PT1274718E - Processo para a preparação de esteróis 7. alfa-hidroxi 3- aminosubstítuidos utilizando intermediários com um grupo 7. alfa-hidroxilo desprotegido - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ESTERÓIS 7.ALFA-HIDROXI 3-AMINOSSUBSTÍTUIDOS UTILIZANDO INTERMEDIÁRIOS COM UM GRUPO 7.ALFA-HIDROXILO DESPROTEGIDO"

FINANCIAMENTO GOVERNAMENTAL A investigação descrita neste pedido de patente foi financiada, em parte, por Small Business Innovative Research Grant #1 R43 CA 80473-01 do National Câncer Institute dos

National Institutes of Health.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Campo da Invenção A invenção refere-se a um novo método de produção de compostos baseados em anel fundido ou aromáticos, incluindo compostos aminoesterol. Um método da invenção oferece oxidação regiosselectiva e sulfonação régio-selectiva de sistemas de anel fundidos com poucos grupos de protecção. Os compostos aminoesterol produzidos através de um método da invenção são úteis como, entre outros, antibióticos, agentes anti-angiogénicos e inibidores do NHE3. 1

Descrição da Técnica Relacionada

Foram isoladas várias composições de aminoesterol do figado do tubarão carocho, Squalus acanthias. Um aminoesterol importante é o esqualeno (3 β —(N-[3-aminopropil]-1,4- butanodiamina) -7oí, 24R-di-hidroxi-5a-colestano-24-sulfato) , ilustrado na Fig. 1. 0 aminosterol esqualamina, que inclui um grupo sulfato na posição C-24, é o tema da Patente U.S. N° 5192756, que descreve também as propriedades do aminosterol como antibiótico.

No entanto, desde a descoberta da esqualamina, foram descobertas várias outras propriedades interessantes deste composto. Por exemplo, como descrito nas Patentes U.S. N° 5733899 e 5721226, a esqualamina pode funcionar como um agente anti-angiogénico útil para o tratamento de cancros. Ver Patente U.S. N°. 6147060. Na Patente U.S. N°. 5792635, são também reveladas outras utilizações da esqualamina, tais como um agente para a inibição do NHE3 e como um agente para a inibição do crescimento de células endoteliais.

Foram descritos métodos para sintetizar a esqualamina. Ver documento WO 94/19366, que se refere ao Pedido de Patente U.S. N°. 08/023347. A Patente U.S. N° 5792635 divulga também o isolamento da esqualamina e técnicas de síntese.

Na progressão da descoberta da esqualamina, foram descobertos e foram investigados outros aminoesteróis no fígado do tubarão carocho. Um aminoesterol importante que foi isolado e identificado como "composto 1436" ou simplesmente "1436" apresenta a estrutura apresentada na Fig. 2. Este composto tem a fórmula molecular geral C37H72N4O5S e um peso molecular calculado 2 de 684,53017. Tal como a esqualamina, este aminoesterol tem um grupo sulfato na posição C-24. O composto 1436 foi previamente descrito na Patente U.S. N° 5795885. Como também descrito nesta patente, o composto 1436 apresenta várias propriedades interessantes. Por exemplo, o composto 1436 inibe a proliferação dos linfócitos T humanos, bem como a proliferação de uma grande variedade de outras células e tecidos. Na Patente U.S. 6143738, são divulgadas outras utilizações do composto 1436. As Patentes U.S. N° 5795885 e 5847172 descrevem também a estrutura do composto 1436, bem como processos para sintetizar e isolar o composto. Por exemplo, o composto 1436 pode ser preparado a partir de um material de partida de esqualamina.

No entanto, foram encontradas dificuldades quando se tentou proporcionar um processo para a sintese da esqualamina ou composto 1436 a partir de materiais de partida disponiveis comercialmente (i. e., não a partir de isolados de figado de tubarão). Estas dificuldades incluem rendimentos globais baixos do produto esteróide desejado, bem como múltiplos passos sintéticos.

Foram encontradas dificuldades adicionais em proporcionar um grupo sulfato na posição C-24. Em particular, é dificil proporcionar o grupo sulfato na posição C-24 numa orientação altamente estereosselectiva. Ver, por exemplo, Pechulis, et al., "Synthesis of 24R-Squalamine, an Anti-Infective Steroidal Polyamine," J. Org. Chem., 1995, Vol. 60, pp. 5121-5126; e Moriarty, et al., "Synthesis of Squalamine. A Steroidal Antibiotic from the Shark," Tetrahedron Letters, Vol. 35, N° 44, (1994), pp. 8103-8106. 3

Devido à importância da esqualamina, composto 1436, outros aminosteróis, esteróides 24.R e 245-hidroxilados e metabolitos da vitamina-D3, tem existido um interesse considerável na preparação de compostos estereoespecíficos, especialmente na posição C-24. Como mencionado anteriormente, foram descritos processos para produzir a esqualamina e o composto 1436. No entanto, estes processos não permitem a produção em grande escala dos compostos de aminoesterol desejados devido aos rendimentos relativamente baixos alcançados com estes processos.

Foram desenvolvidos processos para produzir estereosselectivamente o cerebroesterol, MC 903 e la,24(R)-di-hidroxivitamina D3. Koch, et al., "A Stereoselective Synthesis and a Convenient Synthesis of Optically Pure (24R)- and (24S)-24 hydroxycholesterols," Bulletin de la Société Chimique de France, 1983, (N° 7-8), Vol. II, pp. 189-194; Calverley, "Synthesis of MC 903, a Biologically Active Vitamin D Metabolite Analogue," Tetrahedron, 1987, Vol. 43, No. 20, pp. 4609-4619; e Okamoto, et al. "Asymmetric Isopropylation of Steroidal 24-Aldehydes for the Synthesis of 24(R)-Hydroxycholesterol, Tetrahedron: Asymmetry, 1995, Vol. 6, N° 3, pp. 767-778. Estes processos tentam reduzir os sistemas 22-eno-24-ona e 22-ino-24-ona de um modo estereosselectivo. Infelizmente, os processos não foram altamente estereoespecíficos e, muitas vezes, resultaram em misturas do 24R e 24S que foram difíceis de separar. Assim, estes processos não conduziram a síntese em grande escala.

Outras tentativas também não conduziram à síntese em grande escala. Estes processos sofreram por serem demasiado longos ou impraticáveis. Por exemplo, foi alcançada uma redução bem sucedida de um sistema 25-eno-24-ona relacionado, utilizando reagente de hidreto de alumínio e 2,2'-di-hidroxi-1,1'- 4 binaftillítio de Noyori a -90 °C, para proporcionar uma selectividade de 95:5 para o 24A-álcool. Ishiguro, et ai. "Stereoselective Introduction of Hydroxy-Groups into the 24-, 25-, and 26-Positions of the Cholesterol Side Chain," J. C. S. Chem. Comm., 1981, pp. 115-117. No entanto, o material intermediário 25-eno-24-ona (produzivel em quatro passos) é menos rapidamente acessível que o sistema 22-eno-24-ona (produzivel num passo). Além disso, a temperatura baixa necessária para a redução quiral também diminui a praticabilidade comercial deste método.

Foi desenvolvida uma sintese estereosselectiva em grande escala para satisfazer as necessidades de uma rápida entrada em ensaios clinicos de Fase I. Zhang, X., et ai., J. Org. Chem., 63, 8599-8603 (1998) . No entanto, a sintese sofreu dois grandes retrocessos. Primeiro, a sintese foi bastante longa. Em segundo, a introdução de um grupo 7a-hidroxilo provou ser problemática.

Assim, existe uma necessidade na técnica por um método de preparação de compostos de aminoesterol, tais como a esqualamina, o composto 1436 e vários homólogos que superem as desvantagens dos métodos sintéticos anteriores.

Sumário da Invenção A presente invenção responde a uma tal necessidade proporcionado um método curto, regio- e estereosselectivo de preparação de compostos de aminoesterol. De acordo com um método da invenção, a oxidação e sulfonação regio- e estereosselectiva podem ser alcançadas com poucos grupos de protecção e, consequentemente, poucos passos. 5 A invenção proporciona também um método de oxidação estereosselectiva e regiosselectiva de um substituinte hidroxilo primário na presença de um substituinte hidroxilo secundário ligado ao mesmo sistema de anel fundido. A invenção proporciona também um método de sulfonação regiosselectiva de um substituinte hidroxilo secundário sobre outro substituinte hidroxilo secundário ligado ao mesmo sistema de anel fundido.

Um método da invenção proporciona também novos compostos intermediários.

Breve Descrição Dos Desenhos

Os aspectos vantajosos da invenção irão ser evidentes a partir da seguinte descrição detalhada, que deverá ser considerada em conjunto com os desenhos em anexo, em que:

Fig. 1 ilustra a estrutura quimica da esqualamina; e

Fig. 2 ilustra a estrutura quimica do composto 1436.

Descrição Detalhada da Invenção A hidroxilação microbiana foi alcançada em quimica esteróide. Mahato, S.B., et al., Steroids, 62, 332-345 (1997). Despreaux descreveu a 7a-hidroxilação microbiana do 3-cetobisnorcolenol (1, Esquema 1 abaixo) utilizando a espécie Botryodiplodia theobromae. Despreaux, C.W., et al. , Appl. 6

Environ. Microbiol., 51, 946-949 (1986); Despreaux et al.r Patente U.S. N° 4230625; e Despreaux et al., Patente U.S. N° 4301246. Esta invenção utiliza o composto esteróide 2 como um material de partida para a sintese da esqualamina, 1436 e aminoesteróis homólogos. Um método da invenção introduz o grupo 7-a-hidroxilo utilizando a hidroxilação microbiana e efectua-se sem protecção do grupo 7-hidroxilo. É delineada no Esquema 1 abaixo uma descrição geral de um método da invenção:

Esquema 1

7

De acordo com um método da invenção, o esteróide 2 pode ser convertido nos compostos de aminoesterol esqualamina ou composto 1436, através de duas reacções régio-selectivas sem a utilização de grupos de protecção. De acordo com a invenção, a porção hidroxilo primária do composto 3 pode ser oxidada, selectivamente, sobre uma porção hidroxilo secundária e, especificamente, a porção hidroxilo primária C-22 pode ser oxidada, selectivamente, sobre a porção hidroxilo secundária na posição C-7. Também de acordo com a invenção, a porção hidroxilo secundária C-24 do composto 10, pode ser sulfonada selectivamente sobre uma porção hidroxilo secundária C-7.

De acordo com a invenção, podem ser alcançados rendimentos relativamente elevados (e. g., 77%) bem como regiosselectividade e estereosselectividade. Foi demonstrada alguma selectividade C24 na reacção de sulfonação num diol espermidinil-esteroidal. No entanto, esta reacção não só necessitou de aquecimento e protecção do grupo C7-OH, como também o rendimento do composto foi baixo (10%). Moriarty, R.M., et ai., Tetrahedron Lett., 35, 8103-8106 (1994).

Um exemplo da invenção proporciona um método curto e regiosselectivo de preparação de esqualamina ou composto 1436 que, de acordo com a invenção, são preparados por (a) fazer reagir o composto 2:

(2) com Li e NH3 para formar o composto 3:

(b) fazer reagir o composto 3 com TMSC1 para formar o composto 4: etilenoglicol

9 (4) (c) fazer reagir o composto 4 com lixívia e um catalisador TEMPO para formar o composto 5:

(5) (d) fazer reagir o composto 5 com (EtO)2P(0)-CH2-C(0)- CH(CH3) 2 e t-butóxido de sódio para formar o composto 7:

O

(e) fazer reagir o composto 7 sob condições suficientes para formar o composto 8:

OH

10 (f) hidrogenação do composto 8 para formar o composto 9:

OH

(g) desprotecção do composto 9 para formar o composto 10:

OH

(10) S03: (h) fazer reagir o composto 10 com 5% de excesso de piridina para formar o composto 11: e;

11 (11) (i) fazer reagir o composto 11 com uma amina apropriada para formar esqualamina ou composto 1436,

Cada um dos compostos produzidos por um método da invenção pode ser isolado e purificado utilizando técnicas conhecidas na técnica incluindo, mas não limitado a, extracção e cromatografia. Cada um dos compostos produzidos por um método da invenção pode ser caracterizado utilizando técnicas conhecidas na matéria, tais como, por exemplo, espectrometria de massa, RMN de e RMN de 13C.

Como afirmado acima, um método de acordo com a invenção inclui processos para oxidar régio-selectivamente de um grupo C-22-OH na presença de um grupo C-7-0H, bem como a sulfonação regiosselectiva num grupo C-24-OH na presença de um grupo C-7-0H.

Em relação ao passo (a), o composto 2 pode ser transformado ou convertido no composto 3 utilizando litio em amónia com, de um modo preferido, rendimentos de, pelo menos, 76%. 0 composto 3 pode ser transformado ou convertido no composto 4 por cetalização da porção carbonilo. A cetalização é 12 efectuada utilizando etilenoglicol em clorotrimetilsilano num bom rendimento. Chan, T.H., et ai., Synthesis, 203-205 (1983). O composto 4 pode ser transformado ou convertido no composto 5 por oxidação régio-sselectiva do álcool primário na posição C-22, por reacção com lixivia, na presença de um catalisador. A lixivia pode ser qualquer lixivia, de um modo preferido, hipoclorito de sódio (NaOCl). O catalisador é um catalisador TEMPO (radical livre 2,2, 6, 6-tetrametil-l-piperidiniloxilo, disponível comercialmente da Aldrich Chemicals, Milwaukee, WI). De um modo preferido, as condições são escolhidas de modo a ser alcançado um rendimento de cerca de 98%. Anelli, P.L., et al., Org. Syn., Vol. 69, página 212, "A General Synthetic Method for the Oxidation of Primary Alcohols to Aldehydes: (S)-(+)-2 Methylbutanal". O composto 5 pode ser transformado ou convertido no composto 7 por uma reacção de formação de uma ligação dupla carbono-carbono (reacção Wadsworth-Emmons). O composto 5 é feito reagir com reagente Wadsworth-Emmons 6 (Jones, S.R, et al., J. Org. Chem., 63, 3786-3789 (1998)):

O

para proporcionar eficientemente o composto enona 7 (82%) . 13 0 composto 7 pode ser transformado ou convertido no composto 8 por redução da porção carbonilo C-24 num bom rendimento. 0 composto 8 é transformado ou convertido no composto 9 por redução da ligação dupla C22 através de hidrogenação. 0 composto 9 pode ser transformado ou convertido no composto 10 por desprotecção do carbonilo C3. 0 composto 10 pode ser transformado ou convertido no composto 11 por sulfonação régio-selectiva do grupo hidroxilo C24 por reacção do composto 10 com um pequeno excesso (5%) de complexo enxofre-trióxido. De um modo preferido, o excesso diastereomérico no sulfato é de cerca de 95% com base no método de HPLC.

Por último, o composto 11 pode ser transformado ou convertido no composto aminoesterol desejado (e. g. esqualamina, composto 1436 ou compostos homólogos) através de condições de aminação redutoras. Rao, M., et al., J. Nat. Prod. 63, pp. 631-635 (2000) ; Zhang, X. , et al. , J. Org. Chem. 63, 8599-8603 (1998) ; e Weis, A.L., et ai., Tetrahedron Lett., 40, 4863-4864 (1999) . 0 método preferido de preparação do composto aminoesterol esqualamina é ilustrado no Esquema 2 abaixo: 14

Esquema 2

15 A invenção proporciona também um método de oxidação regiosselectiva do substituinte hidroxilo primário do composto 4 para proporcionar o composto 5. De acordo com esta forma de realização da invenção, o composto 4 é feito reagir com lixívia na presença de um catalisador TEMPO, pelo que apenas o substituinte hidroxilo primário é oxidado num aldeído.

(4) A lixívia e o catalisador TEMPO são, cada um, como aqui descrito. A invenção proporciona também um método de sulfonação regiosselectiva do grupo hidroxilo C-24 do composto 10.

De acordo com esta forma de realização, o composto 10 é feito reagir com complexo enxofre-trióxido de piridina (disponível comercialmente de Aldrich Chemical, Milwaukee, WI): 16

Os métodos da invenção proporcionam régio-selectividade de uma porção hidroxilo na presença de outra porção hidroxilo não protegida. Os métodos da invenção proporcionam regiosselectividade de, pelo menos, de excesso cerca de 9:1 do composto sulfonado ou hidroxilado desejado. De um modo preferido, é alcançada uma selectividade superior a cerca de 19:1, e de um modo muito preferido, superior a cerca de 33:1.

Os métodos da invenção como descritos acima podem ser utilizados para produzir um intermediário hidroxilado que pode ser depois modificado, como descrito acima, para produzir o produto final desejado. Os métodos da invenção produzem intermediários regioespecificos que podem ser depois modificados para sintetizar esqualamina ou o composto 1436 (e. g., grupos sulfato C-24 numa orientação R para, esqualamina e composto 1436) . Tais intermediários incluem, mas não estão limitados a, compostos 3-10 como ilustrado no Esquema 2 acima.

Os métodos da invenção irão agora ser descritos em exemplos específicos. No entanto, os seguintes exemplos servem meramente para ilustrar a invenção e não têm como intenção limitar a invenção de qualquer modo. 17

Exemplos Síntese Estereosselectiva e Régio-selectiva de um Precursor para a Esqualamina e Composto 1436

Geral. Os espectros de RMN de 3Η e 13C foram gerados a 400 e 100 MHz, utilizando respectivamente 7,28 e 77,0 (CDCI3) ppm como referências. As análises elementares foram efectuadas em Oneida Research Services, Inc., Whitesboro, NY. As análises de espectro de massa de Bombardeamento de Átomos Rápido foram efectuadas em M-Scan Inc., West Chester, PA.

Exemplo 1. Preparação de (5-a-, 7-a-)-3-Cetobisnorcolan- 7,22-diol (3).

Amónia líquida (125 mL) foi tratada com tetra-hidrofurano (15 mL) e lítio (3,00 mg, 43 mmol) e agitada durante 30 min.

Depois, foi adicionada uma solução de 2 (Despreaux, C.W., et al., Appl. Environ. Microbiol., 51, 946-949 (1986)) (352 mg, 1,2 0 mmol) em tetra-hidrofurano (20 mL) e etanol (0, 4 mL) . A mistura reaccional foi agitada durante 40 min e, depois, foram adicionadas 20 g de cloreto de amónio. O solvente foi evaporado sob azoto e o resíduo foi tratado com água (200 mL) e extraído com acetato de etilo (3 x 75 mL). A fase orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sob sulfato de sódio, filtrada e evaporada. A purificação do sólido resultante por cromatografia flash em sílica gel (hexano-acetao de etilo-metanol 10:10:1) proporcionando o 3 puro (251 mg, 71%, pf 221-223 °C, PM 348,53); RMN de 3Η (CDC13) : δ 3,86 (br s, 1H) , 3, 65-3, 62 (m, 1H) , 3,39-3,36 (m, 1H) , 2,34-1,18 (m, 23H) , 1,05 (d, J = 6,6 Hz, 3H) , 1,01 (s, 3H) , 0,71 (s, 3H) ; RMN de 13C (CDC13) : δ 67, 9, 67, 4, 18 52,4, 50,2, 45,2, 44,1, 42,7, 39,5, 39,2, 39,0, 38,7, 38,1, 36, 5, 35, 6, 27,7, 23,7, 21,2, 16, 7, 11, 9, 10,4; EM (+FAB) : 349 ( [M+I ]+, 100), 331 (52); Anal. Calcl. para C22H36O3: C, 75, 82; H, 10,41. Observado: C, 75,71; H, 10,19.

Exemplo 2. (5-a-, 7-a-)-3-Dioxolano Bisnorcolan-7,22-diol (4) . A uma mistura do esteróide 3 (101 g, 0,290 mol) do Exemplo 1 e etilenoglicol anidro (800 mL) , foi adicionado clorotrimetilsilano (200 mL, 1,58 mol) durante 60 min à temperatura ambiente sob azoto. A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 19 h. A mistura foi vertida lentamente em solução de bicarbonato de sódio saturada (1 L) e extraida com diclorometano (3 x 500 mL) . A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada (3 x 150 mL) e seca sob sulfato de sódio (20 g) . Após filtração e evaporação, o produto foi recristalizado a partir de acetato de etilo em hexano (800 mL) . O sólido foi filtrado e lavado com hexano (15,0 mL) para proporcionar 4 (96,14 g, 84%, pf 173-175 °C, PM 392,58); RMN de ΧΗ (CDCls) : δ 3,93 (s, 4H) , 3,83 (br s, 1H) , 3,65 (d de d, J = 10,4 e 3,1 Hz, 1H) , 3,36 (d de d, J = 10,4 e 7,1 Hz, 1H) , 2,0-1,8 (m, 3H) , 2,7-1,1 (m, 21H) , 1,05 (d, J = 6,6 Hz, 3H) , 0,82 (s, 3H) , 0,69 (s, 3H) ; RMN de 13C (CDCI3) : δ 109, 2, 67,8, 64,1, 52,4, 50,3, 45, 6, 42,7, 39, 5, 39, 3, 38,8, 37,4, 36,2, 36, 1, 35, 7, 35, 5, 31,2, 27,7, 23, 7, 20, 9, 16, 7, 11, 9, 10,3; EM (+FAB) : 394 ( [M+I ]+, 100); Anal. Calcd para C24H40O4: C, 73, 43; H, 10,27. Observado: C, 73,15; H, 10,15. Esta reacção foi efectuada a uma concentração de substrato de 10%, o que permite um aumento de escala eficiente do processo. 19

Exemplo 3. Preparação de (5-a-, 7-a-)-3-Dioxolano-7- hidroxilo Bisnorcolan-22-al (5). A uma solução de 4 (100 g, 255 mmol) do Exemplo 2 em cloreto de metileno (1,200 mL) foi adicionado brometo de potássio (3,19 g, 26,8 mmol) e bicarbonato de sódio (10,97 g, 130 mmol) dissolvido em água (120 mL) . A mistura reaccional arrefecida (0 °C) foi tratada com TEMPO (1,20 g, 7,7 mmol) e hipocloreto de sódio a 10-13% (170 mL, 275-358 mmol) . Após agitação (magnética) durante 2 h a 0 °C, a mistura reaccional foi tratada com tiossulfato de sódio (20 g, 126 mmol) em água (220 mL) . A fase orgânica foi separada, lavada com solução salina saturada (3 x 70 mL) , seca sob sulfato de sódio (30 g) , filtrada e concentrada sob vácuo durante 18 h à temperatura ambiente para proporcionar 5 (99,5 g, 98%, PM 390,57, FW 397,77); RMN de XH (CDCI3) : δ 9, 57 (d, J = 3,4 Hz, 1H), 3, 95 (s, 4H), 3, 83 (br s, 1H) , 3,76 (m, 1H) , 2,35 (m, 1H), 2, , 0-1,2 (m, 21H), 1 ,13 (d, J = = 6, 8 Hz, 3H), 0, 83 (s, 3H) , 0,72 (s, 3H) ; RMN de 13C (CDCI3) : d 20, 9, 109, 0 , 67,6 , 64,0, 50,8 , 49,7, 49,3, LO 4, 43,0, 39,3, 39 ,0, 37,3, 36,2, 35 ,9, 35, 6, 35,4, 31,0, 26, 8, 23,8, 20,7, 1 3,3 , 12, 1, 10, 2; EM (+FAB): 391 ( [M+I ] +, 100) ;

Anal. Calcd para C24H380,4-H20: C, 72,47; H, 9,83. Observado: C, 72,49; H, 9,77.

Exemplo 4. Preparação de (5-a-, 7-a-)-3-Dioxolano-7- hidroxilo Colest-23-en-24-ona (7).

Uma mistura de t-butóxido de sódio a 97% (37 g, 373 mmol) e tetra-hidrofurano anidro (400 mL) foi agitada durante 10 min sob azoto e, depois, foi adicionada numa porção, uma solução de 6 (94 g, 423 mmol, ver Esquema 2 acima) em tetra-hidrofurano (150 20 mL) . A mistura inicialmente aqueceu para 41 °C, mas voltou aos 24 °C enquanto se procedia à agitação (45 min) . Depois, foi adicionada uma solução de 5 (99, 48 g, 250 mmol) do Exemplo 3 em tetra-hidrofurano (400 mL) durante 60 min. A mistura reaccional foi agitada de um dia para o outro à temperatura ambiente (18 h) e, depois, foi adicionada água (30 mL). A mistura reaccional foi concentrada in vacuo e tratada com ciclo-hexano (1200 mL), tolueno (600 mL) e água (160 mL). A camada orgânica foi separada, lavada com solução salina saturada (3 x 100 mL) e água (160 mL) , seca sob sulfato de sódio (30 g) , filtrada e evaporada para proporcionar um sólido. O sólido em bruto foi recristalizado a partir de acetato de etilo em ciclo-hexano e seco in vacuo a 50 °C, durante 5 h, para proporcionar o 7 (94, 64 g, 82%, pf 177-178 °C, PM 458, 69); RMN de (CDC13) : δ 6,72 (d de d, J = 15,7 e 9,0 Hz, 1H) , 6,07 (d, J = 15,7 Hz, 1H) , 3,94 (s, 4H) , 3,83 (br s, 1H) , 2,85 (hept, J = 6,9 Hz, 1H) , 2,29 (m, 1H) , 2,0-1,1 (m, 22 H) , 1,11 (m, 9H), 0,83 (s, 3H), 0,71 (s, 3H) ; RMN de 13C (CDCI3) : δ 204 ,5, 152,4, 126,2, 109,1, 67,8, 64,1, 54,9, 50,4, 45,6, 43,0, 40,0, 39, 5, 39,3, 38,1, 37,4, 36, 3, 36,1, 35,7, 31,2, 28,1, 23, 6, 20, 9, 19,3, 18,6, 18,4, 12,1, 10,3; EM (+FAB) : 459 ( [M+l]+, 92), 99 (100) ; Anal. Cale. para C29H46O4: C, 75 ,94; H, 10,11. Observado: C, 75, 5 7; H, 9, 87.

Exemplo 5. Preparação de (5-a-, 7-a-, 24S-)-7,24-Di- hidroxi-3-dioxolano Colest-23-eno (8) .

Um reactor seco e revestido a azoto foi carregado com reagente (R)-MeCBS 1 M em tolueno (20 mL, 20 mmol) e complexo borano-tetra-hidrofurano 1 M em tetra-hidrofurano (25 mL, 25 mmol) e agitado durante 2 h à temperatura ambiente. A mistura reaccional foi arrefecida (-15 para -28 °C), tratada com 21 esteróide 7 (9,16 g, 20 mmol) do Exemplo 4 em tetra-hidrofurano (150 mL) e agitada durante 2 h (-20 para -28 °C) . A mistura reaccional foi tratada com metanol (25 mL) com agitação durante 18 h à temperatura ambiente, depois, evaporada repetidamente por destilação e tratada com metanol (4 x 30 mL) para trocar os solventes. Finalmente, foi adicionado metanol (70 mL) e a mistura reaccional foi colocada a refluxo, arrefecida no congelador (não se formaram cristais) e concentrada in vacuo. A recristalização a partir de acetonitrilo (100 mL) , filtração e evaporação a 50-60 °C durante 7 h proporcionou cristais de 8 (7,43 g, 80%, pf 121-12S °C, PM 460,70, FW 464,3 1); RMN de ΧΗ (CDC13) : δ 5,5-5,3 (m, 2H) , 3,94 (s, 4H) , 3,82 (br s, 1H) , 3,75

(in, 1H) , 2,2-1,1 (m, 25H) , 1,05 (d, J = 6,6 Hz, 3H) , 0,94 (d, J = 6,7 Hz, 3H) , 0,88 (d, J = 6,8 Hz, 3H) , 0,83 (s, 3H) , 0,70 (s, 3H) ; RMN de 13C (CDCI3) : δ 139, 5, 128, 6, 109,2, LO OO Γ" OO r~~ LT5 64,1, 55,5, 50, 6, 45, 6, 42, 6, 40, 0, 39, 5, 39,4, 37,5, 36,2, 36,1, 35,7, 35, 6, 33, 9, 31,2, 28,7, 23,6, 20, 9, 20,4, 18,3, 18,1, 12,0, 10,3 ; EM (+ FAB) : 462 ( [M+I ] +, 100) ; Anal. Calcd para C29H48 O4-0,2H2 0: C, 75,02; H, 10,51. Observado: C, 75, 00 ; H, 10,48.

Exemplo 6. Preparação de (5-a-, 7-a-, 24R-)-7, 24-Di- hidroxi-3-dioxolano Colestano (9) . O esteróide 8 (10,0 g, 21,5 mmol) do Exemplo 5, tolueno (170 mL), trietilamina (1 mL) e platina a 10% em carbono (0,5 g) foram combinados sob 50 psi de hidrogénio num aparelho de Parr (19 h) . A mistura reaccional foi filtrada através de Celite (10 g) , lavada com clorofórmio e acetato de etilo (10 mL no total) e concentrada in vacuo para proporcionar um sólido, que foi recristalizado a partir de acetato de etilo em hexano (180 22 mL) . 0 sólido foi filtrado e concentrado a 50-60 °C sob vácuo durante 7 h para proporcionar o 9 puro (9,24 g, 92%, pf 161-163 °C, PM 462,72, FW 466, 32); RMN de 3Η (CDC13) : δ 3,95 (s, 4H) , 3,84 (br s, 1H) , 3,33 (br s, 1H) , 2,0-1,1 (m, 29H) , 0, 93 (m, 9H), 0,83 (s, 3H) , 0, 67 (s, 3H) ; RMN de 13C (CDC13) : δ 109,2, 77, 0, 67,8, 64,1, 55, 9, 50,5, 45, 5, 42, 6, 39, 5, 37,4, 36,2, 36, 1, 35,7, 35,5, 33,5, 32,0, 31, 2, 30,5, 28,2, 23, 6, 20, 9, 18, 8, 18,6, 17,2, 11,8, 10,3; EM ( + FAB) : 463 ([M+I]+, 100)+, Anal. Calcd para C29H50O4-0,2H20: c, 74,70; H, 10,89. Observado: C, 74,48; H, 10,49.

Exemplo 7. Preparação de (5-a-, 7-a-, 24f?-)-7, 24-Di- hidroxi-3-cetocolestano (10). O esteróide 9 (2,03 g, 4,35 mmol) do Exemplo 6, ácido p-toluenossulf ónico (200 mg), água (1 mL) e acetona (100 mL) foram combinados com agitação durante 4 h. A mistura reaccional foi concentrada in vacuo e tratada com diclorometano (100 mL) e solução de bicarbonato de sódio saturada (50 mL) . A camada orgânica foi removida, lavada com solução salina saturada (3 x 25 mL) , seca sob sulfato de sódio (10 g) , filtrada e evaporada a 50-60 °C. O sólido foi recristalizado a partir de acetato de etilo em hexano (50 mL) , filtrado, lavado com hexano e seco in vacuo a 50-60 °C durante 7 h para proporcionar o 10 d, 63 g, 89%, pf 15 Ί-153 C, PM 418,67); RMN de 3H (CDCI3 ) : δ 3, 88 (br s , 1H) , 3,33 (br s, 1H) , 2,5-1,1 (m, 29H) , 1,02 (s , 3H) , 0, 94 (m, 9H) , 0,71 (s, 3H) ; RMN de 13 C (CDCI3) : δ 212 , 0, 76, 9, 67, 3, 56,1, 50,3, 45,1, 44,1 , 42,6, 39, 4 , 39, 0, 38, 1, 38, 0, 36, 6, 35,8, 35, 6, 33, 6, 32,1 , 30,6, 28,2 , 23, 6, 21, 1, 18, 9, 18,6, 17,3, 11,8, 10,4; EM (+FAB): 419 ([M+I]+, 100); Anal. Calcd para C27H46O3: C, 77,46; H, 11,07. Observado: C, 77,25; H, 11,04. 23

Exemplo 8. Preparação do sal de Potássio de Sulfato de (5-a-, 7-a-, 24R-)-7-Hidroxi-3-ceto-colestan-24-ilo (11).

Um frasco coberto por uma manta de azoto e seco foi tratado com o composto 10 (2,09 g, 5,0 mmol) do Exemplo 7 dissolvido em

piridina anidra (30 mL) . Foi adicionado complexo piridina e trióxido de enxofre (836 mg, 5,25 mmol, 1,05 equiv.) dissolvido em piridina (20 mL) à mistura reaccional, que foi agitada durante 4 h à temperatura ambiente. Foi adicionada água (10 mL) e a piridina foi removida por concentração in vacuo a 40 °C. O

residuo foi tratado com acetato de etilo (50 mL) e cloreto de potássio (1,12 g, 15 mmol) dissolvido em água com agitação durante 1,5 h. O sal de potássio de 11 foi recolhido em Celite (3 g) por filtração, lavado com acetato de etilo (50 mL) e água (10 mL) e dissolvido em hidróxido de potássio 1 N em 15 metanol (10 mL, 10 mmol) e metanol (100 mL) . O metanol foi removido in vacuo até à secura e o sólido foi lavado com água (30 mL) , filtrado e seco in vacuo à temperatura ambiente durante 20 h para proporcionar o 11 (2,10 g, 77%, PM 536,82, FW 544)/ Os RMN 1H e 13C foram idênticos aos espectros publicados. A análise por HPLC pelo método descrito previamente (Zhang, X., et ai., J. Org. Chem., 63, 8599-8603 (1998)) indicou um excesso diastereomérico de 95 %.

Exemplo 9. Preparação do Composto 1436

Uma solução incolor límpida do composto 11 (16 mg, 0,032 mmol) e espermina (20 mg, 0,1 mmol, disponível comercialmente da Aldrich) em metanol anidro (3 mL) foi agitada à temperatura ambiente sob azoto durante 12 horas, arrefecida para -78 °C e tratada, gota a gota, com boro-hidreto de sódio (1 24 sedimento, 0,4 g, 10 mmol) em metanol (10 mL) . Esta mistura reaccional foi agitada durante 3 horas, tratada com uma mistura de água e metanol (10 mL cada), aguecida até à temperatura ambiente e, depois, tratada com solução de ácido trifluoroacético (TFA) a 0,78% até o seu pH atingir a gama de 4-5. A mistura resultante foi filtrada através de uma fina almofada de Celite® e a Celite® foi lavada com metanol e água (100 mL) . A Celite® é Si02 que está disponível comercialmente da Aldrich. As lavagens acídicas combinadas foram concentradas in vacuo à temperatura ambiente e depois liofilizadas de um dia para o outro para proporcionar um sólido branco. O bolo de Celite® foi depois lavado com isopropilamina/metanol/água (140 mL de 1:3:3) e a porção básica foi evaporada para reduzir o seu volume. Este material foi liofilizado de um dia para o outro para proporcionar um sólido castanho claro. Ambas as lavagens continham o composto 1436, por isso foram combinadas e acidificadas para um pH de 3 com TFA a 0,78%, filtradas e carregadas numa pequena coluna de HPLC (1 cm de diâmetro, ver abaixo) . O produto de reacção foi o composto 1436 (12,2 mg, 36 %) : RMN de (400 MHz, D20) : δ 4, 14 (m, 1H) , 3, 83 (m, 1H) , 3, 2-3, 0 (m, 13H) , 2,1- 1/0 (m, 35H), 0 , 92 (m, 9H) r 0, 82 (s, 3H) , 0, 67 (s, 3H) ; RMN de 13c (400 MHz r D20) : δ 87, 2 r 68, 0, 57, 9, 56 ,0, 50, 5, 47,4 , 45 , 6, 44, 9, 42, 8, 41 , 9, 39, 7 r 37, 5, 36, 9, 36 ,7, 36, 0, 35, 8 / 31 ,5, 31,1, 30, 6, 28 ,3, 27, 1 r 24, 8, 24,1, 23 , 6, 23, 4, 23,1, 21, 4, 1 9,2, 17,7 r 12,1, 1 1,2; EM ( -LD) : 684 (M-l) ; Anal. Cale. para C37H72N4O5S-3TFA-2H2O: C, 48,58; H, 7,49; F, 16,08; N, 5,27; S, 3,02. Observado: C, 48,49; H, 7,40; F, 16,16; N, 5,31; S, 3,05. 25

Exemplo 10. Purificação do Composto 1436 por HPLC O material em bruto do Exemplo 9 foi dissolvido em água (50 mL) , arrefecido num banho de gelo e acidificado com TFA a 1,5% em água até o seu pH ser 3. Inicialmente, observou-se que um obtem uma suspensão à medida que o pH diminui e, depois, é obtida uma solução a pH inferior. Esta solução foi carregada num sistema de HPLC de fase reversa Rainin (2,14 cm de diâmetro, C18, 100 Â, 8 ym) e eluida com A (água com TFA a 0,1%) e B (acetonitrilo com TFA a 0,1%) . O programa de HPLC foi como se segue: 10 min (0-10% de B) , 60 min (10-45% de B) , 10 min (45-80% de B) , 10 min (80% de B) . O produto puro eluido nas fracções de 33 a 55 minutos, como determinado por TLC (Rf: 0,1-0,2 em 6/3/1 CH2Cl2/MeOH/NH4OH) (deve-se evaporar placas sob vácuo antes da eluição e observar com corante de ninidrina antes da eluição), que foi liofilizado para produzir 1,20 gramas do composto 1436, como um pó branco (70%); C37H72N4O5S-3TFA-2,5H20, FW 1072,18).

Exemplo 11. Preparação da Esqualamina A esqualamina foi preparada por reacção do sal de potássio do composto 11 (0,5 equivalentes) do Exemplo 8 com H2N (CH2) 3NH (CH2) 4N3 · 2HC1 (1 equivalente) em NaOMe (2 equiv) e metanol à temperatura ambiente durante 24 horas e, depois, a -78 °C com NaBH4 seguido por tratamento com H2, RaNi, RP-HPLC, 69% com base no sal de potássio do composto 11. Ver Weis et al., Tetrahedron Letters, 40, 4863-4864 (1999).

Na descrição da invenção, o requerente divulgou certas teorias de modo a revelar como e porque a invenção funciona da maneira que funciona. Estas teorias são apresentadas apenas com 26 objectivo de informação. Os requerentes não tencionam estar ligados por qualquer teoria especifica de funcionamento.

Enquanto a invenção foi descrita em termos de várias formas de realização preferidas especificas e exemplos específicos, os especialistas na técnica irão reconhecer que podem ser efectuadas várias alterações e modificações sem sair do espirito e âmbito da invenção, como definido nas reivindicações em anexo.

Sem mais descrição, acredita-se que um especialista na técnica pode, utilizando a descrição precedente e os exemplos ilustrativos, preparar e utilizar os compostos da presente invenção e praticar os métodos reivindicados. Deverá ser entendido que a discussão anterior e exemplos apresentam meramente uma descrição detalhada de certas formas de realização. Será evidente para os especialistas na técnica que podem ser efectuadas várias modificações e equivalentes sem sair do espirito e âmbito da invenção. Todas as patentes, artigos de jornais e outros documentos discutidos ou citados estão aqui incorporados por referencia na sua totalidade.

Lisboa, 14 de Dezembro de 2006 27

Claims (8)

REIVINDICAÇÕES 1. Método para oxidar regiosselectivamente o substituinte hidroxilo primário do composto 4 para proporcionar o composto 5, o método compreendendo o passo de: fazer reagir o composto 4 com lixivia na presença de um catalisador de radical livre 2,2, 6, 6-tetrametil-l-piperidiniloxilo (TEMPO), <4> (5)
1. (1°) (11)
2. 2 (3) (b) fazer reagir o composto 3 com TMSC1 e etilenoglicol, para formar o composto 4:

   (2) com Li e NH3 para formar o composto 3:

   2. Método para sulfonar regiosselectivamente o grupo hidroxilo C24 do composto 10 para proporcionar o composto 11, o método compreendendo o passo de: fazer reagir o composto 10 com um excesso 5% do complexo trióxido de enxofre-piridina, 1
3. 3. Método para preparar um composto aminoesterol compreendendo os passos de: (a) fazer reagir o composto 2:
4. (4)

   4. Composto

   4 (9) (g) desproteger o composto 9 para formar o composto 10: OH

   (h) fazer reagir o composto 10 com um excesso de 5% de SCgipiridina para formar o composto 11:

   (11) e; (i) fazer reagir o composto 11 com uma amina apropriada para formar a esqualamina ou o composto 1436, 5 ο /so3h h2n

   (4) (c) fazer reagir o composto 4 com lixivia e um catalisador TEMPO, para formar o composto 5:
5. (5) (d) fazer reagir o composto 5 com (EtO)2P(0)-CH2-C(0)-CH(CH3) 2 e t-butóxido de sódio para formar o composto 7: 3 ο
6. 6 ο
7. 7. Composto OH

   (7)

   (7) (e) fazer reagir o composto 7 sob suficientes para formar o composto condições 8 : OH

   (8) formar o (f) hidrogenar o composto 8 para composto 9: OH
8. (8) Lisboa, 14 de Dezembro de 2006 7