PT1543106E - Métodos e meios para controlar a sialilação de proteínas produzidas por células de mamíferos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODOS E MEIOS PARA CONTROLAR A SIALILAÇÃO DE PROTEÍNAS PRODUZIDAS POR CÉLULAS DE MAMÍFEROS"

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se a métodos e meios para controlar a sialilação de uma proteína produzida por células em cultura.

ANTECEDENTES

As proteínas são úteis numa variedade de aplicações em diagnóstico, farmacológicas, em agricultura, nutricionais e investigação. Dado o custo elevado da produção de proteínas, especialmente proteínas terapêuticas, mesmo aumentos pequenos na eficiência da produção ou na função e estabilidade de uma proteína podem ser valiosos. A função e estabilidade, e por isso a utilidade, de uma proteína pode ser afectada pela adição pós-tradução de resíduos de açúcar à proteína, para formar uma glicoproteína. Por exemplo, a adição de resíduos de ácido siálico terminais a polissacáridos ligados a uma glicoproteína geralmente aumenta o tempo de vida da proteína na corrente sanguínea e pode, em casos particulares, também afectar a solubilidade, estabilidade térmica, resistência ao ataque de proteases, antigenicidade e actividade específica de algumas glicoproteínas. Ver, e. g., Gu e Wang (1998), Biotechnol. e Bioeng. 58 (6) :642-48; Morell et al. (1968), J. Biol. Chem. 243(1):155-59. É por isso desejável aumentar o conteúdo em ácido siálico de uma glicoproteína, especialmente uma glicoproteína para ser utilizada para aplicações farmacológicas.

SUMÁRIO A invenção proporciona meios e métodos para cultivar células de mamífero de modo a produzir uma proteína, opcionalmente uma proteína recombinante segregada, e para controlar ou, opcionalmente, para aumentar, o conteúdo em ácido siálico da proteína. A invenção proporciona um método para controlar o conteúdo em ácido siálico de uma proteína produzida por células de mamífero compreendendo cultivar as células em suspensão num meio compreendendo galactose e frutose. 0 meio pode ser isento de soro e pode também compreender N-acetilmanosamina e/ou manose. As concentrações de galactose, manose e frutose podem ser, cada uma, desde cerca de 0,1 mM até cerca de 40 mM, desde cerca de 0,5 mM até cerca de 20 mM, desde cerca de 1 mM até cerca de 10 mM, ou desde cerca de 1 mM até cerca de 5 mM. A concentração de N-acetilmanosamina pode ser de pelo menos cerca de 0,8 mM, opcionalmente pelo menos cerca de 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM, ou 20 mM. A proteína pode ser uma proteína recombinante segregada, e as células de mamífero podem ser células CHO (Ovário de Hamster Chinês) . As células podem ser cultivadas a uma temperatura desde cerca de 29 °C até cerca de 35 °C.

Noutra forma de realização, a invenção proporciona um meio, opcionalmente um meio sem soro, para cultivar células de mamífero compreendendo galactose frutose e manose e, opcionalmente, N-acetilmanosamina. A galactose, manose e frutose podem estar a concentrações desde cerca de 0,1 mM até cerca de 2 40 mM cada, desde cerca de 0,5 mM até cerca de 20 mM cada, desde cerca de 1 mM até cerca de 10 mM cada, ou desde cerca de 1 mM até cerca de 5 mM cada. A N-acetilmanosamina pode estar a uma concentração de pelo menos cerca de 0,8 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, ou 20 mM.

Numa forma de realização, a invenção compreende um método para controlar o conteúdo em ácido siálico de uma proteína, compreendendo cultivar uma célula de mamífero que produz a proteína em meio compreendendo N-acetilmanosamina e galactose. O meio pode compreender ainda frutose e manose. Opcionalmente, a frutose e a manose podem, cada uma, estar presente a uma concentração desde cerca de 1,5 mM até cerca de 4,5 mM. A frutose e a manose podem estar à mesma ou a diferentes concentrações. A célula pode ser cultivada a uma temperatura desde cerca de 29 °C até cerca de 37 °C, opcionalmente, a uma temperatura desde cerca de 29 °C até cerca de 36 °C, ou desde cerca de 30 °C até cerca de 35 °C. A concentração de N-acetilmanosamina no meio pode ser pelo menos cerca de 0,8 mM, e a concentração de galactose no meio pode ser desde cerca de 1,5 mM até cerca de 4,5 mM. A proteína pode ser uma proteína segregada e/ou uma proteína recombinante e pode ser produzida numa célula CHO.

Ainda noutra forma de realização, a invenção compreende um meio para cultivar células de mamífero no qual a galactose, frutose e N-acetilmanosamina e, opcionalmente, também a manose estão combinadas. A frutose pode estar a uma concentração desde cerca de 1,5 mM até cerca de 4,5 mM, e a manose pode estar a uma concentração desde cerca de 1,5 mM até cerca de 4,5 mM. A N- acetilmanosamina pode estar a uma concentração de pelo menos cerca de 0,8 mM, e a galactose pode estar a uma concentração 3 desde cerca de 1,5 mM até cerca de 4,5 mM. As células de mamífero podem ser células CHO, e o meio pode estar isento de soro.

Além disso, a invenção proporciona um método melhorado para aumentar a produção de uma proteína cultivando células de mamífero que expressam a proteína, compreendendo cultivar as células de mamífero a uma temperatura desde cerca de 29 °C até cerca de 35 °C num meio compreendendo frutose, manose e galactose. 0 meio pode também compreender N-acetilmanosamina. A concentração de galactose, manose e frutose pode ser desde cerca de 1,5 mM até cerca de 4,5 mM cada. As concentrações de galactose, manose e frutose podem ser as mesmas ou diferentes umas das outras. A concentração de N-acetilmanosamina pode ser de pelo menos cerca de 0,8 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM ou 20 mM e o meio pode estar isento de soro. As células de mamífero podem ser células CHO e a proteína pode ser uma proteína segregada, recombinante.

Finalmente, a invenção proporciona um método para controlar o conteúdo em ácido siálico de uma proteína recombinante compreendendo cultivar células de mamífero que expressam a proteína recombinante a uma temperatura desde cerca de 29 °C até cerca de 36 °C ou desde cerca de 29 °C até cerca d 35 °C num meio compreendendo frutose, galactose, manose, e N-acetilmanosamina, em que as concentrações de frutose, galactose e manose no meio são desde cerca de 1,0 mM até cerca de 5,0 mM, cada, ou desde cerca de 1,5 mM até cerca de 4,5 mM, cada, e em que a concentração de N-acetilmanosamina no meio é de pelo menos 0,8 mM. As concentrações de frutose, manose e galactose podem ser as mesmas ou diferentes umas das outras. 4 A invenção também proporciona uma utilização de um meio compreendendo N-actilmanosamina e galactose para controlar o conteúdo em ácido siálico de uma proteína produzida por uma célula de mamífero.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 apresenta uma rede de vias metabólicas conduzindo à sialilação de glicoproteínas. Corfield e Schauer (1979), Biol. Cellulaire 35: 213-26; Gu e Wang (1998), Biotechnol. and Bioeng. 58(6):642-48. As moléculas utilizadas na invenção estão em caixas. A regulação negativa é apresentada por um sinal de menos adjacente a uma seta compreendendo uma linha ponteada. A Figura 2 compara a fracção de eluição com sal elevado da região extracelular do receptor do factor de necrose tumoral fundida com a região Fc de um anticorpo (TNFR:Fc, que é descrita na Patente US N° 5 395 760) numa coluna de permuta aniónica quando é produzido TNFR:Fc por culturas cultivadas em meios com os aditivos indicados. Todas as amostras, incluindo a produzida por uma cultura sem aditivos (marcada como "Controlo") , são comparadas com um único lote de TNFR:Fc produzido, numa experiência separada, por culturas cultivadas sem aditivos no meio. A Figura 3 é uma representação de contorno, produzida utilizando o programa de computador JMP (descrito abaixo), apresentando as moles de ácido N-acetilneuramínico (NANA) por mole de TNFR:Fc (impressas a negrito e em caixas ao lado de cada ponto de dados amostrado nesta experiência e 5 marcado como parte de cada linha de contorno) produzida por células cultivadas crescidas em meios com as concentrações indicadas de N-acetilmanosamina e açúcares (frutose, galactose e manose).

DESCRIÇÃO DETALHADA

DEFINIÇÕES

Um anticorpo, como aqui utilizado, é uma proteína ou complexo de proteínas, cada uma das quais compreende pelo menos um, ou opcionalmente pelo menos dois domínios de imunoglobulina de anticorpo variável. Os anticorpos podem ser anticorpos de cadeia simples, anticorpos diméricos ou alguns complexos de proteínas de ordem superior incluindo, mas não limitados, anticorpos heterodiméricos e anticorpos tetraméricos.

Um domínio de imunoglobulina de anticorpo constante é um domínio de imunoglobulina que é idêntico ou substancialmente semelhante a um domínio CL, CH1, CH2, CH3 ou CH4, de origem humana ou animal. Ver, e. g. Hasemann e Capra, Immunoglobulins: Structure and Function, em William E. Paul, ed., Fundamental Immunology, Segunda Edição, 209, 210-218 (1989). Um domínio de imunoglobulina de anticorpo tem pelo menos 10 aminoácidos de comprimento, opcionalmente, pelo menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90 aminoácidos de comprimento.

Uma porção Fc de um anticorpo inclui domínios de imunoglobulina humanos ou animais CH2 e CH3 ou domínios de imunoglobulina substancialmente semelhantes a estes. Para discussão, ver Hasemann e Capra, supra, em 212-213. 6

Uma glicoproteína, como aqui utilizado, é uma proteína que foi modificada pela adição de um ou mais hidratos de carbono, incluindo, especialmente, a adição de um ou mais resíduos de açúcar.

Um oligossacárido ou polissacárido é uma cadeia de dois ou mais resíduos de açúcar ligados por ligações químicas covalentes.

Sialilação, como aqui utilizado, é a adição de um resíduo de ácido siálico a uma proteína, que pode ser uma glicoproteína. 0 termo ácido siálico, como aqui utilizado, compreende uma família de açúcares contendo 9 ou mais átomos de carbono, incluindo um grupo carboxilo. Uma estrutura genérica compreendendo todas as formas naturais conhecidas de ácido siálico é apresentada abaixo.

H“Çs OR1 H—Ci—OR1

H

Os grupos Rl, em várias posições numa única molécula, podem ser os mesmos ou diferentes uns dos outros. Rl pode ser um o 7 hidrogénio ou um grupo acetilo, lactilo, metilo, sulfato, fosfato, anidro, ácido siálico, fucose, glucose ou galactose. R2 pode ser um grupo N-acetilo, N-glicolilo, amino, hidroxilo, N-glicolil-O-acetilo, ou N-glicolil-O-metilo. R3 representa o resíduo de açúcar antecedente num oligossacárido ao qual o ácido siálico está ligado no contexto de uma glicoproteína. R3 pode ser galactose (ligada na sua posição 3, 4, ou 5), N-acetil- galactose (ligada na sua posição 6), N-acetil-glucose (ligada na sua posição 4 ou 6), ácido siálico (ligado na sua posição 8 ou 9), ou ácido 5-N-glicolil-neuramínico. Essentials of Glycobiology, Ch. 15, Varki et al. , eds., Cold Spring Harbor

Laboratory Press, Nova Iorque (1999) . Foram encontradas na natureza mais de 40 formas de ácido siálico. Essentials of

Glycobiology, Ch. 15, Varki et al., eds., Cold Spring Harbor

Laboratory Press, Nova Iorque (1999) . Uma forma comum de ácido siálico é ácido N-acetilneuramínico (NANA) , no qual RI é um hidrogénio em todas as posições e R2 é um grupo N-acetilo.

Proteínas substancialmente semelhantes são pelo menos 80%, opcionalmente, pelo menos, 90% idênticas uma à outra na sequência de aminoácidos e mantêm ou alteram, de um modo desejável, a actividade biológica da proteína inalterada. A percentagem de identidade de duas sequências de aminoácidos ou duas sequências de ácidos nucleicos pode ser determinada por inspecção visual e cálculo matemático, ou de um modo mais preferido, a comparação é realizada comparando a informação da sequência utilizando um programa de computador. Um exemplo de programa de computador é o programa do Genetics Computer Group (GCG; Madison, Wl) Wisconsin package versão 10.0, 'GAP' (Devereux et al. (1984), Nucl. Acids Res. 12:387). Os parâmetros por defeito preferidos para o programa 'GAP' incluem: (1) A implementação do GCG de uma matriz de comparação unitária 8 (contendo um valor de 1 para identidades e 0 para não-identidades) para nucleótidos, e uma matriz de comparação de aminoácidos ponderada de Gribskov e Burgess (1986), Nucl. Acids Res. 14:6745, como descrito por Schwartz e Dayhoff, eds., Atlas of Polypeptide Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979); ou outras matrizes de comparação comparáveis; (2) uma penalização de 30 para cada intervalo e uma penalização adicional de 1 para cada símbolo em cada intervalo para sequências de aminoácidos, ou penalização de 50 para cada intervalo e uma penalização adicional de 3 para cada símbolo em cada intervalo para sequências de nucleótidos; (3) não há penalização para intervalos nas extremidades; e (4) não há penalização máxima para intervalos longos. As regiões das duas proteínas que são alinhadas através de GAP para comparação têm, pelo menos, 10 aminoácidos de comprimento, opcionalmente, pelo menos, 20, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 250, ou 300 aminoácidos de comprimento. Outros programas utilizados pelos especialistas na técnica da comparação de sequências também podem ser utilizados. Um especialista na técnica reconhecerá que os parâmetros escolhidos afectam a percentagem de identidade e ainda o farão mais se as sequências forem diferentes.

Um domínio de imunoglobulina de anticorpo variável é um domínio de imunoglobulina que é idêntico ou substancialmente semelhante a um domínio de VL ou de VH de origem humana ou animal. Um domínio de imunoglobulina de anticorpo variável tem, pelo menos, 10 aminoácidos de comprimento, opcionalmente, pelo menos, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90 aminoácidos de comprimento. 9

DESCRIÇÃO A adição de hidratos de carbono a proteínas (aqui denominada a glicosilação de proteínas) e o subsequente processamento destes hidratos de carbono podem afectar a dobragem, estabilidade e propriedades funcionais de uma proteína. Lodish et ai., Molecular Cell Biology, Capítulo 17, W.H. Freeman, Nova Iorque (2000). Por exemplo, a proteína precursora da hemaglutinina não consegue dobrar apropriadamente na presença de tunicamicina, um antibiótico que interfere com a produção de um precursor de oligossacárido necessário para a glicosilação ligada a N (descrito abaixo). Id. Em adição, uma forma não glicosilada de fibronectina é segregada normalmente por fibroblastos, mas é degradada mais rapidamente do que a fibronectina glicosilada. Lodish et ai., supra. A maior parte das proteínas segregadas e proteínas de superfície celular contém, pelo menos, uma cadeia de hidrato de carbono; em adição, numerosas proteínas citoplásmicas e nucleares também são glicosiladas. Lodish et ai., supra;

Essentials of Glycobiology, Ch. 13, Varki et al.r eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque (1999) . Um conjunto de enzimas capazes de glicosilar proteínas está localizado no retículo endoplasmático e no aparelho de Golgi, organelos que segregaram e proteínas de superfície celular passam através da sua via para a membrana celular e mais além. A identificação de enzimas nucleares e/ou citoplasmáticas capazes de executar funções semelhantes permanece incerta. Essentials of

Glycobiology, Ch. 13, Varki et ai. , eds., Cold Spring Harbor

Laboratory Press, Nova Iorque (1999). 10

Embora a glicosilação de proteínas seja um processo complexo e variável, as modificações de hidrato de carbono de proteínas podem ser divididas, de forma grosseira, em duas classes, glicosilação ligada a 0 e glicosilação ligada a N. Ambas envolvem a adição de oligossacáridos a aminoácidos específicos numa proteína. Os polissacáridos ligados a 0 estão ligados a um grupo hidroxilo, normalmente ao grupo hidroxilo que de um resíduo de serina ou de treonina. Não são adicionados O-glicanos a cada resíduo de serina e treonina, e os critérios para determinar que serinas e treoninas serão glicosiladas não foram totalmente elucidados. Os O-glicanos compreendem normalmente um ou dois ramos e compreendem desde um a quatro tipos de resíduos de açúcar diferentes que foram adicionados um a um. Frequentemente, o resíduo terminal é um ácido siálico. Em contraste, os polissacáridos ligados em N estão ligados ao azoto da amida de uma asparagina. Apenas as asparaginas que fazem parte de uma de duas sequências de tripéptidos, quer sejam asparagina-X-serina ou asparagina-X-treonina (em que X é qualquer aminoácido excepto prolina), são alvos para glicosilação. 0 primeiro passo na glicosilação ligada a N envolve a adição de um oligossacárido complexo, pré-formado, ramificado consistindo em três glicoses, nove manoses e dois resíduos de N-acetilglucosamina. Este oligossacárido é, ainda, processado por uma série complexa e variável de passos, resultando na remoção e adição de vários resíduos de açúcar. No produto final, o resíduo terminal em cada ramo do polissacárido pode ser, mas não é sempre, um ácido siálico. Lodish et ai., supra. Os N-glicanos podem possuir de um a cinco ramos. Varki et al. supra.

Trabalho anterior elucidou um conjunto de vias biossintéticas conduzindo à adição de ácido siálico a proteínas, 11 como ilustrado na Figura 1. Gu e Wang, supra; Corfield e Schauer, supra. Uma grande variedade de moléculas estão envolvidas em vários estádios na sintese de ácido siálico e na sua ligação a glicoproteínas, incluindo açúcares tais como glucose, manose, frutose, e galactose, nucleótidos tais como ATP e CTP, e um hospedeiro de enzimas necessárias para catalisar os numerosos passos biossintéticos envolvidos, para nomear apenas algumas das moléculas envolvidas. A Figura 1 também ilustra dois pontos nesta rede de vias em que se sabe ocorrer a inibição de retroalimentação negativa (linhas ponteadas com pontas de setas) . Além disso, Gu e Wang {supra) relataram que a adição de N-acetilmanosamina ao meio de cultura resulta num aumento da sialilação de uma proteina produzida pelas células cultivadas. Todavia, a utilidade comercial da N-acetilmanosamina está presentemente limitada pelo seu custo e, por isso, são necessárias condições de cultura ou outros aditivos ao meio com efeitos semelhantes ou melhores.

Consequentemente, a invenção proporciona um método para aumentar a sialilação de uma glicoproteina produzida por uma cultura de células que compreende adicionar à cultura de células N-acetilmanosamina e galactose. Noutra forma de realização, a invenção proporciona um método para aumentar a sialilação de uma glicoproteina produzida por uma cultura de células compreendendo cultivar as células em meio compreendendo N-acetilmanosamina, galactose, frutose e manose. Alternativamente, a sialilação pode ser aumentada cultivando as células num meio compreendendo galactose e frutose e, opcionalmente, também N-acetilmanosamina e/ou manose. Ainda noutra forma de realização, a invenção compreende um melhoramento de um método para produzir uma proteina compreendendo cultivar as células de mamífero que expressam a proteína a uma temperatura inferior a 37 °C, 12 opcionalmente desde cerca de 29 °C até cerca de 36 °C ou desde cerca de 29 °C até cerca de 35 °C, ou desde cerca de 30 °C até cerca de 33 °C, num meio compreendendo N-acetilmanosamina. Noutro aspecto, a invenção proporciona um meio de cultura para células de mamífero compreendendo N-acetilmanosamina, galactose e, opcionalmente, também frutose e/ou manose. A concentração de N-acetilmanosamina pode ser pelo menos cerca de 0,8 milimolar (mM) , opcionalmente pelo menos cerca de 2 mM, pelo menos cerca de 3 mM, pelo menos cerca de 4 mM, pelo menos cerca de 5 mM, pelo menos cerca de 10 mM, ou pelo menos cerca de 20 mM, e a concentração de galactose pode ser desde cerca de 1 mM até cerca de 5 mM, opcionalmente desde cerca de 2 mM até cerca de 4 mM, ou desde cerca de 2,5 mM até cerca de 3,5 mM. As concentrações de frutose e manose, quando presentes, podem ser as mesmas ou diferentes umas das outras e de galactose e N-acetilmanosamina. As concentrações de frutose e manose podem ser desde cerca de 1 mM até cerca de 5 mM cada, opcionalmente desde cerca de 2 mM até cerca de 4 mM cada, ou desde cerca de 2,5 mM até cerca de 3,5 mM cada.

Alternativamente, a invenção proporciona um meio de cultura para células de mamífero compreendendo frutose e galactose e, opcionalmente também manose e/ou N-acetilmanosamina. Frutose, galactose, e manose podem, cada uma, estar presentes a concentrações desde cerca de 0,1 mM cada até cerca de 4 0 mM cada, opcionalmente desde cerca de 0,5 mM cada até cerca de 20 mM cada, desde cerca de 1,0 mM cada até cerca de 10 mM cada, ou desde cerca de 1 mM cada até cerca de 5 mM cada. Frutose, galactose e manose podem estar presentes na mesma ou em concentrações diferentes. A N-acetilmanosamina pode estar presente a uma concentração de pelo menos cerca de 0,8 milimolar (mM), opcionalmente pelo menos cerca de 2 mM, pelo 13 menos cerca de 3 mM, pelo menos cerca de 4 mM, pelo menos cerca de 5 mM, pelo menos cerca de 10 mM, ou pelo menos cerca de 20 mM.

Além disso, a invenção compreende um meio de cultura para células de mamífero compreendendo frutose, galactose e manose, que podem estar presentes a concentrações desde cerca de 0,1 mM cada até cerca de 40 mM cada, opcionalmente desde cerca de 0,5 mM cada até cerca de 20 mM cada, desde cerca de 1,0 mM cada até cerca de 10 mM cada, ou desde cerca de 1 mM cada até cerca de 5 mM cada. A frutose, galactose, e manose podem estar presentes na mesma ou em concentrações diferentes.

Num aspecto, a invenção proporciona um método para cultivar células de mamífero compreendendo crescimento na cultura de uma célula de mamífero que tenha sido geneticamente modificada para produzir uma proteína e adicionado à cultura N-acetilmanosamina, galactose e, opcionalmente, também frutose e/ou manose. Noutro aspecto, a invenção proporciona um método para cultivar uma célula de mamífero que foi geneticamente modificada para produzir a proteína num meio compreendendo N-acetilmanosamina a uma temperatura inferior a 37 °C. Um tipo de célula geneticamente modificada é uma célula que tinha sido transformada com um vector recombinante codificando a proteína. A proteína pode ser expressa sob o controlo de um promotor virai forte (e. g., quer um promotor de citomegalovírus (CMV) ou um promotor de vírus de símio 40 (SV40)) ou um promotor indutível (e. g., um promotor de metalotionina ou um promotor de resposta a tetraciclina, como descrito em, por exemplo, Gossen e Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. 89:5547-51). Tipicamente, a célula não expressa naturalmente a proteína ou expressa a proteína 14 apenas a níveis muito baixos (na ausência de engenharia genética).

Uma proteína é geralmente compreendida como sendo um polipéptido de, pelo menos, 10 aminoácidos de comprimento, opcionalmente, pelo menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, ou 200 aminoácidos de comprimento. As proteínas produzidas utilizando os métodos e meios da invenção podem ser proteínas segregadas.

Os métodos e meios da invenção podem ser utilizados para aumentar a sialilação de praticamente qualquer proteína, e é particularmente vantajoso para polipéptidos cuja expressão está sob o controlo de um promotor forte, tal como, por exemplo, um promotor virai, e/ou polipéptidos que estão codificados numa mensagem que possui um elemento líder de tripartido adenoviral. Exemplos de vectores de expressão úteis que podem ser utilizados para produzir proteínas são revelados no Pedido Internacional WO 01/27299 e em McMahan et al., (1991), EMBO J. 10:2821, que descrevem o vector pDC409.

Geralmente, os métodos da invenção são úteis para induzir a produção de polipéptidos recombinantes. Proteínas que podem ser produzidas com os métodos e meios da invenção incluem aquelas que compreendem sequências de aminoácidos idênticas a, ou substancialmente semelhantes ao todo ou a parte de uma das seguintes proteínas: um ligando Flt3 (como descrito no documento WO 94/28391), um ligando CD40 (como descrito na Patente US N° 6087329), eritropoietina, trombopoietina, calcitonina, leptina, IL-2, angiopoietina-2 (como descrito por Maisonpierre et al. (1997), Science 277 (5322):55-60, ligando Fas, ligando para activador de receptor de NF-kappa B (RANKL, como descrito 15 no documento WO 01/36637), factor da necrose tumoral (TNF)- ligando relacionado com a indução de apoptose (TRAIL, como descrito no documento WO 97/01633), linfopoietina derivada do estroma tímico, factor de estimulação de colónias de granulócitos, factor de estimulação de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF, como descrito na Patente Australiana N° 588819), factor de crescimento de mastócitos, factor de crescimento de células estaminais (descrito e. g., na Patente US N° 6204363, factor de crescimento da epiderme, factor de crescimento de queratinócitos, factor de crescimento de desenvolvimento de megacariotas, RANTES, hormona do crescimento, insulina, insulinotropina, factores de crescimento tipo insulina, hormona paratiróide, interferões incluindo interferões a, interferão γ, e interferões de consenso (tais como os descritos nas Patentes US N° 4695623 e 4897471, factor do crescimento nervoso, factor neurotrófico derivado do cérebro, proteínas do tipo sinaptotagmina (SLP 1-5), neurotrofina-3, glucagon, interleucinas 1 a 18, factores de estimulação de colónias, linfotoxina-β, factor da necrose tumoral (TNF), factor de inibição da leucemia, oncostatina-M, e vários ligandos para moléculas de superfície celular ELK e Hek (tais como os ligandos para cinases relacionadas com eph ou LERKS). As descrições de proteínas que podem ser produzidas de acordo com os métodos inventivos podem ser encontradas em, por exemplo, Human Cytokines: Handbook for Basic and Clinicai Research. Vol. II (Aggarwal e Gutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998); Growth Factors: A Practical Approach (McKay e Leigh, eds., Oxford University Press Inc., Nova Iorque, 1993); e The Cytokine Handbook (A.W. Thompson, ed., Academic Press, San Diego, CA, 1991) . 16

Outras proteínas que podem ser produzidas utilizando os métodos e meios da invenção incluem proteínas compreendendo toda ou parte da sequência de aminoácidos de um receptor para qualquer uma das proteínas acima mencionadas, um antagonista contra um receptor de qualquer uma das proteínas acima-mencionadas, e/ou ou proteínas substancialmente semelhantes a esses receptores ou antagonistas. Estes receptores e antagonistas incluem: ambas as formas de receptor de factor da necrose tumoral (TNFR, referido como p55 e p75, como descrito na Patente US N° 5395760 e Patente US N° 5610279), receptores de Interleucina-1 (IL-1) (tipos I e II; descritos na Patente EP N° 0460846, Patente US N° 4968607, e Patente US N° 5767064, antagonistas do receptor de IL-1 (tais como aqueles descritos na Patente US N° 6337072, antagonistas ou inibidores de IL-1 (tais como aqueles descritos nas Patentes US N° 5981713, 6096728, e 5075222, 5767064, receptores de IL-2, receptores de IL-4 (como descrito na Patente EP N° 0367566 e Patente US N° 5856296), receptores de IL-15, receptores de IL-17, receptores de IL-18, receptor do factor de estimulação de colónias de granulócitos-macrófagos, receptor do factor de estimulação de colónia de granulócitos, receptores para oncostatina-M e factor inibidor de leucemia, activador de receptor de NF-kappa B (RANK, descrito no documento WO 01/36637 e Patente US N° 6271349), osteoprotegerina (descrita em e. g., Patente US. N° 6015938, receptores para TRAIL (incluindo receptores TRAIL 1, 2, 3, e 4), e receptores que compreendem domínios de morte, tais como Fas ou Receptor de Indução de Apoptose (AIR).

Mais proteínas do que podem ser produzidas utilizando os métodos e meios da invenção incluem proteínas compreendendo a totalidade ou parte das sequências de aminoácidos de antigénios de diferenciação (referidas como proteínas CD) ou seus ligandos 17 ou proteínas substancialmente semelhantes a qualquer uma destas. Esses antigénios são revelados em Leukocyte Typing VI (Proceedings of the VIth International Workshop and Conference, Kishimoto, Kikutani et al.r eds., Kobe, Japão, 1996). Proteínas CD semelhantes são reveladas em workshops subsequentes. Exemplos desses antigénios incluem CD22, CD27, CD30, CD39, CD40, e ligandos destes (ligando CD27, ligando CD30, etc.). Vários dos antigénios de CD são membros da família do receptor de TNF, que também incluem 41BB e 0X40. Os ligandos são frequentemente membros da família de TNF, como o são o ligando 41BB e ligando 0X40. Consequentemente, membros das famílias de TNF e TNFR também podem ser produzidos utilizando a presente invenção.

Também podem ser produzidas proteínas enzimaticamente activas ou seus ligandos utilizando os métodos e meios da invenção. Exemplos incluem proteínas compreendendo a totalidade ou parte de uma das seguintes proteínas ou seus ligandos ou uma proteína substancialmente semelhante a uma destas: membros da família da metaloproteinase-disintegrina, várias cinases, glucocerebrosidase, superóxido dismutase, activador de plasminogénio no tecido, Factor VIII, Factor IX, apolipoproteina E, apolipoproteina A-l, globinas, um antagonista de IL-2, antitripsina alfa-1, Enzima de Conversão de TNF-alfa, ligandos para qualquer uma das enzimas acima mencionadas, e numerosas outras enzimas e seus ligandos.

Os métodos e meios da invenção também podem ser utilizados para produzir proteínas quiméricas seleccionadas in vitro para se ligarem a uma proteína alvo específica e modificar a sua actividade, tais como aqueles descritos nos Pedidos Internacionais WO 01/83525 e WO 00/24782 e anticorpos ou porções destes e anticorpos quiméricos, i. e., anticorpos possuindo 18 domínios de imunoglobulina de anticorpo constantes humanos acoplados a um ou mais domínios de imunoglobulina de anticorpo variável de murídeo, fragmentos destes, ou proteínas substancialmente semelhantes. 0 método da invenção também pode ser utilizado para produzir conjugados compreendendo um anticorpo e uma substância citotóxica ou luminescente. Essas substâncias incluem: derivados de maitansina (tal como DM1); enterotoxinas (tal como uma enterotoxina Staphlyococcal); isótopos de iodo (tal como iodo-125); isótopos de tecnécio (tal como Tc-99m); fluorocromos de cianina (tal como Cy5. 5.18); e proteínas de inactivação de ribossoma (tais como bouganina, gelonina, ou saporina-S6) . Exemplos de anticorpos, proteínas quiméricas seleccionadas ín vitro, ou anticorpo/citotoxina ou conjugados anticorpo/luminóforo que podem ser produzidos utilizando os métodos e meios da invenção incluem aqueles que reconhecem qualquer um ou uma combinação de proteínas incluindo, mas não limitadas a, qualquer uma das proteínas acima mencionadas e/ou os seguintes antigénios: CD2, CD3, CD4, CD8, CDlla, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-la, IL-Ιβ, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, receptor de IL-2, receptor de IL-4, receptor de IL-6, receptor de IL-13, subunidades do receptor IL-18, PDGF-β e análogos destes (tais como aqueles descritos na Patente US N° 5272064 e 5149792), VEGF, TGF, TGF-p2, TGF-βΙ, receptor de EGF (incluindo aqueles descritos na Patente US N° 6235883 Bl) receptor de VEGF, factor de crescimento de hepatócitos, ligando de osteoprotegerina, interferão gama, estimulador de linfócitos B (BlyS, também conhecido como BAFF, THANK, TALL-1, e zTNF4; ver Do e Chen-Kiang (2002), Cytokine Growth Factor Rev. 13(1):19-25), complemento de C5, IgE, antigénio tumoral CA125, antigénio tumoral MUC1, antigénio PEM, LCG (que é um produto genético que é expresso em associação com 19 cancro do pulmão), HER-2, uma glicoproteína TAG-72 associada a tumor, o SK-1 antigénio, epitopos associados a tumor que estão presentes em níveis elevados no soro de doentes com cancro do cólon e/ou pancreático, epitopos associados a cancro ou proteínas expressas em células do cancro da mama, cólon, célula escamosa, próstata, pancreático, pulmão, e/ou rim e/ou em células de melanoma, glioma, ou neuroblastoma, o núcleo necrótico de um tumor, integrina alfa 4 beta 7, a integrina VLA-4, integrinas B2, receptores de TRAIL 1, 2, 3, e 4, RANK, ligando RANK, TNF-α, a molécula de adesão VAP-1, molécula de

adesão de células epiteliais (EpCAM), molécula-3 de adesão intercelular (ICAM-3), adesina leucointegrina, a glicoproteína de plaquetas gp Ilb/IIIa, cadeia pesada da miosina cardíaca, hormona paratiróide, rNAPc2 (que é um inibidor do factor Vlla-factor de tecido), MHC I, antigénio carcinoembrionário (CEA) , alfa-fetoproteína (AFP), factor da necrose tumoral (TNF), CTLA-4 (que é um antigénio associado aos linfócitos T citotóxicos), receptor Fc-γ-Ι, HLA-DR 10 beta, antigénio HLA-DR, L-selectina, IFN-γ, Vírus de Sincício Respiratório, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da hepatite B (HBV), Streptococcus mutans, e Staphlycoccus aureus.

Os métodos e meios da invenção também podem ser utilizados para produzir a totalidade ou parte de uma proteína que é um anticorpo anti-idiotípico ou uma proteína substancialmente semelhante, incluindo anticorpos anti-idiotípicos contra: um anticorpo direccionado para o antigénio tumoral gp72; um anticorpo contra o gangliósido GD3; um anticorpo contra o gangliósido GD2; ou anticorpos substancialmente semelhantes a estes. 20

Os métodos e meios da invenção também podem ser utilizados para produzir proteínas de fusão recombinantes compreendendo qualquer uma das proteínas acima mencionadas ou proteínas substancialmente semelhantes. Por exemplo, proteínas de fusão recombinantes compreendendo uma das proteínas acima mencionadas mais um domínio de multimerização, tais como um fecho de leucina, uma espiral enrolada, uma porção Fc de um anticorpo, ou uma proteína substancialmente semelhante, pode ser produzido utilizando os métodos e meios da invenção. Ver, e. g., documento WO 94/10308; Lovejoy et al. (1993), Science 259:1288—1293; Harbury et al. (1993), Science 262: 1401-05; Harbury et al. (1994), Nature 371:80-83; Hakansson et al. (1999), Structure 7:255-64,. Especificamente incluídas entre essas proteínas de fusão recombinantes estão proteínas nas quais, pelo menos, uma porção de TNFR ou RANK é fundida com uma porção de Fc de um anticorpo (TNFR:Fc ou RANK:Fc). TNFR:Fc compreende a porção Fc de um anticorpo fundido com um domínio extracelular de TNFR, que inclui sequências de aminoácidos substancialmente semelhantes aos aminoácidos 1-163, 1-185, ou 1-235 da Figura 2A da Patente U.S. N° 5395760. RANK:Fc é descrito no documento WO 01/36637. Células adequadas para praticar a presente invenção incluem qualquer linha celular que pode glicosilar proteínas, de um modo preferido uma linha celular de mamífero que tenha sido geneticamente modificada para expressar uma proteína, embora a invenção também possa ser utilizada para produzir proteínas não recombinantes. De um modo preferido, as células são linhas celulares homogéneas. São conhecidas na técnica numerosas linhas celulares adequadas. Por exemplo, podem ser utilizadas células de ovário de hamster chinês (CHO), HeLa, VERO, BHK, Cos, MDCK, 293, 3T3, mieloma (e. g., NSO, NSI) ou WI38. As linhas celulares de hibridoma que produzem um anticorpo também podem ser 21 utilizadas para a prática da invenção. As linhas celulares derivadas das células acima mencionadas também são adequadas para a prática da invenção. Células particularmente preferidas são células CHO, que são largamente utilizadas para a produção de proteínas recombinantes, e. g., citocinas, factores de coagulação, e anticorpos (Brasel et al. (1996), Blood 88:2004-2012; Kaufman et al. (1988), J. Biol Chem 263:6352-6362; McKinnon et al. (1991), J Mol Endocrinol 6:231-239; Wood et al. (1990), J. Immunol 145:3011-3016). Uma linha celular mutante deficiente em di-hidrofolato redutase (DHFR) (Urlaub i. (1980), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-4220) , tais como DXB11 ou DG-44, é útil porque o sistemas de expressão do gene seleccionável e amplificável de DHFR eficiente permite a expressão da proteína recombinante a um nível elevado nestas células (Kaufman (1990), Meth. Enzymol. 185:527-566). Adicionalmente, estas células são fáceis de manipular como culturas aderentes ou de suspensão e apresentam estabilidade genética relativamente boa. Células CHO e proteínas recombinantes nelas expressas foram extensivamente caracterizadas e foram aprovadas para utilização no fabrico clínico comercial pelas agências reguladoras.

De acordo com a presente invenção, uma célula hospedeira de mamíferos é cultivada em condições que promovem a produção da proteína de interesse, que pode ser um anticorpo ou uma proteína recombinante. Formulações de meio de cultura de células basal para cultivar células de mamífero são bem conhecidas na técnica. Ver e. g. Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, p. 69-84, Wiley-Liss (1987). Para estas formulações de meio de cultura basal, o especialista irá adicionar componentes tais como aminoácidos, sais, açúcares, vitaminas, 22 hormonas, factores de crescimento, tampões, antibióticos, lipidos, elementos vestigiais e semelhantes, dependendo dos requisitos das células hospedeiras a serem cultivadas. 0 especialista também pode escolher utilizar uma de muitas formulações de meios individualizados que foram desenvolvidos para maximizar o crescimento celular, a viabilidade celular, e/ou a produção de proteina recombinante numa célula cultivada particular. Os métodos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados em combinação com meios de cultura de células comercialmente disponíveis ou com um meio de cultura de células que foi formulada individualmente para utilização com uma linha celular particular. 0 meio de cultura pode conter ou não soro e/ou proteina. Meios comerciais adequados incluem Meio RPMI 1641, Meio de Eagle Modificado por Dulbecco, Meio Mínimo Essencial de Eagle, Meio F-12K e F12, Meio 5A de McCoy, Meio L-15 de Leibovitz, e meios sem soro, tais como a Série EX-CELL™ 300 (disponível de JRH Biosciences, Lenexa, Kansas, USA), entre outros, que podem ser obtidos da American Type Culture Collection ou JRH Biosciences, assim como de outros vendedores. O especialista também pode optar por utilizar uma das muitas formulações de meios individualizados que foram desenvolvidos para maximizar o crescimento celular, viabilidade celular, e/ou produção de polipéptido recombinante numa célula hospedeira de cultura particular. Os métodos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados em combinação com meios de cultura de células comercialmente disponíveis ou com um meio de cultura de células que foi formulado individualmente para utilização com uma linha celular particular. Por exemplo, um meio enriquecido que pode apoiar o aumento da produção de polipéptido pode compreender uma mistura de dois ou mais meios comerciais, tais como, por exemplo, meios DMEM e F12 de Ham 23 combinados em proporções tais como, por exemplo, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, ou mesmo até 1:15 ou superior. Alternativamente, ou adicionalmente, um meio pode ser enriquecido pela adição de nutrientes, tais como aminoácidos ou peptona, e/ou um meio (ou a maioria dos seus componentes com as excepções referidas abaixo) pode ser utilizado a uma concentração superior à normalmente recomendada, por exemplo a 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, ou mesmo concentrações superiores. Como aqui utilizado, "IX" significa a concentração convencional, "2X" significa duas vezes a concentração convencional, etc. Em qualquer uma destas formas de realização, os componentes do meio que podem afectar substancialmente a osmolaridade, tais como sais, não podem ser aumentados em concentração de modo a que a osmolaridade do meio caia fora de um intervalo aceitável. Assim, um meio pode, por exemplo, ser 8X em relação a todos os componentes excepto sais, que podem estar presentes apenas a IX. Um meio enriquecido pode ser isento de soro e/ou isento de proteína. Neste contexto, "isento de proteína" significa isento de proteínas de pelo menos 15 aminoácidos, tais como insulina ou factor de crescimento tipo insulina. Meio "isento de proteína" pode conter proteínas hidrolisadas, tais como se encontram nas peptonas (de levedura, soja, ou outras fontes), que são aditivos de meio normalmente utilizados. Além disso, um meio pode ser suplementado periodicamente durante o tempo que uma cultura é mantida para reabastecer os componentes do meio que podem extinguir-se, tais como, por exemplo, vitaminas, aminoácidos, e precursores metabólicos. Como é conhecido na técnica, diferentes meios e temperaturas possuir efeitos algo diferentes em diferentes linhas celulares, e o mesmo meio e temperatura podem não ser adequados para todas as linhas celulares. 24

Os métodos da invenção são úteis para induzir a produção de proteínas recombinantes. Proteínas recombinantes são proteínas produzidas pelo processo de engenharia genética. 0 termo "engenharia genética" refere-se a infectar, transfectar, transformar, ou transduzir uma célula com uma molécula de polinucleótidos recombinante de modo a provocar na célula uma alteração da expressão de uma proteína desejada. Em algumas formas de realização, uma tal molécula de polinucleótidos recombinante compreende ácidos nucleicos codificando a proteína de interesse ligada operacionalmente a sequências de regulação adequadas, que fazem parte de um "vector de expressão" no qual os ácidos nucleicos que codificam a proteína de interesse são inseridas. Métodos e vectores para modificar geneticamente células e/ou linhas celulares para expressar uma proteína de interesse são bem conhecidos dos especialistas na técnica; por exemplo, várias técnicas são ilustradas em Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, Nova Iorque, 1988, e actualizações de quatro em quatro anos); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989); e Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69. Protocolos adicionais utilizando reagentes comercialmente disponíveis, tais como os reagentes de lípido catiónico LIPOFECTAMINE™, LIPOFECTAMINE™-2000, ou LIPOFECTAMINE™-PLUS (que podem ser adquiridos na Invitrogen), podem ser utilizados para transfectar células. Felgner et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:7413-7417. Adicionalmente, pode ser utilizada electroporação ou bombardeamento com microprojécteis revestidos com ácidos nucleicos para transfectar células utilizando processos, tais como os apresentados em Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 25 2a ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, e

Fitzpatrick-McElligott (1992), Biotechnology (NY) 10(9):1036-40. As técnicas de engenharia genética incluem, mas não estão limitadas a, transformação de células com vectores de expressão, activação de genes de recombinação homóloga direccionada (ver e. g. Patente U.S. N° 5272071 de Chappel), e transactivação por factores de transcrição modificados (ver e. g. Segai et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96(6):2758-63).

Um gene codificando um marcador de selecção é frequentemente utilizado para facilitar a identificação de células recombinantes e é, por isso, frequentemente incluído em vectores de expressão. A selecção de transformantes pode ser realizada utilizando métodos tais como, por exemplo, o esquema de selecção de di-hidrofolato redutase (DHFR) ou a resistência a fármacos citotóxicos. Kaufman et al. (1990), Meth. in Enzymology 185:487-511. Uma estirpe hospedeira adequada para selecção de DHFR pode ser, por exemplo, a estirpe de CHO DX-B11, que é deficiente em DHFR. Urlaub e Chasin (1980), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-4220. Outros exemplos de marcadores de selecção incluem aqueles que conferem resistência a antibióticos, tais como G418 e higromicina B.

As sequências reguladoras são tipicamente derivadas de genes de mamíferos, microbianos, virais, e/ou de insecto. Exemplos de sequências reguladoras incluem promotores de transcrição, operadores, e intensificadores, sítios de ligação ao ribossoma (ver e. g. Kozak (1991), J. Biol. Chem. 266:19867-19870), sequências que podem controlar a terminação da transcrição e tradução, sinais de poliadenilação (ver e. g. McLauchlan et al. (1988), Nucleic Acids Res. 16:5323-33), e sítios de ligação à matriz e estruturas de apoio (ver Phi-Van 26 et al. (1988), Mol. Cell. Biol. 10:2302-07; Stief et al. (1989),

Nature 341:342-35; Bonifer et al. (1990), EMBO J. 9:2843-38). As sequências de nucleótidos estão ligadas operacionalmente quando a sequência reguladora esteja funcionalmente relacionada com a sequência codificante da proteína. Essas sequências podem estar presentes em cis ou em trans desde que estejam funcionalmente relacionadas com a sequência codificante da proteína. Deste modo, uma sequência de nucleótidos do promotor está ligada operacionalmente a uma sequência codificante de proteína se a sequência de nucleótidos do promotor controlar a transcrição da sequência codificante. Embora muitas sequências capazes de regular a expressão, tais como promotores, exerçam os seus efeitos quando presentes em cis, não tem que ser sempre assim. Por exemplo, ARNs não codificantes presentes em trans podem desregular ou aumentar a expressão génica. Ver e. g. Storz (2002), Science 296:1260-63.

Sequências de promotor e de intensificador normalmente utilizadas são derivadas de vírus polioma, adenovírus 2, vírus de símio 40 (SV40), e citomegalovírus humano (CMV). Por exemplo, pode ser utilizado o promotor/intensificador do gene 1 precoce imediato de CMV humano. Ver e. g. Patterson et al. (1994), Applied Microbiol. Biotechnol. 40:691-98. Podem ser utilizadas sequências de ADN derivadas do genoma SV40 virai, por exemplo, origem SV40, promotor precoce e tardio, intensificados, excisão, e sítios de poliadenilação, para proporcionar outros elementos genéticos para expressão de uma sequência de genes estruturais numa célula hospedeira de mamífero. Promotores virais precoces e tardios são particularmente úteis porque ambos são facilmente obtidos de um genoma virai como um fragmento, que pode também conter uma origem de replicação virai (Fiers et al., Nature 273:113, 1978; Kaufman (1990), Meth. in Enzymol. 185:487-511). 27

Também podem ser utilizados fragmentos de SV40 mais pequenos ou maiores, desde que a sequência de aproximadamente 250 pb que se estende desde o sitio Hind III em direcção ao sitio Bgl I localizado na origem de replicação de SV40 virai esteja incluído.

Uma sequência codificando um péptido sinal nativo ou heterólogo apropriado (sequência líder) pode ser incorporada num vector de expressão, para promover a secreção extracelular da proteína recombinante. A escolha do péptido sinal ou líder depende do tipo de células hospedeiras nas quais a proteína recombinante deve ser produzida. Exemplos de péptidos sinal que são funcionais em células hospedeiras de mamíferos incluem a sequência sinal para interleucina-7 (IL-7) descrita na Patente US N° 4965195, a sequência sinal para receptor da interleucina-2 descrita em Cosman et al., Nature 312:768, 1984; o péptido sinal receptor de interleucina-4 descrito na Patente EP N° 367566; o péptido sinal de receptor de interleucina-1 de tipo I descrito na Patente U.S. N° 4968607; e o péptido sinal do receptor de interleucina-1 de tipo II descrito na Patente EP N° 460846.

Sequências de controlo adicionais que demonstraram melhorar a expressão de genes heterólogos de vectores de expressão em mamíferos incluem os elementos como o elemento da sequência de aumento da expressão (EASE) derivados de CHO células (Morris et al., in Animal Cell Technology, pp. 529-534 (1997); Patente US N° 6312951 Bl; Patente US N° 6027915; Patente US N° 6309841 Bl) e o líder tripartido (TPL) e ARNs do gene VA de Adenovírus 2 (Gingeras et al. (1982), J. Biol. Chem. 257:13475-13491). Sequências de sítios internos de entrada de ribossoma (IRES) de origem virai permitem que ARNm dicistrónicos sejam traduzidos eficientemente (Oh e Sarnow (1993), Current Opinion in Genetics 28 and Development 3:295-300; Ramesh et al. (1996), Nucleic Acids Research 24:2697-2700). A expressão de um ADNc heterólogo como parte de um ARNm dicistrónico seguido pelo gene para um marcador de selecção (e. q., DHFR) demonstrou melhorar a transfectabilidade do hospedeiro e a expressão do ADNc heterólogo (Kaufman et al. (1990), Methods in Enzymol. 185:487-511) . Vectores de expressão exemplares que empregam ARNm dicistrónicos são pTR-DC/GFP descritos por Mosser et al., Biotechniques 22:150-161 (1997), e p2A5I descrito por Morris et al., em Animal Cell Technology, pp. 529-534 (1997).

Exemplos de vectores de expressão úteis que podem ser utilizados para produzir proteínas são aqueles revelados no documento WO 01/27299 e o vector pDC409 descrito em McMahan et al. (1991), EMBO J. 10:2821. Outro vector de expressão elevada útil, pCAVNOT, foi descrito por Mosley et al. (1989), Cell 59:335-348. Outros vectores de expressão para utilização em células hospedeiras de mamífero podem ser construídos como revelado por Okayama e Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280 (1983)). Um sistema útil para expressão estável de nível elevado de ADNc de mamífero em células epiteliais de mamária de murídeo C127 pode ser construído substancialmente como descrito por Cosman et al. (Mol. Immunol. 23:935 (1986)). Um vector de expressão elevada útil, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman et al. (1984), Nature 312:768, foi depositado como ATCC 39890. Vectores de expressão de mamíferos úteis adicionais são descritos na Patente EP N° A 0367566 e documento WO 01/27299. Os vectores podem ser derivados de retrovírus. Em vez da sequência sinal nativa, pode ser adicionada uma sequência sinal heteróloga, tal como a sequência sinal para IL-7 descrita na Patente US N° 4965195; a sequência sinal para o receptor de IL-2 descrita em Cosman et al. (Nature 312:768 (1984)); o péptido sinal IL-4 descrito na 29

Patente EP N° 367566; o péptido sinal do receptor de IL-1 de tipo I descrito na Patente US N° 4968607; e o péptido sinal do receptor de IL-1 de tipo II descrito na Patente EP N° 460846.

Condições de cultura adequadas e para células de mamífero são conhecidas na técnica. Ver e. g., Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford University Press, Nova Iorque (1992) . As células de mamífero podem ser cultivadas em suspensão ou enquanto ligadas a um substrato sólido. Além disso, as células de mamífero podem ser cultivadas, por exemplo, em biorreactores de leito fluidizado, biorreactores de fibras ocas, biorreactores de leito empacotado, biorreactores de leito fibroso, frascos rolantes, frascos de agitação, ou biorreactores de tanque agitado, com ou sem microtransportadores, e operados de um modo descontínuo, descontínuo com alimentação, contínuo, semi-contínuo, ou de perfusão.

Os métodos e meios da invenção podem ser combinados com outros métodos ou aditivos do meio, especialmente aqueles que aumentam a produção ou sialilação de uma proteína. Por exemplo, as células podem ser cultivadas a temperaturas desde cerca de 29 °C até cerca de 40 °C, opcionalmente desde cerca de 29 °C até cerca de 37 °C, desde cerca de 29 °C até cerca de 36 °C, desde cerca de 29 °C até cerca de 35 °C, ou desde cerca de 30 °C até cerca de 33 °C. Além disso, substâncias diferentes de N-acetilmanosamina, galactose, frutose e manose podem ser adicionadas ao meio. Essas substâncias incluem, mas não estão limitadas a inibidores de desacetilase de histona, butirato, tricostatina, cafeína e hexametileno bisacetamida.

Os métodos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para aumentar o título e/ou sialilação de proteínas 30 tanto em processo de cultura de fase única como de fase múltipla. Num processo de fase única, as células são inoculadas num ambiente de cultura, e os métodos e meios revelados são empregues durante a fase de produção única. Num processo de fase múltipla, as células são cultivadas em duas ou mais fases distintas. Por exemplo, as células podem ser cultivadas primeiro numa fase de crescimento, em condições ambientais que maximizam a proliferação e a viabilidade celular, depois transferidas para uma fase de produção, em condições que aumentam a produção e/ou sialilação de uma proteína. Em processos de fase múltipla, os métodos e meios de acordo com a presente invenção são empregues, pelo menos, durante a fase de produção.

Os exemplos apresentados abaixo não pretendem ser exaustivos ou limitar o âmbito da invenção. 0 especialista entenderá que são possíveis modificações e variações à luz dos ensinamentos acima. EXEMPLO 1 COMPARAÇÃO DA CAPACIDADE DE VÁRIOS AÇUCARES E SUAS COMBINAÇÕES PARA INDUZIR SIALILAÇÃO DE TNFR:Fc A experiência seguinte foi realizada para determinar que hidrato de carbono ou combinação de hidratos de carbono adicionados ao meio de cultura celular é capaz de induzir a maior sialilação de TNFR:Fc produzido pelas células. A extensão relativa da sialilação foi determinada medindo a fracção de TNFR:Fc produzido por uma cultura celular que elui da coluna de permuta aniónica apenas a uma concentração de sais elevada. Isto proporciona uma medida grosseira da extensão da sialilação 31 porque as proteínas com mais ácido siálico requerem uma concentração de sais mais elevada para eluição de uma coluna de permuta aniónica.

Cerca de 2,0 x 106 células de uma linha celular CHO que tinham sido qeneticamente modificadas para produzir TIVFR:Fc foram inoculadas em cada um de 12 frascos contendo 30 mL de meio sem soro com INTRALIPIDS (uma emulsão estenl de oleo de soja fraccionado e fosfolípidos de ovo fraccionados em áqua), factor-I de crescimento de tipo insulina, e butirato e sem quaisquer hidratos de carbono adicionados (denominado "controlo") ou com os aditivos de hidrato de carbono indicados na Figura 2 a uma concentração de 4 mM cada. As culturas foram incubadas durante 7 dias a 30 °C com agitação a 150 revoluções por minuto. TNFR:Fc foi recolhido do meio após sete dias de crescimento e pré-purificado por cromatografia de afinidade em Proteína A. Posteriormente, a concentração da proteína TNFR:Fc purificada foi determinada medindo a absorvência a 280 nanómetros. A concentração da proteína TNFR:Fc foi ajustada até cerca de 0,25 mg/mL por diluição em imidazole a 20 mM, pH 6,2.

Uma coluna de permuta aniónica (4,6 mm em diâmetro e 50 mm de altura) foi operada como se segue. A coluna foi calibrada antes e após a separação das amostras experimentais utilizando uma mistura de duas proteínas de controlo contendo 0,25 mg/mL de inibidor de tripsina de soja e 0,5 mg/mL de lactalbumina (ambas obtidas da Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, Missouri, EUA). Uma amostra de até 200 pL desta mistura foi aplicada à coluna, e foi passado um gradiente linear entre imidazole a 20 mM, pH 6,2 (tampão A) e imidazole a 20 mM, NaCl a 0,7 M, pH 6,2 (Tampão B) através da coluna a uma taxa de 0,8 mL/min. Aos 22,1 minutos, o gradiente estava completo, e a coluna continha 100% de Tampão B. 32 A eluição da proteína foi determinada monitorizando a absorvência a 280 nanómetros, e foi registado automaticamente um gráfico destas medições versus o tempo (em relação ao tempo da aplicação) à medida que a proteína eluía da coluna. A lactalbumina eluída antes do inibidor da tripsina de soja (cerca de 11,2 minutos em comparação com 15,4 minutos). Entre as separações, a coluna foi lavada injectando 0,2 mL de NaCl a 2M, seguido por dois conjuntos de lavagens alternadas com Tampões A e B seguidos por uma lavagem final com Tampão A.

Foi aplicado um volume de até 200 pL (a cerca de 0,25 mg/mL) de TNFR:Fc na coluna de permuta aniónica, e foi passado um gradiente linear através da coluna como explicado acima. A porção do pico de TNFR:Fc que eluiu após o inibidor da tripsina de soja foi considerado como eluindo a sais elevados. A fracção de TNFR:Fc que eluiu a sal elevado foi determinada comparando a área sob a curva que eluiu após o inibidor de tripsina de soja com a área total sob a curva. Este número foi comparado em cada caso com uma fracção semelhante de um lote de TNFR:Fc produzido numa experiência separada por uma cultura celular cultivadas sem manose, frutose, galactose, ou N-acetilmanosamina.

Os resultados são apresentados na Figura 2. O facto de a cultura de controlo da presente experiência sem açúcares adicionados estar apenas muito ligeiramente acima de 100% indica que a sialilação de TNFR:Fc pode ser quase constante de lote para lote. Estes resultados também indicam que as culturas cultivadas em N-acetilmanosamina, frutose, manose e galactose (a concentrações de 4 mM cada) produziram os níveis mais elevados de sialilação de TNFR:Fc de qualquer uma das combinações testadas. Além disso, TNFR:Fc de culturas cultivadas com as 33 seguintes combinações de açúcares também demonstraram aumentar na sialilação: (1) galactose isoladamente; (2) frutose e galactose; (3) frutose, galactose e manose; e (4) N-acetilmanosamina e galactose. EXEMPLO 2

AMOSTRAGEM DE UMA SUPERFÍCIE DE RESPOSTA PARA DETERMINAR CONCENTRAÇÕES ÓPTIMAS DE N-ACETILMANOSAMINA E AÇÚCARES

Esta experiência foi realizada para determinar as concentrações óptimas para N-acetilmanosamina e frutose, manose e galactose em meio de cultura para aumentar a sialilação de TNFR:Fc. A experiência também procura determinar uma combinação que atinja a sialilação de TNFR:Fc mais elevada, com a concentração mais baixa de N-acetilmanosamina.

Foram inoculadas cerca de 2,0 x 106 células da mesma linha celular de CHO utilizada no Exemplo 1, em cada um de 13 frascos contendo 30 mL de meio sem soro com INTRALIPIODS™ (uma emulsão estéril de óleo de soja fraccionado e fosfolipidos de ovo fraccionados em água), factor-1 de crescimento de tipo insulina, e butirato com os aditivos do meio indicados na Figura 3, isto é, concentrações variáveis de N-acetilmanosamina e/ou um cocktail de açúcar contendo quantidades equimolares de frutose, galactose e manose.

Combinações de concentrações de aditivos de meio foram escolhidas para amostrar uma superfície de resposta. Ver e. g. Õberg e Deming, Chemical Eng. Process, Abril de 2000:53-59. Foram utilizados cinco duplicados de culturas para produzir os 34 resultados para o ponto central da Figura 3, e oito outras culturas cada produziram os resultados para um dos oito pontos axiais da Figura 3. Foi recolhida TNFR:Fc do meio após 7 dias de cultura a 30 °C com agitação a 150 revoluções por minuto e pré-purifiçada por cromatografia de afinidade em Proteína A. 0 número de moles de ácido N-acetilneuramínico (NANA) por mole de proteína recombinante foi determinado como se segue. Após cromatografia de afinidade em Proteína A, a concentração de TNFR:Fc foi determinada lendo a absorvência a 280 nanómetros, e a concentração de proteína foi ajustada para 1 mg/mL por diluição em solução salina tamponada com fosfato. Foi diluída sialidase (obtida de Glyko, Inc. de Novato, Califórnia, EUA) para 1 mU/L (em que 1 unidade é a quantidade de enzima necessária para clivar 1 pmole de NANA por minuto a pH 5 e 37 °C) em Tampão de Incubação a 2X (acetato de sódio a 200 mM, pH 5,0). TNFR:Fc e sialidase (10, pL cada) foram misturados e incubados durante 4 horas a 37 °C. Posteriormente, a mistura foi diluída para 0,2 mg/mL de TNFR:Fc adicionando 30 pL de água. O ácido siálico libertado foi detectado e quantificado utilizando cromatografia de permuta aniónica de elevado desempenho, na qual o fluxo de saída foi monitorizado utilizando detecção amperométrica pulsada. A detecção amperométrica pulsada utiliza eléctrodos que intercalam pulsos de limpeza (para remover analitos que obstruem o eléctrodo e impedem leituras precisas) com pulsos de detecção a um potencial apropriado para detectar NANA. O sistema foi calibrado antes e após a separação das amostras experimentais utilizando quantidades conhecidas de NANA adquiridas de um fornecedor comercial, tal como, por exemplo, a Sigma-Aldrich Corporation de St. Louis, Missouri, EUA. O sistema para realizar cromatografia de permuta aniónica de elevado desempenho e detecção amperométrica pulsada foi adquirido da Dionex Corporation de Sunnyvale, Califórnia, EUA. 35

Claims (38)

1. Os resultados, que são apresentados na Figura 3, foram registados graficamente utilizando um programa de computador para análise estatística e apresentação gráfica dos resultados (JMP®, disponível de SAS Institute, Cary, Carolina do Norte, EUA) . Os níveis de sialilação mais elevados de TNFR:Fc foram observados a 3 mM cada de frutose, galactose e manose e ligeiramente acima de 5 mM de N-acetilmanosamina. Todavia, quando são adicionados 3 mM de frutose, galactose e manose às culturas contendo ligeiramente menos de 3 mM de N-acetilmanosamina, os níveis de sialilação são quase iguais aos observados utilizando cerca de 5 mM de N-acetilmanosamina. Lisboa, 8 de Maio de 2007 REIVINDICAÇÕES 1. Método para controlar o conteúdo em ácido siálico de uma proteína produzida por células de mamífero compreendendo a cultura de células em suspensão num meio compreendendo galactose e frutose. 36
2. 2. Método da reivindicação 1, em que o meio compreende ainda manose.
3. 3. Método da reivindicação 1 ou 2, em que o meio compreende ainda N-acetilmanosamina.
4. 4. Método de qualquer uma das reivindicações 1, 2, ou 3, em que o meio é isento de soro.
5. 5. Método de qualquer uma das reivindicações 2, 3 ou 4, em que as concentrações de galactose, manose e frutose são cada uma de 1 mM a 10 mM.
6. 6. Método de qualquer uma das reivindicações 3 a 5, em que a concentração de N-acetilmanosamina no meio é, pelo menos, 0,8 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM ou 20 mM.
7. 7. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a proteína é uma proteína recombinante, segregada.
8. 8. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que as células de mamífero são células CHO (Ovário de Hamster Chinês) .
9. 9. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que as células são cultivadas a uma temperatura desde 29 °C a 36 °C.
10. 10. Meio para a cultura de células de mamífero compreendendo galactose, frutose e manose.
11. 11. Meio da reivindicação 10, compreendendo ainda N-acetil-manosamina.
12. 12. Meio da reivindicação 10 ou 11, em que as concentrações de galactose, manose e frutose são, cada uma, de 1 mM a 10 mM.
13. 13. Meio da reivindicação 11 ou 12, em que a concentração de N-acetilmanosamina no meio é, pelo menos, 0,8 mM.
14. 14. Meio de qualquer uma das reivindicações 10 a 13, em que o meio é isento de soro.
15. 15. Método para controlar o conteúdo em ácido siálico de uma proteína compreendendo a cultura de uma célula de mamífero que produz a proteína no meio compreendendo N-acetilmanosamina e galactose.
16. 16. Método da reivindicação 15, em que o meio compreende ainda frutose e manose.
17. 17. Método da reivindicação 16, em que a concentração de frutose no meio é de 1,5 mM a 4,5 mM e em que a concentração de manose no meio é de 1,5 mM a 4,5 mM.
18. 18. Método de qualquer uma das reivindicações 15 a 17, em que a célula é cultivada a uma temperatura desde 29 °C a 35 °C.
19. 19. Método de qualquer uma das reivindicações 15 a 18, em que a concentração de N-acetilmanosamina no meio é, pelo menos, 0,8 mM e em que a concentração de galactose no meio é desde 1,5 mM a 4,5 mM.
20. 20. Método de qualquer uma das reivindicações 15 a 19, em que a proteína é uma proteína segregada.
21. 21. Método de qualquer uma das reivindicações 15 a 20, em que a proteína é uma proteína recombinante.
22. 22. Método de qualquer uma das reivindicações 15 a 21, em que a célula é uma célula CHO (Ovário de Hamster Chinês).
23. 23. Meio para cultura de células de mamífero, compreendendo galactose, frutose e N-acetilmanosamina.
24. 24. Meio da reivindicação 23, em que o meio compreende ainda manose.
25. 25. Meio da reivindicação 24, em que a concentração de frutose no meio é desde 1,5 mM a 4,5 mM e em que a concentração de manose no meio é desde 1,5 mM a 4,5 mM.
26. 26. Meio de qualquer uma das reivindicações 23 a 25, em que a concentração de N-acetilmanosamina no meio é, pelo menos, 0,8 mM e em que a concentração de galactose no meio é desde 1,5 mM a 4,5 mM.
27. 27. Meio de qualquer uma das reivindicações 23 a 26, em que as células de mamífero são células CHO.
28. 28. Meio de qualquer uma das reivindicações 23 a 27, em que o meio é isento de soro.
29. 29. Método para aumentar a produção de uma proteína através da cultura de células de mamífero que expressam a proteína, compreendendo o método, a cultura de células de mamífero num meio compreendendo frutose, manose e galactose.
30. 30. Método da reivindicação 29, em que o meio compreende ainda N-acetilmanosamina.
31. 31. Método da reivindicação 30, em que a concentração de galactose no meio é desde 1,5 mM a 4,5 mM, em que a concentração de manose no meio é desde 1,5 mM a 4,5 mM, e em que a concentração de frutose no meio é desde 1,5 mM a 4,5 mM.
32. 32. Método da reivindicação 30 ou 31, em que a concentração de N-acetilmanosamina no meio é, pelo menos, 0,8 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 10 mM, ou 20 mM.
33. 33. Método de qualquer uma das reivindicações 29 a 32, em que o meio é isento de soro.
34. 34. Método de qualquer uma das reivindicações 29 a 33, em que as células de mamífero são células CHO (Ovário de Hamster Chinês) .
35. 35. Método de qualquer uma das reivindicações 29 a 34, em que a proteína é uma proteína recombinante, segregada.
36. 36. Método para controlar o conteúdo em ácido siálico de uma proteína recombinante compreendendo a cultura de células de mamífero que expressam a proteína recombinante a uma temperatura desde cerca de 29 °C a cerca de 36 °C num meio compreendendo frutose, galactose, manose e N-acetilmanosamina, em que a concentração de frutose no meio é desde 1,0 mM a 5, 0 mM, em que a concentração de galactose no meio é desde 1,0 mM a 5, 0 mM, em que a concentração de manose no meio é desde 1,0 mM a 5, 0 mM, e em que a concentração de N-acetilmanosamina no meio é, pelo menos, 0,8 mM.
37. 37. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 9, 15 a 22 ou 36, em que o conteúdo em ácido siálico de uma proteína é aumentado.
38. 38. Utilização de um meio compreendendo N-acetilmanosamina e galactose para controlar o conteúdo em ácido siálico de uma proteína produzida por uma célula de mamífero. Lisboa, 8 de Maio de 2007