Opis patentowy opublikowano: 15.07.1977 87546 MKPC07g 11/00 Int. CI.2 • — ¦¦•¦; C07G ii/oa Twórcy wynalazku: Edward Borowski, Malgbinzata Gumiendak, Maciej Smulikowski, Haona Wojciechowska, Wojciech Giruszeoki Uprawniony z patentu: Politechnika Gdanska, Gdansk (Polska) Sposób otrzymywania N-acylowych pochodnych dezalanylotetainy Piraedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia N-acylowych pochodnych dezalanylotetainy.Antybiotyk 'tetaina, wytwarzany przez szczep V Bacillus pumilus, wykazuje szereg interesujacych wlasnosci biologicznych. Cechuje sie bardzo duza aktywnoscia przeciwdrobnoustrojowa, obejmujac za¬ kresem swego dzialania liczne bakterie grammdo- datnie i gramnuujemne, jaik tez i szereg innych mi¬ kroorganizmów.Szczególnie cenna cecha tetainy jest niska toksycz¬ nosc dla organizmów zwierzecych ,wynikajaca z me¬ chanizmu jej dzialania, który polega na hamowa¬ niu syntezy mureiny sciany komórkowej drobno¬ ustroju ;poprzez zahamowanie inkorporacji pierw¬ szego aminokwasu — alaniny do reszty kwasu N- acetylomuiraimlinowego. Dotychczas nie sa znane an¬ tybiotyki, które hamuja ten proces enzymatyczny.Zbadanie nowego mechanizmu hamowania synte¬ zy mureiny otwiera nowe mozliwosci uzyskiwania nietoksycznych chemoterapeutyków na drodze syn¬ tezy analogów strukturalnych tetainy. Otrzymanie takich analogów jest celowe równiez i ze wzgledu na to, ze sama tetaina jest podatna na dzialanie szeregu enzymów, laitwo powodujacych jej umiie- czynnienie w organizmach zywych. Enzymy te z je- ctaeij sforony powoduja hydiroliize wiazania pepltytdo- wago w czasteczce tetainy, uitworzonegio miiedizy gru¬ pe jkatiboksyllowa L-iailainiiiny, a igirupa aminowa po¬ zostalej dzesdi czajsteczfoi tetainy, jaka jest diezalany- lotetaina. Powsitala w ten sposób wolna dezailanylote- Z taina jest biologicznie niecizynna^ Z drugiej slrbny (te enzymy katalizuja szereg niekorzystnych reakcji, zachodzacych we fragmencie dezalanylotetainówym antybiotykiu, prowadzac równiez do powstania sub- stancji biologicznie nieczynnych.Dotychczas nie sa znane N-acylowe pochodne dezalanylotetainy, jak równiez sposób ich otrzy¬ mywania.Celem wynalazku jest opracowanie sposobu otrzy- io mywania N-acylowych pochodnych dezalanyloteta¬ iny.Sposób otrzymywania N-acylowych pochodnych dezalanylotetainy wedlug wynalazku polega na tym, ze grupe aminowa dezalanylotetainy lub jej po~ !5 chodnych rop. peptydów, jak tetaina acyluje Sie N-chronionymd aminokwasami lub peptydami, wzglednie innymi zwiazkami, zdolnymi dó utworze¬ nia wiazania peptydowego i ewentualnie usuwa znanymi sposobami ochrony grup funkcyjnych z uzyskanego produktu koncowego.Dezalanylotetaina w skrócie DAT jest mieszanina dwóch izomerycznych subsatncji nazwanych dezala¬ nylotetaina A i B, otrzymywanych z tetainy, która równiez jest mieszanina dwóch izomerycznych zwiazków zwanych tetaina A i B. Oba skladniki mieszanin posiadaja te same grupy funkcyjne i wy¬ kazuja podobna reaktywnosc chemiczna. Pólsynte- tyczne pochodne mozna otrzymac w identyczny spo¬ sób zarówno ze sklaidników A i B, jak tez • i' z ich so mieszaniny. 87 54887 546 3 Zaleta sposobu wedlug wynalazku jest wysoka czystosc produktu koncowego, który charakteryzuje sie zwiekszona odpornoscia na dzialanie wspomnia¬ nych wyzej enzymów imieczynniajacych oraz wy- eliminowanie-powstawania produktów ubocznych.Przyklad I. 15 mg dezalanylotetainy A w po¬ staci ^liofilizowanego proszku zawiesza sie w 1 ml suchego dwumetyloformamidu i po wymieszaniu dziala sie 15 mg chlorowodorku chlorku kwasu D-C—)-a-aminofenylooctowego. Reagenty miesza sie przez godzine, nastepnie dodaje sie 5 ml eteru i sa¬ czy wytracany osad zawierajacy glównie D-a-amino^ fenyloacetylodezalanylotetaine.Analiza po krystalizacji z acetonu i wody: N zna¬ lezione: 8,21; N obliczone: 8,429. Jon masowy, uzy¬ skany w widmie spektrometrii masowej technika ^ „field desorption"— 332* , i^r^fyift nrtt 11. 15 mg dezalanylotetainy A -.a««rte»zoAei w 0,1 ml dwumetyloformamidu reaguje z 10 ^m£ N-karbc*sytezWodnika kwasu D-<(—)-a- -aminofenylooctowego, w obecnosci N-metylomorfo- lmy, utrzymujacej pH roztworu w granicach 9. Po godzinie mieszania odparowuje sie prózniowo roz¬ puszczalnik i otrzymuje jako glówny produkt B-a- -aminofenyloacetylodezalanylotetaine.Analiza po krystalizacji z acetonu i wody: N zna¬ lezione: 8,25; N obliczone: 8,429. Jon masowy na widmie spektrometrii masowej, wykonany technika „field desorption" — 332.Przyklad. IU. Do 3,7 mg dezalanylotetainy B rozpuszczonej w 0,5 ml wody, dodaje sie roztwór za¬ wierajacy 1,5 mg N-toariboksyfbezwodniika L-ailaniiny w 0,5 ml telrahydrofuranu. Po 20 godzinach reakcji w 'temperaturze 0°C mieszanine odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem i otrzymuje jako glówny produkt surowa tetaine *B.Analiza po krystalizacji z acetonu i wody: N zna¬ lezione: 10,18; N obliczone: 10,306. Jon masowy na widmie spektrometrii masowej, wykonany technika „field desorption" — 270.Przyklad IV. Do 3,7 mg dezalanylotetainy rozpuszczonej w 0,5 ml wody, dodaje sie roztwór* za¬ wierajacy 2,4 mg N-karboksybezwodnika. L-fenyló- alaniny w 0,5 ml dwumelyioiflormamidu. Po 20 go¬ dzinach reakcji w temperaturze 0°C mieszanine od¬ parowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem i otrzy¬ muje jako glówny produkt L-fenyloalanylodezalany- lotetaine.Analiza po krystalizacji z acetonu i wody: N zna¬ lezione: 8,01; N obliczone: 8,088. Jon masowy na Widmie spektrometrii masowej, wykonany technika „field desorption" — 346.Przyklad V. Do 37 mg dezalanylotetainy, rozpuszczonej w 5 ml ibuforu Michaelisa o pH 8,2 w temperaturze 0°C dodaje sie przy silnym miesza¬ niu roztwór zawierajacy 21,2 mg N-karboksybez- wodnika L-alaniny w 5 ml tetrahydrofuranu. Po godzinach reakcji w temperaturze 0°C miesza¬ nine odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem, a otrzymana surowa tetaine oczyszcza na kolumnie chromatograficznej, wypelnionej zelem krzemionko¬ wym . w dkfcacbie ohloroform/metanol/woda 16 :4 : : 0,5. Wydajnosc reakcji wynosi 70%.Analrza po Ikrystallizacji z acetonu i wody: N zna¬ lezione: 10,31; N obliczone: 10,366. Jon masowy na ;; 4 widmie spektrometrii masowej, wykonanej technika „field desorption" — 270.Przyklad VI. Do 37 mg dezalanylotetainy B rozpuszczonej w 5 ml buforu o pH 10, w tempera- turze 0°C dodaje sie przy intensywnym mieszaniu 21,2 mg N-kiaii1x)lksylbeizwodnilka L-alanliny. Po 5 mi¬ nutach doprowadza sie pH do 7 i wydziela otrzy¬ mana tetadne B, jak w przykladzie V. Wydajnosc reakcji wynosi 78%. io Analiza po krystalizacji z acetonu i wody: N zna¬ lezione: 10,25; N obliczone: 10,366. Jon masowy na "' widmie spektrometrii masowej, wykonany technika „field desorption" — 270.Przyklad VII. Do 10 mg liofilizatu tetai- ia ny B rozpuszczonego w 1 ml wody dodaje sie roz¬ twór zawierajacy 3 mg N-karboksybezwodnika L- alaniny W 1 ml tetrahydrofuranu. Po 20 godzinach reakcji w temperaturze 0°C mieszanine odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem i jako glówny produkt otrzymuje I^alanylotetaine B.Analiza po krystalizacji z acetonu i wody: N zna¬ lezione: 12,10; N obliczone: 12,312. Jon masowy na Widmie spektrometrii masowej, wykonany technika „field desorption" — 341.Przyklad VIII. Do 10 mg Mofilizatu teta- iny A rozpuszczonego w 3 ml dwumetyloformamidu dodaje sie roztwór zawierajacy 4,4 mg NHkarboksy- bezwodniika kwasu D-a-aminofenylooctowego w 1 ml dwumetyloformamidu. Po 20 godzinach reakcji m w temperitilsnae 0°C mieszanine odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem i jako glówny produkt Otrzymuje sie D-aHaminofenyloaoe^yilotetaiine A.Analiza po krystalizacji z acetonu i wody: N zna¬ lezione: 10y22; N obliczone: 10,417. Jon masowy na widmie spektrometrii masowej, wykonany technika „field desorption" — 405.Przyklad IX. Do 10 mg liofilizatu tetainy w 1 ml buforu MichaeDisa o pH 8,2 dodaje sie roz¬ twór zawierajacy 4,8 mg N-karboksyfoezwodnika L- 40 fenyloalaniny w 1 ml tetrahydrofuranu. Po 20 go¬ dzinach reakcji w temperaturze 0°C mieszanine od¬ parowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem i jako glówny produkt otrzymuje sie L-fenyloalanylote- taine. 45 Analiza po krystalizacji :z acetonu i wody: N zna¬ lezione: 10,01; N obliczone: 10,067. Jon masowy na widmie spektrometrii masowej, wykonany technika „field desorption" — 417.Przyklad X. 500 mg benzoiloglicylofenylo- 50 alanyloalaniny zawiesza sie w 10 ml tetrahydrofu¬ ranu i dodaje 0,11 ml N-metylomorfoliny, a po schlodzeniu do temperatury —10°C dodaje sie 0,134 ml chloromrówczanu izobutylowego. Po 15 mi¬ nutach intensywnego mieszania w tej temperaturze 55 wkrapla sie roztwór 200 mg dezalanylotetainy w 5 ml buforu Michaelisa o pH 8,2 i prowadzi reak¬ cje przez 3 godziny w temperaturze 0°C. Po tym czasie odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem tetrahydrofuran i po doprowadzeniu pH do 6 60 ekstrahuje produkt reakcji octanem etylu. Nastepnie rozpuszczalnik odparowuje sie pod zmniejszonym cLaniienaiem, a pozosltalotsc izawiesea w (buforze fosfo¬ ranowym o pH 7,6 z dodatkiem 25" mg chymótryp- 65 syny. Mieszanine reakcyjna miesza 6ie w tempera- turze 30°C badajac chromatograficznie przebieg8? 546 6 Nr przy* kladu XI XII XIII XIV XV XVI XVII XVIII XIX XK xpa XXII XXIII XXIV xxv XXVI mvii XXVIII XXIX xxx XXXI XXXII XXXIII XXXIV XiXXV XXXVI X2CXVII XiXKVIII XXXIX XL , XLI XLII XLIII XLIV XLV XLVI | Pochodzenie dezalanylotetainy D-fenyloalanylodezalanylotetaina D-alanylodezalanylotetaina Glicylodezalanylotetaiaia I1yrozylodezalanylotetaina L-walilodezalanylotetaima L-norwaHlodezaianyloitetaina L-leucylodezalanylotetaiina L-izoleucylodezalanyloitetalna LHnorleucylodezalainylotetaina jff-alanylodezalanylotetaina a-aminoizobutyiylodezalanylotetaina L-a-aminobutyrylodezalanylotetaina I^a-aoiiiinofenyloacetylodezalanylotetaina O^jenzyloseaylodezalanylotetaiLna S-beoizylocystóinylodezalanylotetaim sarkozylodezalainyiotetaioa L-NHmetyloalanylodezalanylotetaina N-fenyloglicylodezalanylotetaina D-fenyloalanylotetaima D-alanylotetaina glicylotetaina L-tyrozylotetaina L-walilotetaiina L-norwalilotetaina L-leucylotetaina D-izoleucylotetaina L-norleucylotelaina ^-alanylotetaina a-amtooizobutyaylotetaina L-aHamipobutyrylotetoina L-a^amioiofenyloacetylotetaina O-bemzyloserylotetaiina S-benzylocysteinylotetaina sairkozylotetaina L-N-metyloalanylotetaina N-fenyloglicylotetaina | Sposób otrz.IV V III III III III IV IV IV III III IV IV IV IV III III IV VII VIII VII IX IX IX IX IX IX IX IX IX VIII VIII VIII IX IX VIII | N znal. 8,05 ,25 ,85 7,62 9,19 9,25 8,92 8,85 8,71 ,15 9,67 9,72 8,21 7,25 7,02 ,31 1 9,76 8,27 9,98 12,30 12,81 9,59 11,25 11,19 ,76 ,70 ,69 12,30 11,82 11,69 ,38 9,49 8,98 12,12 11,63 ,23 | N obi. 8,088 ,366'" ,933 7,731 9,39 9,39 8,969 8,969 8,969 101,366 9,854 9,894 8,429 7,443 7,138 ,366 9,854 8,429 ,067 12,312 1 12,838 9,695 11,376 11,376 ,96 ,96 ,96 12,312 11,825 11,825 ,417 9,74 9,066 12,312 11,825 ,417 1 Jon masowy 346 270 .256 362 298 298 312 312 312 270 284 284 332 376 392 270 284 332 „ 417 341 327 433 369 369 383 383 383 312 355 355 403 431 463 341 395 417 1 reakcji. Po calkowitym zaniku substratu roztwór oraz biochromatografiii. Ponadto, przy pomocy chro- doprowadza sie do pH 5, odwirowuje osad i prze- 35 mafografii cienkowarstwowej i bibulowej wobec prowadza sorbcje surowej tetainy na weglu dezak- wzorców badano produkty enzymatycznego rozszcze- tywowym tyrozyna, a nastepnie desorbuje 6% wod- piania otrzymanych zwiazków na skladowe amino- nym roztworem butanolu. Ekstrakt nateza sie pod kwasy, wykonane zgodnie z publikacja (Roczniki zmniejszonym cisnieniem i oczyszcza na kolumnie Chemii 40, 1195 (1966). chromatograficznej wypelnionej zelem krzemionko- 40 wym w ukladzie butanol/woda/metanol 10 :10 :1 — górna faza. Wydajnosc reakcji rzedu 40%. PL