JP2009526746A - タンパク質分解抵抗性の抗体調製物 - Google Patents

Abstract

実質的に均質かつＧ０およびＧ２のようなシアリル化されていないグリコフォームをもつ抗体調製物を、酵素処理、ある条件下での発現、特定の宿主細胞の使用、および血清との接触により製造する。これらの抗体調製物は、パパイン、フィシン、ブロメライン、ペプシン、ＭＭＰ−７、好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、ストロメリシン（ＭＭＰ−３）およびマクロファージエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）のようなマトリックスメタロプロテイナーゼ、ならびにグリコシル化改変酵素のようなプロテアーゼによる切断に抵抗する。実質的に均質かつシアリル化されていないグリコフォームをもつ抗体調製物、および抗体中のグリコシル化の試験方法は、抗体特性の特徴付けに関して、および／またはプロテアーゼ活性の増大を特徴とする疾患若しくは状態で有用である。

Description

本発明は、抗体のグリコフォーム含有率（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ ｃｏｎｔｅｎｔ）を評価すること、ならびに、より具体的には、実質的に均質なグリコフォーム、例えば未シアリル化グリコフォームである抗体調製物の製造および使用方法に関する。

抗体は自然免疫で重大な役割を演じている可溶性血清糖タンパク質である。Ｈ鎖定常領域中の保存された位置の全部の天然に産生される抗体の炭水化物構造はアイソタイプで異なる（図１）。各アイソタイプは異なる多数のＮ結合したオリゴ糖構造を有し、それらはタンパク質の集成、分泌若しくは機能的活性に多様に影響を及ぼす（非特許文献１）。結合されたＮ結合したオリゴ糖の構造（図２）はプロセシングの程度に依存してかなり変動し、そして高マンノース、ならびに分岐ＧｌｃＮＡｃおよびコアフコース残基を伴う若しくは伴わない複雑な二分岐オリゴ糖を包含し得る（非特許文献１）。典型的に、モノクローナル抗体でさえ複数のグリコフォームとして存在するような特定のグリコシル化部位に結合されたコアオリゴ糖構造の不均質なプロセシングが存在する。同様に、抗体のグリコシル化の大きな差違が抗体産生細胞株間で存在し、そしてなお小さな差違が異なる培養条件下で増殖された所定の一細胞株について見られることが示された。

抗体アイソタイプ（例えばＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧ）の間で、ＩｇＧが最も豊富であり、ＩｇＧ１サブクラスが最も大きな程度および範囲のエフェクター機能を表す。ＩｇＧ１タイプの抗体は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性がしばしば重要と思われる癌免疫療法で最も一般に使用される抗体である。構造的に、ＩｇＧのヒンジ領域およびＣＨ２ドメインが抗体エフェクター機能で主要な役割を演じている。（ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの二量体化により形成される）Ｆｃ領域に存在するＮ結合したオリゴ糖がエフェクター機能に影響を及ぼす。これらの共有結合したオリゴ糖は複雑な二分岐型構造であり、そして高度に不均質であり（図２を参照されたい）；ＮＡＮＡすなわち５−Ｎ−アセチルノイラミン酸、（ＮｅｕＡｃ）若しくはＮＧＮＡすなわち５−Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）が典型的に「シアル酸」である。他のシアル酸が見出されているか、若しくは化学合成し得る。Ａｓｎ２９７の保存されたＮ結合したグリコシル化部位が各ＣＨ２ドメイン中に存する。成熟抗体中で、Ａｓｎ２９７に結合された２個の複雑な二分岐オリゴ糖はＣＨ２ドメイン間に埋没されて、ポリペプチドバックボーンと広範な接触点を形成する。ＡＤＣＣのようなエフェクター機能を抗体が媒介するのにそれらの存在が不可欠であることが見出された（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献１）。

特定の位置の個々の糖の生物学的存在および意義もまた探求されることを開始した。例えば、抗体のガラクトシル化の程度は、齢、性および疾患により影響を及ぼされる（非特許文献４）。一般に、オリゴ糖構造はいくぶん種特異的であり、そして広範に変動する。さらに、分岐ＧｌｃＮａｃおよびコアフコース残基を伴うおよび伴わないオリゴ糖構造の生物学的意義もまた研究されている。ヒトＩｇＧ、および組換え産生されたＩｇＧの多くは少量のシアリル化された（若しくは未シアリル化すなわちアシアリル化）オリゴ糖を含有するが、しかしながらＩｇＧの大多数はシアリル化されていないオリゴ糖構造を含有する。

抗体のタンパク質分解性切断は生理学的条件下で天然に起こり、そして、抗体構造に基づく生物学的治療薬の製造における工業的処理工程でもまたあり得る。パパインで生成若しくは処理される治療的抗体フラグメントＦａｂは、より広まった使用を獲得しつつある
。パパインは植物由来酵素であるとは言え、ＩｇＧ１ヒンジ中で同定された多数のプロテアーゼ切断部位が存在し、そしてそれらは図３に要約されている。

組換えＩｇＧは、多様なタンパク質分解酵素を使用して、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびにＦｃのようなＩｇＧフラグメントに転化し得る（図１および３）。該消化フラグメントは、ヒト疾患の管理および処置において有用な主要な生物学的治療薬の一分類を表す。アブシキシマブ（（ｃ７Ｅ３ Ｆａｂ、ＲＥＯＰＲＯ^(R)として市販されている）はＦａｂ治療薬の一例である。４７，６１５ダルトンのＦａｂフラグメントが、細胞培養上清、パパインでの消化、およびカラムクロマトグラフィーから精製される。他の例は、ジゴキシン中毒の潜在的処置のためのヒツジポリクローナル抗体からのＦａｂフラグメントの調製物、ＤｉｇｉＦａｂ（ＤｉｇｉＴＡＢ）；米国で２０００年１０月に承認された、４種の最も一般的な北米のマムシ（ｃｒｏｔａｌｉｄ）（マムシ（ｐｉｔ ｖｉｐｅｒ））による咬傷に対する抗毒素としての蛇毒で免疫したヒツジから得た一価Ｆａｂフラグメントの調製物ＣｒｏＦＡｂ；および西アフリカに多いヘビ、カーペットバイパー（Ｅｃｈｉｓ Ｏｃｅｌｌａｔｕｓ）による咬傷の処置のための一特異性ヒツジポリクローナル抗体のＦａｂフラグメントに基づく抗毒素ＥｃｈｉＴＡｂを包含する。開発中の他のＦａｂは、加齢性黄斑変性の潜在的処置としてのＧｅｎｅｔｅｃｈのベバシズマブの高アフィニティーＦａｂバリアント、ラニビズマブ（ｒｈｕＦａｂ Ｖ２；ＡＭＤ−Ｆａｂ；Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）；ならびに、関節リウマチ（ＲＡ）、膜性腎症およびループス腎炎、皮膚筋炎ならびに発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）を包含する数種の慢性炎症性疾患のための潜在的処置としての、ヒト補体成分Ｃ５のその炎症前成分への切断を予防する静脈内ヒト化モノクローナル抗体、５Ｇ１．１を包含する。

潜在的治療的使用を伴う他のＦａｂ含有組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に連結されたＣＤＰ−８７０（ヒト化抗ＴＮＦα−Ｆａｂフラグメント）のような化学修飾されたＦａｂを包含する。ＣＤＰ−８７０は、その高アフィニティー結合および中和能力のため選択されたマウス抗ヒトＴＮＦα抗体由来である。この抗体のＦａｂフラグメントは、組換えＤＮＡ技術により構築され、ヒト化され、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でフェドバッチ醗酵により合成された。この醗酵手順の収量は、細菌培養物１リットルあたり３００と１２００ｍｇの間のタンパク質に達した。血漿半減期を延長させるため、ＰＥＧ部分をＦａｂフラグメントに付加した。この目的上、その循環半減期を延長するという目的上親水ポリマー（ＰＥＧ）部分の共有付加のために、Ｆａｂフラグメントのヒンジ領域に単一システイン残基を導入した、部位特異的複合法が開発された。Ｆａｂフラグメントを製造するための低価格の大腸菌（Ｅ ｃｏｌｉ）技術を使用することは、製造元（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）が、ＣＤＰ−８７０の製造費用を哺乳動物細胞培養物中で慣習的に産生される抗体と比較して１０ないし２０倍低下することを可能にした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）はグリコシル化タンパク質を発現しない。

今日まで、ヒト若しくは他の種からのタンパク質分解性切断に対するＩｇＧの感受性に対する、グリカンの存在と組成の間の関係は研究されていない。従って、効率的な抗体製造の目的上、ならびに抗体グリカンの存在および／若しくは組成を同定するためのツールとしての、治療上適切な抗体構造のタンパク質分解パターンとグリカン構造の間の関係を理解することの必要性が存在する。

Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．とＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２６−３２（１９９７） Ｌｉｆｅｌｙ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：８１３−８２２（１９９５） Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．１６３：５９−７６（１９９８） Ｒａｊｕ，Ｔ．Ｓ．ら Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０００．１０（５）：４７７−８６

［発明の要約］
本発明は、プロテアーゼによる切断に抵抗する抗体調製物の能力を高める方法、および、癌のような上昇されたレベルのプロテアーゼの存在と関連する病理学的状態を処置するためのこうした抗体調製物の使用方法を含んでなる。本発明の方法の一態様において、抗体調製物は該抗体のＦｃ領域にシアリル化グリコフォームを実質的に含まない。本発明の別の局面において、プロテアーゼは、パパイン、ペプシン、ＭＭＰ−７、好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、ストロメリシン（ＭＭＰ−３）、マクロファージエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）を包含するマトリックスメタロプロテイナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、およびグリコシル化改変酵素、例えばシアリダーゼ−Ａ、ガラクトシダーゼなどを包含する他のプロテアーゼよりなる群から選択される。一態様において、抗体調製物はグリコフォームＧ０に関して実質的に均質であるようにそう改変される。

別の態様において、本発明は、プロテアーゼによる切断に抵抗する抗体調製物の能力の増大若しくは低下方法、および、増大若しくは低下されたレベルのプロテアーゼの存在と関連する疾患若しくは状態でのこうした抗体調製物の使用方法を含んでなる。

本発明は、抗体調製物をｉｎ ｖｉｔｒｏでシアリダーゼで処理すること、ならびに、場合によっては、ガラクトース残基を除去するために抗体をβ−ガラクトシダーゼおよび／若しくはα−ガラクトシダーゼでさらに処理することによる、パパイン、ペプシン、ＭＭＰ−７、好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、ストロメリシン（ＭＭＰ−３）、マクロファージエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）を包含するマトリックスメタロプロテイナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、およびグリコシル化改変酵素を包含する他のプロテアーゼのようなプロテアーゼを用いる、抗体の安定性を高める方法もまた含んでなる。

本発明はさらに、細胞若しくは被験体中の抗体のグリコシル化の状態を測定することを含んでなる、細胞若しくは被験体中の疾患状態の検出若しくは診断方法を含んでなる。疾患状態の測定若しくは診断方法は、前記被験体からの生物学的サンプル中のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｆａｃｂ若しくはＦｃフラグメントの存在の決定と一緒の、被験体中の天然の若しくは治療的に投与された抗体のグリコフォームの分析に頼ることができる。

本発明は、本明細書に記述されるいかなる発明もさらに提供する。

［発明の詳細な記述］
略語
ＡＡ、アントラニル酸；α１，３ＧＴ、α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ；β１，４ＧＴ、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ；α２，３ＳＴ、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ；ＡＤＣＣ、抗体依存性細胞傷害；ＣＤＣ、補体依存性細胞傷害；ＣＭＰ−Ｓｉａ、シチジン一リン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸；ＦＢＳ、ウシ胎児血清；ＩｇＧ、免疫グロブリンＧ；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、マトリックス支援レーザー／脱離イオン化飛行時間質量分析；ＮＡＮＡ、シアル酸のＮ−アセチルノイラミン酸異性体；ＮＧＮＡ、シアル酸のＮ−グリコリルノイラミン酸異性体；ＰＮＧアーゼＦ、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ；ＨＰＬＣ、逆相高速液体クロマトグラフィー；ＳＡ、シナピン酸；Ｓｉａ、シアル酸；ＳＤＨＢ、塩化ナトリウムを含有するジヒドロ安息香酸；ＵＤＰ−Ｇａｌ、ウリジン二リン酸ガラクトース；ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミン。

定義
本明細書で使用されるところの「Ｆｃ」、「Ｆｃ含有タンパク質」若しくは「Ｆｃ含有分子」という用語は、最低１個の免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインを有する単量体、二量対若しくはヘテロ二量体タンパク質を指す。ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは該タンパク質／分子（例えば抗体）の二量体領域の少なくとも一部分を形成し得る。

「抗体」という用語は、抗体模倣物を制限なしに包含するか、あるいは、抗体、または一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ミメティボディ（ｍｉｍｅｔｉｂｏｄｙ）およびそれらのフラグメントを制限なしに包含するその指定されるフラグメント若しくは部分の構造および／若しくは機能を模倣する抗体の部分を含んでなる、抗体、それらの消化フラグメント、指定される部分およびバリアントを包含することを意図している。機能的フラグメントは目的の標的抗原に結合する抗原結合フラグメントを包含する。例えば、限定されるものでないがＦａｂ（例えばパパイン消化による）、Ｆａｂ’（例えばペプシン消化および部分還元による）、ならびにＦ（ａｂ’）_２（例えばペプシン消化による）、ｆａｃｂ（例えばプラスミン消化による）、ｐＦｃ’（例えばペプシン若しくはプラスミン消化による）、Ｆｄ（例えばペプシン消化、部分還元および再凝集による）、ＦｖまたはｓｃＦｖ（例えば分子生物学技術による）フラグメントを挙げることができる、標的抗原若しくはその部分に結合することが可能な抗体フラグメントが、抗体という用語により包含される（例えば、Ｃｏｌｌｉｇａｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、上記を参照されたい）。

本明細書で使用されるところの「モノクローナル抗体」という用語は、動物抗体の最低１種のＨ若しくはＬ鎖抗体可変ドメインの最低１種に対する実質的相同性を保持する最低１個のリガンド結合ドメインを含んでなる、特定の形態のＦｃ含有融合タンパク質である。

抗体の酵素消化
それらの高アフィニティー標的結合により、Ｆａｂは、例えば毒素の抱合のため、若しくはリポソームのようなより複雑な構造に埋め込むための理想的ターゲッティング部分もまた提供する。被包化された薬物を運搬する長く循環する脂質小胞に対する増強として、標的を定めたすなわち免疫リポソームは、正常細胞を容赦する一方で疾患に罹ったすなわち病的な組織への有効成分のより正確な送達を可能にしてそれにより副作用を低減すると期待される。治療的リポソームのターゲッティング部分としてのＩｇＧおよびＦａｂの使用は、米国特許第４９５７７３５号明細書およびＭａｒｕｙａｍａら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２３４：７４−８０に開示されている。

パパインは、反応の間にＬ−システインが存在するか若しくは非存在であるかに依存して、ＩｇＧ抗体をそれぞれＦａｂ若しくはＦ（ａｂ’）２いずれかのフラグメントに消化するのに使用されているスルフヒドリルプロテアーゼである。長時間の処理若しくは過剰量のパパインは、典型的にＦｃドメインの過剰消化をもたらすとは言え、Ｆａｂドメインはしばしばパパインでの過剰消化に抵抗性のまま留まる。これは、Ｆｃドメインが付加的な（二次的）パパイン切断部位を含有するためである（図１）。ヒスチジン残基は、システインの存在下でパパイン消化を実施する場合にアブシキシマブのＣ末端位置にある。

ヒトＩｇＧ１： A-E-P-K-S-C-D-K-T-H-T-C-P-P-C-P-A-P-E-L-L-G-G
ヒトＩｇＧ２： C-P-P -L-K-E-C-P-P-C-P-A-P-P-_-V-A-G
ヒトＩｇＧ３： C-D-T-P-P-P-C-P-R-P-C-P-A-P-E-L-L-G
ヒトＩｇＧ４： S-K-Y-G-P-P-C-P-S-C-P-A-P

パパインは工業上有用な酵素である一方、それは、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）（パパイヤ科（Ｃａｒｉｃａｃｅａｅ）スピーシーズ）の未熟果実および葉から元
は単離された植物起源のものである。工業上有用な哺乳動物酵素はペプシンである。ペプシンは、それが摂食後に胃の管腔に分泌される胃液の正常な一成分であるため、低ｐＨで自己活性化されかつ活性である。低レベルの前駆体酵素ペプシノーゲンは血清中で見出され得るが、しかし、活性化および活性は酸依存性であるため、循環抗体に生理学的に関連しない。ペプシンはヒトＩｇＧを下部のヒンジ（ｌｏｗｅｒ ｈｉｎｇｅ）中のロイシン_２３４−ロイシン_２３５の間で切断する。この切断部位は、ジスルフィド結合を介して２本のＨ鎖を連結して抗原結合について二価であるＦ（ａｂ’）_２分子を創製する２個のシステイン残基を含有するヒンジコア（−Ｃ−Ｐ−Ｐ−Ｃ−）から下流にある。

下ヒンジ／ＣＨ２領域Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｖ−Ｆは、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−１２（それぞれについてＰ−Ａ−Ｐ^＊Ｅ−Ｌ−Ｌ−Ｇ）ならびにペプシンおよびＭＭＰ−７（それぞれについてＰ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｌ^＊Ｌ−Ｇ）について切断部位が存在するドメイン内にある。加えて、生理学的に関連する酵素の一群；好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、ストロメリシン（ＭＭＰ−３）およびマクロファージエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）は異なる位置でＩｇＧを切断して、わずかに異なるＦ（ａｂ’）_２、ＦａｂおよびＦｃフラグメントを生成する（図３）。

Ｆｃのグリコシル化のレベルが前記抗体の酵素的分解に対する感受性を変えて前記抗体の製造工程および生物学的作用の多様な局面の調節をもたらすことが、予期せぬことに見出された。より具体的には、これらの実験の経過中に、グリコシル化ＡｂのＦｃが、脱グリコシル化、アグリコシル化若しくは非グリコシル化Ａｂのものよりパパイン消化に対しより抵抗性であることが発見された。実質的に脱グリコシル化、アグリコシル化若しくは非グリコシル化されたは、実際のかつ／若しくは潜在的グリコシル化部位の大部分が（グリカンで）占有されていない、すなわちグリコシル化されていないことを意味している。

本発明は、ＦｃのＣＨ２ドメインのグリコシル化を変えることによるＦｃ含有分子の特性の制御方法、および該変えられたＦｃ含有分子の使用をさらに含んでなる。

Ｆｃ含有部分中のグリカンの存在若しくは非存在は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ受容体の１種若しくはそれ以上に対するアフィニティー、ＡＤＣＣ活性、マクロファージ若しくは単球活性化、ならびに血清半減期に影響を及ぼす（Ｌｉｆｅｌｙら、Ｊｅｆｆｒｅｉｓ、およびＷｒｉｇｈｔとＭｏｒｒｉｓｏｎ、上記）。従って、タンパク質分解性分解はグリコシル化の尺度であり、かつ、グリコシル化はＩｇＧクラス抗体の二次機能に対する要件であるため、タンパク質分解に対する感受性は前記ＩｇＧクラス抗体の前述された機能のマーカーとなる。例えば、シアル酸は生理学的ｐＨで正味の負の電荷を有し、そして従ってＦｃ結合した炭水化物中のシアル酸の存在は、ＣＨ２ドメインの三次元構造およびこれゆえにコンホメーションを変え、そしてそれによりタンパク質分解酵素によるＦｃの到達可能性に影響を及ぼすと期待されうる。従って、ＣＨ２ドメインに結合されたオリゴ糖のシアル酸含量は、タンパク質分解の感受性の決定子であり、そして、タンパク質分解性切断速度はＩｇＧ若しくは他のＦｃ含有タンパク質のシアル酸含量の尺度である。

Ｆｃ含有タンパク質のグリコフォームの濃縮
グリカン含有率が異なる特定のＦｃ含有タンパク質の下位ロットを製造することへの１アプローチは、グリコシル化およびアグリコシル化双方の分子を包含する不均質なＦｃオリゴ糖とＦｃ含有タンパク質調製物を一緒にし、そして、例えば、シアリル化およびアシアリル化オリゴ糖に対する差別的アフィニティーを有する固定されたレクチンを含有するカラムにそれを通すことである。結合しない通過物（Ｔ、ｔｈｒｏｕｇｈ）すなわちカラム未結合画分を結合画分（Ｂ、ｂｏｕｎｄ）から分離し得、後者は溶出緩衝液がカラムを通過する間に収集される。弱結合画分すなわちカラム停滞画分（Ｒ、ｒｅｔａｒｄｅｄ）
を、例えば、元のサンプル緩衝液でのカラムの継続的洗浄の間に溶離するＦｃ含有タンパク質を収集することにより別個に収集することもまた可能でありうる。使用されるレクチンに依存して、結合画分は、非結合画分より高い糖、例えばシアル酸含量、従ってオリゴ糖含量を有することが期待される。

シアリル化若しくはアシアリル化Ｆｃ含有タンパク質について濃縮しうるレクチンの例は、末端シアル酸をもつオリゴ糖を特異的に結合するイヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）からのレクチン（ＭＡＡ）、および末端シアル酸若しくは末端Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）いずれかをもつオリゴ糖を特異的に結合するレクチン、コムギ胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）である。別の例は、末端ガラクトースをもつオリゴ糖を結合するレクチン、リシンＩ（ＲＣＡ）である。後者の例では、非結合通過画分がシアリル化Ｆｃ含有分子について濃縮されうる。当該技術分野で既知の他のレクチンはＶｅｃｔｏｒ ｌａｂｓおよびＥＹ ｌａｂｓにより提供されるものを包含する。

Ｆｃ含有タンパク質の酵素的改変
グリカン含有率が異なるＦｃ含有タンパク質の下位ロットを製造するための代替の一アプローチは、Ｆｃ含有タンパク質調製物の一部分を、フコシダーゼ若しくはシアリダーゼ酵素のようなサッカラーゼで処理してそれにより特定の糖残基、例えばフコース若しくはシアル酸を除去することである。生じるアフコシル化若しくはアシアリル化物質を、生物学的活性の差違について、元の部分的フコシル化若しくはシアリル化物質と比較し得る。

Ｆｃ領域への糖の付加はｉｎ ｖｉｔｒｏグリコシル化法を使用してもまた達成し得る。グリコシルトランスフェラーゼはもちろんオリゴ糖を合成するように機能する。それらは優れた立体化学および位置化学の配置をもつ特定の生成物を生じる。グリコシル残基の転移はオリゴ糖若しくは多糖の伸長若しくは合成をもたらす。シアリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼなどを包含する多数のグリコシルトランスフェラーゼ型が記述されている。

本発明で有用であるグリコシルトランスフェラーゼは、例えば、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）若しくは他の細菌供給源からのもの、ならびに、ラット、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、ヒトおよび昆虫ならびにウイルス供給源からのもののような、α−シアリルトランスフェラーゼ、α−グルコシルトランスフェラーゼ、α−ガラクトシルトランスフェラーゼ、α−フコシル−トランスフェラーゼ、α−マンノシルトランスフェラーゼ、α−キシロシルトランスフェラーゼ、α−Ｎ−アセチルへキソサミニルトランスフェラーゼ、β−シアリルトランスフェラーゼ、β−グルコシルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β−フコシルトランスフェラーゼ、β−マンノシルトランスフェラーゼ、β−キシロシルトランスフェラーゼおよびβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニルトランスフェラーゼを包含する。好ましくは、グリコシルトランスフェラーゼは、膜結合ドメインが欠失されているグリコシルトランスフェラーゼ酵素の短縮バリアントである。

例示的ガラクトシルトランスフェラーゼは、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．１５１、例えばＤａｂｋｏｗｓｋｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．２５：２９２１（１９９３）およびＹａｍａｍｏｔｏら Ｎａｔｕｒｅ ３４５：２２９−２３３（１９９０）を参照されたい）、ならびにα（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．３８）を包含する。シアリルトランスフェラーゼのような他のグリコシルトランスフェラーゼを使用し得る。

しばしばシアリルトランスフェラーゼと称されるα（２，３）シアリルトランスフェラーゼを、シアリルラクトース若しくはより高次の構造の製造で使用し得る。この酵素は、２種の糖の間のα結合の形成を伴いＣＭＰ−シアル酸からシアル酸（ＮｅｕＡｃ）をＧａｌ残基に転移する。糖間の結合（連結）はＮｅｕＡｃの２位とＧａｌの３位の間である。α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．９９．６）と称される例示的一α（２，３）シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸をＧａｌβ１→３Ｇｌｃ二糖若しくは配糖体の非還元末端Ｇａｌに転移する。Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｉｊｎｄｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５６：３１５９（１９８１）、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７：１３８４５（１９８２）およびＷｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：２１０１１（１９９２）を参照されたい。別の例示的α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．９９．４）は、シアル酸を二糖若しくは配糖体の非還元末端Ｇａｌに転移する。Ｒｅａｒｉｃｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５４：４４４４（１９７９）およびＧｉｌｌｅｓｐｉｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：２１００４（１９９２）を参照されたい。さらなる例示的酵素はＧａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃ α−２，６シアリルトランスフェラーゼ（Ｋｕｒｏｓａｗａら Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：３７５−３８１（１９９４）を参照されたい）を包含する。

本発明のオリゴ糖の製造においてとりわけ有用な他のグルコシルトランスフェラーゼは、α（１，２）マンノシルトランスフェラーゼ、α（１，３）マンノシルトランスフェラーゼ、β（１，４）マンノシルトランスフェラーゼ、Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ合成酵素、ＯＣｈ１およびＰｍｔ１を包含するマンノシルトランスフェラーゼである。

なお他のグルコシルトランスフェラーゼは、α（１，３）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β（１，４）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｎａｇａｔａら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２０８２−１２０８９（１９９２）およびＳｍｉｔｈら Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６９：１５１６２（１９９４））ならびにポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｈｏｍａら Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６８：１２６０９（１９９３））を包含するＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼを包含する。適するＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼは、ＧｎＴＩ（２．４．１．１０１、Ｈｕｌｌら、ＢＢＲＣ １７６：６０８（１９９１））、ＧｎＴＩＩおよびＧｎＴＩＩＩ（Ｉｈａｒａら Ｊ．Ｂｉｏｌｃｈｅｍ．１１３：６９２（１９９３））、ＧｎＴＶ（Ｓｈｏｒｅｉｂａｎら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５３８１（１９９３））を包含する。

該方法が商業的スケールで実施されるべきである態様について、グリコシルトランスフェラーゼを支持体に固定することが有利であり得る。この固定は、生成物のバッチからの酵素の除去および該酵素のその後の再使用を容易にする。グリコシルトランスフェラーゼの固定は、例えば、トランスフェラーゼをその膜結合ドメインから取り出すこと、およびその場所にセルロース結合ドメインを結合することにより達成し得る。当業者は、他の固定方法もまた使用し得かつ入手可能な文献に記述されていることを理解するであろう。

アクセプター基質は、本質的に、特定のグリコシルトランスフェラーゼがそれに対する特異性を表す末端糖残基を有するいかなる単糖若しくはオリゴ糖でもあり得るため、基質はその非還元端の位置で置換されうる。従って、配糖体アクセプターは単糖、オリゴ糖、蛍光標識した糖、若しくはアミノグリコシド抗生物質、ガングリオシドのような糖誘導体、または抗体および他のＦｃ含有タンパク質を包含する糖タンパク質でありうる。好ましい態様の一群において、配糖体アクセプターは、オリゴ糖、好ましくはＧａｌβ（１−３）ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ（１−３）ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ（１−４）ＧａｌＮＡｃ、Ｍａｎα（１，３）Ｍａｎ、Ｍａｎα（１，６）Ｍａ
ｎ若しくはＧａｌＮＡｃβ（１−４）−マンノースである。とりわけ好ましい一態様において、オリゴ糖アクセプターはＦｃ含有タンパク質のＣＨ２ドメインに結合されている。

活性化された糖基質、すなわち糖−ヌクレオシドリン酸の使用は、グリコトランスフェラーゼ反応と同時に再生反応（再利用系としてもまた知られる）を使用することのいずれかにより回避し得る。例えば、例えば米国特許第６，０３０，８１５号明細書に教示されるとおり、ＣＭＰ−シアル酸再利用系は、それがα（２，３）シアリルトランスフェラーゼの存在下でシアリルトランスフェラーゼアクセプターと反応してシアリル糖を形成する際に、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素を利用してＣＭＰ−シアル酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を補給する。本発明で有用なＣＭＰ−シアル酸再生系は、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、ヌクレオシド三リン酸（例えばアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、リン酸ドナー（例えばホスホエノールピルビン酸若しくはアセチルリン酸）、リン酸をリン酸ドナーからヌクレオシド二リン酸に転移することが可能なキナーゼ（例えばピルビン酸キナーゼ若しくは酢酸キナーゼ）、および末端リン酸をヌクレオシド三リン酸からＣＭＰに転移することが可能なヌクレオシド一リン酸キナーゼ（例えばミオキナーゼ）を含んでなる。α（２，３）シアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−シアル酸合成酵素は、活性化されたシアル酸の除去が合成の前進速度を維持するようにはたらくため、ＣＭＰ−シアル酸再生系の一部としてもまた見ることができる。改変されたＣＭＰ−シアル酸合成酵素の酵素の遺伝子を含んでなるファージミドを使用するシアリル化手順でのシアル酸化合物の合成および使用は、１９９２年１０月１日公開の国際特許出願第ＷＯ ９２／１６６４０号明細書に開示されている。

オリゴ糖の代替の一製造方法は、米国特許第５，９５２，２０３号明細書に教示されるとおり、グリコシルトランスフェラーゼ、および、ドナー糖としての糖ヌクレオチドの必要性を未然に防ぐドナー糖としての活性化されたグリコシル誘導体の使用による。活性化グリコシル誘導体は、高価な糖ヌクレオチド、通常は、ヌクレオチドリン酸が糖の１位にα結合されているヌクレオチド二リン酸糖若しくはヌクレオチド一リン酸糖である天然に存在する基質に対する代替として作用する。

有用である活性化された配糖体誘導体は、例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ、トシル酸エステル、メシル酸エステル、トリフレートエステルなどのような活性化された脱離基を包含する。活性化された配糖体誘導体の好ましい態様は、フッ化グリコシルおよびグリコシルメシレートを包含し、フッ化グリコシルがとりわけ好ましい。フッ化グリコシルのなかで、フッ化α−ガラクトシル、フッ化α−マンノシル、フッ化α−グルコシル、フッ化α−フコシル、フッ化α−キシロシル、フッ化α−シアリル、フッ化α−Ｎ−アセチルグルコサミニル、フッ化α−Ｎ−アセチルガラクトサミニル、フッ化β−ガラクトシル、フッ化β−マンノシル、フッ化β−グルコシル、フッ化β−フコシル、フッ化β−キシロシル、フッ化β−シアリル、フッ化β−Ｎ−アセチルグルコサミニルおよびフッ化β−Ｎ−アセチルガラクトサミニルが最も好ましい。

フッ化グリコシルは、最初に糖をアセチル化すること、および次にそれをＨＦ／ピリジンで処理することにより、遊離糖から製造し得る。アセチル化したフッ化グリコシルは、メタノール中弱（触媒的）塩基（例えばＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ）との反応により脱保護しうる。加えて、多くのフッ化グリコシルが商業的に入手可能である。他の活性化されたグリコシル誘導体は、当業者に既知の慣習的方法を使用して製造し得る。例えば、グリコシルメシレートは、完全にベンジル化したヘミアセタールの形態の糖の塩化メシルでの処理、次いでベンジル基を除去するための触媒的水素化により製造し得る。

該反応のさらなる一成分は触媒量のヌクレオシドリン酸若しくはそのアナログである。本発明での使用に適するヌクレオシド一リン酸は、例えば、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ
）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、イノシン一リン酸（ＩＭＰ）およびチミジン一リン酸（ＴＭＰ）を包含する。本発明による使用に適するヌクレオシド三リン酸は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、イノシン三リン酸（ＩＴＰ）およびチミジン三リン酸（ＴＴＰ）を包含する。好ましいヌクレオシド三リン酸はＵＴＰである。好ましくは、ヌクレオシドリン酸はヌクレオシド二リン酸、例えばアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、イノシン二リン酸（ＩＤＰ）およびチミジン二リン酸（ＴＤＰ）である。好ましいヌクレオシド二リン酸はＵＤＰである。上に示されたとおり、本発明はヌクレオシドリン酸のアナログでもまた実施し得る。適するアナログは、例えばヌクレオシド硫酸およびスルホン酸を包含する。なお他のアナログは単純なリン酸例えばピロリン酸を包含する。

ヒドロキシル化された形態のシアル酸が優位を占める（ＮＧＮＡ）例えばマウス細胞中で産生される組換えタンパク質の一改変手順は、タンパク質をシアリダーゼで処理してＮＧＮＡ型シアル酸を除去すること、次いで試薬ＵＤＰ−Ｇａｌおよびβ１，４Ｇａｌトランスフェラーゼを使用して高度に均質なＧ２グリコフォームを生じる酵素的ガラクトシル化である。調製物をその後、場合によっては、高度に均質なＧ２Ｓ２グリコフォームを生じるために試薬ＣＭＰ−ＮＡＮＡおよびα−２，３シアリルトランスフェラーゼで処理し得る。

本発明の目的上、グリコフォームについて実質的に均質は、そのグリコフォームの約８５％若しくはそれ以上、および好ましくはそのグリコフォームの約９５％若しくはそれ以上を意味している。

シアル酸バリアントの構造の特徴付け
シアル酸バリアントを含有するオリゴ糖の構造の特徴付けのため、抗体調製物を包含する糖タンパク質調製物をペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦで処理してＮ結合したオリゴ糖を遊離させた。酵素ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ）はアスパラギンに結合したオリゴ糖を切断する。遊離されたオリゴ糖を、記述されるとおり（Ａｎｕｍｕｌａ，Ｋ．Ｒ．とＤｈｕｍｅ ＳＴ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９９８ Ｊｕｌ；８（７）：６８５−９４を参照されたい）アントラニル酸（２−アミノ安息香酸）で蛍光標識し、精製しかつＨＰＬＣにより分析する。あるいは、遊離されたオリゴ糖を、本明細書に記述されるところのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、若しくはＥｓＩ−ＭＳにかけることができる。これらの方法により、Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ２Ｓ１およびＧ２Ｓ２のような多様な異なる分子量として分離されるオリゴ糖を検出かつ定量し得る。

グリコフォームバリアントの生物学的特徴付け
Ｆｃ含有タンパク質を、数種の公知のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより機能性について比較し得る。とりわけ、Ｆｃγ受容体のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩファミリーのメンバーに対するアフィニティーは興味深い。これらの測定は、組換えの可溶性の形態の受容体若しくは細胞と会合した形態の受容体を使用して行い得る。加えて、ＦｃＲｎ（ＩｇＧの延長された循環半減期の原因である受容体）に対するアフィニティーは、例えば組換えの可溶性ＦｃＲｎを使用するＢＩＡｃｏｒｅにより測定し得る。ＡＤＣＣアッセイおよびＣＤＣアッセイのような細胞に基づく機能アッセイは、特定のバリアント構造のありそうな機能の結果への洞察を提供する。一態様において、ＡＤＣＣアッセイは、ＮＫ細胞を一次エフェクター細胞にならせるよう構成され、それによりＦｃγＲＩＩＩＡ受容体に対する機能の影響を反映する。食作用アッセイもまた、スーパーオキシド若しくは炎症メディエーター遊離のような細胞応答を測定するアッセイがし得るように、多様なバリアントの免疫エフェクター機能を比較するのに使用しうる。例えば、マウスでの
Ｔ細胞活性化、すなわちＦｃγ受容体のようなＦｃドメインを結合する特異的リガンドに依存する活性を測定するために抗ＣＤ３抗体のバリアントを使用する場合のような、ｉｎ
ｖｉｖｏモデルを同様に使用し得る。

タンパク質製造方法
Ｆｃ含有タンパク質の製造に関与する多様な方法がＦｃオリゴ糖構造に影響し得る。一例において、上昇された熱処理（例えば５６℃３０分間）に以前にかけられなかった血清、例えばウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下で、Ｆｃ含有タンパク質を分泌する宿主細胞を培養する。これは、それらの細胞から分泌されるＦｃ含有タンパク質からシアル酸を除去し得る活性のシアリダーゼ酵素の血清中での天然の存在により、シアル酸を含有しないか若しくは非常に少量のシアル酸を含有するＦｃ含有タンパク質をもたらし得る。別の態様において、より高若しくは低レベルのグリコシル化若しくはグリコシル化バリアントをＦｃ含有タンパク質が有するような、上昇された熱処理にかけられてそれによりシアリダーゼ酵素を不活性化させた血清の存在下、または血清若しくはシアリダーゼ酵素を含有しうる他の培地成分の非存在下のいずれかで、Ｆｃ含有タンパク質を分泌する細胞を培養する。

別の態様において、至適のグリカン含有率に好都合であることができる、Ｆｃ含有タンパク質を精製かつさらに加工するのに使用する条件が確立されている。一態様において、該条件は、最大若しくは最小のオリゴ糖含量を生じるか、または、発現されたＦｃ含有ポリペプチドの優勢なグリコフォームへの変換を引き起こす。例えば、シアル酸は酸不安定性であるため、プロテインＡクロマトグラフィーカラムからの溶出若しくはウイルス不活性化の試みの後のような低ｐＨ環境への長時間の曝露は、シアル酸含量の低下につながりうる。

宿主細胞の選択若しくは宿主細胞の工作
本明細書に記述されるとおり、組換えＦｃ含有タンパク質若しくはモノクローナル抗体の発現に選ばれる宿主細胞は、免疫グロブリンＣＨ２ドメイン中のタンパク質を装飾するオリゴ糖部分の組成の変動を制限なしに包含する最終組成への重要な寄与因子である。従って、本発明の一局面は、所望の治療的タンパク質を発現する産生細胞の使用および／若しくは開発のための適切な宿主細胞の選択を伴う。

シアル酸含量が制御される一態様において、宿主細胞は、シアリルトランスフェラーゼが天然に欠損している、すなわちそれを欠く細胞である。別の態様において、宿主細胞はシアリルトランスフェラーゼを欠くように遺伝子的に改変されている。さらなる一態様において、宿主細胞は、低下された若しくは検出不可能なレベルのシアリルトランスフェラーゼを発現するよう選択された誘導体宿主細胞株である。なお別の態様において、宿主細胞は、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（シアル酸を抗体に転移するためにシアリルトランスフェラーゼにより使用されるシアル酸の供給源であるＣＭＰ−シアル酸の形成を触媒する酵素）を天然に欠くか、若しくはそれを欠くように遺伝子的に改変されている。関連する一態様において、宿主細胞は、ピルビン酸合成酵素（ピルビン酸からシアル酸を形成する酵素）を天然に欠くことができるか、若しくはそれを欠くように遺伝子的に改変されている。

付加的な一態様において、宿主細胞は、前記細胞で発現される抗体がガラクトースを欠くような、ガラクトシルトランスフェラーゼを天然に欠くことができるか、若しくはそれを欠くように遺伝子的に改変されている。ガラクトースなしでは、シアル酸は結合されることができない。別個の一態様において、宿主細胞の細胞は、産生の間に抗体からシアル酸を除去するシアリダーゼ酵素を天然に過剰発現しうるか、若しくは過剰発現するように遺伝子的に改変されうる。こうしたシアリダーゼ酵素は、抗体が分泌される前に細胞内で
抗体に作用しうるか、若しくは培地に分泌されかつ培地に既に分泌された抗体に作用することができ、また、ガラクターゼをさらに含有しうる。変えられたグリコシラーゼをもちかつ変えられた炭水化物組成をもつ糖タンパク質を発現する細胞株の選択方法は記述されている（ＲｉｐｋａとＳｔａｎｌｅｙ、１９８６．Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｇｅｎ １２：５１−６２；第ＵＳ２００４／０１３２１４０号明細書）。高められたＡＤＣＣをもたらす変えられたグリコシル化パターンをもつ抗体を産生させるための宿主細胞の工作方法は、例えば米国特許第６，６０２，８６４号明細書に教示されており、ここで、宿主細胞は最低１種の糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ、とりわけβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）をコードする核酸を持つ。

宿主細胞のグリコシルトランスフェラーゼの操作により宿主細胞のグリコシル化特性を遺伝子的に工作することへの他のアプローチは、第ＥＰ１，１７６，１９５号明細書に教示されるところの活性（具体的にはα１，６フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８遺伝子産物））を除外若しくは抑制することを伴う。上で引用された特定の例以外で宿主細胞の工作方法を実施することが当業者に既知であるとみられる。さらに、工作される宿主細胞は哺乳動物起源のものでありうるか、あるいは、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫若しくは植物細胞、またはそれらのいずれかの誘導体、不死化若しくは形質転換細胞から選択しうる。

別の態様において、オリゴ糖結合に必要とされる酵素の活性の抑制若しくは除外方法は、ｓｉＲＮＡ、遺伝子ノックアウトの使用によるような遺伝子サイレンシング、または結合しかつその酵素活性を阻害する酵素に特異的な細胞内Ａｂ若しくはペプチドの共発現によるような酵素阻害剤の付加、および他の既知の遺伝子工学技術よりなる群から選択しうる。別の態様において、糖結合を阻害する酵素、若しくは既に結合されている糖を除去するサッカリダーゼ酵素の発現若しくは活性を高める方法は、組換え酵素遺伝子でのトランスフェクション、酵素ＲＮＡの合成を高める転写因子のトランスフェクション、および酵素ＲＮＡの安定性を高める遺伝子修飾（全部、精製される生成物中でより低レベルのシアル酸をもたらすシアリダーゼのような酵素の高められた活性につながる）よりなる群から選択しうる。別の態様において、特定の酵素阻害剤を細胞培地に添加しうる。あるいは、宿主細胞は、ポリペプチドをグリコシル化することが不可能な種若しくは生物体、例えば、大腸菌 スピーシーズ（Ｅ．ｃｏｌｉ ｓｐｐ．）、クレブシエラ スピーシーズ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．）若しくはシュードモナス スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）のような、および天然の若しくは工作されたそれらの原核生物細胞若しくは生物体から選択しうる。

抗体
本出願に記述される抗体は、限定されるものでないがヒト、マウス、ウサギ、ラット、げっ歯類、霊長類を挙げることができるいずれかの哺乳動物若しくはそれらのいずれかの組み合わせを包含し得るか若しくはそれらに由来し得、そして、単離されたヒト、霊長類、げっ歯類、哺乳動物、キメラ、ヒト化および／若しくはＣＤＲ移植抗体、免疫グロブリン、切断生成物、ならびにそれらの他の指定される部分およびバリアントを包含する。本発明は、当該技術分野で既知であるものと組合せられるところの、一緒に本明細書に記述されるところの、抗体をコードする若しくは相補的核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、調製物、装置、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、ならびにそれらの作成および使用方法にもまた関する。

本明細書に記述される抗体若しくはＦｃ融合タンパク質は、当該技術分野で公知のいくつかの方法で派生させ得る。一局面において、抗体は、マウスを標的ペプチドで免疫する
ことにより製造されるハイブリドーマから便宜的に得られる。抗体は従って、当該技術分野で公知のハイブリドーマ技術（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク（１９８７−２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）；ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク（１９９４−２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク州ニューヨーク（１９９７−２００１）（それぞれそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）のいずれを使用しても得ることができる。

該抗体若しくはＦｃ融合タンパク質またはそれらの成分およびドメインは、こうしたドメイン若しくは成分のライブラリー、例えばファージライブラリーから選択することからもまた得ることができる。ファージライブラリーは、無作為オリゴヌクレオチドのライブラリー、または免疫した動物若しくはヒトのＢ細胞からのような目的の配列を含有するポリヌクレオチドのライブラリー（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５−１３１７）を挿入することにより創製し得る。抗体ファージライブラリーは、１ファージ中にＨおよびＬ鎖可変領域対を含有し、一本鎖Ｆｖフラグメント若しくはＦａｂフラグメントの発現を可能にする（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら ２０００、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１（８）３７１−８）。ファージミドライブラリーの多様性を操作して、付加的な所望のヒトモノクローナル抗体を製造しかつその後同定するようにライブラリーのモノクローナル抗体の免疫特異性を増大しかつ／若しくは変えることができる。例えば、Ｈ鎖およびＬ鎖免疫グロブリン分子をコードする遺伝子を、集成された免疫グロブリン分子中で新たなＨＬ対を創製するように無作為に混合（シャッフル）し得る。加えて、ＨおよびＬ鎖をコードする遺伝子のいずれか若しくは双方を、免疫グロブリンポリペプチドの可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）中で突然変異誘発し得、そしてその後、所望のアフィニティーおよび中和能力についてスクリーニングし得る。抗体ライブラリーは、１種若しくはそれ以上のヒト枠組み配列を選択すること、およびヒト抗体レパートリー由来のＣＤＲカセットの集合物を導入することにより、または設計された変動によってもまた合成で創製し得る（Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒとｖｏｎ Ｒｕｄｅｎ ２０００、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３：５９８−６０２）。多様性の位置はＣＤＲに制限されないが、しかし、可変領域の枠組みセグメントもまた包含し得るか、若しくはペプチドのような抗体可変領域以外を包含しうる。

抗体可変領域以外を包含しうる標的結合成分の他のライブラリーは、リボソームディスプレイ、酵母ディスプレイおよび細菌ディスプレイである。リボソームディスプレイは、タンパク質をＲＮＡに結合されたまま保ちつつｍＲＮＡのそれらの同族のタンパク質への翻訳方法である。核酸のコーディング配列はＲＴ−ＰＣＲにより回収される（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．ら １９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１、９０２２）。酵母ディスプレイは、膜結合α−アグルチニン酵母接着受容体ａｇａ１およびａｇａ２（接合型系の一部）（Ｂｒｏｄｅｒら １９９７．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５：５５３−７）の融合タンパク質の構築に基づく。細菌ディスプレイは、細胞膜若しくは細胞壁と会合する輸送された細菌タンパク質への標的の融合に基づく（ＣｈｅｎとＧｅｏｒｇｉｏｕ ２００２．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ、７９：４９６−５０３）。

ハイブリドーマ技術に比較して、ファージおよび他の抗体ディスプレイ法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、かつ、抗原に対する宿主の影響の可能性の制限なしに、若しくはその逆で、抗原標的に対する選択を操作する機会を提供する。

ペプチド若しくは抗体が検出可能な若しくは回収可能な量で発現されるようなｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｓｉｔｕの条件下で、コードする核酸を翻訳することを含んでなる、抗体若しくはＦｃ融合タンパク質の製造方法もまた記述される。

本発明を概説した一方、本発明の態様は以下の実施例にさらに開示されるであろう。

ＩｇＧからのＦｃドメインの単離
パパインはＳｉｇｍａから得、また、ＰＮＧアーゼＦ（ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ）はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから得た。シナピン酸はＦｌｕｋａから得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析は、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ生体分光法ワークステーション（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用して実施した。

抗体サンプルは、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．０中でＰＮＧアーゼＦで処理することにより脱グリコシル化した。脱グリコシル化抗体サンプルをプロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐプロテインＡカートリッジはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得た）で精製し、そして純度についてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより分析した。

抗体サンプル（約１ｍｇ／ｍｌの、脱グリコシル化前および後）を、２ｍＭ Ｌ−システインを含有する２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．０中でパパイン（１：５０、ｗ／ｗ）で処理し、そしてアリコートを固定された時間間隔（０、１５、３０、６０、９０分、次いで２、３、４、５、６、８および２４時間）に抜き取った。アリコート（約２μｌ）を、２μｌのマトリックス溶液（マトリックス溶液は、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水中５０％アセトニトリル１．０ｍｌに１０ｍｇシナピン酸を溶解することにより調製した）と即座に混合し、そしてこの溶液の２μｌをＭＡＬＤＩ標的プレートに負荷しかつ分析前に風乾させた。

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳデータは、ＰＮＧアーゼＦでの天然の条件下でのＩｇＧの脱グリコシル化が完全かつ非破壊的であることを示す（図４Ａ−Ｇを参照されたい）。

固定された時間間隔に抜き取ったアリコートのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析は、脱グリコシル化ＩｇＧの大部分がパパインにより１時間以内に消化された一方、対照ＩｇＧ（グリコシル化）の完全な消化が４時間以上かかることを示唆する。脱グリコシル化ＩｇＧのＦｃフラグメント（１０ＫＤａおよび２３．７ＫＤａの）は、３０分でパパインで消化されるのが観察され、そして、脱グリコシル化Ｆｃの大部分は４時間以内にフラグメントに消化された。脱グリコシル化ＩｇＧのＦｃフラグメントは、１：５０（ｗ／ｗ）の酵素対基質比でのパパインでの消化のわずか４時間後に観察され、そしてグリコシル化Ｆｃを１０ＫＤａおよび２３．７ＫＤａのより小さいフラグメントに完全に転化するのに２４時間以上必要とする。

多様なＩｇＧ抗体からＦｃフラグメントを単離するための試みの間に、ＣＨ２ドメイングリカンの事前の除去が、Ｆｃドメインのパパイン媒介性の分解の速度を増大させて、脱グリコシル化（すなわちアグリコシル化）ＩｇＧから無傷のＦｃを得ることを困難にしたことが観察された。ＩｇＧ抗体および精製したＦｃドメイン双方のグリコシル化および脱グリコシル化バージョンを比較するその後の時間経過実験は、双方の場合で、脱グリコシ
ル化分子中のＦｃの分解の速度がそれらのグリコシル化対照物に比較して少なくとも４〜８時間より速かったことを示した。これらの結果は、ＣＨ２ドメインのグリカンの存在がＦｃドメインのパパイン媒介性の分解に対する抵抗性を増大させることを示す。それは、グリコシル化を欠くＩｇＧが規定されたＦｃ構造を有するようにどのように思われずかつＦｃ受容体をどのように結合しないかを考えれば、パパイン感受性が適正なＦｃ構造を評価する付加的な一手段を構成しうることもまた示唆する。

均質なグリコフォームのパパイン消化
それらのグリコシル化パターンに関して実質的に均質な抗体調製物のパパイン消化のパラメータを評価するため、抗体サンプルを酵素的に改変して、下述されるとおり試験するためのこうした調製物を製造する。

精製した抗体サンプルを、酵素的方法を介してガラクトシル化するため、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ミズーリ州セントルイス）から得たウシβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（β１，４ＧＴ）およびＵＤＰ−Ｇａｌを抗体サンプルに添加する。組換えラット肝α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（α２，３ＳＴ）、組換えα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α１，３ＧＴ）およびＣＭＰ−ＳｉａをＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（カリフォルニア州サンディエゴ）から得た。ＰＮＧアーゼＦはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（マサチューセッツ州ビバリー）若しくはＰｒｏｚｙｍｅ（カリフォルニア州サンレアンドロ）若しくはＳｅｌｅｃｔｉｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア州プレザントヒル）から得た。肺炎双球菌（Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からのβ−ガラクトシダーゼおよびβ−グルコサミニダーゼはＰｒｏＺｙｍｅ若しくはＳｅｌｅｃｔｉｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓいずれかから得た。ウシ腎からのβ−ガラクトシダーゼおよび全部の他の酵素はＰｒｏＺｙｍｅ若しくはＳｅｌｅｃｔｉｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓいずれかからであった。ＮＡＰ−５およびＨｉＴｒａｐプロテインＡカラムはＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）からであった。全部の他の試薬は分析等級のものであった。

これらの分析のための試験抗体は、トランスフェクトしたＳｐ２／０マウス骨髄腫細胞中で発現されたヒトＩｇＧ１およびκ定常領域をもつモノクローナルＩｇＧ Ａｂを包含する。該Ｍａｂは、例えばヒトＴＮＦに特異的な完全にヒト若しくはマウス／ヒトキメラＭＡｂである。

完全にガラクトシル化されているがしかしシアリル化されていない二分岐構造をＧ２グリコフォームと称する。Ｇ２抗体は、１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中のＩｇＧサンプル（１．０ｍＬの緩衝液中約１０ｍｇ）を５０ミリ単位のβ１，４ＧＴ、５μｍｏｌのＵＤＰ−Ｇａｌおよび５μｍｏｌのＭｎＣｌ２に３７℃で２４時間さらすことにより調製した。酵素の別のアリコートおよびＵＤＰ−Ｇａｌを添加し、そして混合物を３７℃で追加の２４時間インキュベートした。再ガラクトシル化ＩｇＧサンプルを、ＨｉＴｒａｐプロテインＡカラムを使用して精製した。オリゴ糖をＰＮＧアーゼＦにより遊離させ、そして下述されるとおりＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳおよびＨＰＬＣにより特徴付けした。Ｍａｂの生じる調製物は０％シアル酸を含有することが見出された。

完全にシアリル化かつガラクトシル化された抗体をＧ２Ｓ２と称する。Ｇ２Ｓ２グリコフォームは、製造元の示唆されるプロトコルに従ってＮＡＰ−５カラムを使用して１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０中（若しくは１．０ｍＬの緩衝液中約１０ｍｇ）にＩｇＧサンプルをもたらすことにより作成した。この溶液に、それぞれ５０ミリ単位のβ１，４ＧＴおよびα２，３ＳＴ、ならびにそれぞれ５μｍｏｌのＵＤＰ−Ｇａｌ、ＣＭＰ−Ｓｉａ（ＮＡＮＡ異性体）およびＭｎＣｌ_２を添加した。混合物を３７℃でインキュベート
した。２４時間後に、酵素の別のアリコートをヌクレオチド糖と一緒に添加し、そして混合物を３７℃で追加の２４時間インキュベートした。Ｇ２Ｓ２グリコフォームのＩｇＧサンプルを上述されたとおり精製した。この方法を使用して、抗体調製物のシアリル化は９０ないし９８％Ｇ２Ｓ２グリコフォームに達した。

試験Ａｂを多様な方法により構造的に分析した。無傷のＩｇＧ ＡｂのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を実施するため、ＩｇＧサンプルを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．０中にもたらし、そして濃度を約１ｍｇ／ｍＬ緩衝液に調節した。約２μｌのＩｇＧ溶液を２μｌのマトリックス溶液（マトリックス溶液は、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水中５０％アセトニトリル１．０ｍｌに１０ｍｇのシナピン酸を溶解することにより調製した）と混合し、そしてこの溶液２ｍｌを標的に負荷しかつ風乾させた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳはＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ）からのＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ装置を使用して取得した。

遊離されたＦｃグリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を実施するため、ｉｎ ｖｉｔｒｏグリコシル化反応前および後のＩｇＧサンプル（約５０μｇ）を、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（５０μｌ）ｐＨ７．０中でＰＮＧアーゼＦで３７℃で４時間消化した。反応混合物を５０％酢酸（約５μｌ）で酸性化することにより消化を停止し、そしてその後、以前に記述された（Ｐａｐａｃら、１９９６；Ｐａｐａｃら、１９９８；Ｒａｊｕら、２０００）とおり、それに陽イオン交換樹脂カラムを通過させた。酸性および中性のオリゴ糖の混合物を含有するこれらのサンプルを、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ）からのＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ装置を使用して、別の場所に記述された（Ｐａｐａｃら、１９９６；Ｐａｐａｃら、１９９８；Ｒａｊｕら、２０００）とおり、陽および陰イオンモードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより分析した。

ＦｃグリカンのＨＰＬＣ分析は、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（約５０μｌ）ｐＨ７．０中でＩｇＧサンプル（５０μｇ）をＰＮＧアーゼＦで３７℃で４〜８時間消化することにより行った。遊離されたオリゴ糖のアントラニル酸（２−アミノ安息香酸）での誘導体化を、記述された（Ａｎｕｍｕｌａ ＫＲ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０００ Ｊｕｌ １５；２８３（１）：１７−２６）とおり実施した。簡潔には、メタノール中４％酢酸ナトリウム・３Ｈ_２Ｏ（ｗ／ｖ）および２％ホウ酸（ｗ／ｖ）の溶液を最初に調製した。誘導体化試薬をその後、約３０ｍｇのアントラニル酸（Ａｌｄｒｉｃｈ）および約２０ｍｇのシアノホウ水素化ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ）を１．０ｍｌのメタノール−酢酸ナトリウム−ホウ酸溶液に溶解することにより、新たに調製した。ＩｇＧ由来オリゴ糖（２０〜５０μｌの水中３ｎｍｏｌ未満）を、「Ｏ」リング付き１．６ｍｌポリプロピレン製ねじ蓋凍結バイアル中で０．１ｍｌのアントラニル酸（ＡＡ）試薬溶液と混合し、そしてきつく蓋をした。バイアルをオーブン若しくは加熱ブロック（Ｒｅａｃｔｉ−Ｔｈｅｒｍ、Ｐｉｅｒｃｅ）中８０℃で１〜２時間加熱した。バイアルを室温に冷却した後に、容量を約０．５ｍｌにもたらすためサンプルを水で希釈した。誘導体化オリゴ糖は、ＮＡＰ−５カラムを使用することにより精製した。

最低９０％Ｇ２若しくはＧ２Ｓ２グリコフォームである調製物を使用して、実施例１に記述されるところのパパイン消化実験を実施し、そして、パパインの切断速度および特異性に対するシアル酸含量の影響を示すため分析する。付加的な切断分析を、本実施例で調製したところのサンプルを使用して、他のタンパク質分解酵素を用いて実施する。

マトリックスメタロプロテイナーゼ−３を使用する抗体フラグメントの製造
メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を、組換えヒトＭＭＰを発現する細胞クローンの上清
から精製した。該酵素は、１ｍＭの酢酸４−アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ；Ｓｉｇｍａ）で３７℃で１時間で、若しくはキモトリプシンで処理することによるかのいずれかで活性化した。活性化した酵素は−７０℃で保存した。免疫グロブリン調製物（０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌ）を消化物緩衝液（１５〜６０μｇ／ｍｌ活性化ＭＭＰを含有する、１．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＣａＣｌ_２を含有する２５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）と３７℃で０〜２４時間インキュベートした。アリコートを０、１５、３０、４５、６０および１２０分、次いで３、４、５、６、８、１２および２４時間に抜き取った。アリコート（約２マイクロリットル）はマトリックス溶液（約２マイクロリットル）を伴い、そしてこの混合物２マイクロリットルをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ標的プレートに負荷し、そしてその後、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ分光計を使用してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより分析した。

精製したＦｃのタンパク質分解性切断
パパインはＳｉｇｍａから得、そしてＰＮＧアーゼＦ（ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ）はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから得た。シナピン酸はＦｌｕｋａから得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析は、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ生体分光法ワークステーション（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用して実施した。

抗体（ＩｇＧ）サンプルは、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．０中でＰＮＧアーゼＦで処理することにより脱グリコシル化した。脱グリコシル化抗体サンプルをプロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐプロテインＡカートリッジはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得た）で精製し、そして、純度についてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより分析した。ＩｇＧのＦｃフラグメントを、別の場所に記述されるとおり単離かつ精製した。

Ｆｃフラグメントサンプル（約１ｍｇ／ｍｌ、脱グリコシル化前および後）を、２ｍＭ
Ｌ−システインを含有する２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．０中パパイン（１：５０、ｗ／ｗ）で処理し、そして、アリコートを固定された時間間隔（０、１５、３０、６０、９０分、次いで２、３、４、５、６、８および２４時間）に抜き取った。アリコート（約２μｌ）を２μｌのマトリックス溶液（マトリックス溶液は、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水中５０％アセトニトリル１．０ｍｌに１０ｍｇシナピン酸を溶解することにより調製した）と即座に混合し、そしてこの溶液の２μｌをＭＡＬＤＩ標的プレートに負荷しかつ分析前に風乾させた。

グリコシル化および脱グリコシル化ＩｇＧ消化物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳデータを分析して、時間点の全部で無傷のＩｇＧおよびＦｃフラグメントのピーク面積の相対％のデータを得た（図５）。ＩｇＧサンプルについて、時間経過実験は、１５分以内の消化で脱グリコシル化ＩｇＧの７０％以上がＦａｃ、Ｆｃおよびより小さいＦｃフラグメント（ｍ／ｚ １０．５ＫＤａおよび１２ＫＤａのフラグメントの）に転化された一方、グリコシル化ＩｇＧの５０％未満がフラグメントに転化されたことを示した。６０分インキュベーション後に、脱グリコシル化ＩｇＧは検出可能でなかった一方、グリコシル化ＩｇＧのおよそ８０％がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析によりなお無傷であった。Ｆｃフラグメントについては、４時間消化後に脱グリコシル化Ｆｃフラグメントの９５％以上が１０．５および１２ＫＤａのより小さいフラグメントに転化された一方、１０％を超えないグリコシル化Ｆｃがその時間点でこれらのより小さいフラグメントに転化した。事実、グリコシル化Ｆｃのほぼ５０％が２４時間後でさえ消化されないままであった。

これらのデータは、グリコシル化ＩｇＧが脱グリコシル化ＩｇＧよりもパパイン消化に
対し有意により抵抗性であること、およびグリコシル化Ｆｃが脱グリコシル化Ｆｃよりはるかにより抵抗性であることを示す。時間経過実験は、脱グリコシル化およびグリコシル化ＩｇＧからのＦａｂフラグメントの量が同等であったこともまた示し、Ｆｃフラグメントのみが１０．５ＫＤａおよび１２ＫＤａのフラグメントへの過剰消化および転化を受けることを示唆した。

特定のグリコフォームをもつＭＡｂの製造
パパインに対する抗体の抵抗性の増大におけるオリゴ糖の役割をより良好に理解するため、均質なＧ０、Ｇ２およびＧ２Ｓ２オリゴ糖をもつＩｇＧ調製物を、ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法を使用して製造した。

Ｇ０グリコフォームの製造 均質なＧ０グリコフォームを製造するため、ＩｇＧサンプルを最初にシアリダーゼＡで処理して少量の末端シアル酸残基を除去し、次いでβ−ガラクトシダーゼで処理して末端β−ガラクトース残基を除去した。１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中のＩｇＧサンプル（１．０ｍＬ中１０ｍｇ）を、それぞれ１００ミリ単位のシアリダーゼＡ（Ａ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）およびβ−ガラクトシダーゼ（肺炎双球菌（Ｄ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））で３７℃で２４時間処理した。２４時間後に酵素の別のアリコートを添加し、そして３７℃で追加の２４時間インキュベートした。

プロテインＡカラムでの精製後に、生じるＧ０グリコフォームを無傷の質量についてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより特徴付けした（図６Ａ）。該質量スペクトルは、ｍ／ｚ １４７．７ＫＤａの一価の分子イオン、ｍ／ｚ ７３．９ＫＤａの二価の分子イオン、およびｍ／ｚ ４９．３ＫＤａの三価の分子イオンを含有した。該質量スペクトルは、レーザー脱離イオン化の間に生じられる遊離Ｌ鎖を表す２３．４ＫＤａのイオンもまた含有した。この質量スペクトルデータは、Ｆｃグリカンを均質なＧ０オリゴ糖に改変するための酵素での処理後に抗体が無傷であったことを示した。

ＰＮＧアーゼＦでＩｇＧサンプルを処理することにより遊離される改変オリゴ糖鎖を、マトリックスとしてｓＤＨＢを使用する陽性モードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（陽イオン交換カラムを使用する精製後）、およびまたＨＰＬＣ（Ａｎｕｍｕｌａ（１９９８ 上記）により記述されたところの還元的アミノ化手順を使用してアントラニル酸で誘導体化した後）によっても分析した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析は、ＧｌｃＮＡｃ残基で終端する、ナトリウム付加した（ｓｏｄｉａｔｅｄ）コアがフコシル化された複雑な二分岐オリゴ糖の分子量に対応するｍ／ｚ １４８６．８の分子イオンを示した。ＡＡ誘導体化オリゴ糖の順相ＨＰＬＣ分析は、２０．５分に溶離する単一ピークを提供し、そして、ＧｌｃＮＡｃ残基で終端する、ＡＡ標識された標準的なコアがフコシル化された複雑な二分岐オリゴ糖の溶離時間に対応し（データは示されない）、Ｇ０のＩｇＧグリコフォームサンプルが９９％以上のＧ０オリゴ糖を含有したことを示す。

Ｇ２グリコフォームの製造 ＩｇＧサンプルを最初にシアリダーゼＡで処理しかつ上述されたとおり精製した。シアリダーゼＡ処理したＩｇＧサンプル（１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中１．０ｍＬ中１０ｍｇ））を、５０ミリ単位のβ１，４ＧＴ、５μｍｏｌのＵＤＰ−Ｇａｌおよび５μｍｏｌのＭｎＣｌ２で３７℃で２４時間処理した。酵素の別のアリコートおよびＵＤＰ−Ｇａｌを添加し、そして混合物を３７℃で追加の２４時間インキュベートした。

プロテインＡカラムでの精製後に、抗体サンプルを無傷の質量についてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより分析した。質量スペクトルは、ｍ／ｚ １４８．７ＫＤａの一価の分子イオン、ｍ／ｚ ７４．２ＫＤａの二価の分子イオン、および４９．５ＫＤａの三価の分
子イオンを示した。該質量スペクトルは、レーザー脱離イオン化の間に生じられる遊離Ｌ鎖によるｍ／ｚ ２３．４ＫＤａの一価の分子イオンもまた含有した。Ｇ２グリコフォームをその後ＰＮＧアーゼＦ処理にかけてＮ結合したオリゴ糖を遊離させ、そして遊離したオリゴ糖を、マトリックスとしてｓＤＨＢを使用する陽性モードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより分析した。該質量スペクトルは、ｍ／ｚ １８１２．１に分子イオンを示し（図６Ｂ）、そしてｍ／ｚ １８１２．１のこの分子イオンは、ガラクトース残基で終端する、ナトリウム付加したコアがフコシル化された複雑な二分岐オリゴ糖の分子量に対応する。ＡＡでの誘導体化後のＰＮＧアーゼＦで遊離されたオリゴ糖の順相ＨＰＬＣ分析は単一ピークを表し、そしてこのピークの溶離時間は標準的Ｇ２オリゴ糖の溶離時間に対応し、Ｇ２グリコフォーム調製物が９９％以上のＧ２オリゴ糖をもつ無傷のＩｇＧ分子を含有したことを示す。

Ｇ２Ｓ２グリコフォームの製造 Ｇ２Ｓ２グリコフォームの製造のため、抗体サンプルを、ＵＤＰ−Ｇａｌ、ＣＭＰ−ＮＡＮＡおよびＭｎＣｌ_２の存在下にβ−ガラクトシルトランスフェラーゼおよびα２，３−シアリルトランスフェラーゼの混合物で単一工程で処理した。ＩｇＧサンプルを、製造元の示唆されるプロトコルに従ってＮＡＰ−５カラムを使用して１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中にもたらした（１．０ｍＬ中１０ｍｇ）。この溶液に、それぞれ５０ミリ単位のβ１，４ＧＴおよびα２，３ＳＴ、ならびにそれぞれ５μｍｏｌのＵＤＰ−Ｇａｌ、ＣＭＰ−ＳｉａおよびＭｎＣｌ_２を添加した。混合物を３７℃でインキュベートした。２４時間後に酵素の別のアリコートをヌクレオチド糖と一緒に添加し、そして混合物を３７℃で追加の２４時間インキュベートした。

プロテインＡカラムでの精製後の酵素処理したサンプルのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析は、ｍ／ｚ 約１４８．８ＫＤａに一価の分子イオン、ｍ／ｚ 約７４．３ＫＤａに二価の分子イオン、およびｍ／ｚ 約４９．５Ｋｄａに三価の分子イオンを示し（図６Ｃ）、抗体が無傷でありかつ酵素処理が該抗体の一次構造を変えなかったことを示唆した。ＰＮＧアーゼＦで遊離されたオリゴ糖の陰性モードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳおよびＨＰＬＣ分析（図７Ａ〜Ｄ）は、該抗体が少量のＧ２Ｓ１構造（一シアリル化構造）と一緒に８５％以上のＧ２Ｓ２グリコフォームを含有したことを示した。さらに、Ｆｃグリカンの９９％は最低１個のシアル酸残基を含有した。図７Ａは対照（Ｖｏｙａｇｅｒ Ｓｐｅｃ
＃１→ＮＦ０．７→ＮＲ（２．００）［ＢＰ＝１４８５．０、６６３６］）を示し、図７ＢはＧ２グリコフォーム（Ｖｏｙａｇｅｒ Ｓｐｅｃ ＃１→ＮＦ０．７→ＮＲ（２．００）［ＢＰ＝１８１１．４、５４０３］）を示し、図７ＣはＧ０グリコフォーム（Ｖｏｙａｇｅｒ Ｓｐｅｃ ＃１→ＮＦ０．７→ＮＦ０．７→ＮＲ（２．００）［ＢＰ＝１４８６．５、７００６］）を示し、そして図７ＤはＧ２Ｓ２グリコフォーム（陰性モード）（Ｖｏｙａｇｅｒ Ｓｐｅｃ ＃１→ＮＦ０．７［ＢＰ＝２３８５．４、２７６９］）を示す。

サイズ排除クロマトグラフィー グリカン構造のｉｎ ｖｉｔｒｏ改変前および後の抗体サンプル中に存在する凝集物の量を評価するため、Ａｂサンプルを、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。ＴＯＳＯ ＨＡＡＳ ＴＳＫ ３０００ＳＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｅｐ ＬＬＣ）７．８ｍｍ×３０ｃｍ、５μｍカラムを周囲温度で使用した。移動相はリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）であり、また、流速は０．５ｍｌ／分であった。改変ＩｇＧグリコフォーム調製物は、対照抗体のプロファイルに類似のクロマトグラフィープロファイルを表し、該改変手順がいかなる付加的な凝集および／若しくは該タンパク質の一次構造の変化も創製しなかったことを示した。

特定のグリコフォームをもつＭＡｂのパパイン消化
Ｇ０、Ｇ２およびＧ２Ｓ２グリコフォームのパパイン切断に対する相対的抵抗性を評価するため、ＩｇＧグリコフォームおよび対照サンプルを、システインの存在下３７℃でパパインで２４時間処理し、そして消化物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより分析した。

パパイン消化物の時間経過分析
対照ＩｇＧサンプルと一緒のＧ０、Ｇ２およびＧ２Ｓ２グリコフォームを１：５０の酵素対基質比のパパインで３７℃で処理した。これらの反応から、０、１５、３０、６０および９０分、ならびに２、３、４、５、６、８および２４時間のアリコートをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより検査した。対照抗体サンプルと一緒の全３種のＩｇＧグリコフォームは、ＦａｂおよびＦｃフラグメントについてそれぞれｍ／ｚ 約４７．３および約５２．５ＫＤａの分子イオンの存在により明白に示されるとおり、ＦａｂおよびＦｃフラグメントに切断された（図８）。

ｍ／ｚ 約１４７．５ＫＤａに観察される無傷のＩｇＧのピーク高の比較を図９に示す。ｍ／ｚ 約１４７．５ＫＤａの無傷のＩｇＧピークは０から１２０分まで測定されたが、しかしながら、２時間後は非常にわずかの無傷のＩｇＧピークが観察された。０分に、対照ＩｇＧと一緒のＩｇＧグリコフォームの全部のピーク高は同一であることが観察された。１５分に、Ｇ０の約５０％、対照の４５％およびＧ２グリコフォームの３５％が消化されないままであった。対照的に、Ｇ２Ｓ２グリコフォームの約２５％のみが消化されないままであった。３０分に、Ｇ０グリコフォームの約４５％、対照抗体の４０％およびＧ２グリコフォームの約２０％が消化されないままであった一方、Ｇ２Ｓ２グリコフォームの約１０％のみが消化されないままであった。従って、図９に提示されるデータは、Ｇ０グリコフォームが、一次生成物としてＦａｂおよびＦｃフラグメントを生じるＣＨ１ドメイン中のパパインによる切断に対し他のグリコフォームより抵抗性であることを示唆する。

ＣＨ１ドメイン中の一次パパイン切断部位に加え、ＩｇＧは、還元されたパパインにより、ＦｃのＣＨ２ドメイン中の二次切断もまた受け得る。該二次切断部位でのパパイン消化に対するＩｇＧグリコフォームの抵抗性を検査するため、ｍ／ｚ 約５２．５ＫＤａに観察されたＦｃフラグメントのピーク高を比較した。Ｇ０、Ｇ２、Ｇ２Ｓ２および対照のＩｇＧのＦｃフラグメントのピーク高データを図１０に示す。０．２５時間（１５分）から１時間までのＧ２およびＧ２Ｓ２のＦｃフラグメントの相対ピーク高は、Ｇ０グリコフォームの相対ピーク高より約５％より高く；Ｇ０グリコフォームおよび対照ＩｇＧのＦｃフラグメントのピーク高はほぼ同様であった。従って、Ｇ２およびＧ２Ｓ２グリコフォームとしての無傷のＩｇＧならびにこれらのグリコフォームを含んでなるＦｃ生成物それ自身双方が、パパインによる消化に対しより感受性である。図１０に示されるデータは、従って、Ｆｃ生成物の形成および分解の競合する速度を例示する。すなわち、１．５時間の時間点で、グリコフォームの全部および対照ＩｇＧのＦｃフラグメントのピーク高がほぼ同一であった。１．５時間の時間点後、Ｇ２およびＧ２Ｓ２グリコフォームのＦｃフラグメントのピーク高は、徐々に、Ｇ０グリコフォームおよび対照ＩｇＧのＦｃフラグメントのピーク高未満となった。６時間の時間点で、Ｇ２Ｓ２グリコフォームのピーク高はＧ０グリコフォームのピーク高より約３０％少なく；Ｇ２グリコフォームのピーク高はＧ０グリコフォームのピーク高より約２５％少なかった。８時間の時間点で、Ｇ２Ｓ２グリコフォームのＦｃフラグメントのピーク高はＧ０グリコフォームのＦｃフラグメントのピーク高より約６０％少なく；Ｇ２グリコフォームのＦｃフラグメントのピーク高はＧ０グリコフォームのＦｃフラグメントのピーク高より約５０％少なかった。０．５時間消化後の全部の時間点で、Ｇ０のＦｃフラグメントのピーク高は、Ｇ２、Ｇ２Ｓ２および対照ＩｇＧのものより大きかった。２４時間の時間点で、認識可能なＦｃフラグメントはＧ２およびＧ２Ｓ２グリコフォームについて観察されなかった一方、Ｇ０および対照ＩｇＧのＦｃフラグメントの約７０％が観察された。これらのデータは、Ｇ０グリコフォームのＦｃフラ
グメントが、ＦｃのＣＨ２ドメインに存在する二次的切断部位でのパパイン消化に対しより抵抗性であることを示す。さらに、該データは、Ｇ２Ｓ２グリコフォームが、ＣＨ１ドメイン中の一次消化およびＣＨ２ドメイン中の二次消化双方に対しグリコフォームの最も感受性のものであることもまた示唆する。

これらのデータは、Ｇ２Ｓ２グリコフォームがパパイン消化に対しより感受性であることができ、かつ、Ｇ０グリコフォームがＧ２グリコフォームよりもパパイン消化に対しより抵抗性でありうることを示唆する。Ｇ２グリコフォームはＧ２Ｓ２グリコフォームよりもパパイン消化に対しより抵抗性であったが、しかし、Ｇ０グリコフォームより約５０％少なく抵抗性であった。これらの結果は、パパイン消化に対するＩｇＧグリコフォームの差別的感受性が存在したことを示唆した。感受性のこれらの差違は、Ｆｃ中の一次切断部位ならびに二次切断部位双方でであるようである。

本発明は前述の記述および例で具体的に記述されたもの以外の方法で実施し得ることが明らかであろう。本発明の多数の改変および変形物が上の教示に照らして可能であり、そして従って付随する請求の範囲の範囲内にある。

ドメインと主要な指定された切断フラグメントの間の関係を示す抗体ＩｇＧドメインを描く。 ヒトＩｇＧに見出される二分岐オリゴ糖構造の変動の図解である。 ヒトＩｇＧヒンジ領域のアミノ酸配列および多様な酵素の切断部位を示す。 重ねた種の同定に関するピーク情報（＋１は一価の分子イオンであり、＋２は二価の分子イオンであり、＋３は三価の分子イオンであり、そしてＬＣは遊離Ｌ鎖である）を伴い、かつ、グリコシル化および脱グリコシル化調製物のパパインでの消化の間の時間にわたるＩｇＧフラグメントの形成を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ記録である。すなわち、（Ａ）未消化、（Ｂ）１／２時間、（Ｃ）１時間、（Ｄ）２時間、（Ｅ）４時間、（Ｆ）８時間および（Ｇ）２４時間後。 パパイン消化の間のグリコシル化および脱グリコシル化ＩｇＧサンプルの無傷のＩｇＧ（Ａ）およびＦｃフラグメント（Ｂ）の＋１分子イオンのピーク面積パーセントの比較を示す。 Ｇ０、Ｇ２およびＧ２Ｓ２グリコフォームの実施例５に記述される無傷の均質なＩｇＧグリコフォーム調製物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の追跡を示す。 多様な均質なグリコフォーム調製物および対照サンプルからのＰＧＮアーゼで遊離されるグリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の追跡を示す。 多様なピークの同一性を標識した、５０：１の比で３７℃でのパパイン消化にかけた１５分後の対照サンプルと一緒の均質なＩｇＧグリコフォーム調製物Ｇ０、Ｇ２およびＧ２Ｓ２のパパイン消化物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の追跡を示す。 ３７℃で５０：１の比でパパイン消化にかけた多様な時間の対照に関しての均質なＩｇＧグリコフォーム調製物Ｇ０、Ｇ２およびＧ２Ｓ２のパパイン消化物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析からの無傷のＩｇＧの積分ピーク面積のグラフ表示である。 多様な時間の対照サンプルと一緒の均質なＩｇＧグリコフォーム調製物Ｇ０、Ｇ２およびＧ２Ｓ２のパパイン消化の間に形成されるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析からのＦｃドメインの積分ピーク面積のグラフ表示である。

Claims (48)

1. プロテアーゼの遊離を特徴とするヒト疾患の処置方法であって、グリコシル化Ｆｃ含有タンパク質調製物を投与することを含んでなり、該抗体調製物が単一のグリコフォームについて実質的に均質である、上記方法。
2. Ｆｃ含有タンパク質が抗体である、請求項１に記載の方法。
3. 抗体が治療性モノクローナル抗体である、請求項２に記載の方法。
4. プロテアーゼが、ペプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、トリプシン、キモトリプシンおよびグリコシル化改変酵素よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
5. マトリックスメタロプロテイナーゼが、マトリックスメタロプロテイナーゼ−７（ＭＭＰ−７）、好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、ストロメリシン（ＭＭＰ−３）およびマクロファージエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）よりなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
6. グリコシル化改変酵素がβ−ガラクトシダーゼ若しくはシアリダーゼＡを含んでなる、請求項４に記載の方法。
7. 抗体のグリコフォームが実質的にＧ０グリコフォームである、請求項２に記載の方法。
8. 抗体のグリコフォームが実質的にＧ２グリコフォームである、請求項２に記載の方法。
9. 抗体のグリコフォームが実質的にＧ２Ｓ２グリコフォームである、請求項２に記載の方法。
10. 処置されるべき疾患が、身体の冒されている部位への好中球の浸潤を特徴とする、請求項１に記載の方法。
11. 処置されるべき疾患が自己免疫疾患である、請求項１に記載の方法。
12. 自己免疫疾患が関節リウマチである、請求項１１に記載の方法。
13. Ｆｃ含有タンパク質中のシアリル化グリコフォームの量を改変することを含んでなる、プロテアーゼによる切断に対するＦｃ含有タンパク質の安定性を改変する方法。
14. Ｆｃ含有タンパク質が抗体調製物中の抗体を含んでなる、請求項１３に記載の方法。
15. 改変する工程が、抗体がシアリル化グリコフォームを実質的に含まずかつ抗体の安定性が増大されるように抗体調製物を改変することを含んでなる、請求項１４に記載の方法。
16. 抗体調製物を改変する工程が、抗体宿主細胞を血清を用いて培養すること、低ｐＨで抗体を製造すること、特定の宿主細胞の使用、およびグリコシル化改変酵素での処理よりなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
17. 抗体がグリコフォームＧ０について実質的に均質であるように抗体調製物を改変する工程をさらに含んでなる、請求項１６に記載の方法。
18. 改変する工程が、抗体調製物をシアリダーゼＡで処理することを含んでなる、請求項１６に記載の方法。
19. 抗体調製物をシアリダーゼＡでの処理後にβ−ガラクトシダーゼで処理する工程をさらに含んでなる、請求項１８に記載の方法。
20. プロテアーゼが、パパイン、フィシン、ブロメライン、ペプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ−７（ＭＭＰ−７）、好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、ストロメリシン（ＭＭＰ−３）、マクロファージエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）、トリプシン、キモトリプシンおよびグリコシル化改変酵素よりなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
21. プロテアーゼがｉｎ ｖｉｔｒｏで抗体調製物を接触する、請求項２０に記載の方法。
22. プロテアーゼがパパインである、請求項２０に記載の方法。
23. プロテアーゼがｉｎ ｖｉｖｏで抗体調製物を接触する、請求項２０に記載の方法。
24. プロテアーゼが病理学的状態と関連する、請求項２３に記載の方法。
25. 病理学的状態が癌である、請求項２４に記載の方法。
26. 細胞若しくは被験体中のＦｃ含有タンパク質のグリコシル化の状態を測定すること；
    グリコシル化の状態を、プロテアーゼの存在若しくはレベルと相関させること；および
    プロテアーゼの存在若しくはレベルを、該プロテアーゼの存在若しくはレベルにより示される疾患状態と相関させること
    を含んでなる、細胞若しくは被験体中の疾患状態の検出若しくは診断方法。
27. Ｆｃ含有タンパク質が抗体である、請求項２６に記載の方法。
28. 抗体を酵素と接触させること、および
    酵素の活性をモニターすること
    を含んでなる、抗体のグリコシル化の評価方法。
29. 酵素の活性を、既知の抗体組成物に関しての該酵素の既知活性と比較することをさらに含んでなる、請求項２８に記載の方法。
30. モニターされる活性が、抗体による切断に対する抵抗性である、請求項２８に記載の方法。
31. 抵抗性が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｆａｃｂ若しくはＦｃフラグメントの存在により決定される、請求項３０に記載の方法。
32. 酵素がプロテアーゼである、請求項２８に記載の方法。
33. プロテアーゼが、パパイン、ペプシン、ＭＭＰ−７、好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、ストロメリシン（ＭＭＰ−３）、マクロファージエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）を包含するマトリックスメタロプロテイナーゼ、トリプシン、キモトリプシンおよびグリコシル化改変酵素よりなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
34. 評価されるグリコシル化がグリコシル化の量を含んでなる、請求項２８に記載の方法。
35. 評価されるグリコシル化がグリコフォームの含有率を含んでなる、請求項２８に記載の方法。
36. 実質的に脱グリコシル化された抗体を製造すること；および
    該実質的に脱グリコシル化された抗体をプロテアーゼと接触させること
    を含んでなる、抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｆａｃｂ若しくはＦｃへの迅速な切断方法。
37. プロテアーゼがパパインである、請求項３６に記載の方法。
38. 特定のグリコフォーム組成をもつ抗体を製造すること；および
    該抗体をプロテアーゼと接触させること
    を含んでなる、抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｆａｃｂ若しくはＦｃへの迅速な切断方法。
39. プロテアーゼが、パパイン、ペプシン、ＭＭＰ−７、好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、ストロメリシン（ＭＭＰ−３）、マクロファージエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）を包含するマトリックスメタロプロテイナーゼ、トリプシン、キモトリプシンおよびグリコシル化改変酵素よりなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
40. 実質的に脱グリコシル化された抗体を製造すること；および
    該実質的に脱グリコシル化された抗体をプロテアーゼと接触させること
    を含んでなる、抗体の複数の部分への迅速な消化方法。
41. プロテアーゼが、パパイン、ペプシン、ＭＭＰ−７、好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、ストロメリシン（ＭＭＰ−３）、マクロファージエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）を包含するマトリックスメタロプロテイナーゼ、トリプシン、キモトリプシンおよびグリコシル化改変酵素よりなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
42. 特定のグリコフォーム組成をもつ抗体を製造すること；および
    該抗体をプロテアーゼと接触させること
    を含んでなる、抗体の複数の部分への迅速な消化方法。
43. プロテアーゼが、パパイン、ペプシン、ＭＭＰ−７、好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、ストロメリシン（ＭＭＰ−３）、マクロファージエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）を包含するマトリックスメタロプロテイナーゼ、トリプシン、キモトリプシンおよびグリコシル化改変酵素よりなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
44. 実質的に脱グリコシル化されたＦｃ含有タンパク質を投与することを含んでなる、短縮された半減期をもつＦｃ含有タンパク質で処置または診断するという願望を特徴とするヒト疾患の処置若しくは診断方法。
45. 脱グリコシル化Ｆｃ含有タンパク質がタンパク質調製物中にある、請求項４４に記載の方法。
46. Ｆｃ含有タンパク質が抗体である、請求項４４に記載の方法。
47. 抗体が治療的モノクローナル抗体である、請求項４６に記載の方法。
48. 本明細書に記述されるいずれかの発明。