PT1857541E - Microorganismo que degrada substância estrogénica e seu uso - Google Patents
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Description
ΕΡ 1 857 541/ΡΤ
DESCRIÇÃO
"Microorganismo que degrada substância estrogénica e seu uso" CAMPO TÉCNICO 0 presente invento refere-se a um microorganismo que degrada substância estrogénica e seu uso e, mais particularmente, a um microorganismo capaz de degradar uma substância estrogénica contida em águas residuais domésticas, águas residuais descarregadas de uma exploração pecuária e semelhantes, a um método para a degradação biológica de uma substância estrogénica usando o microorganismo e a um aparelho para conseguir a degradação.
ANTECEDENTES DA ARTE São conhecidos mecanismos de oxidação de esteroides por Nocarida sp. de Croombe, R. G., et al., J. Biol. Chem., 241(7), 1587-1595, (1966).
Os desreguladores endócrinos que desregulam o sistema endócrino num corpo vivo foram entendidos como um problema social grave desde que T. Colborn publicou "Our Stolen Future" em 1996. 0 sistema endócrino num corpo é um sistema que mantém e regula a geração de um organismo, o desenvolvimento de órgãos sexuais e as funções de vários órgãos num corpo vivo, originados pelas acções de um androgénio, um estrogénio, uma hormona tiróide, uma hormona adrenal cortical e semelhante. Os produtos químicos desreguladores endócrinos são um grupo de substâncias que desregulam o sistema endócrino num corpo. É descarregada uma grande quantidade de desreguladores endócrinos para a Natureza por várias actividades humanas e semelhantes, e provocam um grande quantidade de desenvolvimento anormal na vida selvagem.
Em conjunto com as substâncias estrogénicas, os compostos organoclorados como pesticidas, agentes antibacterianos e herbicidas e produtos químicos industriais como bisfenol A e nonilfenol, são conhecidos como produtos químicos que desreguladores endócrinos. De entre estes, o uso 2 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ de produtos químicos foi regulado rigorosamente pela "Lei de Controlo da Poluição da Água" ("The Water Pollution Control Law"), e por outros regulamentos sobre a poluição, devido às suas propriedades tóxicas. A quantidade destes produtos químicos descarregada para o ambiente está em diminuição. Contudo, a quantidade de substâncias estrogénicas como 17β-βε^3άίο1, estrona e estriol contidos na urina humana e animal, descarregada para o ambiente, está a aumentar com o crescimento da população. A feminização anormal da vida selvagem foi confirmada em rios e lagos, para os quais convergem grandes quantidades de águas residuais domésticas com origem em áreas urbanas ("The Feminization of Nature", com autoria de Deborah Cadbury, editado por Taisen Iguchi, Shueisha, 1998) . Isto sugere incapacidade para a fertilização e pode desequilibrar os ecossistemas. 0 17β-β3ό^άίο1, representado pela fórmula (I) seguinte, é uma hormona esteroide segregada pelos folículos do ovário e é a substância fisiologicamente mais activa de entre as substâncias estrogénicas. A sua secreção é controlada por hormonas estimuladoras do foliculo e por hormonas luteinizantes na glândula pituitária. 0 17β-β3^30ϊο1 é usado na medicina para o tratamento da amenorreia, desordens menstruais, dismenorreia, hipoplasia uterina, síndroma pós-menopáusica e semelhantes.
OH
(I) A estrona, representada pela fórmula (II), seguinte, é um tipo de estrogénio que é um metabolito do 17β-estradiol. A estrona, que tem uma forte actividade estrogénica forte, aparece na urina e é descarregada do corpo. A estrona é usado como um agente hormonal para o tratamento da disfunção sexual em mulheres, síndrome pós-menopáusica, cancro da próstata nos homens e semelhantes. 3 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ
Ο estriol, representado pela fórmula (III), seguinte, num corpo é um estrogénio que é metabolito de 17p-estradiol, que é formado através de estrona e que é descarregado na urina. 0 estriol tem um efeito de estro.
Tal como descrito acima, as substâncias estrogénicas são usadas como medicamentos para humanos. Estão contidos na urina e são descarregados do corpo em conjunto com a urina. Estas substâncias são, também, administradas a animais de explorações pecuárias e, deste modo, são descarregados para o ambiente pelas explorações pecuárias. Uma vez que a vida animal e os peixes nos rios e lagos são contaminados com estas substâncias estrogénicas, é necessário diminuir as substâncias estrogénicas contidas nas águas residuais, antes da descarga num rio ou num lago, por exemplo, em instalações de tratamento de águas residuais.
Existem três tipos de métodos de tratamento de águas residuais usados, correntemente, em instalações de tratamento de águas residuais: tratamento fisico, tratamento quimico e tratamento biológico. 0 tratamento físico inclui centrifugação, filtração, separação por flotação sob pressão, adsorção e semelhantes. 0 tratamento químico é, especificamente, a destoxificação de substâncias tóxicas por adição de produtos químicos e semelhantes, electrodiálise, permuta iónica e semelhante. Por ouro lado, o tratamento 4 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ biolágico é ο tratamento usando microorganismos para a degradação e remoção de substâncias orgânicas em águas residuais e é eficaz para o tratamento de substâncias que são difíceis de tratar fisicamente ou quimicamente. 0 tratamento biológico tem, recentemente, sido usado popularmente em muitas instalações de tratamento de águas residuais. 0 tratamento biológico, em geral, tem três passos: um tratamento preliminar, um tratamento de oxidação biológica e um tratamento de lama. 0 tratamento preliminar compreende tratamentos usando um peneiro, uma bacia de areia ("sand basin"), uma bacia de decantação ("settling basin"), um banho de flotação e semelhantes. Estes dispositivos removem materiais sólidos e os materiais inorgânicos flutuantes nas águas residuais, com um tamanho grande de partícula e são úteis na redução da carga de substâncias orgânicas em instalações de tratamento de oxidação biológica. 0 tratamento por oxidação biológica, por outro lado, usa microorganismos. Pode ser referido, como método de utilização de microorganismos, um método que promove a adesão de microorganismos à superfície de um suporte sólido e desenvolvimento dos microorganismos sobre a superfície e um método de suspensão de grupos microbianos num líquido. 0 primeiro método é, usualmente, realizado num aparelho de leito fixo de um processo de filtração por percolação ("trickling filter") , ao passo que um aparelho de leito fluidizado de um processo de lama activada é utilizado para o último método.
De entre estes, no método de tratamento de águas residuais usando um aparelho de leito fixo, são usados para imobilização de microorganismos, um método de imobilização por ligação, um método de imobilização por envolvimento e semelhantes. 0 método de imobilização por ligação é um método de promover a adesão do microorganismo a um portador insolúvel por uma ligação covalente, ligação iónica, ligação por ponte de hidrogénio, adsorção física ou semelhantes. 0 método de imobilização por envolvimento é um método de envolvimento de microorganismos num gel de polímero, produzido por polimerização ou associação de um composto de baixa massa molecular ou por alteração do estado de composto 5 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ um polimérico, de um estado solúvel para um estado insolúvel. Um portador cerâmico, um portador celulósico, carvão activado em partículas e semelhantes são usados como o material no método anterior, ao passo que são usados como o material, no último método, poli (álcool vinílico) (PVA) carragenano e semelhantes.
Uma vez que o tratamento de lama activada, o tratamento por filtração por percolação e semelhantes são métodos excelentes de redução de substâncias poluidoras em águas residuais, foram, recentemente, utilizadas, activamente várias abordagens biológicas de degradação de desreguladores endócrinos. Alguns esforços incluem o melhoramento da eficiência de tratamento e utilização de um padrão mais rigoroso para pesquisa e escolha de microorganismos que podem degradar os desreguladores endócrinos, cujo tratamento é difícil. Até agora, foram referidos microorganismos que pertencem ao género Sphingomonas, capazes de degradarem nonilfenol (Documento de patente 1), microorganismos que pertencem ao género Fusarium, capazes de degradar dioxina (Documento de patente 2), microorganismos que pertencem ao género Fusarium, capazes de degradarem etinilestradiol, que é um estrogénio sintético (Documento de patente 3) , e semelhantes. 0 requerente do presente invento referiu microorganismos que pertencem ao género Rhodococcus ou Sphingomonas que podem degradar 17β-β3^3άίο1 e semelhantes (Documento de patente 4).
Contudo, poucos foram os microorganismos encontrados que são capazes de degradar, rapidamente e eficientemente, as substâncias estrogénicas que são particularmente difíceis de degradar pelo tratamento, com microorganismos. É necessário um microorganismo com uma capacidade superior de degradação. em nao 0 requerente do presente invento já referiu microorganismos, pertencentes ao género Rhodococcus ou Sphingomonas, que podem degradar ΐνβ-estradiol e semelhantes. Contudo, embora estas bactérias que degradam estrogénio exibam boas capacidades de degradação, em circunstâncias de caudal contínuo com uma concentração relativamente baixa de estrogénio, os seus efeitos não são suficientes 6 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ circunstâncias que permitem uma concentração elevada de estrogénio como corrente principal.
[Documento Público n° de Patente 2001-333767 1] Pedido de Patente Japonesa Tornado [Documento Público n° de Patente 11-341978 2] Pedido de Patente Japonesa Tornado [Documento Público n° de Patente 2003-52356 3] Pedido de Patente Japonesa Tornado [ Documento Público n° de Patente 2004-65008 4] Pedido de Patente Japonesa Tornado
DESCRIÇÃO DO INVENTO
Problemas a Serem Resolvidos Pelo Invento 0 presente invento foi realizado tendo em vista uma situação como a referida e tem por objecto proporcionar um microorganismo que degrada substância estrogénica, um método para a degradação, simples e eficaz, de uma substância estrogénica contida em águas residuais domésticas, águas residuais descarregas de explorações pecuárias ou semelhantes utilizando o microorganismo e um aparelho para conseguir essa degradação.
Meio Para a Solução do Problema
Como resultado de estudos extensivos, os inventores de presente invento encontraram microorganismos capazes de degradarem, eficazmente, substâncias estrogénicas usando o método de selecção que será discutida adiante. Os inventores verificaram, ainda, que a substância estrogénica contida na água residual, ou semelhante, pode ser degradada, simples e eficazmente, usando o microorganismo. Estes factos conduziram à concretização do presente invento. como
Especificamente, o presente invento proporciona microorganismos que degradam substância estrogénica, que pertencem ao género Pseudaminobacter, Gordonia, Zoogloea, Cryptococcus ou Trichosporon, tal como definido adicionalmente na reivindicação 1. 7 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ Ο presente invento também proporciona um método para degradar biologicamente uma substância estrogénica, usando um ou mais dos microorganismos mencionados atrás. 0 presente invento proporciona, adicionalmente, um aparelho para a degradação de uma substância estrogénica compreendendo um meio para suportar o referido microorganismo que degrada substância estrogénica e também é descrito um meio para promover o contacto do microorganismo com águas residuais ou em solo.
Para além disso, o presente invento é usado para a degradação de uma substância estrogénica, pelos referidos microorganismos que degradam substância estrogénica.
EFEITO DO INVENTO 0 microorganismo que degrada substância estrogénica do presente invento tem a capacidade de degradar substâncias estrogénicas como 17p-estradiol, estrona ou estriol.
Consequentemente, as substâncias estrogénicas em águas residuais e solo poluido com as substâncias estrogénicas, podem ser degradadas utilizando o método e aparelho para a degradação de substâncias estrogénicas, em que o referido microorganismo é usado, pelo que haverá uma melhoria no meio ambiente.
MELHOR MODO DE REALIZAR O INVENTO 0 microorganismo que degrada substância estrogénica do presente invento, tal como definido na reivindicação 1 (a partir daqui referido como "microorganismo do presente invento"), tem a capacidade de degradar substâncias estrogénicas num corpo vivo, como 17p-estradiol, estrona e estriol, que são apresentados, respectivamente, nas fórmulas (I) a (III) anteriores ou os seus metabolitos (a partir daqui referidos colectivamente como "substâncias estrogénicas"). Estas substâncias estrogénicas não podem ser removidas por um tratamento comum de oxidação biológica e podem ser tratadas quimicamente com dificuldade, devido à sua estrutura quimica estável. 8 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ
Podem ser apresentados como microorganismos do presente invento, que têm estas características, os microorganismos do género Pseudaminobacter, Gordonia, Zoogloea, Cryptococcus ou Trichosporon. Mais especificamente podem ser apresentados um ou mais microorganismos, pertencem ao seguinte Grupo A. <Grupo A>
Pseudaminobacter salicylatoxidans Gordonia terrae Zoogloea sp.
Cryptococcus sp.
Trichosporon loubieri
Estes microorganismos do presente invento podem ser obtidos a partir de vários microorganismos que existem em lama activada e lama para reprocessamento ("return sludge") em estações de tratamento de esgotos e semelhantes, por selecção em passos múltiplos, usando uma substância estrogénica.
Especificamente, de modo a se obter o microorganismo do presente invento, a partir de microorganismos que existem em lama activada em estações de tratamento de esgotos e semelhantes, os microorganismos contidos em lama activada são cultivadas por cultura de enriquecimento usando uma substância estrogénica para a separação dos microorganismos que degradam substâncias estrogénicas de microorganismos que não degradam substâncias estrogénicas. A cultura de enriquecimento é, preferivelmente, realizada usando um caldo de cultura, contendo lama, como lama activada e lama para reprocessamento e meio de cultura MDG, por exemplo, que contém uma substância estrogénica e tem uma composição de acordo com a Tabela 1, seguinte, (Meio de DOMINIC & GRAHAM, modificado; os compostos listados na Tabela 2 são usados como elementos vestigiais) . É desejável cultivar os microorganismos por agitação vigorosa de um tubo de ensaio, ou semelhante, a uma temperatura de cerca de 28°C, por exemplo, durante uma semana por cada geração. É preferível a cultura durante cerca de cinco gerações. 9 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ TABELA 1
Unidade: % (ρ/ν)
Meio MDG K2HP04 (g/L) 3, 5 KH2PO4 1,5 (NH4)2S04 0,5 NaCl 0.5 MgS04 · 7H20 0.15 Elementos vestigiais (ml/1) 1,0 Extracto de levedura 0,005 ou 0 PH 6,0 ou 7,0 TABELA 2
Unidade: g/1
Elemento vestigial NaHC03·10H2O O CM MnS04-4H20 0,3 ZnS04 · 7H20 0,2 (NH4) Mo7024 * 4H20 0,02 CuS04 · 5H20 \—1 0 CoC12* 6H20 LO O CaCl2 * 2H20 0,05 FeS04 · 7H20 LO O
Seguidamente, quer as substâncias estrogénicas tenham, ou não, sido degradadas, a solução de cultura de enriquecimento obtida acima é examinada e confirmada usando uma cromatografia de camada fina (CCF), e semelhantes, e são selecionadas as soluções de cultura de enriquecimento em que as substâncias estrogénicas foram degradadas.
Os microorganismos contidos na solução de cultura de enriquecimento, que foram selecionados deste modo, são isolados usando um meio comum de cultura, para a separação de microorganismos, por exemplo, um meio de cultura disponível 10 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ comercialmente como meio de cultura ISP, meio de cultura R2A e meio de cultura YM.
Cada um dos microorganismos isolados é cultivado, adicionalmente, num meio de cultura contendo substâncias estrogénicas e os microorganismos, com capacidade elevada de degradação de substância estrogénica, podem ser pesquisados por medição da quantidade de substâncias estrogénicas que permanecem no meio de cultura após a cultura, usando, por exemplo, uma cromatografia em camada (CCF), cromatografia em fase gasosa ou semelhante. Um microorganismo com uma capacidade elevada de degradação de substância estrogénica pode ser obtido por repetição desta operação de pesquisa varias vezes.
Quando 107 a 108 células de microorganismo/1 do presente invento, obtidas deste modo, são feitas actuar em lama, esgoto, um meio de cultura, ou semelhante, contendo substâncias estrogénicas a uma concentração de 100 mg/1, o microorganismo pode degradar 65% ou mais e, preferivelmente, 80% ou mais, das substâncias estrogénicas contidas no meio de cultura após cinco horas. O microorganismo do presente invento pode, particularmente, degradar 90% ou mais e, mais preferivelmente, 99% ou mais, de ΐνβ-estradiol entre substâncias estrogénicas, em oito horas. A temperatura a que o microorganismo do presente invento é feito actuar é de 25 a 30°C e, preferivelmente, 27 a 28°C.
Especificamente, foram obtidas, como microorganismos que degradam substância estrogénica, as seguintes nove estirpes de microorganismos pelo método de pesquisa referido acima, a partir de lama activada ou lama para reprocessamento da Estação de Tratamento de Águas Residuais de Fushimi (Kyoto-shi, Kyoto), Estação de Tratamento de Águas Residuais de Tarumi (Kobe-shi, Hyogo), Estação de Tratamento de Tamagawa-joryu (Akishima-shi, Tóquio), Centro de Tratamento de Morigasaki (Ota-ku, Tóquio), Segunda Estação de Tratamento de Águas Residuais do Norte (Yokohama-shi, Kanagawa), Centro Ambiental de Todoroki (Kawasaki-shi, Kanagawa) e Estação de Tratamento de Tachikawa-Fujimi (Tachikawa-shi, Tóquio). Estas estirpes de microorganismos foram identificadas por análise pelo sistema de evolução molecular descrita por Cari R. Wose, 11 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ "Bacterial Evolution", Microbiological Reviews, 51; 221-271 (1987) e E. Stackebrandt e B. M. Goebel, Taxonomic Note, "A Place for DNA-DNA Reassociation and 16S rRNA Sequence Analysis in the Present Species Definition in Bacterilogy", International Journal of Systematic Bacteriology, 44, (4) , 846-849 (1994), usando a sequência 16s de ADNr do microorganismo.
Pseudaminobacter salicylatoxidans, estirpe TAA-I3 (FERM BP-10519)
Gordonia terrae, estirpe TAI-I5 (FERM BP-10521)
Zoogloea sp., estirpe TMJ-I1 (FERM BP-10523)
Cryptococcus sp., estirpe TMN-Y2 (FERM BP-10525)
Trichosporon loubieri, estirpe FF-Y2 (FERM BP-10526)
De entre estes microorganismos, Pseudaminobacter salicylatoxidans, estirpe TAA-I3, Gordonia terrae, estirpe TAI-I5, Zoogloea sp., estirpe TMJ-I1, Cryptococcus sp., estirpe TMN-Y2 e Trichosporon loubieri, estirpe FF-Y2, foram depositados internacionalmente junto de Agência Administrativa Independente, Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Avançada, Centro de Depósito do Organismo Internacional de Patentes (Endereço: Chuo N° 6,1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, 305-8566, Japão) com os números de depósito acima referidos, em 26 de Abril de 2004.
De entre os microorganismos anteriores as caracteristicas microbiológicas de Pseudaminobacter salicyloxidans, estirpe TAA-I3, foram examinadas e sendo as seguintes.
Forma: é estritamente aeróbica e aplanética, desenvolve-se na forma de hifas, forma, na maior parte dos casos, uma colónia amarela e está incluida na, subdivisão α de Proteobacteria das bactérias gram-negativas.
Caracteristicas Fisiológicas: é positiva para oxidase e catálase.
Gama de desenvolvimento: desenvolve-se a uma temperatura de 20 a 40°C, mas não se desenvolve quando incubada a 10°C ou 45°C durante sete dias. 12 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ
Utilização de sacáridos: utiliza aerobicamente D-glucose, D-manitol, dulcitol e melibiose e exibe um efeito anabólico sobre D-glucose, D-maltose, D-ribose, D-xilose e semelhante.
Estas caracteristicas são as mesmas caracteristicas de Pseudaminobacter sp. que inclui Pseudaminobacter salicylatoxidans, descrita por P. Kampfer, "Description of Pseudaminobacter gen. Nov. with two new species, Pseudaminobacter salicylatoxidans sp. Nov. and pseudaminobacter defluvii sp. Nov.", International Journal of Systematic Bacteriology, 49:887-897 (1999).
As caracteristicas microbianas de Gordonia terrae, estirpe TAI-I5 foram examinadas de entre os microorganismos anteriores e verificaram-se ser as seguintes.
Forma: são bacilos curtos("short bacillus") ou pseudococos estritamente aeróbicos, aplanéticos e fracamente resistentes a ácidos. Em muitos casos formam colónias vermelhas e amarelas e podem ser separados dos ambientes como solo e lama activada e estão incluídas no coccus de Corynebacterium de GC elevado, gram positiva.
Caracteristicas fisiológicas: o peptidoglicano da parede celular é do tipo Aly, muitos dos quais são do tipo glicol e incluem arabinose e galactose. 0 componente básico de uma quinona da cadeia respiratória é MK-9(H2) . 0 ácido gordo celular é do tipo linear, mono-insaturado e contém 10Me-18:0. 0 teor em ácidos impares varia de acordo com a espécie. Como fosfolípidos, para além de PE, são detectados DPG, PG, PI e PIM. Também existem alguns fosfolipidos.
Gama de desenvolvimento: A temperatura óptima de desenvolvimento é 28 a 37°C.
Estas caracteristicas são iguais às caracteristicas de Gordonia sp.r incluindo Gordonia terrae, Gordonia rubropertínctus e Gordonia amarae, descritas em "Classification and Identification of Actinomyces", Business 13 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ
Center for Academic Societies Japan, editado por The Society for Actinomyces Japão: 183-184 (2001).
De entre os vários microorganismos anteriores foram examinadas as caracteristicas microbiológicas de Zoogloea sp., estirpe TMJ-I1 e verificaram-se serem as seguintes:
Forma: é estritamente aeróbica e aplanética, desenvolve-se na forma de hifas, forma, em muito casos, colónias brancas a amarelo claro, está incluida na subdivisão β de Proteobacteria de bactérias gram negativas e existem em lama formando flocos.
Caracteristicas fisiológicas: possui actividade de urease, oxidase e gelatinase.
Gama de desenvolvimento: A temperatura óptima de desenvolvimento é 20 a 37°C.
Estas caracteristicas são as mesmas caracteristicas de Zoogloea sp. descrita em documentos publicados (Rossello-Mora, R., Ludwig, W. e Schleifer, K. H. : "Zoologea ramigera, a phylogenetically diverse species", FEMS Microbiol. Lett 114, 129-134 (1993) e R. G. E. Murray: "BERGY'S MANUAL" of Sytematic Bacteriology, Volume 4, 214-219 (1992)) .
As caracteristicas microbiológicas de Cryptococcus sp. , estirpe TMN-Y2, foram examinadas e verificou-se serem as seguintes.
Forma: produz um basidio como uma geração sexual, produz exogenamente, como consequência, basidiósporos e, em muitos casos, forma colónias brancas, que se desenvolvem rapidamente, são macias e apresentam um lustro forte ou suave. Os conidios são monocelulares, do tipo rebento ("bud-type"), cobertos com uma cápsula, globulares ou ovais e multipolares.
Caracteristicas fisiológicas: não fermenta açúcar, mas utiliza inositol, e produz urease. 14 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ
Gama de desenvolvimento: A temperatura óptima de desenvolvimento é 20 a 37°C.
Estas caracteristicas são as mesmas características de Cryptococcus sp. descrita em documentos publicados (Takashima, M. e Nakase, T., "Molecular phylogeny of the genus Cryptococcus and related species based on the sequence of 18S rDNA and internai transcribed spacer regions", Microbiol. Cult. Coll., 15, 35-47 (1999)).
As caracteristicas microbiológicas de Trichosporon loubieri, estirpe FF-Y2, foram examinadas e verificou-se serem as seguintes.
Forma: é reprodutível sexualmente e produz ascosporos em sacos de esporos. As colónias desenvolvem-se rapidamente, têm uma superfície suave, engelhada, com protuberâncias ("torose"), sem pelos a aveludada e apresentam um lustro forte a suave. É semelhante a cera e frágil e tem uma cor branca a amarelada-cor creme. Os pseudomicelos e hifas são abundantes e bem desenvolvidos. Os conídios do tipo rebento, são monocelulares e de formas diversas. Os conídios de divisão são monocelulares e têm forma alongada.
Características fisiológicas: não é fermentada ou é fermentada apenas fracamente e são positivos para sacarose, lactose, sorbitol e glucose são negativos para levulinato.
Gama de desenvolvimento: A temperatura óptima de desenvolvimento é 20 a 37°C.
Estas características são as mesmas características de Trichosporon sp., que inclui Trichosporon loubieri, descrita num documento publicado (Wouter J., Middelhoven, Gloria Scorzetti e Jack W. Fell, "Trichosporon porosum comb. nov. an anamorphic basidiomycetous yeast inhabiting soil, related to the loubieri/laibachii group of species that assimilate hemicelluloses and phenolic compounds", FEMS Yeast Research, Vol. 1, 15-22 (2001)) .
Condições adequadas para a cultura em massa dos microorganismos obtidos acima foram examinadas, para se 15 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ verificar que a cultura em massa usando um vaso de fermentação de 10 1 é adequada, com uma temperatura ótima sendo de 28 a 30°C e um pH óptimo sendo de 6,0 a 7,0.
Os microorganismos do presente invento, descritos acima, podem ser usados independentemente, ou em combinação, de dois ou mais, para a degradação de substâncias estrogénicas em águas residuais ou solo.
De modo a degradar substâncias estrogénicas em águas residuais usando o microorganismo do presente invento, é preferível usar o microorganismo entre o tanque de decantação ("settling tank") e o tanque de decantação final num processo de tratamento de águas residuais, particularmente num passo de tratamento secundário em processo de oxidação biológica. Quando o microorganismo é usado no passo de tratamento secundário, é mais preferível um sistema de fixação e desenvolvimento do microorganismo numa superfície de um corpo de suporte sólido, do que um sistema de suspensão do microorganismo numa solução, porque a fuga do microorganismo pode ser impedida e um líquido de cultura com maior concentração pode ser obtido por ligação dos microorganismos à superfície do corpo sólido de suporte. Como corpo sólido de suporte para a ligação do microorganismo do presente invento, podem ser referidos PVA (poli(álcool vinílico), celulose porosa e semelhante. É preferida a celulose porosa, quando usada no passo secundário de tratamento. Como método de imobilização do microorganismo num corpo sólido de suporte, são indicados um método de ligação por imobilização usando polipropileno, material cerâmico e semelhantes, um método de imobilização por envolvimento, como o método de congelação com PVA e semelhantes, sendo preferível o método de imobilização por ligação.
No tratamento de águas residuais, referido acima, o microorganismo do presente invento é usado por fornecimento directo de um caldo de cultura, em que as células foram cultivadas até uma concentração de 108 a 109 células/ml de massa de cultura, ao tanque de tratamento de águas residuais ou por fornecimento, ao tanque de tratamento, de um portador no qual o microorganismo foi imobilizado. O portador no qual o microorganismo foi imobilizado (portador de imobilização) 16 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ pode ser preparado por alimentação de uma quantidade determinada de portador a um vaso de cultura como um fermentador de vaso, e por operação do vaso de cultura, durante dois ou três dias, com agitação, ou semelhante para a imobilização do microorganismo. 0 portador de imobilização é removido do caldo de cultura na altura do fornecimento ao tanque de tratamento e é alimentado ao tanque de tratamento.
Por outro lado, a degradação de substâncias estrogénicas no solo, usando o microorganismo do presente invento pode ser realizada por centrifugação do microorganismo cultivado até uma concentração de 108 a 109 células/ml de massa de cultura, num vaso de fermentação, suspensão das células numa solução salina fisiológica ou semelhante, na medida do necessário e dispersão directa da suspensão no solo contaminado, para provocar o contacto do microorganismo com o solo. Neste caso, o número de células do microorganismo do presente invento a ser espalhado na superfície do solo ou em áreas escavadas do solo a ser tratado, poderá ser ajustada a cerca de 109 a IO10 células/m3.
De modo a degradar eficientemente as substâncias estrogénicas, usando o microorganismo do presente invento, podem, por exemplo, ser usados um aparelho equipado com um meio de suporte do microorganismo do presente invento e um meio de promover o contacto do microorganismo com águas residuais ou solo. Como exemplos específicos desses aparelhos podem ser referidos bio-reactores de agitação pneumática, do tipo de coluna cheia ou do tipo pistão. Um desses aparelhos também pode ser usado durante o passo de tratamento secundário de um processo de tratamento de águas residuais para a degradação eficiente de substâncias estrogénicas em águas residuais ou solo.
EXEMPLOS 0 presente invento será explicado em mais detalhe por exemplos, que não se pretende sejam limitantes do presente invento. 17 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ
Exemplo 1 (1) Cultura de enriquecimento
Os seguintes meios de cultura MDG foram carregados em tubos de ensaios, cada um numa quantidade de 10 ml, e foi adicionado 17p-estradiol, como substância estrogénica, para proporcionar uma concentração de 0,1%, para a obtenção de grupos de meios de cultura de enriquecimento, consistindo um grupo em quatro meios. Foi adicionado a cada tubo de ensaio, para a preparação de 56 soluções de meio de cultura de enriquecimento, 1 ml de lama activada ou lama para reprocessamento recolhidas em cada um dos processos de tratamento de águas residuais da Estação de Tratamento de Águas Residuais de Fushimi (Kyoto-shi, Kyoto, referida por F), Estação de Tratamento de Águas Residuais de Tarumi (Kobe-shi, Hyogo, referida por TM) , Estação de Tratamento de
Tamagawa-joryu (Akishima-shi, Tóquio, referida por TJ) ,
Centro de Tratamento de Morigasaki (Ota-ku, Tóquio, referida por M) , Segunda Estação de Tratamento de Águas Residuais do Norte (Yokohama-shi, Kanagawa, referida por H) , Centro Ambiental de Todoroki (Kawasaki-shi, Kanangawa referida por TO) e a Estação de Tratamento de Tachikawa-Fujimi (Tachikawa-shi, Tóquio, referida por TA) . Estas soluções de meio de cultura de enriquecimento foram cultivadas com agitação a 28°C durante uma semana. Depois da incubação estar completa, foi extraído 1 ml da solução de cultura do caldo de cultura e foi adicionado a um tubo de ensaio em conjunto com 10 ml de meio MDG fresco e foram cultivados com agitação, durante uma semana. Esta operação foi repetida cinco vezes para a cultura contínua de microorganismos durante cinco gerações. 18 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ TABELA 3
Meio MDG 1 Meio MDG 2 Meio MDG 3 Meio MDG 4 k2hpo4(g/1) 3,5 3,5 3,5 3,5 kh2po4 1,5 1,5 1,5 1,5 (NH4)2S04 0,5 0,5 0,5 0,5 NaCl 0,5 0,5 0,5 0,5 MgS04 · 7H20 0, 15 0,15 0,15 0,15 Elementos vestigiais (ml/1) 1,0 1,0 1,0 1,0 Extracto de levedura 0,005 0,005 - - pH 6, 0 7,0 6, 0 7,0 TABELA 4
Elemento vestigial NaHC03 · 10H2O 2,0 MnS04 · 4H20 0,3 ZnS04 · 7H20 0,2 (NH4) Mo7024 · 4H20 0,02 CuSCq · 5H20 0,1 CoCl2 · 6H20 0,5 CaCl2 · 2H20 0,05 FeS04*7H20 0,5 (2) Isolamento e pesquisa primária do microorganismo
Depois da cultura de enriquecimento em (1) acima, foram colocados 100 μΐ de cada uma das soluções de cultura numa placa de Petri contendo meio de cultura ISP (Difco 277010), meio de cultura R2A (Difco 218263) ou meio de cultura YM (Difco 271120: todos fabricados por Difco) para a cultura de microorganismos, de modo a isolar colónias em cada placa.
Foram adicionados 4 g de extracto de levedura, 10 g de extracto de malte e 4 g de dextrose a 1 1 do meio ISP anterior e a mistura foi ajustada a pH 7,2. Foram adicionados 0,5 g de extracto de levedura, 0,5 g de proteose-peptona, 0,5 g de casaminoacido, 0,5 g de dextrose, 0,5 g de amido solúvel, 0,3 g de piruvato de sódio, 0,3 g de difosfato de potássio e 0,05 g de sulfato de magnésio, a 11 do meio R2A anterior e a mistura foi ajustada a pH 7,2. Foram adicionados 3 g de extracto de levedura, 3 g de extracto de malte, 5 g de 19 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ peptona e 10 g de dextrose a 1 1 do meio YM anterior e a mistura foi ajustada a pH 6,2.
Para além disso, em conjunto com o isolamento de microorganismos, a solução de cultura de enriquecimento obtida em (1) foi analisada por revelação directa num cromatógrafo de camada fina (CCF) , para a selecção do caldo de cultura que consumiu o substrato 17p-estradiol (a partir daqui referido algumas vezes com "E2") (Pesquisa primária). O CCF foi operado nas condições seguintes: (Condições de cromatografia)
Placa de CCF usada: MERCK (n° 13727)
Solvente de revelação: etanol-benzeno (1:9)
Quantidade de solvente de revelação: 5 ml Tempo de revelação: cerca de 16 minutos/10 cm Quantidade da amostra: 5 μΐ
Agente de coloração: Dicromato de potássio-ácido sulfúrico (quando necessário) A actividade de degradação de E2 e o número de lotes ("stocks") quando cada solução de cultura de enriquecimento foi revelada por CCF são apresentados nas Tabelas 5 e 6. A actividade de degradação foi avaliada de acordo com o seguinte procedimento. (Avaliação) (Conteúdo) O: Actividade de degradação (sem manchas de E2) forte Δ: Actividade de degradação comparativamente forte Branco: Sem actividade de degradação (presença de manchas de E2 muito esbatidas) (presença de manchas de E2) 20 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ TABELA 5-1
Instalação de onde a lama foi recolhida (Abreviatura) Tipo de lama pH do meio Adição de extracto de levedura Símbolo Actividade de degradação Numero de lotes separados Número total de lotes Estação de Tratamento de Águas residuais de Fushimi (F) Lama Activada 7 - FA 14 35 6 4 7 + FB 13 6 - FE 4 6 + FF 0 4 Lama para reprocessarnento 7 - FI 12 29 7 + FJ 6 6 - FM 5 6 + FN 6 Estação de Tratamento de Águas residuais de Tarumi (TM) Lama Activada 7 - TMA 6 26 60 7 + TMB 8 6 - TME 5 6 + TMF 7 Lama para reprocessarnento 7 - TMI 0 12 34 7 + TMJ 0 13 6 - TMM Δ 4 6 + TMN 0 5 Estação de Tratamento de Águas residuais de Tamagawa-joryu (TJ) Lama Activada 7 - TJA 5 21 49 7 + TJB 8 6 - TJE 6 6 + TJF 2 Lama para reprocessarnento 7 - TJI 11 28 7 + TJJ 9 6 - TJM 4 6 + TJN 4 TABELA 5-2
Centro de Tratamento de Morigasaki (M) Lama Activada 7 - MA 14 32 59 7 + MB 9 6 - ME 3 6 + MF 6 Lama para reprocessarnento 7 - MI 7 27 7 + MJ 11 6 - MM 0 3 6 + MN 6 21 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ TABELA 6
Instalação de onde a lama foi recolhida (abreviatura Tipo de lama PH do meio Adição de extracto de levedura Símbolo Actividade de degradação Numero de lotes separados Número total de lotes Segunda Estação de Tratamento de Águas Residuais do Norte(H) Lama Activada 7 - HA 7 25 53 7 + HB 9 6 - HE 3 6 + HF 6 Lama para reprocessarnento 7 - Hl 8 28 7 + HJ 10 6 - HM 3 6 + HN 7 Centro Ambiental de Todoroki (TO) Lama Activada 7 - TOA 0 12 35 67 7 + TOB 14 6 - TOE 5 6 + TOF 4 Lama para reprocessarnento 7 - TOI 0 12 32 7 + TOJ 10 6 - TOM 3 6 + TON 0 7 Estação de Tratamento de Tachikawa-Fujimi (TA) Lama Activada 7 - TAA Δ 14 35 67 7 + TAB 13 6 - TAE 6 6 + TAF 2 Lama para reprocessarnento 7 - TAI 0 14 32 7 + TAJ 0 11 6 - TAM 4 6 + TAN 3
Como resultado da pesquisa primária, verificou-se que o 17β-θ3θ^άίο1 nas soluções de cultura de enriquecimento de FF, TMI, TMJ, TMM, TMN, MM, TOA, TOI, ΤΟΝ, TAA, TAI e TAJ era degradado e foram seleccionados um total de 111 lotes separados das soluções de enriquecimento de cultura. (3) Pesquisa secundária
Os 111 lotes selecionados na pesquisa primária de (2) , acima, foram cultivados usando 17p-estradiol como substrato de acordo com o procedimento seguinte.
Os 111 lotes de microorganismos foram cultivados em cultura de estrias usando uma placa de ágar YM. A pequena quantidade de caldo de cultura foi inoculada em cada solução de cultura à qual o 17p-estradiol foi adicionado para proporcionar uma concentração de 100 mg/1. Após um dia, a 22 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ quantidade total da cultura desenvolvida no caldo foi extractada por uma coluna C18 de fase sólida (fabricada por Waters) e colocada em manchas em CCF para a selecção de 23 microorganismos em que ο 17β-β3^3άϊο1 tinha sido completamente degradado. (4) Pesquisa ternária
De modo a selecionar lotes que podem degradar ΐνβ-estradiol mais rapidamente e a examinar a sua capacidade de degradar outras substâncias estrogénicas naturais (estrona, estriol) foi realizada a experiência seguinte usando os 23 lotes selecionados na pesquisa secundária de (3) acima.
Os 23 lotes de microorganismos foram cultivados por cultura em estrias usando uma placa de ágar YM, seguindo-se cultura usando tubos de ensaio do mesmo modo que na pesquisa primária. A cultura foi terminada a 0, 3, 5, 8 ou 24 horas após iniciação, seguindo-se, imediatamente, extracção em fase sólida. Seguidamente, a quantidade total do caldo de cultura foi retida numa coluna C18 de fase sólida (fabricada por Waters), seguindo-se eluição com metanol. Uma substância substituta (17β-65^3ά1ο1-ά4) foi adicionada a uma quantidade adequada do eluido. A mistura foi seca até um estado sólido por corrente de azoto e foi feita reagir com BSTFA (N,0--bis(trimetilsili)trifluoracetamida) para a indução de um composto trimetilsililado (composto TMS) . Depois de secar, novamente, até um estado sólido por corrente de azoto, o sólido foi dissolvido em n-hexano e a solução amostra foi analisada usando um espectrómetro de massa de cromatografia gasosa (GC-MS). A concentração de substâncias estrogénicas, após cultura durante diferentes períodos de tempo foi medida para a determinação da quantidade degradada. As condições da análise de GC-MS são apresentadas na Tabela 7. 23 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ TABELA 7 GC Coluna Gás Portador Temperatura do forno Método de injecção Volume de injecção Temp. do injector Temp. Interface
Argilent 6890 HP-5(30mx0,32mm d.i., espessura de película 0,25pm, Agilent)
He, 1,5 ml/min
150°C (2min)->50°C/min->250oC->5°C/min->300oC (15 min)
Sem divisão (1 min para o tempo de purga) 1 μΐ
280°C
300°C MS JEOL JMS-700 Resolução de massa 1000 Voltagem do 1,0 kV detector Modo de operação SIM Ião monitorização de TMS-17 β-estradiol 416 (m/z) TMS-Estrona 342 (m/z) TMS-Estriol 504 (m/z) TMS-17 β-estradiol- d4 420 (m/z) Taxa de amostrage :m 50 (ms)
Como resultado da pesquisa, foram selecionados nove lotes que podem degradar 65% ou mais de 17 β-estradiol em cinco horas. As variações ao longo do tempo das quantidades residuais de ΐνβ-estradiol, estrona e estriol, após a degradação pela estirpe TAA-I3, estirpe TAA-I5 e estirpe FF-Y2 de entre os microorganismos selecionados são apresentadas na FIG. 1 a Fig. 3 e a taxa residual (%) de cada substância estrogénica, após cinco horas em solução tratada com cada uma das nove estirpes é apresentada na Tabela 8. 24 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ TABELA 8
Tempo após o início da experiência 17β-θ3όΓ3άίο1 (E2) Estrona (El) Estriol (E3) TAA-I3 5 h 18% 15% 18% TAI-I5 5 h 10% 8% 10% TMJ-I1 5 h 15% 10% 16% TMN-Y2 5 h 18% 20% 17% FF-Y2 5h 5% 8% 12%
Exemplo 2
Identificação de microorganismos com a capacidade de degradarem substância estrogénica (1) Identificação da estirpe usando sequência de 16S ADNr
Foi preparada uma árvore filogenética usando a sequência 16S ou 18S de ADNr para nove lotes de microorganismos que degradam substância estrogénica que foram selecionados pela pesquisa ternária de acordo com o procedimento seguinte para conduzir a identificação da estirpe. (a) Extracção da ADN do microorganismo 0 ADN foi extractado, usando o método de cloreto de benzilo, de cada uma das culturas puras de microorganismo, das nove estirpes anteriores. Os microorganismos foram cultivados usando meio ágar YM inclinado a 30°C durante 3 dias. Foram adicionados 250 μΐ de uma solução tampão de extracção de ADN (Tris-HCl 100 mmol/1, EDTA 40 mmol/1, pH 9, 0), 200 μΐ de cloreto de benzilo e 50 μΐ de SDS a 10%, a cada um dos microorganismos recolhidos e a mistura foi agitada vigorosamente a 50°C durante 30 minutos. Após adição de 150 μΐ de acetato de sódio 3 mol/1, a mistura foi centrifugada e o liquido sobrenadante foi transferido para um tubo separado, seguindo-se precipitação com isopropanol, lavagem com etanol a 70% e secagem ao ar. O sólido resultante foi dissolvido em 100 μΐ de solução tampão TE (Tris-HCl 10 mmol/1 (pH 8,0), EDTA 1 mmol/1).
(b) Reacção de amplificação por PCR de ADN 16S ou 18S
Os seguintes 8F e 15R foram usados como iniciadores de amplificação de 16S e Y1F e Y1770R foram usados como 25 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ iniciadores de amplificação de 18S. Um total de 50 μΐ de uma solução de reacção contendo Tris-HCl 10 mmol/1 (pH 8,3), KC1 50 mmol/1, MgCl2 1,5 mmol/1, 200 μΐ de uma mistura de dNTP, 1 U de Taq de ADN-polimerase (fabricada por TAKARA Co., Ltd) , 50 ng de matriz de ADN e0,4 pmol/l de iniciador de amplificação foram submetidos a 25 ciclos de reacção de PCR usando um ciclizador térmico de ADN PTC200 (fabricado por MJ Research), consistindo num ciclo de uma reacção durante 20 segundos a 94°C, 15 segundos a 55°C e 180 segundos a 72°C. O produto de amplificação foi purificado usando Microcon-PCR (fabricado por Milipore) CIniciadores de amplificação> 8F: (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') 15R: (5'-AAGGAGGTGATCCARCCGCA-3') Y1F: (5'-TATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3') Y1770R: (5'-CTACGGAAACCTTGTTACGAC-3') (c) Determinação da sequência 16S e 18S de ADNr A sequência base de 16S ou 18S ADNr foi descodificada pelo sequenciador ABI PRISM 373A (fabricado por ABI) usando um conjunto ABI PRISM™ Dye Terminator (fabricado por Perkin Elmer). Os iniciadores usados para a descodificação 16S e 18S de ADNr são apresentados na Tabela 9. Foi usado para o alinhamento de sequência um Auto Assembler™ (fabricado por Perkin Elmer). 26 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ TABELA. 9
Iniciador No. Sequência (5' ...3') (para 16S) 8F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 520F CAGGAGTGCCAGCAGCCGCGG 930F CAAGCGGTGGAGCATGTGG 1100F CAGGAGCAACGAGCGCAACCC 520R ACCGCGGCTGCTGGC 800R GGACTACCAGGGTATCTAAT 1100R AGGGTTGCGCTCGTTG 15R AAGGAGGTGATCCARCCGCA (para 18S) YlF TATCTGGTTGATCCTGCCAGT Y380F C CGGAGAGGGAGCCTGAG Y430R TTTGCGCGCCTGCTGCCTT Y570F AGCCGCGGTAATTCCAGC Y820R CGTCCTATTCTATTATTCCATGC Y97 0F AAGAACGAAAGTTAGGGGATC Y1200R CTTTCCCCGTGTTGAGTCAA Y1430F AGGTCTGTGATGCCCTTAGA Y1580R CGCTTACTAGGAATTCCTCGTT Y1770R CTACGGAAACCTTGTTACGAC (d) Análise filogenética de sequência 16S ou 18S de ADNr
A análise por evolução molecular filogenética foi conduzida usando uma programa de computador de análise filogenética (Clustal X) usando a sequência de 16S ou 18S ADNr obtida acima a sequência relacionada base de 16S ADNr de baterias obtida de uma base de dados de genes como DDBJ (e) Resultados da identificação
As sequências foram determinadas usando a sequência 18S de ADNr para as estirpes que foram considerados como levedura a partir da forma bacilos e usando a sequência 16S ADNr para outras estirpes. A pesquisa de homologia da sequência determinada com a sequência na base de dados, foi conduzida para verificar que, de entre as 23 estirpes separadas, quatro estirpes pertencem ao grupo gram positivo G+C elevado, uma estirpe pertence a α-Proteobacteria, duas estirpes a β-Proteobacteria e duas estirpes são leveduras (FIG. 10) . Foi preparada uma árvore filogenética para cada grupo (FIG. 4 a FIG. 7). 27 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ TABELA. 10
Instalação de onde a lama foi recolhida Microorganismo separado N°. Resultado da identificação Grupo de classificação superior Estação de Tratamento de Tachikawa-Fuj imi Lama activada TAA-I3 Pseudaminobacter salicylatoxidans α Return sludge TAI-15 Gordonia terrae H Estação de Tratamento de Águas residuais de Tarumi Return sludge TMJ-I1 Zoogloea sp. β TMN-Y2 Cryptococcus sp. Y Estação de Tratamento de Águas residuais de Fushimi Lama activada FF-Y2 Trichosporon loubieri Y a: Proteobacteria subdivisão α β: Proteobacteria subdivisão β H: bactéria Gram positiva G + C Elevada Y: levedura
Exemplo 3
Degradação de substância estrogénica usando lama activada
Foi obtida lama activada em bruto de uma Estação de eliminação de esgotos, actualmente em operação, para a medição da actividade de Gordonia terrae estirpe TAI-I5, que se considera exibir actividade forte de degradação de substância estrogénica e a ter um nivel de segurança comparativamente elevado. 28 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ seguindo-se por agitação durante 24 horas, para a imobilização da estirpe TAI-I5 em cada um dos portadores. Após 24 horas, os portadores foram removidos e, após remoção da água usando papel filtro, foi medido o seu peso. Seguidamente, os portadores foram postos numa solução salina fisiológica, agitados suficientemente usando um misturador de vórtex e tratados ultrasonicamente durante cinco minutos para provocar a eluição da estirpe TAI-I5 dos portadores. Este eluato foi diluído adequadamente com uma solução salina fisiológica e aplicado a um meio de ágar (placa de Petri) preparados a partir de um meio de cultura YG (Tabela 11) para a incubação a 28°C. 0 número de células vivas por unidade de peso dos portadores foram medidos. Os resultados são apresentados na Tabela 12. TABELA 11
Componente Quantidade D(+)-Glucose lOg/L Polipeptona 5,Og/L Extracto de levedura 5,Og/L K2HP04 2,0 g / L KH2P04 1,Og/L MgS04·7H20 0,5 g / L PH 7,0 TABELA 12
Material Tamanho (mm) Densidade aparente Células vivas (células/g) Polipropileno cp4 0, 98 1,2 x 109 Cerâmico (p6 >1 Ό O \—1 X co r- Alumina-sílica cpl2 >1 2,2 x 106 Imobilização em carvão activado de PVA cplO >1 co O t—1 X <0
Como resultado do teste de imobilização, verificou-se que o portador feito de polipropileno era o que melhor 29 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ imobilizava a estirpe TAI-I5 de entre os portadores disponíveis comercialmente. (2) Teste de eficiência usando portador de imobilização de microorganismo
Foi preparado um portador de polipropileno com a estirpe TAI-I5 nele imobilizada do mesmo modo que em (1) acima e foi examinada a sua actividade de degradação de 17β-ε3ΐ^άίο1 usando lama activada de uma estação de eliminação que é actualmente operada no município de Ibaraki. 0 portador de polipropileno foi esterilizado a 121°C durante 10 minutos e carregado com uma solução da estirpe TAI-I5, cultivado até uma concentração de 107 células/ml, numa quantidade de 150 g/1. A mistura foi incubada durante 24 horas com agitação para imobilização dos microorganismos da estirpe TAI-I5 no portador de polipropileno. O portador de imobilização de microorganismo resultante foi adicionado a um tanque de arejamento numa quantidade de 50 g por 1 1 de lama.
Foi adicionado 17p-estradiol ao tanque de lama contendo o portador de polipropileno para proporcionar uma concentração de 17p-estradiol de 0,1 mg/1 e foi medida a concentração após oito horas. TABELA 13
Experiência No. Concentração Inicial mg/1 Concentração após oito horas pg/l Taxa de remoção (%) 1 0,098 0,15 99,8 2 0,10 0,082 99,9 3 0,099 0,055 99,9 4 0,095 0,55 99,4 5 0,091 0,14 99,8 30 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ
APLICABILIDADE INDUSTRIAL
Um microorganismo que degrada substância estrogénica do presente invento pode, prontamente, degradar uma substância estrogénica.
Consequentemente, a substância estrogénica contida em águas residuais domésticas, descarregadas, explorações pecuárias, ou semelhante pode prontamente e efectivamente ser degradada por utilização do microorganismo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 é um desenho apresentando a variação na quantidade residual de 17β-estradiol ao longo do tempo, A FIG.2 é um desenho apresentando a variação na quantidade residual de estrona ao longo do tempo. A FIG. 3 é um desenho apresentando a variação na quantidade residual de estriol ao longo do tempo. A FIG. 4 apresenta uma árvore filogenética da estirpe separada e a estirpe pertencendo ao grupo gram positivo G+C elevado com relação próxima à estirpe separada, preparada com base nas suas sequências de 16S ADNr (cerca de 1450 bases) usando o método união próxima ("neighbor-joining") (os números indicam valores de iniciação ("Bootstrap values") obtidos por repetição de 100 vezes e uma barra na zona inferior esquerda indica uma distância de substituição de base de 5%). A FIG. 5 apresenta uma árvore filogenética da estirpe separada e da estirpe pertencendo à subdivisão α de
Proteobacteria com relação próxima à estirpe separada, preparada com base nas suas sequências de 16S ADNr (cerca de 1450 bases) usando o método de união próxima (os números indicam valores de iniciação obtidos por repetição de 100 vezes e uma barra na zona inferior esquerda indica uma distância de substituição de base de 5%). 31 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ A FIG. 6 apresenta uma árvore filogenética da estirpe separada e da estirpe pertencendo à subdivisão β de Proteobacteria com relação próxima à estirpe separada, preparada com base nas suas sequências de 16S ADNr (cerca de 1450 bases) usando o método de união próxima (os números indicam valores de iniciação obtidos por repetição de 100 vezes e uma barra na zona inferior esquerda indica uma distância de substituição de base de 5%). A FIG. 7 apresenta uma árvore filogenética da estirpe separada e de levedura com relação próxima à estirpe separada, preparada com base nas suas sequências 18S de ADNr (cerca de 1750 bases) usando o método de união próxima (os números indicam valores de iniciação obtidos por repetição de 100 vezes e uma barra na zona inferior esquerda indica uma distância de substituição de base de 3%). 32 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ
LISTAGEM DE SEQUÊNCIA <110> Kabushiki Kaisha Yakule Honsha
Director-Geral do Ministério do Território,
Infraestruturas e Transporte, Instituto Nacional para o Território e Gestão das Infraestruturas <120> Microorganismo de decomposição de estrogénio e sua utilização <130> PF-0 60 0 02-W0 <150> JP2005-46392 <151> 2005-02-23 <160> 18 <170> Patentln versão 3.1 <210> 1 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> 8f <4 0 0> 1 aqagtttgat cmtggctcag 20 <210> 2 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> 520F <400> 2 21 caggagtqcc agcagccgcg g ΕΡ 1 857 541/ΡΤ 33 <210> 3 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> 930F <4 0 0> 3 caagcggtgg agcatgtgg 19 <210> 4 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> 1100F <4 0 0> 4 caggagcaac gagcgcaacc c 21 <210> 5 <211> 15 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> 52 OR <4 0 0> 5 accgcggctg ctgqc 15
<210> 6 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> 8 0 OR 34 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ <4Ο0> 6 ggaotaccag ggtatctaat 20 <210> 7 <211> 16 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> 1100R <4 0 0> 7 agggttqcgc tcgttg 16 <210> 8 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> 15R <4 0 0> 8 aaggaggtga tccarccgca 20 <210> 9 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Y1F <4 0 0> 9 tatctggttg atcctgccag t 21 <210> 10 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial ΕΡ 1 857 541/ΡΤ 35 <22 0> <223> Y380F <4 0 0> 10 ccggagaggg agcctgag 18 <210> 11 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Y430R <4 0 0> 11 tttgcgcgcc tgctgcctt 19 <210> 12 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Y570F <4 0 0> 12 agccgcggta attccagc 18 <210> 13 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Y820R <4 0 0> 13 cgtcctattc tattattcca tgc 23 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ 36 <210> 14 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Y97 0F <4 0 0> 14 aagaacgaaa gttaggggat c 21 <210> 15 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Y1200R <4 0 0> 15 ctttccccgt gttgagtcaa 20 <210> 16 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Y1430F <4 0 0> 16 aggtctgtga tgcccttaga 20
<210> 17 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Y1580R 37 ΕΡ 1 857 541/ΡΤ <4 Ο 0> 17 cgcttactag gaattcctcg tt 22 <210> 18 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Y1770R <4 Ο 0> 18 ctacggaaac cttgttacga c 21
Lisboa, 2012-05-04
Claims (6)
- ΕΡ 1 857 541/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Microorganismo que degrada substância estrogénica em que o microorganismo é um ou mais dos microorganismos que pertencem ao seguinte grupo: Pseudamínobacter salicylatoxidans, estirpe TAA-I3 (FERM BP-10519) Gordonia terrae, estirpe TAI-I5 (FERM BP-10521) Zoogloea sp., estirpe TMJ-I1 (FERM BP-10523) Cryptococcus sp., estirpe TMN-Y2 (FERM BP-10525) Trichosporon loubieri, estirpe FF-Y2 (FERM BP-10526) e que têm a capacidade de degradar uma substância estrogénica selecionada de entre 17β-β3^3άίο1, estrona e estriol.
- 2. Método para a degradação biológica de uma substância estrogénica selecionada de entre 17β-estradiol, estrona e estriol usando o microorganismo da reivindicação 1.
- 3. Método para a degradação de uma substância estrogénica de acordo com a reivindicação 2 aplicada à degradação de uma substância estrogénica em águas residuais ou solo.
- 4. Método para a degradação de uma substância estrogénica de acordo com a reivindicação 2 ou 3 no qual é usado um microorganismo que degrada substância estrogénica ligado a e desenvolvido sobre, a superfície de um corpo sólido de suporte.
- 5. Uso de um microorganismo que degrada substância estrogénica de acordo com a reivindicação 1 para a degradação de uma substância estrogénica selecionada de entre 17β-estradiol, estrona e estriol.
- 6. Uso de acordo com a reivindicação 5 no qual é empregue um aparelho para a degradação de uma substância estrogénica compreendendo i. um meio para o suporte de um microorganismo que degrada uma substância estrogénica e ΕΡ 1 857 541/ΡΤ 2/2 ϋ . um meio para provocar o contacto do microorganismo com águas residuais ou solo. Lisboa, 2012-05-04
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