PL89227B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych zwiazków diagnostycznych o duzej wrazliwosci na trypsyne i inne enzymy proteolityczne typu peptydohydrolaz peptydowych, w postaci wolnych zasad lub addycyjnych soli tych zasad z kwasami.Strukture tych zwiazków wyraza wzór przedstawiony na rysunku, w którym to wzorze Ri oznacza atom wodoru, rodnik acylowy o 112 atomach wegla, co-aminoacylowy o 1-12 atomach wegla, cykloheksylo-karbo- nylowy, ocykloheksyloacylowy, 4-aminometylocykloheksylokarbonylowy, benzoilowy niepodstawiony lub podstawiony np. jednym lub wieksza licza atomów chlorowca, grupa metylowa, aminowa lub fenylowa, rodnik ofenyloacylowy o I -6 atomach wegla w czesci acylowej, ewentualnie podstawiony w pierscieniu, rodnik benze- nosulfonylowy lub 4-tolucnosul fonyIowy, R2 oznacza atom wodoru, rodnik feny Iowy, alkilowy o 1-6 atomach wegla lub cyklohcksylowy, X oznacza rodnik metylenowy lub pojedyncze wiazanie, R3 oznacza prostolancucho- wy, rozgaleziony lub pierscieniowy rodnik alkilowy o-3-8 atomach wegla, R4 oznacza prostolancuchowy, rozgaleziony lub pierscieniowy rodnik alkilowy o 3-8 atomach wegla, rodnik fenylowy lub benzylowy, R5 oznacza atom wodoru lub rodnik guanylowy, R6 oznacza rodnik fenylowy, nitrofenylowy, metylonitrofenylowy, dwunitrofenylowy, naftylowy, nitronaftylowy, chinolinowy lub nitrochinolinowy, a n oznacza liczbe calkowita 2, 3 lub 4. W sposobie wedlug wynalazku do odpowiedniego aminokwasu dolacza sie grupe chromoforowa R6, a do tak powstalej struktury stopniowo przylacza pozostale aminokwasy w takiej kolejnosci, by otrzymac pozadany produkt o wzorze przedstawionym na rysunku (grupa chromoforowa blokuje C-terminalna grupe kar¬ boksylowa pierwszego aminokwasu) lub tez stopniowo tworzy sie pozadana strukture peptydowa, usuwa z niej grupy blokujace i przylacza grupe chromoforowa R*. Aminokwas zawierajacy ugrupowanie o wzorze RsNH/CH^nCHNH/BI/CO-, poddaje sie reakcji ze zwiazkiem zawierajacym grupe chromoforowa Re, a na¬ stepnie z aminokwasem zawierajacym ugrupowanie o wzorze R4CHNH/BI/CO-,. Tak wytworzona struktura pep¬ tydowa reaguje dalej z aminokwasem zawierajacyugrupowanie o wzorze R2N/B1/XCHR3C0-, po czym do po-2 89 227 wstalego ugrupowania peptydowego wprowadza sie grupe Ri. W przytoczonych wzorach Bi oznacza grupe blokujaca a poszczególne skladniki aminokwasowe laczy sie ze soba znanymi sposobami. Mozna tez najpierw wytworzyc strukture peptydowa oozorze R,N/R2/XCH/R3/GONHCH/R4/CONHCH/CH2/n/NlIR5/CONH- do której nastepnie wprowadza sie grupe chromoforowa R6.Zwiazki o wzorze przedstawionym na rysunku sa przeznaczone do ilosciowego oznaczania sklasyfikowa¬ nych i dotychczas nie sklasyfikowanych enzymów typu E.C.3.4.4, a szczególnie enzymów rozkladajacych wiaza¬ nia peptydów lub bialek, w które sa zaangazowane grupy karboksylowe argininy lub lizyny, np. trombiny, plazminy, enzymu o nazwie ReptilaseR, produkcji Pentapharm, Bazylea, Szwajcaria, enzymy o nazwie ArvineR, produkcji Ferring AB, Malmo, Szwecja lub dotychczas nie sklasyfikowanego enzymu o nazwie Brinase Repro¬ dukcji Astra, Sódertalje, Szwecja. Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku mozna stosowac do badania reakcji, w których powyzsze enzymy powstaja, sa inhibitowane lub rozkladane, jak równiez do oznaczania czynników wplywajacych na przebieg takich reakcji lub bioracych w nich udzial, np. do oznaczania proenzy- mów, aktywatorów, antyenzymów i inhibitorów enzymów.W klasyfikacji oparto sie na podreczniku „Enzymie Nomenclature", Elsevier, Amsterdam 1965, zaleconym przez The International Union of Biochemistry.Zwiazki dotychczas stosowane do ilosciowego oznaczania wyzej wymienionych enzymów sa opisane w po¬ dreczniku - „Methoden der enzymatischen Analyse", vol. I, str.1023, Bergmeyer H.U., Verlag Chemie, 1970. Te syntetyczne zwiazki moga byc podzielone w zaleznosci od tego w jakiego rodzaju katalitycznej reakcji enzymów proteolitycznych biora udzial, na dwie grupy: zwiazków estrowych i amidowych. Wiekszosc stosowanych do¬ tychczas zwiazków syntetycznych nalezy do grupy pierwszej. Sa one rozkladane przez peptydohydrolazy pepty- dowe znacznie szybciej niz znane dotychczas zwiazki typu amidowego. Jednakze glówna funkcja biologiczna enzymów klasyfikowanych jako peptydohydrolazy peptydowe jest, jak to wynika z ich nazwy, czynnosc hydroli- zowania wiazan peptydowych (amidowych), a nie wiazan estrowych, zwiazków pochodzenia naturalnego. Jak wynika z literatury (Blood Clotting Enzymology, str.36 142-44, Seegers W.H., Acadomic Press, 1967, stosunek szybkosci reakcji estrolitycznej do szybkosci reakcji amidolitycznej trombiny nie ma stalej wartosci w róznych warunkach reakcji. Dlatego pozadane sa syntetyczne zwiazki typu amidowego o znacznie wiekszej wrazliwosci na omawiane enzymy i które szybciej rozkladaja sie na mierzalne produkty niz zwiazki znane dotychczas.Do badania i sledzenia przebiegu enzymatycznej hydrolizy nadaja sie takie zwiazki typu amidowego, które rozkladaja sie, dajac: a) produkty chromoforowe latwe do pomiaru spektrofotometrycznego i posiadajace maksi¬ ma absorpcji swiatla nie pokrywajace sie z maksimami zwiazków wyjsciowych, b) produkty fluoryzujace, które moga byc mierzone za pomoca spektrofotometrii fluorescencyjnej, c) produkty, które reaguja z odpowiednimi odczynnikami, w wyniku czego powstaja zwiazki fotometrycznie mierzalne z duza czuloscia.Zastosowanie znalazly pewne zwiazki typu amidowego z hydrolitycznie odszczepialnymi grupami chromo- forowymi. Sa to glównie mono-p-nitroanilidy i mono-0-naftyloamidy aminokwasów niepodstawionych i podsta¬ wionych w pozycji Na. Sposród tych zwiazków mozna wymienic odczynnik na trypsyne i reakcje, w których trypsyna bierze udzial - chlorowodorek p-nitroanilidu N^-benzoilo-DL-argininy (BAPNA). Enzymatyczna hydroliza lego zwiazku daje posiadajaca chromofor p-nitroaniline, która mozna ilosciowo oznaczac spektrofoto- metrycznic. Znane dotychczas odczynniki amidowe nie wykazuja pozadanej wybiórczosci i czulosci, co stanowi ich powazna wade, poniewaz pociaga to za soba koniecznosc stosowania bardziej zlozonej procedury i w zwiazku z tym ir.ycia znacznej ilosci materialu biologicznego. Ponadto czas przebiegu reakcji enzymatycznej jest dlugi, a dokladnosc oznaczenia enzymu moze nic byc zadowalajaca.Wad dotychczas znanych zwiazków sa pozbawione otrzymywane sposobem wedlug wynalazku zwiazki o wzorze przedstawionym na rysunku. Skladniki aminokwasowe tych zwiazków laczy sie ze soba ogólnie znany¬ mi sposobami. Jako grupy blokujace grup aminowych stosuje sie np. grupe karbobenzoksylowa (Cbo), p-meto- ksykarbobcnzoksylowa (MeCbo), p-nitrokarbobenzoksylowa (N02Cbo), p-metoksyfenyloazokarbobenzoksylowa (NlCbo), lllrz.butoksykarbonylowa (BOC), trójfluoroacetylowa (TFA) lub formylowa. a-karboksylowe grupy mozna aktywowac przez przeprowadzenie ich w odpowiednie znane z chemii peptydów pochodne, takie jak np. ester p-nitrofenylowy, ester trójchlorofcnylowy, ester pieciochlorofenylowy, ester N-hydroksysukcynimidowy, azydek, symetryczny lub niesymetryczny bezwodnik. Pochodne mozna wyodrebniac lub poddawac dalszej re¬ akcji bez wyodrebniania. Aktywacje mozna równiez przeprowadzac karbodwuimidami, takimi jak np. N^-dwu- cykloheksylokarbodwuimid. C-terminalna grupe karboksylowa pochodnej aminopeptydu lub aminokwasu mozna chronic przez estryfikacje, np. do estru metylowego etylowego lub izopropylowego lub przez przeprowadzanie w chromoforowa pochodna anilinowa, która wówczas spelnia zadanie grupy blokujacej w procesie syntezy lancu¬ cha peptydowego. Grupy funkcyjne nie biorace udzialu w reakcjach syntezy chroni sie odpowiednimi grupami89 227 3 blokujacymi. Grupe 6-gmin idy nowa argininy mozna chronic np. grupa N02, p-tolucnosulfonylowa (Tos) lub protonujac ja, grupe c-aminowa lizyny mozna chronic grupa Cbo, BOC lub Tos. Grupe wodorotlenowa tyrozyny mozna chronic np. grupa benzylowa lub lllrz.butylowa.W stopniowej syntezie ukladu pcplydowcgo po przylaczeniu kolejnego aminokwasu mozna produkt oczys¬ cic na drodze chromatografii kolumnowej na zelu, np. na usicciowanym zelu dekstranowym Scphadcx G lub LII produkcji Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala Szwecja. Odpowiednimi do tego celu zelami sa równiez kopolimery octanu winylu, np. Merc kogel OR PVA produkcji AG E.Merck, Darmstadt, RFN. Zel równowazy sie odpo¬ wiednim rozpuszczalnikiem, którym nastepnie prowadzi sie eluacje, np. metanolem, etanolem, acetonem, dwu- mctyloformamidcm, dwumelyloacctamidcm, dwumetylosulfotlenkicm lub trójamidem kwasu szesciomctylofos- fbrowego.W dalszej czesci opisu wynalazek zilustrowano przykladami, które nie ograniczaja jego zakresu. W przykla¬ dach tych przebieg syntezy i oczyszczania kontroluje sie za pomoca chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym (F 254 AG F.Merck, Darmstadt. RFN) w nastepujacych ukladach: A: n-butanol kwas octowy woda (3:1:1) C: n-propanol octan etylu woda (7:1:2) D: n-heptan - n-butanol kwas octowy (3:2:1) Pi : chloroform--metanol (c:l) Rozwiniete chromatogramy obserwuje sie w swietle nadfioletowym (254 urn), a nastepnie wywoluje od¬ czynnikiem chlorowotoluidynowym (G. Palaki: Dttnnschichlchromatografic iu der Aminosaurc und Pcptid-Chc- mic, Walter de Gruytcr und Co., Berlin, ll)do str. I 25).Jezeli nic zaznaczono inaczej, uzyte w syntezach aminokwasy maja konfiguracje L. Oznaczono je nastepu¬ jacymi symbolami: Arg =arginina .Phe = fenyloalanina Ile =izoleucyna Ala = alanina Len =leticyna Lys= lizyna Val = walina Ponadto w opisie przyjeto nastepujace skróty: Ac = rodnik acetylowy Ac20 = bezwodnik octowy AcOlI = kwas octowy BOC - rodnik lllrz.-buloksykarbonylowy Bz = rodnik benzoil owy Bzl = rodnik benzylowy Bz20 = bezwodnik.kwasu'benzoesowego Cbo = grupa karhobenzoksylowa DCCI = dwucykloheksylokarbodwuimid IX1!!A = dwucykloheksyloamina DCU = dwucyklohoksylokarbamid DMI; = dwumelylolormamid Ft3N = trójctyloaniina HM PTA = N,N,N\N\N,\N" s/A\sViomet ylolrój fosforowego kwasu liójamid MCbo = grupa p-metoksyfenyloazokarbobenzoksylowa McOM = metanol NA = naftyloamina OtBu = grupa lllrz.butoksylowa OFt = grupa etoksylowa OMe = grupa metoksylowa OpNP = grupa p-nitrofenoksylowa CisoPr = grupa izopropoksylowa pNA = p-nitroauilid TLA = grupa trójlluoroacetylowa Tos =grupa p-loluenosul fony Iowa TLC = chromatografia cienkowarstwowa Stosowane w chromatografii kolumnowej zele Sephadcx G 15 i G 25 sa usieciowanymi zelami dekstra¬ nowymi o róznym stopniu usieciowania, SephadexR LII 20 jest hyJroksypropylowanym zelem dekstranowym Zele te sa produkowane przez Pharmacia FineChemicals, Uppsala, Szwecja.4 89 227 Zwiazki otrzymywane sposobem wedlug wynalazku zastosowano do oznaczania róznych enzymów. Zasada oznaczania jest oparta na tym, ze w wyniku enzymatycznej hydrolizy powstaje zwiazek o widmie w nadfiolecie w istotny sposób rózniacym sie od widma substratu. Tak wiec np. N^-Bz-Leu-Leu-Arg-pNA HC1 ma widmo absorpcji z maksimum przy 302 nm, z molowym wspólczynnikiem ekstynkcji 12920. Absorpcja substratu przy 405 nm jest nieznaczna. Powstajaca z substratu w wyniku enzymatycznej hydrolizy p-nitroanilina (pNA) wykazu¬ je maksimum absopcji przy 380 nm, z molowym wspólczynnikiem ekstynkcji 13200, a przy 405 nm jej molowy wspólczynnik ekstynkcji wynosi 9620. Tak wiec ze spektrofotometrycznego pomiaru absorpcji przy 405 nm mozna wyliczyc stopien enzymatycznej hydrolizy, który jest proporcjonalny do ilosci powstalej p-nitroaniliny.Nadmiar substratu nic przeszkadza w pomiarach przy tej dlugosci fali. Warunki pomiaru zuzyciem innych zwiazków otrzymywanych sposobem wedlug wynalazku sa prawie identyczne i dlatego wszystkie pomiary spek- trofotometryczne wykonywano przy 405 nm.Reakcje enzymatyczna wyraza schemat przedstawiony na rysunku. Uzyte w tym schemacie symbole maja nastepujace znaczenie: E enzym, S - substrat (zwiazek do ilosciowego oznaczania enzymu), ES. — kompleks enzymu zsubstratem, P1 i P2 -produkty, k,, k2, k3 i k4 - stale szybkosci reakcji. Stala dysocjacji dla ES = k2/ki =Km (stala Michaelisa).Jezeli /S/ /E/, a k4 < k3, to wazna jest zaleznosc: ., I/E/-/ES/I-/S/ m Km " ~/ES/ (1) Szybkosc powstawania chromoforu v = k3 * /ES/ k3 • IEI • /S/ (2) Km + /S/ Gdy E jest calkowicie zwiazane z S, to /ES/ = /E/, a v = vmax = k3 •/E/ (3) Równanie Lineweaver Burka i Km 1 1 ,-,+ W v vmax /S/ vmax Jak wynika z równania /2/, stale Km i k3 okreslaja wydajnosc substratu w stosunku do danego enzymu.Wartosci tych stalych oznacza sie jak nastepuje: enzym i substrat miesza sie w roztworze buforowym i w ciagu 5 minut przeprowadza pomiary spektrofotometryczne. Stezenie substratu /S/ jest zmienne, natomiast stezenie enzymu /E/ jest dla kazego substratu takie same. Wykresla sie ekstynkcje /OD/ w funkcji czasu, a nastepnie wyznacza styczna /zmiane ekstynkcji wciagu minuty, A OD/min, z której to wartosci mozna wyliczyc ilosc powstajacych w ciagu minuty jumoli p-NA/ do otrzymanej w ten sposób krzywej w czasie zero, która odpowiada poczatkowej szybkosci reakcji v„ Z wykresu-^ w funkcji--mozna wyliczyc wchodzace w równanie (4) wielkosci Km ' vmax- . , . , , _ vmax Wartosci Km ik3 dla trypsyny i innych substratów enzymowych sa podane w tablicy I, a dla /E/ trombiny w tablicy II. Danych dotyczacych Km i k3 nie podano w tych przypadkach, gdy nie mogly byc one oznaczone z powodu braku liniowej zaleznosci miedzy — a — . v /S/ l*rzyblizone obliczenie zaleznosci miedzy enzymem a substratem mozna wykonac porównujac ilosci p-ni¬ troaniliny powstajacej w 1 ml wciagu minuty, przy tym samym stezeniu substratów. W tablicach III, IV i V przedstawiono te dane odpowiednio dla trypsyny, trombiny i plazminy.Uzyty w tablicach sierót N1H oznacza jednostki przyjete przez Narodowy Instytut Zdrowia (National Institute of Health). Jednostka trypsynowa jest równa hydrolizie jednego mikromola chlorowodorku estru mety¬ lowego Na -tosylo-argininy /TAME/ w ciagu 1 minuty, przy 25°C i pH 8,1, w obecnosci 0,01 M jonu wapniowe¬ go. Trypsyne otrzymano z Worthington Biochemical Corporation, Freehold, N.J., USA, plazmine z AB Kabi, Sztokholm, Szwecja; 1 mg odpowiada 3 jednostkom kazeinowym (CU).Wzory chemiczne stubstratów oznaczonych cyframi rzymskimi sa podane w przykladach.Dane przedstawione w tablicach wykazuja wyzszosc zwiazków o ogólnym wzorze przedstawionym na rysunku nad substratami amidowymi dotychczas stosowanymi do oznaczania trypsyny (BAPNA). Nowe substra-89 227 5 ty, dzieki wiekszej, c^ulesei, umozliwiaja oznaczanie % duza dokladnoscia malych ilosci enzymu, co jest bardzo wazne^ll&ml^ie materialu do prób. t fzfk l i#'i; Sj^feza H,Leu^Arg-pNA-2;flp (I) Synteza Cbo-Arg/N02/-pNA (la) K ,3 g (0,1 mol) suchego Cbo-Arg/N02/-OH rozpuszcza sie w 200 ml swiezo przedestylowanego HMPTA, w temperaturze pokojowej. Do roztworu zabezpieczonego przed dostepem wilgoci dodaje sie, mieszajac, 10,1 g (0,1 mol) Et3N i 24,6 g (0,15 mol) izocyjanianu p-nitrofenylu. Mieszanine reakcyjna utrzymuje sie w ciagu 24 godzin w temperaturze pokojowej, a nastepnie wylewa, mieszajac, do 2 litrów 2% roztworu kwasnego weglanu sodu. Wytracony osad odsacza sie i trzykrotnie przemywa porcjami po 0,5 litra 2% roztworu kwasnego weglanu sodu,- dwukrotnie porcjami po 0,2 litra wody destylowanej, dwukrotnie porcjami po 0,5 litra 0,5 n HC1 i piecio¬ krotnie porcjami po 0,2 litra wody destylowanej. Po wysuszeniu, pozostalosc ekstrahuje sie cieplym MeOH.Nierozpuszczony N^-dwu-p-nitrofenylokarbamid odsacza sie, a przesacz oczyszcza na zelu Sephadex LH—20 zrównowazonym MeOH„ Otrzymuje sie 29,8 g (wydajnosc 63%) la o temperaturze topnienia 185—188°C. Pro¬ dukt jest jednorodny w TLC w ukladzie Px • [a]^4 = -1,3° (c=1,1 ,AcOH).Synteza Cbo-Leu-Arg/N02/-pNA (Ib) ,0 g (10,6 mmol) la rozpuszcza sie w 21 ml AcOH i 22 ml 4 n HBr w AcOH, w warunkach wykluczajacych dostep wilgoci. Roztwór miesza sie wciagu godziny, a nastepnie powoli wylewa do 200 ml intensywnie miesza¬ nego eteru, co powoduje wytracenie 1,5 HBr • H-Arg/N02 /-pNA. Z nad granulowanego osadu zdekantowuje sie roztwór eterowy, a osad trzykrotnie przemywa sie porcjami po 100 ml eteru, w celu usuniecia bromku benzylu i nadmiaru HBr i AcOH. Po wysuszeniu pod zmniejszonym cisnieniem nad P205 wydajnosc bromowodorku pochodnej aminokwasu jest ilosciowa (4,87 g). 4,87 g (10,6 mmol) 1,5 HBr • H-Arg/N02/p-NA rozpuszcza sie w 50 ml przedestylowanego DMF.Roztwór ochladza sie do -10°C i dodaje sie do niego 1,6 g (15,9 mmol) Et3N, w celu uwolnienia H-Arg/N02/-pNA z bromowodorku. Mieszanina reaguje wciagu godziny w warunkach zabezpieczajacych przed dostepem wilgoci.Wytracony Et3N*HBr odsacza sie, przesacz ochladza do -10°C i dodaje do niego 4,3 g (12,7 mmol) Cbo-Leu-OpNP, a nastepnie powoli doprowadza do temperatury pokojowej. Po uplywie 3 godzin roztwór po¬ nownie ochladza sie do -10°C i buforuje za pomoca 0,55 g (5 mmol) Et3N. Buforowanie powtarza sie po uplywie 2—3 godzin. Reakcje prowadzi sie w sumie wciagu 24 godzin, a nastepnie odparowuje roztwór pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 40°C, do sucha. Pozostalosc trzykrotnie ekstrahuje sie porcjami po 100 ml wody destylowanej, a nastepnie suszy pod zmniejszonym cisnieniem. Sucha pozostalosc rozpuszcza sie w MeOH i oczyszcza na zelu SephadexR LH—20 zrównowazonym MeOH. Otrzymuje sie 6,1 g (wydajnosc 98%) bezpostaciowego Ib. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie ?i • [a]^5 = -33,3° (c=l,0,MeOH).Synteza Cbo-Leu-Leu-Arg/N02/-pNA (Ic) Materialy wyjsciowe: 2,8 g (4,77 mmol) Ib i 2,22 g (5,72 mmol) Cbo-Leu-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu Sephadex LH—20 w MeOH. Otrzymuje sie 2,5 g (wydajnosc 80%) bezpostaciowego Ic. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pi • [a]£5 = -9,9° (c=l,0,DMF).Synteza /Id/ H-Leu^Leu-Arg-pNA • 2 HC1 Do naczynia reakcyjnego aparatu Sakakibary wprowadza sie 134,2 mg (0,192 mmol)Ic. Do naczynia przedestylowuje sie 5 ml bezwodnego fluorowodoru. Grupa nitrowa chroniaca funkcje guanidynowa argininy i grupa Cbo ulegaja odszczepieniu. Pod zmniejszonym cisnieniem oddestylowuje sie fluorowodór, a sucha pozo¬ stalosc rozpuszcza w DMF. Dla przeprowadzenia fluorowodorku peptydu w chlorowodorek do roztworu dodaje sie 0,25 ml stezonego kwasu solnego. Roztwór odparowuje sie do sucha i ponownie przeprowadza zakwaszanie i odpedzenie HC1.Oczyszczanie: pozostalosc po ostatnim odparowaniu rozpuszcza sie w 50% AcOH i oczyszcza na zelu Sephadex G—25 zrównowazonym 50% AcOH. Eakcje zawierajace czysty chlorowodorek trójpeptydu liofilizuje sie. Otrzymuje sie 80,0 mg (wydajnosc 71%) bezpostaciowego I o zawartosci Cl 11,83%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A • [a]^3 = -29,9° (C=0,59, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Leu 2,0, Arg 0,95.Przyklad II. Synteza N^-B2-Leu-Leu-Arg-pNA • HC1 (II) Synteza N^-Bz-Leu-Leu-Arg/N02/-pNA (Ha) Materialy wyjsciowe: 703 mg (1 mmol) Ic i 272 mg (1,2 mmol) Bz20.Sposób syntezy: Odszczepienie grupy karbobenzoksylowej Ic przeprowadza sie w sposób analogiczny jak przy syntezie Ib. Bezwodny roztwór H-Leu-Leu-Arg/N02/-pNA • HBr odsacza sie ochladza do -10°C i dodaje do niego 272 mg (1,2 mmol) Bz2 O. W ciagu 3 godzin doprowadza sie roztwór do temperatury pokojowej, nastepnie ponownie ochladza i buforuje za pomoca 0,07 ml (0,5 mmol) Et3N. Buforowanie powtarza sie po uplywie6 89 227 dalszych 3 godzin. Reakcje prowadzi sie w sumie w ciagu 24 godzin, po czym odparowuje roztwór do sucha, pod zmniejszonym cisnieniem* Pozostalosc przerabia sie i suszy w sposób analogiczny do zastosowanego w synte¬ zieIb. .Oczyszczanie: na zelu SephadexR LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 550 mg (wydajnosc 82%) bezpostacio¬ wego IJa. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A¦• [a|jjy = -3,6° (c= 1,01, DMF).Synteza ^-Bz-Leu-Leu-Arg-pNA • HCI (II) Material wyjsciowy: 554,8 mg (0,828 mmol) Ha.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Id.Oczyszczanie: na zelu Sephadex G- 15 w 20% AcOH i na zelu LH-20 w MeOH-. Po liofilizacji otrzymuje sie 476 mg (wydajnosc 87%) bezpostaciowego II o zwartosci Cl 5,30%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukla¬ dzie A • |a|£3 * -73,0° (c=0,66, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Leu 2,0, Arg 0,95.Przyklad III. Synteza H-0-cyk1oheksylo-Ala-Val-Arg-pNA • 2 HCI.Synteza Cbo-Val-Arg/N02/-pNA (Hla) Materialy wyjsciowe: 20,6 g (43,5 mmol) la i 20,3 g (54,3 mmol) Cbo-Val-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: przekrystalizowanie surowego produktu z MeOH. Lug macierzysty oczyszcza sie na zelu Sephadex LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 23,2 g (wydajnosc 93,3%) Ilia o temperaturze topnienia 200-202°C. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie: P, i C • [a]£4 =¦ +5,8° (c= 1,0, DMF).Synteza Cbo-0-cykloheksylo-Ala-Val-Arg/NOa/-pNA (IHb) Materialy wyjsciowe: 0,48 g (0,83 mmol) Ilia i 0,53 g (1,24 mmol) Cbo-0-cykloheksylo-Ala-OpNP o tempe¬ raturze topnienia 105- 106°C i [a]^A = -28,8° (c= 1,0, DMF).Sposób syntezy: analogiczny dr syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu Sephadex LH-20 w MeOH. Wydajnosc 531 mg (88%) bezwodnego IHb. Produkt jest jednorodny w TLC w rkladzie P, • \a\^ = -7,3° (c=2,0, DMF).Synteza H-j3-cykloheksylo-Ala-Val-Arg-pNA • 2 HCI (III) Material wyjsciowy: 120,4 hig (0,165 mmol) IHb.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Id.Oczyszczanie: na zelu ScphadexR G-15 w 20% AcOH, Otrzymuje sie, po liofilizacji, 56,6 mg (wydaj¬ nosc 55%) bezpostaciowego 111 o zawartosci Cl 11,32. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A ¦ [a]£3 - -36,8° (c=0,62, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Val 1,0, 0-cykloheksylo-Ala 1 I.Przyklad IV. Synteza N-Bz-/3-cyklo1ieksy1o-Ala-Va1-Arg-pNa - HCI (IV).Synteza N-Bz-0-cyklohcksylo-Ala-Val-ArgVNO:/-pNA(IVa) Materialy wyjsciowe: 243 mg (0,335 mmol) IIIb i 93 mg (0,41 mmol) Bz20.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ha.Oczyszczanie: na zelu Sephadcx LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 147 mg (wydajnosc 63%) IVa o tempe¬ raturze topnienia 148- 152°C. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie P, • [a]£3 - -6,33° (c=0,84, DMF).Synteza N-Bz-0-cykfoheksylo-Ala-Va1-Arg-pNA • HCI(IV) ^. '¦' Material wyjsciowy: 106,0 mg (0,152 mmol) IVa.. Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Id.Oczyszczanie: na zelu SephadexR G-15 w 20% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 86,7 mg (wydaj¬ nosc 84%) bezpostaciowego IV o zawartosci Cl 5,10%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A ' [a]£3 = -77° (c=0,3, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Val 1,0,0-cykloheksylo-Ala-1,2, Arg 1,0.Przyklad V. Synteza N-Bz-N-cykloheksylo-j(?-Aia-Val-Arg-pNA • HCI (V).Synteza. N-Cbo-N-cykloheksylo-i3-Ala-Val-Arg/N02/-pNA (Va.Materialy wyjsciowe: 286 mg (0,5 mmol) III i 300 mg (0,7 mmol) N-Cbo-eykloheksylo-0-Ala-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu SephadexR LH 20 w MeOH. Otrzymuje sie 313 mg (wydajnosc 86%) bezpostacio¬ wego Va. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie P|-[ol^4 = ±0° (c= 1,0, DMF).Synteza N-Bz-N^cykloheksylo-/?-Ala-Val-Arg/NOa/-pNA(Vb) ' Materialy wyjsciowe: 300 mg (0,413 mmot) V i 123 mg (0,544 mmol) Bz20.. Sposób syntezy: analogiczny do. syntezy Ila.Oczyszczanie: .na zelu SephadexR LH 20 w MeOH. Otrzymuje sie 243,5 mg (wydajhoic 87%) bezpostacio¬ wego Vb. Produkt jest jednorpdny w TLC w ukladzie P, • [a]^ • = 0,5° (c=0,43; DMF). ; • * -/Synteza^Bz-cyktol^^^^ ;',"''.. - • • .Material wyjsciowy: 170 mg (0,242 mmol) Vb. • '"'.•'¦ - * * 'Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Id. •• . .39227 7 Oczyszczanie: na zelu Sephadex LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 126 mg (wydajnosc 76%) zliofilizowane- go, bezpostaciowego V o zawartosci CJ 5,11%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A • [a]^ - -38,5° (c=0,69, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Val 1,0, N-cykloheksylo-0-Ala 1,3, Arg 0,9.Przyklad VI. Synteza N<*-Bz-Val-VaJ-Arg-pNA• HCI (VI) Synteza Cbo-Val-Vul-Arg/N02/-pNA(Via) Materialy wyjsciowe: 1,97 g (3,43 mmol) III i 1,6 g (4,2 mmol) Cbo-Val-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu SephadexR LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 1,9 g (82%) bezpostaciowego VI. Pro- ' dukt jest jednorodny w TLC w ukladach Pi i C.Synteza: Na-Bz-Val-Val-Arg-/N02/-pNA(Vlb) Materialy wyjsciowe: 1,9, g (2,83 mmol) Via i 0,77 g (3,40 mmol) Bz2O.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ha.Oczyszczanie: na zelu SephadexR LH—20 w MeOH. Otrzymuje sie 1,45 g (wydajnosc 80%) bezpostaciowe¬ go VIb. Produktjest jednorodny w TLC w ukladzie Pj • [a]£3 - ±5,6° (c=l,01, DMF).Synteza N^-Bz^al^al-Arg-pNA • HC1 (VI) Material wyjsciowy: 362 mg (0,564 mmol) VIb.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Id. \ Oczyszczanie: na zelu SephadexR G-15 w 33% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 248 mg (69,7%) bezpo¬ staciowego VI o zawartosci Cl 5,54%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A/[o]p4 » -57,0° (c=0,65, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Val 2,0, Arg 0,9.Przyklad VII. Synteza N^-Bz-Leu^al-Arg-pNA • HC1 (VII).Synteza Cbo-Leu-Val-Arg/N02/-pNA(VIIa) Materialy wyjsciowe: l ,97 g (3,43 mmol) Ilia i 1,7 g (^,2 mmol) Cbó-Leu-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy fb.Oczyszczanie: na zelu SephadexR LII 20 w MeOH. Otrzymuje sie 2,05 g (wydajnosc 87%) bezpostaciowe¬ go VIIa. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladach Pi i C.Synteza N^Bz-Leu-Yal-Arg/NOj/-pNA (VIIb) Materialy wyjsciowe: 1 ,75 g (2,55 mmol) VIIa i 695 mg (3,06 mmol) Bz20.Sposób syntezy: analogiczny do synte/y I la.Oczyszczanie: na zelu SephadexRLlI 20 w MeOH. Otrzymuje sie 1,49 g (wydajnosc 91%) VIIb. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie P, • |a|*3 = ±2,4° (c= 1,01, DMF).Synteza N^-Bz-Leu-Yal-Arg-pNA ¦ HCI (VII) Material wyjsciowy: 319 mg (0,486 mmol) VIIb.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Vllb Id.Oczyszczanie: na zelu SephadcxR G 15 w 33% AcOH. Otrzymuje sie, po liofilizacji, 276 mg (wydajnosc 88%) bezpostaciowego Vii o zawartosci Cl 5,41%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A. Sklad amino¬ kwasowy: Val 1,0, Leu 1,1, Arg 0,95.Przyklad VIII. Synteza Na-Bz-IIe-Va1-Arg-pNA • HCI (VIII) Synteza Cbo-IIe-Val-Arg/N02/-pNA (VIHa) Materialy wyjsciowe: 1,97 g (3,43 mmol) Ilia i 1,7 g (4,2 mmol) Cbo-IIe-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: chromatografia na zelu Sephadex LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 2,0 g (wydajnosc 85%) bezpostaciowego VII la. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pt.Synteza N^Bz-lIe^al-Arg-ZNO* /-pNA (Vlllb) Materialy wyjsciowe: 1,75 g (2,55 mmol) VIIIa i 695 mg (3,06 mmol) Bz20.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ha.Oczyszczanie: na zelu SephadexR LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 1,46 g (89%) bezpostaciowego VIIIb.Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pj.Synteza N^-Bz-IIe^al-Arg-pNA • HCI (VIII) Material wyjsciowy: 319 mg (0/186 mmol) VIIIb.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Id.Oczyszczanie: na zelu SephadexR G-15 w 33% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 264 mg (wydajnosc 84%) bezpostaciowego VIII o zawartosci Cl 5,43%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A*[a]^ = -29,9° (c=0,59, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Val 1,0, Ile 0,9, Arg 1,1.8 89 227 Przyklad IX. N^-Bz-Yal-IIe-Arg-pNA• HC1 (IX) Synteza Cbo-Ile-Arg/N02/-pNA (lXa) Materialy wyjsciowe: 4,9 g (10,4 mmol) la i 6,2 g (16 mmol) Cbo-Ile-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu SephadexR LH 20 w MeOH. Otrzymuje sie 4,75 g (wydajnosc 78,1%) czesciowo krystalicznego IXa. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie P, * [«1^ = ±2,3 (c*l ,0 DMF).Synteza Cbo-Val-Ile-Arg-/N02/-pNA (IXb) Materialy wyjsciowe: 800 mg (1,37 mmol) IXa i 615 mg (1,65 mmol) Cbo-Val-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu SephadexR LH 20 w MeOH. Otrzymuje sie 833 mg (wydajnosc 88,5%) bezpostacio¬ wego IXb. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie P, • [a]^4 = -3,23° (c= 1,1; DMF).Synteza Na-Bz-Val-Ilc-Arg/N02/-pNA(IXc) Materialy wyjsciowe: 500 mg (0,73 mmol) IXb i 198 mg (0,876 mmol) Bz2O.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Na.Oczyszczanie: na zelu ScphadexR LII 20 w MeOH. Otrzymuje sie 374 mg (wydajnosc 78%) bezpostacio¬ wego IXc. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie P, • [a|^3 = +I,9°(c=0,99, DMF).Synteza Na-Bz-Val-lle-Arg-pNa • HCI (IX) Material wyjsciowy: 200 mg (0,305mmol) IXc.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Id.Oczyszczanie: na zelu SephadcxR G 15 w 33% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 153 g (77,5%) bezposta¬ ciowego IX o zawartosci Cl 5,40%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A'[a|^ =-56,4° (c=0,64, 50% AcOIl). Sklad aminokwasowy: Val 1,0, Ile U, Arg 1,1.Przyklad X. Synteza Na-Bz-Va1-Lcu-Arg-pNA • HCI (X) Synteza Cbo-Val-Leu-Arg/N02/-pNA(Xa) Materialy wyjsciowe: 880 mg( 1,5 mmol) Ib i 670 mg (1,8 mmol) Cbo-Val-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu ScphadcxR LII 20 w MeOH. Otrzymuje sie 882 mg (wydajnosc 86%) bezpostacio¬ wego Xa. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie P,- |a|^3 = -6,6° (c= l,01, DMF).Synteza Na-Bz-Val-Leu-Arg/N02/-pNA(Xb) Materialy wyjsciowe: 400 mg (0,583 mmol) Xa i 160 mg (0,707 mmol) Bz20.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy I la.Oczyszczanie: na zelu ScphadexR LII 20 w MeOH. Otrzymuje sie 279 mg (wydajnosc 73%) bezpostacio¬ wego Xb. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie P, • [a|j^ = - 0,4° (c= 1,04, DMF).Synteza N^-Bz-Yal-Lcu-Arg-pNA • HCI (X) Material wyjsciowy: 150 mg (0,23 mmol) Xb.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy I.Oczyszczanie: na zelu SephadcxR G 15 w 33% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 126 mg (wydajnosc 84,5%) bezpostaciowego X o zawartosci Cl 5,45%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A *[<*1d = -54,0° (C=0,64, 50% AcOIl). Sklad aminokwasowy: Val 1,0, Lcu 1,1, Arg 1,0.Przyklad XI. Synteza Na-Bz-llc-Arg-pNA • HCI (XI) Synteza Cbo-lle-lle-Arg/N02/-pNA (Xla) Materialy wyjsciowe: 800 mg (1,37 mmol) lXa i 640 mg (1,66 mmol) Cbo-Ile-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu ScphadcxR LH 20 w MeOH. Otrzymuje sie 838 mg (wydajnosc 87,5%) czesciowo krystalicznego XIa. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pt • [a|p3 = -5,7° (c=l,04, DMF).Synteza Na-Bz-lle-lle-Arg/N02/-pNA (Xlb) Materialy wyjsciowe: 440 mg (0,63 mmol) XIa i 171 mg (0,76 mmol) Bz20.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ila.Oczyszczanie: na zelu SephadexR LH 20 w MeOH. Otrzymuje sie 409 mg (wydajnosc 97%) czesciowo krystalicznego XIb. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie P|.Synteza Na-Bz-Ne-llc-Arg-pNA • HCI (Xl) Material wyjsciowy: 201 mg (0,3 mmol) XIb.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy I.Oczyszczanie: na zelu SephadexR G 15 w 33% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 172 mg (wydaj¬ nosc 87%) bezpostaciowego XI o zawartosci Cl 5,33%. Produkt jest jednorodny w TCL w ukladzie A* [a]^3 =-57,0° (c = 0,67, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Ile 2,0, Arg 0,9.89 227 9 Przyklad XIL Synteza N^Bz-Leu-lle-Arg-pNA • MCI (XII) Synteza Cbo-Leu-Ile-Arg/N02/-pNA (XIIa) Materialy wyjsciowe: 800 mg (1,37 mmol) IXa i 640 mg (1,66 mmol) Cbo-Leu-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu SephadexR LU 20 w MeOH. Otrzymuje sie 772 mg (wydajnosc 81%) bezpostacio¬ wego XIla. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie ?i*\a]^ = -7,3° (c=l,02, DMF).Synteza N^-Bz-Leu-Ile-Arg/NO^-pNA (XIlb) Materialy wyjsciowe: 500 mg (0,72 mmol) XIIa i 205 mg (0,86 mmol) Bz20.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ila.Oczyszczanie: na zclu ScphadexR LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 482 mg (wydajnosc 82%) bezpostacio¬ wego XIIb. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie P, • la]^3 = +0,5° (c=l ,03, DMF).Synteza N^-Bz-Leu-Ile-Arg-pNA • HC1 (XII) Material wyjsciowy: 193 mg (0,288 mmol) Xllb.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy I.Oczyszczanie: na zelu ScphadexR G-15 w 33% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 166 mg (wydaj¬ nosc 86%) bezpostaciowego XII o zawartosci Cl 5,34%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A(a]p = =-51,4°(c=0,67, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Leu 1,0, Ile 1,2, Arg 0,9.Przyklad XIII. Synteza Na-Bz-Ilc-Leu-Arg-pNA • HC1 (XIII) Synteza Cbo-lie-Leu-Arg/N02/-pNA(XIUa) Materialy wyjsciowe: 880 mg (1,5 mmol) Ib i 696 mg (1,8 mmol) Cbo-Ileu-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zclu ScphadexR LII 20 w MeOH. Otrzymuje sie 750 mg (wydajnosc 71%) bezpostacio¬ wego XIIla. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie P, -[a^3 ^ -9,85° (c= 1,05, DMF).Synteza N^Bz-lleu-Leu-Arg/NO^-pNA (Xlllb) Materialy wyjsciowe: 498 mg (0.71 mmol) XIIIa i 193 mg (0,85 mmol) Bz20.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ha.Oczyszczanie: na zelu SepbadcxK LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 345 mg (wydajnosc 73%) czesciowo krystalicznego Xlllb. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie P, • [a|^3 = -5,7° (c=l,04, DMF).Synteza Na-Bz-Ile-Leu-Arg-pNA • HC1 (XIII) Materialy wyjsciowe: 170 mg (0,254 mmol) XIIIb.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy I.Oczyszczanie: na zelu SephadexR G 15 w 333% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 129 mg (wydaj¬ nosc 77%) bezpostaciowego XIII o zawartosci Cl 5,31%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A • [a]^ = = -49,9° (c=0,68, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Leu 1,0, lic 1,1, Arg 1,05.Przyklad XIV. Synteza N^Bz • Lcu-Leu-Arg-2-NA • HC1 (XIV) Synteza Cbo-Arg/N02 /-2-NA (XIVa) 3,6 g (10 mmol) suchego Cbo-Arg/N02/-OH rozpuszcza sie w 200 ml THF. Do roztworu dodaje sie 1,0 g (10 mmol) Et3N i roztwór ochladza sie w warunkach uniemozliwiajacych dostep wilgotnosci.Do ochlodzonego roztworu dodaje sie w ciagu 10 minut 1,3 g (10 mmol) chloromrówczanu izobutylu rozpuszczonego w 10 ml THF, a po uplywie dalszych 10 minut 1,72 g (10 mmol) 2-naftyloaminy. Mieszanine reakcyjna doprowadza sie do temperatury pokojowej i pozostawia w tej temperaturze wciagu 24 godzin, na¬ stepnie odparowuje do sucha i ekstrahuje kolejno 3 5 krotnie woda destylowana, 3-5 krotnic 5% roztworem kwasnego weglanu sodu i ponownie 3 5 krotnie woda destylowana, po czym suszy pod zmniejszonym cisnie¬ niem.Oczyszczanie: na zelu SephadexR LH 20 w MeOH. Otrzymuje sie 4,05 g (wydajnosc 84%) czesciowo krystalicznego XIVa. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladach P, i C • [aj23 = +7,35° (c= 1,0, DMF).Synteza Cbo-Leu-Arg/N02 /-2NA (XIVb) Materialy wyjsciowe: 1,5 g (3,1 mmol) XIVa i 1,43 g (3,7 mmol) Cbo-Leu-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu SephadexR LH 20 w MeOH. Otrzymuje sie 1,6 g (86%) bezpostaciowego XIVb.Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie P, • [a]22 = -9,1° (c=l,0, DMF).Synteza Cbo-Leu-Leu-Arg/N02/-2-NA (XIVe) Materialy wyjsciowe: 1,35 g (2,26 mmol) XIVb i 1,05 g (2,71 mmol) Cbo-Leu-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.10 89227 Oczyszczanie: na zelu SephadexR LH 20 w MeOH. Otrzymuje sie 1,00 g (wydajnosc 62,4%) czesciowo krystalicznego XIVc. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie P/ • [ottf* = -20,6° (c*l ,0, DMF).Synteza Na-Bz-Leu-Leu-Arg/N02/-2.NA (XIVd) Materialy wyjsciowe: 990 mg (1 ,^mmol)XIVc i 407 mg (1,8 mmol) Bz2 O.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ha.Oczyszczanie: na zelu Sephadex^ LH 20 w MeOH. Otrzymuje sie 800 mg (wydajnosc 84%) bezpostacio¬ wego XIVd. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pt • [a]£°*= -13,4° (e=1,0, DMF). ' Synteza N^Bz-Leu-Leu-Arg-2-NA -HCI (XIV) Material wyjsciowy: 350 mg (0,52 mmol) XIVd.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy I.Oczyszczanie: na zelu SephadexR G-15 w 33% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 260 mg (wydaj¬ nosc 75%) bezpostaciowego XIV o zawartosci Cl 5,30%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A •'.[ft]^, * = -51,8° (c=0,57, AcOH 50%). Sklad aminokwasowy: Leu 2,0, Arg 0,95.¦ Przy k-l ad XV. Synteza Na-Bz-Leu-Leu-Arg-l-nitro-2-Na • HCI (XV).Synteza Cbo-Arg/N02/-l-nitro-2-NA (XVa) Materialy wyjsciowe: 3,6 g (10 mmol) Cbo-Arg/N02/-OH i 2,26 g (12 mmol) l-nitro-2-naftyloaminy.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy XIVa.Oczyszczanie: na zelu ScphadexR LH 20 w MeOH. Otrzymuje sie 3,1 g (wydajnosc 58,7%) bezpostaciowe¬ go XVa. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie P, i C -[a]^9 = -11,8° (c=l,0, DMF).Synteza Cbo-Leu-Arg/N02 /-I -nitro-2-NA (XVb) Materialy wyjsciowe: 950 mg (1,8 mmol) XVa i 850 mg (2,2 mmol) Cbo-Leu-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu SephadexR LH 20 w MeOH. Otrzymuje sie 900 mg (wydajnosc 78%) bezpostacio¬ wego XVb. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie ?{ • |a]^2 = -10,2° (c=l ,02, DMF).Synteza Cbo-Leu-Leu-Arg/N02/-l-nitro-2-NA (XVc) Materialy wyjsciowe: 900 mg (1,4 mmol) XVb i 650 mg (1J mmol) Cbo-Leu-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu SephadexR LII 20 w MeOH. Otrzymuje sie 810 mg (wydajnosc 77%)bezpostacio¬ wego XVc. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie P/- [a]^4 = -18,2° (c=1,01, DMF).Synteza I^-Bz-Leu-Leu-Arg/NOi/-lMiitro-2-NA(XVd) Materialy wyjsciowe: 680 mg (0,88 mmol) XVc i 260 mg (1,15 mmol) Bz2O.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ha.Oczyszczanie: na zelu SephadexR LH 20 w MeOH. Otrzymuje sie 480 mg (wydajnosc 73%) bezpostacio¬ wego XVd. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pi • [a]^4 = -31,4° (c=0,9, DMF).Synteza N^-Bz-Leu-Arg-l-nitro-2-NA • HCI (XV) Material wyjsciowy: 74 mg'0,1 mmol) XVd.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy I.Oczyszczanie: na zelu SephadexR G-15 w 33% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 47 mg (wydajnosc 66%) bezpostaciowego XV o zawartosci Cl 4,94%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie: A • [a]^- a-33,6° (c=0,72, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Leu 2,0, Arg 0,9.P r z y k l a d XVI. Synteza h^-Bz-Leu-Leu-Arg-4-nitro-l-NA • HCI (XVI) Synteza Cbo-Arg-/N02/-4-nitro-l-NA (XVIa) Materialy wyjsciowe: 3,6g(10 mmol) Cbo-Arg/N02/-OH i 2,26g(12 mmol)4-nitro-l-naftyloaminy.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy XIVa.Oczyszczanie: na zelu SephadexR LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 2,9 g (wydajnosc 55%) bezpostaciowego XVIa. Produkt jest jednorodny w TLC w uladzie Pt i C-[a]p2 =-11,4° (c= 1,01, DMF).Synteza Cbo-Leu-Arg/N02/-4-nitro-l-NA-(XVIb) Materialy wyjsciowe: 650 mg (1,23 mmol) XVIa i 560 mg (1,45 mmol) Cbo-Leu-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ib.Oczyszczanie: na zelu SephadexR LH-20 w MeOH. Otrzymuje sie 378 mg (wydajnosc 62%) czesciowo krystalicznego XVIc. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie ?x • [a]^3 - -18° (c=l ,C DMF).Synteza N^-Bz-Leu-Leu-Arg/N02-4-nitro-l-NA (XVId) Materialy wyjsciowe: 150 mg (0,2 mmol) XVIc i 57 mg (0,25 mmol) Bz2O.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy Ha.89 227 11 Oczyszczanie: na zelu Scphadex LH 20 w MeOII. Otrzymuje sie 120 mg (wydajnosc 83%) bezpostacio¬ wego XVld. Produkt jest jednorodny w TLCw ukladzie: Pi-[a]y2 = 30,9° (c=0,95, DMF).Synteza N^-Bz-Leu-Leu-Arg-4-nitro-l-NA • HC1 (XVI) Material wyjsciowy: 120 mg (0,165 mmol) XVId.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy I.Oczyszczanie: na zelu SephadexR G -15 w 33% AcOH. Po liofilizacji otrzymuje sie 48 mg (wydajnosc 42%) bezpostaciowego XVI o zawartosci 014,95%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A *[ot]jf =-36,0° (c=0,71, 50% AcOH). Sklad aminokwasowy: Leu 2,0, Arg 0,9.Przyklad XVII. Synteza N^-Bz-Leu-Lys-pNA • HC1 (XVII) Synteza ^BOC-Lys-Ze-Cbo^pNA (XVlIa) 6,3 g (11,2 mmol) Na-BOC-Lys/e-Cbo/-OH • DCHA rozpuszcza sie w 40 ml bezwodnego, swiezo przedesty¬ lowanego HMPTA, w temperaturze pokojowej. Roztwór zabezpiecza sie przed dostepem wilgoci i mieszajac dodaje do niego stopniowo 5 g (30,5 mmol) izocyjanianu p-nitrofenylu. Reakcje prowadzi sie w ciagu 24 godzin w temperaturze pokojowej, a nastepnie mieszanine reakcyjna przerabia w sposób opisany w przykladzie la. Nie¬ rozpuszczalny N,N'-dwu-p-nitrofcnylokarbamid odsacza sie, a przesacz oczyszcza za pomoca chromatografii ko¬ lumnowej na zelu SephadexR LII 20 zrównowazonym MeOH. Otrzymuje sie 4,17 g (wydajnosc 74,5%) czescio¬ wo krystalicznego XVIIa. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pi • [a|jy = +1,7° (c= 1,0, DMF).Synteza N^-BOC-Leu-Lys/e-Cbo/pNA (XVIIb) 2,20 g (4,4 mmol) XVI la rozpuszcza sie w 10 ml swiezo przedestylowanego kwasu trójfluórooctowego, w warunkach zabezpieczajacych przed dostepem wilgoci. Calosc miesza sie wciagu godziny w temperaturze pokojowej, a nastepnie powoli wylewa do 150 ml suchego eteru, intensywnie mieszajac. Po ochlodzeniu wytraca sie CF3COOH'H-Lys/€:-Cbo/-pNA. Roztwór eterowy zdekantowujc sie, a bezpostaciowa pozostalosc trzykrotnie ekstrahuje porcjami po 75 ml eteru i suszy pod zmniejszonym cisnieniem nad P2O5 i NaOH. Otrzymuje sie sól trójfluoroociowa pochodnej aminokwasu z wydajnoscia ilosciowa (2,25 g). 2,25 g (4,4 mmol) CF^COOlI-M-Lys/c-Cbo/pNA rozpuszcza sie w 10 ml DMF. Roztwór ochladza sie do -10°C i dodaje do niego 0,78 ml (5,5 mmol) Et3N, w celu uwolnienia aminokwasu z soli. Nastepnie dodaje sie 2,4 g (6,5 mmol) BOC-Leu-OpNP i doprowadza roztwór do temperatury pokojowej. Po uplywie 3 godzin roz¬ twór ponownie ochladza sie do -I0°C i buforuje za.pomoca 0,31 ml (2,2-mmol) E)t3N. Proces buforowania powtarza sie po uplywie dalszych 2 3 godzin. Reakcje prowadzi sie w sumie 24 godziny, a nastepnie pod zmniejszonym cisnieniem, w temperaturze 40°C\ odparowuje roztwór do sucha. Pozostalosc trzykrotnie ekstra¬ huje sie porcjami po 20 ml wody destylowanej i suszy pod zmniejszonym cisnieniem. Surowy produkt rozpusz¬ cza sie w MeOII i oczyszcza na zelu ScphadexK LU 20 zrównowazonym MeOH. Otrzymuje sie 1,70 e (wydaj¬ nosc 70%) bezpostaciowego XVI Ib. Produkt jest jednorodny ¦ w TLC w ukladzie Vx \C*[a\D =-4,9° (c=l,l,DMF).Synteza N^-liOC^Leu-Leu-Lys-Lys/o-Cbo/pNA(XVIIc) Materialy wyjsciowe: 950 mg (1,55 mmol) XVI Ib i 1.1 o g (3,1 mmol) BOC-Lcu-OpNP.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy XVI Ib.Oczyszczanie: na zelu SephadcxK LII 20 w MeOII. Otrzymuje sie 985 mg (wydajnosc 88%) bezpostacio¬ wego XVIIc. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie P, • |or|^° = -22,0° (c= 1.0. DMF).Synteza Ncv-Bz-Lcu-Lcu-Lys-Lys/c-Cbo/-pNA(XVlld) Materialy wyjsciowe: 1,25 g (1,4 mmol) XVlIc i 384 mg (1,7 mmol) Bz2 O.Sposób syntezy: grupe karbonylobutoksylowa XVNc odszczepia sie w sposób analogiczny jak w syntezie XVIlb.Bezwodny CF;,COOH*H-Leu-Leu-Lys/(:-Cbo/-pNA rozpuszcza sie w 20 ml DMF. Roztwór ochladza sie do -10°C i dodaje do niego 200 ml (1,45 mmol) Ft3N, w celu uwolnienia aminy peptydu z soli. Do roztworu utrzy¬ mywanego w temperaturze -10°C dodaje 384 mg (1,7 mmol) Bz20, a dalsze buforowanie i przerób prowadzi sie jak przy syntezie XVllb.Oczyszczanie: na zelu Sephadcx LU 20 w MeOH. Otrzymuje sie 920 mg (wydajnosc 90%) czesciowo krystalicznego XVIId. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie Pt i C-[a|^° = -5,95° (c=l,02, DMF).Synteza Na-Bz Leu-Leu-Lys-pNA • MCI (XVII) Material wyjsciowy: 300 mg (0,41 mmol) XVlId.Sposób syntezy: analogiczny do syntezy L Oczyszczanie: na zelu SephadexR G 15 w 33% AcOH. Otrzymuje sie, po liofilizacji, 170 mg (wydajnosc 66%) bezpostaciowego XVII o zawartosci Cl 5,51%. Produkt jest jednorodny w TLC w ukladzie A • [tf]p * = -50,5° (c=0,62, 50% AcOlI). Sklad aminokwasowy: Leu 2,0, Lys 0,35.12 89 227 PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych zwiazków diagnostycznych o duzej wrazliwosci na trypsyne i inne enzymy proteolityczne typu peptydohyclrolaz peptydowych o strukturze wyrazonej wzorem przedstawionym na rysunku, w którym to w/orze Rj oznacza atom wodoru, rodnik acylowy o 1 — 12 atomach wegla, co-aminoacyiowy o 1-12 atomach wegh;, cyklohcksylokarbonylowy, ocykloheksyloacylowy, 4-aminometylocykloheksylokarbonylowy, benzoilowy ewentualnie podstawiony jednym lub wieksza liczba atomów chlorowca, grupa metylowa, aminowa lub fenyIowa. rodnik co-fcnyloacylowy o 1-6 atomach wegla w czesci acylowej, ewentualnie podstawiony w pierscieniu, rodnik benzenosulfonylowy lub 4-toluenosulfonylowy, R2 oznacza atom wodoru, rodnik fenylo¬ wy, alkilowy o 16 atomach wegla tub cykloheksylowy, X oznacza rodnik metylenowy lub pojedyncze wiazanie, R3 oznacza prostolancuchowy, rozgaleziony lub pierscieniowy rodnik alkilowy o 3—8 atomach wegla, R* oznacza prostolancuchowy, rozgaleziony lub pierscieniowy rodnik alkilowy o 3-8 atomach wegla, rodnik feny- lowy lub benzylowy, R5 oznacza atom wodoru lub rodnik guanylowy, R6 oznacza rodnik fenylowy, nitrofenylo- wy, metylenitrofenyIowy, dwunitrofenylowy, naftylowy, nitronaftylowy, chinolilowy lub nitrochinolilowy, a u oznacza liczbe calkowita 2, 3 lub 4, w postaci wolnych zasad lub addycyjnych soli tych zasad z kwasami, znamienny I y m, ze aminokwas zawierajacy ugrupowanie o wzorze R5 NH/CH2 /n CHNH/B1/CO, w którym R5 ma wyzej podane znaczenie a BI oznacza grupe blokujaca poddaje sie reakcji ze zwiazkiem zawierajacym grupe chromoforowa R6 posiadajaca wyzej podane znaczenie, a nastepnie z aminokwasem zawierajacym ugrupowanie o wzorze R4 (1IN11/B1/CO, w którym R4 ma wyzej podane znaczeniee a BI oznacza grupe blokujaca, poczyni otrzymani strukture peptydowa poddaje sie reakcji z aminokwasem zawierajacym ugrupowanie o wzorze R2N/BI/XCIIRjCO-. w którym R2, R3 oraz X maja wyzej podane znaczenie a BI oznacza grupe blokujaca a do wytworzonej struktury peplydowej wprowadza sie grupe o wzorze Ri posiadajaca wyzej podane znaczenie.
2. 2. Sposób wytwarzania nowych zwiazków diagnostycznych o duzej wrazliwosci na trypsyne i inne enzymy proteolityczne typu peptydohyclrolaz peptydowych, o strukturze wyrazonej wzorem przedstawionym na rysun¬ ku, w którym to wzorze Rj oznacza atom wodoru, rodnik acylowy o 1 12 atomach wegla, co-aminoacylowy 0 1 12 atomach wegla, cyklohcksylokarbonylowy, co-cykloheksyloacylowy, 4-aminometylocyklohcksylokarbo- nylowy. benzoilowy ewentualnie podstawiony jednym lub wieksza liczba atomów chlorowca, grupa metylowa, ai-Muuwa lub fenylowa, rodnik co-fenyloacylowy o 16 atomach wegla w czesci acylowej, ewentualnie podsta- 1 : ny w pierscieniu, rodnik benzenosulfonylowy lub 4-toluenosulfonylowy, R2 oznacza atom wodoru, rodnik fenylowy, alkilowy o 1 6 atomach wegla lub cykloheksylowy, X oznacza rodnik metylenowy lub pojedyncze wiazania, R3 oznacza prostolancuchowy, rozgaleziony lub pierscieniowy rodnik alkilowy o 3-8 atomach wegla, R4 oznacza prostolancuchowy, rozgaleziony lub pierscieniowy rodnik alkilowy o 3 8 atomach wegla, rodnik fenylowy lub benzylowy, Rs oznacza atom wodoru lub rodnik guanylowy, R6 oznacza rodnik fenylowy, nitrofe- nylowy, mctylonitrofenylowy, dwunitrofenylowy, naftylowy, nitronaftylowy, chinolilowy lub nitrochinolilowy, a n oznacza liczbe calkowita 2, 3 lub 4, w postaci wolnych zasad lub addycyjnych soli tych zasad z kwasami, z 11 a iti i e n n y t y 111, ze aminokwas zawierajacy ugrupowanie o wzorze R5 NH/CH2 /nCHNH/Bl/CO- wktórym R5 ma wyzej podane znaczenie a BI oznacza grupe blokujaca poddaje sie reakcji z aminokwasem zawierajacym ugrupo¬ wanie o wzorze R4 Cl INJI/BI/CO-, w których R4 ma wyzej podane znaczenie a BI oznacza grupe blokujaca, wytworzona strukture peptydowa poddaje sie dalej reakcji z aminokwasem zawierajacym ugrupowanie o wzorze R2N/BI/XC11 R3CO-, w którym R2, R3 oraz X maja wyzej podane znaczenie, a do wytworzonej struktury peptydowej wprowadza sie grupe o wzorze R{ posiadajaca wyzej podane znaczenie, z utworzonego ugrupowania usuwa sie grupy blokujace i wprowadza grupe chromoforowa R6 o wyzej podanym znaczeniu.V 89227 13 Tablica I. Aktywnosc trypsynowa, Km i k*. Substrat 1 BAPNA I II IV Stezenie substratu Ga mol/l) 250-666 33,6-112,0 35,0-150,0 35,0-150,0 Stezenie enzymu (NIH/ml) 75 6 3,3 3,3 '¦".:Krt!X'lQV'.- (mol/l) 16 7,40 0,64 0,17 k3 x 104 (H mol/min, NIH/ml) 8,3 330 276 71 Tablica II. Aktywnosc trombinowa, Km i k3 Substrat 1 BAPNA I Stezenie substratu Ou mol/l) 250-666 33,6-112,0 Stezenie enzymu (NIH/ml) 50 10 Km x 104 (mol/l) ~6 2,92 k3 x 104 (p. mol/min, NIH/ml) ~11 40 Tablica III. Aktywnosc trypsynowa Substrat I BAPNA II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII Stezenie substratu /umol/ml 333,0 66,9 66,7 67,C 66,3 66,8 66,2 66,7 67,0 67,1 66,3 65,9 66,9 Stezenie enzymu jednostek/ml 50,0 0,0833 0,0833 0,0833 0,0833 0,0833 0,0833 0,0833 0,0833 0,0833 0,0833 0,0833 0,0833 Utworzona p-nitroanilina jumol/min/ml 1,04 1'4,2 16,8 10,2 22,7 12,8 16,6 17,1 12,0 15,5 12,4 16,5 16,7 TablicaIV. Aktywnosc trombinowa Substrat BAPNA II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV Stezenie substratu ^mol/ml 333,0 66,9 67,2 67,0 66,5 66,8 66,2 66,7 67,0 67,1 66,3 66,3 66,9 67,0 Stezenie enzymu jednostek/NIH/ml 2,08 0,417 0,417 0,417 0,417 0,417 0,417 0,417 0,417 0,417 0,417 0,417 0,417 0,417 Utworzona p-nitroanilina jumol/min/ml 6,1 1,8- 0,5 0,9 W 0,2 0,4 0,1 0,3 0,4 0,2 0,7 0,2 0,114 89 227 Substrat II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XVII TablicaV. Aktywnosc plazminowa Stezenie substratu jumol/ml 66,9 66,7 67,0 66,5 66,8 66,2 66,7 66,3 67,1 66,3 65,9 66,9 67,0 Stezenie enzymu jednostek/CU/ml 0,167 0,167 0,167 0,167 0,167 0,167 0,167 0,167 0,167 0,167 0,167 0,167 0.167 Utworzona.p-nitroanilina Atmol/min/ml 2J "1 17,2 2,7 7,7 2,8 2,2 4,0 1,5 17,2 2,0 1,5 17,9 21,3 9 o o RrN-X-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-RR II II 6 R2 R3 R< (CH^n. NH i R5 Wzór Prac. Poligraf. UP PRL naklad 120+18 CenalOzl PL