PT2114993E - Vacina - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "VACINA" A presente invenção refere-se a uma proteína de fusão compreendendo um antigénio derivado do denominado antigénio PRAME de rejeição tumoral (também conhecido por DAGE), ligado a um parceiro de fusão imunológico derivado de proteína D de Haemophilus influenzae B, métodos para a sua preparação e para a formulação de vacinas e sua utilização para o tratamento de uma gama de cancros, incluindo mas não limitados a, melanoma, mama, bexiga, cancro do pulmão, tal como NSCLC, sarcoma, cancro do ovário, cancro da cabeça e pescoço, cancro renal, carcinoma colorrectal, mieloma múltiplo, leucemia, incluindo leucemia aguda, e carcinoma esofágico.

Entre os diferentes grupos de antigénios associados a tumor, os antigénios de cancro do testículo são de interesse para imunoterapia, devido à sua ampla expressão tumoral específica e ao facto de que, em geral, estes antigénios não são expressos em células saudáveis. Até agora, foram descritos mais de 50 antigénios de cancro/testículo e, para muitos deles, foram identificados os epitopos reconhecidos por linfócitos T. O PRAME é um antigénio de cancro do testículo e está sob investigação como uma potencial imunoterapia.

Na imunoterapia, o antigénio de cancro é introduzido no doente, habitualmente como uma vacina, por exemplo, contendo um antigénio como uma proteína ou um seu fragmento imunogénico, ou como ADN codificando para a proteína ou como um vector contendo 1 o referido ADN, que estimula o sistema imunitário do doente a atacar tumores expressando o mesmo antigénio.

Se a resposta apropriada for estimulada, os linfócitos T (células T) atacam os antigénios directamente e proporcionam controlo da resposta imunitária. Desenvolvem-se células B e células T que são específicas para um tipo de antigénio. Quando o sistema imunitário é exposto a um antigénio diferente, são formadas células B e células T diferentes. À medida que os linfócitos se desenvolvem aprendem, normalmente, a reconhecer os tecidos do próprio corpo (próprios) como diferentes de tecidos e partículas não encontrados normalmente no corpo (não próprios). Uma vez formadas as células B e células T, algumas dessas células irão multiplicar-se e proporcionar "memória" para o sistema imunitário. Isto permite que o sistema imunitário responda mais rapidamente e mais eficientemente da próxima vez que for exposto ao mesmo antigénio.

Determinadas experiências parecem indicar que os antigénios de cancro do testículo podem estimular os mecanismos de memória no sistema imunitário. É admitida a hipótese, por alguns, que o PRAME está envolvido na morte celular ou ciclos celulares. Foi demonstrado por alguns grupos que é expresso em melanoma e uma ampla variedade de tumores incluindo pulmão, rim e cabeça e pescoço. De modo interessante, também parece ser expresso em 40-60% das leucemias, tais como leucemia linfóide aguda e leucemia mielóide aguda, ver, por exemplo, Exp Hematol. Dez. de 2000; 28(12):1413-22. Em doentes, foi observado que a sobreexpressão de PRAME parece estar associada a taxas superiores de 2 sobrevivência e taxas inferiores de recidiva, em comparaçao com os que não sobreexpressam a proteína. 0 antigénio e sua preparação são descritos na patente US N° 5830753. O PRAME encontra-se na Base de Dados Genética

Humana Anotada, H-Inv DB, sob os números de acesso : U65011.1, BC022008.1, AK129783.1, BC014974.2, CR608334.1, AF 025440.1, CR591755.1, BC039731.1, CR623010.1, CR611321.1, CR618501.1, CR60 4 7 72.1, CR456549.1 e CR620272.1. A proteína D é uma proteína de superfície da bactéria Gram-negativa, Haemophilus influenza B. A informação sobre os parceiros de fusão imunológicos derivados da proteína D pode ser obtida do documento WO 91/18926.

As proteínas de fusão de uma porção de um antigénio e um parceiro de fusão heterólogo são, por vezes, preparadas para aumentar a imunogenicidade do antigénio e/ou auxiliar na produção da proteína em quantidades apropriadas e/ou pureza, ver, por exemplo, o documento WO 99/40188 que descreve uma proteína de fusão de MAGE e, por exemplo, a proteína D de uma proteína de superfície da bactéria gram-negativa, Haemophilus influenza B. A proteína de fusão é preparada de modo recombinante e a sequência de secreção de proteína D pode ser incorporada dentro da proteína de fusão para, potencialmente, auxiliar a secreção e solubilização do produto final.

O documento WO00/50077 descreve um número de imunogénios peptídicos ligados a um veículo, em que o veículo é derivado da Proteína D de Haemophilius Influenzae ou seus fragmentos. O documento WO99/10375 descreve proteínas de fusão de Papilomavírus Humano (HPV), ligadas a um parceiro de fusão 3 imunológico que proporciona epitopos auxiliares T ao antigénio de HPV.

Breve Descrição das Figuras e Construções/Seguências

Figura 1 Análise de SDS-page da Construção 3 e 4 Figura 2 Análise de SDS-page da Construção 3a e 4a Figura 3 Resposta de CD4 (adjuvante AS01B) Figura 4 Resposta de CD8 (adjuvante AS01B - 20070499) Figura 5 Resposta de CD4 (adjuvante AS15) Figura 6 Resposta de CD8 (adjuvante 15) Figura 7 Uma sequência de aminoácidos marcada dos exemplos das construções da presente invenção Figura 8 Alinhamento entre LipoD-MAGE3-His (SEQ ID N°: 43) e pDl/3-PRAME-His (SEQ ID N°: 10) Figura 9 Alinhamento entre a sequência partilhada da proteína D original de Haemophilus influenzae (SEQ ID N°: 45) e a LipoD-MAGE3-His (SEQ ID N°: 43) Figura 10 Alinhamento entre a sequência partilhada da proteína D original de Haemophilus influenzae (SEQ ID N°: 41), a pD-MAGE3-His (SEQ ID N°: 45) e uma construção de pDl/3-PRAME-His que não inclui os aminoácidos 2-D e 3-P (SEQ ID N°: 44) Figura 11 Análise de SDS page de pDl/3-PRAME com ou sem sinal de secreção (SS) e cauda de His (His) no vector pET21. 4

Figura 12 Sequência da proteína D 1/3 MAGE-A3-His (SEQ ID N°: 44) Construção 1 MDP- 20-127 - Proteína D - PRAME - TSGHHHHHH (Exemplo 1) (plasmídeo TCMP14) (sequência nucleotídica SEQ ID N°: 1; sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 2) Construção 2 MDP- 20-127 - Proteína D - PRAME - sem cauda de (Exemplo 2) His (plasmídeo TCMP 14) (sequência nucleotídica SEQ ID N°: 3; sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 4) Construção 3 MDP- 20-127 - Proteína D - PRAME - LEHHHHHH (Exemplo 3) (plasmídeo pET21) (sequência nucleotídica SEQ ID N°: 5; sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 6) Construção 4 MDP- 20-127 - Proteína D - PRAME - sem cauda de (Exemplo 4) His (plasmídeo pET21) (sequência nucleotídica SEQ ID N°: 7; sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 8) Construção 3a MDP- 20-127 - Proteína D - PRAME - HHHHHH (Exemplo 3a) (plasmídeo pET26) (sequência nucleotídica SEQ ID N°: 9; sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 10) Construção 4a MDP- 20-127 - Proteína D - PRAME - sem cauda de (Exemplo 4a) His (plasmídeo pET26) (sequência nucleotídica SEQ ID N°: 11; sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 12) Sequência 1 é a sequência de ADN para o Exemplo 1 (SEQ ID N°: 1) Sequência 2 é a sequência de aminoácidos para o Exemplo 1 (SEQ ID N°: 2) 5

Sequência 3 (SEQ ID N°: 3) é a sequência de ADN para o Exemplo 2 Sequência 4 (SEQ ID N°: 4) é a sequência de aminoácidos para o Exemplo 2 Sequência 5 (SEQ ID N°: 5) é a sequência de ADN para o Exemplo 3 Sequência 6 (SEQ ID N°: 6) é a sequência de aminoácidos para o Exemplo 3 Sequência 7 (SEQ ID N°: 7) é a sequência de ADN para o Exemplo 4 Sequência 8 (SEQ ID N°: 8) é a sequência de aminoácidos para o Exemplo 4 Sequência 9 (SEQ ID N°: 9) é a sequência de ADN, codão-optimizada, para o Exemplo 3a Sequência 10 (SEQ ID N°: 10) é a sequência de aminoácidos para o Exemplo 3a Sequência 11 (SEQ ID N°: 11) é a sequência de ADN, codão-optimizada, para o Exemplo 4a Sequência 12 (SEQ ID N°: 12) é a sequência de aminoácidos para o Exemplo 4a SEQ ID N°: 13 VLDGLDVLL (PRA100~108) SEQ ID N°: 14 SLYSFPEPEA (PRA142~151) SEQ ID N°: 15 ALYVDSLFFL (PRA300~309 ) SEQ ID N°: 16 LYVDSLFFL (PRA301~309 ) SEQ ID N°: 17 SLLQHLIGL (PRA425~433 ) SEQ ID N°: 18 a 35 Oligonucleótidos utilizados nos exemplos da presente invenção SEQ ID N°: 36 TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826;) 6 SEQ ID N°: 37 TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) SEQ ID N°: 38 ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006) SEQ ID N°: 39 TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668) SEQ ID N°: 40 TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456) SEQ ID N°: 41 AA 1 a 127 da Proteína D de Haemophilus Influenzae SEQ ID N°: 42 1-Met; 2-Asp; 3-Pro; seguido de AA 20 a 127 de Proteína D SEQ ID N°: 43 Sequência de aminoácidos da proteína D 1/3-MAGE-A3 -His SEQ ID N°: 44 Aminoácidos da proteína D de Haemophilus influenzae para utilização numa sequência pDl/3-PRAME-His SEQ ID N°: 45 Aminoácidos da proteína D de Haemophilus influenzae para utilização numa sequência pDl/3-MAGE-His

Sumário da invenção A presente invenção proporciona uma proteína de fusão compreendendo: a) PRAME; b) um parceiro de fusão heterólogo derivado da proteína D, em que a proteína de fusão compreende os aminoácidos 20 a 127 da proteína D; e 7 c) os aminoácidos adicionais Met-Asp-Pro na extremidade N-terminal da sequência de proteína de fusão, em que a proteína parceira de fusão heteróloga derivada da proteína D (b) está fundida ao N-terminal de PRAME.

Parece que para as proteínas de fusão compreendendo PRAME ou um seu fragmento imunogénico e proteína D, ou para proteínas de fusão compreendendo proteína D, ou para uma proteína parceira de fusão compreendendo a proteína D, que a presença da sequência de secreção (ou sequência sinal) pode afectar de modo nocivo a quantidade de proteína de fusão produzida.

PRAME

Num aspecto, a proteína de fusão da presente invenção compreende uma proteína parceira de fusão, como aqui descrito, e um antigénio PRAME ou um seu fragmento imunogénico. Em geral, a proteína PRAME tem 509 aminoácidos e, numa forma de realização, todos os 509 aminoácidos de PRAME podem ser utilizados. Vários epitopos citotóxicos de linfócito T (CTL) foram identificados em PRAME, por exemplo: VLDGLDVLL (PRA100-108 ; SEQ ID N° : 13); SLYSFPEPEA (PRA142-151; SEQ ID N° : 14); ALYVDSLFFL (PRA300-309 ; SEQ ID N° : 15); LYVDSLFFL (PRA301-309 ; SEQ ID N° : 16) e SLLQHLIGL (PRA425-433 ; SEQ ID N° : 17).

Em geral, é desejável incluir no antigénio tantos epitopos destes quanto possível, para gerar uma forte resposta imunitária e garantir que o antigénio seja tão imunogénio quanto possível. Todavia, pode ser possível compensar para uma imunogenicidade inferior de uma dada construção pelo emprego de uma formulação com um potente adjuvante imunológico. Os adjuvantes fortes são discutidos abaixo em mais detalhe.

Num aspecto, a invenção proporciona a porção de PRAME da proteína de fusão compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente de, uma proteína de tamanho total.

Contudo, a invenção também se estende a construções de PRAME com substituições conservadoras. Numa forma de realização, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais aminoácidos podem ser substituídos. A construção de PRAME, como aqui descrito, pode conter, além disso ou em alternativa, deleções ou inserções na sequência de aminoácidos, em comparação com a sequência de PRAME de tipo selvagem. Numa forma de realização, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais aminoácidos podem ser inseridos ou eleminados.

As substituições conservadoras são bem conhecidas e são, em geral, implementadas como matrizes de pontuação predefinidas em programas de computador de alinhamento de sequências. Estes programas incluem PAM250 (Dayhoft M.O. et al., (1978), "A model of evolutionary changes in proteins", Em "Atlas of Protein sequence and structure" 5(3) M.O. Dayhoft (ed.), 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington e Blosum 62 (Steven Henikoft e Jorja G. Henikoft (1992), "Amino acid substitution matricies from protein blocks"), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919. 9

Em termos gerais, as substituições dentro dos seguintes grupos são substituições conservadoras, mas as substituições entre grupos são consideradas não conservadas. Os grupos são: i) Aspartato/asparagina/glutamato/glutamina ii) Serina/treonina iii) Lisina/arginina iv) Fenilalanina/tirosina/triptofano v) Leucina/isoleucina/valina/metionina vi) Glicina/alanina

Em geral, a sequência de PRAME/aminoácidos utilizada na proteína de fusão da invenção será mais de 80%, tal como 85, 90, 95 e, de um modo mais específico, 99% idêntica ao PRAME de ocorrência natural. Contudo, os especialistas na técnica estão conscientes de que os resíduos de aminoácidos gerados como resultado do processo de clonagem podem ser retidos em proteínas sintetizadas de modo recombinante. Se estes não afectarem de modo nocivo as características do produto, é opcional se são ou não removidos.

Num aspecto, a invenção proporciona uma proteína de fusão, como aqui descrito, compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente de uma proteína de PRAME de tamanho total. Num aspecto adicional, a porção de PRAME da proteína de fusão da presente invenção compreende, consiste ou consiste essencialmente de um ou mais dos seguintes epitopos:

VLDGLDVLL (PRA 100-108

SLYSFPEPEA (PRA 142-151 . ALYVDSLFFL (PRA' 300-309 . LYVDSLFFL (PRA' 301-309 . ; SEQ ID N°: 13); S1; SEQ ID N° : 14) ; 19; SEQ ID N° : 15) ; ; SEQ ID N°: 16) e 10

SLLQHLIGL (PRA 425-433 ; SEQ ID N° : 17) .

As proteínas de fusão do antigénio PRAME e proteína parceira de fusão de proteína D, como aqui descritas, são, de um modo preferido, expressas como proteínas de fusão recombinantes, que podem permitir que sejam produzidos níveis aumentados de proteína de PRAME num sistema de expressão, em comparação com PRAME isoladamente, sem parceiro de fusão, tais como proteínas de proteína D ou proteína D modificada.

As proteínas de fusão da presente invenção, como aqui descritas, podem, além disso, compreender uma ou mais sequências ligantes entre a proteína parceira de fusão e o antigénio tumoral ou sua porção imunogénica; ou entre a proteína parceira de fusão e uma cauda His ou outra cauda de afinidade (se presente); ou entre o antigénio tumoral ou sua porção imunogénica e uma cauda His ou outra cauda de afinidade (se presente). Os aminoácidos nas sequências ligantes podem não ser relacionados com as sequências do antigénio e/ou parceiro de fusão. 0 parceiro de fusão pode auxiliar na expressão da proteína (estimulador de expressão), com rendimentos mais elevados do que a proteína recombinante nativa. A proteína D parceira de fusão, devido à sua natureza estranha, pode ser particularmente imunogénica in vivo e auxiliar a proteína de fusão compreendendo PRAME, proporcionando epitopos auxiliares T, de um modo preferido, epitopos auxiliares T reconhecidos por células T CD4. Considera-se que essas células T CD4 possam contribuir para a geração de uma resposta imunitária favorável, em particular uma resposta de célula T citolítica CD8. 11

Numa forma de realização, o parceiro de fusão pode actuar como um parceiro melhorando a expressão e um parceiro de fusão imunológico.

Num aspecto, a invenção proporciona uma proteína de fusão, em que a porção N-terminal da proteína D (como descrito acima ou aqui) está fundida ao N-terminal de PRAME. De um modo mais específico, a fusão com o fragmento de proteína D e a terminação N de PRAME é efectuada de modo a que o PRAME substitua o fragmento C-terminal da proteína D que tenha sido excisado. Deste modo, a terminação N da proteína D torna-se na terminação N da proteína de fusão.

As proteínas de fusão da invenção podem incluir uma cauda de afinidade, tal como, por exemplo, uma cauda de histidina, compreendendo entre 5 a 9, tal como 6 resíduos de histidina.

Estes resíduos podem, por exemplo, estar na porção terminal da proteína D (tal como a terminação N da proteína D) e/ou podem estar fundidos à porção terminal do antigénio PRAME ou seu derivado, ou do antigénio tumoral ou seu derivado, como aqui descrito. Contudo, em geral, a cauda de histidina estará localizada na porção terminal do antigénio PRAME ou seu derivado, ou do antigénio tumoral ou seu derivado, como aqui descrito, tal como a extremidade C-terminal do antigénio PRAME ou seu derivado, ou do antigénio tumoral ou seu derivado, como aqui descrito. As caudas de histidina podem ser vantajosas no auxílio da purificação. A presente invenção também proporciona um ácido nucleico codificando as proteínas da presente invenção. Essas sequências podem ser inseridas dentro de um vector de expressão adequado e utilizadas para vacinação de ADN/ARN ou expressas num hospedeiro 12 adequado. Os vectores microbianos expressando o ácido nucleico podem ser utilizados como vacinas. Esses vectores incluem, por exemplo, poxvírus, adenovirus, alfavirus, listeria e monofago.

Uma sequência de ADN codificando as proteínas da presente divulgação pode ser sintetizada utilizando técnicas de síntese de ADN padrão, tais como por ligação enzimática, como descrito por D.M. Roberts et al. em Biochemistry 1985, 24, 5090-5098, por polimerização enzimática in vitro ou por tecnologia de PCR utilizando, por exemplo, uma polimerase termoestável ou por uma combinação destas técnicas. A polimerização enzimática de ADN pode ser efectuada in vitro utilizando uma ADN polimerase, tal como ADN polimerase I (fragmento de Klenow), num tampão apropriado contendo os trifosfatos nucleósidos dATP, dCTP, dGTP e dTTP, como requerido, a uma temperatura de 10°-37 °C, em geral num volume de 50 pL ou menos. A ligação enzimática de fragmentos de ADN pode ser efectuada utilizando uma ADN ligase, tal como T4 ADN ligase, num tampão apropriado, tal como Tris a 0,05 M (pH 7,4), MgCl2 a 0,01 M, ditiotreitol a 0,01 M, espermidina a 1 mM, ATP a 1 mM e albumina de soro bovino a 0,1 mg/mL, a uma temperatura de 4 °C até ambiente, em geral num volume de 50 mL ou menos. A síntese química do polímero ou fragmentos de ADN pode ser efectuada por química convencional de fosfotriéster, fosfito ou fosforamidito, utilizando técnicas de fase sólida, tal como as descritas em "Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual" (ed. H.G. Gassen e A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982), ou noutras publicações científicas, por exemplo M.J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B.S. Sproat e R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S. Sproat e W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D. 13

Matteucci e M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D. Matteucci e M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P. Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus e H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; e H.W.D. Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801. O processo da invenção pode ser realizado por técnicas recombinantes convencionais, tal como descrito em Maniatis et ai., Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989.

Em particular, o processo pode compreender as etapas de: i) preparação de um vector de expressão replicável ou de integração capaz, numa célula hospedeira, da expressão de um polímero de ADN compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica a proteína ou um seu derivado imunogénico; ii) transformação de uma célula hospedeira com o referido vector; iii) cultivo da referida célula hospedeira transformada, sob condições permitindo a expressão do referido polímero de ADN, para produzir a referida proteína; e iv) recuperação da referida proteína. O termo "transformação" é aqui utilizado para significar a introdução de ADN estranho dentro de uma célula hospedeira. Isto pode ser alcançado, por exemplo, por transformação, transfecção ou infecção com um vector plasmídico ou virai apropriado, utilizando, e. g. , técnicas convencionais, como descrito em 14

Genetic Engineering; Ed. S.M. Kingsman e A.J. Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, Inglaterra, 1988. 0 termo "transformado" ou "transformante" será, a seguir, aplicado à célula hospedeira resultante contendo e expressando o gene estranho de interesse.

Os vectores de expressão são novos e também formam parte da invenção.

Os vectores de expressão replicáveis podem ser preparados de acordo com a invenção, pela clivagem de um vector compatível com a célula hospedeira, para proporcionar um segmento de ADN linear tendo um replicão intacto e combinação do referido segmento linear com uma ou mais moléculas de ADN que, juntamente com o referido segmento linear, codificam o produto desejado, tal como o polímero de ADN codificando a proteína da invenção ou seu derivado, sob condições de ligação.

Deste modo, o polímero de ADN pode ser pré-formado ou formado durante a construção do vector, como desejado. A escolha do vector será determinada, em parte, pela célula hospedeira, que pode ser procariótica ou eucariótica mas é, em geral, E. coli ou células CHO. Os vectores adequados podem incluir plasmídeos, por exemplo, TMCP14 ou pET21 ou pET26, pcDNA3, bacteriófagos, cosmídeos e vírus recombinantes. A preparação do vector de expressão replicável pode ser efectuada de modo convencional, com enzimas apropriadas para restrição, polimerização e ligação do ADN, por processos descritos em, por exemplo, Maniatis et al., citado acima. 15 A célula hospedeira recombinante é preparada, de acordo com a invenção, pela transformação de uma célula hospedeira com um vector de expressão replicável da invenção, sob condições de transformação. As condições de transformação adequadas são convencionais e são descritas em, por exemplo, Maniatis et al., citado acima, ou "DNA Cloning" Vol. II, D.M. Glover ed., IRL Press Ltd, 1985. A escolha de condições de transformação é determinada pela célula hospedeira. Deste modo, um hospedeiro bacteriano, tal como E. coli, pode ser tratado com uma solução de CaCl2 (Cohen et al., Proc. Nat. Acad. Sei., 1973, 69, 2110) ou com uma solução compreendendo uma mistura de RbCl, Μη012, acetato de potássio e glicerol e, depois, com ácido 3-[N-morfolino]-propano-sulfónico, RbCl e glicerol. As células de mamífero em cultura podem ser transformadas por co-precipitação com cálcio do ADN de vector nas células. A invenção também se estende a uma célula hospedeira transformada com um vector de expressão replicável da invenção. O ADN pode ser codão-optimizado por técnicas padrão para facilitar, ainda, a expressão do hospedeiro relevante. Numa forma de realização da presente invenção, é proporcionado ADN codificando uma proteína de fusão compreendendo um antigénio FRAME ou sua porção ou fragmento, como aqui descrito, no qual a sequência nucleotídica do antigénio PRAME ou sua porção ou fragmento, é codão-optimizada. Numa forma de realização, a sequência nucleotídica de proteína D não é codão-optimizada. O cultivo da célula hospedeira transformada, sob condições permitindo a expressão do polímero de ADN, é efectuado de modo convencional, como descrito em, por exemplo, Maniatis et al. e 16 "DNA Cloning", citado acima. Deste modo, de um modo preferido, a célula é provida com nutriente e cultivada a uma temperatura abaixo de 50 °C.

As proteínas da presente invenção podem ser expressas em procariotas ou eucariotas, tal como levedura, mas são, frequentemente, expressas em E. coli. Podem ser empregues estirpes particulares de E. coli, tais como AR58 e BLR DE3 . Em geral, um marcador de selecçao de, por exemplo, resistência a canamicina ou resistência a ampicilina, é incorporado para facilitar a identificação da incorporação bem-sucedida do gene recombinante/construção dentro do sistema de expressão. 0 produto é recuperado por métodos convencionais, de acordo com a célula hospedeira e de acordo com a localização do produto de expressão (intracelular ou segregado para dentro do meio de cultura ou para dentro do periplasma celular). Numa forma de realização da presente invenção, o produto de expressão é intracelular. Numa forma de realização da presente invenção, o produto de expressão é uma proteína insolúvel. Deste modo, onde a célula hospedeira é bacteriana, tal como E. coli, pode, por exemplo, ser lisada fisicamente, quimicamente ou enzimaticamente e o produto de proteína isolado do lisado resultante. Onde a célula hospedeira é de mamífero, o produto pode ser, em geral, isolado do meio nutriente ou de extractos isentos de células. As técnicas convencionais de isolamento de proteína incluem precipitação selectiva, cromatografia de adsorção e cromatografia de afinidade, incluindo uma coluna de afinidade de anticorpo monoclonal. 17

Numa forma de realização da invenção, é proporcionado um processo para a produção de uma proteína de fusão, como aqui descrito, compreendendo a etapa da expressão, numa célula, de uma proteína de fusão compreendendo uma proteína parceira de fusão, como aqui descrito. A célula pode ser uma bactéria. Numa forma de realização na qual a célula é uma bactéria, a bactéria pode ser E. coli. 0 processo da presente invenção pode compreender a etapa da expressão de uma proteína de fusão, como aqui descrito, numa célula, como uma proteína insolúvel. 0 processo pode, ainda, compreender a etapa de lise da célula e purificação da proteína de fusão expressa a partir das células lisadas.

Numa forma de realização da invenção, é proporcionada uma proteína de fusão, obtida ou obtenível por um método ou processo aqui descrito.

As proteínas da presente invenção são proporcionadas solúveis, numa forma líquida ou numa forma liofilizada.

Em geral, é esperado que cada dose humana compreenda 1 a 1000 pg de proteína e, de um modo preferido, 30 - 300 pg. A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica, tal como vacina, compreendendo uma proteína de fusão da presente invenção num excipiente farmaceuticamente aceitável. A vacina pode, opcionalmente, conter um ou vários outros antigénios ou polipéptidos associados a tumor ou, de um modo preferido, ser combinada com outras vacinas de cancro baseadas num antigénio associado a tumor. Por exemplo, estes antigénios 18 associados a tumor, poderiam ser antigénios como aqui descritos e/ou podem ser membros pertencendo às famílias MAGE, LAGE e GAGE ou WT-l. Numa forma de realização, o antigénio associado a tumor pode compreender ou consistir no antigénio MAGE-A3. A preparação vacinai é, em geral, descrita em Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (ed. Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press, Nova Iorque). A encapsulação dentro de lipossomas é descrita por Fullerton, Patente US 4235877.

As proteínas da presente invenção podem ser, de um modo preferido, com adjuvante na formulação vacinai da invenção. Os adjuvantes adequados podem incluir um sal de alumínio, tais como gel de hidróxido de alumínio (alum) ou fosfato de alumínio, mas também podem ser um sal de cálcio, ferro ou zinco ou podem ser uma suspensão insolúvel de tirosina acilada ou açúcares acilados, polissacáridos cationicamente ou anionicamente derivatizados, ou polifosfazenos. Outros adjuvantes conhecidos incluem oligonucleótidos contendo CpG. Os oligonucleótidos são caracterizados por o dinucleótido CpG ser não metilado. Esses oligonucleótidos são bem conhecidos e são descritos, por exemplo, no documento WO 96/02555.

Na formulação das invenções, pode ser desejável que a composição de adjuvante induza uma resposta imunitária, de um modo preferido, do tipo TH1. Numa forma de realização, é proporcionado um sistema adjuvante incluindo, por exemplo, uma combinação de monofosforil-lípido A, de um modo preferido monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL), juntamente com um sal de alumínio. O adjuvante pode, opcionalmente, também 19 incluir oligonucleót idos CpG para a indução, de um modo preferido, de uma resposta de TH1.

Um sistema melhorado que pode ser utilizado na presente invenção compreende a combinação de monofosforil-lipido A e um derivado de saponina, particularmente a combinação de QS21 e 3D-MPL, como divulgado no documento WO 94/00153, ou, por exemplo, uma composição menos reactogénica, onde o QS21 é neutralizado com colesterol, como divulgado no documento WO 96/33739.

Uma formulação que pode ser utilizada em formulações da presente invenção, compreendendo QS21 3D-MPL e tocoferol, por exemplo, numa emulsão de óleo em água, é descrita no documento WO 95/17210.

Outra formulação de adjuvante que pode ser utilizada em formulações da presente invenção é QS21, 3D-MPL e CpG ou seu equivalente, por exemplo, numa emulsão de óleo em água ou como uma formulação lipossomal.

Consequentemente, numa forma de realização da presente invenção, é proporcionada uma vacina compreendendo uma proteína de fusão ou proteína parceira de fusão, como aqui descrito, e um adjuvante, por exemplo como descrito acima.

Combinação de PRAME e MAGE

Numa forma de realização da presente invenção, é proporcionada uma composição compreendendo (a) um componente de antigénio compreendendo um antigénio PRAME ou proteína de fusão, 20 como aqui descrito, e (b) um componente de antigénio compreendendo um antigénio MAGE ou proteina de fusão, como aqui descrito. Numa forma de realização, a composição pode, ainda, compreender um adjuvante, como aqui descrito. 0 antigénio MAGE, para utilização na combinação, pode compreender o antigénio MAGE de tamanho total. Alternativamente, o antigénio MAGE pode compreender uma porção imunogénica de MAGE, na qual 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos podem ser eleminados ou substituídos na sequência de aminoácidos. Numa forma de realização da presente invenção, 2 aminoácidos podem ser eleminados da terminação N da sequência de MAGE. Numa forma de realização da presente invenção, na qual o antigénio é MAGE-A3 ou uma sua porção imunogénica, a sequência de MAGE-A3 pode ser desde o aminoácido 3 até 314 de MAGE-A3.

Para a combinação descrita acima, um ou ambos dos antigénios PRAME e/ou MAGE podem ser parte de uma proteína ou proteínas de fusão, como aqui descrito, ou os antigénios podem estar presentes noutras proteínas de fusão ou podem estar presentes apenas como antigénio.

Numa forma de realização da presente invenção, é proporcionada uma composição compreendendo uma proteína de fusão compreendendo um antigénio PRAME e proteína parceira de fusão, como aqui descrito, e uma proteina de fusão compreendendo um antigénio MAGE-A3 e proteína parceira de fusão, como aqui descrito. Numa forma de realização alternativa, a proteína de fusão compreendendo o antigénio MAGE-A3 compreende ou consiste no antigénio MAGE-A3 e uma proteína parceira de fusão compreendendo, aproximadamente, os primeiros 109 aminoácidos de proteína D, na qual um ou dois ou mais aminoácidos da proteína D 21 estão, opcionalmente, substituídos e na qual a sequência sinal da proteína D está, opcionalmente, presente, além dos primeiros 109 aminoácidos da proteína D.

As proteínas de fusão da presente invenção podem, ainda, de um modo opcional, compreender um ou mais aminoácidos como "ligantes" entre as sequências do antigénio e a proteína parceira de fusão ou entre o antigénio e uma cauda de His, se presente. Os aminoácidos podem não ser relacionados com as sequências do antigénio e/ou parceiro de fusão.

As proteínas de fusão da presente invenção, como aqui descrito, podem ainda compreender os aminoácidos Met-Asp-Pro na extremidade N-terminal da sequência da proteína de fusão. O aminoácido Met pode ser da sequência da proteína D original ou pode ser de uma sequência não relacionada.

Numa forma de realização, a sequência de uma proteína de fusão compreendendo MAGE-A3 e proteína D, para utilização na presente invenção, é mostrada na Figura 12 e SEQ ID N°: 43. A presente invenção também se estende a métodos de preparação das referidas vacinas/composições.

EXEMPLOS

Foram preparadas quatro construções de fusão e serão aqui referidas como Exemplos/construções 1, 2, 3 e 4. A partir do exemplo 3, foi preparada uma construção codão-optimizada e é aqui designada como exemplo 3a. A partir do exemplo 4, foi 22 preparada uma construção codao-optimizada e é aqui designada como exemplo 4a.

Nos Exemplos 3a e 4a, a sequência a respeito da porção da proteína D da molécula é a mesma. Contudo, determinados codões na região de PRAME foram modificados para melhorar, ainda, a expressão e, no Exemplo 3a, o ligante entre PRAME e a cauda de his foi removido. 23 TABELA A Estruturas de Proteína de Fusão e Detalhes de Plasmideo dos

Exemplos/Construções 1 a 4. N-terminal------------------------------------------------C Terminal

Exemplo/ Construção N° aminoácidos inseridos pelo processo de clonagem parceiro de fusão antigénio de cancro Seq. de aminoácidos de Ligante/cauda de His plasmideo utilizado 1 MDP 20-127 PRAME TSGHHHHHH proteína D TCMP 14 2 MDP 20-127 PRAME proteína D TCMP14 3 MDP 20-127 PRAME LEHHHHHH proteína D pET21 4 MDP 20-127 PRAME proteína D pET21 3a MDP 20-127 PRAME HHHHHH proteína D pET26 4a MDP 20-127 PRAME proteína D pET26

As proteínas de fusão dos exemplos acima compreendem os aminoácidos 20-127 de proteína D. Os aminoácidos Met, Asp e Pro foram incluídos na terminação N do fragmento da proteína D (i. e., aminoácidos MDP-20-127 da Proteína D). Considera-se que estes três aminoácidos adicionais podem auxiliar na estabilidade da proteína e/ou aumentar o nível da sua expressão de proteína. O aminoácido 127 da proteína D está fundido ao N-terminal do PRAME de tamanho total (i. e., o aminoácido 12 7 da proteína D está fundido ao N-terminal de PRAME). Uma cauda de histidina, para auxiliar a purificação, foi incluída em três das seis proteínas. A sequência exacta da cauda está dependente do plasmídeo utilizado.

Foram construídos três tipos de plasmídeos diferentes, TCMP14 e pET21 ou pET26: para cada plasmídeo, ADN codificando para proteína de fusão foi incluído com e sem uma cauda de histidina.

Salvo referido em contrário, na preparação de cada dos exemplos foi utilizada a estratégia geral abaixo.

Estratégia de clonagem para a geração da proteína recombinante PD1/3—PRAME (com ou sem cauda de His) utilizando o vector TCMP14:

A amplificação das sequências apresentadas no plasmídeo TCMP14 foi feita utilizando uma estratégia de PCR de três etapas. O vector pHIC348, contendo a sequência de ADN

codificando o gene de proteína D integral foi obtido do Dr. A. Forsgren, Departamento de Microbiologia Médica, Universidade de Lund, Malmõ General Hospital, Malmõ, Suécia. A sequência de ADN 25 da proteína D foi publicada por Janson et al., (1991) {Janson H, LO Heden, A Grubb, M Ruan, & A Forsgren. 1991. Infect Immun 59:119-125}. O vector de expressão pMG81 é um derivado de pBR322, no qual foram introduzidos os elementos de controlo derivados do bacteriófago λ para transcrição e tradução de genes estranhos inseridos (Shatzman et al. , 1983) {Shatzman A, YS Ho, & M Rosenberg. 1983. Experimental Manipulation of Gene Expression. Inouya (ed) p. 1-14. Academic N.I.}. Além disso, o gene de resistência a Ampicilina foi trocado com o gene de resistência a Canamicina. A sequência codificante para a porção da proteína NS1 (aminoácido 4 a 81) foi substituída por um sitio de múltipla clonagem para se obter pMG81 MCS. A sequência codificante para a 1/3 da proteína D (aminoácido 20 a 127) foi clonada dentro de pMG81 MCS, utilizando os sítios de restrição BamHI e Ncol para se obter pMG81-l/3PD. Em primeiro lugar, a amplificação por PCR da secção correspondendo ao aminoácido 20-127 da proteína D foi feita utilizando o vector pMG81-l/3PD como molde e oligonucleótido sentido: 5' ATA TAA CAT ATG GAT CCA AGC AGC CAT TCA TCA AAT 3 ' (CAN008; SEQ ID N°: 18) e anti-sentido: 5' CCA CAA ACG CCT TCG TTC CAT GGT TTC AAA GTT TTC TGT C 3' (CAN03 7; SEQ ID N°: 19) . O ADNc de PRAME, obtido do Ludwig Institute, Bruxelas, Bélgica, foi inserido nos sítios Bstxl-Notl do vector pCDNAl (Invitrogen) para gerar o vector recombinante pCDNA-1-PRAME. A amplificação por PCR da secção correspondendo ao aminoácido da proteína PRAME foi feita utilizando o vector pcDNA-l-PRAME (GSKBio) como molde e oligonucleótido sentido: 26 5' GAC AGA AAA CTT TGA AAC CAT GGA ACG AAG GCG TTT GTG G 3' (CAN036); SEQ ID N°: 20) e anti-sentido: 5' AGA GAG ACT AGT CTA GTT AGG CAT GAA ACA GGG GCA CAG 3' (CAN029; SEQ ID N°: 21) ou 5' GGA GGA ACT AGT GTT AGG CAT GAA ACA GGG GCA CAG 3' (CAN002; SEQ ID N°: 22), dependendo se uma cauda de his foi adicionada (CAN002) ou não (CAN029). A sequência de PRAME final inserida no plasmídeo TCMP14 foi obtida após amplificações por PCR utilizando os moldes génicos de 1/3PD e PRAME que foram gerados nas etapas preliminares para molde e oligonucleótido sentido: CAN008 e anti-sentido: CAN029 ou CAN002, dependendo se uma cauda de his estava presente (CAN002) ou não (CAN029). Os sítios Ndel na extremidade 5' e Spel na extremidade 3' também foram adicionados para clonagem do fragmento no vector TCMP 14.

Construção da concepção de vector para expressar a proteína recombinante 1/3PD-PRAME com ou sem proteína recombinante de cauda de His utilizando o vector pET21:

Um plasmídeo de ADNc recombinante, denominado pcDNAl-PRAME (como descrito na estratégia anterior), contendo a sequência codificante para o gene de PRAME e o vector PMG81-1/3PD (como descrito na estratégia anterior), contendo a porção N-terminal da sequência codificante de proteína D foram utilizados. A estratégia de clonagem incluiu as seguintes etapas. a) Em primeiro lugar, a sequência de 1/3PD, sem sinal de secreção (sequência de secreção ou sinal) foi amplificada por PCR a partir do plasmídeo PMG81-1/3PD, utilizando o oligonucleótido sentido: 27 5'

AGAGAGCATATGAGCAGCCATTCATCAAATATGGCG (CANO 40; SEQ ID N°: 22) e o anti-sentido: 5' ACGTGGGCGGCCGCGGTTTCAAAGTTTTCTGTCATTTCTAA (CAN032; SEQ ID N°: 23);

Os sítios Ndel na extremidade 5' e Notl na extremidade 3' também foram adicionados para clonagem do fragmento no vector pET21b(+). b) A seguência de PRAME foi amplificada por PCR a partir do plasmídeo pcDNAl-PRAME, utilizando o oligonucleótido sentido: 5' TTGTTGGCGGCCGCAATGGAACGAAGGCGTTTGTGGGGT (CAN033; SEQ N°: 25) e o anti-sentido: 5' GGAGGACTCGAGGTTAGGCATGAAACAGGGGCACAG (CAN034; SEQ ID N° : 26); os sítios Notl na extremidade 5' e Xhol na extremidade 3' também foram adicionados para clonagem do fragmente no vector pET21b. Esta amplificação resultou na adição, na terminação C da proteína, de dois aminoácidos, Leu e Glu, seguido de 6 His no plasmídeo pET21b( + ) . Para a geração da proteína sem cauda de His, um codão de terminação (TAG) foi adicionado na extremidade 3' do gene de PRAME pela utilização de CAN033 e CAN035 (anti-sentido: 5' GGAGGAC T CGAGC T AGT T AGGCAT GAAACAGGGGCACAG (CAN035; SEQ ID N°: XX), em vez de CAN033 e CAN034. c) Clonagem dentro do plasmídeo pET21b(+) (Invitrogen) dos fragmentos amplificados acima. 28 d) Remoção do sítio Notl entre 1/3PD e PRAME, pela utilização do kit de Mutagénese Dirigida Pontual QuikChange II (Stratagene) e o oligonucleótido sentido: 5' CAGAAAACTTTGAAACCATGGAACGAAGGCG (CAN106; SEQ N°: XX) e o anti-sentido: 5' cgccttcgttccatggtttcaaagttttctg (CAN107; SEQ ID N°: XX). e) Adição de dois aminoácidos Asp e Pro a seguir a Met, na posição 1, na terminação N da proteína D 1/3, por mutagénese e utilizando o oligonucleótido sentido: 5' GGAGATATACATATGGATCCAAGCAGCCATTCATCAAATATGG (CAN104; SEQ ID N°: XX) e o anti-sentido: 5' CCATATTTGATGAATGGCTGCTTGGATCCATATGTATATCTCC (CAN105; SEQ ID N°: XX).

Construção da concepção de vector para expressar a proteína recombinante 1/3PD-PRAME codão-optimizada (sem ou com cauda de His) no vector pET26: 0 gene de PRAME foi codão-optimizado e clonado na estrutura de pGA4, com a adição dos sítios Notl e Xhol na extremidade 5' e na extremidade 3' do gene optimizado, respectivamente.

Este plasmídeo, denominado 0606420pGA4, foi utilizado para clonar o gene em fusão com o PD1/3 no vector pET26 utilizando as seguintes etapas. 29 a) Remoção do fragmento NotI/Xhol, correspondendo à sequência de PRAME optimizada com um codão de terminação na extremidade 3' do gene do plasmídeo 0606420pGA4. b) Clonagem do fragmento de PRAME optimizado dentro de um plasmideo pET26b(+) que contém o 1/3PD, anteriormente clonado Ndel/Notl com os oligonucleótidos CAN040 e CAN032, como descrito acima, e onde os aminoácidos Asp e Pro foram adicionados em N-terminal pelo método de mutagénese com os oligonucleótidos CAN104 e CAN105. c) Remoção do sitio Notl por mutagénese com os oligonucleótidos: sentido 5' GACAGAAAACTTTGAAACCATGGAACGTCGTCGTCTGTGG (CAN123; SEQ ID N°: XX) e anti-sentido 5' CCACAGACGACGACGTTCCATGGTTTCAAAGTTTTCTGTC (CAN124; SEQ ID N° : XX) . Isto resultou na proteína de fusão codão-optimizada 1/3PD-PRAME, sem a cauda de His. d) 0 plasmídeo foi, depois, utilizado como um molde para a geração de 1/3PD-PRAME codão-optimizado com o plasmídeo 6 His. A amplificação por PCR da proteína de fusão foi feita com os oligonucleótidos sentido 5' GGAATTCCATATGGATCCAAGCAGCCATTC (CAN199; SEQ ID N° : XX) e um anti-sentido

5' GGAGCTCTCGAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTTCGGCATAAAGCACGGGC (CAN198; SEQ ID N°: XX); sítios Ndel na extremidade 5', Xhol na extremidade 3', seguido de 6 His e uma codão de terminação também foram adicionados para clonagem do fragmento no vector pET26b(+). e) Clonagem do fragmento amplificado no plasmídeo pET26b(+) da Invitrogen. 30

Para a produção da proteína de fusão, a construção de ADN foi clonada no vector de expressão TCMP14. Este plasmídeo utiliza sinais de ADN de fago lambda para dirigir a transcrição e tradução de genes estranhos inseridos. 0 vector contém o promotor PL, operador OL e dois sítios de utilização (NutL e NutR) de lambda PL, para atenuar efeitos de polaridade transcricional, quando é proporcionada a proteína N (Gross et al., 1985. Mol. & Cell. Biol. 5:1015). O plasmídeo expressando a proteína de fusão pD-PRAME foi concebido para que os aminoácidos de PRAME fossem adicionados à terminação C de um derivado de 108 aminoácidos de pD, sem a sua sequência sinal (sequência de secreção ou sinal) (i. e., resíduos 20-127). A esta construção, foram adicionados três aminoácidos não relacionados (Met e Asp e uma Prolina) na terminação N do derivado de pD e, para determinadas construções, foi incluída uma cauda de his na terminação C dos aminoácidos de PRAME (ver a tabela A acima) . Esta construção poderia, alternativamente, ser descrita como contendo 109 aminoácidos derivados de pD, se a Met N-terminal for considerada como vindo da sequência de pD.

Estirpe Hospedeira e Transformação

Os hospedeiros da estirpe AR58 de E. Coli (Mott et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 82, p. 88-92, Janeiro de 1985, Biochemistry) foram transformados com ADN plasmídico para os Exemplos/construções 1 e 2. A estirpe de E. coli lisogénica AR58, utilizada para a produção dos Exemplos/construções 1 e 2, é um derivado da 31 estirpe N99 de E. coli K12 de NIH padrão (F- su- galK2, lacZ-thr-) . Contém um fago lambda lisogénico defeituoso (galE::TN10, 1 Kil- cl857 DH1) . 0 fenótipo Kil- impede o corte da sintese macromolecular do hospedeiro. A mutação cl857 confere uma lesão sensivel à temperatura ao repressor cl. A deleção de DH1 remove o operão direito do fago lambda e os loci bio, uvr3 e chlA do hospedeiro. A estirpe AR58 foi gerada por transdução de N99 com um stock de fago lambda P, anteriormente cultivado num derivado de SA500 (galE::TN10, 1 Kil- cl857 DH1). A introdução do lisogénio defeituoso dentro de N99 foi seleccionada com tetraciclina, em virtude da presença de um transposão TN10 codificando para resistência à tetraciclina no gene galE adjacente. N99 e SA500 são estirpes de E. coli K12, derivadas a partir do laboratório do Dr. Martin Rosenberg, no National

Institutes of Health.

Os vectores contendo o promotor PL são introduzidos dentro de um hospedeiro lisogénico de E. coli para estabilizar o ADN plasmídico. As estirpes hospedeiras lisogénicas contêm ADN de fago lambda de replicação defeituosa integrado dentro do genoma (Shatzman et al., 1983; Em Experimental Manipulation of Gene

Expression. Inouya (ed) p. 1-14. Academic Press N.I.). 0 ADN de fago lambda dirige a sintese da proteína repressora cl que se liga ao repressor OL do vector e impede a ligação de ARN polimerase ao promotor PL e, desse modo, a transcrição do gene inserido. 0 gene cl da estirpe AR58 de expressão contém uma mutação sensível à temperatura, de modo que a transcrição dirigida por PL pode ser regulada por mudança de temperatura, i. e., um aumento na temperatura de cultura inactiva o repressor e a síntese da proteína estranha é iniciada. Este sistema de expressão permite a síntese controlada de proteínas estranhas, 32 em especial das que possam ser tóxicas para a célula (Shimataka & Rosenberg, 1981. Nature 292:128).

Os hospedeiros da estirpe BLR de E. Coli (DE3) Novagen, WI, EUA (número de catálogo: 69053-4) BLR (DE3) Novagen, WI, EUA (número de catálogo: 69053-4), BLR é um derivado recA~ de BL21 que melhora os rendimentos de monómero de plasmídeo e pode ajudar a estabilizar plasmideos alvo contendo sequências repetitivas ou cujos produtos possam causar a perda do profago DE3 (1, 2) foram transformados com ADN plasmídico dos exemplos/construções 3 e 4.

Cada da transformação foi efectuada por métodos padrão com células tratadas com CaCl2 (Hanahan D. "Plasmid transformation by Simanis". Em Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press, Londres. (1985): p. 109-135).

Crescimento e indução de estirpe hospedeira bacteriana • Cultura

As bactérias foram cultivadas em 20 mL de caldo

Luria-Bertani (LB) (BD) + glucose a 1% (p/v) (Laboratoire MAT, número de catálogo: GR-0101) + antibiótico (Carbenicilina, a 100 pg/mL, para pET21b, Canamicina, a 40 pg/mL, para TCMP14). As culturas foram incubadas, a 33 °C, para as células AR58 e a 37 °C para as células BLR (DE3), até uma D.0.6oonm em torno de 0, 8 . 33 • Indução À D. 0. g o o nm em torno de 0,8, as culturas BLR (DE3) foram induzidas a 1 mM de isopropil β-D-l-tiogalactopiranósido (IPTG; EMD Chemicals Inc., número de catálogo: 5815) e incubadas, durante 2 horas ou 3 horas, a 37 °C, embora a solubilidade possa ser aumentada se for utilizada uma temperatura inferior. À D.O.g o o nm em torno de 0,8, as culturas AR58 foram induzidas por activação de calor, a 37 °C e incubadas durante 7 horas. O crescimento bacteriano foi adequado para os dois sistemas de expressão. • Extracção e Purificação da Proteína

Após expressão do polipéptido em cultura, as células são tipicamente recolhidas por centrifugação, depois, dissociadas por meio físico ou químico (se o polipéptido expresso não for segregado para dentro dos meios) e o extracto em bruto resultante retido para isolar o polipéptido de interesse. O TM , , ,

Reagente de Extracção de Proteína BugBuster e utilizado sob condições recomendadas pelos fornecedores (Novagen).

Purificação da proteína PDl/3-Prame-his

Pasta celular de E. coli foi ressuspensa em tampão de TRIS a 20 mM, pH 8,5, depois, passada através de um sistema homogeneizador (Panda da Niro Soavi S.p.A. 34 - 2 passagens - 750 bar). Após adição de MgCl2 a 2 mM e Benzonase (50 U/mL), o homogeneizado foi incubado 1 hora, à temperatura ambiente (T.A.), sob agitação suave, depois, centrifugado, 30 minutos, a 15900 g e T.A. O sedimento resultante foi ressuspenso em tampão de TRIS a 20 mM, pH 8,5, contendo Dodecilssulfato de Sódio (SDS) a 1% e Glutationo a 60 mM e incubado 30 minutos, a T.A., sob agitação suave. Após centrifugação de 30 minutos, a 15900 g e T.A., o sedimento foi descartado. O sobrenadante de centrifugação foi diluido 10 vezes em tampão de TRIS a 20 mM, contendo Ureia a 6,66 M, cloreto de sódio (NaCl) a 0,333 M e Imidazole a 11,11 mM e, depois, submetido a separação cromatográfica numa coluna de afinidade metálica de ião de Niquel (IMAC Sepharose 6 FF - GE Healthcare), equilibrada num tampão de TRIS a 20 mM, pH 8,5, contendo SDS a 0,1%, Ureia a 6,0 M, NaCl a 0,3 M e Imidazole a 10 mM. Após lavagem da coluna com tampão de TRIS a 20 mM, pH 8,5, contendo

Sarcosil a 0,5%, Ureia a 6,0 M, NaCl a 0, 3 M e Imidazole a 10 mM, o antigénio foi eluído da coluna pelo aumento da concentração de Imidazole até 40 mM, no mesmo tampão de lavagem. Após adição de fosfato até 50 mM, o eluato positivo para antigénio foi passado através de uma coluna de tipo II de Hidroxiapatite Cerâmica Macro-Prep (Bio-Rad), equilibrada num tampão de TRIS a 20 mM, pH 8,5, contendo fosfato a 50 mM, Sarcosil a 0,5%, Ureia a 6,0 Me NaCl a 0,3 M. 0 escoamento de hidroxiapatite contendo o antigénio foi, depois, diafiltrado contra tampão de Borato a 5 mM, pH 9,8, contendo sacarose a 3,15% numa membrana de 30 kDa Omega (Pall) . O retentado de ultrafiltração foi esterilizado por filtração através de uma membrana de acetato de Celulose de 0,45/0,22 pm (Sartorius). O material purificado foi armazenado a -70 °C. 35

Também foi utilizado um processo de purificação alternativo, que difere do processo acima nas seguintes etapas: - Sem tratamento de benzonase - Sem mudança de SDS para sarcosil numa coluna IMAC (SDS da extracção até à etapa de HA) - 0 tampão utilizado para a diafiltração foi tampão de TRIS a 5 mM, pH 8,5 - Arginina a 0,5 M.

Este processo de purificação alternativo resultou na remoção incompleta de SDS, com o valor residual em torno de 0,05 e 0,085%. • Purificação

As proteínas recombinantes expressas foram purificadas de fracções de sobrenadante obtidas após centrifugação de E. coli induzida, utilizando uma resina de quelação metálica de His-Bind (QIAgen, Chatsworth, CA) , de acordo com as instruções do fabricante da resina.

Caracterização da Proteína SDS-Page:

Gel: NuPAGE a 4-12%, Gel Bis-Tris, 1,0 mm, de 15 ou 26 poços (Invitrogen número de catálogo: NP0323BOX) 36

Ver a Figura 1 e 2 abaixo, que mostra a análise de SDS page do Exemplo 3 e 4 e 3a e 4a, respectivamente, em que as diferentes proteínas l/3pD-PRAME recombinantes, com ou sem cauda de his, migram no gel, a um peso molecular aparente de ~70 kDa. As proteínas recombinantes são verificadas com corpos de inclusão no lisado celular de E. coli, após indução. A preparação de amostras, tampões e condições de migração foram feitos sob condições recomendadas pelos fornecedores (Invitrogen). 10 pL de todas as preparações foram carregadas (antes de indução (BI) e após indução (AI)) em poços, correspondendo a 100 pL de equivalente de cultura.

Legenda da Fig. 1: Análise de SDS page, após coloração de azul de Coomassie de 1/3PD-PRAME recombinante, após indução de IPTG da estirpe BLR DE3 de E. coli, transformada com pET21 recombinante. Um equivalente de 100 pL de cultura, após 2 horas de indução na estirpe BLR DE3, com IPTG a 1 mM, a 25, 30 ou 37 °C, foi carregado no gel. O Clone #3 (1/3PD-PRAME/pET21) e Clone #4 (l/3PD-PRAME-His/pET21) são apresentados no gel antes (BI) e após (AI) induções em fracções solúveis (sobrenadante) e não solúveis (sedimento). Pista 1 e 10: pré-coloração de Gama Alargada Padrão (BioRad Cat#161-0318), pista 2 (clone N° 3, BI, sobrenadante), pista 3 (clone N° 3, BI, sedimento), pista 4 (clone N° 3, AI, 25 °C , sobrenadante) , pista 5 (clone N° 3, AI, 25 °C, sedimento), pista 6 (clone N° 3, AI, 30 0 c, sobrenadante), pista 7 (clone N° 3, AI, 30 °C, sedimento ) , pista 8 (clone N° 3, AI, 37 0 C, sobrenadante), pista 9 (clone N° 3, AI, 37 °C, sedimento), pista 11 (clone N° 4, BI, sobrenadante), pista 12 (clone N° 4, BI, sedimento), pista 13 (clone N° 4, AI, 25 °C, sobrenadante), , pista 14 (clone N° 4, AI, 25 °C, sedimento), pista 15 (clone N° 4, AI, 30 ° c, 37 sobrenadante), pista 16 (clone N° 4, AI, 30 °C, sedimento), pista 17 (clone N° 4, AI, 37 °C, sobrenadante), pista 18 (clone N° 4, AI, 37 °C, sedimento).

Legenda da Fig 2: Análise de SDS page, após coloração de azul de Coomassie de 1/3PD-PRAME recombinante, após indução de IPTG da estirpe BLR DE3 de E. coli, transformada com pET26 recombinante. Um equivalente de 100 pL de cultura, após 2 horas de indução na estirpe BLR DE3, com IPTG a 1 mM, a 25, 30 ou 37 °C, foi carregado no gel. O Clone N° 3a (1/3PD-PRAME codão-optimizado/pET26) e Clone N° 4a (1/3PD-PRAME-His codão-optimizado/pET26) são apresentados no gel antes (BI) e após (AI) induções em fracções solúveis (sobrenadante) e não solúveis (sedimento). Pista 2 e 10: pré-coloração de Gama Alargada Padrão (BioRad Cat N°161-0318), pista 1 (clone N° 3a, BI, sobrenadante), pista 3 (clone N° 3a, BI, sedimento), pista 4 (clone N° 3a, AI, 25 °C, sobrenadante), pista 5 (clone N° 3a, AI, 25 °C, sedimento), pista 6 (clone N° 3a, AI, 30 °C, sobrenadante), pista 7 (clone N° 3a, AI, 30 °C, sedimento), pista 8 (clone N° 3a, AI, 37 °C, sobrenadante), pista 9 (clone N° 3a, AI, 37 °C, sedimento), pista 11 (clone N° 4a, BI, sobrenadante), pista 12 (clone N° 4a, BI, sedimento), pista 13 (clone N° 4a, AI, 25 °C, sobrenadante), pista 14 (clone N° 4a, AI, 25 °C, sedimento), pista 15 (clone N° 4a, AI, 30 °C, sobrenadante), pista 16 (clone N° 4a, AI, 30 °C, sedimento), pista 17 (clone N° 4a, AI, 37 °C, sobrenadante), pista 18 (clone N° 4a, AI, 37 °C, sedimento). 38

Transferência de Western

As membranas foram bloqueadas, durante 30 minutos, a 37 °C, 60 RPM, utilizando solução fresca de leite/PBS IX a 3%. Após a incubação de bloqueio, foram adicionados anticorpos primários (coelho anti-PRAME; GSK Biologicals SA) , à diluição de 1:5000, ou cauda de oí-6X His (AbCam) , à diluição 1:3000, em solução fresca de leite/PBS IX a 3%, durante 1 hora, a 37 °C, 60 RPM.

Depois disso, as membranas foram lavadas três vezes, 5 minutos, à temperatura ambiente, utilizando Tween 20/PBS IX a 0,02%. Foram adicionados anticorpos secundários (coelho anti-IgG (H+L) de burro perox (Jackson laboratory), à diluição 1:20000, utilizando solução fresca de leite/PBS IX a 3%. As membranas foram incubadas, durante 1 hora, a 37 °C, 60 RPM. Depois disso, as membranas foram lavadas três vezes, 5 minutos, à temperatura ambiente, utilizando Tween 20/PBS IX a 0,02%, antes das exposições das membranas a substrato de peroxidase (KH2P04, 10 mM; (NH4) 2S04, 10 mM; O-dianisidina, 0,01% & peróxido de hidrogénio a 0,045%) ou substrato de fosfatase alcalina (Sigma Fast), segundo as recomendações do fornecedor.

Análise molecular:

Exemplo/construçao 1

Análise Proteína Integral Comprimento 629 aa Peso Molecular 71629,96 p.m. 1 micrograma = 13,961 pMoles 39 (continuação)

Análise Proteína Integral Coeficiente de Extinção Molar 67680 1 A[2 8 0] corr. a 1,06 mg/mL A[2 8 0] de 1 mg/mL 0,94 AU Ponto Isoeléctrico 6, 41 Carga a pH 7 1 ΟΊ CO Ponto Isoeléctrico 6,41 Carga a pH 7 -5, 84

Exemplo/construçao 2

Análise Proteína Integral Comprimento 620 aa Peso Molecular 70561,90 p.m. 1 micrograma = 14,172 pMoles Coeficiente de Extinção Molar 67680 1 A[280] corr. para 1,04 mg/mL A[2 8 0] de 1 mg/mL 0,96 AU Ponto Isoeléctrico 6,28 Carga a pH 7 -6,36 40

Exemplo/construçao 3

Análise Proteína Integral Comprimento 628 aa Peso Molecular 71627,01 p.m. 1 micrograma = 13,961 pMoles Coeficiente de Extinção Molar 67680 1 A[280] corr. para 1,06 mg/mL A[2 8 0] de 1 mg/mL 0,94 AU Ponto Isoeléctrico 6,34 Carga a pH 7 1 co

Exemplo/construçao 4

Análise Proteína Integral Comprimento 620 aa Peso Molecular 70561,90 p.m. 1 micrograma = 14,172 pMoles Coeficiente de Extinção Molar 67680 1 A[280] corr. para 1,04 mg/mL A[2 8 0] de 1 mg/mL 0,96 AU Ponto Isoeléctrico 6,28 Carga a pH 7 -6,36 41

Exemplο 5

Avaliação da produção de proteínas com ou sem o sinal de secreção (sequência de secreção ou sinal) da proteína D 1/3 na proteína de fusão.

Tabela B Nível de expressão + +++

Proteína PD1/3-PRAME com sinal de secreção PD1/3-PRAME sem sinal de secreção

Fig. 11: Análise de SDS page, após coloração de azul de Coomassie de 1/3PD-PRAME recombinante, com ou sem sinal de secreção, após indução de IPTG da estirpe BL21 DE3 de E. coli, transformada com pET21 recombinante. Um equivalente de 100 pL de cultura, após 3 horas de indução na estirpe BL21 DE3, com IPTG a 1 mM, a 37 °C, foi carregado no gel. As construções são apresentadas no gel antes (BI) e após (AI) induções em fracções solúveis (sobrenadante) e não solúveis (sedimento). Pista 1: pré-coloração de Gama Alargada Padrão (BioRad Cat N° 161-0318), pista 2 (pDl/3-PRAME + SS, BI, sobrenadante), pista 3 (pDl/3-PRAME + SS, BI, sedimento), pista 4 (pDl/3-PRAME + SS, AI, sobrenadante) , pista 5 (pDl/3-PRAME + SS, Al, sedimento) , pista 6 (pDl/3-PRAME + SS + His, BI, sobrenadante), pista 7 (pDl/3-PRAME + SS + His, BI, sedimento), pista 8 (pDl/3-PRAME + SS + His, AI, sobrenadante) , pista 9 (pDl/3-PRAME + SS + His, AI, sedimento), pista 10 (pDl/3-PRAME sem SS, BI, sobrenadante), pista 11 (pDl/3-PRAME sem SS, BI, sedimento), pista 12

(pDl/3-PRAME sem SS, AI, sobrenadante), pista 13 (pDl/3-PRAME 42 sem SS, AI, sedimento), pista 14 (pDl/3-PRAME sem SS + His, BI, sobrenadante) , pista 15 (pDl/3-PRAME sem SS + His, BI, sedimento), pista 16 (pDl/3-PRAME sem SS + His, AI, sobrenadante), pista 17 (pDl/3-PRAME sem SS + His, AI, sedimento).

Exemplo 6: Imunogenicidade de PD-PRAME-His formulada em AS01B ou AS15: gama de dose de antigénio numa dose constante de adjuvante.

Objectivo: gama de dose de antigénio para seleccionar a melhor dose para utilizar em experiências pré-clinicas.

Protocolo: 6 Grupos de 12 murganhos CB6F1 receberam injecções intramusculares (IM) no dia 0 e 14 de: 1. PBS 2. PRAME (50 * pg) em AS01B ou AS 15 3. PRAME (10 pg) em AS01B ou AS15 4 . PRAME (2 pg) em AS01B ou AS 15 5 . PRAME (0, 4 pg) em AS01B ou AS 15 6 . PRAME (0, 08 pg) em AS01B ou AS15 * Efectivamente administrados 44,7 pg, em vez da dose pretendida de 50 pg. 43 AS01B é uma formulação adjuvante lipossomal compreendendo QS21 e 3D-MPL; AS15 é uma formulação adjuvante lipossomal compreendendo QS21, 3D-MPL e CpG. A construção utilizada neste exemplo foi Exemplo/Construção 3a (pET26 com uma cauda de His), proporcionada em tampão de TRIS a 5 mM, pH 8,5 - Arginina a 0,5 M. Também pode ser utilizada proteína proporcionada num tampão de borato com sacarose.

Leituras: • Coloração de Citocina Intracelular (ICS), 14 dias após 2 injecções, após reestimulação in vitro de células do baço (4 agregados de 3 murganhos por grupo) com o agregado de péptidos PRAME, a 1 pg/mL/péptido (15-mer).

Resposta de CD4 (adjuvante AS01B)

Os resultados de ICS para citocinas CD4, para o adjuvante AS01B, são mostrados na Figura 3. Nesta experiência, pode ser concluído que, nestas condições, a melhor dose de antigénio PRAME para induzir uma resposta de CD4 em AS01B parece ser 2 pg.

Resposta de CD8 (adjuvante AS01B)

Os resultados de ICS para citocinas CD8, para o adjuvante AS01B, são mostrados na Figura 4. Os dados parecem mostrar uma resposta de CD8 muito baixa e heterogeneidade da resposta intragrupo. 44

Resposta de CD4 (adjuvante AS15)

Os resultados de ICS para citocinas CD4, para o adjuvante AS15, são mostrados na Figura 5. Estes dados parecem mostrar que uma resposta de CD4 semelhante foi induzida com 44 pg, 10 pg, 2 pg e 0,4 pg de PRAME formulado em AS15; com uma resposta diminuída induzida com 0,08 pg de PRAME.

Resposta de CD8 (adjuvante AS15)

Os resultados de ICS para citocinas CD8, para o adjuvante AS15, são mostrados na Figura 6. Estes dados não parecem mostrar resposta de CD8 (fundo no grupo de PBS).

Exemplo 7 descritas, o seguinte descrever construções agora, geradas:

Em suma, para as invenções aqui sumário pode ser utilizado para especificas de PD1/3-PRAME que foram, até

Construções utilizadas para PD1/3-PRAME - Sem sequência sinal de proteína D incluída (aminoácidos 2 a 19 da proteína D) - A Metionina da Proteína D está incluída (AA 1 da proteína D) 45

Dois AA nao relacionados (Asp e Pro) estão substituídos pelos aminoácidos 2-Lys e 3-Leu da Proteína D Os primeiros 109 AA da proteína D após a sequência sinal de proteína D estão incluídos (109 aminoácidos, incluindo o primeiro Met em N-term ± AA 20 a 127 da proteína D) AA 1 - 509 de PRAME estão incluídos (sequência original de tamanho total de PRAME)

Com ou sem uma cauda de His composta por um dos seguintes: • Três aminoácidos não relacionados (Thr, Ser e Gly) + 6 resíduos de His para clonagem no plasmídeo TCMP 14; ou • Dois aminoácidos não relacionados (Leu e

Glu) + 6 resíduos de His para clonagem no plasmídeo pET21; ou • 6 Resíduos de His para clonagem no plasmídeo pET26.

Proteína pDl/3 - PRAME +/- cauda de His: pDl/3 20 - 127 PRAME 1 - 509 N term MDP pD 1/3 PRAME C term N term MDP pD 1/3 PRAME TSG 6xHis (em TCMP14) C term N term MDP pD 1/3 PRAME LE 6xHis (em pET21) C term N term MDP pD 1/3 PRAME 6xHis (em pET26) C term 46

Uma sequência de aminoácidos marcada dos exemplos das construções da presente invenção é mostrada na Figura 7.

Os alinhamentos das seguintes construções são mostrados nas Figuras 8, 9 e 10:

Alinhamento entre LipoD-MAGE3-His e Dl/3-PRAME-His (Figura 8)

Alinhamento entre a sequência partilhada da proteína D original de Haemophilus influenzae e a LipoD-MAGE3-His (Figura 9)

Alinhamento entre a sequência partilhada da proteína D original de Haemophilus influenzae, a LipoD-MAGE3-His e a pDl/3-PRAME-His (Figura 10)

Formulação da Preparação vacinai utilizando proteínas de fusão:

As proteínas de fusão da invenção podem ser formuladas em vacinas que são cornou sem adjuvante. Numa forma de realização, como adjuvante, a formulação pode compreender uma mistura de monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) e QS21, numa emulsão de óleo/água. O sistema adjuvante SBAS2 foi anteriormente descrito no documento WO 95/17210. O adjuvante para utilização na presente invenção pode, alternativamente, compreender monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL), QS21 e CpG numa formulação de óleo-em-água ou numa formulação lipossomal. 3D-MPL: é um imunoestimulante derivado do lipopolissacárido (LPS) da bactéria Gram-negativa Salmonella minnesota. O MPL foi desacilado e não tem um grupo fosfato na fracção de lípido A. Este tratamento químico reduz drasticamente a toxicidade preservando, simultaneamente, as propriedades imunoestimulantes (Ribi, 1986) .

Pensa-se que o 3D-MPL, combinado com diversos veículos, pode fortemente melhorar a imunidade celular humoral e de tipo TH1. QS21: é uma molécula de saponina natural, extraída da casca da árvore Sul-americana Quillaja saponaia Molina. Uma técnica de purificação, desenvolvida para separar as saponinas individuais dos extractos em bruto da casca, permitiu o isolamento da saponina particular, QS21, que é um glicósido triterpeno, demonstrando actividade adjuvante mais forte e menor toxicidade, em comparação com o componente parental. Demonstrou-se que a QS21 activa os CTL restringidos a MHC de classe I a vários Ag subunitários, assim como estimula a proliferação linfocitica específica de Ag (Kensil, 1992).

Considera-se que pode haver um efeito sinérgico das combinações de MPL e QS21 na indução de respostas imunitárias celulares humorais e de tipo TH1. A emulsão de óleo/água compreende uma fase orgânica composta por 2 óleos (um tocoferol e esqualeno) e uma fase aquosa de PBS contendo Tween 80 como emulsionante. A emulsão compreendia esqualeno a 5%, tocoferol a 5%, Tween 80 a 0,4% e tinha um tamanho de partícula médio de 180 nm e é conhecida como SB62 (ver o documento WO 95/17210). As goticulas de óleo resultantes deverão ter um tamanho de, aproximadamente, 180 nm. 48 0 adjuvante para utilização na presente invenção pode ser formulado como uma combinação de MPL e QS21, numa emulsão de óleo/água ou numa formulação lipossomal. Esta preparação deve ser distribuída em frascos-ampola de 0,7 mL, para serem misturados com o antigénio liofilizado ou proteína de fusão (frascos-ampola contendo de 30 a 300 pg de antigénio).

Também podem ser utilizados oligonucleótidos imunoestimulatórios. Exemplos de oligonucleótidos para utilização em adjuvantes ou vacinas da presente invenção incluem oligonucleótidos contendo CpG, em geral contendo dois ou mais motivos do dinucleótido CpG separados por, pelo menos, três, mais frequentemente, pelo menos, seis ou mais nucleótidos. Um motivo CpG é um nucleótido citosina, seguido de um nucleótido guanina. Os oligonucleótidos CpG são, tipicamente, desoxinucleótidos. Numa forma de realização, o internucleótido no oligonucleótido é fosforoditioato ou, de um modo mais preferido, uma ligação de fosforotioato, embora as ligações de fosfodiéster e outras ligações de internucleótido estejam dentro do âmbito da invenção. Também estão incluídos dentro do âmbito da invenção oligonucleótidos com ligações mistas de internucleótido. Os métodos para a produção de oligonucleótidos fosforotioato ou fosforoditioato são descritos nos documentos US5666153, US 5278302 e WO 95/26204.

Os exemplos dos oligonucleótidos são como se segue: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826; SEQ ID N°: 36) TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758; SEQ ID N°: 37)

ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006; SEQ ID N°: 38) TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668; SEQ ID N°: 39) 49 TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456; SEQ ID N°: 40), as sequências podem conter ligações de internucleótido modificadas por fosforotioato.

Os oligonucleótidos CpG alternativos podem compreender uma ou mais sequências acima em que têm deleções ou adições inconsequentes destes.

Os oligonucleótidos CpG podem ser sintetizados por qualquer método conhecido na técnica (ver, por exemplo, o documento EP 468520). Convenientemente, esses oligonucleótidos podem ser sintetizados utilizando um sintetizador automatizado.

Numa forma de realização da presente invenção, uma combinação de adjuvante para utilização na invenção inclui um ou mais dos seguintes componentes: 3D-MPL e QS21 (documento EP 0671948B1); emulsões de óleo em água, compreendendo 3D-MPL e QS21 (documentos WO 95/17210, WO 98/56414); ou 3D-MPL formulado com outros veiculoes (documento EP 0689454B1). Outros sistemas de adjuvantes que podem ser utilizados na presente invenção compreendem uma combinação de 3D-MPL, QS21 e um oligonucleótido CpG, como descrito nos documentos US6558670 e US6544518. A vacina final pode ser obtida após reconstituição da formulação liofilizada.

Referências: 1. A. Roca (U. of Wisconsin), comunicação pessoal. 2. Studier, F.W. (1991) J. Mol. Biol. 219, 37-44. 50 3. Jan H. Kessler3 et al. The Journal of Experimental Medicine, Volume 193, Número 1, 1 de Janeiro de 2001 73-88, 4. Ikeda H et al. Immunity, Fev.; 6(2): 1997, 199-208 SEQ ID N°: 1

Sequência de ADN para o Exemplo 1 atggatccaagcagccattcatcaaatatggcgaatacccaaatgaaatcagacaaaatcattattgctc accgtggcgctagcggttatttaccagagcatacgttagaatctaaagcacttgcgtttgcacaacaggc tgattatttagagcaagatttagcaatgactaaggatggtcgtttagtggttattcacgatcacttttta gatggcttgactgatgttgcgaaaaaattcccacatcgtcatcgtaaagatggccgttactatgtcatcg actttaccttaaaagaaattcaaagtttagaaatgacagaaaactttgaaaccatggaacgaaggcgttt gtggggttccattcagagccgatacatcagcatgagtgtgtggacaagcccacggagacttgtggagctg gcagggcagagcctgctgaaggatgaggccctggccattgccgccctggagttgctgcccagggagctct tcccgccactcttcatggcagcctttgacgggagacacagccagaccctgaaggcaatggtgcaggcctg gcccttcacctgcctccctctgggagtgctgatgaagggacaacatcttcacctggagaccttcaaagct gtgcttgatggacttgatgtgctccttgcccaggaggttcgccccaggaggtggaaacttcaagtgctgg atttacggaagaactctcatcaggacttctggactgtatggtctggaaacagggccagtctgtactcatt tccagagccagaagcagctcagcccatgacaaagaagcgaaaagtagatggtttgagcacagaggcagag cagcccttcattecagtagaggtgctcgtagacctgttcctcaaggaaggtgcctgtgatgaattgttct cccacctcattgagaaagtgaagcgaaagaaaaatgtactacgcctgtgctgtaagaagctgaagatttt tgcaatgcccatgcaggatatcaagatgatcctgaaaatggtgcagctggactctattgaagatttggaa gtgacttgtacctggaagctacccaccttggcgaaattttctccttacctgggccagatgattaatctgc gtagactcctcctctcccacatccatgcatcttcctacatttccccggagaaggaagagcagtatatcgc ccagttcacctctcagttcctcagtctgcagtgcctgcaggctctctatgtggactctttatttttcctt agaggccgcctggatcagttgctcaggcacgtgatgaaccccttggaaaccctctcaataactaactgcc ggctttcggaaggggatgtgatgcatctgtcccagagtcccagcgtcagtcagctaagtgtcctgagtct aagtggggtcatgctgaccgatgtaagtcccgagcccctccaagctctgctggagagagcctctgccacc ctccaggacctggtctttgatgagtgtgggatcacggatgatcagctccttgccctcctgccttccctga gccactgctcccagcttacaaccttaagcttctacgggaattccatctccatatctgccttgcagagtct cctgcagcacctcatcgggctgagcaatctgacccacgtgctgtatcctgtccccctggagagttatgag gacatccatggtaccctccacctggagaggcttgcctatctgcatgccaggctcagggagttgctgtgtg agttggggcggcccagcatggtctggcttagtgccaacccctgtcctcactgtggggacagaaccttcta tgacccggagcccatcctgtgcccctgtttcatgcctaacactagtggccaccatcaccatcaccat 51 SEQ ID N°: 2

Sequência de Aminoácidos para o Exemplo 1 mdpsshssnmantqmksdkiiiahrgasgylpehtleskalafaqqadyleqdlamtkdgrlwihdhfl

DGLTDVAKKFPHRHRKDGRYYVIDFTLKEIQSLEMTENFETMERRRLWGSIQSRYISMSVWTSPRRLVEL

AGQSLLKDEALAIAALELLPRELFPPLFMAAFDGRHSQTIjKAMVQAWPFTCLPLGVLMKGQHLHLETFKA

VLDGLDVLLAQEVRPRRWKLQVLDLRKNSHQDFWTVWSGNRASLYSFPEPEAAQPMTKKRKVDGLSTEAE

QPFIPVEVLVDLFLKEGACDELFSYLIEKVKRKKNVLRLCCKKLKIFAMPMQDIKMILKMVQLDSIEDLE

VTCTWKLPTLAKFSPYLGQMINLRRLLLSHIHASSYISPEKEEQYIAQFTSQFIjSLQCLiQAIjYVDSIjFFL ΡΟΕΙ-ΟΟΙ,Ι,ΡΗνΜΝΡΙ,ΕΤΙ^ΙΤΝαΡΙΞΕαονΜΗΙιΕΟΕΡΕνΕΟΙ.Ενί^ΙιΕΟνΜΙ/ΓΟνΕΡΕΡΙιΟΑίΧΕΕΑΕΑΤ

LQDLVFDECGITDDQLLALLPSLSHCSQLTTLSFYGNSISISALQSLLQHLIGLSNLTHVLYPVPLESYE

DIHGTLHLERLAYLHARLREIjLCELGRPSMVWLSANPCPHCGDRTFYDPEPILCPCFMPNTSGHHHHHH SEQ ID N°: 3

Sequência de ADN para o exemplo 2 atggatccaagcagccattcatcaaatatggcgaatacccaaatgaaatcagacaaaatcattattgctc accgtggtgctagcggttatttaccagagcatacgttagaatctaaagcacttgcgtttgcacaacaggc tgattatttagagcaagatttagcaatgactaaggatggtcgtttagtggttattcacgatcacttttta gatggcttgactgatgttgcgaaaaaattcccacatcgtcatcgtaaagatggccgttactatgtcatcg actttaccttaaaagaaattcaaagtttagaaatgacagaaaactttgaaaccatggaacgaaggcgttt gtggggttccattcagagccgatacatcagcatgagtgtgtggacaagcccacggagacttgtggagctg gcagggcagagcctgctgaaggatgaggccctggccattgccgccctggagttgctgcccagggagctct tcccgccactcttcatggcagcctttgacgggagacacagccagaccctgaaggcaatggtgcaggcctg gcccttcacctgcctccctctgggagtgctgatgaagggacaacatcttcacctggagaccttcaaagct gtgcttgatggacttgatgtgctccttgcccaggaggttcgccccaggaggtggaaacttcaagtgctgg atttacggaagaactctcatcaggacttctggactgtatggtctggaaacagggccagtctgtactcatt tccagagccagaagcagctcagcccatgacaaagaagcgaaaagtagatggtttgagcacagaggcagag cagcccttcattccagtagaggtgctcgtagacctgttcctcaaggaaggtgcctgtgatgaattgttct cctacctcattgagaaagtgaagcgaaagaaaaatgtactacgcctgtgctgtaagaagctgaagatttt tgcaatgcccatgcaggatatcaagatgatcctgaaaatggtgcagctggactetattgaagatttggaa gtgacttgtacctggaagctacccaccttggcgaaattttctccttacctgggccagatgattaatctgc gtagactcctcctctcccacatccatgcatcttcctacatttccccggagaaggaagagcagtatatcgc ccagttcacctctcagttcctcagtctgcagtgcctgcaggctctctatgtggactctttatttttcctt agaggccgcctggatcagttgctcaggcacgtgatgaaccccttggaaaccctctcaataactaactgcc ggctttcggaaggggatgtgatgcatctgtcccagagtcccagcgtcagtcagctaagtgtcctgagtct aagtggggtcatgctgaccgatgtaagtcccgagcccctccaagctctgctggagagagcctctgccacc ctccaggacctggtctttgatgagtgtgggatcacggatgatcagctccttgccctcctgccttccctga 52 gccactgctcccagcttacaaccttaagcttctacgggaattccatctccatatctgccttgcagagtct cctgcagcacctcatcgggctgagcaatctgacccacgtgctgtatcctgtccccctggagagttatgag gacatccatggtaccctccacctggagaggcttgcctatctgcatgccaggctcagggagttgctgtgtg agttggggcggcccagcatggtctggcttagtgccaacccctgtcctcactgtggggacagaaccttcta tgacccggagcccatcctgtgcccctgtttcatgcctaac SEQ ID N°: 4 SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DO EXEMPLO 2

MDPSSHS SNMANTQMKSDKIIIAHRGASGYLPEHTLESKALAFAQQADYLEQDLAMTKDGRLWIHDHFL dgltdvakkfphrhrkdgryyvidftlkeiqslemtenfetmerrrlwgsiqsryismsvwtsprrlvel

AGQSLLKDEALAIAALELLPRELFPPLFMAAFDGRHSQTLKAMVQAWPFTCLPLGVLMKGQHLHLETFKA VLDGIiDVLLiAQEVRPRRWKIjQVIiDLRKNSHQDFWTVWSGNRASIjYSFPEPEAAQPMTKKRKVDGLSTEAE QPFIPVEVLVDLFLKEGACDELFSYLIEKVKRKKNVLRLCCKKLKIFAMPMQDIKMILKMVQLDSIEDLE VTCTWKLPTLAKFSPYLGQMINLRRLLLSHIHASSYISPEKEEQYIAQFTSQFLSLQCLQALYVDSLFFL RGRIiDQLLRHVMNPLETLSITNCRLSEGDVMHLSQSPSVSQLSVLSIjSGVMLTDVSPEPLQAIjLERASAT LQDLVFDECGITDDQLLALLPSLSHCSQLTTLSFYGNSISISALQSLLQHLIGLSNLTHVLYPVPLESYE DIHGTLHLERLAYLHARLRELLCELGRPSMVWLSANPCPHCGDRTFYDPEPILCPCFMPN SEQ ID N°: 5

Sequência de ADN para o Exemplo 3 atggatccaagcagccattcatcaaatatggcgaatacccaaatgaaatcagacaaaatcattattgctc accgtggtgctagcggttatttaccagagcatacgttagaatctaaagcacttgcgtttgcacaacaggc tgattatttagagcaagatttagcaatgactaaggatggtcgtttagtggttattcacgatcacttttta gatggcttgactgatgttgcgaaaaaattcccacatcgtcatcgtaaagatggccgttactatgtcatcg actttaccttaaaagaaattcaaagtttagaaatgacagaaaactttgaaaccatggaacgaaggcgttt gtggggttccattcagagccgatacatcagcatgagtgtgtggacaagcccacggagacttgtggagctg gcagggcagagcctgctgaaggatgaggccctggccattgccgccctggagttgctgcccagggagctct tcccgccactcttcatggcagcctttgacgggagacacagccagaccctgaaggcaatggtgcaggcctg gcccttcacctgcctccctctgggagtgctgatgaagggacaacatcttcacctggagaccttcaaagct gtgcttgatggacttgatgtgctccttgcccaggaggttcgccccaggaggtggaaacttcaagtgctgg atttacggaagaactctcatcaggacttctggactgtatggtctggaaacagggccagtctgtactcatt tccagagccagaagcagctcagcccatgacaaagaagcgaaaagtagatggtttgagcacagaggcagag cagcccttcattccagtagaggtgctcgtagacctgttcctcaaggaaggtgcctgtgatgaattgttct 53 cctacctcattgagaaagtgaagcgaaagaaaaatgtactacgcctgtgctgtaagaagctgaagatttt tgcaatgcccatgcaggatatcaagatgatcctgaaaatggtgcagctggactctattgaagatttggaa gtgacttgtacctggaagctacccaccttggcgaaattttctccttacctgggccagatgattaatctgc gtagactcctcctctcccacatccatgcatcttcctacatttccccggagaaggaagagcagtatatcgc ccagttcacctctcagttcctcagtctgcagtgcctgcaggctctctatgtggactctttatttttcctt agaggccgeetggateagttgctcaggcacgtgatgaaccccttggaaaccctctcaataactaactgcc ggctttcggaaggggatgtgatgcatctgtcccagagtcccagcgtcagtcagctaagtgtcctgagtct aagtggggtcatgctgaccgatgtaagtcccgagcccctccaagctctgctggagagagcctctgccacc ctccaggacctggtctttgatgagtgtgggatcacggatgatcagctccttgccctcctgccttccctga gccactgctcccagcttacaaccttaagcttctacgggaattccatctccatatctgccttgcagagtct cctgcagcacctcatcgggctgagcaatctgacccacgtgctgtatcctgtccccctggagagttatgag gacatccatggtaccctccacctggagaggcttgcctatctgcatgccaggctcagggagttgctgtgtg agttggggcggecGagcatggtctggcttagtgccaacGcctgtcctGactgtggggacagaaectteta tgacccggagcccatcctgtgcccctgtttcatgcctaacctcgagcaccaccaccaccaccac SEQ ID N°: 6

Sequência de Aminoácidos: para o Exemplo 3

MD PS S HSSNMANTQMKSDKIIlAHRGASGYLPEHTLESKALAFAQQADYLEQDLAMTKDGRLWIHDHFL DGLTDVAKKFPHRHRKDGRYYVIDFTLKEIQSLEMTENFETMERRRLiWGSIQSRYISMSVWTSPRRIjVEL AGQSLIíKDEALAIAALELLPRELFPPlFMAAFDGRHSQTLKAMVQAWPFTCLPLGVLMKGQHLHLETFKA VLDGLDVLLAQEVRPRRWKLQVLDLRKNSHQDFWTVWSGNRASLYSFPEPEAAQPMTKKRKVDGLSTEAE QPFIPVEVLVDLFLKEGACDELFSYLIEKVKRKKNVLRLCCKKLKIFAMPMQDIKMILKMVQLDSIEDLE VTCTWKLPTLAKFSPYLGQMINLRRLLLSHIHASSYISPEKEEQYIAQFTSQFLSLQCLQALYVDSIjFFL RGRLDQLLRHVMNPIjETIjSITNCRIjSEGDVMHLiSQSPSVSQLSVLSLiSGVMLiTDVSPEPLQAIiIjERASAT lqdlvfdecgitddqllallpslshcsqlttlsfygnsisisalqsllqhliglsnlthvlypvplesye

DIHGTLHLERLAYLHARLRELLCELGRPSMVWIjSAÍIPCPHCGDRTFYDPEPILCPCFMPNLEHHHHHH SEQ ID N°: 7.

Sequência de ADN para o Exemplo 4: atggatccaagcagccattcatcaaatatggcgaatacccaaatgaaatcagacaaaatcattattgctc accgtggtgctagcggttatttaccagagcatacgttagaatctaaagcacttgcgtttgcacaacaggc tgattatttagagcaagatttagcaatgactaaggatggtcgtttagtggttattcacgatcacttttta gatggcttgactgatgttgcgaaaaaattcccacatcgtcatcgtaaagatggccgttactatgtcatcg actttaccttaaaagaaattcaaagtttagaaatgacagaaaactttgaaaccatggaacgaaggcgttt gtggggttccattcagagccgatacatcagcatgagtgtgtggacaagcccacggagacttgtggagctg 54 gcagggcagagcctgctgaaggatgaggccctggccattgccgccctggagttgctgcccagggagctct tcccgccactcttcatggcagcctttgacgggagacacagccagaccctgaaggcaatggtgcaggcctg gcccttcacctgcctccctctgggagtgctgatgaagggacaacatcttcacctggagaccttcaaagct gtgcttgatggacttgatgtgctccttgcccaggaggttcgccccaggaggtggaaacttcaagtgctgg atttacggaagaactctcatcaggacttctggactgtatggtctggaaacagggccagtctgtactcatt tccagagccagaagcagctcagcccatgacaaagaagcgaaaagtagatggtttgagcacagaggcagag cagcccttcattccagtagaggtgctcgtagacctgttcctcaaggaaggtgcctgtgatgaattgttct cctacctcattgagaaagtgaagcgaaagaaaaatgtactacgcctgtgctgtaagaagctgaagatttt tgcaatgcccatgcaggatatcaagatgatcctgaaaatggtgcagctggactctattgaagatttggaa gtgacttgtacctggaagctacccaccttggcgaaattttctccttacctgggccagatgattaatctgc gtagactcctcctctcccacatccatgcatcttcctacatttccccggagaaggaagagcagtatatcgc ccagttcacctctcagttcctcagtctgcagtgcctgcaggctctctatgtggactctttatttttcctt agaggccgcctggatcagttgctcaggcacgtgatgaaccccttggaaaccctctcaataactaactgcc ggctttcggaaggggatgtgatgcatctgtcccagagtcccagcgtcagtcagctaagtgtcctgagtct aagtggggtcatgctgaccgatgtaagtcccgagcccctccaagctctgctggagagagcctctgccacc ctccaggacctggtctttgatgagtgtgggatcacggatgatcagctccttgccctcctgccttccctga gccactgctcccagcttacaaccttaagcttctacgggaattccatctccatatctgccttgcagagtct cctgcagcacctcatcgggctgagcaatctgacccacgtgctgtatcctgtccccctggagagttatgag gacatccatggtaccctccacctggagaggcttgcctatctgcatgccaggctcagggagttgctgtgtg agttggggcggcccagcatggtctggcttagtgccaacccctgtcctcactgtggggacagaaccttcta tgacccggagcccatcctgtgcccctgtttcatgcctaac SEQ ID N°: 8

Sequência de Aminoácidos para o Exemplo 4 MDPSSHSSÍJMANTQMKSDKIIIAHRGASGYLPEHTIjESKALAFAQQADYLEQDLAMTKDGRLWIHDHFli

DGLTDVAKKFPHRHRKDGRYYVIDFTLKEIQSLEMTENFETMERRRLWGSIQSRYISMSVWTSPRRLVEL

AGQSLLKDEALAIAALELLPRELFPPLFMAAFDGRHSQTLKAMVQAWPFTCLPLGVLMKGQHLHLETFKA vldgldvllaqevrprrwklqvldlrknshqdfwtvwsgnraslysfpepeaaqpmtkkrkvdglsteae

QPFIPVEVLVDLFLKEGACDELFSYLIEKVKRKKNVLRLCCKKLKIFAMPMQDIKMIIjKMVQLDSIEDLE VTCTWKLPTLAKFSPYLGQMINLRRLLLSHIHASSYISPEKEEQYIAQFTSQFLSLQCLQALYVDSLFFL.

RGRLDQLLRHVMNPLETLSITNCRLSEGDVMHLSQSPSVSQLSVLSLSGVMLTDVSPEPLQALLERASAT

LQDLVFDECGITDDQLLALLPSLSHCSQLTTLSFyGNSISISALQSLLQHLIGLSNLTHVLYPVPLESYE

DIHGTLHLERLAYLHARLRELLCELGRPSMVWLSANPCPHCGDRTFYDPEPILCPCFMPN 55 SEQ ID N°: 9

Sequência de ADN, codão-optimizada, para o exemplo 3a atggatccaagcagccattcatcaaatatggcgaatacccaaatgaaatcagacaaaatcattattgctc accgtggtgctagcggttatttaccagagcatacgttagaatctaaagcacttgcgtttgcacaacaggc tgattatttagagcaagatttagcaatgactaaggatggtCgtttâgtggttattcacgatcactt:ttta gatggcttgactgatgttgcgaaaaaattcccacatcgtcatcgtaaagatggccgttactatgtcatcg actttaccttaaaagaaattcaaagtttagaaatgacagaaaactttgaaaccatggaacgtcgtcgtct gtggggcagcattcagagccgttatattagcatgagcgtgtggaccagcccgcgtcgtetggttgagctg gccggccagagcctgctgaaagatgaagcgctggccattgcggcgctggagctgctgccgcgtgagctgt ttccgccgctgtttatggcggcgtttgatggccgtcatagccagaccctgaaagcgatggtgcaggcgtg gccgtttacctgtctgccgctgggcgtgctgatgaaaggccagcatctgcatctggaaacctttaaagcg gtgctggatggcctggatgtgctgctggcccaggaagttcgtccgcgtcgttggaaactgcaagtgctgg atctgcgtaaaaacagccatcaggatttttggaccgtgtggagcggcaatcgtgcgagcctgtatagctt tccggaaccggaagcggcgcagccgatgaccaaaaaacgtaaagtggatggcctgagcaccgaagcggaa cagccgtttattccggtggaagtgctggttgacctgtttctgaaagaaggcgcctgcgacgagctgttta gctatctgatcgaaaaagtgaaacgcaaaaaaaacgtgctgcgtctgtgctgcaaaaaactgaaaatctt cgcgatgccgatgcaggatattaaaatgatcctgaaaatggtgcagctggatagcattgaggacctggaa gtgacctgcacctggaaactgccgaccctggccaaatttagcccgtatctgggccagatgattaacctgc gtcgtctgctgctgtctcatattcatgcgagcagctatattagcccggaaaaagaagaacagtatatcgc gcagtttaccagccagtttctgagcctgcaatgcctgcaagcgctgtatgtggatagcctgttttttctg cgtggccgtctggatcagctgctgcgtcatgtgatgaatccgctggaaaccctgagcattaccaactgcc gtctgagcgaaggcgatgtgatgcatctgagccagagcccgagcgttagccagctgtctgttctgagcct gagcggcgtgatgctgaccgatgtgagcccggaaccgctgcaagccctgctggaacgtgcgagcgcgacc ctgcaagacctggtgtttgatgaatgcggcattaccgatgatcagctgctggccctgctgccgagcctga gccattgcagccagctgaccaccctgagcttttatggcaacagcattagcattagcgcgctgcaaagcct gctgcaacatctgattggcctgagcaacctgacccatgtgctgtatccggtgccgctggaaagctatgaa gatattcatggcaccctgcatctggaacgtctggcctatctgcacgcgcgtctgcgtgagctgctgtgcg agctgggcegtccgagcatggtttggctgtctgcgaatccgtgcccgcattgcggcgatcgtacctttta tgatccggaaccgattctgtgcccgtgctttatgccgaaccaccaccaccaccaccac SEQ ID N°: 10

Sequência de Aminoácidos para o Exemplo 3a MDPSSHSSNMANTQMKSDKIIIAHRGASGYLPEHTLESKALAFAQQADYLEQDLAMTKDGRLVVIHDHFIj

DGLTDVAKKFPHRHRKDGRYYVIDFTLKEIQSLEMTENFETMERRRLWGSIQSRYISMSVWTSPRRLVEL

AGQSIjLKDEALAIAALELLPREIjFPPLFMAAFDGRHSQTLKAMVQAWPFTCLPLGVLMKGQHLHIjETFKA vldgldvllaqevrprrwklqvldlrknshqdfwtvwsgnraslysfpepeaaqpmtkkrkvdglsteae 56 qpfipvevlvdlflkegacdelfsyliekvkrkknvlrlcckklkifampmqdikmilkmvqldsiedle VTCTWKLPTLAKFSPYIjGQMINIjRRLIjLSHIHASSYISPEKEEQYIAQFTSQFIjSIjQCLiQAIjYVDSIjFFIj

RGRLDQLLRHVMNPLETLSITNCRLSEGDVMHLSQSPSVSQLSVLSLSGVMLTDVSPEPLQALLERASAT

LQDLVFDECGITDDQLLALLPSLSHCSQLTTLSFYGNSISISALQSLLQHLIGIjSNLTHVLYPVPLESYE

DIHGTLHLERLAYLHARLRELLCELGRPSMVWLSANPCPHCGDRTFYDPEPILCPCFMPNHHHHHH SEQ ID N°: 11

Sequência de ADN, codão-optimizada, para o Exemplo 4a atggatccaagcagccattcatcaaatatggcgaatacccaaatgaaatcagacaaaatcattattgctc accgtggtgctagcggttatttaccagagcatacgttagaatctaaagcacttgcgtttgcacaacaggc tgattatttagagcaagatttagcaatgactaaggatggtcgtttagtggttattcacgatcacttttta gatggcttgactgatgttgcgaaaaaattcccacatcgtcatcgtaaagatggccgttactatgtcatcg actttaccttaaaagaaattcaaagtttagaaatgacagaaaactttgaaaccatggaacgtcgtcgtct gtggggcagcattcagagcegttatattagcatgagcgtgtggaccagcccgcgtcgtctggttgagctg gccggccagagcctgctgaaagatgaagcgctggccattgcggcgctggagctgctgccgcgtgagctgt ttccgccgctgtttatggcggcgtttgatggccgtcatagccagaccctgaaagcgatggtgcaggcgtg gccgtttacctgtctgccgctgggcgtgctgatgaaaggccagcatctgcatctggaaacctttaaagcg gtgctggatggcctggatgtgctgctggcccaggaagttcgtccgcgtcgttggaaactgcaagtgctgg atctgcgtaaaaacagccatcaggatttttggaccgtgtggagcggcaatcgtgcgagcctgtatagctt tccggaaccggaagcggcgcagccgatgaccaaaaaacgtaaagtggatggcctgagcaccgaagcggaa cagccgtttattccggtggaagtgctggttgacctgtttctgaaagaaggcgcctgcgacgagctgttta gctatctgatcgaaaaagtgaaacgcaaaaaaaacgtgctgcgtctgtgctgcaaaaaactgaaaatctt cgcgatgccgatgcaggatattaaaatgatcctgaaaatggtgcagctggatagcattgaggacctggaa gtgacctgcacctggaaactgccgaccctggccaaatttagcccgtatctgggccagatgattaacctgc gtcgtctgctgctgtctcatattcatgcgagcagctatattagcccggaaaaagaagaacagtatatcgc gcagtttaccagccagtttctgagcctgcaatgcctgcaagcgctgtatgtggatagcctgttttttctg cgtggccgtctggatcagctgctgcgtcatgtgatgaatccgctggaaaccctgagcattaccaactgcc gtctgagcgaaggcgatgtgatgcatctgagccagagcccgagcgttagccagctgtctgttctgagcct gagcggcgtgatgctgaccgatgtgagcccggaaccgctgcaagccctgctggaacgtgcgagcgcgacc ctgcaagacctggtgtttgatgaatgcggcattaccgatgatcagctgctggccctgctgccgagcctga gccattgcagccagctgaccaccctgagcttttatggcaacagcattagcattagcgcgctgcaaagcct gctgcaacatctgattggcctgagcaacctgacccatgtgctgtatccggtgccgctggaaagctatgaa gatattcatggcaccctgcatctggaacgtctggcctatctgcacgcgcgtctgcgtgagctgctgtgcg agctgggccgtccgagcatggtttggctgtctgcgaatccgtgcccgcattgcggcgatcgtacctttta tgatccggaaccgattctgtgcccgtgctttatgccgaac 57 SEQ ID N°: 12

Sequência de Aminoácidos para o Exemplo 4a

MDPSSHSSNMANTQMKSDKIIIAHRGASGYLPEHTLESKALAFAQQADYLEQDLAMTKDGRLWIHDHFL dgltdvakkfphrhrkdgryyvidftlkeiqslemtenfetmerrrlwgsiqsryismsvwtsprrlvel AGQSLLKDEALAIAALELLPRELFPPLFMAAFDGRHSQTLKAMVQAWPFTCLPLGVLMKGQHLHLETFKA VLDGLDVLLAQEVRPRRWKLQVLDIjRKNSHQDFWTVWSGNRASLiYSFPEPEAAQPMTKKRKVDGLSTEAE QPFIPVEVLVDLFLKEGACDELFSYLIEKVKRKKNVLRIjCCKKLKIFAMPMQDIKMILKMVQLDSIEDLE VTCTWKLPTLAKFSPYLGQMINLRRLLLSHIHASSYISPEKEEQYIAQFTSQFLSLQCLQAIjYVDSLFFL RGRLDQLLRHVMNPLETLSITNCRLSEGDVMHLSQSPSVSQLSVLSLSGVMLTDVSPEPLQALLERASAT LQDLVFDECGITDDQLLAIjLiPS LSHCSQLTTLSFYGNSISISAIjQSIiLQHLiIGLSNIjTHVLYPVPLESYE DIHGTLHLERLAYLHARLRELLCELGRPSMVWLSANPCPHCGDRTFYDPEPIIjCPCFMPN LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> GlaxoSmithKline Biologicals SA <120> Vacina <130> VB62293 <150> 0700760.2 <151> 2007-01-15 <150> 0701262.8 <151> 2007-01-23 <160> 45 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0 <210> 1 <211> 1887 58

<212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0>

<223> MDP- 20-127 - Proteína D - PRAME - TSGHHHHHH (plasmídeo TCMP14) <40 0> 1 atggatccaa gcagccattc atcaaatatg gcgaataccc aaatgaaatc agacaaaatc 60 attattgctc accgtggtgc tagcggttat ttaccagagc atacgttaga atctaaagca 120 cttgcgtttg cacaacaggc tgattattta gagcaagatt tagcaatgac taaggatggt 180 cgtttagtgg ttattcacga tcacttttta gatggcttga ctgatgttgc gaaaaaattc 240 ccacatcgtc atcgtaaaga tggccgttac tatgtcatcg actttacctt aaaagaaatt 300 caaagtttag aaatgacaga aaactttgaa accatggaac gaaggcgttt gtggggttcc 360 attcagagcc gatacatcag catgagtgtg tggacaagcc cacggagact tgtggagctg 420 gcagggcaga gcctgctgaa ggatgaggcc ctggccattg ccgccctgga gttgctgccc 480 agggagctct tcccgccact cttcatggca gcctttgacg ggagacacag ccagaccctg 54 0 aaggcaatgg tgcaggcctg gcccttcacc tgcctccctc tgggagtgct gatgaaggga 600 caacatcttc acctggagac cttcaaagct gtgcttgatg gacttgatgt gctccttgcc 660 caggaggttc gccccaggag gtggaaactt caagtgctgg atttacggaa gaactctcat 720 caggacttct ggactgtatg gtctggaaac agggccagtc tgtactcatt tccagagcca 780 gaagcagctc agcccatgac aaagaagcga aaagtagatg gtttgagcac agaggcagag 840 cagcccttca ttccagtaga ggtgctcgta gacctgttcc tcaaggaagg tgcctgtgat 900 gaattgttct cctacctcat tgagaaagtg aagcgaaaga aaaatgtact acgcctgtgc 960 tgtaagaagc tgaagatttt tgcaatgccc atgcaggata tcaagatgat cctgaaaatg 1020 gtgcagctgg actctattga agatttggaa gtgacttgta cctggaagct acccaccttg 1080 gcgaaatttt ctccttacct gggccagatg attaatctgc gtagactcct cctctcccac 1140 atccatgcat cttcctacat ttccccggag aaggaagagc agtatatcgc ccagttcacc 1200 tctcagttcc tcagtctgca gtgcctgcag gctctctatg tggactcttt atttttcctt 1260 agaggccgcc tggatcagtt gctcaggcac gtgatgaacc ccttggaaac cctctcaata 1320 actaactgcc ggctttcgga aggggatgtg atgcatctgt cccagagtcc cagcgtcagt 1380 cagctaagtg tcctgagtct aagtggggtc atgctgaccg atgtaagtcc cgagcccctc 1440 caagctctgc tggagagagc ctctgccacc ctccaggacc tggtctttga tgagtgtggg 1500 atcacggatg atcagctcct tgccctcctg ccttccctga gccactgctc ccagcttaca 1560 accttaagct tctacgggaa ttccatctcc atatctgcct tgcagagtct cctgcagcac 1620 ctcatcgggc tgagcaatct gacccacgtg ctgtatcctg tccccctgga gagttatgag 1680 59 gacatccatg gtaccctcca cctggagagg cttgcctatc tgcatgccag gctcagggag 1740 ttgctgtgtg agttggggcg gcccagcatg gtctggctta gtgccaaccc ctgtcctcac 1800 tgtggggaca gaaccttcta tgacccggag cccatcctgt gcccctgttt catgcctaac 1860 actagtggcc accatcacca tcaccat 1887

<210> 2 <211> 629 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220>

<223> MDP- 20-127 - Proteína D - PRAME - TSGHHHHHH (plasmídeo TCMP14) <400> 2

Met Asp Pro Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gin Met Lys 1 5 10 15 Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro 20 25 30 Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gin Gin Ala Asp 35 40 45 Tyr Leu Glu Gin Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Vai Vai 50 55 60 Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Vai Ala Lys Lys Phe 65 70 75 80 Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Vai Ile Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Glu Ile Gin Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Met 100 105 110 Glu Arg Arg Arg Leu Trp Gly Ser Ile Gin Ser Arg Tyr Ile Ser Met 115 120 125 Ser Vai Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Vai Glu Leu Ala Gly Gin Ser 130 135 140 Leu Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu Glu Leu Leu Pro 145 150 155 160 60

Arg Clu Leu Phe Pro Pro Leu Phe Met Ala Ala Phe Asp Gly Arg His 165 170 175 Ser Gin Thr Leu Lys Ala Met Vai Gin Ala Trp Pro Phe Thr Cys Leu 180 185 190 Pro Leu Gly Vai Leu Met Lys Gly Gin His Leu His Leu Glu Thr Phe 195 200 205 Lys Ala Vai Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu Ala Gin Glu Val Arg 210 215 220 Pro Arg Arg Trp Lys Leu Gin Val Leu Asp Leu Arg Lys Asn Ser His 225 230 235 240 Gin Asp Phe Trp Thr Vai Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Tyr Ser 245 250 255 Phe Pro Glu Pro Glu Ala Ala Gin Pro Met Thr Lys Lys Arg Lys Val 260 265 270 Asp Gly Leu Ser Thr Glu Ala Glu Gin Pro Phe lie Pro Val Glu Val 275 280 285 Leu Vai Asp Leu Phe Leu Lys Glu Gly Ala Cys Asp Glu Leu Phe Ser 290 295 300 Tyr Leu Ile Glu Lys Vai Lys Arg Lys Lys Asn Val Leu Arg Leu Cys 305 310 315 320 Cys Lys Lys Leu Lys Ile Phe Ala Met Pro Met Gin Asp Ile Lys Met 325 330 335 Ile Leu Lys Met Vai Gin Leu Asp Ser Ile Glu Asp Leu Glu Val Thr 340 345 350 Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu Ala Lys Phe Ser Pro Tyr Leu Gly 355 360 365 Gin Met Ile Asn Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ser His Ile His Ala Ser 370 375 380 Ser Tyr Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gin Tyr Ile Ala Gin Phe Thr 385 390 395 400 Ser Gin Phe Leu Ser Leu Gin Cys Leu Gin Ala Leu Tyr val Asp Ser 405 410 415 Leu Phe Phe Leu Arg Gly Arg Leu Asp Gin Leu Leu Arg His Val Met 420 425 430 Asn Pro Leu Glu Thr Leu Ser Ile Thr Asn Cys Arg Leu Ser Glu Gly 435 44 0 445 Asp Vai Met His Leu Ser Gin Ser Pro Ser Val Ser Gin Leu Ser Val 450 455 460 61

Leu Ser Leu Ser Gly Vai Met Leu Thr Asp Vai Ser Pro Glu Pro Leu 465 470 475 4 80 Gin Ala Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Thr Leu Gin Asp Leu Vai Phe 485 490 495 Asp Glu Cys Gly Ile Thr Asp Asp Gin Leu Leu Ala Leu Leu Pro Ser 500 505 510 Leu Ser His Cys Ser Gin Leu Thr Thr Leu Ser Phe Tyr Gly Asn Ser 515 520 525 Ile Ser Ile Ser Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gin His Leu Ile Gly Leu 530 535 540 Ser Asn Leu Thr His Vai Leu Tyr Pro Vai Pro Leu Glu Ser Tyr Glu 545 550 555 560 Asp Ile His Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His Ala 565 570 575 Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Vai Trp 580 585 590 Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr Asp 595 600 605 Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn Thr Ser Gly His 610 615 620

His His His His His 625 <210> 3 <211> 1860

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> MDP- 20-127 - Proteína D - PRAME - sem cauda de His (plasmídeo TCMP14) 62 <400> 3 atggatccaa gcagccattc atcaaatatg gcgaataccc aaatgaaatc agacaaaatc 60 attattgctc accgtggtgc tagcggttat ttaccagagc atacgttaga atctaaagca 120 cttgcgtttg cacaacaggc tgattattta gagcaagatt tagcaatgac taaggatggt 180 cgtttagtgg ttattcacga tcacttttta gatggcttga ctgatgttgc gaaaaaattc 240 ccacatcgtc atcgtaaaga tggccgttac tatgtcatcg actttacctt aaaagaaatt 300 caaagtttag aaatgacaga aaactttgaa accatggaac gaaggcgttt gtggggttcc 360 attcagagcc gatacatcag catgagtgtg tggacaagcc cacggagact tgtggagctg 420 gcagggcaga gcctgctgaa ggatgaggcc ctggccattg ccgccctgga gttgctgccc 480 agggagctct tcccgccact cttcatggca gcctttgacg ggagacacag ccagaccctg 540 aaggcaatgg tgcaggcctg gcccttcacc tgcctccctc tgggagtgct gatgaaggga 600 caacâtcttc acctggâgac cttcaaágct gtgcttgatg gacttgatgt gctccttgcc 660 caggaggttc gccccaggag gtggaaactt caagtgctgg atttacggaa gaactctcat 720 caggacttct ggactgtatg gtctggaaac agggccagtc tgtactcatt tccagagcca 780 gaagcagctc agcccatgac aaagaagcga aaagtagatg gtttgagcac agaggcagag 840 cagcccttca ttccagtaga ggtgctcgta gacctgttcc tcaaggaagg tgcctgtgat 900 gaattgttct cctacctcat tgagaaagtg aagcgaaaga aaaatgtact acgcctgtgc 960 tgtaagaagc tgaagatttt tgcaatgccc atgcaggata tcaagatgat cctgaaaatg 1020 gtgcagctgg actctattga agatttggaa gtgacttgta cctggaagct acccaccttg 1080 gcgaaatttt ctccttacct gggccagatg attaatctgc gtagactcct cctctcccac 1140 atccatgcat cttcctacat ttccccggag aaggaagagc agtatatcgc ccagttcacc 1200 tctcagttcc tcagtctgca gtgcctgcag gctctctatg tggactcttt atttttcctt 1260 agaggccgcc tggatcagtt gctcaggcac gtgatgaacc ccttggaaac cctctcaata 1320 actaactgcc ggctttcgga a9999at9t9 atgcatctgt cccagagtcc cagcgtcagt 1380 cagctaagtg tcctgagtct aagtggggtc atgctgaccg atgtaagtcc cgagcccctc 1440 caagctctgc tggagagagc ctctgccacc ctccaggacc tggtctttga tgagtgtggg 1500 atcacggatg atcagctcct tgccctcctg ccttccctga gccactgctc ccagcttaca 1560 accttaagct tctacgggaa ttccatctcc atatctgcct tgcagagtct cctgcagcac 1620 ctcatcgggc tgagcaatct gacccacgtg ctgtatcctg tccccctgga gagttatgag 1680 gacatccatg gtaccctcca cctggagagg cttgcctatc tgcatgccag gctcagggag 1740 ttgctgtgtg agttggggcg gcccagcatg gtctggctta gtgccaaccc ctgtcctcac 1800 tgtggggaca gaaccttcta tgacccggag cccatcctgt gcccctgttt catgcctaac 1860

<210> 4 <211> 620 <212> PRT <213> Sequência Artificial 63 <220> <223> MDP- 2 0-12 7 - Proteína D - PRAME - sem cauda de His (plasmídeo TCMP14) <400> 4

Met Asp Pro Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gin Met Lys 1 5 10 15 Ser Asp Lys Ile He Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro 20 25 30 Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gin Gin Ala Asp 35 40 45 Tyr Leu Glu Gin Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Vai Vai 50 55 60 Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Vai Ala Lys Lys Phe 65 70 75 80 Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Vai Ile Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Glu Ile Gin Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Met 100 105 110 Glu Arg Arg Arg Leu Trp Gly Ser Ile Gin Ser Arg Tyr Ile Ser Met 115 120 125 Ser Vai Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Vai Glu Leu Ala Gly Gin Ser 130 135 140 Leu Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu Glu Leu Leu Pro 145 150 155 160 Arg Glu Leu Phe Pro Pro Leu Phe Met Ala Ala Phe Asp Gly Arg His 165 170 175 Ser Gin Thr Leu Lys Ala Met Vai Gin Ala Trp Pro Phe Thr Cys Leu 180 185 190 Pro Leu Gly Vai Leu Met Lys Gly Gin His Leu His Leu Glu Thr Phe 195 200 205 Lys Ala Vai Leu Asp Gly Leu Asp Vai Leu Leu Ala Gin Glu Vai Arg 210 215 220 Pro Arg Arg Trp Lys Leu Gin Vai Leu Asp Leu Arg Lys Asn Ser His 225 230 235 240 Gin Asp Phe Trp Thr Vai Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Tyr Ser 245 250 255 64

Phe Pro Glu Pro Glu Ala Ala Gin 260 Asp Gly Leu Ser Thr Glu Ala Glu 275 280 Leu Vai Asp Leu Phe Leu Lys Glu 290 295 Tyr Leu Ile Glu Lys Vai Lys Arg 305 310 Cys Lys Lys Leu Lys Ile Phe Ala 325 Ile Leu Lys Met Vai Gin Leu Asp 340 Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu 355 360 Gin Met Ile Asn Leu Arg Arg Leu 370 375 Ser Tyr Ile Ser Pro Glu Lys Glu 385 390 Ser Gin Phe Leu Ser Leu Gin Cys 405 Leu Phe Phe Leu Arg Gly Arg Leu 420 Asn Pro Leu Glu Thr Leu Ser Ile 435 440 Asp Vai Met His Leu Ser Gin Ser 450 455 Leu Ser Leu Ser Gly Vai Met Leu 465 470 Gin Ala Leu Leu Glu Arg Ala Ser 485 Asp Glu Cys Gly Ile Thr Asp Asp 500 Leu Ser His Cys Ser Gin Leu Thr 515 520 Ile Ser Ile Ser Ala Leu Gin Ser 530 535 Ser Asn Leu Thr His Vai Leu Tyr 545 550

Pro Met Thr Lys Lys Arg Lys Val 265 270 Gin Pro Phe Ile Pro Vai Glu Val 285 Gly Ala Cys Asp Glu Leu Phe Ser 300 Lys Lys Asn Vai Leu Arg Leu Cys 315 320 Met Pro Met Gin Asp Ile Lys Met 330 335 Ser Ile Glu Asp Leu Glu Vai Thr 345 350 Ala Lys Phe Ser Pro Tyr Leu Gly 365 Leu Leu Ser His Ile His Ala Ser 380 Glu Gin Tyr Ile Ala Gin Phe Thr 395 400 Leu Gin Ala Leu Tyr Vai Asp Ser 410 415 Asp Gin Leu Leu Arg His Vai Met 425 430 Thr Asn Cys Arg Leu Ser Glu Gly 445 Pro Ser Vai Ser Gin Leu Ser Val 460 Thr Asp Vai Ser Pro Glu Pro Leu 475 480 Ala Thr Leu Gin Asp Leu Val Phe 490 495 Gin Leu Leu Ala Leu Leu Pro Ser 505 510 Thr Leu Ser Phe Tyr Gly Asn Ser 525 Leu Leu Gin His Leu Ile Gly Leu 540 Pro Vai Pro Leu Glu Ser Tyr Glu 555 560 65

Asp Ile HÍS Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His Ala 565 570 575 Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Vai Trp 580 585 590 Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr Asp 595 600 605 Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn 610 615 620

<210> 5 <211> 1884 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0>

<223> MDP- 20-127 - Proteína D - PRAME - LEHHHHHH (plasmídeo ρΕΤ21) <400> 5 atggatccaa gcagccattc atcaaatatg gcgaataccc aaatgaaatc agacaaaatc 60 attattgctc accgtggtgc tagcggttat ttaccagagc atacgttaga atctaaagca 120 cttgcgtttg cacaacaggc tgattattta gagcaagatt tagcaatgac taaggatggt 180 cgtttagtgg ttattcacga tcacttttta gatggcttga ctgatgttgc gaaaaaattc 240 ccacatcgtc atcgtaaaga tggccgttac tatgtcatcg actttacctt aaaagaaatt 300 caaagtttag aaatgacaga aaactttgaa accatggaac gaaggcgttt gtggggttcc 360 attcagagcc gatacatcag catgagtgtg tggacaagcc cacggagact tgtggagctg 420 gcagggcaga gcctgctgaa ggatgaggcc ctggccattg ccgccctgga gttgctgccc 480 agggagctct tcccgccact cttcatggca gcctttgacg ggagacacag ccagaccctg 540 aaggcaatgg tgcaggcctg gcccttcacc tgcctccctc tgggagtgct gatgaaggga 600 caacatcttc acctggagac cttcaaagct gtgcttgatg gacttgatgt gctccttgcc 660 caggaggttc gccccaggag gtggaaactt caagtgctgg atttacggaa gaactctcat 720 caggacttct ggactgtatg gtctggaaac agggccagtc tgtactcatt tccagagcca 780 gaagcagctc agcccatgac aaagaagcga aaagtagatg gtttgagcac agaggcagag 840 cagcccttca ttccagtaga ggtgctcgta gacctgttcc tcaaggaagg tgcctgtgat 900 66 gaattgttct cctacctcat tgagaaagtg aagcgaaaga aaaatgtact acgcctgtgc 960 tgtaagaagc tgaagatttt tgcaatgccc atgcaggata tcaagatgat cctgaaaatg 1020 gtgcagctgg actctattga agatttggaa gtgacttgta cctggaagct acccaccttg 1080 gcgaaatttt ctccttacct gggccagatg attaatctgc gtagactcct cctctcccac 1140 atccatgcat cttcctacat ttccccggag aaggaagagc agtatatcgc ccagttcacc 1200 tctcagttcc tcagtctgca gtgcctgcag gctctctatg tggactcttt atttttcctt 1260 agaggccgcc tggatcagtt gctcaggcac gtgatgaacc ccttggaaac cctctcaata 1320 actaactgcc ggctttcgga aggggatgtg atgcatctgt cccagagtcc cagcgtcagt 1380 cagctaagtg tcctgagtct aagtggggtc atgctgaccg atgtaagtcc cgagcccctc 1440 caagctctgc tggagagagc ctctgccacc ctccaggacc tggtctttga tgagtgtggg 1500 atcacggatg atcagctcct tgccctcctg ccttccctga gccactgctc ccagcttaca 1560 accttaagct tctacgggaa ttccatctcc atatctgcct tgcagagtct cctgcagcac 1620 ctcatcgggc tgagcaatct gacccacgtg ctgtatcctg tccccctgga gagttatgag 1680 gacatccatg gtaccctcca cctggagagg cttgcctatc tgcatgccag gctcagggag 1740 ttgctgtgtg agttggggcg gcccagcatg gtctggctta gtgccaaccc ctgtcctcac 1800 tgtggggaea gaaccttcta tgacccggag cccatcctgt gcccctgttt catgcctaac 1860 ctcgagcacc accaccacca ccac 1884

<210> 6 <211> 628 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0>

<223> MDP- 20-127 - Proteína D - PRAME - LEHHHHHH (plasmídeo pET21) < 4 0 0 > 6

Met Asp Pro Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gin Met Lys 1 5 10 15 Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro 20 25 30 Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gin Gin Ala Asp 35 40 45 Tyr Leu Glu Gin Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Vai Vai 50 55 60 67

Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe 65 70 75 80 Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Glu Ile Gin Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Met 100 105 110 Glu Arg Arg Arg Leu Trp Gly Ser ile Gin Ser Arg Tyr Ile Ser Met 115 120 125 Ser Vai Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Val Glu Leu Ala Gly Gin Ser 130 135 14 0 Leu Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu Glu Leu Leu Pro 145 150 155 160 Arg Glu Leu Phe Pro Pro Leu Phe Met Ala Ala Phe Asp Gly Arg His 165 170 175 Ser Gin Thr Leu Lys Ala Met Val Gin Ala Trp Pro Phe Thr Cys Leu 180 185 190 Pro Leu Gly Vai Leu Met Lys Gly Gin His Leu His Leu Glu Thr Phe 195 200 205 Lys Ala Vai Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu Ala Gin Glu Val Arg 210 215 220 Pro Arg Arg Trp Lys Leu Gin Val Leu Asp Leu Arg Lys Asn Ser His 225 230 235 240 Gin Asp Phe Trp Thr val Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Tyr Ser 245 250 255 Phe Pro Glu Pro Glu Ala Ala Gin Pro Met Thr Lys Lys Arg Lys Val 260 265 270 Asp Gly Leu Ser Thr Glu Ala Glu Gin Pro Phe Ile Pro Val Glu Val 275 280 285 Leu Vai Asp Leu Phe Leu Lys Glu Gly Ala Cys Asp Glu Leu Phe Ser 290 295 300 Tyr Leu Ile Glu Lys Val Lys Arg Lys Lys Asn Val Leu Arg Leu Cys 305 310 315 320 Cys Lys Lys Leu Lys Ile Phe Ala Met Pro Met Gin Asp Ile Lys Met 325 330 335 Ile Leu Lys Met Vai Gin Leu Asp Ser Ile Glu Asp Leu Glu Val Thr 340 345 350 Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu Ala Lys Phe Ser Pro Tyr Leu Gly 355 360 365 68

Gin Met Ile Asn Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ser His Ile His Ala Ser 370 375 380 Ser Tyr Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gin Tyr Ile Ala Gin Phe Thr 385 390 395 400 Ser Gin Phe Leu Ser Leu Gin Cys Leu Gin Ala Leu Tyr Vai Asp Ser 405 410 415 Leu Phe Phe Leu Arg Gly Arg Leu Asp Gin Leu Leu Arg His Vai Met 420 425 430 Asn Pro Leu Glu Thr Leu Ser Ile Thr Asn Cys Arg Leu Ser Glu Gly 435 440 445 Asp Vai Met His Leu Ser Gin Ser Pro Ser Vai Ser Gin Leu Ser Vai 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Gly Vai Met Leu Thr Asp Vai Ser Pro Glu Pro Leu 465 470 475 480 Gin Ala Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Thr Leu Gin Asp Leu Vai Phe 485 490 495 Asp Glu Cys Gly Ile Thr Asp Asp Gin Leu Leu Ala Leu Leu Pro Ser 500 505 510 Leu Ser His Cys Ser Gin Leu Thr Thr Leu Ser Phe Tyr Gly Asn Ser 515 520 525 Ile Ser Ile Ser Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gin His Leu Ile Gly Leu 530 535 540 Ser Asn Leu Thr His Vai Leu Tyr Pro Vai Pro Leu Glu Ser Tyr Glu 545 550 555 560 Asp Ile His Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His Ala 565 570 575 Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Vai Trp 580 585 590 Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr Asp 595 600 605 Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn Leu Glu His His 610 615 620 His His His His 625 <210> 7 <211> 1860 <212> ADN 69 <213> Sequência Artificial <22 0> <223> MDP- 20-127 - Proteína D - PRAME - sem cauda de His (plasmídeo pET21) <400> 7 atggatccaa gcagccattc atcaaatatg gcgaataccc aaatgaaatc agacaaaatc 60 attattgctc accgtggtgc tagcggttat ttaccagagc atacgttaga atctaaagca 120 cttgcgtctg cacaacaggc tgattattta gagcaagatt tagcaatgac taaggatggt 1B0 cgtttagtgg ttattcacga tcacttttta gatggcttga ctgatgttgc gaaaaaattc 240 ccacatcgtc atcgtaaaga tggccgttac tatgtcatcg actttacctt aaaagaaatt 300 caaagtttag aaatgacaga aaactttgaa accatggaac gaaggcgttt gtggggttcc 360 attcagagcc gatacatcag catgagtgtg tggacaagcc cacggagact tgtggagctg 420 gcagggcaga gcctgctgaa ggatgaggcc ctggccattg ccgccctgga gttgctgccc 480 agggagctct tcccgccact cttcatggca gcctttgacg ggagacacag ccagaccctg 540 aaggcaatgg tgcaggcctg gcccttcacc tgcctccctc tgggagtgct gatgaaggga 600 caacatcttc acctggagac cttcaaagct gtgcttgatg gacttgatgt gctccttgcc 660 caggaggttc gccccaggag gtggaaactt caagtgctgg atttacggaa gaactctcat 720 caggacttct ggactgtatg gtctggaaac agggccagtc tgtactcatt tccagagcca 780 gaagcagctc agcccatgac aaagaagcga aaagtagatg gtttgagcac agaggcagag 840 cagcccttca ttccagtaga ggtgctcgta gacctgttcc tcaaggaagg tgcctgtgat 900 gaattgttct cctacctcat tgagaaagtg aagcgaaaga aaaatgtact acgcctgtgc 960 tgtaagaagc tgaagatttt tgcaatgccc atgcaggata tcaagatgat cctgaaaatg 1020 gtgcagctgg actctattga agatttggaa gtgacttgta cctggaagct acccaccttg 1080 gcgaaatttt ctccttacct gggccagatg attaatctgc gtagactcct cctctcccac 1140 atccatgcat cttcctacat ttccccggag aaggaagagc agtatatcgc ccagttcacc 1200 tctcagttcc tcagtctgca gtgcctgcag gctctctatg tggactcttt atttttcctt 1260 agaggccgcc tggatcagtt gctcaggcac gtgatgaacc ccttggaaac cctctcaata 1320 actaactgcc ggctttcgga aggggatgtg atgcatctgt cccagagtcc cagcgtcagt 1380 cagctaagtg tcctgagtct aagtggggtc atgctgaccg atgtaagtcc cgagcccctc 1440 caagctctgc tggagagagc ctctgccacc ctccaggacc tggtctttga tgagtgtggg 1500 atcacggatg atcagctcct tgccctcctg ccttccctga gccactgctc ccagcttaca 1560 accttaagct tctacgggaa ttccatctcc atatctgcct tgcagagtct cctgcagcac 1620 ctcatcgggc tgagcaatct gacccacgtg ctgtatcctg tcccectgga gagttatgag 1680 gacatccatg gtaccctcca cctggagagg cttgcctatc tgcatgccag gctcagggag 1740 ttgctgtgtg agttggggcg gcccagcatg gtctggctta gtgccaaccc ctgtcctcac 1800 tgtggggaca gaaccttcta tgacccggag cccatcctgt gcccctgttt catgcctaac 1860 70 <210>

<211> 620 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> MDP- 2 0-12 7 - Proteína D - PRAME - sem cauda de His (plasmídeo pET21) <400> 8

Met Asp Pro Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gin Met Lys 1 5 10 15 Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro 20 25 30 Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gin Gin Ala Asp 35 40 45 Tyr Leu Glu Gin Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val 50 55 60 Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe 65 70 75 80 Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Glu Ile Gin Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Met 100 105 110 Glu Arg Arg Arg Leu Trp Gly Ser Ile Gin Ser Arg Tyr Ile Ser Met 115 120 125 Ser Vai Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Val Glu Leu Ala Gly Gin Ser 130 135 140 Leu Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu Glu Leu Leu Pro 145 150 155 ISO Arg Glu Leu Phe Pro Pro Leu Phe Met Ala Ala Phe Asp Gly Arg His 165 170 175 Ser Gin Thr Leu Lys Ala Met Val Gin Ala Trp Pro Phe Thr Cys Leu 180 185 190 Pro Leu Gly Vai Leu Met Lys Gly Gin His Leu His Leu Glu Thr Phe 195 200 205 71

Lys Ala Vai Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu Ala Gin Glu Val Arg 210 215 220 Pro Arg Arg Trp Lys Leu Gin Val Leu Asp Leu Arg Lys Asn Ser His 225 230 235 240 Gin Asp Phe Trp Thr val Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Tyr Ser 245 250 255 Phe Pro Glu Pro Glu Ala Ala Gin Pro Met Thr Lys Lys Arg Lys Val 260 265 270 Asp Gly Leu Ser Thr Glu Ala Glu Gin Pro Phe Ile Pro Val Glu Val 275 280 285 Leu Vai Asp Leu Phe Leu Lys Glu Gly Ala Cys Asp Glu Leu Phe Ser 290 295 300 Tyr Leu Ile Glu Lys Val Lys Arg Lys Lys Asn Val Leu Arg Leu Cys 305 310 315 320 Cys Lys Lys Leu Lys Ile Phe Ala Met Pro Met Gin Asp Ile Lys Met 325 330 335 Ile Leu Lys Met Vai Gin Leu Asp Ser Ile Glu Asp Leu Glu Val Thr 340 345 350 Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu Ala Lys Phe Ser Pro Tyr Leu Gly 355 360 365 Gin Met Ile Asn Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ser His Ile His Ala Ser 370 375 380 Ser Tyr Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gin Tyr Ile Ala Gin Phe Thr 385 390 395 400 Ser Gin Phe Leu Ser Leu Gin Cys Leu Gin Ala Leu Tyr Val Asp Ser 405 410 415 Leu Phe Phe Leu Arg Gly Arg Leu Asp Gin Leu Leu Arg His Val Met 420 425 430 Asn Pro Leu Glu Thr Leu Ser Ile Thr Asn Cys Arg Leu Ser Glu Gly 435 440 445 Asp Vai Met His Leu Ser Gin Ser Pro Ser Val Ser Gin Leu Ser Val 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Gly Val Met Leu Thr Asp Val Ser Pro Glu Pro Leu 465 470 475 480 Gin Ala Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Thr Leu Gin Asp Leu Val Phe 485 490 495 Asp Glu Cys Gly Ile Thr Asp Asp Gin Leu Leu Ala Leu Leu Pro Ser 500 505 510 72

Leu Ser His Cys Ser Gin Leu Thr Thr Leu Ser Phe Tyr Gly Asn Ser 515 520 525 Ile Ser Ile Ser Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gin His Leu Ile Gly Leu 530 535 54 0 Ser Asn Leu Thr His Vai Leu Tyr Pro Vai Pro Leu Glu Ser Tyr Glu 545 550 555 560 Asp Ile His Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His Ala 565 570 575 Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Vai Trp 580 585 590 Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr Asp 595 600 605 Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn 610 615 620 <210> 9 <211> 1878

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> MDP- 20-127 - Proteína D - PR ΑΜΕ - ΗΗΗΗΗΗ (plasmídeo ρΕΤ26) <400> 9 atggatccaa gcagccattc atcaaatatg gcgaataccc aaatgaaatc agacaaaatc 60 attattgctc accgtggtgc tagcggttat ttaccagagc atacgttaga atctaaagca 120 cttgcgtttg cacaacaggc tgattattta gagcaagatt tagcaatgac taaggatggt 180 cgtttagtgg ttattcacga tcacttttta gatggcttga ctgatgttgc gaaaaaattc 240 ccacatcgtc atcgtaaaga tggccgttac tatgtcatcg actttacctt aaaagaaatt 300 caaagtttag aaatgacaga aaactttgaa accatggaac gtcgtcgtct gtggggcagc 360 attcagagcc gttatattag catgagcgtg tggaccagcc cgcgtcgtct ggttgagctg 420 gccggccaga gcctgctgaa agatgaagcg ctggccattg cggcgctgga gctgctgccg 480 cgtgagctgt ttccgccgct gtttatggcg gcgtttgatg gccgtcatag ccagaccctg 540 aaagcgatgg tgcaggcgtg gccgtttacc tgtctgccgc tgggcgtgct gatgaaaggc 600 73 cagcatctgc atctggaaac ctttaaagcg gtgctggatg gcctggatgt gctgctggcc 660 caggaagttc gtccgcgtcg ttggaaactg caagtgctgg atctgcgtaa aaacagccat 720 caggattttt ggaccgtgtg gagcggcaat cgtgcgagcc tgtatagctt tccggaaccg 780 gaagcggcgc agccgatgac caaaaaacgt aaagtggatg gcctgagcac cgaagcggaa 840 cagccgttta ttccggtgga agtgctggtt gacctgtttc tgaaagaagg cgcctgcgac 900 gagctgttta gctatctgat cgaaaaagtg aaacgcaaaa aaaacgtgct gcgtctgtgc 960 tgcaaaaaac tgaaaatctt cgcgatgccg atgcaggata ttaaaatgat cctgaaaatg 1020 gtgcagctgg atagcattga ggacctggaa gtgacctgca cctggaaact gccgaccctg 1080 gccaaattta gcccgtatct gggccagatg attaacctgc gtcgtctgct gctgtctcat 1140 attcatgcga gcagctatat tagcccggaa aaagaagaac agtatatcgc gcagtttacc 1200 agccagtttc tgagcctgca atgcctgcaa gcgctgtatg tggatagcct gttttttctg 1260 cgtggccgtc tggatcagct gctgcgtcat gtgatgaatc cgctggaaac cctgagcatt 1320 accaactgcc gtctgagcga aggcgatgtg atgcatctga gccagagccc gagcgttagc 1380 cagctgtctg ttctgagcct gagcggcgtg atgctgaccg atgtgagccc ggaaccgctg 1440 caagccctgc tggaacgtgc gagcgcgacc ctgcaagacc tggtgtttga tgaatgcggc 1500 attaccgatg atcagctgct ggccctgctg ccgagcctga gccattgcag ccagctgacc 1560 accctgagct tttatggcaa cagcattagc attagcgcgc tgcaaagcct gctgcaacat 1620 ctgattggcc tgagcaacct gacccatgtg ctgtatccgg tgccgctgga aagctatgaa 1680 gatattcatg gcaccctgca tctggaacgt ctggcctatc tgcacgcgcg tctgcgtgag 1740 ctgctgtgcg agctgggccg tccgagcatg gtttggctgt ctgcgaatcc gtgcccgcat 1800 tgcggcgatc gtacctttta tgatccggaa ccgattctgt gcccgtgctt tatgccgaac 1860 caccaccacc accaccac 1878 <210> 10 <211> 626 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> MDP- 20-127 - Proteína D - PRAME - HHHHHH (plasmídeo pET26) <400> 10 Met Asp Pro Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gin Met Lys 1 5 10 15

Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro 20 25 30 74

Glu HÍS Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gin Gin Ala Asp 35 40 45 Tyr Leu Glu Gin Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Vai Val 50 55 60 Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Vai Ala Lys Lys Phe 65 70 75 80 Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Vai Ile Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Glu lie Gin Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Met 100 105 110 Glu Arg Arg Arg Leu Trp Gly Ser Ile Gin Ser Arg Tyr Ile Ser Met 115 120 125 Ser Vai Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Vai Glu Leu Ala Gly Gin Ser 130 135 140 Leu Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu Glu Leu Leu Pro 145 150 155 160 Arg Glu Leu Phe Pro Pro Leu Phe Met Ala Ala Phe Asp Gly Arg His 165 170 175 Ser Gin Thr Leu Lys Ala Met Vai Gin Ala Trp Pro Phe Thr Cys Leu 180 185 190 Pro Leu Gly Vai Leu Met Lys Gly Gin His Leu His Leu Glu Thr Phe 195 200 205 Lys Ala Vai Leu Asp Gly Leu Asp Vai Leu Leu Ala Gin Glu val Arg 210 215 220 Pro Arg Arg Trp Lys Leu Gin Vai Leu Asp Leu Arg Lys Asn Ser His 225 230 235 240 Gin Asp Phe Trp Thr Vai Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Tyr Ser 245 250 255 Phe Pro Glu Pro Glu Ala Ala Gin Pro Met Thr Lys Lys Arg Lys Val 260 265 270 Asp Gly Leu Ser Thr Glu Ala Glu Gin Pro Phe Ile Pro Vai Glu val 275 280 285 Leu Vai Asp Leu Phe Leu Lys Glu Gly Ala Cys Asp Glu Leu Phe Ser 290 295 300 Tyr Leu Ile Glu Lys Vai Lys Arg Lys Lys Asn Vai Leu Arg Leu Cys 305 310 315 320 75

Cys Lys Lys Leu Lys He Phe Ala Met Pro Met Gin Asp Ile Lys Met 325 330 335 Ile Leu Lys Met Vai Gin Leu Asp Ser Ile Glu Asp Leu Glu Vai Thr 340 345 350 Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu Ala Lys Phe Ser Pro Tyr Leu Gly 355 360 365 Gin Met Ile Asn Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ser His Ile His Ala Ser 370 375 380 Ser Tyr Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gin Tyr Ile Ala Gin Phe Thr 385 390 395 400 Ser Gin Phe Leu Ser Leu Gin Cys Leu Gin Ala Leu Tyr Vai Asp Ser 405 410 415 Leu Phe Phe Leu Arg Gly Arg Leu Asp Gin Leu Leu Arg His Vai Met 420 425 430 Asn Pro Leu Glu Thr Leu Ser Ile Thr Asn Cys Arg Leu Ser Glu Gly 435 440 445 Asp Vai Met His Leu Ser Gin Ser Pro Ser Vai Ser Gin Leu Ser Vai 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Gly Vai Met Leu Thr Asp Vai Ser Pro Glu Pro Leu 465 470 475 480 Gin Ala Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Thr Leu Gin Asp Leu Vai Phe 485 490 495 Asp Glu Cys Gly Ile Thr Asp Asp Gin Leu Leu Ala Leu Leu Pro Ser 500 505 510 Leu Ser His Cys Ser Gin Leu Thr Thr Leu Ser Phe Tyr Gly Asn Ser 515 520 525 Ile Ser Ile Ser Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gin His Leu Ile Gly Leu 530 535 540 Ser Asn Leu Thr His Vai Leu Tyr Pro Vai Pro Leu Glu Ser Tyr Glu 545 550 555 560 Asp Ile His Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His Ala 565 570 575 Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Vai Trp 580 585 590 76

His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr Asp 600 605 Cys Phe Met Pro Asn His His His His 620

Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro 595

Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro 610 615

His His 625 <210> 11 <211> 1860 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> MDP- 20-127 - Proteína D - PRAME - sem cauda de His (plasmídeo pET26) <400> 11 atggatccaa gcagccattc atcaaatatg gcgaataccc aaatgaaatc agacaaaatc 60 attattgctc accgtggtgc tagcggttat ttaccagagc atacgttaga atctaaagca 120 cttgcgtttg cacaacaggc tgattattta gagcaagatt tagcaatgac taaggatggt 180 cgtttagtgg ttattcacga tcacttttta gatggcttga ctgatgttgc gaaaaaattc 240 ccacatcgtc atcgtaaaga tggccgttac tatgtcatcg actttacctt aaaagaaatt 300 caaagtttag aaatgacaga aaactttgaa accatggaac gtcgtcgtct gtggggcagc 360 attcagagcc gttatattag catgagcgtg tggaccagcc cgcgtcgtct ggttgagctg 420 gccggccaga gcctgctgaa agatgaagcg ctggccattg cggcgctgga gctgctgccg 480 egtgagotgt ttccgccgct gtttatggcg gcgtttgatg gccgtcatag ccagaccctg 540 aaagcgatgg tgcaggcgtg gccgtttacc tgtctgccgc tgggcgtgct gatgaaaggc 600 cagcatctgc atctggaaac ctttaaagcg gtgctggatg gcctggatgt gctgctggcc 660 caggaagttc gtccgcgtcg ttggaaactg caagtgctgg atctgcgtaa aaacagccat 720 caggattttt ggaccgtgtg gagcggcaat cgtgcgagcc tgtatagctt tccggaaccg 780 gaagcggcgc agccgatgac caaaaaacgt aaagtggatg gcctgagcac cgaagcggaa 840 cagccgttta ttccggtgga agtgctggtt gacctgtttc tgaaagaagg cgcctgcgac 900 gagctgttta gctatctgat cgaaaaagtg aaacgcaaaa aaaacgtgct gcgtctgtgc 960 tgcaaaaaac tgaaaatctt cgcgatgccg atgcaggata ttaaaatgat cctgaaaatg 1020 gtgcagctgg atagcattga ggacctggaa gtgacctgca cctggaaact gccgaccctg 1080 77 gccaaattta gcccgtatct gggccagatg attaacctgc gtcgtctgct gctgtctcat 1140 attcatgcga gcagctatat tagcccggaa aaagaagaac agtatatcgc gcagtttacc 1200 agccagtttc tgagcctgca atgcctgcaa gcgctgtatg tggatagcct gttttttctg 1260 cgtggccgtc tggatcagct gctgcgtcat gtgatgaatc cgctggaaac cctgagcatt 1320 accaactgcc gtctgagcga aggcgatgtg atgcatctga gccagagccc gagcgttagc 1380 cagctgtctg ttctgagcct gagcggcgtg atgctgaccg atgtgagccc ggaaccgctg 1440 caagccctgc tggaacgtgc gagcgcgacc ctgcaagacc tggtgtttga tgaatgcggc 1500 attaccgatg atcagctgct ggccctgctg ccgagcctga gccattgcag ccagctgacc 1560 accctgagct tttatggcaa cagcattagc attagcgcgc tgcaaagcct gctgcaacat 1620 ctgattggcc tgagcaacct gacccatgtg ctgtatccgg tgccgctgga aagctatgaa 1680 gatattcatg gcaccctgca tctggaacgt ctggcctatc tgcacgcgcg tctgcgtgag 1740 ctgctgtgcg agctgggccg tccgagcatg gtttggctgt ctgcgaatcc gtgcccgcat 1800 tgcggcgatc gtacctttta tgatccggaa ccgattctgt gcccgtgctt tatgccgaac 1860

<210> 12 <211> 620 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> MDP- 20-127 - Proteína D - PRAME - sem cauda de His (plasmídeo pET26) <400> 12

Met Asp Pro Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gin Met Lys 1 5 10 15 Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro 20 25 30 Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gin Gin Ala Asp 35 40 45 Tyr Leu Glu Gin Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Vai Vai 50 55 60 Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Vai Ala Lys Lys Phe 65 70 75 80 Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Vai Ile Asp Phe Thr 85 90 95 78

Leu Lys Glu Ile Gin Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Met 100 105 110 Glu Arg Arg Arg Leu Trp Gly Ser Ile Gin Ser Arg Tyr Ile Ser Met 115 12 0 12 5 Ser vai Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Vai Glu Leu Ala Gly Gin Ser 130 135 140 Leu Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu Glu Leu Leu Pro 145 150 155 160 Arg Glu Leu Phe Pro Pro Leu Phe Met Ala Ala Phe Asp Gly Arg His 165 170 175 Ser Gin Thr Leu Lys Ala Met Vai Gin Ala Trp Pro Phe Thr Cys Leu 180 185 190 Pro Leu Gly Vai Leu Met Lys Gly Gin His Leu His Leu Glu Thr Phe 195 200 205 Lys Ala Vai Leu Asp Gly Leu Asp Vai Leu Leu Ala Gin Glu Vai Arg 210 215 220 Pro Arg Arg Trp Lys Leu Gin Vai Leu Asp Leu Arg Lys Asn Ser His 225 230 235 240 Gin Asp Phe Trp Thr Vai Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Tyr Ser 245 250 255 Phe Pro Glu Pro Glu Ala Ala Gin Pro Met Thr Lys Lys Arg Lys Vai 250 265 270 Asp Gly Leu Ser Thr Glu Ala Glu Gin Pro Phe Ile Pro Vai Glu Vai 275 280 285 Leu Vai Asp Leu Phe Leu Lys Glu Gly Ala Cys Asp Glu Leu Phe Ser 290 295 300 Tyr Leu Ile Glu Lys Vai Lys Arg Lys Lys Asn Vai Leu Arg Leu Cys 305 310 315 320 Cys Lys Lys Leu Lys Ile Phe Ala Met Pro Met Gin Asp Ile Lys Met 325 330 335 Ile Leu Lys Met Vai Gin Leu Asp Ser Ile Glu Asp Leu Glu Vai Thr 340 345 350 Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu Ala Lys Phe Ser Pro Tyr Leu Gly 355 360 365 Gin Met Ile Asn Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ser His Ile His Ala Ser 370 375 380 79

Ser Tyr Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gin Tyr Ile Ala Gin Phe Thr 385 390 395 400 Ser Gin Phe Leu Ser Leu Gin Cys Leu Gin Ala Leu Tyr Vai Asp Ser 405 410 415 Leu Phe Phe Leu Arg Gly Arg Leu Asp Gin Leu Leu Arg His Vai Met 420 425 430 Asn Pro Leu Glu Thr Leu Ser Ile Thr Asn Cys Arg Leu Ser Glu Gly 435 440 445 Asp Vai Met His Leu Ser Gin Ser Pro Ser Vai Ser Gin Leu Ser Vai 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Gly Vai Met Leu Thr Asp Vai Ser Pro Glu Pro Leu 465 470 475 480 Gin Ala Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Thr Leu Gin Asp Leu Vai Phe 485 490 4 95 Asp Glu Cys Gly Ile Thr Asp Asp Gin Leu Leu Ala Leu Leu Pro Ser 500 505 510 Leu Ser His Cys Ser Gin Leu Thr Thr Leu Ser Phe Tyr Gly Asn Ser 515 520 525 Ile Ser Ile Ser Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gin His Leu Ile Gly Leu 530 535 540 Ser Asn Leu Thr His Vai Leu Tyr Pro Vai Pro Leu Glu Ser Tyr Glu 545 550 555 560 Asp Ile His Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His Ala 565 570 575 Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Vai Trp 580 585 590 Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr Asp 595 600 605 Pro Glu Pro ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn 610 615 620

<210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 80 <40 0> 13 Val Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu 1 5 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ser Leu Tyr Ser Phe Pro Glu Pro Glu Ala 1 5 10 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Ala Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu 1 5 10 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16

Leu Tyr Vai Asp Ser Leu Phe Phe Leu 1 5 81

<210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17

Ser Leu Leu Gin His Leu lie Gly Leu 1 5

<210> 18 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido sentido CAN008 <400> 18 atataacata tggatccaag cagccattca tcaaat 36

<210> 19 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido anti-sentido CAN037 <400> 19 ccacaaacgc cttcgttcca tggtttcaaa gttttctgtc 40 <210> 20 82 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sentido CAN036 <40 0> 20 gacagaaaac tttgaaacca tggaacgaag gcgtttgtgg 40 <210> 21 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido anti-sentido CAN029 <40 0> 21 agagagacta gtctagttag gcatgaaaca ggggcacag 39 <210> 22 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido anti-sentido CAN002 <40 0> 22 ggaggaacta gtgttaggca tgaaacaggg gcacag 36 83 <210> 23 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sentido CANO 4 0 <40 0> 23 agagagcata tgagcagcca ttcatcaaat atggcg <210> 24 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido anti-sentido CAN032 <40 0> 24 acgtgggcgg ccgcggtttc aaagttttct gtcatttct. <210> 25 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sentido CANO33 <40 0> 25 ttgttggcgg ccgcaatgga acgaaggcgt ttgtggggt 36 41 39 84 <210> 26 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido anti-sentido CAN034 <40 0> 26 ggaggactcg aggttaggca tgaaacaggg gcacag 36 <210> 27 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido anti-sentido CAN035 <40 0> 27 ggaggactcg agctagttag gcatgaaaca ggggcacag 39 <210> 28 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sentido CAN106 <40 0> 28 85 31 cagaaaactt tgaaaccatg gaacgaaggc g <210> 29 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido anti-sentido CAN107 <40 0> 29 cgccttcgtt ccatggtttc aaagttttct g 31 <210> 30 <211> 43 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sentido CAN104 <40 0> 30 ggagatatac atatggatcc aagcagccat tcatcaaata tgg 43 <210> 31 <211> 43 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido anti-sentido CAN105 86 <400> 31 ccatatttga tgaatggctg cttggatcca tatgtatatc tcc 43

<210> 32 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sentido CAN123 <400> 32 gacagaaaac tttgaaacca tggaacgtcg tcgtctgtgg 40

<210> 33 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido anti-sentido CAN124 <400> 33 ccacagacga cgacgttcca tggtttcaaa gttttctgtc 40

<210> 34 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sentido CAN199 87 <400> 34 ggaattccat atggatccaa gcagccattc 30 <210> 35 <211> 53 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido anti-sentido CAN19 <40 0> 35 ggagctctcg agtcagtggt ggtggtggtg gtggttcggc ataaagcacg ggc 53 <210> 36 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido imunoestimulatório CpG 1826 <400> 36 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 37 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido imunoestimulatório CpG 1758 <400> 37 tctcccagcg tgcgccat 18

<210> 38 <211> 54 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido imunoestimulatório CpG2006 <400> 38 accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 54

<210> 39 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido imunoestimulatório CpG1668 <400> 39 tccatgacgt tcctgatgct 20

<210> 40 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido imunoestimulatório CpG5456 89 <400> 40 22 tcgacgtttt cggcgcgcgc cg

<210> 41 <211> 127 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae b <400> 41

Met Lys Leu Lys Thr Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Gly Vai Leu 1 5 10 15 Ala Gly Cys Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gin Met Lys 20 25 30 Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro 55 40 45 Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Al a Leu Ala Phe Ala Gin Gin Ala Asp 50 55 60 Tyr Leu Glu Gin Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Vai Vai 65 70 75 80 Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Vai Ala Lys Lys Phe 85 90 95 Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Vai Ile Asp Phe Thr 100 105 110 Leu Lys Glu Ile Gin Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr 115 120 125

<210> 42 <211> 111 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220>

<223> 1-Met; 2-Asp; 3-Pro; seguido dos AA 20 a 127 da Proteína D 90 <400> 42

Met Asp Pro Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gin Met Lys 1 5 10 15 Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro 20 25 30 Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gin Gin Ala Asp 35 40 45 Tyr Leu Glu Gin Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val 50 55 60 Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Vai Ala Lys Lys Phe 65 70 75 80 Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Vai Ile Asp Phe Thr as 90 95 Leu Lys Glu Ile Gin Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr 100 105 110

<210> 43 <211> 450 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Proteína D-MAGE-A3-HÍS <400> 43

Met Asp Pro Lys Thr Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Gly Val Leu 1 5 10 15 Ala Gly Cys Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gin Met Lys 20 25 30 Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro 35 40 45 Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gin Gin Ala Asp 50 55 60 91

Tyr Leu Glu Gin Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val 65 70 75 80 Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe 85 90 95 Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr 100 105 110 Leu Lys Glu Ile Gin Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Met 115 120 125 Asp Leu Glu Gin Arg Ser Gin His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu Glu 130 135 14 0 Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Vai Gly Ala Gin Ala Pro Ala Thr 145 150 155 160 Glu Glu Gin Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val Thr 165 17 0 175 Leu Gly Glu Vai Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gin Ser Pro 180 185 190 Gin Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu Trp Ser 195 200 205 Gin ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gin Glu Glu Glu Gly Pro Ser Thr 210 215 220 Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gin Ala Ala Leu Ser Arg Lys Val 225 230 235 240 Ala Glu Leu Vai His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro 245 250 255 Vai Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Vai Val Gly Asn Trp Gin Tyr 260 265 270 Phe Phe Pro Vai Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gin Leu Val 275 280 285 Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Vai Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr Ile 290 295 300 Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp Asn 305 310 315 320 Gin Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile Ile 325 330 335 Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu Glu Leu 340 345 350 Ser Vai Leu Glu Vai Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser ile Leu Gly Asp 355 360 365 92

Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gin His Phe Vai Gin Glu Asn Tyr Leu Glu 370 375 380 Tyr Arg Gin Vai Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu Trp 385 390 395 400 Gly Pro Arg Ala Leu Vai Glu Thr Ser Tyr Vai Lys Vai Leu His His 405 410 415 Met vai Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu His 420 425 430 Glu Trp Vai Leu Arg Glu Gly Glu Glu Gly Gly His His His His His 435 440 445

His His 450

<210> 44 <211> 109 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> os aa da proteína D de Haemophilus influenzae para utilização numa sequência pDl/3-PRAME-His <400> 44

Met Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gin Met Lys Ser Asp 1 5 10 15 Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro Glu His 20 25 30 Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gin Gin Ala Asp Tyr Leu 35 40 45 Glu Gin Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Vai Vai Ile His 50 55 60 Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Vai Ala Lys Lys Phe Pro His 65 70 75 80 93

Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Vai Ile Asp Phe Thr Leu Lys 85 90 95

Glu Ile Gin Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr 100 105

<210> 45 <211> 127 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> os aa da proteína D de Haemophilus influenzae para utilização numa sequência pDl/3-MAGE-His <400> 45

Met Asp Pro Lys Thr Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Gly Val Leu 1 5 10 15 Ala Gly Cys Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gin Met Lys 20 25 30 Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro 35 40 45 Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gin Gin Ala Asp 50 55 60 Tyr Leu Glu Gin Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val 65 70 75 80 Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Vai Ala Lys Lys Phe 85 90 95 Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr 100 105 110 Leu Lys Glu Ile Gin Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr 115 120 125

Lisboa, 12 de Novembro de 2012 94

Claims (18)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Proteína de fusão compreendendo: (a) antigénio PRAME de cancro do testículo; (b) uma proteína parceira de fusão heteróloga derivada de proteína D, em que a proteína parceira de fusão compreende os aminoácidos 20 a 127 da proteína D; e (c) os aminoácidos adicionais Met-Asp-Pro na extremidade N-terminal da sequência da proteína de fusão em que a proteína parceira de fusão heteróloga derivada da proteína D, (b), está fundida ao N-terminal de PRAME
2. 2. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1 compreendendo, ainda, uma cauda de afinidade.
3. 3. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 2, em que a cauda de afinidade é uma cauda de histidina.
4. 4. Proteína de fusão de acordo com qualquer das reivindicações anteriores compreendendo, além disso, uma ou mais sequências ligantes entre a proteína parceira de fusão e o PRAME; ou entre a proteína parceira de fusão e a cauda de afinidade; ou entre o PRAME e a cauda de afinidade.
5. 5. Sequência de ácidos nucleicos codificando uma proteína de fusão, como reivindicada em qualquer das reivindicações 1 a 4. 1
6. 6. Vector compreendendo a sequência de ácidos nucleicos da reivindicação 5.
7. 7. Célula hospedeira isolada transformada com o vector da reivindicação 6.
8. 8. Vacina contendo uma proteína de fusão, como reivindicada em qualquer das reivindicações 1 a 4, ou um ácido nucleico, como reivindicado na reivindicação 5, ou um vector, como reivindicado na reivindicação 6.
9. 9. Vacina como reivindicada na reivindicação 8 compreendendo, além disso, um adjuvante e/ou citocina ou quimiocina imunoestimuladora.
10. 10. Vacina como reivindicada na reivindicação 9, em que o adjuvante compreende 3D-MPL, QS21 e/ou um oligonucleótido CpG.
11. 11. Vacina como reivindicada em qualquer das reivindicações 8 a 10 para utilização em medicina.
12. 12. Utilização de uma proteína ou ácido nucleico ou vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, para a preparação de uma vacina para tratar imunoterapeuticamente um doente sofrendo de cancro.
13. 13. Processo para a produção de uma proteína de fusão, compreendendo a etapa de expressão, numa célula isolada, de uma proteína de fusão de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4. 2
14. 14. Processo de acordo com a reivindicação 13, no qual a célula é uma bactéria.
15. 15. Processo de acordo com a reivindicação 14, no qual a bactéria é E. coli.
16. 16. Processo de acordo com a reivindicação 16 compreendendo, ainda, a etapa de lise celular e purificação da proteína de fusão expressa a partir das células lisadas.
17. 17. Proteína de fusão obtida ou obtenível pelo processo de qualquer das reivindicações 13 a 16.
18. 18. Utilização de acordo com a reivindicação 12, na qual o cancro é seleccionado de melanoma, mama, bexiga, cancro do pulmão, tal como NSCLC, sarcoma, cancro do ovário, cancro da cabeça e pescoço, cancro renal, carcinoma colorrectal, mieloma múltiplo, leucemia, incluindo leucemia aguda, e carcinoma esofágico. Lisboa, 12 de Novembro de 2012 3