Przedmiotem wynalazku jest równiez sposób wy- twarzamia farmakologicznie dopuszczalnych, to zna¬ czy nie toksycznych ^pochodnych antybiotyku 67^094 takich, jak farmakologicznie dopuszczalne sole. Do 'typowych soli naleza sole addycyjne z kwasami, po¬ chodne kwasów nieorganicznych takich, jak kwas solny, kwas siamkowy lub fosforowy, lufo sole kwa¬ sów organicznych takildh, jak kwas octowy, bur¬ sztynowy, cytrynowy, mlekowy, jablkowy, malono- wy, maleinowy, winowy, gHuterowy, liaurynowy, adaman1x)nokairboklsylowy, cynamonowy, kamforo¬ wy, palmitynowy, stearynowy, undecyienowy i po- doibne kwasy. Sole tafcie mozna wytworzyc, podda¬ jac antybiotyk 67—694 lub jego reaktywna pochod¬ na reakcji z odpowiednim kwasem lufo jego reak¬ tywna pochodna i wyodirehniajac wytworzona sól. 4) Biologiczne wlasciwosci antybiotyku 67—694 I. Czynnosc in vitro. Czynnosc in Vitro antyfoioty¬ ku 67—694 o mocy 775 p g/mg stwierdzono za po¬ moca konwencjonalnej metody rozcienczen w pro¬ bówkach, stosujac jako pozywke ekstrakt dirozdz©^ wy i bulion wolowy przy wartosci pH =* 7,4. Pro¬ bówki infcufoowano w ciagu 18 godzin w tempera- 60 turze 37°C i nastepnie sprawdzana Wyniki ozna¬ czen podano ponizej w tablicy 6. Wykazuja one, ze antybiotyk posiada 'dosc szerokie spektrum prze- ciwbakteryjne in vittro, przy czym czynnosc jego jest silniej wyrazona w stosunku do bakterii gram- 65 dodatnich. 40 45 50 5587 225 16 Tablica 6 Organizm Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Enterococcus sp.Diplococcus pneuimioniae Escharichia coli Klebsiella pneuimoniae Aeix}bacter aerogenes -Proteus sip.Pseudioimonas aeruginosa Salmonella schottmuelleri Ilosc szcze¬ pów 6 7 2 3 3 4 3 3 4 3 Minimalne ste¬ zenie hamujace {ju g/ml) zakres* 0,03 — 3,0 0,75 — 3,0 0,03 — 0,08 0,03 — 0,08 3,0 0,3 — 3,0 0,75 — 7,5 0,3 0,75 — 3,0 0,3 — 3,0 * Stosowano antybiotyk 67—694 o mocy 775 ng/ml i wy¬ niki przeliczono na moc 1000 ng/ml. Liczby podane w ta¬ blicy 6 dotycza wiec mocy 1000 pg.II. Czynnosci in vivo. Ochronne 'dzialanie anty¬ biotyku 67—694 o mocy 1000 ^g/mg testowano ma sanucaclh myszy CF-1 (Carworth Farmia) o wadze okolo 20 g kazdy. Antybtiotyk podawano w postaci zawiesiny lub rdztworu w nosniku wodnym zawie¬ rajacym 0„5% ikarbcteymetylloceliuilozy w dwóch dawkach. Pierwsza dawke podawano bezposrednio przed dootrzewnowym zakazeniem bakteriami, dru¬ ga po uplywie 4 godzin. Zakazone nieleczone my¬ szy kontrolne w zasadzie padaly po uplywie 18 go¬ dzin. Wyniki w leczonej grupie oznaczano po uply¬ wie 48 godzin od zakazenia. Wyniki testów in vivo podano w ta/blicy 7, stosujac reprezentatywne szczepy gram-dodatnie i reprezentatywne szczepy gram^ujemne.Tablica 7 Organizm Staphylococcus aureus gray Streptococcus 1 pyogenes C Sposób podania podskórnie idoustnie podskórnie doustnie Czynnosc ochronna u myszy PD50 mg/kg 50 200 50 200 | III. Toksycznosc ostra. Toksycznosc ostra wyrazo¬ na jako LD50 antybiotyku 67—694 podano ponizej w tablicy 8.Tablica 8 Sposób podaniia dootrzewnowo podskórnie dozylnie LD50 (mg/kg) 350 625 155 " 25 40 45 50 55 60 Antybiotyk 67—694 i jego farmakologicznie do¬ puszczalne pochodne mozna stosowac same lub w polaczeniu z innymi czynnikami, pirzeciwbakteryj- nymi w celu zapobiegania wzrostowi lub zmniej¬ szenia ilosci wrazliwych mitorooirganilzmów, zwla¬ szcza organizmów igram^dodatnich, podanych w ta¬ blicy 6. Tak wiec lanityibiotyk 67—694 i jego far¬ makologicznie dopuszczalne pochodne mozna stoso¬ wac w roztworach, sluzacych do celów sanitarnych takich,, jak czyszczenie szkla laboratoryjnego i wy¬ posazenia, a równiez do celów pralniczych, na przyklad do plukania odziezy ochronnej w labora¬ torium. Ponadto antybiotyk 67—694 i ijego farma¬ kologicznie dopuszczalne sole mozna stosowac w le¬ czeniu zwierzat laboratoryjnych i domowych za¬ kazonych wrazliwymi na ten antybiotyk organi¬ zmami, w postaci preparatów farmaceutycznych, zwlaszcza dawek jednostkowych .takich, jiak np. kapsulki*, zawiesiny, kremy, masci itp1.Wymienione postacie leku, poza postaciami do stosowania miejscowego, sa przeznaczone do poda¬ wania okolo 5—50 mg lantyibiiotyku (w postaci wol¬ nej zasady) na kilogram wagi ciala dziennie. Uwa¬ za sie, ze leki ipowinnio sie podawac do 8 razy w cia¬ gu 24 godzin. Postacie do stosowania miejiscowego powinny byc stosowlane na zakazonej powierzchni okolo 2—4 nazy dziennie. Nalezy jednak zauwazyc, ze wielkosc podawanej idawki zalezy w znacznym stopniu iod (rodzaju zalkazeniia, stanu zaktazenia i osobniczych cech gatunku leczonego zwierzecia.[Nastepujace przyklady wyjasniaja blizej sposób wedlug wynalazku. Przyklady I i II wyjasniaja spo- sób hodowli Micnomionospora rosairia, przy czym stosowano szczep, oznaczony NRRL 3718 i sposób wytwarzania antybiotyku 67—694. Przyklady II—V wyjiaisniaja sposób wyodrebniania i loczyszczaniia an¬ tybiotyku 67^694. Przyklady VI—VII wyjasniaja sposób wytwarzania wymienibinych soli antybioty¬ ku 67^694.Przyklad sanydh.I. Fermentacja w kolbach wytrza- A. Etap zarodnikowania. W warunkach aseptycz- nych dodaje sie za pomoca ezy 0„5 ml hodowli Mi- cromonospora rosaria z skosnej hodowli lub ho¬ dowli liofilizowanej M. rosaria ido 100 ml jialowego podloza, znajdujacego sie w 300 ml kolbie stozkowej, o skladzie: Bacto-ekstrakt wolowy (Disfco) Bacto-tryptoiza i(Difico) Bacto-iekstrakt drozdzowy (Difco dekstroza skrobia ziemniaczana weglan wapniowy woda wodociagowa 3-g g g 1 g 24 g 2 g 1000 ml Zawartosc kolby inkulbuije isie w temperaturze °C w ciagu 72 godzin, mieszajac na wyttazasarce obrotowej.B. Etap fermentacji. Przenosi sie aseptycznie po ml inooulum, wytworzonego w poprzednim etapie 65 zarodnikowania do kazdej z 500 ml kolb stozkowych,87 225 17 zawierajacych po 100 ml jalowej pozywki o skla¬ dzie: RaCto-eks-trakt drozdzowy (Difco) 5 g stale skladniki naimoku kukurydzianego 1 g skrobia 30 g weglanwapniowy 1 g woda wodociagowa 1000 ml Zawatrtosc kolby inkubuije sie w temeperaturze 28°C w ciagu 72^-il0O godzin, mieszajac na wy¬ trzasarce obrotowej. Po 'Uplywie 24 godzin pobiera sie okresowo próbki z podlozy fermentacyjnych i sprawdza czynnosc antybiotyczna tak, aby ustalic etap, w którym czynnosc antybiotyczna podloza fermentacyjnego osiagnie maksimum. Po stwierdze¬ niu maksimum .czynnosci, a wiec zakonczenie pro¬ cesu fermentacyjnego, laczy sie zawartosc kolb, celem wyodrebnienia nastepnie antyibiotycznie czyn¬ nego produktu.W czasie zarodnikowania i fermentacji dtrzymuje sie wartosc pH pozywlki w korzysltnym zakresie za pomoca buforujacego dzialania weglanu wapniowe¬ go, stanowiacego skladnik pozywki. Hodowle pro¬ wadzi sie w warunkach aerobowej fermentacji gle¬ binowej.Przyk l a d II. Fermentacja w tanku A. Etap zarodnikowania. W wairunkach aseptycz- nydh dodaje sie 25 ml inoouluim, przygotowanego), jak opisano w przykladzie IA, do 500 ml jalowego podloza o skladzie, podanym w przykladzie IA, znaj¬ dujacego sie w 2-litrowej kolbie stozkowej. Zawar¬ tosc kolby poddaje Sie inkubacji w temperaturze 28°C w ciagu 72 godzin, mieszajac na wytrzasarce obrotowej.B. Etap fermentacji. Caly produkt etapu zarodni¬ kowania przenosi sie aseptycznie do fermeiDtora o pojemnosci 14 litrów, zawierajacego 9,5 litra pod¬ loza., stosowanego w przykladzie IB. Dodaje sie 6 ml czynnika przeciwjpiennego (ma przyklad o na¬ zwie handlowej Dow-Oarning B) i nastawia war¬ tosc pH mieszaniny na okolo 7,0, stosujac albo rozcienczony (1 n) wodny, roztwór wodorotlenku so¬ dowego lub rozcienczony (1 n) wodny noztwór kwa¬ su siarkowego. Mieszanine poddaje sie fermenta¬ cji w temperaturze 28°C, do uzyskania maksimum czynnosci antybiotycznej, co zwykle osiaga sie po fermentacji trwajacej 72—100 godzin. Podczas fer¬ mentacji utrzymuje sie warunki aerobowe, przepu¬ szczajac powietrze 1przez podloze fermentacyjne.Korzystne okazalo sie przepuszczanie powietrza z szybkoscia okolo 3,5 litra/minute.Przyklad III. Wyodrebnianie antybiotyku 67—694. Wartosc pH podloza po fermentacji, pro¬ wadzonej sposobem wedlug przykladu II, nastawia sie na okolo 9,5 za pomoca 1 n roztworu Wodoro¬ tlenku sodowego i nastepnie podloze ekstrahuje kolejno porcjami po 20 litrów1 ocltanu etylu do sku¬ tecznego usuniecia antybiortycznie czynnego produk¬ tu. ZwyMe wystarcza 2-^5 ekstrakcji. Laczy sie ekstrakty w octanie etylu i zageszcza je pod zmniej¬ szonym cisnieniem do objetosci okolo 200 ml.Biologicznie czynny material ekstrahuje sie po¬ nownie z ekstraktu w octanie etylu za pomoca oko- 18 lo 200 ml 0,1 n wodnego roztworu kwasu siarko¬ wego. Wartosc pH kwasnego ekstraktu nastawia sie na okolo 9,5 za pomoca rozcienczonego wodnego roztworu wodorotlenku sodowego i ponownie efcs- trahuje octanem etylu. Ekstrakty laczy sie i odpa¬ rowuje pod zmniejszonym aisndeniem do okolo mi. Koncentrat dodaje siie ido okolo 100 ml ener¬ gicznie mieszanej mieszaniny 6 objetosci eteru ety¬ lowego i 4 objetosci heksanu. Odsacza sie osad, przemywa go niewielka 'iloscia swiezej mieszaniny eteru etylowego i 'heksanu i odrzuca. Laczy sie przesacze i przemywki z eteru etylowego i heksa¬ nu i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem do sucha.Pozostalosc rozpuszcza sie w okolo 5 ml eteru etylowego, saczy i nastepnie, mieszajac dodaje do 60 ml eteru naftowego o temperaturze wrzenia 30— 60°C. Brudno bialy do zóltego osad 'Odsacza sie i przemywa niewielka iloscia eteru naftowego. Osad suszy sie w 'temperaiturze 40°C pod zmniejszonym cisnieniem. Antybiiotyczniie czynny produkt — su¬ rowy antybiotyk 67-694 wytworzony powyzszym sposobem, zwykle wykazuje moc okolo 700 /^g/mg w oznaczeniach opisanych poprzednlio.P rz y k l a d IV. Oczyszczanie antybiotyku 67-694.Antybiotyk 67-694, wytworzony wedlug przykladu III, rozpuszcza sie w mieszaninie chloroformu (9 czesci objetosciowych) i metanolu (1 czesc obje¬ tosciowa). Tak (otrzymany roztwór przepuszcza sie przez kolumne, zawierajaca 250 g kwasu krzemo¬ wego i nastepnie eluuje kolumne mieszanina chlo- roformu (8 czesci Objetosciowych) d metanolu (2 czesci objetosciowe). sg Zbiera sie 5 ml frakcje z szybkoscia okolo 0,5 ml na minute. Z kazdej frakcji pobiera sde próbke d bada za pomoca tesitu ma krazkach do Staphyliococous aureus. Czesc kazdej próbki pod¬ daje sie chromatografii cienkowarstwowej na plyt¬ kach z zelem krzemionkowym GF (igrulbosc 250 mi¬ kronów), dostepnych w firmie Analtech Inc. Wil- monigton, Delaware pod nazwa handlowa UnapOate.Frakcje, zawierajace antybiotyk 67-694, posiadaja wartosc Rf okolo 0,4—0,5. Frakcje o wartosci Rf 4g w tych graniicadh laczy sie i odlparowuje polaczone frakcje pod zmniejszonym cisnieniem do sucha. Po¬ zostalosc rozpuszcza sie w acetonie ii nasitepnie do¬ daje eteru etyflowego. Wytworzony osad odsacza sie lub odwirowuje i odrzuca. Przesacz lulb ciecz znad 5Q osaldu odparowuje sie do sucha pod zmniejszonym cisnieniem. Tak wytworzony an^biotycznie czynny produkt stanowi antybiotyk 67-694 o mocy 1000 [Ag/mg, usitalonej za .pomoca metody, oplisanej po¬ przednio d posiada nastepujace stale fizyczne: cc temperatura topnienia = 110°C—114°C. (a)g = —33,4° (stezenlile = 3% w etanolu) F,\°im cm = 238 flprzy 240 m fi) Widmto w podczerwieni — jak pokazano na fig. 1.Wiidmo magnetycznego rezonansu jadrowego — 60 jak pokazano na fig. 2. Pozostale wlasciwosci fi¬ zyczne i chemiczne tego produktu opisano po¬ przednlio.Przyklad V. Inny sposób wyodrebniania 65 i oczyszczania antybiotyku 67-694. Wartosc pH87 225 19 brzeczki pofermentacyjnej wytworzonej, jak w przykladzie II, nastawia sie na wartosc okolo 9,5, stosujac 1 n wodny roztwór wodorotlenku sodowe¬ go. Brzeczke pofermentacyjna ekstrahuje sie kolej- no porcjami po 20 litrów octanu etyfliu do efektyw- 5 negio usuniecia z niej antyfbiotycznie czynnej sub¬ stancji.ZwyMe wystarcza 2-^5 ekstrakcji. Nastepnie od¬ parowuje sie do sucha pod zmndejiszonym casnde- ntiem polajczone ekstrakty w octanie etylu. Pozosta- 10 losc rozpuszcza sie w mieszaninie chloroformu ii me¬ tanolu (-9 czesci objetoscdowyicih cMoitaformoi i 1 czesc objetosciowa metanolu) 1 roztwór prze¬ puszcza sie przez kolumne z kwasem krzemowym.Nastepnie kolumne eluuje sie rnueszaniina chloro- 15 formu d metanolu, skladajaca sie z 8 czesci obje¬ toscdowyicih chloroformu i 2 czesci objetosciowych metanolu. Zbiera sde 5 iml frakcje i z kazdej frak¬ cji pblbiera próbke. Czesc próbki bada sie metoda krazkowa w stosunku do Staiphyilocoaaus aaureus 20 i dmuga czesc próbki [poddaje dhromaiiografliti cien- kdwarstwowej na Unijpliate (jaazwa handlowa). La¬ czy sie frakcje o podobnych wantoscdach Rf. Frak¬ cje, zawierajace anlylbiotyk 67-694, posiadaja war¬ tosc Rf okolo 0,4—0,5. Erakcje te laczy sie ii od- 25 parowuje ido sudha pod zmimejiszonym cisnieniem.Pozostalosc rozipuszcza sie w acetontie i nastepnie dodaje eter etylowy. Wytworzony osad odsacza sie lufo odwaJrowuJe i osad odrzuca. Przesacz lub ciecz znald osadu odparowalje sie ido isucha pod zminiej- 30 szonytm dsndeitfem, otrzymujac stala pozostalosc.Tak wytworzony antybiolycznie czynny produkt stanowi antybiotyk 67-694, wykazujacy moc okolo 1000 ^g/mg d posiadiajajcy stale fizyczne zgodne z ipodanymi w przykladzieIV. S5 Przyklad VI. Sól: fosforan jednopotasowy antybiotyku 67-694. 500 mg antytdoHyku 67-694 do¬ daje sie do 13 mil wody. Nastepnie dodaje sie 130 mig fosforeJnu jednopotasowego i miesza w tern- 40 peratuirze otoczenia w ciagu 2 godzin, po czym do¬ daje sde okolo 50 mg wegla odbarwiajacego i mie¬ sza w ciagu 15 minut. Roztwór saczy sie i liofili¬ zuje, otrzymujac produkt wymdendony w tytule o temperaturze topnienia 118°C—121°C. 45 (a) =21,2° (0,3% w wodzie).Stosujac w zasadzie ten sam sposób i równo¬ wazne iilosci kwasów rozpuszczalnych w wodzie ta¬ kich,, jak kwas solny, siarkowy, fosforowy, octowy, 50 baireatymawy, cytrynowy, mflekowy, jalblkowy, ma- lonowy, maleinowy d podlolbne, mozna wytworzyc dopuszczalne farmakologicznie sole addycyjne z kwasami. W zasadzie takie sole wykazuja in vi- tro d in vivo widma poracawbafcteryjne podobne, 55 a nawet identyczne z widimem antiybakteryjnym wolnej zasady. Wystepuljace róznice nalezy przy- pdisac zwykle róznicom w rozpuszczalnosci. Dzieki rozpuszczalnosci w wodnych srodowiskach sole po¬ wyzsze miadaja sie zwlaszcza do stosowania w po- eo staci pnepiaratów wodnych d roztworów do podawa¬ nia doustnego li pozajelitowego.Przyklad VII. Sól antybiotyku 67-694 z kwa¬ sem winowym. 1 g antybiotyku 67-694 rozpuszcza 65 sie w 50 ml eteru etylowego i zadaje roztworem 250 mig kwasu winowego w 1,5 ml etanolu. Otrzy¬ many roatwór miesza sie w ciagu 15 imi/mit i na¬ stepnie odsacza wytracona sól. Osad przemywa sie eterem etylowym* suszy osad i otrzymuje w ten sposób zwiazek wymieniony w tytule o tempera¬ turze topnienia 129°C—134°C(o)]5 = —12° (0,3% w wodizde). Stosujac sposób, opisany w tym przykla¬ dzie i równowazne ilosci kwasów, rozpuszczalnych w ^mieszaniinadh eteru ii alkoholu takich^ jak kwas gliutarowy, ilaurylowy, adamanitanokarboksylowy, cy¬ namonowy, kamforowy, (palmitynowy, stearynowy, un|decylenowy i podobne, wytwarza sie odpowied¬ nie, farmakologicznie dopuszczalne sole addycyjne z kwasami. W zasadzie dzieki swojemu ciezarowi czasteczkowemu i rozpuszczalnosci sole te nadaja sie zwlaszcza do preparatów do stosowania miej¬ scowego takich, jak kremy i masci. PL PL PLThe invention also relates to a process for the preparation of pharmacologically acceptable, ie non-toxic, antibiotic derivatives 67 ^ 094, such as pharmacologically acceptable salts. Typical salts include acid addition salts, derivatives of inorganic acids such as hydrochloric acid, siamic acid or phosphoric acid, or salts of organic acids such as acetic acid, succinic acid, citric acid, lactic acid, malonic acid, malonic acid. yum, maleic, tartaric, gHuteric, liauric, adaman1x), nocairboxylic, cinnamic, camphoric, palmitic, stearic, undecyne, and similar acids. Taffeta salts can be prepared by reacting antibiotic 67-694 or a reactive derivative thereof with an appropriate acid or a reactive derivative thereof and isolating the salt formed. 4) Biological properties of the antibiotic 67-694 I. Activity in vitro. The in vitro activity of the antiphiotic 67-694 at a strength of 775 µg / mg was found by a conventional tube dilution method, using dirole extract and beef broth at a pH value of 7.4. Tubes were infused for 18 hours at 37 ° C and then checked. The results of the determinations are given below in Table 6. They show that the antibiotic has a fairly broad antimicrobial spectrum in vittro, its activity being more pronounced in relation to gram-positive bacteria. 40 45 50 5587 225 16 Table 6 Organism Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Enterococcus sp.Diplococcus pneuimioniae Escharichia coli Klebsiella pneuimoniae Aeix} bacter aerogenes -Proteus sip. Seudioimonas aeruginosa Salmonella 3 3 p. Inhibitory pressure (μg / ml) range * 0.03 - 3.0 0.75 - 3.0 0.03 - 0.08 0.03 - 0.08 3.0 0.3 - 3.0 0 75-7.5 0.3 0.75-3.0 0.3-3.0 * The antibiotic 67-694 was used with a potency of 775 ng / ml and the results were converted to a potency of 1000 ng / ml. The figures given in Table 6 therefore relate to a power of 1000 pg. II. In vivo activities. The protective effect of antibiotic 67-694 at a strength of 1000 µg / mg was tested in Sanucacl CF-1 mice (Carworth Farmia) weighing about 20 g each. The antibiotic was administered as a suspension or core in an aqueous medium containing 0-5% icarbcteymethylcelliuilose in two doses. The first dose was administered immediately prior to the intraperitoneal infection with the bacteria, the second one after 4 hours. The infected untreated control mice essentially died after 18 hours. The results in the treatment group were determined 48 hours after the infection. The results of the in vivo tests are given in Table 7 using representative gram positive strains and representative gram negative strains Table 7 Organism Staphylococcus aureus gray Streptococcus 1 pyogenes C Method of administration subcutaneously and orally subcutaneously orally Protective activity in mice PD50 mg / kg 50 200 50 200 | III. Acute toxicity. The acute toxicity expressed as the LD50 of antibiotic 67-694 is given in Table 8 below. Table 8 Method of administration intraperitoneally subcutaneously intravenously LD50 (mg / kg) 350 625 155 25 40 45 50 55 60 Antibiotic 67-694 and its pharmacologically acceptable the derivatives may be used alone or in conjunction with other antimicrobial agents to prevent the growth or reduction of the susceptible microbial organisms, especially the positive organisms listed in Table 6. Thus lanityibiotic 67-694 and its pharmaceuticals Macologically acceptable derivatives can be used in solutions for sanitary purposes, such as cleaning laboratory glassware and furnishings, and for laundry purposes, such as rinsing protective clothing in a laboratory. and its pharmaceutically acceptable salts can be used in the treatment of laboratory and domestic animals prohibited with antibiotic-sensitive organisms, in the form of pharmaceutical preparations. aceutical doses, in particular unit doses, such as capsules, suspensions, creams, ointments, etc. Said drug forms, apart from those for topical application, are intended for the administration of about 5 to 50 mg of lantibiotic (as free base) ) per kilogram of body weight per day. It is believed that drugs should be administered up to 8 times in 24 hours. Topical forms should be applied on the contaminated area, about 2 to 4 doses per day. It should be noted, however, that the amount administered and the dose largely depends on (the type of disease, the state of infection and the peculiarities of the species of animal treated. [The following examples explain the method according to the invention in more detail. strain, designated NRRL 3718 and the method of producing the antibiotic 67-694. Examples II-V explain the isolation and polishing of the antibiotic 67-694. Examples VI-VII explain the preparation of the said antibiotic salts 67-694. Fermentation in agitation flasks A. Sporulation step. Under aseptic conditions, 0 to 5 ml of a culture of Micomonospora rosaria from an oblique culture or from a freeze-dried culture of M. rosaria and to 100 ml of jial in 300 ml are added with the aid of an aseptic loop. ml conical flask, composed of: Bacto-beef extract (Disfco) Bacto-tryptoiza and (Difico) Bacto-yeast extract (Difco dextrose potato starch calcium carbonate tap water 3 g g 1 g 24 g 2 g 1000 ml The contents of the flask are incubated and incubated at ° C for 72 hours, mixing on a rotary mill. B. Fermentation stage. Aseptically transfer ml of inooulum prepared in the preceding stage 65 sporulation into each of 500 ml of conical flasks, 87 225 17 each containing 100 ml of sterile medium composed of: RaCto-ex-yeast (Difco) 5 g solid ingredients of corn oil. 1 g starch 30 g calcium carbonate 1 g tap water 1000 ml The contents of the flask are incubated at 28 ° C for 72-10 hours, while agitating on a rotary shaker. After 24 hours, samples are taken periodically from the fermentation medium and the antibiotic activity is checked to establish the stage at which the antibiotic activity of the fermentation medium will reach its maximum. After the maximum activity has been found, and thus the end of the fermentation process, the contents of the cobs are combined to isolate the then antibiotically active product. it, which is an ingredient of the medium. The cultivation is carried out under the conditions of aerobic soil fermentation. Example a d II. In-tank fermentation A. Spore formation step. 25 ml of inoouluim, prepared as described in example IA, are added in aseptic tubes to 500 ml of a sterile medium having the composition of example IA in a 2 liter conical flask. The contents of the flask are incubated at 28 ° C for 72 hours, while mixing on a rotary shaker. B. Fermentation stage. The entire product of the nucleation step is aseptically transferred to the 14 liter fermentor containing 9.5 liters of the medium used in Example IB. 6 ml of an antifoam (for example, the trade name Dow-Oarning B) is added and the pH of the mixture is adjusted to about 7.0 using either diluted (1N) aqueous, sodium hydroxide solution or diluted (1 n) an aqueous solution of sulfuric acid. The mixture is fermented at 28 ° C. until the maximum antibiotic activity is obtained, which is usually achieved after a fermentation period of 72 to 100 hours. During the fermentation, aerobic conditions are maintained by forcing air 1 through the fermentation medium. It has proven advantageous to pass the air at a rate of about 3.5 liters / minute. Example III. Isolation of Antibiotic 67-694. The pH of the fermentation medium, carried out according to the method of Example 2, is adjusted to about 9.5 with 1 N sodium hydroxide solution and then the medium is extracted successively with 20 liters of ethyl acetate each time until the antibiotically active product is removed effectively. here. Usually 2- ^ 5 extractions are enough. The ethyl acetate extracts are combined and concentrated under reduced pressure to a volume of about 200 ml. The biologically active material is re-extracted from the ethyl acetate extract with about 200 ml of 0.1N aqueous sulfuric acid solution. wego. The pH of the acidic extract is adjusted to about 9.5 with dilute aqueous sodium hydroxide solution and re-treated with ethyl acetate. The extracts are pooled and evaporated to approximately approximately under reduced aisndenium. The concentrate is added to about 100 ml of a vigorously stirred mixture of 6 volumes of ethyl ether and 4 volumes of hexane. The precipitate is filtered off, washed with a little fresh mixture of diethyl ether and hexane and discarded. Combine the filtrates and washings of diethyl ether and hexane and evaporate to dryness under reduced pressure. The remainder is dissolved in about 5 ml of diethyl ether, filtered and then added with stirring to 60 ml of petroleum ether bp 30-60 ° C. A dirty white to yellow precipitate. Filter off and wash with a little petroleum ether. The precipitate is dried at 40 ° C under reduced pressure. The antibiotic active product, crude antibiotic 67-694, prepared by the above method, usually shows a potency of about 700 µg / mg in the determinations described above. Purification of Antibiotic 67-694. Antibiotic 67-694, prepared according to Example 3, is dissolved in a mixture of chloroform (9 parts by volume) and methanol (1 part by volume). Yes (the obtained solution is passed through a column containing 250 g of silicic acid and then the column is eluted with a mixture of chloroform (8 parts by volume) and methanol (2 parts by volume). Sg 5 ml fractions are collected at a rate of about 0.5 ml Each fraction is sampled and tested with Staphyliococous aureus test discs Part of each sample is subjected to thin layer chromatography on GF silica gel plates (250 microns) available from Analtech Inc. Wilmonigton, Delaware under the trade name UnapOate. Fractions containing the antibiotic 67-694 have an Rf value of about 0.4-0.5. Fractions with an Rf value of 4g in these boundaries are combined and pooled fractions under reduced pressure to dryness. The residue is dissolved in acetone and immediately added with ethyl ether. The resulting precipitate is filtered off or centrifuged and discarded. not. The antibiotically active product thus produced is the antibiotic 67-694 with a strength of 1000 [mu] g / mg, established by the aid of the previously wrapped method, having the following physical constants: cc melting point = 110 ° C-114 ° C. (a) g = -33.4 ° (stezenilile = 3% in ethanol) F, µm cm = 238 µm at 240 µfi) Infrared spectrum - as shown in Fig. 1 Nuclear magnetic resonance spectrum - 60 as shown in Fig. 2. The remaining physical and chemical properties of this product are described in the following example. Example 5 Another method of isolating 65 and purifying antibiotic 67-694. The pH 87 225 19 of the fermentation broth prepared as in Example 2 is adjusted to a value of about 9.5 using a 1 N aqueous sodium hydroxide solution. The post-fermentation wort is extracted successively with 20 liters of ethyl acetate until the antiphiotic active substance is effectively removed from it. 2 to 5 extractions are sufficient. The combined ethyl acetate extracts are then evaporated to dryness under a reduced cascade. The residue is dissolved in a mixture of chloroform and methanol (9 parts by volume of cMoitaformol and 1 part by volume of methanol) and the solution is passed through a silicic acid column. The column is then eluted with a mixture of chloroform and methanol consisting of consists of 8 parts by volume chloroform and 2 parts by volume methanol. He collects 5 µl fractions and takes a sample from each fraction. A part of the sample is tested by the disc method in relation to Staiphyilocoaaus aaureus 20 and a long part of the sample is subjected to a thin-layer dhromaiiographite on Unijpliate (commercial name). There are fractions with similar Rf intents. The fractions containing the anlylbiotic 67-694 have an Rf value of about 0.4-0.5. These fractions are combined and the ido sudha evaporates under reduced pressure. The residue is dissolved in acetone and then diethyl ether is added. The formed precipitate is filtered off or the precipitate is weighed off and the precipitate is discarded. The slurry or liquid found in the sediment evaporated and dry under the reduced dsndeite to give a solid residue. The antibiotic active product thus produced is the antibiotic 67-694, showing a potency of about 1000 µg / mg d having physical constants consistent with those given in example IV. S5 Example VI. Salt: monopotassium phosphate of antibiotic 67-694. 500 mg of antioxidant 67-694 is added to 13 mils of water. Thereafter, 130 ml of monopotassium phosphorus are added and mixed in the ambient environment for 2 hours, then added about 50 mg of decolorizing carbon and mixed for 15 minutes. The solution is filtered and freeze-dried to give the title product, mp 118 ° C-121 ° C. 45 (a) = 21.2 ° (0.3% in water). Using essentially the same method and equivalent amounts of water-soluble acids such as hydrochloric, sulfuric, phosphoric, acetic acid, 50 baireatimous , citric, mfecic, sterile, malonic, maleic and hypersalmic, pharmacologically acceptable acid addition salts can be prepared. In principle, such salts exhibit in vitro and in vivo similar, or even identical to, the anti-bacterial spectrum of the free base. The differences that occur are usually due to differences in solubility. Due to their solubility in aqueous environments, the above salts are especially suitable for use in the form of aqueous parenterates for parenteral or oral administration. Example VII. Antibiotic 67-694 salt with tartaric acid. 1 g of the antibiotic 67-694 is dissolved in 50 ml of diethyl ether and treated with a solution of 250 ml of tartaric acid in 1.5 ml of ethanol. The resulting solution is stirred for 15 minutes and then the precipitated salt is filtered off. The precipitate is washed with diethyl ether, and the precipitate is dried to give the title compound, mp 129.degree. C. 134.degree. C. [deg.]] 5 = -12.degree. (0.3% in water). Using the method described in this example and the equivalent amounts of acids, soluble in ether and alcohol mixtures such as gliutaric, ilauric, adamanitanecarboxylic, zinonic, camphor, (palmitic, stearic, undecylene and the like) correspondingly, pharmacologically acceptable acid addition salts In principle, due to their molecular weight and solubility, these salts are particularly suitable for topical preparations such as creams and ointments.