. n2 5 807 715; 4 816 567; e 4 816 397, que são aqui incorporadas por referência na sua globalidade. Além disso, podem usar-se técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos" (Morrison et ai., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. 81:851-855; Neuberger et ai., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et ai., 1985, Nature 314:452-454 que são aqui incorporados por referência na sua globalidade) por splicing de genes de uma molécula de anticorpo de ratinho com especificidade antigénica apropriada conjuntamente com genes de uma molécula de anticorpo humano com atividade biológica apropriada.

Numa concretização, os anticorpos quiméricos da invenção são produzidos por substituição da região constante da cadeia pesada dos anticorpos monoclonais murinos anti-RGM A humana aqui descritos por uma região constante de IgGl humana.

4.3 Anticorpos anti-RGM A com enxerto de CDR

Os anticorpos com enxerto de CDR da invenção compreendem sequências das cadeias pesada e leve da região variável de um anticorpo humano em que uma ou mais das regiões de CDR de Vh e/ou Vl são substituídas por sequências de CDR de não humanos, tal como por exemplo anticorpos murinos da invenção. Uma sequência de esqueleto de qualquer anticorpo humano pode servir como um molde para enxerto de CDR. Contudo, a substituição direta da cadeia em tal esqueleto leva muitas vezes a alguma perda de afinidade de ligação ao antigénio. Quanto mais homólogo for o anticorpo humano ao anticorpo murino original, menos provável é a possibilidade que a combinação das CDR murinas com o esqueleto humano introduza distorções nas CDR que possam reduzir a afinidade. Assim, é preferível que o esqueleto variável humano que é escolhido para substituir o esqueleto variável murino tenha, além das CDR, uma identidade de sequência de pelo menos 65% com o esqueleto da região variável do anticorpo murino. É mais preferível que as regiões variáveis humana e murina tenham, além das CDR, pelo menos 70% de identidade de sequência. É ainda mais preferível que as regiões variáveis humana e murina tenham, além das CDR, pelo menos 75% de identidade de sequência. A maior preferência é que as regiões variáveis humana e murina tenham, além das CDR, pelo menos 80% de identidade de sequência. Os métodos para produção de anticorpos com enxerto de CDR são conhecidos na especialidade (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); patente U.S. n2 5 225 539). Numa concretização específica a invenção proporciona anticorpos com enxerto de CDR com cadeias Vh e/ou Vl tal como descritas na tabela 6.

TABELA 6: ANTICORPOS COM ENXERTO DE CDR

As sequências de CDR derivadas de mAb 5F9 apresentam-se por letras em negrito. Também se faz referência às sequências de esqueleto específicas (FR1 a FR4) mencionando as SEQ ID N2 correspondentes (consultar também as tabelas 3 e 4) 4.4 Anticorpos anti-RGM A humanizados

Os anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo de anticorpo de espécies não humanas que ligam o antigénio pretendido apresentando uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDR) das espécies não humanas e regiões de esqueleto de uma molécula de imunoglobulina humana. Revelam-se sequências de Ig humanas conhecidas em e.g., www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; www:atcc:org/phage/hdb.html; www.sciquest:com/; www.abcam.com/; www. antibodyresource . com/onlinecomp .html; www. public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman . com/immunology/CH-0 5/kuby0 5.htm; www. library .thinkquest.org/12 42 9/Immune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www. path.cam.ac.uk/.about.mrc7/mikeimages .html; www. antibodyresource. com/; mcb. harvard.edu/BioLinks/Immunology .html.www. immunologylink .co m/;pathbox.wust1.edu/. about.hcenter/index .-html; www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html; www.nal. usda . gov/awic/pubs/anticorpo/; www.m.ehime-u.acjp/. about:yasuhito-/Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www:icnet.uk/axp/facs/davies/links .html; www.biotech.ufl.edu/.about.feel/protocol.html; www.isac-net.org/sites_geo.html; aximtl.imt.uni-marburg.de/. about.rek/AEP-Start.html; baserv.uci.kun.nl/. about.jraats/linksl.html; www. recab .:uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mre-epe. cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO .html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html;imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/.about. martin/abs/index .html; anticorpo.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/. about.honegger/AHOseminar/SlideO1.html; www. cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www. path.cam.ac.uk/.about.mrc7/humanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www. cryst.bioc.cam.ac.uk/.about.fmolina/Webpages /Pept/spottech .html; www.jerini.de/products.htm; www. patent s.ibm. com/ibm.html. Rabat et al. , Sequences of

Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983), cada um aqui completamente incorporado por referência. Podem usar-se tais sequências importadas para reduzir a imunogenicidade ou para reduzir, aumentar ou modificar a ligação, afinidade, velocidade de ligação, velocidade de dissociação, avidez, especificidade, semivida ou qualquer outra caracteristica adequada, tal como conhecido na especialidade.

Podem substituir-se os resíduos de esqueleto nas regiões de esqueleto humano pelo resíduo correspondente da CDR do anticorpo dador para alterar, preferentemente melhorar, a ligação de antigénio. Estas substituições de esqueleto são identificadas por métodos bem conhecidos na especialidade, e.g., por modelação das interações dos resíduos de CDR e de esqueleto para identificar resíduos de esqueleto importantes para ligação de antigénio e comparação de sequências para identificar resíduos de esqueleto não usuais em posições específicas. (Consultar, e.g., Queen et al., patente U.S. n2 5 585 089; Riechmann et al. , Nature 332:323 (1988), que são aqui incorporadas por referência na sua globalidade). Os modelos tridimensionais de imunoglobulinas estão facilmente disponíveis e são familiares aos peritos na especialidade. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e apresentam estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção destas apresentações permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, i.e., a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata ligar o seu antigénio. Desta forma, podem selecionar-se e combinar-se resíduos de FR a partir das sequências consensual e de importação de modo a que se atinja a caracteristica pretendida do anticorpo, tal como afinidade aumentada para o (s) antigénio (s) alvo. De um modo geral, os resíduos de CDR estão direta e muito substancialmente envolvidos na determinação da ligação do antigénio. Os anticorpos podem ser humanizados usando uma variedade de técnicas conhecidas na especialidade, tal como as descritas em Jones et ai., Nature 321:522 (1986); Verhoeyen et ai., Science 239:1534 (1988)), Sims et ai., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia e Lesk, J. Mol.

Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991);

Studnicka et al. , Protein Engineering 7(6):805-814 (1994);

Roguska et al. , PNAS 91:969-973 (1994); publicação PCT WO91/09967, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, W090/14430, EP 229 246, EP 592 106; EP 519 596, EP 239 400, patentes U.S. n2 5 565 332, 5 723 323, 5 976 862, 5 824 514, 5 817 483, 5 814 476, 5 763 192, 5 723 323, 5 766 886, 5 714 352, 6 204 023, 6 180 370, 5 693 762, 5 530 101, 5 585 089, 5 225 539; 4 816 567, não se lhes limitando, cada um aqui completamente incorporado por referência, incluindo as referências ai citadas. 5. Concretizações adicionais dos anticorpos da invenção 5.1 Anticorpos de fusão e imunoadesinas O presente pedido também descreve um anticorpo de fusão ou imunoadesina que pode ser produzido e que compreende a totalidade ou uma parte de um anticorpo anti-RGM A do presente pedido ligado a outro polipéptido. Em algumas concretizações, apenas a região variável do anticorpo anti-RGM A é que está ligada ao polipéptido. Noutras concretizações, o domínio VH de um anticorpo anti-RGM A deste pedido está ligado a um primeiro polipéptido, enquanto o domínio VL do anticorpo está ligado a um segundo polipéptido que se associa ao primeiro polipéptido de uma forma que permite que os domínios VH e VL interajam entre si para formar um local de ligação de anticorpo. Noutras concretizações, o domínio VH é separado do domínio VL por um ligante que permite que os domínios VH e VL interajam entre si (consultar seguidamente em Anticorpos de cadeia única). Liga-se então o anticorpo VH-ligante-VL a um polipéptido de interesse. O anticorpo de fusão é útil para dirigir um polipéptido para uma célula ou tecido que expressa uma RGM A. O polipéptido de interesse pode ser um agente terapêutico, tal como uma toxina ou pode ser um agente de diagnóstico, tal como uma enzima; que pode ser facilmente visualizada tal como peroxidase de rábano. Além disso, podem criar-se anticorpos de fusão nos quais dois (ou mais) anticorpos de cadeia única estão ligados entre si. Tal é útil para se criar um anticorpo divalente ou polivalente numa única cadeia de polipéptido ou caso se pretenda criar um anticorpo biespecifico.

Uma concretização proporciona uma proteína de ligação marcada em que um anticorpo ou parte de anticorpo do presente pedido é derivatizada ou ligada a outra molécula funcional (e.g., outro péptido ou proteína). Por exemplo, uma proteína de ligação marcada do presente pedido pode ser derivada por ligação funcional de um anticorpo ou parte de anticorpo do presente pedido (por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais de outras entidades moleculares, tal como um ácido nucleico, outro anticorpo (e.g., um anticorpo biespecífico ou um diacorpo), um agente detetável, um agente citotóxico, um agente farmacêutico e/ou uma proteína ou péptido que possam mediar a associação do anticorpo ou parte de anticorpo com outra molécula (tal como uma região nuclear de estreptavidina ou um marcador de poli-histidina).

Os agentes detetáveis úteis com os quais se pode derivatizar um anticorpo ou parte de anticorpo do presente pedido incluem compostos fluorescentes. Os exemplos de agentes detetáveis fluorescentes incluem fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloreto de 5-dimetilamina-1-naftalenossulfonilo, ficoeritrina e semelhantes. Um anticorpo pode também ser derivatizado com enzimas detetáveis, tais como fosfatase alcalina, peroxidase de rábano, glucose oxidase e semelhantes. Quando um anticorpo é derivatizado com uma enzima detetável, é detetado por adição de reagentes adicionais que a enzima usa para produzir uma produto de reação detetável. Por exemplo, quando está presente o agente detetável de peroxidase de rábano, a adição de peróxido de hidrogénio e diaminobenzidina leva a um produto de reação colorido, que é detetável. Um anticorpo pode também ser derivatizado com um ácido nucleico, biotina e detetado através de medições indiretas de ligação de avidina ou estreptavidina. 5.2 Anticorpos de cadeia única 0 presente pedido inclui um anticorpo de cadeia única (scFv) que liga uma RGM A imunogénica da invenção. Para produzir o ADN que codifica para scFv, VH e V, este está ligado operacionalmente ao ADN que codifica para um ligando flexível, e.g., que codifica para a sequência de aminoácidos (Gly4-Ser), de modo a que as sequências VH e VL possam ser expressas como uma proteína de cadeia única contígua com as regiões VL e VH unidas pelo ligando flexível (consultar e.g., Bird et ai. (1988) Science 242:423-42 6; Huston et ai. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883; McCafferty et ai., 30 Nature (1990) 34 8: 552-554). O anticorpo de cadeia única pode ser monovalente, caso se usem apenas uma única VH e VL, bivalente, caso se usem duas VH e VL ou polivalente, caso se usem mais do que duas VH e VL. Dois dos referidos fragmentos de scFv acoplados através de um ligante denominam-se "diacorpo" cuja forma é também abrangida pelo âmbito da invenção. 5.3 Anticorpos biespecíficos O presente pedido inclui adicionalmente um anticorpo biespecífico ou seu fragmento de ligação de antigénio no qual uma especificidade é para um polipéptido de RGM A imunogénico do presente pedido. Por exemplo, pode gerar-se um anticorpo biespecífico que se liga especificamente a um polipéptido de RGM A imunogénico da invenção através de um domínio de ligação e a uma segunda molécula através de um segundo domínio de ligação. Adicionalmente, pode gerar-se um anticorpo de cadeia única contendo mais do que um VH e VL que se liga especif icamente a um polipéptido imunogénico da invenção e a outra molécula que está associada a colapso do cone de crescimento mediado pela atenuação de mielina e inibição de crescimento para o exterior de neurites e germinação. Podem gerar-se tais anticorpos biespecíficos usando técnicas que são bem conhecidas por exemplo, Fanger et ai. Immunol Methods 4: 72-81 (1994) e Wright e Harris, 20 (anteriormente).

Em algumas concretizações, preparam-se os anticorpos biespecíficos usando uma ou mais das regiões variáveis de um anticorpo da invenção. Noutra concretização, prepara-se o anticorpo biespecífico usando uma ou mais regiões de CDR do referido anticorpo. 5.4 Anticorpos derivatizados e marcados

Um anticorpo ou um fragmento de ligação de antigénio do presente pedido pode ser derivatizado ou ligado a outra molécula (e.g., outro péptido ou proteína). De um modo geral, o anticorpo ou fragmento de ligação de antigénio é derivatizado de modo a que a ligação a um polipéptido imunogénico da invenção não seja afetada negativamente pela derivatização ou pela marcação.

Por exemplo, um anticorpo ou parte de anticorpo do presente pedido pode ser funcionalmente ligado (por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais de outras entidades moleculares, tal como outro anticorpo (e.g., um anticorpo biespecífico ou um diacorpo), um reagente de deteção, um agente citotóxico, um agente farmacêutico e/ou uma proteína ou péptido que pode mediar associação do anticorpo ou fragmento de ligação de antigénio com outra molécula (tal como uma região nuclear de estreptavidina ou um marcador de poli-histidina). Ainda adicionalmente, um anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio pode ser parte de uma molécula de imunoadesão maior, formada por associação covalente ou não covalente do anticorpo ou parte de anticorpo com uma ou mais outras proteínas ou péptidos distintos ou diferentes. Os exemplos de tais moléculas de imunoadesão incluem o uso da região nuclear de estreptavidina para produzir uma molécula de scFv tetramérica (Kipriyanov et ai. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) e uso de um resíduo de cisteína, um péptido marcador e um marcador de poli-histidina no terminal C para produzir moléculas de scFv bivalentes e biotiniladas (Kipriyanov et ai. (1994) Molecular Immunology 31:1047-1058) . Podem preparar-se partes de anticorpo, tal como fragmentos Fab e F (ab' a partir de anticorpos completos usando técnicas convencionais tal como digestão com papaína ou pepsina, respetivamente, de anticorpos completos. Além disso, podem obter-se anticorpos, partes de anticorpo e moléculas de imunoadesão usando técnicas de ADN recombinante padrão.

Pode produzir-se um anticorpo derivatizado por reticulação de dois ou mais anticorpos (do mesmo tipo ou de tipos diferentes, e. g., para criar anticorpos biespecificos). Os agentes de reticulação adequados incluem os que são heterobifuncionais, com dois grupos reativos distintos separados por um espaçador apropriado (e.g. éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) ou homobifuncionais (e.g., suberato de disuccinimidilo). Tais ligantes estão disponíveis de Pierce Chemical Company, Rockford, 111.

Um anticorpo derivatizado pode também ser um anticorpo marcado. Por exemplo, os agentes de deteção com os quais se pode derivatizar um anticorpo ou parte de anticorpo da invenção são compostos fluorescentes, incluindo fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloreto de 5-dimetilamino-l-naftalenossulfonilo, ficoeritrina, fósforos de lantanídeo e semelhantes. Um anticorpo pode também ser marcado com enzimas que são úteis para deteção, tal como peroxidase de rábano, galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina, glucose oxidase e semelhantes. Em concretizações que estão marcadas com uma enzima detetável, deteta-se o anticorpo por adição de reagentes adicionais que a enzima usa para produzir um produto de reação detetável. Por exemplo, peroxidase de rábano com peróxido de hidrogénio e diaminobenzidina. Um anticorpo pode também ser marcado com biotina e detetado através de medição indireta da ligação de avidina ou de estreptavidina. Pode também marcar-se um anticorpo com um epítopo de polipéptido predeterminado reconhecido por um repórter secundário (e. g., sequências de par de cremalheira de leucina, locais de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, marcadores de epítopo). Pode também marcar-se um anticorpo anti-RGM A ou seu fragmento de antigénio com um aminoácido marcado radioativamente. 0 marcador radioativo pode ser usado com objetivos tanto de diagnóstico como terapêuticos. 0 anticorpo anti-RGM A marcado radioativamente pode ser usado para diagnóstico, por exemplo, para determinar os níveis de receptor de RGM A num indivíduo. Além disso, o anticorpo anti-RGM A marcado radioativamente pode ser usado terapeuticamente para tratar lesão da espinal medula.

Os exemplos de marcadores para polipéptidos incluem os seguintes isótopos radioativos ou radionucleótidos 15N, 35S, 90Y, "Tc, 111In, 1251 , 1311 , 177Lu, 166Ho, 153Sm, não se lhes limitando. Pode também derivatizar-se um anticorpo anti-RGM A ou seu fragmento de antigénio com um grupo químico tal como polietilenoglicol (PEG), um grupo metilo ou etilo ou um grupo de hidrato de carbono. Estes grupos podem ser úteis para melhorar as características biológicas do anticorpo, e.g., para aumentar a semivida sérica ou para aumentar a ligação ao tecido. De igual modo, um marcador para polipéptidos pode incluir um ácido nucleico, por exemplo ADN para deteção por PCR ou melhoria da expressão génica ou ARNsi para suprimir expressão génica em células ou tecidos contendo RGM A. A classe e subclasse de anticorpos anti-RGM A pode ser determinada por qualquer método conhecido na especialidade. De um modo geral, a classe e subclasse de um anticorpo pode ser determinada usando anticorpos que são específicos para uma classe e subclasse específica de anticorpo. Tais anticorpos estão disponíveis comercialmente. Pode determinar-se a classe e subclasse por ELISA, transferência "Western" assim como por outras técnicas. Alternativamente, pode determinar-se a classe e subclasse por sequenciação da totalidade ou de parte dos domínios constantes das cadeias pesada e/ou leve dos anticorpos, comparação das suas sequências de aminoácidos com as sequências de aminoácidos conhecidas de várias classes e subclasses de imunoglobulinas e determinação da classe e subclasse dos anticorpos. 5.5 Imunoglobulinas de domínio variável duplo

As proteínas de ligação ou imunoglobulinas de domínio variável duplo (DVD) tal como aqui usadas, são proteínas de ligação que compreendem dois ou mais locais de ligação de antigénio e são proteínas de ligação multivalentes, tal como por exemplo divalentes e tetravalentes. A expressão "proteína de ligação multivalente" usa-se neste fascículo para denominar uma proteína de ligação compreendendo dois ou mais locais de ligação de antigénio. A proteína de ligação multivalente é preferentemente concebida racionalmente para apresentar dois ou mais locais de ligação de antigénio e geralmente não é um anticorpo de ocorrência natural. A expressão "proteína de ligação multiespecífica" refere-se a uma proteína de ligação capaz de ligar dois ou mais alvos relacionados ou não. Tais DVD podem ser monoespecíficas i.e capazes de ligar um antigénio ou multiespecificas, i.e. capazes de ligar dois ou mais antigénios. As proteínas de ligação DVD compreendendo polipéptidos DVD de cadeia pesada e dois polipéptidos DVD de cadeia leve são denominadas DVD Ig. Cada metade de uma DVD Ig compreende um polipéptido DVD de cadeia pesada e um polipéptido DVD de cadeia leve e dois locais de ligação de antigénio. Cada local de ligação compreende um domínio variável da cadeia pesada e um domínio variável da cadeia leve com um total de 6 CDR envolvidas na ligação de antigénio por local de ligação de antigénio. As proteínas de ligação DVD e métodos para produzir proteínas de ligação DVD são divulgados no pedido de patente US N2 11/507 050 e aqui incorporado por referência. Pretende-se que a presente invenção compreenda uma proteína de ligação DVD compreendendo proteínas de ligação capazes de ligar RGM A. Preferentemente a proteína de ligação DVD é capaz de ligar RGM A e um segundo alvo. O segundo alvo é selecionado do grupo que consiste de atividades anti-inflamatórias de MAB (IL-1, IL-6, IL-8, IL-11, IL-12, IL-17, IL-18, IL-23, TNF alfa/beta, IFN-beta, gama, LIF, OSM, CNTF, PF-4, proteína básica de plaquetas (PBP), NAP-2, beta-TG, MIP-1, MCP2/3, RANTES, linfotatina), de proteínas mediadoras de transporte (recetor de insulina, recetor de transferrina, recetor de trombina, recetor de leptina, recetor de LDL), de outros MAB neurorregenerativos (NgR, Lingo, p75, CSPG (e.g. NG-2, neurocan, brevican, versican, aggrecan) ácido hialurónico, mAG, tenascina, NI-35, NI-250, IMP, perlecan, neurocan, fosfacan, nogo-A; OMGP, Sema4D, Sema 3A, efrina B3, efrina A2, efrina A5, MAG, EphA4, plexina Bl, TROY, wnts, ryk rec., BMP-2, BMP-4, BMP-7), de atividades de MAB neuroprotetores (EGF, EGFR, Sema 3), de MAB anti-beta-amiloide (e.g. m266, 3D6 (bapineuzumab), MAB anti-globulómero 7C6) , de recetores e transportadores localizados no SNC (recetores de serotonina, recetores de dopamina, DAT, Asc-1, GlyTl). 5.6 Anticorpos com especificidade dupla O presente pedido também descreve a tecnologia de "anticorpo com especificidade dupla". Os anticorpos com especificidade dupla podem servir como agonistas, antagonistas ou ambos em diferentes combinações. Os anticorpos com especificidade dupla são anticorpos nos quais a cadeia VH se liga a um primeiro antigénio e a cadeia VL se liga a outro antigénio tal como exemplificado em W02008082651. 5.7 Anticorpos cristalizados

Outra concretização do presente pedido proporciona uma proteína de ligação cristalizada. A expressão "cristalizada" tal como aqui usada, refere-se a um anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio, que existe sob a forma de um cristal. Os cristais são uma forma do estado sólido da matéria que é distinta de outras formas tais como o estado sólido amorfo e o estado liquido cristalino. Os cristais são compostos por matrizes regulares, repetitivas e tridimensionais de átomos, iões, moléculas (e.g., proteínas tais como anticorpos) ou conjuntos moleculares (e.g., complexos antigénio/anticorpo) . Estas matrizes tridimensionais estão organizadas de acordo com relações matemáticas específicas que são bem compreendidas no campo. A unidade fundamental ou bloco de construção, que é repetida num cristal denomina-se unidade assimétrica. A repetição da unidade assimétrica num arranjo que está em conformidade com uma simetria cristalográfica determinada e bem definida proporciona a "célula unitária" do cristal. A repetição da célula unitária por translações regulares em todas as três dimensões dá origem ao cristal. Consultar Giege, R. e Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2a ed., p. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999).

Preferentemente o presente pedido descreve cristais de anticorpos anti-RGM A completos e seus fragmentos tal como aqui divulgado e formulações e composições compreendendo tais cristais. Numa concretização a proteína de ligação cristalizada tem uma semivida in vivo maior do que a homónima solúvel da proteína de ligação. Noutra concretização a proteína de ligação retém atividade biológica após cristalização. A proteína de ligação cristalizada da invenção pode ser produzida de acordo com métodos conhecido na especialidade e tal como divulgado em WO 02072636, aqui incorporada por referência. 5.8 Anticorpos glicosilados

Outra concretização da invenção proporciona uma proteína de ligação glicosilada em que o anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio compreende um ou mais resíduos de hidrato de carbono. A produção de proteína in vivo nascente pode sofrer processamento adicional conhecido como modificação pós-tradução. Nomeadamente, podem adicionar-se enzimaticamente resíduos de açúcar (glicosilo), um processo conhecido como glicosilação. As proteínas resultantes apresentado cadeias laterais de oligossacárido ligadas covalentemente são conhecidas como proteínas glicosiladas ou glicoproteínas. Os anticorpos são glicoproteínas com um ou mais resíduos de hidrato de carbono no domínio de Fc, assim como no domínio variável. Os resíduos de hidrato de carbono no domínio de Fc têm um efeito importante na função efetora do domínio de Fc, tendo um efeito mínimo na ligação do antigénio ou na semivida do anticorpo (R. Jefferis, Biotechnol. Prog. 21 (2005), p. 11-16). Contrariamente, a glicosilação do domínio variável pode ter um efeito na atividade de ligação do antigénio ao anticorpo. A glicosilação no domínio variável pode ter um efeito negativo na afinidade de ligação de anticorpo, provavelmente devido ao impedimento estérico (Co, M.S., et ai., Mol. Immunol. (1993) 30:1361- 1367) ou pode resultar num aumento da afinidade para o antigénio (Wallick, S.C., et ai., Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright, A., et ai., EMBO J. (1991) 10:2717 2723).

Um aspeto da presente invenção é dirigido para a geração de mutantes do local de glicosilação nos quais se mutou o local de glicosilação ligado a O ou ligado a N da proteína de ligação. O perito na especialidade pode gerar tais mutantes usando tecnologias padrão bem conhecidos. É outro objetivo da presente invenção que os mutantes do local de glicosilação mantenham a atividade biológica mas apresentem atividade de ligação aumentada ou diminuída.

Ainda noutra concretização, modifica-se a glicosilação do anticorpo ou parte de ligação de antigénio da invenção. Por exemplo, pode produzir-se um anticorpo aglicosilado (i.e., o anticorpo não apresenta glicosilação). A glicosilação pode ser alterada para, por exemplo, aumentar a afinidade do anticorpo para o antigénio. Tais modificações de hidratos de carbono podem obter-se, por exemplo, por alteração de um ou mais locais de glicosilação no interior da sequência do anticorpo. Por exemplo, podem efetuar-se uma ou mais substituições de aminoácidos que resultam na eliminação de um ou mais locais de glicosilação de região variável para assim eliminar a glicosilação nesse local. Tal aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo para o antigénio. Descreve-se tal abordagem com detalhe adicional na publicação PCT W02003016466A2 e patentes U.S. n2 5 714 350 e 6 350 861, sendo cada uma das quais aqui incorporada por referência na sua globalidade.

Adicional ou alternativamente, pode produzir-se um anticorpo modificado da invenção que tem um tipo de glicosilação alterada, tal como um anticorpo hipofucosilado apresentando quantidades reduzidas de resíduos de fucosilo ou um anticorpo com aumento de estruturas de GlcNAc que bissetam. Demonstrou-se que tais padrões de glicosilação alterados aumentam a capacidade de ADCC dos anticorpos. Tais modificações de hidratos de carbono podem obter-se, por exemplo, por expressão do anticorpo numa célula hospedeira com maquinaria de glicosilação alterada. Descreveram-se na especialidade células com maquinaria de glicosilação alterada e podem usar-se como células hospedeiras nas quais se pode expressar anticorpos recombinantes da invenção para assim produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Consultar, por exemplo, Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, assim como, patente europeia n2: EP 1 176 195; publicações PCT WO 03/035835; WO 99/54342 80, sendo cada uma das quais aqui incorporada por referência na sua globalidade. A glicosilação de proteínas depende da sequência de aminoácidos da proteína de interesse, assim como da célula hospedeira na qual a proteína é expressa. Organismos diferentes podem produzir enzimas de glicosilação diferentes (eg., glicosiltransferases e glicosidases) e têm disponíveis substratos diferentes (açúcares de nucleótido). Devido a tais fatores, o padrão de glicosilação de proteína e a composição dos resíduos glicosilos, podem diferir dependendo do sistema de hospedeiro no qual se expressa a proteína específica. Os resíduos de glicosilo úteis na invenção podem incluir glucose, galactose, manose, fucose, n-acetilglucosamina e ácido siálico, não se lhes limitando. Preferentemente a proteína de ligação glicosilada compreende resíduos glicosilo tal como o padrão de glicosilação seja humano.

Os peritos na especialidade sabem que a glicosilação diferencial de proteínas pode resultar em diferentes características da proteína. Por exemplo, a eficácia de uma proteína terapêutica produzida num microrganismo hospedeiro, tal como levedura e glicosilada utilizando a via endógena de levedura pode ser reduzida comparativamente com a da mesma proteína expressa em células de mamífero, tal como uma linha celular de CHO. Tais glicoproteínas podem também ser imunogénicas em humanos e apresentar uma semivida reduzida in vivo após administração. Os recetores específicos em humanos e outros animais podem reconhecer resíduos glicosilo específicos e promover a depuração rápida da proteína da corrente sanguínea. Outros efeitos adversos podem incluir alterações no enrolamento, solubilidade, suscetibilidade a protéases, tráfego, transporte, compartimentalização, excreção, reconhecimento de outras proteínas ou fatores, antigenicidade ou alergenicidade da proteína. Assim, o especialista pode preferir uma proteína terapêutica com uma composição e padrão de glicosilação específicos, por exemplo composição e padrão de glicosilação idênticos ou pelo menos semelhante, ao produzido em células humanas ou nas células específicas da espécie do animal individual pretendido. A expressão de proteínas glicosiladas diferentes das provenientes de uma célula hospedeira pode obter-se por modificação genética da célula hospedeira para expressar enzimas de glicosilação heterólogas. Usando técnicas conhecidas na especialidade, um especialista pode gerar anticorpos ou suas partes de ligação de antigénio apresentando glicosilação de proteína humana. Por exemplo, modificaram-se geneticamente estirpes de levedura para expressar enzimas de glicosilação que não são de ocorrência natural de modo a que as proteínas glicosiladas (glicoproteínas) produzidas nestas estirpes de levedura apresentem glicosilação de proteínas idêntica à de células animais, especialmente células humanas (pedidos de patente U.S 20040018590 e 20020137134 e publicação PCT W02005100584 A2).

Além disso, o perito na especialidade considerará que uma proteína de interesse pode ser expressa usando uma biblioteca de células hospedeiras modificadas por engenharia genética para expressarem várias enzimas de glicosilação, de modo a que as células hospedeiras que são membros da biblioteca produzam a proteína de interesse com vários padrões de glicosilação. 0 especialista pode então selecionar e isolar a proteína de interesse com novos padrões de glicosilação específicos. Preferentemente, a proteína apresentando um padrão de glicosilação novo e selecionado especificamente apresenta propriedades biológicas melhoradas ou alteradas. 5.9 Anticorpos anti-idiotípicos

Além das proteínas de ligação, a presente invenção dirige-se também a um anticorpo anti-idiotípico (anti-Id) específico para tais proteínas de ligação da invenção. Um anticorpo anti-Id é um anticorpo que reconhece determinantes únicos geralmente associados com a região de ligação de antigénio de outro anticorpo. Os anti-Id podem preparar-se por imunização de um animal com a proteína de ligação ou com uma sua região contendo a CDR. 0 animal imunizado reconhecerá e responderá aos determinantes idiotípicos do anticorpo imunizante e produzirá um anticorpo anti-Id. 0 anticorpo anti-Id pode também ser usado como um "imunogénio" para induzir uma resposta imunitária num terceiro animal, produzindo o denominado anticorpo anti-anti-Id. 6. Usos dos anticorpos

Dada a sua capacidade de se ligarem a RGM A humana, os anticorpos neutralizantes do presente pedido ou suas partes, podem usar-se para detetar RGM A humana (e.g., numa amostra biológica, tal como soro ou plasma), usando um imunoensaio convencional, tal como ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) e um radioimunoensaio (RIA) ou imuno-histoquímica de tecidos. 0 presente pedido proporciona um método para detetar RGM A humana numa amostra biológica compreendendo por em contacto uma amostra biológica com um anticorpo ou parte de anticorpo da invenção e detetar o anticorpo (ou parte de anticorpo) ligado a RGM A humana ou anticorpo (ou parte de anticorpo) não ligado, para assim detetar RGM A humana na amostra biológica. 0 anticorpo está marcado direta ou indiretamente com uma substância detetável para facilitar a deteção do anticorpo ligado ou não ligado. As substâncias detetáveis adequadas incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes e materiais radioativos. Os exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou acetilcolinesterase; os exemplos de complexos de grupos prostéticos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; os exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazinilaminafluoresceina, cloreto de dansilo ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; e exemplos de material radioativo adequado incluem 3H, 14C, 35S, 90Y, "Tc, 711In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, 153Sm.

Os anticorpos e partes de anticorpo do presente pedido são preferentemente capazes de neutralizar a atividade de RGM A humana tanto in vitro como in vivo. Assim, tais anticorpos e partes de anticorpo da invenção podem usar-se para inibir a ligação de RGM A ao seu recetor neogenina, a BMP-2 e/ou BM-4 e assim inibir a atividade resultante.

Noutra concretização, o presente pedido proporciona um método para reduzir a atividade de RMG A num indivíduo e vantajosamente de um indivíduo que sofra de uma doença ou distúrbio na qual a atividade resultante de RGM A seja prejudicial. 0 presente pedido proporciona métodos para reduzir a atividade de RGM A num indivíduo que sofra de tal doença ou distúrbio, ao evitar a ligação de RGM A a neogenina e/ou BMP-2 e/ou BMP-4, através do uso dos anticorpos monoclonais do presente pedido. Os anticorpos do presente pedido, em particular os anticorpos humanizados aqui revelados, podem ser administrados a um indivíduo humano com objetivos terapêuticos. Além disso, os anticorpos do presente pedido podem ser administrados a um mamífero não humano que expresse uma RGM A com a qual o anticorpo é capaz de ligação com objetivos veterinários ou como um modelo animal de doença humana. Relativamente a esta última, tais modelos animais podem ser úteis para avaliar a eficácia terapêutica dos anticorpos da invenção (e.g., testagem de dosagens e calendários de administração).

Tal como aqui utilizada, pretende-se que a expressão "a doença para a qual a atividade de RGM A é prejudicial" inclua doenças e outros distúrbios nas quais se provou ou se suspeite que a presença de RGM A ou da sua atividade resultante num indivíduo que sofra do distúrbio, é responsável pela patofisiologia do distúrbio ou é um factor que contribui para um agravamento do distúrbio. Assim, um distúrbio no qual a atividade de RGM A é prejudicial é um distúrbio no qual se espera que a redução da atividade de RGM A alivie os sintomas e/ou a progressão do distúrbio. Os exemplos não limitativos de distúrbios que podem ser tratados com os anticorpos da invenção incluem os distúrbios discutidos na secção seguinte relativos a composições farmacêuticas dos anticorpos da invenção.

Considera-se que RGM A desempenha um papel importante na patologia associada a várias doenças envolvendo doenças neurológicas associadas com neurodegeneração ou inibição de processos neurorregenerativos, resultando em paralisia. Estas incluem demência, demência senil, dificuldades cognitivas moderadas, demência relacionada com Alzheimer, coreia de Huntington, discinesia tardia, hipercinesias, manias, doença de Parkinson, síndrome de Steel-Richard, síndrome de Down, miastenia grave, traumatismo dos nervos, amiloidose vascular, hemorragia cerebral I com amiloidose, inflamação cerebral, ataxia de Friedrich, doença de confusão aguda, glaucoma, doença de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica, lesão do plexo braquial, lesão cerebral incluindo traumatismo craniano, paralisia cerebral, Guillain Barre, leucodistrofias, esclerose múltipla, pós-pólio, espinha bífida, lesão da espinal medula, atrofia da espinal medula, tumores espinais, AVC e mielite transversa.

Igualmente, tal como discutido anteriormente, podem usar-se imunoglobulinas de DVD ou anticorpos com especificidade dupla entre qualquer um dos parceiros descritos anteriormente. Tais preparações de anticorpo tal como descritas anteriormente podem ser úteis para o tratamento de doença de Alzheimer, doença de Parkinson, lesão da espinal medula, traumatismo craniano, esclerose múltipla, lesão dos nervos periféricos, esquizofrenia, depressão, ansiedade, assim como qualquer plasticidade e crescimento de neurites e doença relacionada com neurotoxicidade mencionada anteriormente.

Os anticorpos do presente pedido podem também ser combinados com péptidos permitindo que a transferência transmembranar inclua a direção ao alvo de proteínas alvo intracelulares. Tais sequências de péptido podem incluir tat, Antennapedia, poliargininas, alguns péptidos antimicrobianos, não se lhes limitando. Tais péptidos podem permitir a transferência através de membranas, incluindo membranas do plasma celular, mas também epitélios e membranas endoteliais, incluindo a barreira hematoencefálica, mucosa intestinal, meninges e outras.

Um anticorpo ou parte de anticorpo do presente pedido pode ser também administrado com um ou mais agentes terapêuticos de moléculas pequenas adicionais que são úteis no tratamento de doenças nas quais está envolvida a atividade de RGM A tal como discutido nos parágrafos anteriores. Deve considerar-se que os anticorpos do presente pedido ou uma sua parte de ligação de antigénio se podem utilizar sozinhos ou em combinação com um agente adicional, e.g., um agente terapêutico, sendo o referido agente adicional selecionado pelo perito para o objetivo pretendido. Por exemplo, o agente adicional pode ser um agente terapêutico reconhecido na especialidade como sendo útil para tratar a doença ou condição que está a ser tratada pelo anticorpo da presente invenção. 0 agente adicional pode também ser um agente que confere uma caracteristica benéfica à composição terapêutica e.g., um agente que afeta a viscosidade da composição. 7. Composições farmacêuticas A invenção também proporciona composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo da invenção, ou sua parte de ligação de antigénio, e um transportador farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas compreendendo anticorpos da invenção são para uso em diagnóstico, deteção ou monitorização de uma doença, na prevenção, tratamento, controlo ou melhoria de uma doença ou um ou mais dos seus sintomas e/ou em investigação, não se lhes limitando. Numa concretização específica, uma composição compreende um ou mais anticorpos da invenção. Noutra concretização, a composição farmacêutica compreende um ou mais anticorpos da invenção e um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos diferentes dos anticorpos da invenção para tratar uma doença no qual a atividade de RGM A é prejudicial. De preferência, sabe-se que os agentes profiláticos ou terapêuticos são úteis para a prevenção, tratamento, controlo ou melhoria de uma doença ou um ou mais dos seus sintomas ou são atualmente usados para tal. De acordo com estas concretizações, a composição pode compreender adicionalmente um transportador, diluente ou excipiente.

Os anticorpos e partes de anticorpo da invenção podem ser incorporados em composições farmacêuticas adequadas para administração a um indivíduo. Tipicamente, a composição farmacêutica compreende um anticorpo ou parte de anticorpo da invenção e um transportador farmaceuticamente aceitável. Tal como aqui usado, "transportador farmaceuticamente aceitável" inclui todo e qualquer solvente, meio de dispersão, revestimento, agente antibacteriano e antifúngico, agente isotónico e de absorção prolongada e semelhantes que sejam fisiologicamente compatíveis. Os exemplos de transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem um ou mais de água, soro fisiológico, solução salina tamponada de fosfato, dextrose, glicerol, etanol e semelhantes, bem como as suas combinações. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis podem compreender adicionalmente quantidades minoritárias de substâncias auxiliares, tais como agentes humectantes ou emulsionantes, conservantes ou tampões, que aumentam o tempo de vida útil ou a eficácia do anticorpo ou parte de anticorpo.

Conhecem-se vários sistemas de entrega e podem ser usados para administrar um ou mais anticorpos da invenção ou a combinação de um ou mais anticorpos da invenção e um agente profilático ou agente terapêutico útil para prevenir, controlar, tratar ou melhorar uma doença ou um ou mais dos seus sintomas, e.g., encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar anticorpo ou fragmento de anticorpo, endocitose mediada por recetor (consultar, e. g., Wu e Wu, J. Biol. Chem. 262:4429- 4432 (1987)), construção de um ácido nucleico como parte de um vetor retrovírico ou outro vetor, etc. Os métodos de administrar um agente profilático ou terapêutico da invenção incluem administração parentérica (e.g., intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa e subcutânea), administração epidural, administração intratumoral e administração mucosa (e.g., vias intranasal e oral), não se lhes limitando. Além disso, pode usar-se administração pulmonar, e.g. usando um inalador ou nebulizador e formulação com um agente de aerossol. Consultar, e.g., patentes U.S. N2 6 019 968, 5 985 320, 5 985 309, 5 934 272, 5 874 064, 5 855 913, 5 290 540 e 4 880 078; e publicações PCT N2 WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 e WO 99/66903, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na sua globalidade. Numa concretização, administra-se um anticorpo da invenção, terapia de combinação ou uma composição da invenção usando a tecnologia de entrega pulmonar de fármacos Alkermes AIR®. (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.). Numa concretização especifica, os agentes profiláticos ou terapêuticos da invenção são administrados intramuscularmente, intravenosamente, intratumoralmente, oralmente, intranasalmente, pulmonarmente ou subcutaneamente. Os agentes profiláticos ou terapêuticos podem ser administrados por qualquer via conveniente, por exemplo por infusão ou injeção de bolus, por absorção através do revestimento epitelial ou mucocutâneo (e.g. , mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.) e podem ser administrados conjuntamente com outros agentes ativos biologicamente. A administração pode ser sistémica ou local.

Numa concretização especifica, pode pretender-se administrar os agentes profiláticos ou terapêuticos da invenção localmente à área com necessidade de tratamento; tal pode ser conseguido, por exemplo não limitativo, por infusão local, injeção ou através de um implante, em que o referido implante é de um material poroso ou não poroso, incluindo membranas e matrizes, tais como membranas sialásticas, polímeros, matrizes fibrosas (e.g., Tisseel®) ou matrizes de colagénio. Numa concretização, administra-se localmente uma quantidade eficaz de antagonistas de um ou mais anticorpos da invenção à área afetada a um indivíduo para prevenir, tratar, controlar e/ou melhorar uma doença ou um seu sintoma. Noutra concretização, administra-se localmente uma quantidade eficaz de um ou mais anticorpos da invenção à área afetada em combinação com uma quantidade eficaz de uma ou mais terapias (e.g. um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos) diferentes de um anticorpo da invenção a um indivíduo para prevenir, tratar, controlar e/ou melhorar uma doença ou um ou mais dos seus sintomas.

Noutra concretização, o agente profilático ou terapêutico pode ser entregue num sistema de libertação controlada ou de libertação prolongada. Numa concretização, pode usar-se uma bomba para conseguir libertação controlada ou prolongada (consultar Langer, anteriormente; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et ai., 1980, Surgery 88:507; Saudek et ai., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574) . Noutra concretização, podem usar-se materiais poliméricos para conseguir libertação controlada ou prolongada das terapias da invenção (consultar e.g., Medicai Applications of Controlled Release, Langer e Wise (ed.), CRC Pres., Boca Raton, Fia. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen e Ball (ed.), Wiley, New York (1984); Ranger e Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; consultar também Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); patente U.S. N2 5 679 377; patente U.S. N2 5 916 597; patente U.S. N2 5 912 015; patente U.S. N2 5 989 463; patente U.S. N2 5 128 326; publicação PCT N2 WO 99/15154; e publicação PCT N2 WO 99/20253. Os exemplos de polímeros usados em formulações de libertação prologada incluem poli(2-hidroxietilmetacrilato) , poli(metilmetacrilato) , poli (ácido acrílico), poli(etileno-co-acetato de vinilo), poli(ácido metacrilico), poliglicolideos (PLG), polianidridos, poli(N-vinilpirrolidona), poli(álcool vinílico), poliacrilamida, poli(etilenoglicol), polilactideos (PLA), poli(lactídeo-co-glicolídeos) (PLGA) e poliortoésteres, não se lhes limitando. Numa concretização preferida, o polímero usado numa formulação de libertação prolongada é inerte, isento de impurezas lixiviáveis, estável ao armazenamento, estéril e biodegradável. Ainda noutra concretização, o sistema de libertação controlada ou prolongada pode ser colocado próximo do alvo profilático ou terapêutico, sendo assim necessário apenas uma fração da dose sistémica (consultar, e.g., Goodson, em Medicai Applications of Controlled Release, anteriormente, vol. 2, p. 115-138 (1984)).

Discutem-se sistemas de libertação controlada na revisão de Langer (1990, Science 249:1527-1533) . Pode usar-se qualquer técnica conhecida dos peritos na especialidade para produzir formulações de libertação prologada compreendendo um ou mais agente terapêuticos da invenção. Consultar, e.g., patente U.S. N2 4 526 938, publicação PCT WO 91/05548, publicação PCT WO 96/20698, Ning et ai., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel", Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions", PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application", Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854 e Lam et al. , 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized

Monoclonal Antibody for Local Delivery", Proc. Int' I. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, cada uma das quais aqui incorporada na globalidade por referência.

Numa concretização especifica, quando a composição da invenção é um ácido nucleico que codifica um agente profilático ou terapêutico, o ácido nucleico pode ser administrado in vivo para promover a expressão do seu agente profilático ou terapêutico codificado, para a sua construção como parte de um vetor de expressão de ácido nucleico adequado e sua administração de modo a tornar-se intracelular, e.g. pelo uso de um vetor retrovirico (consultar patente U.S. N2 4 980 286) ou por injeção direta, ou por uso de bombardeamento de microparticulas (e.g., uma pistola de gene; Biolistic, Dupont), ou por revestimento com lipidos ou recetores de superfície celular ou agentes de transfeção, ou por administração em ligação com um péptido do tipo "homeobox" que se sabe que entra para dentro do núcleo (consultar, e.g., Joliot et al. , 1991,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:1864-1868) . Alternativamente, pode introduzir-se um ácido nucleico intracelularmente e incorporar-se dentro do ADN da célula hospedeira para expressão por recombinação homóloga.

Uma composição farmacêutica da invenção é formulada de modo a ser compatível com a sua via de administração pretendida. Os exemplos de vias de administração incluem administração parentérica, e.g., intravenosa, intradérmica, subcutânea, oral, intranasal (e.g., inalação), transdérmica (e.g., tópica), transmucosa e retal, não se lhes limitando. Numa concretização especifica, a composição é formulada de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa, subcutânea, intramuscular, oral, intranasal ou tópica a seres humanos. Tipicamente, as composições para administração intravenosa são soluções em tampão aguoso estéril e isotónico. Quando necessário, a composição pode também incluir um agente de solubilização e um anestésico local, tal como lidocaina, para aliviar a dor no local de injeção.

Caso as composições da invenção sejam para administração tópica, as composições podem ser formuladas sob a forma de um unguento, creme, penso transdérmico, loção, gel, champô, pulverizador, aerossol, solução, emulsão ou outra forma bem conhecida dos peritos na especialidade. Consultar, e.g., Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19a ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). Para formas de dosagem tópica não pulverizáveis, usam-se tipicamente formas viscosas a semissólidas ou sólidas compreendendo um transportador ou um ou mais excipientes compatíveis com aplicação tópica e, de preferência, com uma viscosidade dinâmica superior à da água. As formulações adeguadas incluem soluções, suspensões, emulsões, cremes, unguentos, pós, bálsamos, pomadas e semelhantes, não se lhes limitando, gue caso se pretenda são esterilizados ou misturados com agentes auxiliares (e.g., conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, tampões ou sais) para influenciar várias propriedades, tais como, por exemplo, a pressão osmótica. Outras formas de dosagem tópica adequadas incluem preparações em aerossol pulverizáveis em que o ingrediente ativo é empacotado, de preferência em combinação com um transportador inerte sólido ou líquido, numa mistura com um volátil pressurizado (e.g., um propulsor gasoso, tal como fréon) ou num frasco compressível. Caso se pretenda, também se podem adicionar hidratantes ou agentes humectantes às composições farmacêuticas e formas de dosagem. Os exemplos de tais ingredientes adicionais são bem conhecidos na especialidade.

Caso o método da invenção compreenda administração intranasal de uma composição, a composição pode ser formulada sob a forma de aerossol, vaporizador, nebulizador ou sob a forma de gotas. Em particular, os agentes profiláticos ou terapêuticos para uso de acordo com a presente invenção podem ser entregues convenientemente sob a forma de uma apresentação em vaporizador de aerossol de embalagens pressurizadas ou de um nebulizador, com o uso de um propulsor adequado (e.g., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado). No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada proporcionando uma válvula para entregar uma quantidade medida. As cápsulas e cartuchos (compostos e.g., de gelatina) para uso num inalador ou insuflador podem ser formuladas contendo uma mistura em pó do composto e uma base em pó adequada, tal como lactose ou amido.

Caso o método da invenção compreenda administração oral, as composições podem ser formuladas oralmente sob a forma de comprimidos, cápsulas, cachets, cápsulas de gel, soluções, suspensões e semelhantes. Os comprimidos ou cápsulas podem ser preparados por meios convencionais com excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes aglutinantes (e.g., amido de milho pregelatinizado, polivinilpirrolidona, ou hidroxipropilmetilcelulose); agentes de enchimento (e.g., lactose, celulose microcristalina ou hidrogenofosfato de cálcio) ; lubrificantes (e.g., estearato de magnésio, talco ou silica); desintegrantes (e.g., fécula de batata ou amidoglicolato de sódio); ou agentes humectantes (e.g., laurilsulfato de sódio). Os comprimidos podem ser revestidos por métodos bem conhecidos na especialidade. As preparações liquidas para administração oral podem estar sob a forma de soluções, xaropes ou suspensões, não se lhes limitando, ou podem ser apresentadas como um produto seco para reconstituição com água ou outro veiculo adequado antes de utilização. Tais preparações liquidas podem ser preparadas por meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes de suspensão (e.g., xarope de sorbitol, derivados de celulose ou óleos alimentares hidrogenados); agentes emulsionantes (e.g., lecitina ou goma arábica); veículos não aquosos (e.g., óleo de amêndoa, ésteres de óleo, álcool etílico ou óleos vegetais fracionados); e conservantes (e.g., metil-p- hidroxibenzoatos ou propil-p-hidroxibenzoatos ou ácido sórbico). As preparações podem também conter sais de tampão, agentes corantes, aromatizantes e edulcorantes, tal como adequado. As preparações para administração oral podem também ser formuladas adequadamente para libertação lenta, libertação controlada ou libertação prolongada de um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos. 0 método da invenção pode compreender administração pulmonar, e.g., pelo uso de um inalador ou nebulizador, de uma composição formulada com um agente para formação de aerossol. Consultar, e.g., patentes U.S. N2 6 019 968, 5 985 320, 5 985 309, 5 934 272, 5 874 064, 5 855 913, 5 290 540 e 4 880 078; e Publicações PCT N2 WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 e WO 99/66903, cada uma das quais aqui incorporada por referência na sua globalidade. Numa concretização especifica, administra-se um anticorpo da invenção, terapia de combinação e/ou composição da invenção usando a tecnologia de entrega de fármaco pulmonar Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass .) . O método da invenção pode compreender administração de uma composição formulada para administração parentérica por injeção (e.g., por injeção de bolus ou infusão continua). As formulações para injeção podem ser apresentadas em formas de dosagem unitária (e.g., em ampolas ou em recipientes multidose) com um conservante adicionado. As composições podem estar sob a forma de suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos e podem conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, de estabilização e/ou de dispersão. Alternativamente, o ingrediente ativo pode estar sob a forma de um pó para reconstituição com um veículo adequado (e.g., água estéril e isenta de pirogénios) antes de utilização. Os métodos da invenção podem compreender adicionalmente a administração de composições formuladas como preparações "depot". Tais formulações de ação prolongada podem ser administradas por implante (e.g., subcutânea ou intramuscularmente) ou por injeção intramuscular. Assim, por exemplo, as composições podem ser formuladas com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (e.g., tal como uma emulsão num óleo aceitável) ou resinas permutadoras iónicas ou como derivados insolúveis (e.g., como um sal insolúvel).

Os métodos da invenção abrangem administração de composições formuladas como formas neutras ou de sais. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os formados com aniões tais como os derivados de ácido clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc. e os formados com catiões, tais como os derivados de sódio, potássio, amónio, cálcio hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2- etilaminoetanol, histidina, procaína, etc.

Em geral, os ingredientes das composições são fornecidos separadamente ou misturados conjuntamente na forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado isento de água, num recipiente hermeticamente fechado, tal como uma ampola ou saqueta, indicando a quantidade de agente ativo. Quando o modo de administração é infusão, a composição pode ser entregue com um frasco de infusão contendo água ou soro fisiológico estéril e de grau farmacêutico. Quando o modo de administração é por injeção pode proporcionar-se uma ampola de água estéril para injeção ou soro fisiológico, de modo a poder misturar os ingredientes antes de administração.

Em particular, a invenção também proporciona condições para que um ou mais dos agentes profiláticos ou terapêuticos, ou composições farmacêuticas da invenção esteja empacotado num recipiente hermeticamente fechado, tal como uma ampola ou saqueta indicando a quantidade do agente. Numa concretização, um ou mais dos agentes profiláticos ou terapêuticos, ou composições farmacêuticas da invenção é fornecido como um pó liofilizado esterilizado seco ou concentrado isento de água, num recipiente hermeticamente fechado e pode ser reconstituído (e.g., com água ou soro fisiológico) para a concentração adequada para administração a um indivíduo. De preferência, um ou mais dos agentes profiláticos ou terapêuticos ou composições farmacêuticas da invenção é fornecido como um pó liofilizado seco e estéril, num recipiente hermeticamente fechado, numa dosagem unitária de pelo menos 5 mg, com maior preferência pelo menos 10 mg, pelo menos 15 mg, pelo menos 25 mg, pelo menos 35 mg, pelo menos 45 mg, pelo menos 50 mg, pelo menos 75 mg ou pelo menos 100 mg. Os agentes profiláticos ou terapêuticos ou composições farmacêuticas da invenção liofilizados devem ser armazenados entre 2 °C e 8 °C, no seu recipiente original e os agentes profiláticos ou terapêuticos ou composições farmacêuticas da invenção devem ser administrados no intervalo de 1 semana, de preferência no intervalo de 5 dias, no intervalo de 72 horas, no intervalo de 48 horas, no intervalo de 24 horas, no intervalo de 12 horas, no intervalo de 6 horas, no intervalo de 5 horas, no intervalo de 3 horas ou no intervalo de 1 hora após ser reconstituído. Numa concretização alternativa, um ou mais dos agentes profiláticos ou terapêuticos ou composições farmacêuticas da invenção é fornecido numa forma liquida num recipiente hermeticamente fechado indicando a quantidade e concentração do agente. Preferentemente, a forma líquida da composição administrada é fornecida num recipiente hermeticamente fechado a pelo menos 0,25 mg/ml, com mais preferência a pelo menos 0,5 mg/ml, a pelo menos 1 mg/ml, a pelo menos 2,5 mg/ml, a pelo menos 5 mg/ml, a pelo menos 8 mg/ml, a pelo menos 10 mg/ml, a pelo menos 15 mg/kg, a pelo menos 25 mg/ml, a pelo menos 50 mg/ml, a pelo menos 75 mg/ml ou a pelo menos 100 mg/ml. A forma líquida deve ser armazenada entre 2 °C e 8 °C, no seu recipiente original.

Os anticorpos e partes de anticorpo da invenção podem ser incorporados numa composição farmacêutica adequada para administração parentérica. Preferentemente, o anticorpo ou partes de anticorpo serão preparados como uma solução injetável contendo 0,1-250 mg/ml de anticorpo. A solução injetável pode ser composta por uma forma de dosagem líquida ou liofilizada num frasquinho de vidro "flint" ou âmbar, ampola ou seringa precheia. O tampão pode ser L-histidina (1-50 mM) , otimamente 5-10 mM, a pH 5,0 a 7,0 (otimamente pH 6,0) . Outros tampões adequados incluem succinato de sódio, citrato de sódio, fosfato de sódio ou fosfato de potássio, não se lhes limitando. Pode usar-se cloreto de sódio para modificar a toxicidade da solução a uma concentração de 0-300 mM (otimamente 150 mM para uma forma de dosagem líquida). Podem incluir-se crioprotetores para uma forma de dosagem liofilizada, principalmente sacarose a 0-10% (otimamente 0,5-1,0%). Outros crioprotetores adequados incluem tre-halose e lactose. Podem incluir-se agentes de enchimento para uma forma de dosagem liofilizada, principalmente manitol a 1-10% (otimamente 2-4%) . Podem usar-se estabilizantes tanto na forma de dosagem líquida, como na forma de dosagem liofilizada, principalmente L-metionina 1-50 mM (otimamente 5-10 mM). Outros agentes de enchimento adequados incluem glicina, arginina e podem ser incluídos como polissorbato 80 a 0-0,05% (otimamente 0,005-0,01%). Os surfactantes adicionais incluem surfactantes polissorbato 20 e BRIJ, não se lhes limitando. A composição farmacêutica compreendendo os anticorpos e partes de anticorpo da invenção, preparada como uma solução injetável para administração parentérica, pode compreender adicionalmente um agente útil como um adjuvante, tal como os usados para aumentar a absorção ou dispersão de uma proteína terapêutica (e.g. anticorpo). Um adjuvante particularmente útil é hialuronidase, tal como Hylenex® (hialuronidase humana recombinante). A adição de hialuronidase na solução injetável melhora a biodisponibilidade em humanos após administração parentérica, em particular administração subcutânea. Também permite maiores volumes no local de injeção (i.e. maiores do que 1 ml) com menos dores e desconforto e uma incidência mínima de reações no local de injeção. (consultar W02004078140, US2006104968 aqui incorporadas por referência).

As composições desta invenção podem estar sob uma variedade de formas. Estas incluem, por exemplo, formas de dosagem líquidas, semissólidas e sólidas, tais como soluções líquidas (e.g. soluções injetáveis e passíveis de infusão), dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas, pós, lipossomas e supositórios. A forma preferida depende do modo de administração pretendido e da aplicação terapêutica. As composições preferidas típicas estão sob a forma de soluções injetáveis e passíveis de infusão, tais como as composições semelhantes às usadas para imunização passiva de humanos com outros anticorpos. O modo de administração preferido é parentérico (e.g., intravenoso, subcutâneo, intraperitoneal, intramuscular). Numa concretização preferida, o anticorpo é administrado por infusão ou injeção intravenosa. Noutra concretização preferida, o anticorpo é administrado por injeção intramuscular ou subcutânea.

Tipicamente, as composições terapêuticas devem ser estéreis e estáveis nas condições de fabrico e armazenagem. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada para elevada concentração de fármaco. As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas por incorporação do composto ativo (i.e., anticorpo ou parte de anticorpo) na quantidade necessária de um solvente adequado com um ou com uma combinação dos ingredientes listados anteriormente, tal como necessário, seguido por esterilização por filtração. Em geral, as dispersões podem ser preparadas por incorporação do composto ativo num veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários dos listados anteriormente. No caso de pós liofilizados estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são secagem por vácuo e secagem por vaporização, que proporciona um pó do ingrediente ativo com qualquer ingrediente adicional pretendido a partir da sua solução previamente filtrada para esterilização. A fluidez adequada da solução pode ser mantida, por exemplo, usando um revestimento tal como lecitina, mantendo o tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e pelo uso de surfactantes. Pode conseguir-se absorção prolongada de composições injetáveis incluindo na composição um agente que atrasa a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

Os anticorpos e partes de anticorpo da presente invenção podem ser administrados por uma variedade de métodos conhecidos na especialidade, embora para muitas aplicações terapêuticas, a via/modo de administração preferido seja injeção subcutânea, injeção intravenosa ou infusão. Tal como será considerado por um perito na especialidade, a via e/ou modo de administração variará dependendo dos resultados pretendidos. Em determinadas concretizações, o composto ativo pode ser preparado com um transportador que protegerá o composto contra libertação rápida, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes, pensos transdérmicos e sistemas de entrega microencapsulados. Podem usar-se polímeros biodegradáveis e biocompatíveis, tais como etilenovinilacetato, polianidridos, poliácido glicólico, colagénio, poliortoésteres e poliácido láctico. Muitos métodos para a preparação de tais formulações estão patenteados ou são geralmente conhecidos dos peritos na especialidade. Consultar, e.g., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Em determinadas concretizações, um anticorpo ou parte de anticorpo da invenção pode ser administrado oralmente, por exemplo, com um diluente inerte ou um transportador comestível assimilável. 0 composto (e outros ingredientes, caso se pretenda) podem também ser encapsulados numa cápsula de gelatina de superfície dura ou mole, sujeitos a compressão para formar comprimidos ou incorporados diretamente na dieta do indivíduo. Para administração terapêutica oral, os compostos podem ser incorporados com excipientes e usados na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bocais, drageias, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, hóstias e semelhantes. Para administrar um composto da invenção por um método diferente de administração parentérica, pode ser necessário revestir o composto ou coadministrar o composto com um material que evite a sua inativação.

Também se podem incorporar compostos ativos suplementares nas composições. Em determinadas concretizações, um anticorpo ou parte de anticorpo da invenção é coformulado e/ou coadministrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais que são úteis para tratar doenças em que a atividade de RGM A é prejudicial. Por exemplo, um anticorpo anti-RGM A ou parte de anticorpo da invenção pode ser coformulado e/ou coadministrado com um ou mais anticorpos adicionais que se ligam a outros alvos (e.g., anticorpos que ligam citocinas ou que ligam moléculas de superfície celular). Adicionalmente, pode usar-se um ou mais anticorpos da invenção em combinação com dois ou mais dos agentes terapêuticos anteriores. Tais terapias de combinação podem utilizar vantajosamente dosagens inferiores dos agentes terapêuticos administrados, evitando assim possíveis toxicidades ou complicações associadas a várias monoterapias.

Em determinadas concretizações, liga-se um anticorpo contra RGM A ou seu fragmento a um veículo que aumenta a semivida conhecido na especialidade. Tais veículos incluem o domínio Fc, polietilenoglicol e dextrano, não se lhes limitando. Tais veículos são descritos em, e.g., pedido U.S. N2 de série 09/428 082 e pedido PCT publicado N2 WO 99/25044, que são aqui incorporados por referência para qualquer objetivo.

Numa concretização específica, administram-se sequências de ácido nucleico compreendendo sequências de nucleótidos que codificam um anticorpo da invenção ou outro agente profilático ou terapêutico da invenção para tratar, prevenir, controlar ou melhorar uma doença ou um ou mais dos seus sintomas através de terapia génica. A terapia génica refere-se a terapia efetuada pela administração a um indivíduo de um ácido nucleico expresso ou expressável. Nesta concretização da invenção, os ácidos nucleicos produzem o seu anticorpo ou agente profilático ou terapêutico da invenção codificado que medeia um efeito profilático ou terapêutico.

Pode usar-se qualquer um dos métodos para terapia génica disponíveis na especialidade de acordo com a presente invenção. Para revisões gerais dos métodos de terapia génica, consultar Goldspiel et ai., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu e Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, Science 260:926-932 (1993); e Morgan e Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; maio de 1993, TIBTECH 11(5) :155-215. Descrevem-se métodos usualmente conhecidos na especialidade de tecnologia de ADN recombinante que podem ser usados em Ausubel et ai. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); e Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). Divulga-se a descrição detalhada de vários métodos de terapia génica em US20050042664 AI que é aqui incorporada por referência. RGM A desempenha um papel crítico na patologia associada a várias doenças, tal como aqui definido anteriormente. Descreveu-se que RGM A e proteínas de RGM são reguladas positivamente em locais de lesão em humanos que sofreram traumatismo craniano (Schwab et ai., Arch. Neurol. 62: 1561-8, 2005a) nas áreas de penumbra e do núcleo de enfarte do cérebro humano com danos devidos a AVC (Schwab et ai., Arch. Neurol. 62: 1561-8, 2005a); Na substância nigra de doentes que sofrem de doença de Parkinson (Bossers metal. Brain Pathology vol. 19: 91-107, 2008) . Assim, os anticorpos contra RGM A são agentes adequados para terapia de combinação para AVC, traumatismo craniano, doença de Parkinson, doença de Alzheimer e outras doenças neurodegenerativas do sistema nervoso humano. Em doentes de AVC, o tratamento atual nas primeiras três horas consiste de entrega de ativador de plasminogénio de tecido para lise dos coágulos sanguíneos (Liang et ai. Arch. Neurol. 65: 1429 - 33, 2008) e tal tratamento poderia em princípio ser combinado com entrega de um anticorpo contra RGM A que proporciona uma abordagem de tratamento diferente e uma janela terapêutica mais extensa. Em doença de Alzheimer, a combinação de fármacos com anticorpos contra RGMA é possível com os fármacos aprovados para melhoramento cognitivo Donepezil e Memantine e tal abordagem poderia atrasar significativamente a neuropatologia progressiva. A entrega intranasal de insulina tem efeitos positivos na atenção e memória (Hanson e Frey, BMC Neurosci. 9: S5, 2008) e é uma via de administração possível para anticorpos contra RGM A, passando assim a barreira hematoencefálica. Em doentes com doença de Parkinson (PD), o tratamento atual baseia-se principalmente em agentes dopaminérgicos tais como levodopa, um profármaco de dopamina (Khor e Hsu, Curr. Clin. Pharmacol. 2: 234 - 43, 2007), ropinirola, um agonista de dopamina não ergolínico (Jost et ai. J. Neurol. 255 Supl. 5: 60-63, 2008), os inibidores de monoamina oxidase B, Rasagiline e Selegiline (Elmer e Bertoni, Expert Opin. Pharmacother. 9: 2759 - 72, 2008) . Apesar dos seus efeitos benéficos em PD inicial e moderada, nenhum destes fármacos é capaz de evitar a degeneração progressiva da substância nigra e das áreas cerebrais subcorticais e corticais associadas, e uma terapia de combinação com anticorpos contra RGM A estimulantes de regeneração poderia portanto desacelerar o processo da doença.

Qualquer agente neuroprotetor, seja um antioxidante, um sequestrador de radicais, um fármaco anticonvulsivo tal como fenitoina ou o fármaco para anemia eritropoietina é adequado para terapia de combinação com anticorpos contra RGM A prorregenerativos, estendendo assim a janela terapêutica usualmente muito estreita dos neuroprotetores.

Os anticorpos e partes de anticorpo da invenção podem ser usados para tratar humanos que sofrem de tais doenças.

Deve entender-se que os anticorpos da invenção ou sua parte de ligação de antigénio podem ser usados sozinhos ou em combinação com um agente adicional, e.g. um agente terapêutico, em que o referido agente adicional é selecionado pelo perito na especialidade para o seu objetivo pretendido. Por exemplo, o agente adicional pode ser um agente terapêutico reconhecido na especialidade como útil para tratar a doença ou distúrbio a ser tratada pelo anticorpo da presente invenção. O agente adicional também pode ser um agente que confere um atributo benéfico à composição terapêutica, e.g. um agente que afeta a viscosidade da composição.

Deve considerar-se adicionalmente que as combinações que devem ser incluídas no âmbito desta invenção são as combinações úteis para o seu objetivo pretendido. Os agentes apresentados seguidamente são a título ilustrativo e não se pretende que sejam limitados. As combinações que são parte desta invenção podem ser os anticorpos da presente invenção e pelo menos um agente adicional selecionado das listas seguintes. A combinação pode também incluir mais do que um agente adicional, e.g. dois ou três agentes adicionais, caso a combinação seja tal que a composição formada possa efetuar a sua função pretendida.

Os exemplos não limitativos de agentes terapêuticos para esclerose múltipla com os quais se podem combinar um anticorpo ou parte de anticorpo da invenção incluem os seguintes: corticosteroides; prednisolona; metilprednisolona; azatioprina; ciclofosfamida; ciclosporina; metotrexato; 4-aminopiridina; tizanidina; interferão 1 a (AVONEX; Biogen); interferão lb (BETASERON; Chiron/Berlex); interferão -n3) (Interferon Sciences/Fujimoto), interferão (Alfa

Wassermann/J&J), interferão 1A-IF (Serono/Inhale

Therapeutics), Peginterferão 2b (Enzon/Schering-Plough), copolímero 1 (Cop-1; COPAXONE; Teva Pharmaceutical Industries,

Inc.); oxigénio hiperbárico; imunoglobulina intravenosa; cladribina; anticorpos ou antagonistas de outras citocinas humanas ou fatores de crescimento e seus recetores, por exemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-23, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF e PDGF. Os anticorpos da invenção ou suas partes de ligação de antigénio podem ser combinados com anticorpos contra moléculas de superfície celular, tais como CD2, CD3, CD4, CD 8, CD19, CD20, CD25, CD28, CD30, CD40; CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 ou os seus ligandos. Os anticorpos da invenção ou suas partes de ligação de antigénio podem também ser combinados com agentes tais como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato mofetil, leflunomida, anti-inflamatórios não esteroides, por exemplo ibuprofeno, corticosteroides tal como prednisolona, inibidores de fosfodiesterase, agonistas de adensosina, agentes antitrombóticos, inibidores de complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interferem com a sinalização por citocinas proinflamatórias tais como TNF ou IL-1 (e.g. IRAK, NIK, IKK, p38 ou inibidores de MAP cinase), inibidores de enzima de conversão de IL-1 , inibidores de TACE, inibidores de sinalização de células T tal como inibidores de cinase, inibidores de metaloproteinase, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inibidores de enzima de conversão de angiotensina, receptores de citocina solúveis e seus derivados (e.g. receptores de TNF p55 ou p75 solúveis, sIL-lRI, sIL-lRII, SIL-6R) e citocinas anti-inflamatórias (e.g. IL-4, IL-10, IL- 13 e TGF ).

Os exemplos preferidos de agentes terapêuticos para esclerose múltipla com os quais se podem combinar o anticorpo ou sua parte de ligação de antigénio incluem interferão , por exemplo, IFN la e IFN lb; copaxona, corticosteroides, inibidores de caspase, por exemplo inibidores de caspase-1, inibidores de IL-1, inibidores de TNF e anticorpos contra ligando CD40 e CD80.

Os anticorpos da invenção ou suas partes de ligação de antigénio podem também ser combinados com agentes tais como alemtuzumab, dronabinol, Unimed, daclizumab, mitoxantrona, cloridrato de xaliprodeno, fampridina, acetato de glatiramer, natalizumab, sinabidol, a-imunocina NNS03, ABR-215062, AnergiX.MS, antagonistas de receptor de quimiocina, BBR-2778, calagualina, CPI-1189, LEM (mitoxantrona encapsulada em lipossoma), THC.CBD (agonista de canabinoide) MBP-8298, mesopram (inibidor de PDE4), MNA-715, anticorpo anti-recetor de IL-6, neurovax, pirfenidona allotrap 1258 (RDP-1258), sTNF-Rl, talampanel, teriflunomida, TGF-beta2, tiplimotida, antagonistas de VLA-4 (por exemplo, TR-14035, VLA4 Ultrahaler, Antegran-ELAN/Biogen), antagonistas de interferão gama, agonistas de IL-4 .

As composições farmacêuticas da invenção podem incluir uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou uma "quantidade profilaticamente eficaz" de um anticorpo ou parte de anticorpo da invenção. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens e durante os períodos de tempo necessários para conseguir o resultado terapêutico pretendido. Pode determinar-se uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou parte de anticorpo por um perito na especialidade e pode variar de acordo com fatores tais como o estado da doença, idade, género e peso do indivíduo e com a capacidade do anticorpo ou parte de anticorpo desencadear uma resposta pretendida no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou nocivos do anticorpo ou parte de anticorpo são ultrapassados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz nas dosagens e durante os períodos de tempo necessários para atingir o resultado profilático pretendido. Tipicamente, dado que se usa uma dose profilática em indivíduos antes da doença ou num estágio inicial da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será inferior à quantidade terapeuticamente eficaz.

Os regimes de dosagem podem ser ajustados para obter a resposta pretendida ótima (e.g., uma resposta terapêutica ou profilática). Por exemplo, pode administrar-se um bolus único, podem administrar-se várias doses divididas ao longo do tempo ou a dose pode ser diminuída ou aumentada proporcionalmente tal como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parentéricas numa forma de dosagem unitária para facilitar a administração e uniformidade da dosagem. A forma de dosagem unitária, tal como aqui usada, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos mamíferos a serem tratados; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico pretendido em associação com o transportador farmacêutico necessário. As especificações para as formas de dosagem unitárias da invenção são ditadas e diretamente dependentes de (a) as características únicas do compostos ativos e do efeito terapêutico ou profilático específico a atingir e (b) as limitações inerentes à especialidade de composição de tal composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.

Um exemplo, não limitativo, de uma gama para uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um anticorpo ou parte de anticorpo da invenção é 0,1-20 mg/kg, com mais preferência 1-10 mg/kg. Deve salientar-se que os valores de dosagem podem variar com o tipo e gravidade do distúrbio a ser aliviado. Deve entender-se adicionalmente que para qualquer indivíduo específico, os regimes de dosagem específicos devem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com as necessidades individuais e com o critério profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições e que as gamas de dosagem aqui apresentadas são apenas exemplos que não pretendem limitar o âmbito ou prática da composição reivindicada.

Será facilmente aparente ao perito na especialidade que outras modificações e adaptações adequadas dos métodos da invenção aqui descritos são óbvias e podem ser efetuadas usando equivalentes adequados sem divergência do âmbito da invenção ou das concretizações aqui divulgadas. Tendo agora descrito a presente invenção detalhadamente, a mesma será mais claramente entendida por referência aos seguintes exemplos, que são incluídos apenas com objetivos ilustrativos e que não se pretende que limitem a invenção. EXEMPLOS: Métodos

Os seguintes métodos descrevem detalhadamente os procedimentos experimentais usados na secção de exemplos (i) As placas de ELISA de ligação direta foram revestidas com hRGM A (R&D) a uma concentração de 2 pg/mL em tampão de carbonato. Os poços foram então bloqueados com solução de bloqueamento (Bio-Rad) a 2% durante 1 hora à temperatura ambiente. Diluíram-se os anticorpos biotinilados em série com um fator de diluição de 1:5 em BSA a 0,1%/PBS na placa e incubou-se durante 1 hora à temperatura ambiente. 0 reagente de deteção foi uma diluição de 1:10000 de estreptavidina-HRP em BSA a 0,1%/PBS. A deteção foi efetuada com um reagente TMB, que foi parada com H2SO4 2 N e leu-se a DO a 450 nM. (ii) Análise por FACS. Sujeitaram-se os produtos de transfeção estáveis de células HEK293 que sobrexpressam hRGM A ou de células BAF3 que sobrexpressam ratRGM A a coloração com MAB 5F9 ou 8D1 não marcados durante mais de 15 minutos a 4 0 em tampão de BSA a 0,1%/PBS. A deteção foi efetuada com um anticorpo de ratinho anti-IgG PE de rato. (iii) Ensaios de ELISA em fase sólida para avaliar MAB 5F9 em ensaios de ligação hRGM A - neogenina.

Revestiram-se placas de ELISA (Immuno Plate Cert. Maxi Sorb. F96 NUNC, 439454) durante 1 h a 37 °C com uma concentração de 2,5 pg/ml do domínio extracelular de proteina Neogenina humana marcada com His (concentração de solução mãe: 30 pg/ml). Após a incubação, removeu-se Neogenina não marcada em 3 etapas de lavagem independentes com PBS contendo Tween 20 a 0,02%. O bloqueamento das placas revestidas com Neogenina foi efetuado por adição de 200 μΐ por poço de solução de bloqueamento de albumina de soro bovino (BSA) a 3%, PBS, Tween 20 (0,02%) . Após incubação durante 1 h a 37 °C, removeu-se a solução de bloqueamento e adicionou-se fragmentos de RGM A ou a proteina completa, conjugada com um marcador fc humano, com ou sem anticorpo. Em algumas experiências, os anticorpos foram preincubados com proteínas hRGM A conjugadas a fc durante 1 h à temperatura ambiente. Incubaram-se as placas revestidas com Neogenina com hRGM A com ou sem anticorpos durante 1 h a 37 °C. Após 3 etapas de lavagem com PBS-Tween 20 (0,02%), incubaram- se as placas com um anticorpo anti-fc humano marcado com biotina (1 mg/ml, diluído a 1:200 em PBS contendo BSA a 0,6%, Tween 20 a 0,02%), Jackson ImmunoResearch n2 de catálogo: 709-065-149, durante 1 h a 37 °C. Removeu-se o anticorpo não marcado por 3 etapas de lavagem com PBS-Tween 20 (0,02%). Para visualizar a ligação do anticorpo anti-fc marcado com biotina, adicionou-se um complexo consistindo de estreptavidina-peroxidase (Roche, n2 de catálogo 11089153001), diluído a 1:5000 com PBS contendo BSA a 0,6%, Tween 20 a 0,02%, seguido por incubação a 37 °C durante 1 h. Removeu-se o complexo de peroxidase não ligado em 3 etapas de lavagem subsequentes (PBS-Tween 20 (0,02%) antes de adicionar o substrato de peroxidase (Immuno Pure TMB, Pierce η2 34021). Parou-se a reação de substrato 1-30 min após a sua adição aos poços por H2SO4 2,5 M. Analisaram-se as placas (determinação de DO) a um comprimento de onda de 450 nm usando um fotómetro Anthos. (iv) Ensaios de ELISA de fase sólida para avaliar MAB 5F9 em ensaios de ligação hRGM A - BMP-4.

Revestiram-se placas de ELISA (Immuno Plate Cert. Maxi Sorb. F96 NUNC, 439454) durante 1 h a 37 °C com uma solução contendo uma concentração de 2,5 yg/ml de proteína BMP-4 humana recombinante (R&D Systems, η2 314-BP, Lote η2 BEM316061). Após a incubação, removeu-se BMP-4 não ligada em 3 etapas de lavagem independentes com PBS contendo Tween 20 a 0,02%. O bloqueamento das placas revestidas com BMP-4 foi efetuado por adição de 200 μΐ por poço de uma solução de bloqueamento de albumina de soro bovino (BSA) a 3%, PBS, Tween 20 (0,02%). Após incubação durante 1 h a 37 °C, removeu-se a solução de bloqueamento e adicionaram-se fragmentos de RGM A ou proteína completa, conjugada com um marcador fc humano, com ou sem anticorpo. Em algumas experiências preincubaram-se anticorpos com proteínas hRGM A conjugadas a fc durante 1 h à temperatura ambiente. As placas revestidas com BMP-4 foram incubadas com hRGM A, com ou sem anticorpos, durante 1 h a 37 °C. Após 3 etapas de lavagem com PBS-Tween 20 (0,02%), as placas foram incubadas com um anticorpo anti-fc humano marcado com biotina (1 mg/ml, diluído a 1:200 em PBS contendo BSA a 0,6%, Tween 20 a 0,02%), Jackson ImmunoResearch n2 de catálogo: 709-065-149, durante 1 h a 37 °C. Removeu-se anticorpo não ligado por 3 etapas de lavagem com PBS-Tween 20 (0, 02%) . Para visualizar a ligação do anticorpo anti-fc marcado com biotina, adicionou-se um complexo consistindo de estreptavidina-peroxidase (Roche, n2 de catálogo 11089153001), diluído a 1:5000 com PBS contendo BSA a 0,6%, Tween 20 a 0,02%, seguido por incubação a 37 °C durante 1 h. Removeu-se o complexo de peroxidase em 3 etapas de lavagem subsequentes (PBS-Tween 20 (0,02%) antes de adicionar o substrato de peroxidase (Immuno Pure TMB, Pierce η2 34021). Parou-se a reação do substrato 1-30 min após a sua adição aos poços com H2SO4 2,5 M. Analisaram-se as placas (determinação de DO) a um comprimento de onda de 450 nm usando um fotómetro Anthos. (v) Ensaios de ELISA de fase sólida para avaliar MAB 5F9 em ensaios de ligação hRGM A - BMP-2.

Revestiram-se placas de ELISA (Immuno Plate Cert. Maxi Sorb. F96 NUNC, 439454) durante 1 h a 37 °C com uma solução contendo uma concentração de 2,5 pg/ml de proteína BMP-2 humana recombinante (R&D Systems, η2 355-BM, Lote n2 MSA04) . Após a incubação, removeu-se BMP-2 não ligada em 3 etapas de lavagem independentes com PBS contendo Tween 20 a 0,02%. Efetuou-se bloqueamento das placas revestidas com BMP-2 por adição de 200 μΐ por poço de uma solução de bloqueamento de albumina de soro bovino (BSA) a 3%, Tween 20 (0,02%). Após incubação durante 1 h a 37 °C, removeu-se a solução de bloqueamento e adicionaram-se fragmentos de RGM A ou proteína completa, conjugada com um marcador fc humano, com ou sem anticorpo. Em algumas experiências, os anticorpos foram preincubados com proteína hRGM A conjugada a fc durante 1 h à temperatura ambiente. As placas revestidas com BMP-2 foram incubadas com hRGM A, com ou sem anticorpos, durante 1 h a 37 °C. Após 3 etapas de lavagem com PBS-Tween 20 (0,02%), as placas foram incubadas com um anticorpo anti-fc humano marcado com biotina (1 mg/ml, diluído a 1:200 em PBS contendo BSA a 0,6%, Tween 20 a 0,02%), Jackson ImmunoResearch n2 de catálogo: 709-065-149, durante 1 h a 37 °C. Removeu-se anticorpo não ligado por 3 etapas de lavagem com PBS-Tween 20 (0,02%). Para visualizar a ligação do anticorpo anti-fc marcado com biotina, adicionou-se um complexo consistindo de estreptavidina-peroxidase (Roche, n2 de catálogo 11089153001), diluído a 1:5000 com PBS contendo BSA a 0,6%, Tween 20 a 0,02%, seguido por incubação a 37 °C durante 1 h. Removeu-se o complexo de peroxidase em 3 etapas de lavagem subsequentes (PBS-Tween 20 (0,02%) antes de adicionar o substrato de peroxidase (Immuno Pure TMB, Pierce n2 34021). Parou-se a reação do substrato 1-30 min após a sua adição aos poços com H2SO4 2,5 M. Analisaram-se as placas (determinação de DO) a um comprimento de onda de 450 nm usando um fotómetro Anthos. (vi) Cultura de células Ntera-2

Obtiveram-se células Ntera-2 de Coleção Alemã de Microrganismos e Culturas Celulares (DMSZ, Braunschweig). Descongelaram-se soluções mãe congeladas de células indiferenciadas Ntera-2 em meio DMEM contendo soro fetal de bovino (FBS; JRH Bioscience, Kansas, EUA) a 10% e soro de cavalo (HS; Sigma, Alemanha) a 5%. Cultivaram-se as células em frascos de cultura (Greiner, Alemanha) até terem atingido confluência de 80%.

Para diferenciação neuronal, inocularam-se células Ntera-2 a uma densidade de 2,5 x 106 células/175 cm2 em meio de diferenciação (meio DMEM contendo FBS a 10%, HS a 5%, penicilina-estreptomicina a 1%, ácido retinóico 10 μΜ) . As células foram diferenciadas durante 3 semanas e trocou-se o meio duas vezes por semana.

Após diferenciação, as células foram destacadas com tripsina-EDTA e dividiram-se a uma razão de 1:6. Após 48 h separaram-se as células neuronais batendo ligeiramente nas células subjacentes. Transferiram-se as células desalojadas para agregação em meio novo em novos frascos de cultura com agitação (Corning, EUA). Deixaram-se agregar as células Ntera-2 diferenciadas em condições de agitação horizontal suave a 37 °C, durante 24 h em meio Neurobasal (Gibco) suplementado com B27 (Gibco), glutamina (Gibco) e penicilina-estreptomicina. Inocularam-se agregados de Ntera-2 a uma densidade de aproximadamente 20 - 30 agregados por lamela em placas de 24 poços. Revestiram-se as lâminas prerrevestidas com polilisina com laminina (20 pg/ml, Sigma) e com o fragmento n2 786 (aminoácidos 47 - 168) de RGM A humana recombinante acoplado a fc a uma concentração de 10 pg/ml. Após inoculação, as culturas foram tratadas com o MAB 5F9, adicionado a três concentrações diferentes (0,1 pg/ml; 1 pg/ml; 10 pg/ml) ao meio de cultura e foram incubadas adicionalmente durante 24 h a 37 °C em meio Neurobasal. Os agregados foram então fixados em paraformaldeido a 4% (2 h, temperatura ambiente) e permeabilizados por adição de Triton X-100 a 0,1% em PBS (20 min, temperatura ambiente). Para coloração fluorescente, as culturas foram bloqueadas com PBS contendo BSA a 1% durante 1 h à temperatura ambiente. Após bloqueamento, as células Ntera foram incubadas com um anticorpo monoclonal de ratinho contra β-tubulina isotipo 3 (clone SDL3D10, Sigma η2 T8660) durante 2 h à temperatura ambiente. Removeu-se anticorpo não ligado por 3 etapas de lavagem diferentes (5 - 15 min cada) e incubaram-se as células Ntera com um anticorpo de burro anti-ratinho conjugado a Cy-3 (Jackson ImmunoResearch Lote 62597), diluído a 1:350 vezes em PBS/BSA a 0,5% e bisbenzimida a 0,5 pg/ml. Após 1 hora de incubação, lavaram-se as culturas 3 vezes para remover anticorpo secundário não ligado. Para microscopia de fluorescência, embeberam-se as lâminas em Fluoromount G (Southern Biotech, Eching).

Obtiveram-se imagens de agregados de Ntera-2 usando um microscópio de fluorescência Zeiss Axiovert 200 e o crescimento para o exterior das culturas foi analisado automaticamente usando um sistema interno de aquisição e análise de imagem. A análise automática do crescimento para o exterior foi efetuada com Image Pro Plus 4.5 e efetuou-se análise estatística dos dados com Graph Pad Prism 4. O crescimento para o exterior foi normalizado relativamente a culturas de controlo cultivadas na ausência do fragmento n2 786 de RGM A humana. (vii) Cultura de SH-SY5Y.

As células SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) são células de neuroblastoma humanas derivadas de um tumor cerebral metastático. Estas células foram cultivadas num meio consistindo de solução salina equilibrada de Earle a 50% (Invitrogen Life Technologies, n2 de catálogo 24010-043) e mistura de nutrientes F12(Ham) a 50% + GlutaMAX-1 (Invitrogen

Life Technologies, n2 de catálogo 31765-027) . Este meio foi suplementado adicionalmente com soro fetal de vitelo a 10% inativado por calor (FCS, JRH Biosciences, Kansas n2 de catálogo 12107-1000M), NEAA a 1% (solução de aminoácidos não essenciais MEM (Sigma-Aldrich n2 de catálogo M1745) e penicilina a 1% (10000 U/ml)/estreptomicina (10000 pg/ml) (Invitrogen Life Technologies, n2 de catálogo 15140-122) . Para estimular diferenciação e crescimento neuronal dos processos neuronais, cultivaram-se as células SH-SY5Y em meio suplementado com ácido retinóico 10 μΜ (RA, Sigma-Aldrich n2 de catálogo R2625-050MG)) durante vários dias. Cultivaram-se células SH-SY5Y diferenciadas em frascos de cultura de tecidos e foram removidas por tripsinização cuidadosa e foram plaqueadas em lamelas de vidro revestidas com um padrão de riscas de proteína RGM A ou seu fragmento e colagénio I. (viii) Preparação de lamelas de vidro com um padrão de riscas A versão modificada do ensaio de riscas em lamelas de vidro foi efetuada de um modo ligeiramente diferente ao descrito anteriormente (Knoell et al. Nature Protocols 2: 1216 - 1224, 2007) e é resumido seguidamente.

Pressionaram-se matrizes de silício estéreis para produção de riscas consistindo de proteínas purificadas na superfície de uma placa de petri com a superfície rugosa da matriz virada para cima. Colocaram-se lamelas limpas, lavadas com etanol, por cima da matriz e marcaram-se os cantos da matriz com uma esferográfica na parte de trás da lamela. Virou-se cuidadosamente para baixo a matriz com a lamela virada para o fundo da placa de petri. Misturou-se RGM A de inibição completa conjugada a Fc ou fc - fragmentos ou RGM A recombinante humana (R&D Systems n2 de catálogo 2459 RM) com 10 μΐ de um anticorpo anti-ratinho marcado com FITC (IgG de cabra anti-ratinho específico de Fab, Sigma-Aldrich n2 de catálogo F-4018) para visualizar as riscas de RGM A. Usando uma seringa Hamilton, injetou-se cuidadosamente 50 μΐ da solução de RGM A - anticorpo com FITC através do canal de entrada. O excesso de fluido sai da matriz através do canal de saída e é removido com um papel absorvente Kleenex. Após incubação da matriz-lamela a 37 °C durante 2 horas, lavou-se a primeira solução de revestimento (contendo RGM A) com 100 μΐ de PBS. Na etapa seguinte, transferiu-se a lamela com as riscas de RGM A para uma placa de 24 poços, revestiu-se com 500 μΐ de colagénio I (colagénio I de cauda de rato, Becton Dickinson Biosciences n2 de catálogo 354236) para preencher os espaços vazios entre as riscas de RGM A e incubou-se a 37 °C durante 2 horas. No final, produziu-se um padrão de riscas alternadas de RGM A e colagénio I na lamela. Após incubação, lavou-se o colagénio I não ligado em três etapas de lavagem independentes com PBS e plaquearam-se células SH-SY5Y diferenciadas para as lamelas. Continuou-se a incubação das células SH-SY5Y no substrato com padrão a 37 °C durante 20 - 24 horas na presença ou ausência de anticorpos monoclonais dirigidos contra RGM A humana.

Para análise por imunofluorescência, as células foram fixadas em paraformaldeído a 4% durante 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C e permeabilizadas por incubação com PBS contendo Triton X-100 a 0,1% durante 10 - 20 min à temperatura ambiente. Após bloqueamento com BSA a 3% durante 60 minutos, as células foram incubadas com o anticorpo primário (anti- -tubulina monoclonal isotipo 3 clone SDL 3D10, Sigma-Aldrich n2 de catálogo T8660) durante 2 horas à temperatura ambiente e, após várias etapas de lavagem, com o anticorpo secundário (de burro Cy-3 anti-ratinho Jackson Immuno

Research Lote:62597), diluído em PBS com BSA a 0,1% durante 1 h. Contracoraram-se os núcleos usando bisbenzimida H33258 (Riedel-De-Haen, n2 de catálogo A-0207). Finalmente, as células foram embebidas em Fluoromount G (Southern Biotechnology Associates Inc. : n2 de catálogo 010001) . Analisaram-se as células usando um microscópio de fluorescência Axioplan2 (Zeiss). (ix) Construção e expressão de anticorpos anti-RGMA recombinantes O ADN que codifica os fragmentos de ADNc da região variável da cadeia pesada dos anticorpos monoclonais de rato anti-RGMA humana 5F9 e 8D1 foram clonado para um vetor de expressão pHybE contendo a região constante de IgGl humana, que contém 2 mutações de aminoácidos na região de dobra, por recombinação homóloga em bactérias. Estas mutações são uma alteração de leucina para alanina nas posições 234 e 235 (numeração EU, Lund et ai., 1991, J. Immunol., 147:2657). A região variável da cadeia leve dos anticorpos monoclonais 5F9 e 8D1 foi clonada para o vetor pHybE contendo uma região constante kapa humana. Os exemplos de vetores pHyb-E incluem pHybE-hCk e pHybE-hCgl,z,non-a (consultar pedido de patente US N2 de série 61/021 282). Expressaram-se transitoriamente os anticorpos completos em células 293E por cotransfeção dos ADNc de cadeia pesada e leve quiméricos ligadas para o plasmídeo de expressão pHybE. Purificaram-se os sobrenadantes celulares contendo anticorpo recombinante por cromatografia em Sepharose Proteína A e eluiu-se o anticorpo ligado por adição de tampão ácido. Neutralizaram-se os anticorpos e dialisaram-se para PBS. Os anticorpos monoclonais anti-RGMA humana purificados foram então ensaiados para a sua capacidade de ligarem RGMA por ELISA, tal como descrito no exemplo 1 e ELISA competitiva, tal como descrito no exemplo 7.

Exemplo 1: Geração de anticorpos monoclonais anti-RGMÃ. humana

Os anticorpos monoclonais de rato anti-RGMA humana foram obtidos da seguinte forma:

Exemplo ΙΑ: Imunização de ratos com antigénio de RGMA humana

Injetaram-se subcutaneamente vinte e cinco microgramas de RGMA humana recombinante purificada (R&D Systems n2 de catálogo 2459-RM lote MRH02511A) misturada com adjuvante completo de Freund (Sigma,) em quatro ratos Harlan Sprague Dawley de 6-8 semanas de idade no dia 1. Nos dias 21, 42 e 63 injetaram-se subcutaneamente vinte e cinco microgramas de RGMA humana recombinante purificada misturada com adjuvante incompleto de Freund (Sigma) nos mesmos 4 ratos Harlan Sprague Dawley. No dia 144 ou no dia 165 os ratos foram injetados intravenosamente com 10 pg de RGMA humana recombinante purificada.

Exemplo 1 B: Geração de hibridoma

Fundiram-se esplenócitos obtidos dos ratos imunizados descritos no exemplo 1.2.A com células SP2/0- a uma razão de 2:1, de acordo com o método estabelecido descrito em Kohler, G. e Milstein 1975, Nature, 256:495 para gerar hibridomas. Plaquearam-se os produtos de fusão em meio de seleção contendo azasserina e hipoxantina em placas de 96 poços a uma densidade de l,5xl05 células de baço por poço. Sete a dez dias após fusão, observaram-se colónias de hibridoma macroscópicas. Ensaiou-se o sobrenadante de cada poço contendo colónias de hibridoma por ELISA direta (consultar o exemplo 2) para a presença de anticorpo contra RGMA humana. Ensaiaram-se as linhas celulares positivas em ELISA por FACS contra células HEK293 transfetadas estavelmente que expressam RGMA humana e/ou de rato. Estas linhas celulares de hibridoma de rato foram subsequentemente ensaiadas em ELISA direta para reatividade cruzada com RGMA de rato e ligação em ELISA à proteína de fusão HuRGMA 47-168.

Tabela 7: Ligação de anticorpos monoclonais anti-RGMA de rato ELISA FACS ELISA ELISA direta de

Nome direta de HEK293- direta de hRGMA 47- rHuRGMA rhRGMA rRatRGMA 168/HuIgGFc ML68-

Sim Sim Não Sim 8D1 ML69-

Sim Sim Sim Sim 5F9

Exemplo 2. Ligação direta em ELISA de mAB 5F9 e 8D1.

Tal como apresentado na figura IA, os MAB 5F9 e 8D1 ligam-se a hRGM A com títulos semelhantes, tal como descrito na secção (i) anterior. Também se verificou que MAB 5F9 se liga a ratRGM A em ELISA, enquanto 8D1 não é capaz de se ligar a ratRGM A (dados não apresentados). A figura 1B mostra que os MAB 5F9 e 8D1 se ligam a células HEK293 que sobrexpressam hRGM A em FACS. A figura 1C mostra que 5F9, mas não 8D1, é capaz de se ligar a células BAF3 que sobrexpressam ratRGM A em FACS. Efetuou-se FACS tal como descrito na secção (ii).

Usaram-se ensaios de ELISA em fase sólida para avaliar a ligação de MAB 5F9 em ensaios de ligação competitiva hRGM A-neogenina. Prepararam-se placas de ELISA e usaram-se tal como descrito na secção (iii) do presente pedido. Adicionou-se hRGM A a uma concentração de 0,5 pg/ml com anticorpos 5F9 durante 1 h a 37 °C. Usou-se MAB 5F9 às seguintes concentrações: 1,25 pg/ml; 0,63 pg/ml; 0,32 pg/ml; 0,16 pg/ml; 0,08 pg/ml; 0,04 yg/ml; 0,02 yg/ml; 0,01 yg/ml. Visualizou-se a ligação de hRGM A usando um anticorpo anti-fc marcado com biotina e um complexo estreptavidina-peroxidase. Analisaram-se as placas (determinação de DO) a um comprimento de onda de 450 nm usando um fotómetro Anthos. Tal como apresentado na figura 2, as três concentrações mais elevadas de anticorpo inibiram de forma dependente da dose a ligação de RGM A humana completa a neogenina.

Também se usaram ensaios de ELISA em fase sólida para avaliar MAB 5F9 em ensaios de ligação competitiva hRGM A - BMP- 4. As placas de ELISA foram preparadas e usadas tal como descrito na secção (iv) do presente pedido. Adicionou-se hRGM A a uma concentração de 0,5 pg/ml com anticorpos 5F9 durante 1 h a 37 °C. Usou-se MAB 5F9 às seguintes concentrações: 1,25 pg/ml; 0,63 pg/ml; 0,32 pg/ml; 0,16 pg/ml; 0,08 pg/ml; 0,04 pg/ml; 0,02 pg/ml; 0,01 pg/ml. Visualizou-se a ligação de hRGM A usando um anticorpo anti-fc marcado com biotina e um complexo estreptavidina-peroxidase. Analisaram-se as placas (determinação de DO) a um comprimento de onda de 450 nm usando um fotómetro Anthos. Tal como apresentado na figura 3, as quatro concentrações de anticorpo mais elevadas inibirem, de uma forma dependente da dose, a ligação de RGM A humana completa a BMP-4 .

Também se usaram ensaios de ELISA em fase sólida para avaliar a inibição de ligação de MAB 5F9 de fragmento 0 (47 -168) de hRGM A a BMP-4. Revestiram-se placas de ELISA durante 1 h a 37 SC com uma concentração de 2,5 yg/ml da proteína BMP-4 humana recombinante. Adicionou-se cadeia leve de hRGM A (fragmento 0, 47-168) a uma concentração de 0,5 pg/ml a anticorpos 5F9 durante 1 h a 37 2C. Usou-se MAB 5F9 às seguintes concentrações: 1,25 pg/ml; 0,63 pg/ml; 0,32 pg/ml; 0,16 pg/ml; 0,08 pg/ml; 0,04 pg/ml; 0,02 pg/ml; 0,01 pg/ml. A ligação de hRGM A foi visualizada usando um anticorpo anti-fc marcado com biotina e um complexo estreptavidina-peroxidase. Analisaram-se as placas (determinação de DO) a um comprimento de onda de 450 nm usando um fotómetro Anthos. A figura 4 apresenta a inibição de ligação das concentrações de anticorpo de 1,25 pg/ml, 0,63 pg/ml e 0,32 pg/ml de uma forma dependente de dose da cadeia leve de RGM A humana a BMP-4.

Também se usaram ensaios de ELISA de fase sólida para avaliar a ligação de MAB 5F9 em ensaios de ligação competitiva hRGM A - BMP-2. Prepararam-se placas de ELISA e usaram-se tal como descrito na secção (v) do presente pedido. Adicionou-se hRGM A completa a uma concentração de 0,5 pg/ml a anticorpos 5F9 durante 1 h a 37 2C. Usou-se MAB 5F9 às seguintes concentrações: 5 pg/ml; 2,5 pg/ml; 1,25 pg/ml; 0,63 pg/ml; 0,32 yg/ml; 0,16 yg/ml. A ligação de hRGM A foi visualizada usando um anticorpo anti-fc marcado com biotina e um complexo estreptavidina-peroxidase. Analisaram-se as placas (determinação de DO) a um comprimento de onda de 450 nm usando um fotómetro Anthos. A figura 5 apresenta a inibição das concentrações de anticorpo de 5 pg/ml, 2,5 pg/ml, 1,25 pg/ml, 0,63 pg/ml, da ligação de RGM A humana completa a BMP-2.

Também se usaram ensaios de ELISA de fase sólida para avaliar MAB 5F9 e 8D1 em ensaios de ligação hRGM A - neogenina, hRGM A - BMP-2 e hRGM A - BMP-4 (figura 9). Tal como descrito, revestiram-se placas de ELISA durante 1 h a 37 2C com uma concentração de 2,5 pg/ml do domínio extracelular da proteína neogenina humana marcada com His ou com Bmp-2 ou BMP-4 a 2,5 yg/ml. Adicionou-se hRGM A completa conjugada a fc a uma concentração de 0,5 pg/ml a anticorpos durante 1 h a 37 2C. Usaram-se MAB 5F9 e 8D1 às seguintes concentrações: 5 pg/ml; 2,5 pg/ml; 1,25 pg/ml; 0,63 pg/ml; 0,32 pg/ml; 0,16 pg/ml; 0,08 pg/ml. A ligação de hRGM A foi visualizada usando um anticorpo anti-fc marcado com biotina e um complexo estreptavidina-peroxidase. Analisaram-se as placas (determinação de DO) a um comprimento de onda de 450 nm usando um fotómetro Anthos. Tal como apresentado na figura 9, o anticorpo monoclonal 8D1 de rato inibe ou diminui a ligação de RGM A humana a BMP-2 e a BMP-4, mas não é capaz de inibir a sua ligação a neogenina.

Exemplo 3. Atividade de mAb 5F9 em ensaios de crescimento de neurites com agregados de neurónios NTera diferenciados.

Obtiveram-se células Ntera e cultivaram-se tal como descrito na secção de métodos (vi) do presente pedido. mAb 5F9 neutralizou a atividade de inibição de crescimento para o exterior de neurites da potente cadeia leve (aminoácidos 47 -168) da proteína RGM A humana conjugada a fc em ensaios de crescimento de neurites com agregados de neurónios NTera humanos diferenciados. Tal como apresentado na figura 6, na ausência de uma proteína RGM A inibidora ou fragmento e na presença do substrato laminina estimulante de crescimento para o exterior, os agregados de NTera neuronais apresentaram uma rede extensa e densa de crescimento para o exterior de neurites (A). Também se apresenta na figura 6 que a presença da cadeia leve de hRGM A diminui drasticamente o número, densidade e comprimento de neurites de NTera, provando a potente atividade de inibição do fragmento de hRGM A. As escassas neurites a sair do agregado são curtas e altamente agrupadas (B). As partes C-E da figura 6 mostram que as concentrações crescentes do MAB 5F9 adicionado às culturas neutralizam ou não reprimem, de uma forma dependente da dose, a atividade de inibição de crescimento de neurites do fragmento de cadeia leve de hRGM A. Com o aumento das concentrações de MAB, o crescimento para o exterior de agregados neuronais de NTera é completamente restaurado, apesar da presença do inibidor de RGM A (C: MAB 5F9 a 0,1 pg/ml; D: MAB 5F9 a 1 pg/ml; E: MAB 5F9 a 10 pg/ml).

Efetuou-se análise quantitativa da atividade neutralizante de MAB 5F9 em ensaios de crescimento de neurites com agregados de NTera humanos para ensaiar o potente fragmento de inibição de cadeia leve (aminoácidos 47 - 168) da proteína RGM A humana, conjugado a fc. O crescimento para o exterior das culturas foi analisado automaticamente por coloração dos agregados com bisbenzimida e fotografia subsequente. A coloração apenas marcou o agregado e não as neurites em crescimento para o exterior. Contudo, estas são coradas com um anticorpo contra B3-tubulina e um anticorpo secundário marcado com fluoróforo. O crescimento para o exterior de neurites foi determinado automaticamente pelo cálculo do índice de crescimento para o exterior de neurites, um índice que é determinado pela subtração da área de corpos celulares da área corada com B3-tubulina do agregado e dos seus processos. Este fator foi então dividido pela área de corpos celulares, tal como descrito em Lingor et ai. J. Neurochem. 103: 181 - 189, 2007. A figura 7 mostra que MAB 5F9 neutralizou, de uma forma dependente da dose (0,1-10,0 pg) , a atividade de inibição de crescimento para o exterior de um potente fragmento de inibição (fragmento 0, 47 - 168; 10 pg) de hRGM A conjugada a fc em ensaios de crescimento de neurites com agregados de Ntera humana.

Exemplo 4. Atividade de mAb 5F9 em riscas de hRGM A/ colagénio I.

Cultivaram-se células SH-SY5Y e usaram-se tal como descrito na secção (vii) do presente pedido. Prepararam-se lamelas de vidro com riscas de RGM A e colagénio I, tal como descrito na secção (viii) do presente pedido. Produziu-se uma carpete com riscas alternadas de hRGM A/colagénio I e colagénio I, para as experiências de acordo com um protocolo descrito na literatura (Knoell et al. Nature Protocols 2: 1216 - 1224, 2007) . Na ausência do MAB 5F9 (A), as células neuronais SH-SY5Y mostraram uma clara preferência pela risca de colagénio I, com mais de 90% das células preferindo as riscas de colagénio I relativamente às riscas de hRGM A. Com concentrações crescentes de MAB 5F9, as células neuronais SH-SY5Y preferem as riscas de hRGM A relativamente às riscas de colagénio I (B-E) . À concentração mais elevada de MAB usada (E)), os neurónios SH-SY5Y apresentam uma forte preferência para as riscas de hRGM A comparativamente às riscas de colagénio I (consultar a figura 8). Tal pode ser interpretado como uma característica única do MAB 5F9, dado que transformou a natureza inibidora de RGM A numa atividade de atração. Na presença de concentrações crescentes de 5F9, as células neuronais preferem migrar e crescer num substrato de RGM A e não num substrato permissivo, tal como colagénio I. Tal característica única nunca tinha sido descrita anteriormente para um anticorpo monoclonal.

EXEMPLO 5: Construção de anticorpos com enxerto de CDR

Por aplicação de métodos padrão bem conhecidos na especialidade, as sequências das CDR das cadeias VH e VL do anticorpo monoclonal 5F9 (consultar a tabela 5, anteriormente) são enxertadas em diferentes sequências aceitadoras de cadeia pesada e leve humanas. Com base no alinhamento das sequências de VH e VL com as sequências de VH e VL do anticorpo monoclonal 5F9 da presente invenção, selecionaram-se as seguintes sequências humanas conhecidas: a) VH3-48, VH3-33 e VH3-23, bem como as sequências de junção hJH3, hJH4 e hJH6 para construção das sequências aceitadoras de cadeia pesada (de acordo com a tabela 3, anteriormente); b) A17 e A18, bem como hJK2 para construir as sequências aceitadoras de cadeia leve (de acordo com a tabela 4, anteriormente).

Por enxerto das CDR de VH e VL correspondentes de 5F9 nas referidas sequências aceitadoras, prepararam-se as seguintes sequências de CDR de VH e VL enxertadas, humanizadas e modificadas (consultar também a tabela 6, anteriormente): VH 5F9.1-GL, VH 5F9.2-GL, VH 5F9.3-GL, VH 5F9.4-GL, VH 5F9.5-GL, VH 5F9.6-GL, VH 5F9.7-GL e VH 5F9.8-GL; VL 5F9.1-GL, VL 5F9.2-GL e VL 5F9.3-GL. EXEMPLO 6: Construção de retromutações de esqueleto em anticorpos com CDR enxertadas

Para gerar retromutações de esqueleto de anticorpo humanizado, introduziram-se mutações nas sequências de anticorpo com enxerto de CDR, preparado de acordo com o exemplo 5, por síntese de novo do domínio variável e/ou usando iniciadores mutagénicos e PCR e métodos bem conhecidos na especialidade. Constroem-se diferentes combinações de retromutações e outras mutações para cada um dos enxertos de CDR, da seguinte forma.

Para as cadeias pesadas VH 5F9.1-GL, VH 5F9.2-GL e VH 5F9.3-GL um ou mais dos seguintes resíduos de Vernier e de interface de VH/VL são retromutados da seguinte forma: V37 I, V48 I, S49 G

e/ou R98 K

Para as cadeias pesadas VH 5F9.4-GL, VH 5F9.5-GL e VH 5F9.6-GL um ou mais dos seguintes resíduos de Vernier e de interface de VH/VL são retromutados da seguinte forma: V37 I, V48 I, A49 G, R98 K.

Para as cadeias pesadas VH 5F9.7-GL, VH 5F9.8-GL e VH 5F9.9-GL um ou mais dos seguintes resíduos de Vernier e de interface de VH/VL são retromutados da seguinte forma: V37 I, V48 I; S49 G.

As mutações adicionais incluem as seguintes: para as cadeias pesadas VH 5F9.1-GL, VH 5F9.2-GL e VH 5F9.3-GL: D88 A, para as cadeias pesadas VH 5F9.4-GL, VH 5F9.5-GL e VH 5F9.6-GL: Q1 E e para as cadeias pesadas VH 5F9.7-GL, VH 5F9.8-GL e VH 5F9.9-GL: L5 V.

Para a cadeia leve VL 5F9.1-GL um ou mais dos seguintes resíduos de Vernier e de interface de VH/VL são retromutados da seguinte forma: 12 V, M4 L, Y41 F.

Para a cadeia leve VL 5F9.2-GL um ou mais dos seguintes resíduos de Vernier e de interface de VH/VL são retromutados da seguinte forma: M4 L, R51 L.

Para a cadeia leve VL 5F9.3-GL um ou mais dos seguintes resíduos de Vernier e de interface de VH/VL são retromutados da seguinte forma: M4 L, Y41 F.

EXEMPLO 7: CONSTRUÇÃO E EXPRESSÃO DE ANTICORPOS ANTI-RGMA HUMANIZADOS RECOMBINANTES

Cotransfetaram-se vetores de expressão pHybE apresentando cadeias pesada e leve contendo retromutações de esqueleto para células 293-6E para produzir transitoriamente anticorpos humanizados completos, tal como descrito na secção ix anteriormente. As mutações foram introduzidos nas sequências de anticorpo com enxerto de CDR, preparadas de acordo com o exemplo 5, pela síntese de novo do domínio variável e/ou usando iniciadores mutagénicos e PCR e métodos bem conhecidos na especialidade. As sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos humanizados divulgam-se na tabela 8.

Especificamente para as cadeias pesadas: VH 5F9.1, VH 5F9.5 e VH 5F9.9 contêm VH 5F9.4-GL com uma mutação Q1 E. VH 5F9.2, VH 5F9.6, VH 5F9.10, VH 5F9.19, VH 5F9.20, VH 5F9.21 e VH 5F9.22 contêm VH 5F9.4-GL com uma mutação Q1 E e as seguintes retromutações de resíduos de Vernier e de interface de VH/VL: V37 I, V48 I, A49 G, R98 K. VH 5F9.3, VH 5F9.7 e VH 5F9.il contêm VH 5F9.7-GL com uma mutação L5 V. VH 5F9.4, VH 5F9.8, VH 5F9.12, VH 5F9.23, VH 5F9.24, VH 5F9.25 e VH 5F9.26 contêm VH 5F9.7-GL com uma mutação L5 V e as seguintes retromutações de resíduos de Vernier e de interface de VH/VL: V37 I, V48 I, S49 G.

VL 5F9.1, VL 5F9.2, VL 5F9.3 e VL 5F9.4 são idênticas a VL 5F9.1-GL.

Para as cadeias leves: VL 5F9.5, VL 5F9.6, VL 5F9.7 e VL 5F9.8 são idênticas a VL 5F9.2-GL. VL 5F9.9, VL 5F9.10, VL 5F9.il e VL 5F9.12 são idênticas a VL 5F9.3-GL. VL 5F9.19 e VL 5F9.23 contêm VL 5F9.2-GL com as seguintes retromutações de resíduos de Vernier e de interface de VH/VL: M4 L, R51 L. VL 5F9.20 e VL 5F9.24 contêm VL 5F9.2-GL com as seguintes retromutações de resíduos de Vernier e de interface de VH/VL: M4 L. VL 5F9.21 e VL 5F9.25 contêm VL 5F9.3-GL com as seguintes retromutações de resíduos de Vernier e de interface de VH/VL: M4 L, Y41 F. VL 5F9.22 e VL 5F9.26 contêm VL 5F9.3-GL com as seguintes retromutações de resíduos de Vernier e de interface de VH/VL: M4 L. TABELA 8: Expressão de anticorpos humanizados

Exemplo 8: Caracterização de anticorpos 5F9 humanizados usando ELISA competitiva

Revestiram-se placas de ELISA (Costar 3369) durante a noite a 4 °C com 5 0 μΐ/poço de hRGMA a 0,2 5 yg/ml em tampão de carbonato-bicarbonato de sódio 0,2 M, pH 9,4, lavou-se com tampão de lavagem (PBS contendo Tween 20 a 0,1%) e bloqueou-se durante 1 h à temperatura ambiente com 200 μΐ/poço de leite em pó magro a 2% em PBS. Após lavagem com tampão de lavagem, adicionou-se em duplicado uma mistura de um 5F9 biotinilado quimérico (concentração final de 0,1 pg/ml) e anticorpo de ensaio competidor não marcado com inicio a uma concentração final de 50 pg/ml e diluído em série 5 vezes) em 50 μΐ/poço de tampão de ELISA. Após incubação das placas durante 1 h à temperatura ambiente e lavagem com tampão de lavagem, detetaram-se os anticorpos ligados usando 100 μΐ/poço de uma diluição 1:10000 de estreptavidina conjugada a HRP (Fitzgerald) em tampão de ELISA. Após incubação durante 1 h à temperatura ambiente e lavagem com tampão de lavagem, efetuou-se revelação da cor por adição de 100 μΐ/poço de tampão TMB (Zymed) . Após incubação durante 15 min à temperatura ambiente, parou-se a revelação da cor por adição de 50 μΐ/poço de ácido clorídrico 1 N. Leu-se a absorvância a 490 nm. A tabela 9 apresenta os valores de IC50 dos anticorpos 5F9 humanizados obtidos usando o utilitário de computador GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA).

Tabela 9: Valores de IC50 de anticorpos 5F9 humanizados em ELISA competitiva

Exemplo 9: Determinações de afinidade de anticorpos

quiméricos e humanizados usando tecnologia BIACORE O ensaio BIACORE (Biacore, Inc, Piscataway, NJ) determina a afinidade de anticorpos com medições cinéticas das constantes de ligação e de dissociação. Determinou-se a ligação de anticorpos a RGMA humana recombinante purificada por medições baseadas em ressonância plasmónica de superfície com um instrumento Biacore® 3000 (Biacore® AB, Uppsala, Suécia) usando HBS-EP de operação (HEPES 10 mM [pH 7,4], NaCl 150 mM, EDTA 3 mM e surfactante P20 a 0,005%) a 25° C. Todos os produtos químicos foram obtidos de Biacore® AB (Uppsala, Suécia).

Imobilizou-se diretamente aproximadamente 5000 RU de IgG de cabra anti-humano, (Fc ), anticorpo policlonal especifico de fragmento (Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL) diluido em acetato de sódio 10 mM (pH 4,5) num chip biossensor CM5 de grau para investigação, usando um kit de acoplamento de amina padrão, de acordo com as instruções e procedimentos do fabricante, a 25 pg/ml. A parte que não reagiu da superfície do biossensor foi bloqueada com etanolamina. Usou-se uma superfície de carboximetildextrano modificada na célula de fluxo 2 e 4 como superfície de reação. Usou-se carboximetildextrano não modificado sem IgG de cabra anti-humano na célula de fluxo 1 e 3 como superfície de referência. Diluíram-se os anticorpos purificados em solução salina tamponada com HEPES durante a captura nas superfícies de reação específicas para IgG de cabra anti-humano. Injetaram-se os anticorpos humanos a serem capturados como ligandos (25 pg/ml) nas matrizes de reação, a um caudal de 5 μΐ/min. As constantes de velocidade de associação e dissociação, kon (unidades de M_1s_1) e k0ff (unidades de s_1) foram determinadas sob um caudal contínuo de 25 μΐ/min. As constantes de velocidade foram derivadas efetuando medições de ligação cinéticas a dez concentrações de antigénio diferentes na gama de 0,39 - 50 nM. Para análise cinética, ajustaram-se equações de velocidade derivadas do modelo de ligação de Langmuir 1:1 simultaneamente às fases de associação e dissociação de todas as oito injeções (usando análise de ajuste global) usando o utilitário Biaevaluation 4.0.1. A constante de equilíbrio de dissociação (unidades de M) da reação entre os anticorpos humanizados e RGMA humana recombinante purificada foi então calculada a partir das constantes de velocidade cinéticas pela seguinte fórmula: Kd = k0ff/k0n.

Tabela 9: Afinidade de anticorpos monoclonais anti-RGMA quiméricos e humanizados

Exemplo 10: Os anticorpos 5F9 humanizados neutralizam a atividade quimiorrepulsiva de RGM A humana num ensaio de quimotaxia de SH-SY5Y neuronal. 0 ensaio de quimiotaxia mede o comportamento quimiotático de células em resposta a fatores de difusão que podem exercer atividades de quimioatração ou quimiorrepulsão. RGM A foi descrita como uma proteína que atua tanto na forma ligada a membrana (repulsão dependente de contato), como na forma difundivel solúvel (quimiorrepulsiva) e portanto foi avaliada num ensaio de quimiotaxia de hRGM A. Para este objetivo usaram-se células de neuroblastoma humano SH-SY5Y sensíveis a RGM A, com o recetor de RGM neogenina (Schaffar et ai. J. Neurochemistry: 107:418 - 431, 2008). Cultivaram-se células SH-SY5Y em meio de solução salina equilibrada de Earle/F12 (EBSS/F12) suplementado com soro fetal bovino a 10% e aminoácidos não essenciais (MEM-NEAA) a 1%. Para indução de crescimento para o exterior de neurites, cultivaram-se as células em meio suplementado com ácido retinóico (RA) 10 μΜ. 5-6 horas mais tarde, as células foram tripsinizadas e contadas para plaqueamento em câmaras de Boyden de 24 poços (BD Falcon 351185, HTS Multiwell System). Adicionou-se 500 μΐ da suspensão celular (correspondente a lxlO5 células) ao circulo interior de cada poço. Separou-se este circulo interior do círculo exterior maior de cada poço com uma membrana de PET com um diâmetro de poro de 8 pm. Pipetou-se 600 μΐ de meio +/- RGM A +/- anticorpos para o círculo exterior e cultivaram-se as células nas câmaras de Boyden multipoços durante a noite a 37 °C. Após aspiração do meio de incubação e substituição pelo fixador (paraformaldeído a 2%), continuou-se a fixação durante 2 horas à temperatura ambiente e, após várias etapas de lavagem com PBS, efetuou-se permeabilização usando PBS contendo Triton-X-100 a 0,1% (15 min, temperatura ambiente). Efetuou-se coloração das células pela sua incubação durante 1 hora no escuro numa solução de Alexa Fluor 488 faloidina 1:100 (Invitrogen A12379) e bisbenzimida (H332456) 1:100. Após 2 etapas de lavagem com PBS, encheram-se as culturas com PBS, selaram-se com parafilm e armazenaram-se no escuro para análise num microscópio de fluorescência (Zeiss Axiovert).

Na ausência de hRGM A, as células migram através dos poros da membrana e podem ser contadas após fixação e coloração. Só se contam as células que estão coladas ao fundo da membrana, dado que estas células migraram através da membrana de PET. As células no lado superior da membrana foram removidas cuidadosamente antes do procedimento de fixação. Este ensaio de quimiotaxia prova que a presença de hRGM A reduziu significativamente o número de células SH-SY5Y que migram através da membrana em mais de 80%. O anticorpo monoclonal 5F9 de rato, 5F9 quimérico humano-rato e 5F9 humanizado, mas não o anticorpo monoclonal de controlo de isotipo de rato (p21), neutralizaram parcial ou completamente a atividade quimiorrepulsiva de hRGM A a 10 yg/ml, que se manifestou como um maior número de células encontradas no fundo da membrana (figura 10). EXEMPLO 11: 5F9 induz regeneração de axónios do nervo ótico esmagados, danificados, num modelo de rato de lesão do nervo ótico. O modelo de esmagamento do nervo ótico (ou lesão do nervo ótico) proporciona um modelo animal para ensaiar várias substâncias que estimulam a regeneração das fibras do nervo ótico e reduzem a morte celular massiva de células do gânglio retinal.

As experiências foram efetuadas em ratos machos adultos Sprague Dawley e machos Wistar obtidos de Charles River (D) Laboratories (Alemanha). Mantiveram-se os animais em gaiolas individuais num ciclo de 12 : 12 h de claro/escuro com alimento e água à discrição. Efetuou-se esmagamento do nervo ótico sempre apenas no olho esquerdo, por cirurgia anterior mínima. Este é um método minimamente invasivo de lesão do nervo ótico e foi desenvolvido por nós, de acordo com métodos de cirurgia visual anterior em humanos. Antes e durante o procedimento cirúrgico, os animais são anestesiados por anestesia de inalação usando sevoflurano (Abbott GmbH Co. & KG, Delkenheim, Alemanha) e são fixados à mesa de operação usando uma pinça de mandíbula e fita adesiva para os membros. Evita-se uma queda da temperatura corporal montando os animais numa manta de aquecimento. Para cirurgia anterior de esmagamento do nervo ótico de rato, liberta-se cuidadosamente o olho esquerdo do ligamento e tecido conjuntivo. Como uma primeira etapa, efetua-se um corte microcirúrgico (2-3 mm) do tecido adjacente do canto externo do olho. Seguidamente, expõe-se o nervo ótico usando um par de fórceps para mover os músculos laterais do olho e a glândula lacrimal, assim poupando-a. Na etapa seguinte, abrem-se as meninges longitudinalmente usando microtesouras para expor o nervo ótico.

Tal resulta numa maior mobilidade do olho e permite rotação lateral do olho e acesso ao seu nervo ótico esquerdo. Lesiona-se o nervo ótico aproximadamente 1-3 mm atrás do olho, usando um par de fórceps regulados para proporcionar uma pressão máxima fixa durante 20-30 s. Toma-se especial cuidado para não danificar o fornecimento vascular ao olho.

Administração local de anticorpos e solução tampão.

Após lesão por esmagamento do nervo ótico, os ratos macho Sprague Dawley foram tratados localmente com anticorpo 5F9 (n = 10 animais) , anticorpo de controlo 8D1 (n = 10 animais) ou com um veículo de controlo de PBS (n = 10 animais) . Os experimentalistas foram cegos relativamente aos diferentes grupos de tratamento. Para aplicação local de anticorpo, embeberam-se pequenas peças de "gelfoam" (comprimento: 2,5 mm, largura: 2,5 mm, altura: 2,5 mm) em 20 μΐ de uma solução de anticorpo a 10 mg/ml ou com 20 μΐ de PBS e foram colocadas diretamente adjacentes ao local de lesão no nervo ótico. Após cirurgia minimamente invasiva e aplicação de anticorpo, os animais foram colocados em toalhas de papel numa jaula limpa montada num aquecedor para controlar a temperatura corporal, até se começarem a mexer. Aplicou-se um unguento que contém antibiótico (Gentamytrex, Dr. Mann Pharma) no olho para evitar infeção bacteriana e secagem da esclera. Aplicou-se carprofeno (Rimadyl, 5 mg/kg, Pfizer GmbH, Karlsruhe) i.p. para terapia para a dor posoperatória diretamente após cirurgia e seguidamente duas vezes ao dia durante um período de 3 dias. Observaram-se os animais e controlaram-se regularmente várias horas diretamente após cirurgia e nos dias seguintes para assegurar que todos os animais sobrevivem e recuperam da anestesia e cirurgia. 5 semanas após cirurgia e aplicação de anticorpo/veículo, anestesiaram-se os animais com uma dose excessiva de Narcoren (40 - 60 mg/kg) e perfundiram-se com injeção de solução de paraformaldeído a 4% no coração. Isolaram-se os nervos óticos e transferiram-se para uma solução de paraformaldeído a 4% durante 1 h à temperatura ambiente, para assegurar fixação adequada do tecido. Seguidamente a posfixação, armazenaram-se os nervos óticos de rato durante a noite numa solução de sacarose a 30% (4 °C) . No dia seguinte, embeberam-se os nervos óticos em Tissue Tek, congelaram-se e prepararam-se secções longitudinais com uma espessura de 16 pm usando um Cryostat.

Para as imunocolorações, fixaram-se secções de nervo ótico com acetona fria (-20 °C, 10 min), lavadas 3x (5 min) com solução salina tamponada de Tris (TBS, Fluka 93312) e foram bloqueadas e permeabilizadas com TBS, contendo albumina de soro bovino a 5% e Triton-X-100 a 1% (30 min), à temperatura ambiente). Removeu-se BSA e detergente residuais por 2 etapas de lavagem independentes (5 min cada) com TBS. Incubaram-se as secções durante 1 h à temperatura ambiente com um anticorpo policlonal anti-GAP-43 de coelho (Abeam, ab 7562) diluído a 1:100 em solução de BSA a 5%/TBS. Após 3 etapas de lavagem com TBS, Tween a 0,1%, incubaram-se as secções durante 1 h à temperatura ambiente com um anticorpo secundário de cabra anti-coelho conjugado a Alexa Fluor 488 (Molecular Probes A11034), diluído a 1:1000 em BSA a 5%/TBS, contendo uma diluição a 1:100 de bisbenzimida (H33258, 50 pg/ml) para visualizar os núcleos celulares. Antes de embebimento, as secções coradas foram lavadas 3 vezes com TBS Tween a 0,1% (5 min cada etapa) e com água destilada. Embeberam-se as secções em Fluoromount G, cobriram-se com uma lamela e armazenaram-se no escuro para documentação microscópica.

Usando um microscópio de fluorescência Zeiss, armazenaram-se as imagens (figura 11) de secções longitudinais coradas usando o utilitário Zeiss Axiovison. Montaram-se imagens únicas de cada nervo para análise usando o utilitário de análise de imagem Photoshop (Adobe). Efetuou-se análise quantitativa de dois modos diferentes usando as imagens compostas dos nervos óticos. Mediu-se a área positiva para GAP-43 no local de lesão usando o utilitário Axiovision (figura 12B). Independentemente desta primeira análise quantitativa, contaram-se fibras simples em regeneração (positivas para GAP-43) em 4 áreas diferentes: 0 - 200 pm, 200 - 400 pm, 400 - 600 pm e 600 - 1200 pm em redor do local de lesão. A análise de dados e avaliação estatística dos dados foi efetuada com o auxílio do utilitário Graphpad Prism, (figura 12A)

Administração sistémica de solução de anticorpos e tampão.

Para entrega sistémica de anticorpo, trataram-se ratos Wistar machos sistemicamente (intraperitonealmente, ip) ou intravenosamente, iv) com anticorpo 5F9 (n = 10 animais) ou com um controlo de veículo de PBS (n = 10 animais). Injetaram-se os animais duas vezes e efetuaram-se injeções no dia 0, logo após induzir esmagamento do nervo, e no dia 21 após esmagamento. As doses de anticorpo administradas foram 2 mg/kg no dia 0 e 10 mg/kg no dia 21. Mataram-se os animais cinco semanas após lesão por esmagamento e efetuou-se isolamento de tecido, preparação de secções, colorações e análise quantitativa, tal como descrito anteriormente. Tal como anteriormente, os experimentadores foram cegos para os dois grupos de tratamento diferentes. As imagens compostas dos nervos óticos de rato apresentam-se na figura 13. Nos animais tratados com 5F9 (A), muitas fibras positivas para GAP-43 estendem-se para além do local de esmagamento, contrariamente aos animais de controlo tratados com PBS (B). O local de esmagamento está localizado na margem esquerda e as fibras em regeneração são coradas com um anticorpo contra GAP-43. Verifica-se a existência de muitas fibras no rebordo superior e inferior do nervo ótico em animais tratados com 5F9 mas não em animais tratados com PBS. 5F9, mas não o controlo de veículo de PBS, aumentou significativamente o número de fibras positivas para GAP-43 em regeneração. Encontraram-se significativamente mais fibras (p < 0,001) em animais tratados com 5F9 a distâncias de 300 pm a 1800 pm, do que em animais tratados com veículo. Os animais foram tratados com 5F9 no dia 0 e d21 com 2 mg/kg e 10 mg/kg, respectivamente. O anticorpo ou veículo foram administrados intraperitoneal ou intravenosamente. Os dados são da análise de 9 animais por grupo. Analisaram-se 3 séries de secções criostáticas por animal, (figura 14A)

Numa segunda experiência, trataram-se ratos Wistar machos, após lesão do nervo ótico, sistemicamente (iv) com anticorpo 5F9 (n = 10 animais), anticorpo de controlo 8D1 (n = 10 animais) ou com o controlo de veículo de PBS (n = 10 animais). Os ratos foram injetados uma vez por semana com 2 mg/kg de anticorpo administrado iv e iniciaram-se as injeções imediatamente após esmagamento do nervo ótico. Todos os ratos receberam 4 injeções e eutanizaram-se os animais 5 semanas após lesão por esmagamento. Os experimentadores foram cegos relativamente à distribuição de animais e efetuou-se processamento de tecidos e análise quantitativa tal como descrito anteriormente. 5F9, mas não o controlo de veiculo de PBS, aumentou significativamente o número de fibras positivas para GAP-43 em regeneração. Encontraram-se significativamente mais fibras (p < 0,001) em animais tratados com 5F9 a distâncias de 200 ym a 1400 ym, do que em animais tratados com veiculo ou anticorpo de controlo. Os animais foram tratados iv uma vez por semana durante 4 semanas, com inicio no dia 0 com 5F9 (2 mg/kg por dose) , com o anticorpo de controlo 8D1 (2 mg/kg por dose) ou com PBS. (figura 14B) EXEMPLO 12: 5F9 induz remielinização de axónios de nervo ótico lesionado por esmagamento num modelo de rato de lesão de nervo ótico.

Um marcador para oligodendrócitos e mielina é proteína básica de mielina (MBP). Usou-se um anticorpo dirigido contra MBP para responder à questão se ocorrem diferenças na remielinização nos diferentes grupos de tratamento. Para visualizar o processo de remielinização, fixaram-se secções de nervo ótico de animais tratados sistemicamente, com acetona fria (-20 °C, 10 min) , lavaram-se 3x (5 min) com solução salina tamponada de Tris (TBS, Fluka 93312) e foram bloqueados e permeabilizados com TBS contendo albumina de soro bovina a 5% e Triton-X-100 a 1% (30 min) , à temperatura ambiente) . Removeu-se BSA e detergente residuais por duas etapas de lavagem independentes (5 min cada) com TBS. Incubaram-se as secções durante 3 h ou durante a noite a 4 °C com um anticorpo policlonal de coelho anti-MBP (Abeam, ab 2404) diluído a 1:50 em solução de BSA a 5%/TBS. Após 3 etapas de lavagem com TBS, Tween a 0,1%, incubaram-se as secções durante 1 h à temperatura ambiente com um anticorpo secundário de cabra anti-coelho conjugado a Alexa Fluor 488 (Molecular Probes A11034), diluído a 1: 000 em BSA a 55/TBS, contendo bisbenzimida (H33258, 50 pg/ml) a uma diluição de 1:100 para visualizar os núcleos celulares. Antes de embebimento, lavaram-se as secções coradas 3 vezes com TBS Tween a 0,1% (5 min cada etapa) e com água destilada. Embeberam-se as secções em Fluoromount G, cobriram-se com uma lamela e armazenaram-se no escuro para documentação microscópica.

Usando um microscópio de fluorescência Zeiss, armazenaram-se imagens de secções longitudinais coradas usando o utilitário Zeiss Axiovison. Montaram-se imagens únicas de cada nervo para análise usando o utilitário de análise de imagem Photoshop (Adobe). Efetuou-se análise quantitativa de dois modos diferentes usando as imagens compostas dos nervos óticos. Mediu-se a área positiva para MBP no local de lesão usando o utilitário Axiovision. A análise de dados e a avaliação estatística dos dados foi efetuada com o auxílio do utilitário Graphpad Prism.

Os animais foram tratados com 5F9 no dia 0 e d21 com 2 mg/kg e 10 mg/kg, respectivamente. Administrou-se anticorpo ou veículo intraperitoneal ou intravenosamente. Imagens compostas dos nervos óticos de ratos.

Visualizou-se mielinização usando um anticorpo dirigido contra o marcador de mielina, proteína básica de mielina MBP. Os locais de esmagamento estão localizados no meio dos nervos compostos e a área está isenta nos animais de controlo tratados com veículo (A e B) . Nos animais tratados com 5F9 (C e D) observaram-se muitas estruturas positivas para MBP na área central (centro de esmagamento) dos nervos óticos, (figura 15) A mielinização foi visualizada usando um anticorpo dirigido contra o marcador de mielina, proteína básica de mielina MBP. Mediu-se a área de MBP usando o utilitário Zeiss Axiovison. Ml e M2 são duas medições independentes e M é a área média positiva para MPB medida. 5F9 aumenta significativamente (p < 0,001 relativamente a controlo de veículo) a área de MBP do local de esmagamento do nervo ótico por um fator de 3,5. (figura 16)

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Abbott GmbH & Co. KG <120> Anticorpos contra a proteína RGM A e seus usos <130> M/49229-PCT <160> 68 <170> Patentln versão 3.3

<210> 1 <211> 1353 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1) .. (1353) <4 Ο 0> 1 atg cag ccg cca agg gag agg eta gtg gta aca ggc ega get gga tgg 48

Met Gin Pro Pro Arg Glu Arg Leu Val Val Thr Gly Arg Ala Gly Trp 15 10 15 atg ggt atg ggg aga ggg gca gga cgt tea gee ctg gga ttc tgg ccg 96

Met Gly Met Gly Arg Gly Ala Gly Arg Ser Ala Leu Gly Phe Trp Pro 20 25 30 acc etc gee ttc ett etc tgc age ttc ccc gca gee ace tee ccg tgc 144

Thr Leu Ala Phe Leu Leu Cys Ser Phe Pro Ala Ala Thr Ser Pro Cys 35 40 45 aag ate etc aag tgc aac tet gag ttc tgg age gee aeg teg ggc age 192

Lys lie Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Gly Ser 50 55 60 cac gee cca gee tea gac gac acc ccc gag ttc tgt gca gee ttg ege 240

His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu Arg 65 70 75 80 age tac gee ctg tgc aeg egg egg aeg gee ege acc tgc egg ggt gac 288

Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp 85 90 95 ctg gee tac eae teg gee gtc cat ggc ata gag gac etc atg age cag 336

Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly He Glu Asp Leu Met Ser Gin 1O0 105 110 cac aac tgc tee aag gat ggc ccc acc teg cag cca ege ctg ege aeg 384

His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gin Pro Arg Leu Arg Thr 115 120 125 etc cca ccg gee gga gac age cag gag ege teg gac age ccc gag ate 432

Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gin Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu lie 130 135 140 tgc cat tac gag aag age ttt cac aag cac teg gee acc ccc aac tac 480

Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Thr Pro Asn Tyr 145 150 155 160 acg cac tgt ggc etc ttc ggg gac cca cac etc agg act ttc acc gac 528

Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr Asp 165 170 175 ege ttc cag acc tgc aag gtg cag ggc gee tgg ccg etc ate gac aat 576

Arg Phe Gin Thr Cys Lys Val Gin Gly Ala Trp Pro Leu lie Asp Asn 180 185 190 aat tac ctg aac gtg cag gee acc aac acg cct gtg ctg ccc ggc tea 624

Asn Tyr Leu Asn Val Gin Ala Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly Ser 195 200 205 geg gee act gee acc age aag etc acc ate ate ttc aag aac ttc cag 672

Ala Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr lie He Phe Lys Asn Phe Gin 210 215 220 gag tgt gtg gac cag aag gtg tac cag get gag atg gac gag etc ccg 720

Glu Cys Val Asp Gin Lys Val Tyr Gin Ala Glu Met Asp Glu Leu Pro 225 230 235 240 gee gee ttc gtg gat ggc tet aag aac ggt ggg gac aag cac ggg gee 768

Ala Ala Phe Val Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly Ala 245 250 255 aac age ctg aag ate act gag aag gtg tea ggc cag cac gtg gag ate 816

Asn Ser Leu Lys lie Thr Glu Lys Val Ser Gly Gin His Val Glu lie 260 265 270 cag gee aag tac ate ggc acc acc ate gtg gtg ege cag gtg ggc ege 864

Gin Ala Lys Tyr lie Gly Thr Thr lie Val Val Arg Gin Val Gly Arg 275 280 285 tac ctg acc ttt gee gtc ege atg cca gag gaa gtg gtc aat get gtg 912

Tyr Leu Thr Phe Ala val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala val 290 295 300 gag gac tgg gac age cag ggt etc tac etc tgc ctg egg ggc tgc ccc 960

Glu Asp Trp Asp Ser Gin Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys Pro 305 310 315 320 etc aac cag cag ate gac ttc cag gee ttc cac acc aat get gag ggc 1008

Leu Asn Gin Gin lie Asp Phe Gin Ala Phe His Thr Asn Ala Glu Gly 325 330 335 acc ggt gee ege agg ctg gca gee gee age cct gca ccc aca gee ccc 1056

Thr Gly Ala Arg Arg Leu Ala Ala Ala Ser Pro Ala Pro Thr Ala Pro 340 . 345 350 gag acc ttc cca tac gag aca gee gtg gee aag tgc aag gag aag ctg 1104

Glu Thr Phe Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu 355 360 365 ccg gtg gag gac ctg tac tac cag gee tgc gtc ttc gac etc etc acc 1152

Pro Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gin Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr 370 375 3B0 acg ggc gac gtg aac ttc aca ctg gee gee tac tac geg ttg gag.gat 1200

Thr Gly Asp Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp 385 390 395 400 gtc aag atg etc cac tee aac aaa gac aaa ctg cac ctg tat gag agg 1248

Val Lys Met Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Tyr Glu Arg 405 410 415 act egg gac ctg cca ggc agg geg get geg ggg ctg ccc ctg gee ccc 1296

The Arg Asp Leu Pro Gly Arg Ala Ala Ala Gly Leu Pro Leu Ala Pro 420 425 430 egg ccc etc ctg ggc gee etc gtc ccg etc ctg gee ctg etc cct gtg 1344

Arg Pro Leu Leu Gly Ala Leu Val Pro Leu Leu Ala Leu Leu Pro Val 435 440 445 ttc tgc tag 1353

Phe Cys 450

<210> 2 <211> 450 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 2

Met Gin Pro Pro Arg Glu Arg Leu Val Val Thr Gly Arg Ala Gly Trp 15 10 15

Met Gly Met Gly Arg Gly Ala Gly Arg Ser Ala Leu Gly Phe Trp Pro 20 25 30

Thr Leu Ala Phe Leu Leu Cys Ser Phe Pro Ala Ala Thr Ser Pro Cys 35 40 45

Lys lie Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Gly Ser 50 55 60

His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys Alá Ala Leu Arg 65 70 75 80

Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp 85 90 95

Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly lie Glu Asp Leu Met Ser Gin 100 105 110

His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gin Pro Arg Leu Arg Thr 115 120 125

Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gin Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu lie 130 135 140

Cys His Tyr Glu Lys Ser phe His Lys His Ser Ala Thr Pro Asn Tyr 145 150 155 160-

Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr Asp 165 170 175

Arg Phe Gin Thr Cys Lys Val Gin Gly Ala Trp Pro Leu lie Asp Asn 180 185 190

Asn Tyr Leu Asn Val Gin Ala Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly Ser 195 200 205

Ala Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr lie lie Phe Lys Asn Phe Gin 210 215 220

Glu Cys Val Asp Gin Lys Val Tyr Gin Ala Glu Met Asp Glu Leu Pro 225 230 235 240

Ala Ala Phe Val Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly Ala 245 250 255

Asn Ser Leu Lys lie Thr Glu Lys Val Ser Gly Gin His Val Glu lie 260 265 270

Gin Ala Lys Tyr lie Gly Thr Thr lie Val Val Arg Gin Val Gly Arg 275 280 285

Tyr Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala Val 290 295 300

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Leu Asn Gin Gin lie Asp Phe Gin Ala Phe His Thr Asn Ala Glu Gly 325 330 335

Thr Gly Ala Arg Arg Leu Ala Ala Ala Ser Pro Ala Pro Thr Ala Pro 340 345 350

Glu Thr Phe Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu 355 360 365

Pro Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gin Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr 370 375 380

Thr Gly Asp Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp 385 390 395 400

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Thr Arg Asp Leu Pro Gly Arg Ala Ala Ala Gly Leu Pro Leu Ala Pro 4 20 <125 430

Arg Pro Leu Leu Gly Ale Leu Val Pro Leu Leu Ala Leu Leu Pro Val 435 440 445

Phe Cys 450 <210> 3 <211> 1929 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> hRGMA fc <22 0> <221> CDS <222> (1) .. (1929) <22 0> <221> sig_peptide <222> (1) . . (102) <22 0> <221> misc_feature <222> (103) . . (1230)

<223> Fragmento 47-422 de hRGMA <22 0> <221> misc_feature <222> (1231) . . (1929) <223> parte fc <4Ο0> 3 atg gag aca gac aca etc ctg eta tgg gta ctg ctg etc tgg gtt cca 48

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 15 10 15 ggt tee act ggt gac geg gee cag ccg gee agg ege geg ege cgt aeg 96

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gin Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr 20 25 30 aag ett ccg tgc aag ate etc aag tgc aac tet gag ttc tgg age gee 144

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Arg Leu Arg Thr Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gin Glu Arg Ser Asp 115 120 125 age ccc gag ate tgc cat tac gag aag age ttt cac aag cac teg gee 432

Ser Pro Glu Tie Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala 130 135 140 acc ccc aac tac aeg cac tgt ggc etc ttc ggg gac cca cac etc agg 400

Thr Pro Asn Tyr Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg 145 150 155 160 act ttc acc gac ege ttc cag acc tgc aag gtg cag ggc gee tgg ccg 528

Thr Phe Thr Asp Arg Phe Gin Thr Cys Lys Val Gin Gly Ala Trp Pro 165 170 175 etc ate gac aat aat tac ctg aac gtg cag gtc acc aac aeg cct gtg 576

Leu lie Asp Asn Asn Tyr Leu Asn Val Gin Val Thr Asn Thr Pro Val 1Θ0 185 190 ctg ccc ggc tea geg gee act gee acc age aag etc acc ate ate ttc 624

Leu Pro Gly Ser Ala Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr lie lie Phe 195 200 205 aag aac ttc cag gag tgt gtg gac cag aag gtg tac cag get gag atg 672

Lys Asn Phe Gin Glii Cys Val Asp Gin Lys Val Tyr Gin Ala Glu Met 210 215 220 gac gag etc ccg gee gee ttc gtg gat ggc tet aag aac ggt ggg gac 720

Asp Glu Leu Pro Ala Ala Phe Val Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp 225 230 235 240 aag cac ggg gee aac age ctg aag ate act gag aag gtg tea ggc cag 768 T.ys His Gly Ala Asn Ser Leu Lys lie Thr Glu Lys Val Ser Gly Gin 245 250 255 cac gtg gag ate cag gee aag tac ate ggc acc acc ate gtg gtg ege 816

His Val Glu lie Gin Ala Lys Tyr lie Gly Thr Thr He Val Val Arg 260 265 270 cag gtg ggc ege tac ctg acc ttt gee gtc ege atg cca gag gaa gtg 864

Gin Val Gly Arg Tyr Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val 275 280 285 gtc aat get gtg gag gac tgg gac age cag ggt etc tac etc tgc ctg 912

Val Asn Ala Val Glu Asp Trp Asp Ser Gin Gly Leu Tyr Leu Cys Leu 290 295 300 egg ggc tgc ccc etc aac cag cag ate gac ttc cag gee ttc cac acc 960

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Glu Gly Arg Met Asp Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 420 425 430 ccg tea gtc ttc etc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc etc atg ate 1344

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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 450 455 460 gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat 1440

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 465 470 475 480 aat gcc aag aca aag ccg egg gag gag cag tac aac age aeg tac cgt 1488

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 4G5 490 495 gtg gtc age gtc etc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag 1536

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Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp 565 570 575 gag age aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc aeg cct ccc gtg 1776

Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 580 585 590 ctg gac tee gac ggc tee ttc ttc etc tat age aag etc acc gtg gac 1824

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 595 60 ΰ S05 aag age agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tea tgc tee gtg atg cat 1872

Lys Ser Atg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 510 515 620 gag get ctg cac aac cac tac aeg cag aag age etc tee ctg tet ccg 1920

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 625 630 635 640 ggt aaa tga 1929

Gly Lys <210> 4 <211> 642 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Construção sintética <4Ο0> 4

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 15 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gin Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr 20 25 30

Lys Leu Pro Cys Lys lie Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala 35 40 45

Thr Ser Gly Ser His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys 50 55 60

Ala Ala Leu Arg Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr 65 70 75 80

Cys Arg Gly Asp Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly He Glu Asp 85 90 95

Leu Met Ser Gin His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gin Pro 100 105 110

Arg Leu Arg Thr Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gin Glu Arg Ser Asp 115 120 125

Ser Pro Glu He Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala 130 135 140

Thr Pro Asn Tyr Thr His Cys Gly Le'u Phe Gly Asp Pro His Leu Arg 145 150 155 160

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Leu lie Asp Asn Asn Tyr Leu Asn Val Gin Val Thr Asn Thr Pro val 180 185 190

Leu Pro Gly Ser Ala Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr He lie Phe 195 200 205

Lys Asn Phe Gin Glu Cys Val Asp Gin Lys Val Tyr Gin Ala Glu Met 210 215 220

Asp Glu Leu Pro Ala Ala Phe Val Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp 225 230 235 240

Lys His Gly Ala Asn Ser Leu Lys He Thr Glu Lys Val Ser Gly Gin 245 250 255

His Val Glu lie Gin Ala Lys Tyr lie Gly Thr Thr lie Val Val Arg 260 265 270

Gin Val Gly Arg Tyr Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val 275 280 285

Val Asn Ala Val Glu Asp Trp Asp Ser Gin Gly Leu Tyr Leu Cys Leu 290 295 300

Arg Gly Cys Pro Leu Asn Gin Gin lie Asp Phe Gin Ala Phe His Thr 305 310 315 320

Asn Ala Glu Gly Thr Gly Ala Arg Arg Leu Ala Ala Ala Ser Pro Ala 325 330 335

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Lys Glu Lys Leu Pro Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gin Ala Cys Val Phe 355 360 365

Asp Leu Leu Thr Thr Gly Asp Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr 370 375 3S0

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Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 485 490 495

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Gly Lys <210> 5 <211> 1167 <212> ADN <213> Artificial <22 0>

<223> Fc de LC de hRGMA <22 0> <221> CDS <222> (1) . . (1167) <22 0> <221> sig_peptide <222> (1) . . (102) <22 0> <221> misc_feature <222> (103) . . (468)

<223> Fragmento 47-168 de hRGMA <22 0> <221> misc_feature <222> (469) .. (1167) <223> parte fc <4Ο0> 5 atg gag aca gac aca etc ctg eta tgg gta ctg ctg etc tgg gtt cca -5 3

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 15 10 15 qgt tcc act ggt gac geg gcc cag ccg gcc agg ege geg ege cgt aeg 95

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gin Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr 20 25 30 aag ett ccg tgc aag ate etc aag tgc aac tet gag ttc tgg age gcc 144

Lys Leu Pro Cys Lys lie Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala 35 40 45 aeg teg ggc age cac gcc cca gcc tea gac gac acc ccc gag ttc tgt 192

Thr Ser Gly Ser His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys 50 55 60 gca gcc ttg ege age tac gcc ctg tgc aeg egg egg aeg gcc ege acc 240

Ala Ala Leu Arg Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr 65 70 75 80 tgc egg ggt gac ctg gcc tac cac teg gcc gtc cat ggc ata gag gac 288

Cys Arg Gly Asp Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly lie Glu Asp 85 90 95 etc atg age cag cac aac tgc tec aag gat ggc ccc acc teg cag cca 336

Leu Met Ser Gin His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gin Pro 100 105 110 ege ctg ege aeg etc cca ccg gcc gga gac age cag gag ege teg gac 384

Arg Leu Arg Thr Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gin Glu Arg Ser Asp 115 120 125 age ccc gag ate tgc cat tac gag aag age ttt cac aag cac teg gcc 432

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Thr Pro Asn Tyr Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Leu Asn Ser Ala 145 150 155 160 gat ate gag gga ega atg gat cca ccg tgc cca gca cct gaa ctcctg 528

Asp lie Glu Gly Arg Met Asp Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 165 170 175 ggg gga ccg tea gtc ttc etc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc etc 576

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 180 185 190 atg ate tee egg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age 624

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His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 210 215 220 gtg cat aat gee aag aca aag ccg egg gag gag cag tac aac age acg 720

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He Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 275 280 285 gtg tac acc ctg ccc cca tee egg gag gag atg acc aag aac cag gtc 912

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val 290 295 300 age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc age gac ate gee gtg 960

Ser Leu Ttir Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val 305 310 315 320 gag tgg gag age aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct 1008

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 325 330 335 ccc gtg ctg gac tee gac ggc tee ttc ttc etc tat age aag etc acc 1056

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 340 345 350 gtg gac aag age agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tea tgc tee gtg 1104

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 355 360 365 atg cat gag get ctg cac aac cac tac acg cag aag age etc tee ctg 1152

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 370 375 380 tet ccg ggt aaa tga 1167

Ser Pro Gly Lys 385 <210> 6 <211> 388 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Construção sintética <4Ο0> 6

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 15 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gin Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr 20 25 30

Lys Leu Pro Cys Lys lie Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala 35 40 45

Thr Ser Gly Ser His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys 50 55 60

Ala Ala Leu Arg Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr 65 70 75 80

Cys Arg Gly Asp Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly lie Glu Asp 85 90 95

Leu Met Ser Gin His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gin Pro 100 105 110

Arg Leu Arg Thr Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gin Glu Arg Ser Asp 115 120 125

Ser Pro Glu lie Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala 130 135 140

Thr Pro Asn Tyr Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Leu Asn Ser Ala 145 150 155 160

Asp He Glu Gly Arg Met Asp Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 165 170 175

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 180 185 190

Met lie. Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 195 200 205

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 210 215 220

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr 225 230 235 240

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 245 250 255

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 260 265 270 lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 275 280 285

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val 290 295 300

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val 305 310 315 320

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 325 330 335

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 340 345 350

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 355 360 365

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 370 375 380

Ser Pro Gly Lys 385 <210> 7 <211> 1431 <212> ADN <213> Rattus sp. <22 0> <221> CDS <222> (1) . . (1431) <400> 7 atg gag aca gac aca etc ctg eta tgg gta ctg ctg etc tgg gtt cca 48

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 ggt tcc act ggt gac geg gee cag ccg gee agg ege geg ege cgt aeg 96

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gin Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr 20 25 30 aag ett ggt acc gag etc gga tec act agt cca gtg tgg tgg aat tet 144

Lys Leu Gly Thr Glu Leu Gly Ser Thr Ser Pro Val Trp Trp Asn Ser 35 40 45 gca gat ate aca agt ttg tac aaa aaa gca ggc tec ccg tgc aag ate 192

Ala Asp lie Thr Ser Leu Tyr Lys Lys Ala Gly Ser Pro Cys Lys lie 50 55 60 etc aag tgc aac tet gag ttc tgg age gee aeg teg tea ggc age cac 240

Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Ser Gly Ser His 65 TO 75 80 gee cct gee tet gac gac gtg ccc gag ttc tgt get gee ctg ege acc 288

Ala Pro Ala Ser Asp Asp Val Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu Arg Thr 85 90 95 tac gee ctg tgc aeg ega egg aca gee ege acc tgc egg ggc gac ctg 336

Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp Leu 100 105 110 get tac cac teg get gtc cat ggc ata gag gac etc atg age cag cac 384

Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly lie Glu Asp Leu Met Ser Gin His 115 120 125 aac tgc tec aag gat ggc ccc acc tea cag cct ega gtg ege aeg etc 432

Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gin Pro Arg Val Arg Thr Leu 130 135 140 ccg cca get ggg gac age cag gag ege tea gat age ccc gag ate tgc 480

Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gin Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu lie Cys 145 150 155 160 cac tat gag aag agt ttc cac aag cac tea get gee ccc aac tac act 528

His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Ala Pro Asn Tyr Thr 165 170 175 cac tgc ggc etc ttt ggg gac cca cac etc agg act ttc aca gac cac 576

His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr Asp His 190 185 190 ttc cag aca tgt aag gtg caa ggc get tgg cct etc ate gac aat aat 624

Phe Gin Thr Cys Lys Val Gin Gly Ala Trp Pro Leu lie Asp Asn Asn 195 200 205 tae ctg aac gtg cag gtc acc aat aca cct gtg ctg ccc ggc tet gee 672

Tyr Leu Asn Val Gin Val Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly Ser Ala 210 215 220 gee act gee acc age aag etc acc ate ate ttc aag aac ttc caa gag 720

Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr lie lie Phe Lys Asn Phe Gin Glu 225 230 235 240 tgt gtg gac cag aaa gta tac caa gee gag atg gac gag ett ccg tec 768

Cys Val Asp Gin Lys Val Tyr Gin Ala Glu Met Asp Glu Leu Pro Ser 245 250 255 gee ttt gee gat ggc tec aaa aac ggt gga gat aaa cac gga gee aac 816

Ala Phe Ala Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly Ala Asn 260 265 270 age ctg aag ate aca gag aag gtg tea ggc cag cac gtg gag ate cag 864

Ser Leu Lys lie Thr Glu Lys Val Ser Gly Gin His Val Glu lie Gin 275 280 285 gee aag tac ate ggc ace ace ate gtg gtg aga cag gtg ggc egc tac 912

Ala Lys Tyr lie Gly Thr Thr lie Val Val Arg Gin Val Gly Arg Tyr 290 295 300 ctg acc ttc gee gtc egg atg ccc gag gag gta gtc aac gee gtg gag 960

Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala Val Glu 305 310 315 320 gac cgt gac age caa ggc etc tac etc tgc ctg egg ggc tgc ccg etc 1008

Asp Arg Asp Ser Gin Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys Pro Leu 325 330 335 aac cag cag ate gac ttc cag get ttc cgt gee aac gee gag age cct 1056

Asn Gin Gin lie Asp Phe Gin Ala Phe Arg Ala Asn Ala Glu Ser Pro 340 345 350 ege agg cca gca get gee age ccc tet cct gtg gtc ccc gag aca ttt 1104

Arg Arg Pro Ala Ala Ala Ser Pro Ser Pro Val Val Pro Glu Thr Phe 355 360 365 ccg tac gag aca get gtg gee aag tgc aaa gag aag ctg cct gta gaa 1152

Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu Pro val Glu 370 375 380 gac ttg tac tac cag gee tgt gtc ttc gac etc etc aeg act ggc gac 1200

Asp Leu Tyr Tyr Gin Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr Thr Gly Asp 385 390 395 400 gtg aac ttc aeg ctg gee gee tac tat get ttg gag gat ggc aag atg 1248

Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp Gly Lys Met 405 410 415 etc cac tee aac aag gac aag eta cac ctg ttt gaa agg act egg gag 1296

Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Phe Glu Arg Thr Arg Glu 420 425 430 ctg cct gac cca get ttc ttg tac aaa gtg gtg ata tee age aca gtg 1344

Leu Pro Asp Pro Ala Phe Leu Tyr Lys Val Val He Ser Ser Thr Val 435 440 445 geg gee get ega gga ggg ccc gaa caa aaa etc ate tea gaa gag gat 1392

Ala Ala Ala Arg Gly Gly Pro Glu Gin Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp 450 455 460 ctg aat age gee gtc gac cat cat cat cat cat cat tga 1431

Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His 465 470 475 <210> 8 <211> 476 <212> PRT <213> Rattus sp. <4Ο0> 8

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 15 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gin Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr 20 25 30

Lys Leu Gly Thr Glu Leu Gly Ser Thr Ser Pro Val Trp Trp Asn Ser 35 40 45

Ala Asp lie Thr Ser Leu Tyr Lys LyS Ala Gly Ser Pro Cys LyS lie 50 55 60

Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Ser Gly Ser His 65 70 75 80

Ala Pro Ala Ser Asp Asp Val Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu Arg Thr 85 90 95

Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp Leu 100 105 110

Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly lie Glu Asp Leu Met Ser Gin His 115 120 125

Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gin Pro Arg Val Arg Thr Leu 130 135 140

Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gin Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu lie Cys 145 150 155 ' 160

His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Ala Pro Asn Tyr Thr 165 170 175

His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr Asp His 180 185 190

Phe Gin Thr Cys Lys Val Gin Gly Ala Trp Pro Leu lie Asp Asn Asn 195 200 205

Tyr Leu Asn Val Gin Val Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly Ser Ala 210 215 220

Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr lie He Phe Lys Asn Phe Gin Glu 225 230 235 240

Cys Val Asp Gin Lys Val Tyr Gin Ala Glu Met Asp Glu Leu Pro Ser 245 250 255

Ala Phe Ala Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly Ala Asn 2 60 265 270

Ser Leu Lys lie Thr Glu Lys Val Ser Gly Gin His Val Glu lie Gin 275 280 285

Ala Lys Tyr lie Gly Thr Thr lie Val Val Arg Gin Val Gly Arg Tyr 290 295 300

Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala Val Glu 305 310 315 320

Asp Arg Asp Ser Gin Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys Pro Leu 325 330 335

Asn Gin Gin lie Asp Phe Gin Ala Phe Arg Ala Asn Ala Glu Ser Pro 340 345 350

Arg Arg Pro Ala Ala Ala Ser Pro Ser Pro Val Val Pro Glu Thr Phe 355 360 365

Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu Pro Val Glu 370 375 380

Asp Leu Tyr Tyr Gin Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr Thr Gly Asp 385 390 395 400

Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp Gly Lys Met 405 410 415

Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Phe Glu Arg Thr Arg Glu 420 425 430

Leu Pro Asp Pro Ala Phe Leu Tyr Lys val Val lie Ser Ser Thr Val 435 440 445

Ala Ala Ala Arg Gly Gly Pro Glu Gin Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp 450 455 460

Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His 465 470 475 <210> 9 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VH 5F9 <22 0> <221> misc_feature <222> (62) . . (62) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural <400> 9

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Ser 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Vai Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp He Arg Gin Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Met lie Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Xaa Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Vai Met Vai Thr 100 105 110

Vai Ser Ser 115 <210> 10 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VL 5F9 <4 Ο 0> 10

Asp Vai Vai Leu Thr Gin Thr Pro Vai Ser Leu Ser Vai Thr Leu Gly 15 10 15

Asp Gin Ala Ser Met Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Glu Tyr Ser 20 25 30

Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Trp Phe Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu ILe Tyr Glu Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro ' 50 55 60

Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Vai Glu Pro Glu Asp Leu Gly Vai Tyr Tyr Cys Phe Gin Ala 85 90 95

Thr His Asp Pro .Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 1Í0

Arg

<210> 11 <211> 330 212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> região constante de Ig gama-1 <4 Ο 0> 11

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Phe Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 <30 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr lie Cys Asn Val Asn Hia Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Ly3 85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 1-50

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arq Glu Glu 225 ' 230 235 ' 240

Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255

Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 - 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 12 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> mutante da região constante de Ig gama-1 <4 Ο 0> 12

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 s 10 is

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser val phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met .lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 ISO 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255

Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 26S 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leo Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 13 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> região constante de Ig Kapa

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 15 10 15 <4 Ο 0> 13

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 35 40 45

Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr SO 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 14 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> região constante de Ig Lambda <4 Ο 0> 14

Gin Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 15 10 15

Glu Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu lie Ser Asp Phe 20 25 30

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys 50 55 60

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser 65 10 75 80

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 15 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VH3-48/JH3 FR1 <4 0 0> 15

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 16 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <22 0>

Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <223> VH3-48/JH3 FR2 <4 Ο 0> 16 <210> 17 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VH3-48/JH3 FR3 <4 0 0> 17

Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gin 15 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VH3-49/JH3 FR4 <4 0 0> 18

Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VH3-48/JH4 FR4 <4 Ο 0> 19

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VH3-48/JH6 FR4 <400> 20

Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 21 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VH3-33/JH6 FR! <400> 21

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 22 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VH3-33/JH6 FR2

Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 15 10 <4Ο0> 22 <210> 23 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VH3-33/JH6 FR3 <400> 23

Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 15 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 24 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VH3-23/JH3 FR1 <400> 24

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 25 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VH3-23/JH3 FR2

Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <4Ο0> 25 <210> 26 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VH3-23/JH3 FR3 <400> 26

Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys 20 25 30 <210> 27 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> A18/JK2 FR1 <400> 27

Asp He Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 15 10 15

Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys 20 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> A18/JK2 FR2 <4Ο0> 28

Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu He Tyr 15 10 15 <210> 29 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> A18/JK2 FR3 <400> 29

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 15 10 15

Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> A18/JK2 FR4 <400> 30

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 15 10 <210> 31 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> A17/JK2 FR1

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15 <4Ο0> 31

Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys 20 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> A17/JK2 FR2 <400> 32

Trp Phe Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ser Pro Arg Arg Leu lie Tyr 15 10 15 <210> 33 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> A17/JK2 FR3 <400> 33

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 15 10 15

Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 34 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VH 5F9 <4Ο0> 34

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Ser 15 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Vai Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp lie Arg Gin Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Met He Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Vai Met Vai Thr 100 105 110

Vai Ser Ser 115 <210> 35 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <22 0>

<223> VH 5F9.1-GL

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15 <4Ο0> 35

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Pbe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ser Met lie Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp-Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Met Vai Thr 100 105 110

Vai Ser Ser 115 <210> 36 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VH 5F9.2-GL <400> 36

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly LyS Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Met lie Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 SO

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110

Val Ser Ser 115 <210> 37 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <22 0>

<223> VH 5F9.3-GL

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15 <4Ο0> 37

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Met He Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110

Val Ser Ser 115 <210> 38 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <22 0>

<223> VH 5F9.4-GL

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15 <4Ο0> 38

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Met lie Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr 100 105 110

Val Ser Ser 115 <210> 39 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VH 5F9.5-GL <400> 39

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Met lie Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 1O0 105 110

Val Ser Ser 115 <210> 40 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <22 0>

<223> VH 5F9.6-GL

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15 <4Ο0> 40

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Met lie Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110

Val Ser Ser 115 <210> 41 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <22 0>

<223> VH 5F9.7-GL

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15 <4Ο0> 41

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Gly Net Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ser Met He Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 S0

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Met Vai Thr 100 105 110 val Ser Ser 115 <210> 42 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VH 5F9.8-GL <400> 42

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Met lie Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 ' 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110

Val Ser Ser 115 <210> 43 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <22 0>

<223> VH 5F9.9-GL

Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1'5 10 15 <4Ο0> 43

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ser Met lie Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr 100 . 105 110

Vai Ser Ser 115 <210> 44 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <22 0>

<223> VL 5F9.1-GL <4Ο0> 44

Asp lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 15 10 15

Gin Pro Ale Ser lie Ser Cvs Arg Ser Ser Gin Ser Leu Glu Tyr Ser 20 25 30

Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu lie Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Ala 85 90 95

Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 L10

Arg <210> 45 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VL 5F9.2-GL <400> 45

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15

Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Glu Tyr Ser 20 25 30

Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Trp Phe Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Arg Arg Leu lie Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Ala 85 90 95

Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110

Arg <210> 46 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <22 0>

<223> VL 5F9.3-GL

Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15 <4Ο0> 46

Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Glu Tyr Ser 20 25 30

Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu lie Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Ala 85 90 95

Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110

Arg <210> 47 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VH h5F9.1

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly GJLy Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15 <4Ο0> 47

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ala Met lie Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Met Vai Thr 100 105 110

Vai Ser Ser 115 <210> 48 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VH h5F9.2 <400> 48

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr. 20 25 30

Gly Met Asn Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Met lie Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr 100 105 110

Val Ser Ser 115 <210> 49 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VH h5F9.3

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15 <4Ο0> 49

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ser Met lie Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Met Vai Thr 100 105 110

Vai Ser Ser 115 <210> 50 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VH h5F9.4

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15 <4Ο0> 50

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30

Gly Met Asn Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Met lie Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 .80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Gly Thr Thr Pro Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Met Vai Thr 100 105 110

Vai Ser Ser 115 <210> 51 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VL h5F9.19 <400> 51

Asp Vai Vai Leu Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Leu Gly 15 10 15

Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Glu Tyr Ser 20 25 30

Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Trp Phe Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Arg Leu Leu He Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Ala 85 90 95

Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110

Arg <210> 52 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VL h5F9.20

Asp Vai Vai Leu Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Leu Gly 15 10 15 <4Ο0> 52

Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Glu Tyr Ser 20 25 30

Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Trp Phe Gin Gin Arg Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Glu Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Phe Gin Ala 85 90 95

Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Arg <210> 53 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VL h5F9.21

Asp Val Val Leu Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 <4Ο0> 53

Gin Pro Ala Ser lie ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Glu Tyr ser 20 25 30

Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Trp Ehe Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu lie Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Tie

65 70 73 SO

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Ala 85 90 95

Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu.Tie Lys 100 105 110

Arg <210> 54 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VL h5F9.22 <400> 54

Asp Val Val Leu Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15

Gin Pro'Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Glu Tyr Ser 20 25 30

Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu lie Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Ala B5 90 95

Thr His Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110

Arg <210> 55 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VH 8D1

Glu Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Vai Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 <4Ο0> 55

Ser Vai Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Vai Met His Trp Vai Lys Gin Lys Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr lie lie Pro Tyr Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Arg Asn Glu Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Thr Leu Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 56 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VL 8D1

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Glu 15 10 15 <4Ο0> 56

Glu lie Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp lie Asp Asn Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr His Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Leu Leu He 35 - 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Gin Phe Ser Leu Lys lie Asn Arg Leu Gin He 65 70 75 80

Glu Asp Leu Gly lie Tyr Tyr Cys Leu Gin Gly Tyr lie Pro Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 57 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VH 5F9 CDR HI <400> 57

Asn Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> 58 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VH 5F9 CDR-H2

Met lie Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15 <4Ο0> 58

Gly <210> 59 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VH 5F9 CDR-H3 <400> 59

Gly Thr Thr Pro Asp Tyr 1 5 <210> 60 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VL 5F9 CDR-L1 <400> 60

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Glu Tyr Ser Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu 15 10 15 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VL 5F9 CDR-L2 <4Ο0> 61

Glu Vai Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VL 5F9 CDR-L3 <400> 62

Phe Gin Ala Thr His Asp Pro Leu Thr 1 : 5 <210> 63 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VH 8D1 CDR-H1 <400> 63

Ser Tyr Vai Met His 1 5 <210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VH 8D1 CDR-H2 <4Ο0> 64

Tyr lie lie Pro Tyr Asπ Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1.5 10 15

Gly <210> 65 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VH 8D1 CDR-H3 <400> 65

Ala Arg Arg Asn Glu Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Phe Asp Tyr 1 -5 10 <210> 66 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VL 8D1 CDR-L1 <4 0 0> 6 6

Gin Ala Ser Gin Asp lie Asp Asn Tyr Leu Ala 1 ' 5 10 <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VL 8D1 CDR-L2 <4Ο0> 67

Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> VL 8D1 CDR-L3 <400> 68

Leu Gin Gly Tyr lie Pro Pro Arg Thr 1 5

Lisboa, 2015-10-20

Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo monoclonal compreendendo um domínio de ligação de antigénio, em que o referido anticorpo é capaz de se ligar a um epitopo de uma molécula de RGM, em que o referido domínio de ligação de antigénio compreende um domínio variável da cadeia pesada contendo pelo menos três regiões determinantes de complementaridade e um domínio variável da cadeia leve contendo pelo menor três regiões determinantes de complementaridade, em que as regiões determinantes de complementaridade do domínio variável da cadeia pesada têm a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58 e SEQ ID NO:59 e em que as regiões determinantes de complementaridade do domínio variável da cadeia leve têm a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61 e SEQ ID NO:62.
2. 2. Anticorpo da reivindicação 1, em que o referido anticorpo compreende adicionalmente um esqueleto aceitador humano, em que o referido esqueleto aceitador humano compreende pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 e 33.
3. 3. Anticorpo da reivindicação 1 ou 2 , em que o domínio variável da cadeia pesada tem a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de: SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 47, 48, 49 e 50.
4. 4. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o domínio variável da cadeia leve tem a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 44, 45, 46, 51, 52, 53 e 54.
5. 5. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o anticorpo é um anticorpo quimérico, um anticorpo com enxerto de CDR, um anticorpo humanizado, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo com especificidade dupla ou um anticorpo biespecífico.
6. 6. Fragmento de ligação de antigénio do anticorpo monoclonal de qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
7. 7. Ácido nucleico isolado que codifica o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação de antigénio de qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
8. 8. Vetor compreendendo o ácido nucleico isolado da reivindicação 7.
9. 9. Célula hospedeira compreendendo o vetor da reivindicação 8 .
10. 10. Método de produzir o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação de antigénio de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o método compreende cultivar a célula hospedeira da reivindicação 9 no meio de cultura em condições suficientes para produzir o anticorpo ou o fragmento de ligação de antigénio.
11. 11. Composição farmacêutica compreendendo o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação de antigénio de qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e um transportador farmaceuticamente aceitável.
12. 12. Uso do anticorpo monoclonal ou do fragmento de ligação de antigénio de qualquer uma das reivindicações 1 a 6 na preparação de um medicamento para tratar uma doença neurológica que é selecionada do grupo que consiste de esclerose lateral amiotrófica, lesão do plexo braquial, lesão cerebral, incluindo lesão de traumatismo craniano, paralisia cerebral, Guillain Barre, leucodistrofias, esclerose múltipla, pós-pólio, espinha bifida, lesão da espinal medula, atrofia do músculo espinal, tumores espinais, AVC, mielite transversa; demência, demência senil, dificuldades cognitivas moderadas, demência relacionada com Alzheimer, coreia de Huntington, discinesia tardia, hipercinesias, manias, doença de Parkinson, sindrome de Steel-Richard, sindrome de Down, miastenia grave, traumatismo dos nervos, amiloidose vascular, hemorragia cerebral I com amiloidose, inflamação cerebral, doença de confusão aguda, esclerose lateral amiotrófica, glaucoma e doença de Alzheimer.
13. 13. Anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação de antigénio de qualquer uma das reivindicações 1 a 6 para uso no tratamento de esclerose múltipla. Lisboa, 2015-10-20