JP3944428B2 - 女性ホルモン物質分解能を有する微生物およびその利用 - Google Patents
女性ホルモン物質分解能を有する微生物およびその利用 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は女性ホルモン物質分解能を有する微生物およびその利用に関し、更に詳細には、環境中に排出され、存在する女性ホルモン物質を特異的に分解する微生物およびこれを利用する女性ホルモン物質の分解方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体の内分泌系を攪乱するとされる内分泌攪乱化学物質（いわゆる環境ホルモン）は、コルボーンの「奪われし未来」（Colborn T., "Our Stolen Future"(1996)）の発表以来、大きな社会問題となっている。生体における内分泌系は、男性ホルモン、女性ホルモン、甲状腺ホルモン、副腎皮質ホルモンなどの作用によって、生命体の発生や生殖器の発達および身体内諸器官の機能を正常に維持調整するシステムである。内分泌攪乱化学物質は、これら生体における内分泌系に障害を起こす物質群であり、さまざまな人間活動などにより、自然界へと大量に排出されており、すでに野生生物に多くの異常を引き起こしている。
【０００３】
この内分泌攪乱化学物質としては、有機塩素系の殺虫剤、抗菌剤、除草剤、ビスフェノールＡやノニルフェノールに代表される工業に起因する化学物質と、ホルモン剤に代表される医薬に起因する化学物質が知られている。これらの化学物質のうち工業系の化学物質は、その有毒性から水質汚濁防止法、公害関係法規などによりその使用に対して厳しい規制が設けられている。そのため環境中に放出される化学物質群の量は減少傾向を示している。
【０００４】
しかしながら、医薬系の化学物質のうち、下式（Ｉ）で示される１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオールなどの女性ホルモン物質や、エチニルエストラジオールなどの合成女性ホルモン物質等の女性ホルモン物質はヒトや動物の尿中に含まれ環境中に排出され、その排出量は人口の増加にともない増加している。そのため、都市の生活排水が大量に流れ込んでいる河川や湖沼で、棲息する野生生物にメス化の異常が確認され（デボラ・キャドバリィー著、井口泰泉監修、「メス化する自然」、集英社（１９９８））、繁殖不能によって生態系バランスを崩す懸念が示唆されている。従って、排水を河川などに放出する前の段階で、例えば、排水中の女性ホルモン物質を排水処理施設で低減させる必要がある。
【０００５】
【化１】
【０００６】
ところで、従来の排水処理施設においては、物理学的処理、化学的処理、生物学的処理の３つの処理方法が行われている。このうち物理学的処理とは、具体的に示すと、遠心分離法、ろ過法、加圧浮上分離法、吸着法などであり、また、化学的処理とは、化学薬品等の添加による有害物質の無害化処理法、電気透析法、イオン交換法などをさす。これに対し、生物学的処理は、微生物を用いて、排水中の有機物質を分解し、除去する方法であり、物理学的処理、化学的処理では処理の困難な物質などの処理にも有効である。
【０００７】
このため、生物学的処理は、近年、多くの排水処理施設で利用されており、一般的に次の３つの段階に別けられる。すなわち、予備処理、生物酸化処理、汚泥の処理である。このうち、予備処理には、スクリーン、沈砂池、沈殿池、浮上槽などが含まれ、これらの装置は、排水に含まれる粒径の大きい固形物や無機性の浮遊物などを除去するとともに、さらに、生物酸化処理施設への有機物質の負荷を減らすために役立っている。
【０００８】
また、生物酸化処理は、微生物を利用するものであるが、その手法としては、微生物を固体支持体表面に付着させ生育させる方法と、微生物群を液中に懸濁させる方法とがある。前者は、通常、散水ろ床法などの固定床式の装置により、また後者は、活性汚泥法などの流動床式の装置により実施される。
【０００９】
上記の活性汚泥処理や散水ろ床処理などは、排水中の汚濁物質を低減するためには非常にすぐれた方法であるため、近年、内分泌攪乱化学物質の分解にあたっても、こうした生物学的処理によるアプローチが各種なされており、更には、処理効率の向上や処理の困難な内分泌攪乱化学物質の分解を目的とした微生物の選別・強化も行われている。例えば、特開２００１−３３３７６７号には、ノニルフェノール分解能を有するスフィンゴモナス属細菌が、特開平１１−３４１９７８号には、ダイオキシン分解能を有するフザリウム属細菌がそれぞれ記載されている。しかしながら、女性ホルモン物質を効果的に分解することのできる微生物については、現在まで全く報告されていなかった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、女性ホルモン物質分解能を有する微生物の提供と、この微生物を利用して、生活排水および家畜養殖場等から環境中に排出された女性ホルモン物質を簡便に分解する方法の提供を課題とするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、女性ホルモン物質を用いた集積培養による多くの微生物をスクリーニングした結果、特異的に優れた女性ホルモン物質の分解能を有する微生物を見出した。また、当該微生物を利用した女性ホルモン物質の分解方法や分解装置により環境中に排出された女性ホルモン物質を分解できることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち本発明は、ロドコッカス（Rhodococcus）属またはスフィンゴモナス（Sphingomonas）属に属し、女性ホルモン物質分解能を有することを特徴とする微生物を提供するものである。
【００１３】
また、本発明は、上記微生物を使用し、女性ホルモン物質を分解することを特徴とする女性ホルモン物質の分解方法を提供するものである。
【００１４】
更に、本発明は、上記微生物を担持する手段および当該微生物を排水または土壌と接触させる手段を有する女性ホルモン物質分解用装置を提供するものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明において、分解処理の対象となる女性ホルモン物質は、例えば、前記式（Ｉ）で示される天然あるいは合成女性ホルモンである。このうち、１７β−エストラジオールは、卵巣ろ胞から分泌されるステロイドホルモンで、生理活性が最も高い物質である。その分泌は、脳下垂体の卵胞刺激ホルモン、および、黄体形成ホルモンの支配を受けている。薬剤として、無月経症、月経周期異常、月経困難症、子宮発育不全、更年期障害などに用いられている。また、エストロンは、卵胞ホルモンの一種で、１７β−エストラジオールの代謝産物である。このものは、強いエストロゲン活性を有し、女性ホルモン剤として、女性の性機能不全、更年期障害、および、前立腺ガンなどに使用される。更にエストリオールは、生体内での１７β−エストラジオールの代謝産物で、エストロンを経由して生成され尿中へ出現するものである。一方、エチニルエストラジオールは、人工の女性ホルモン物質で、卵胞ホルモン作用薬として用いられている。１７β−エストラジオールより肝臓で分解されにくく、経口投与で１７β−エストラジオールより有効とされており、子宮発育不全、無月経、不妊症、更年期障害等に経口投与され、また、経口避妊薬「ピル」にも用いられているものである。
【００１６】
これらの女性ホルモン物質を分解する微生物（以下、単に「本発明微生物」という）は、例えば、活性汚泥槽中に存在するロドコッカス属またはスフィンゴモナス属に属する微生物を、前記式（Ｉ）の女性ホルモン物質を用いてスクリーニングすることにより得られる。
【００１７】
より具体的には、下水処理場の活性汚泥槽中から得られた活性汚泥を、女性ホルモン物質を用いた多段階のスクリーニングに付すことにより、本発明微生物を得ることができる。
【００１８】
すなわち、本発明微生物はそれぞれの活性汚泥を、女性ホルモン物質を基質としたカラム集積培養法で長時間（およそ１０週間）培養を行い、女性ホルモン物質の分解能を有する微生物をスクリーニングした後、更に女性ホルモン物質を基質とした培養を行い、数値的にも有意に高い分解能を示す微生物をスクリーニングすることにより得ることができる。
【００１９】
女性ホルモン物質の分解能を有する微生物のスクリーニングの具体例としては下記のような手順を示すことができる。まず、図１に示すようなカラム、基質導入口および空気導入口を備える培養装置を作成する。この培養装置に、活性汚泥と、例えば、下記に示すＭＤＧ培地（Modified DOMINIC & GRAHAM's medium）をカラムに入れ、これに空気導入口から酸素と基質導入口から１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオール、エチニルエストラジオール等の女性ホルモン物質とを導入し、２５℃程度で、１０週間程度回分培養する。この培養中は、定時に生菌数やｐＨを測定する。培養終了後、ＩＳＰ培地、Ｒ２Ａ培地、ＹＭ培地等で菌株の選抜および釣菌を行い、女性ホルモン物質分解能を有する微生物を得る。
【００２０】
ＭＤＧ培地の組成：
Ｋ２ＨＰＯ４ ３.５
ＫＨ２ＰＯ４ １.５
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０.５
ＮａＣｌ ０.５
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０.１５
Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０.００５％（ｗ／ｖ）
トレースエレメント＊ １.０ （ｍＬ／Ｌ）
ｐＨ ７.０
数値の単位はｇ／Ｌ。
【００２１】
＊トレースエレメントの組成：
ＮａＨＣＯ３・１０Ｈ２Ｏ ２.０
ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ ０.３
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０.２
（ＮＨ４）Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ ０.０２
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０.１
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０.５
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０.０５
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０.５
数値の単位はｇ／Ｌ。
【００２２】
次いで、上記スクリーニングにより選抜された微生物を、例えば、女性ホルモン物質を含むＹＭ培地中で培養し、培養後の培地中の女性ホルモン物質の残存量を測定することにより、女性ホルモン物質の分解能の高い微生物のスクリーニングを行うことができる。このスクリーニングを複数回繰り返し行うことで、より女性ホルモン物質の分解能の高い微生物を得ることができる。
【００２３】
かくして得られる本発明微生物は、スクリーニングに用いた１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオールまたはエチニルエストラジオール等の女性ホルモン物質の少なくとも１種以上を生物学的に分解可能であり、具体的には女性ホルモン物質として１７β−エストラジオールを１００ｐｐｍ添加した１ＬのＭＤＧ培地において１０８〜１０９個程度の本発明微生物を８時間培養した場合に、当該培地中の１７β−エストラジオールを８０％以上分解することができる能力を有するものである。
【００２４】
上記のスクリーニングにより、伏見下水処理場（京都府京都市）の活性汚泥槽、等々力水処理センター（神奈川県川崎市）の活性汚泥槽、多摩川上流処理場（東京都昭島市）の活性汚泥槽、森ヶ崎水処理センター（東京都大田区）の活性汚泥槽より得られた微生物中から選抜された女性ホルモン物質を分解することができる微生物として、下記５株を得た。なお、これらの微生物の菌種同定は微生物の１６ＳｒＤＮＡ配列を用いて文献記載（Carl R. Woese, Bacterial Evolution., Microbiological Reviews., 51:221-271(1987)およびE. Stackebrandt and B. M. Goebel, Taxonomic Note: A Place for DNA-DNA Reassociation and 16S rRNA Sequence Analysis in the Present Species Definition in Bacteriology., International Journal of Systematic Bacteriology, 44, (4): 846-849 (1994)）の分子進化系統解析に基づき行った。分子進化系統解析により５株の微生物は次のように同定された。
【００２５】
・ロドコッカス・ゾフィイ（Rhodococcus zopfii） Ｄ−Ｉ７
・スフィンゴモナス・スピーシーズ（Sphingomonas sp.） Ｃ−Ｉ２
・ロドコッカス・イクイ（Rhodococcus equi） Ａ−Ｙ２
・ロドコッカス・イクイ（Rhodococcus equi） Ｄ−Ｙ４
・ロドコッカス・イクイ（Rhodococcus equi） Ｅ−Ｙ５
【００２６】
これら５株のうちＤ−Ｉ７株およびＣ−Ｉ２株については、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に４月２６日付でそれぞれ受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８８３９およびＦＥＲＭ Ｐ−１８８３８で寄託されている。一方、Ａ−２Ｙ株、Ｄ−Ｙ４株およびＥ−Ｙ５株については上記特許生物寄託センターにおいて、分類学上の問題から受託を拒否されたため寄託を行っていないが、本株は特許法施行規則第２７条の３の条件を満足する分譲の請求があった場合は、出願人株式会社ヤクルト本社において、同条の条件に従って分譲することを保証する。
【００２７】
本発明の微生物であるロドコッカス・イクイ（Rhodococcus equi）およびロドコッカス・ゾフィイ（Rhodococcus zopfii）を含むロドコッカス・スピーシーズ（Rhodococcus sp.）は（日本放射菌学会編、「放射菌の分類と同定」、日本学会事務センター、１８７−１８８（２００１））、Ｈｉｇｈ−ＧＣグラム陽性球菌であるコリネバクテリウム（Corynebacterium）グループに含まれる。これまでは、マイコバクテリウム・スピーシーズ（Mycobacterium sp.）とノカルディア・スピーシーズ（Nocardia sp.）の中間的な性状を示すことでまとめられたロドクロス・コンプレックス（Rhodochrous complex）のグループであったが、１８９１年にゾフ（Zopf）が提案した属名を当てて再定義された（Tsukamura, M. A Further numerical taxonomic study of the rhodochrous group, Jpn. J. Microbiol., 18, 37-44 (1974)）。本発明の微生物は、好気性であり、非運動性である。また、抗酸性は示さないか、あっても極めて弱い。更に、菌糸状の生育をするものから、擬球菌状の細胞のものまであるが、気菌糸を持つものはない。また更に、菌糸状あるいは分枝状の桿菌は一般に長時間の培養によって細胞が断裂して、短桿菌状あるいは擬球菌状となる。更にまた、生育至適温度は２０℃から３７℃と広い。また、橙色から赤色のコロニーを形成し、その表面はラフ、スムース共に存在する。更に、細胞壁ペプチドグリカンは、Ａ１γ−タイプ、グリコリル型、アラビノースとガラクトースを含む。また更に、呼吸鎖キノンの主要成分はＭＫ−８（Ｈ２）である。更にまた、菌体脂肪酸は直鎖−モノ不飽和型で１０Ｍｅ−１８：０を含む０１０メチル脂肪酸の含量は、種または株によって異なる。また、リン脂質としてはＰＥが検出されるほか、ＤＰＧ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＩＭｓと、いくらかの糖脂質がみられる。本スピーシーズの多くは土壌由来であるが、動植物にも幅広く分布している。
【００２８】
本発明のもう一方の微生物であるスフィンゴモナス・スピーシーズ（Sphingomonas sp.）はグラム陰性菌であり、α−プロテオバクテリア（Proteobacteria α-subdivision）に含まれる（坂崎利一監訳、「グラム陰性、好気性および通性嫌気性桿菌の同定」、近代出版、３０２−３０３（１９９３））。また、比較的長い桿菌のものが多くあり、運動性があるものも含まれる。更に、好気性で黄色の不溶性な色素を産生する。また更に、通常、マッコンキー（MacConkey）寒天に非発育で、グルコース、キシロース、ラクトース、シュークロース、マルトースを利用する。更にまた、マンニットは非利用で、硝酸塩に対しては非還元である。また、リシンデカルボキシラーゼに陰性、アルギニンジヒドロラーゼに陰性という特徴を持つ微生物である。
【００２９】
かくして得られた本発明微生物について、これらの大量培養に好適な条件を検討したところ、至適培養温度が３０℃、ｐＨが全般的に６.０から７.０であった。また、至適培地の検討には、ＩＳＰ培地を基本に、その成分量を増減させ、無機塩の添加等を行った下記に示す改変培地１および改変培地２を使用し、増殖に与える影響を検討した。この結果、上記５株のうち、Ｃ−Ｉ２株を除いては改変培地１においてよく増殖しており、Ｃ−Ｉ２株が最も低栄養な微生物であることが明らかになった。
【００３０】
改変培地１の組成（蒸留水１Ｌ中）：
Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ
Ｐｅｐｔｏｎｅ １０ｇ
Ｇｌｕｃｏｓｅ ５ｇ
ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４ ２ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０.５ｇ
【００３１】
改変培地２の組成（蒸留水１Ｌ中）：
Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ２ｇ
Ｍａｌｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ
Ｄｅｘｔｏｒｏｓｅ ４ｇ
【００３２】
以上説明した本発明微生物は、単独あるいはこれらを組合わせて排水中または土壌中の女性ホルモン物質を分解するのに使用することができる。また、これらの微生物は、例えば活性汚泥法などによる場合はそのまま使用しても良いが、これらの微生物を固体支持体に付着生育させて使用することが女性ホルモン物質の分解の点から好ましい。
【００３３】
固体支持体に付着生育させる場合には、微生物を固定化する方法として、共有結合、イオン結合、水素結合、物理的な吸着などにより不溶性の担体に微生物を付着させる結合固定化方法と、低分子化合物を重合または会合させるか、または高分子化合物を可溶の状態から不溶の状態に変化させることによって生じる高分子ゲルに微生物を包み込んでしまう包括固定化方法があるが、いずれを採用しても良い。しかしながら、微生物の保持能力の点で結合固定化法が好ましく、微生物を付着させる固体支持体としては多孔性セルロース、ＰＶＡ、微粉末活性炭コート顆粒ポリビニルアルコール担体（ＡＣＰ担体：三好ら、「染色排水に対する脱色細菌の適用」、下水道協会誌、３９、１２３−１３２（２００２））等が挙げられるが、特にＡＣＰ担体の使用が好ましい。
【００３４】
具体的に排水中の女性ホルモン物質を分解するにあたって、例えば活性汚泥法を採用する場合は、一般的には、被処理液１Ｌ当たり１０８から１０９個程度の本発明微生物を用い、５から１０時間程度好気的に培養処理すれば良い。また、固体支持体を用いる方法を採用する場合は、固体支持体上の本発明微生物と被処理液を５から１０時間程度好気的な培養条件下で接触させれば良い。
【００３５】
また、土壌中の女性ホルモン物質を分解するにあたっては、例えば、必要により緩衝溶液または生理食塩水に懸濁させた本発明微生物を、処理すべき土壌表面あるいは掘り起こした土壌に、１ｍ３当たり１０９から１０１０個程度散布すればよい。
【００３６】
なお、本発明微生物を用いて、効率よく女性ホルモン物質を分解するには、本発明の微生物を利用した女性ホルモン物質を分解するための、本発明微生物を担持する手段および当該微生物を排水または土壌と接触する手段を有する装置の利用が挙げられる。具体的には、完全混合タイプ、エアーリフトタイプ、カラム充填タイプ、ラグフロータイプ等のバイオリアクター装置を用いることができる。このような装置は生物酸化処理中の２次処理工程で使用することができ、その際には、微生物群を排水中に懸濁させる方式よりも固体支持体表面に付着生育させて用いる方式の方が、好適である。これは、微生物を支持体表面に付着させることにより、バイオリアクターから外部への微生物の流出を防ぐことができ、より濃厚な菌液を得られることが出来るため、排水中の女性ホルモン物質を効率よく分解することができる。
【００３７】
【実施例】
以下、実施例について本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３８】
実 施 例 １
連続集積培養による女性ホルモン物質の分解能を有する微生物のスクリーニング：
長さ５０ｃｍ×直径８ｃｍの円筒形カラムの上部に基質導入口および下部に空気導入口を設け、これらにチューブを接続した後、ゴム栓にて蓋をし、培養装置を作製した（図１）。この培養装置中に前記したＭＤＧ培地と表１に示す場所より採取した活性汚泥２０ｍＬを加えた。次いで、上部流出入口より、０.１ｍｇ／Ｌの１７β−エストラジオール水溶液を、６０〜１００ｍＬ／時間で、また下部流出入口より酸素を５０〜１００ｍＬ／分で吹き込んだ。この状態で、およそ１０週間連続的に回分培養をし、０、５、２４、７２時間、その後は１週間毎に生菌数およびｐＨを調べた。再現性の確認のため、培養は３回行った。３回とも、微生物の増殖が確認された１０週間目（等々力水処理センターのみ９週間目）の培養液より、特徴的な集落を、それぞれＩＳＰ分離培地、Ｒ２Ａ分離培地およびＹＭ培地で菌株を選択・釣菌した。表１に各培地で得られた集落の数およびそこから釣菌された菌株数を示す。
【００３９】
【表１】
【００４０】
この結果に示すように、連続集積培養により伏見下水処理場からは１４株、等々力水処理センターからは１０株、多摩川上流処理場からは１６株、森ヶ崎処理センターからは１６株の合計５６株の女性ホルモン物質分解微生物が得られた。
【００４１】
実 施 例 ２
女性ホルモン物質の高分解能を有する微生物のスクリーニング：
（１）一次スクリーニング
実施例１において得られた５６株の微生物を、１７β−エストラジオールを基質とする培地を用い、下記に示す方法で培養し、増殖速度が高い菌株を選抜した。まず、１７β−エストラジオールをＤＭＳＯ溶液に溶解し、０.２２μｍのメンブレンフィルターを用いてろ過滅菌した。この溶液をＭＤＧ培地中に、１７β−エストラジオール濃度が１００ｐｐｍとなるように添加した。
【００４２】
２５℃に保存している実施例１で得られた各微生物を、ＹＭ平板培地に線引き植菌した後、流動パラフィンを重層して画線培養を行った。３〜１０日後、この１白金耳をかきとり、上記で調製した培地が入った試験管に植菌した。植菌した試験管を２５℃にて激しく振とうさせ、１０日間培養した。植菌していない基質の入った試験管をコントロールとして、植菌した試験管の基質の濁度を観察した。微生物の増殖の度合いの判定は以下の基準で行った。その結果を表２および表３に示す。
【００４３】
＜判定基準＞
− ： コントロールと比較して全く同じである。
＋ ： コントロールと比較して多少の濁りが観察され、菌の増殖があると予測される。
＋＋： コントロールと比較して明らかに濁っており、活発な菌の増殖が推測される。
【００４４】
【表２】
【００４５】
【表３】
【００４６】
一次スクリーニングの結果、＋以上の判定が得られたのは、５６株中、２５株であった。
【００４７】
（２）二次スクリーニング
一次スクリーニングで選択した微生物２５株について、下記に示す方法で菌株を選定した。まず、一次スクリーニングで＋以上の増殖を示した２５株をＹＭ平板培地に画線培養し、一次スクリーニングと同様の手法で培養した。１０日後、増殖した培地の全量を、Ｃ１８固相カラム（Ｗａｔｅｒｓ社製）で固相抽出し、抽出物１０μＬを薄層クロマトグラフにスポッティングし、ベンゼン−メタノール（９：１）混液を展開溶媒として展開させて、１７β−エストラジオールの減少を確認した。この結果、有効に１７β−エストラジオールを分解する９株を選択した。
【００４８】
（３）三次スクリーニング
二次スクリーニングで選択した微生物９株について、より強く１７β−エストラジオールを分解する菌株を選定するとともに、他の女性ホルモン物質（エストロン、エストリオール、エチニルエストラジオール）についてもその分解能を検討した。材料および方法は以下の手順に従った。まず、女性ホルモン物質（１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオール、エチニルエストラジオール）をそれぞれＤＭＳＯ溶液に溶解し、０.２２μｍのメンブレンフィルターを用いてろ過滅菌したものを用意し、これをＭＤＧ培地中で濃度１００ｐｐｍとなるように調製し、培養培地とした。
【００４９】
この培養培地を試験管に取り、上記微生物を二次スクリーニングと同様植菌した後、所定時間培養した。培養開始５時間後、８時間後、２４時間後の女性ホルモン物質の濃度を測定し、減少量を確認した。女性ホルモン物質量の測定は、培養後の培地の全量を、Ｃ１８固相カラム（Ｗａｔｅｒｓ社製）に保持させ、その後、酢酸メチルで溶出させ、分析することにより行った。より具体的には、次のようにして分析した。すなわち、まず溶出液を適当量分取し、これにサロゲート物質（１７β−エストラジオール−ｄ４）を添加した。次いで、窒素気流により乾固させた後、Ｎ,Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）によりＴＭＳ化体を誘導し、再び乾固させ、ｎ−ヘキサンに溶解させ、その検液を下記条件のガスクロマトグラフィーで分析した。
【００５０】
【００５１】
三次スクリーニングの結果、８時間で１７β−エストラジオールを８０％以上分解する微生物として５株(Ａ−Ｙ２株、Ｅ−Ｙ５株、Ｄ−Ｙ４株、Ｄ−Ｉ７株、Ｃ−Ｉ２株)を選択した。その選択した微生物による１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオール、エチニルエストラジオールの分解による残存量の経時変化を図２〜図５に示した。
【００５２】
実 施 例 ３
女性ホルモン物質分解能を有する微生物の同定：
女性ホルモン物質分解能を有する微生物（以下、「女性ホルモン物質分解菌」という）の５菌株(Ａ−Ｙ２株、Ｅ−Ｙ５株、Ｄ−Ｙ４株、Ｄ−Ｉ７株、Ｃ−Ｉ２株）について、１６ＳｒＤＮＡ配列を用いた菌種同定を、以下の手順に従って行い、１６ＳｒＤＮＡ配列を用いた系統樹図を作製した（図６および図７）。
【００５３】
（１）菌体からのＤＮＡ抽出
上記の５菌株の各純培養菌体から、以下に示す塩化ベンジル法を用いてＤＮＡを抽出した。すなわち、ＹＭ斜面寒天培地を用いて３日間、３０℃で培養した。培養後、集菌した菌体に２５０μＬのＤＮＡ抽出バッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、４０ｍＭのＥＤＴＡの混合液：ｐＨ９．０）、２００μＬのベンジルクロライドおよび５０μＬの１０％ＳＤＳを加え、５０℃で、激しく３０分間振とうした。３Ｍの酢酸ナトリウムを１５０ｍＬ加えた後、遠心し、上清を別のチューブに移し、イソプロパノール沈殿、７０％エタノール洗浄を順に行い、風乾した後、これを１００μＬのＴＥバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１ｍＭのＥＤＴＡ）に溶解して各菌体のＤＮＡとした。
【００５４】
（２）１６ＳrＤＮＡ増幅ＰＣＲ反応
増幅プライマーには下記の二つのプライマーを使用した。
１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１.５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＬのｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ、１Ｕ ＴａｑのＤＮＡポリメラーゼ（タカラ社製）、５０ｎｇの菌体ＤＮＡおよび増幅プライマー８Ｆと１５Ｒをそれぞれ０.４μＭ含む反応液（総量５０μＬ）について、ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）により、ＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ反応は、９４℃で２０秒、５５℃で１５秒、７２℃で１８０秒で２５サイクル行った。ＰＣＲ反応後、得られた増幅産物は、マイクロコン−ＰＣＲ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて精製した。
【００５５】
（３）１６ＳrＤＮＡ配列の決定
１６ＳrＤＮＡ塩基配列の解読は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）により、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７３Ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ社製）を使用して行った。使用したｐｒｉｍｅｒは下記に示した。配列のアライメントには、ＡｕｔｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いた。
【００５６】
（４）１６ＳｒＤＮＡ配列の系統解析
得られた１６ＳrＤＮＡ配列とＤＤＢＪ等の遺伝子データベースより得られた近縁な細菌の１６ＳrＤＮＡ塩基配列をもちいて、系統解析ソフト（Ｃｌｕｓｔｕｌ Ｘ）を使用して分子進化系統解析を行った（図６）。その結果、Ａ−Ｙ２株、Ｅ−Ｙ５ 株、Ｄ−Ｙ４株はロドコッカス・イクイ（Rhodococcus equi）に属する菌株と、 Ｄ−Ｉ７株はロドコッカス・ゾフィイ（Rhodococcus zopfii）に即する菌株と 、Ｃ−Ｉ２株スフィンゴモナス・スピーシーズ（Sphingomonas sp.）であると同定された。
【００５７】
実 施 例 ４
女性ホルモン物質分解能を有する微生物を用いた排水処理：
女性ホルモン物質分解菌５菌株（Ａ−Ｙ２株、Ｅ−Ｙ５株、Ｄ−Ｙ４株、Ｄ−Ｉ７株、Ｃ−Ｉ２株）を担体に固定し、排水の処理を行った。
【００５８】
（１）固定化担体の作製
多孔性セルロース、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、微粉末活性炭コート顆粒ポリビニルアルコール（ＡＣＰ）の３種類の担体を用い、結合固定化法により女性ホルモン物質分解菌を次の手順で固定した。まず、固定化する女性ホルモン物質分解菌の各菌体をジャーファーメンターを用いて大量に培養した。この培養において対数増殖期の培養液５００ｍＬを滅菌したフラスコに入れ、次いで、このフラスコに表４に示す３種類の担体を１００ｇずつ入れて良く混合し、固定化担体を作製した。
【００５９】
（２）固定化担体の微生物保持能力の評価
上記（１）で作製した固定化担体から次の手順で菌体を溶出させ、生菌数を測定することで微生物保持能力を評価した。まず、固定化担体を数粒すりつぶし、１０ｇ量り取った。この固定化担体をガラス製試験管の生理食塩水１０ｍＬ（０.１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００含有）中に入れ、これを１０分間超音波処理して十分にミキシングした後、再度１０分間超音波処理をした。このようにして得られた溶液を生菌数測定用の溶出液とした。溶出液の生菌数はＣＧＹ培地を用いた希釈平板法により計数した。なお、担体中の生菌数の測定は、担体作成後２４時間および７２時間に、フラスコ中に浸漬した固定化担体の一部を採取することで行った。その結果を表４に示す。この結果、ＡＣＰ担体の微生物保持能力が高いことが示された。
【００６０】
【表４】
【００６１】
（３）回分式曝気法による有効性試験
５株の女性ホルモン物質分解菌の各々を（１）と同様の手順でＡＣＰ担体に固定化し、女性ホルモン物質を添加した合成下水に対する有効性試験を行った。具体的には、５株の女性ホルモン物質分解菌をジャーファーメンターにて大量培養し、得られた培養液を１０５℃で１０分間高圧滅菌した後、滅菌水で洗浄したＡＣＰ担体（培養液５００ｍＬに対して乾燥重量５０ｇのＡＣＰ担体）を２４時間浸漬して固定化した。合成下水は、文献記載（橋本奨著、「バイオテクノロジー活用の高機能型活性汚泥法」、技報堂出版、２６７−２６８（１９８９））の方法により作成した。下水中の女性ホルモン物質の濃度については、平成１２年度都内処理場での実態調査で、流入下水および処理中の１７β−エストラジオール濃度は０.０１７〜０.０６８μｇ／Ｌであり、エストロンの濃度は０.０１４〜０.１４μｇ／Ｌであることが報告されている（東京都下水道局報告書、「平成１２年度下水道における内分泌攪乱化学物質の実態調査結果」）。本有効試験は、作成した合成下水に、１７β−エストラジオールが０.１μｇ／Ｌ、エストロンが０.２μｇ／Ｌとなるように添加して実施した。
【００６２】
合成下水の組成（蒸留水１Ｌ中）：
Ｐｅｐｔｏｎｅ １５０ｍｇ
Ｍｅａｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １００ｍｇ
Ｕｒｅａ ２５ｍｇ
ＮａＣｌ ７.５ｍｇ
ＫＣｌ ３.５ｍｇ
ＣａＣｌ２ ３.５ｍｇ
ＭｇＳＯ４ ２.５ｍｇ
Ｋ２ＨＰＯ４ ２６７ｍｇ
ＫＨ２ＰＯ４ ３３ｍｇ
【００６３】
有効性試験は、図８に示す回分式曝気装置を用いた回分式曝気法により行った。すなわち、回分式曝気装置中におよそ２Ｌの合成下水を入れ、各女性ホルモン物質分解菌を固定化したＡＣＰ担体をおよそ１００ｇ投入し、空気導入口から０.１〜２ＶＶＭの空気を送り、攪拌翼で担体が沈殿しない程度に低速で攪拌した。曝気開始８時間後の１７β−エストラジオールとエストロンの濃度と分解率を表５に示した。ＡＣＰ担体に固定化したそれぞれの微生物は、８時間で１７β−エストラジオールを８０％以上分解する能力を示した。
【００６４】
【表５】
【００６５】
【発明の効果】
本発明の微生物は、１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオールまたはエチニルエストラジオール等の女性ホルモン物質を分解することが可能な微生物である。
【００６６】
従って、本発明の微生物を利用した女性ホルモン物質を分解する方法および装置により、女性ホルモン物質に汚染された排水や土壌中の女性ホルモン物質を分解し、環境を改善することができる。
【００６７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 連続集積培養に使用した装置を示す図面である。
【図２】 １７β−エストラジオールの経時変化を示す図面である。
【図３】 エストロンの経時変化を示す図面である。
【図４】 エストリオールの経時変化を示す図面である。
【図５】 エチニルエストラジオールの経時変化を示す図面である。
【図６】 本発明の（Rhodococcus属）微生物の分子進化系統解析を示す図面である。
【図７】 本発明の（Sphingomonas属）微生物の分子進化系統解析を示す図面である。
【図８】 回分式曝気培養に使用した装置を示す図面である。
【符号の説明】
１ … … 培養装置
２ … … カラム
３ … … 基質導入口
４ … … 空気導入口
５ … … 回分式曝気装置
６ … … ＡＣＰ担体
７ … … 合成下水
８ … … 攪拌翼
９ … … 空気導入口
以 上
【発明の属する技術分野】
本発明は女性ホルモン物質分解能を有する微生物およびその利用に関し、更に詳細には、環境中に排出され、存在する女性ホルモン物質を特異的に分解する微生物およびこれを利用する女性ホルモン物質の分解方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体の内分泌系を攪乱するとされる内分泌攪乱化学物質（いわゆる環境ホルモン）は、コルボーンの「奪われし未来」（Colborn T., "Our Stolen Future"(1996)）の発表以来、大きな社会問題となっている。生体における内分泌系は、男性ホルモン、女性ホルモン、甲状腺ホルモン、副腎皮質ホルモンなどの作用によって、生命体の発生や生殖器の発達および身体内諸器官の機能を正常に維持調整するシステムである。内分泌攪乱化学物質は、これら生体における内分泌系に障害を起こす物質群であり、さまざまな人間活動などにより、自然界へと大量に排出されており、すでに野生生物に多くの異常を引き起こしている。
【０００３】
この内分泌攪乱化学物質としては、有機塩素系の殺虫剤、抗菌剤、除草剤、ビスフェノールＡやノニルフェノールに代表される工業に起因する化学物質と、ホルモン剤に代表される医薬に起因する化学物質が知られている。これらの化学物質のうち工業系の化学物質は、その有毒性から水質汚濁防止法、公害関係法規などによりその使用に対して厳しい規制が設けられている。そのため環境中に放出される化学物質群の量は減少傾向を示している。
【０００４】
しかしながら、医薬系の化学物質のうち、下式（Ｉ）で示される１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオールなどの女性ホルモン物質や、エチニルエストラジオールなどの合成女性ホルモン物質等の女性ホルモン物質はヒトや動物の尿中に含まれ環境中に排出され、その排出量は人口の増加にともない増加している。そのため、都市の生活排水が大量に流れ込んでいる河川や湖沼で、棲息する野生生物にメス化の異常が確認され（デボラ・キャドバリィー著、井口泰泉監修、「メス化する自然」、集英社（１９９８））、繁殖不能によって生態系バランスを崩す懸念が示唆されている。従って、排水を河川などに放出する前の段階で、例えば、排水中の女性ホルモン物質を排水処理施設で低減させる必要がある。
【０００５】
【化１】
ところで、従来の排水処理施設においては、物理学的処理、化学的処理、生物学的処理の３つの処理方法が行われている。このうち物理学的処理とは、具体的に示すと、遠心分離法、ろ過法、加圧浮上分離法、吸着法などであり、また、化学的処理とは、化学薬品等の添加による有害物質の無害化処理法、電気透析法、イオン交換法などをさす。これに対し、生物学的処理は、微生物を用いて、排水中の有機物質を分解し、除去する方法であり、物理学的処理、化学的処理では処理の困難な物質などの処理にも有効である。
【０００７】
このため、生物学的処理は、近年、多くの排水処理施設で利用されており、一般的に次の３つの段階に別けられる。すなわち、予備処理、生物酸化処理、汚泥の処理である。このうち、予備処理には、スクリーン、沈砂池、沈殿池、浮上槽などが含まれ、これらの装置は、排水に含まれる粒径の大きい固形物や無機性の浮遊物などを除去するとともに、さらに、生物酸化処理施設への有機物質の負荷を減らすために役立っている。
【０００８】
また、生物酸化処理は、微生物を利用するものであるが、その手法としては、微生物を固体支持体表面に付着させ生育させる方法と、微生物群を液中に懸濁させる方法とがある。前者は、通常、散水ろ床法などの固定床式の装置により、また後者は、活性汚泥法などの流動床式の装置により実施される。
【０００９】
上記の活性汚泥処理や散水ろ床処理などは、排水中の汚濁物質を低減するためには非常にすぐれた方法であるため、近年、内分泌攪乱化学物質の分解にあたっても、こうした生物学的処理によるアプローチが各種なされており、更には、処理効率の向上や処理の困難な内分泌攪乱化学物質の分解を目的とした微生物の選別・強化も行われている。例えば、特開２００１−３３３７６７号には、ノニルフェノール分解能を有するスフィンゴモナス属細菌が、特開平１１−３４１９７８号には、ダイオキシン分解能を有するフザリウム属細菌がそれぞれ記載されている。しかしながら、女性ホルモン物質を効果的に分解することのできる微生物については、現在まで全く報告されていなかった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、女性ホルモン物質分解能を有する微生物の提供と、この微生物を利用して、生活排水および家畜養殖場等から環境中に排出された女性ホルモン物質を簡便に分解する方法の提供を課題とするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、女性ホルモン物質を用いた集積培養による多くの微生物をスクリーニングした結果、特異的に優れた女性ホルモン物質の分解能を有する微生物を見出した。また、当該微生物を利用した女性ホルモン物質の分解方法や分解装置により環境中に排出された女性ホルモン物質を分解できることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち本発明は、ロドコッカス（Rhodococcus）属またはスフィンゴモナス（Sphingomonas）属に属し、女性ホルモン物質分解能を有することを特徴とする微生物を提供するものである。
【００１３】
また、本発明は、上記微生物を使用し、女性ホルモン物質を分解することを特徴とする女性ホルモン物質の分解方法を提供するものである。
【００１４】
更に、本発明は、上記微生物を担持する手段および当該微生物を排水または土壌と接触させる手段を有する女性ホルモン物質分解用装置を提供するものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明において、分解処理の対象となる女性ホルモン物質は、例えば、前記式（Ｉ）で示される天然あるいは合成女性ホルモンである。このうち、１７β−エストラジオールは、卵巣ろ胞から分泌されるステロイドホルモンで、生理活性が最も高い物質である。その分泌は、脳下垂体の卵胞刺激ホルモン、および、黄体形成ホルモンの支配を受けている。薬剤として、無月経症、月経周期異常、月経困難症、子宮発育不全、更年期障害などに用いられている。また、エストロンは、卵胞ホルモンの一種で、１７β−エストラジオールの代謝産物である。このものは、強いエストロゲン活性を有し、女性ホルモン剤として、女性の性機能不全、更年期障害、および、前立腺ガンなどに使用される。更にエストリオールは、生体内での１７β−エストラジオールの代謝産物で、エストロンを経由して生成され尿中へ出現するものである。一方、エチニルエストラジオールは、人工の女性ホルモン物質で、卵胞ホルモン作用薬として用いられている。１７β−エストラジオールより肝臓で分解されにくく、経口投与で１７β−エストラジオールより有効とされており、子宮発育不全、無月経、不妊症、更年期障害等に経口投与され、また、経口避妊薬「ピル」にも用いられているものである。
【００１６】
これらの女性ホルモン物質を分解する微生物（以下、単に「本発明微生物」という）は、例えば、活性汚泥槽中に存在するロドコッカス属またはスフィンゴモナス属に属する微生物を、前記式（Ｉ）の女性ホルモン物質を用いてスクリーニングすることにより得られる。
【００１７】
より具体的には、下水処理場の活性汚泥槽中から得られた活性汚泥を、女性ホルモン物質を用いた多段階のスクリーニングに付すことにより、本発明微生物を得ることができる。
【００１８】
すなわち、本発明微生物はそれぞれの活性汚泥を、女性ホルモン物質を基質としたカラム集積培養法で長時間（およそ１０週間）培養を行い、女性ホルモン物質の分解能を有する微生物をスクリーニングした後、更に女性ホルモン物質を基質とした培養を行い、数値的にも有意に高い分解能を示す微生物をスクリーニングすることにより得ることができる。
【００１９】
女性ホルモン物質の分解能を有する微生物のスクリーニングの具体例としては下記のような手順を示すことができる。まず、図１に示すようなカラム、基質導入口および空気導入口を備える培養装置を作成する。この培養装置に、活性汚泥と、例えば、下記に示すＭＤＧ培地（Modified DOMINIC & GRAHAM's medium）をカラムに入れ、これに空気導入口から酸素と基質導入口から１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオール、エチニルエストラジオール等の女性ホルモン物質とを導入し、２５℃程度で、１０週間程度回分培養する。この培養中は、定時に生菌数やｐＨを測定する。培養終了後、ＩＳＰ培地、Ｒ２Ａ培地、ＹＭ培地等で菌株の選抜および釣菌を行い、女性ホルモン物質分解能を有する微生物を得る。
【００２０】
ＭＤＧ培地の組成：
Ｋ２ＨＰＯ４ ３.５
ＫＨ２ＰＯ４ １.５
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０.５
ＮａＣｌ ０.５
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０.１５
Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０.００５％（ｗ／ｖ）
トレースエレメント＊ １.０ （ｍＬ／Ｌ）
ｐＨ ７.０
数値の単位はｇ／Ｌ。
【００２１】
＊トレースエレメントの組成：
ＮａＨＣＯ３・１０Ｈ２Ｏ ２.０
ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ ０.３
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０.２
（ＮＨ４）Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ ０.０２
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０.１
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０.５
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０.０５
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０.５
数値の単位はｇ／Ｌ。
【００２２】
次いで、上記スクリーニングにより選抜された微生物を、例えば、女性ホルモン物質を含むＹＭ培地中で培養し、培養後の培地中の女性ホルモン物質の残存量を測定することにより、女性ホルモン物質の分解能の高い微生物のスクリーニングを行うことができる。このスクリーニングを複数回繰り返し行うことで、より女性ホルモン物質の分解能の高い微生物を得ることができる。
【００２３】
かくして得られる本発明微生物は、スクリーニングに用いた１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオールまたはエチニルエストラジオール等の女性ホルモン物質の少なくとも１種以上を生物学的に分解可能であり、具体的には女性ホルモン物質として１７β−エストラジオールを１００ｐｐｍ添加した１ＬのＭＤＧ培地において１０８〜１０９個程度の本発明微生物を８時間培養した場合に、当該培地中の１７β−エストラジオールを８０％以上分解することができる能力を有するものである。
【００２４】
上記のスクリーニングにより、伏見下水処理場（京都府京都市）の活性汚泥槽、等々力水処理センター（神奈川県川崎市）の活性汚泥槽、多摩川上流処理場（東京都昭島市）の活性汚泥槽、森ヶ崎水処理センター（東京都大田区）の活性汚泥槽より得られた微生物中から選抜された女性ホルモン物質を分解することができる微生物として、下記５株を得た。なお、これらの微生物の菌種同定は微生物の１６ＳｒＤＮＡ配列を用いて文献記載（Carl R. Woese, Bacterial Evolution., Microbiological Reviews., 51:221-271(1987)およびE. Stackebrandt and B. M. Goebel, Taxonomic Note: A Place for DNA-DNA Reassociation and 16S rRNA Sequence Analysis in the Present Species Definition in Bacteriology., International Journal of Systematic Bacteriology, 44, (4): 846-849 (1994)）の分子進化系統解析に基づき行った。分子進化系統解析により５株の微生物は次のように同定された。
【００２５】
・ロドコッカス・ゾフィイ（Rhodococcus zopfii） Ｄ−Ｉ７
・スフィンゴモナス・スピーシーズ（Sphingomonas sp.） Ｃ−Ｉ２
・ロドコッカス・イクイ（Rhodococcus equi） Ａ−Ｙ２
・ロドコッカス・イクイ（Rhodococcus equi） Ｄ−Ｙ４
・ロドコッカス・イクイ（Rhodococcus equi） Ｅ−Ｙ５
【００２６】
これら５株のうちＤ−Ｉ７株およびＣ−Ｉ２株については、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に４月２６日付でそれぞれ受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８８３９およびＦＥＲＭ Ｐ−１８８３８で寄託されている。一方、Ａ−２Ｙ株、Ｄ−Ｙ４株およびＥ−Ｙ５株については上記特許生物寄託センターにおいて、分類学上の問題から受託を拒否されたため寄託を行っていないが、本株は特許法施行規則第２７条の３の条件を満足する分譲の請求があった場合は、出願人株式会社ヤクルト本社において、同条の条件に従って分譲することを保証する。
【００２７】
本発明の微生物であるロドコッカス・イクイ（Rhodococcus equi）およびロドコッカス・ゾフィイ（Rhodococcus zopfii）を含むロドコッカス・スピーシーズ（Rhodococcus sp.）は（日本放射菌学会編、「放射菌の分類と同定」、日本学会事務センター、１８７−１８８（２００１））、Ｈｉｇｈ−ＧＣグラム陽性球菌であるコリネバクテリウム（Corynebacterium）グループに含まれる。これまでは、マイコバクテリウム・スピーシーズ（Mycobacterium sp.）とノカルディア・スピーシーズ（Nocardia sp.）の中間的な性状を示すことでまとめられたロドクロス・コンプレックス（Rhodochrous complex）のグループであったが、１８９１年にゾフ（Zopf）が提案した属名を当てて再定義された（Tsukamura, M. A Further numerical taxonomic study of the rhodochrous group, Jpn. J. Microbiol., 18, 37-44 (1974)）。本発明の微生物は、好気性であり、非運動性である。また、抗酸性は示さないか、あっても極めて弱い。更に、菌糸状の生育をするものから、擬球菌状の細胞のものまであるが、気菌糸を持つものはない。また更に、菌糸状あるいは分枝状の桿菌は一般に長時間の培養によって細胞が断裂して、短桿菌状あるいは擬球菌状となる。更にまた、生育至適温度は２０℃から３７℃と広い。また、橙色から赤色のコロニーを形成し、その表面はラフ、スムース共に存在する。更に、細胞壁ペプチドグリカンは、Ａ１γ−タイプ、グリコリル型、アラビノースとガラクトースを含む。また更に、呼吸鎖キノンの主要成分はＭＫ−８（Ｈ２）である。更にまた、菌体脂肪酸は直鎖−モノ不飽和型で１０Ｍｅ−１８：０を含む０１０メチル脂肪酸の含量は、種または株によって異なる。また、リン脂質としてはＰＥが検出されるほか、ＤＰＧ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＩＭｓと、いくらかの糖脂質がみられる。本スピーシーズの多くは土壌由来であるが、動植物にも幅広く分布している。
【００２８】
本発明のもう一方の微生物であるスフィンゴモナス・スピーシーズ（Sphingomonas sp.）はグラム陰性菌であり、α−プロテオバクテリア（Proteobacteria α-subdivision）に含まれる（坂崎利一監訳、「グラム陰性、好気性および通性嫌気性桿菌の同定」、近代出版、３０２−３０３（１９９３））。また、比較的長い桿菌のものが多くあり、運動性があるものも含まれる。更に、好気性で黄色の不溶性な色素を産生する。また更に、通常、マッコンキー（MacConkey）寒天に非発育で、グルコース、キシロース、ラクトース、シュークロース、マルトースを利用する。更にまた、マンニットは非利用で、硝酸塩に対しては非還元である。また、リシンデカルボキシラーゼに陰性、アルギニンジヒドロラーゼに陰性という特徴を持つ微生物である。
【００２９】
かくして得られた本発明微生物について、これらの大量培養に好適な条件を検討したところ、至適培養温度が３０℃、ｐＨが全般的に６.０から７.０であった。また、至適培地の検討には、ＩＳＰ培地を基本に、その成分量を増減させ、無機塩の添加等を行った下記に示す改変培地１および改変培地２を使用し、増殖に与える影響を検討した。この結果、上記５株のうち、Ｃ−Ｉ２株を除いては改変培地１においてよく増殖しており、Ｃ−Ｉ２株が最も低栄養な微生物であることが明らかになった。
【００３０】
改変培地１の組成（蒸留水１Ｌ中）：
Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ
Ｐｅｐｔｏｎｅ １０ｇ
Ｇｌｕｃｏｓｅ ５ｇ
ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４ ２ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０.５ｇ
【００３１】
改変培地２の組成（蒸留水１Ｌ中）：
Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ２ｇ
Ｍａｌｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ
Ｄｅｘｔｏｒｏｓｅ ４ｇ
【００３２】
以上説明した本発明微生物は、単独あるいはこれらを組合わせて排水中または土壌中の女性ホルモン物質を分解するのに使用することができる。また、これらの微生物は、例えば活性汚泥法などによる場合はそのまま使用しても良いが、これらの微生物を固体支持体に付着生育させて使用することが女性ホルモン物質の分解の点から好ましい。
【００３３】
固体支持体に付着生育させる場合には、微生物を固定化する方法として、共有結合、イオン結合、水素結合、物理的な吸着などにより不溶性の担体に微生物を付着させる結合固定化方法と、低分子化合物を重合または会合させるか、または高分子化合物を可溶の状態から不溶の状態に変化させることによって生じる高分子ゲルに微生物を包み込んでしまう包括固定化方法があるが、いずれを採用しても良い。しかしながら、微生物の保持能力の点で結合固定化法が好ましく、微生物を付着させる固体支持体としては多孔性セルロース、ＰＶＡ、微粉末活性炭コート顆粒ポリビニルアルコール担体（ＡＣＰ担体：三好ら、「染色排水に対する脱色細菌の適用」、下水道協会誌、３９、１２３−１３２（２００２））等が挙げられるが、特にＡＣＰ担体の使用が好ましい。
【００３４】
具体的に排水中の女性ホルモン物質を分解するにあたって、例えば活性汚泥法を採用する場合は、一般的には、被処理液１Ｌ当たり１０８から１０９個程度の本発明微生物を用い、５から１０時間程度好気的に培養処理すれば良い。また、固体支持体を用いる方法を採用する場合は、固体支持体上の本発明微生物と被処理液を５から１０時間程度好気的な培養条件下で接触させれば良い。
【００３５】
また、土壌中の女性ホルモン物質を分解するにあたっては、例えば、必要により緩衝溶液または生理食塩水に懸濁させた本発明微生物を、処理すべき土壌表面あるいは掘り起こした土壌に、１ｍ３当たり１０９から１０１０個程度散布すればよい。
【００３６】
なお、本発明微生物を用いて、効率よく女性ホルモン物質を分解するには、本発明の微生物を利用した女性ホルモン物質を分解するための、本発明微生物を担持する手段および当該微生物を排水または土壌と接触する手段を有する装置の利用が挙げられる。具体的には、完全混合タイプ、エアーリフトタイプ、カラム充填タイプ、ラグフロータイプ等のバイオリアクター装置を用いることができる。このような装置は生物酸化処理中の２次処理工程で使用することができ、その際には、微生物群を排水中に懸濁させる方式よりも固体支持体表面に付着生育させて用いる方式の方が、好適である。これは、微生物を支持体表面に付着させることにより、バイオリアクターから外部への微生物の流出を防ぐことができ、より濃厚な菌液を得られることが出来るため、排水中の女性ホルモン物質を効率よく分解することができる。
【００３７】
【実施例】
以下、実施例について本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３８】
実 施 例 １
連続集積培養による女性ホルモン物質の分解能を有する微生物のスクリーニング：
長さ５０ｃｍ×直径８ｃｍの円筒形カラムの上部に基質導入口および下部に空気導入口を設け、これらにチューブを接続した後、ゴム栓にて蓋をし、培養装置を作製した（図１）。この培養装置中に前記したＭＤＧ培地と表１に示す場所より採取した活性汚泥２０ｍＬを加えた。次いで、上部流出入口より、０.１ｍｇ／Ｌの１７β−エストラジオール水溶液を、６０〜１００ｍＬ／時間で、また下部流出入口より酸素を５０〜１００ｍＬ／分で吹き込んだ。この状態で、およそ１０週間連続的に回分培養をし、０、５、２４、７２時間、その後は１週間毎に生菌数およびｐＨを調べた。再現性の確認のため、培養は３回行った。３回とも、微生物の増殖が確認された１０週間目（等々力水処理センターのみ９週間目）の培養液より、特徴的な集落を、それぞれＩＳＰ分離培地、Ｒ２Ａ分離培地およびＹＭ培地で菌株を選択・釣菌した。表１に各培地で得られた集落の数およびそこから釣菌された菌株数を示す。
【００３９】
【表１】
この結果に示すように、連続集積培養により伏見下水処理場からは１４株、等々力水処理センターからは１０株、多摩川上流処理場からは１６株、森ヶ崎処理センターからは１６株の合計５６株の女性ホルモン物質分解微生物が得られた。
【００４１】
実 施 例 ２
女性ホルモン物質の高分解能を有する微生物のスクリーニング：
（１）一次スクリーニング
実施例１において得られた５６株の微生物を、１７β−エストラジオールを基質とする培地を用い、下記に示す方法で培養し、増殖速度が高い菌株を選抜した。まず、１７β−エストラジオールをＤＭＳＯ溶液に溶解し、０.２２μｍのメンブレンフィルターを用いてろ過滅菌した。この溶液をＭＤＧ培地中に、１７β−エストラジオール濃度が１００ｐｐｍとなるように添加した。
【００４２】
２５℃に保存している実施例１で得られた各微生物を、ＹＭ平板培地に線引き植菌した後、流動パラフィンを重層して画線培養を行った。３〜１０日後、この１白金耳をかきとり、上記で調製した培地が入った試験管に植菌した。植菌した試験管を２５℃にて激しく振とうさせ、１０日間培養した。植菌していない基質の入った試験管をコントロールとして、植菌した試験管の基質の濁度を観察した。微生物の増殖の度合いの判定は以下の基準で行った。その結果を表２および表３に示す。
【００４３】
＜判定基準＞
− ： コントロールと比較して全く同じである。
＋ ： コントロールと比較して多少の濁りが観察され、菌の増殖があると予測される。
＋＋： コントロールと比較して明らかに濁っており、活発な菌の増殖が推測される。
【００４４】
【表２】
【表３】
一次スクリーニングの結果、＋以上の判定が得られたのは、５６株中、２５株であった。
【００４７】
（２）二次スクリーニング
一次スクリーニングで選択した微生物２５株について、下記に示す方法で菌株を選定した。まず、一次スクリーニングで＋以上の増殖を示した２５株をＹＭ平板培地に画線培養し、一次スクリーニングと同様の手法で培養した。１０日後、増殖した培地の全量を、Ｃ１８固相カラム（Ｗａｔｅｒｓ社製）で固相抽出し、抽出物１０μＬを薄層クロマトグラフにスポッティングし、ベンゼン−メタノール（９：１）混液を展開溶媒として展開させて、１７β−エストラジオールの減少を確認した。この結果、有効に１７β−エストラジオールを分解する９株を選択した。
【００４８】
（３）三次スクリーニング
二次スクリーニングで選択した微生物９株について、より強く１７β−エストラジオールを分解する菌株を選定するとともに、他の女性ホルモン物質（エストロン、エストリオール、エチニルエストラジオール）についてもその分解能を検討した。材料および方法は以下の手順に従った。まず、女性ホルモン物質（１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオール、エチニルエストラジオール）をそれぞれＤＭＳＯ溶液に溶解し、０.２２μｍのメンブレンフィルターを用いてろ過滅菌したものを用意し、これをＭＤＧ培地中で濃度１００ｐｐｍとなるように調製し、培養培地とした。
【００４９】
この培養培地を試験管に取り、上記微生物を二次スクリーニングと同様植菌した後、所定時間培養した。培養開始５時間後、８時間後、２４時間後の女性ホルモン物質の濃度を測定し、減少量を確認した。女性ホルモン物質量の測定は、培養後の培地の全量を、Ｃ１８固相カラム（Ｗａｔｅｒｓ社製）に保持させ、その後、酢酸メチルで溶出させ、分析することにより行った。より具体的には、次のようにして分析した。すなわち、まず溶出液を適当量分取し、これにサロゲート物質（１７β−エストラジオール−ｄ４）を添加した。次いで、窒素気流により乾固させた後、Ｎ,Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）によりＴＭＳ化体を誘導し、再び乾固させ、ｎ−ヘキサンに溶解させ、その検液を下記条件のガスクロマトグラフィーで分析した。
【００５０】
三次スクリーニングの結果、８時間で１７β−エストラジオールを８０％以上分解する微生物として５株(Ａ−Ｙ２株、Ｅ−Ｙ５株、Ｄ−Ｙ４株、Ｄ−Ｉ７株、Ｃ−Ｉ２株)を選択した。その選択した微生物による１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオール、エチニルエストラジオールの分解による残存量の経時変化を図２〜図５に示した。
【００５２】
実 施 例 ３
女性ホルモン物質分解能を有する微生物の同定：
女性ホルモン物質分解能を有する微生物（以下、「女性ホルモン物質分解菌」という）の５菌株(Ａ−Ｙ２株、Ｅ−Ｙ５株、Ｄ−Ｙ４株、Ｄ−Ｉ７株、Ｃ−Ｉ２株）について、１６ＳｒＤＮＡ配列を用いた菌種同定を、以下の手順に従って行い、１６ＳｒＤＮＡ配列を用いた系統樹図を作製した（図６および図７）。
【００５３】
（１）菌体からのＤＮＡ抽出
上記の５菌株の各純培養菌体から、以下に示す塩化ベンジル法を用いてＤＮＡを抽出した。すなわち、ＹＭ斜面寒天培地を用いて３日間、３０℃で培養した。培養後、集菌した菌体に２５０μＬのＤＮＡ抽出バッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、４０ｍＭのＥＤＴＡの混合液：ｐＨ９．０）、２００μＬのベンジルクロライドおよび５０μＬの１０％ＳＤＳを加え、５０℃で、激しく３０分間振とうした。３Ｍの酢酸ナトリウムを１５０ｍＬ加えた後、遠心し、上清を別のチューブに移し、イソプロパノール沈殿、７０％エタノール洗浄を順に行い、風乾した後、これを１００μＬのＴＥバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１ｍＭのＥＤＴＡ）に溶解して各菌体のＤＮＡとした。
【００５４】
（２）１６ＳrＤＮＡ増幅ＰＣＲ反応
増幅プライマーには下記の二つのプライマーを使用した。
【００５５】
（３）１６ＳrＤＮＡ配列の決定
１６ＳrＤＮＡ塩基配列の解読は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）により、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７３Ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ社製）を使用して行った。使用したｐｒｉｍｅｒは下記に示した。配列のアライメントには、ＡｕｔｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いた。
（４）１６ＳｒＤＮＡ配列の系統解析
得られた１６ＳrＤＮＡ配列とＤＤＢＪ等の遺伝子データベースより得られた近縁な細菌の１６ＳrＤＮＡ塩基配列をもちいて、系統解析ソフト（Ｃｌｕｓｔｕｌ Ｘ）を使用して分子進化系統解析を行った（図６）。その結果、Ａ−Ｙ２株、Ｅ−Ｙ５ 株、Ｄ−Ｙ４株はロドコッカス・イクイ（Rhodococcus equi）に属する菌株と、 Ｄ−Ｉ７株はロドコッカス・ゾフィイ（Rhodococcus zopfii）に即する菌株と 、Ｃ−Ｉ２株スフィンゴモナス・スピーシーズ（Sphingomonas sp.）であると同定された。
【００５７】
実 施 例 ４
女性ホルモン物質分解能を有する微生物を用いた排水処理：
女性ホルモン物質分解菌５菌株（Ａ−Ｙ２株、Ｅ−Ｙ５株、Ｄ−Ｙ４株、Ｄ−Ｉ７株、Ｃ−Ｉ２株）を担体に固定し、排水の処理を行った。
【００５８】
（１）固定化担体の作製
多孔性セルロース、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、微粉末活性炭コート顆粒ポリビニルアルコール（ＡＣＰ）の３種類の担体を用い、結合固定化法により女性ホルモン物質分解菌を次の手順で固定した。まず、固定化する女性ホルモン物質分解菌の各菌体をジャーファーメンターを用いて大量に培養した。この培養において対数増殖期の培養液５００ｍＬを滅菌したフラスコに入れ、次いで、このフラスコに表４に示す３種類の担体を１００ｇずつ入れて良く混合し、固定化担体を作製した。
【００５９】
（２）固定化担体の微生物保持能力の評価
上記（１）で作製した固定化担体から次の手順で菌体を溶出させ、生菌数を測定することで微生物保持能力を評価した。まず、固定化担体を数粒すりつぶし、１０ｇ量り取った。この固定化担体をガラス製試験管の生理食塩水１０ｍＬ（０.１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００含有）中に入れ、これを１０分間超音波処理して十分にミキシングした後、再度１０分間超音波処理をした。このようにして得られた溶液を生菌数測定用の溶出液とした。溶出液の生菌数はＣＧＹ培地を用いた希釈平板法により計数した。なお、担体中の生菌数の測定は、担体作成後２４時間および７２時間に、フラスコ中に浸漬した固定化担体の一部を採取することで行った。その結果を表４に示す。この結果、ＡＣＰ担体の微生物保持能力が高いことが示された。
【００６０】
【表４】
（３）回分式曝気法による有効性試験
５株の女性ホルモン物質分解菌の各々を（１）と同様の手順でＡＣＰ担体に固定化し、女性ホルモン物質を添加した合成下水に対する有効性試験を行った。具体的には、５株の女性ホルモン物質分解菌をジャーファーメンターにて大量培養し、得られた培養液を１０５℃で１０分間高圧滅菌した後、滅菌水で洗浄したＡＣＰ担体（培養液５００ｍＬに対して乾燥重量５０ｇのＡＣＰ担体）を２４時間浸漬して固定化した。合成下水は、文献記載（橋本奨著、「バイオテクノロジー活用の高機能型活性汚泥法」、技報堂出版、２６７−２６８（１９８９））の方法により作成した。下水中の女性ホルモン物質の濃度については、平成１２年度都内処理場での実態調査で、流入下水および処理中の１７β−エストラジオール濃度は０.０１７〜０.０６８μｇ／Ｌであり、エストロンの濃度は０.０１４〜０.１４μｇ／Ｌであることが報告されている（東京都下水道局報告書、「平成１２年度下水道における内分泌攪乱化学物質の実態調査結果」）。本有効試験は、作成した合成下水に、１７β−エストラジオールが０.１μｇ／Ｌ、エストロンが０.２μｇ／Ｌとなるように添加して実施した。
【００６２】
合成下水の組成（蒸留水１Ｌ中）：
Ｐｅｐｔｏｎｅ １５０ｍｇ
Ｍｅａｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １００ｍｇ
Ｕｒｅａ ２５ｍｇ
ＮａＣｌ ７.５ｍｇ
ＫＣｌ ３.５ｍｇ
ＣａＣｌ２ ３.５ｍｇ
ＭｇＳＯ４ ２.５ｍｇ
Ｋ２ＨＰＯ４ ２６７ｍｇ
ＫＨ２ＰＯ４ ３３ｍｇ
【００６３】
有効性試験は、図８に示す回分式曝気装置を用いた回分式曝気法により行った。すなわち、回分式曝気装置中におよそ２Ｌの合成下水を入れ、各女性ホルモン物質分解菌を固定化したＡＣＰ担体をおよそ１００ｇ投入し、空気導入口から０.１〜２ＶＶＭの空気を送り、攪拌翼で担体が沈殿しない程度に低速で攪拌した。曝気開始８時間後の１７β−エストラジオールとエストロンの濃度と分解率を表５に示した。ＡＣＰ担体に固定化したそれぞれの微生物は、８時間で１７β−エストラジオールを８０％以上分解する能力を示した。
【００６４】
【表５】
【発明の効果】
本発明の微生物は、１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオールまたはエチニルエストラジオール等の女性ホルモン物質を分解することが可能な微生物である。
【００６６】
従って、本発明の微生物を利用した女性ホルモン物質を分解する方法および装置により、女性ホルモン物質に汚染された排水や土壌中の女性ホルモン物質を分解し、環境を改善することができる。
【００６７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 連続集積培養に使用した装置を示す図面である。
【図２】 １７β−エストラジオールの経時変化を示す図面である。
【図３】 エストロンの経時変化を示す図面である。
【図４】 エストリオールの経時変化を示す図面である。
【図５】 エチニルエストラジオールの経時変化を示す図面である。
【図６】 本発明の（Rhodococcus属）微生物の分子進化系統解析を示す図面である。
【図７】 本発明の（Sphingomonas属）微生物の分子進化系統解析を示す図面である。
【図８】 回分式曝気培養に使用した装置を示す図面である。
【符号の説明】
１ … … 培養装置
２ … … カラム
３ … … 基質導入口
４ … … 空気導入口
５ … … 回分式曝気装置
６ … … ＡＣＰ担体
７ … … 合成下水
８ … … 攪拌翼
９ … … 空気導入口
以 上
Claims (7)
- ロドコッカス・イクイ（ Rhodococcus equi ）またはロドコッカス・ゾフィイ（ Rhodococcus zopfii ）であって、１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオールまたはエチニルエストラジオールの分解能を有することを特徴とする微生物。
- ロドコッカス・イクイ Ａ−Ｙ２、ロドコッカス・イクイ Ｄ−Ｙ４、ロドコッカス・イクイＥ−Ｙ５またはロドコッカス・ゾフィイ Ｄ−Ｉ７（ＦＥＲＭ Ｐ−１８８３９）から選ばれるものである請求項第１項記載の微生物。
- １０８〜１０９個程度を、１７β−エストラジオールを１００ｐｐｍ添加した１ＬのＭＤＧ培地（Modified DOMINIC & GRAHAM's medium）で８時間培養した場合に、当該培地中の１７β−エストラジオールを８０％以上分解する能力を有するものである請求項第１項または第２項記載の微生物。
- 請求項第１項ないし第３項の何れかの項記載の微生物を使用し、１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオールまたはエチニルエストラジオールを分解することを特徴とする１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオールまたはエチニルエストラジオールの分解方法。
- 排水中または土壌中の１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオールまたはエチニルエストラジオールを分解するものである請求項第４項記載の１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオールまたはエチニルエストラジオールの分解方法。
- 微生物を固体支持体表面に付着生育させたものである請求項第４項または第５項記載の１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオールまたはエチニルエストラジオールの分解方法。
- 請求項第１項ないし第３項の何れかの項記載の微生物を担持する手段および当該微生物を排水または土壌と接触させる手段を有する１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオールまたはエチニルエストラジオール分解用装置。
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