NO134061B

NO134061B -

Info

Publication number: NO134061B
Application number: NO218/71A
Authority: NO
Inventors: M J Weinstein; G H Wagman; J A Marquez
Original assignee: Scherico Ltd
Priority date: 1970-01-22
Filing date: 1971-01-21
Publication date: 1976-05-03
Also published as: BG21241A3; PH9705A; PL87225B1; CH552583A; AT309677B; YU35162B; IL36043A; FR2081448A1; OA03679A; JPS5020157B1; CY851A; MY7600142A; IE35230L; GB1302142A; FR2081448B1; ZA71402B; FI48286C; IL36043A0; NO134061C; CA985193A

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte ved fremstilling av et hittil ukjent antibiotisk stoff betegnet antibiotikum 67-694 og salter derav, ved hvilken fremgangsmåte en mikroorganisme dyrkes i et næringsmedium under aerobe betingelser. The present invention relates to a method for the production of a hitherto unknown antibiotic substance designated antibiotic 67-694 and salts thereof, in which method a microorganism is grown in a nutrient medium under aerobic conditions.

Det omhandlede antibiotisk aktive stoff fåes ved dyrkning av The antibiotic active substance in question is obtained by cultivation of

en hittil ikke beskrevet art av Micromonospora, her betegnet Micromonospora rosaria. a hitherto undescribed species of Micromonospora, here termed Micromonospora rosaria.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kjennetegnes ved at der som mikroorganisme anvendes en stamme av arten Micromonospora rosaria, og at det aktive stoff eventuelt isoleres fra næringsmediet, og eventuelt overføres til et salt derav. The method according to the invention is characterized by the fact that a strain of the species Micromonospora rosaria is used as the microorganism, and that the active substance is optionally isolated from the nutrient medium, and optionally transferred to a salt thereof.

Mikroorganismen som anvendes ved foreliggende fremgangsmåte, The microorganism used in the present method,

er en antibiotikum 67-694-dannende art av slekten Micromonospora, hvilken art er blitt betegnet som Micromonospora rosaria (nedenfor også betegnet som M. rosaria). Denne art ble isolert fra en jord-prøve tatt fra en park (Little Thicket) i San Jacinto County, Texas, U.S.A. En av dens egenskaper er evnen til å produsere antibiotikum 67-694• En kultur av den levende organisme er deponert og utgjør en del av kultursamlingen til United States Department of Agriculture, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, hvor den er blitt tildelt samlingsnr. NRRL.3718- Under-, kulturer av Micromonospora rosaria NRRL 3718 er tilgjengelig for offentligheten ved henvendelse til den nevnte samling. M. rosaria er aerob og vokser godt på en rekke forskjellige faste og flytende næringsmedier. Den vokser særlig godt under sub-merse aerobe betingelser. M. rosaria kan skilles fra andre arter av Micromonospora ved en rekke taxonomiske parametre. Således viser makroskopisk undersøkelse av en 2-ukers kultur ved 24 - 26°C av M. rosaria (NRRL 3718) på et agarmedium inneholdende 3% "NZ Amine Type A" (et pepton som fåes ved enzymatisk oppslutning av casein som tjener som en kilde til nitrogen og er tilgjengelig fra Sheffield Chemical Company, Norwich, New York), 1% dextrose og 1,5% agar, temmelig god vekst uten noe synlig luftmycelium, koloniene er svakt hevet og er granulære til svakt foldet. Intet diffunderbart pigment sees. is an antibiotic 67-694-producing species of the genus Micromonospora, which species has been designated as Micromonospora rosaria (also designated as M. rosaria below). This species was isolated from a soil sample taken from a park (Little Thicket) in San Jacinto County, Texas, USA. One of its properties is the ability to produce antibiotic 67-694• A culture of the living organism has been deposited and forms part of the culture collection of the United States Department of Agriculture, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, where it has been assigned collection no. NRRL.3718- Sub-cultures of Micromonospora rosaria NRRL 3718 are available to the public on request from the aforementioned collection. M. rosaria is aerobic and grows well on a variety of solid and liquid nutrient media. It grows particularly well under sub-merse aerobic conditions. M. rosaria can be distinguished from other species of Micromonospora by a number of taxonomic parameters. Thus, macroscopic examination of a 2-week culture at 24 - 26°C of M. rosaria (NRRL 3718) on an agar medium containing 3% "NZ Amine Type A" (a peptone obtained by enzymatic digestion of casein which serves as a source of nitrogen and is available from Sheffield Chemical Company, Norwich, New York), 1% dextrose and 1.5% agar, fairly good growth with no visible aerial mycelium, colonies slightly raised and granular to slightly folded. No diffusible pigment is seen.

Farven av kolonioverflaten, beskrevet i henhold til "Descrip-tive Color Name Dictionary", Taylor, Knoche og Granville, publisert av the Container Corporation of America, 1950, U.S.A., sammen med "the color chip number" i henhold til'Color Harmony Manual", 4- utg., 1958» utgitt av samme firma, er "chestnut brown g-4ni". Denne farve svarer til synonymet, eller det nære synonym, "moderate brown 58"> beskrevet i henhold til National Bureau of standards Circular No. 553, 1. november 1955, U.S.A. (Farvebetegnelsene i det efterfølgende er angitt i henhold til de samme to farvereferansesystemer). Det vil innsees at, som ved andre mikroorganismer, kan farven av kolonioverflaten og dannelsen av pigment som beskrevet her, skjønt den generelt er karakteristisk for den spesielle mikroorganisme, tempiorært eller permanent forandres ved videredyrkning. The color of the colony surface, described according to the "Descriptive Color Name Dictionary", Taylor, Knoche and Granville, published by the Container Corporation of America, 1950, U.S.A., together with "the color chip number" according to the 'Color Harmony Manual' ", 4- ed., 1958" published by the same company, is "chestnut brown g-4ni". This color corresponds to the synonym, or the close synonym, "moderate brown 58"> described according to the National Bureau of standards Circular No 553, Nov. 1, 1955, U.S.A. (The color designations hereinafter are given according to the same two color reference systems.) It will be appreciated that, as with other microorganisms, the color of the colony surface and the formation of pigment as described herein, although it generally is characteristic of the particular microorganism, temporarily or permanently changed by further cultivation.

Mikroskopisk undersøkelse av kulturen fra ovennevnte medium viser at myceliet er forgrenet, har en gjennomsnittlengde på 10 til .. 20\ i og en diameter på ca. 0,6p. Tallrike chlamydosporer dannes, idet sporene er inntil 2, 0\ x i diameter. Konidier er ikke iakttatt når ovenstående agarmedium anvendes. Microscopic examination of the culture from the above medium shows that the mycelium is branched, has an average length of 10 to .. 20\ in and a diameter of approx. 0.6 p. Numerous chlamydospores are formed, the spores being up to 2.0\ x in diameter. Conidia have not been observed when the above agar medium is used.

M. rosaria vokser godt ved 27 - 37°C, men ingen vekst er iakttatt ved 5o°C. En voksende koloni av M. rosaria vil hydrolysere gelatin, melk og stivelse, men reduserer ikke nitrat til nitrit. Forsøksmetodene anvendt ved bestemmelse av de foregående egenskaper er de som er beskrevet av Gordon et al i J. Bacteriology 6_9_, 147 M. rosaria grows well at 27 - 37°C, but no growth has been observed at 5o°C. A growing colony of M. rosaria will hydrolyze gelatin, milk and starch, but does not reduce nitrate to nitrite. The experimental methods used in determining the preceding properties are those described by Gordon et al in J. Bacteriology 6_9_, 147

(1956) og 21, 15 (1957). (1956) and 21, 15 (1957).

Likesom på det ovennevnte medium er der heller ikke på andre medier på hvilke M. rosaria har vært dyrket, iakttatt noe luftmycelium. Dette er forøvrig et av hovedkjennetegnene for slekten Micromonospora, hvorom det i "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7. utgave, side 822, anføres at den ikke på noe tids-punkt danner et egentlig luftmycelium. As on the above-mentioned medium, no aerial mycelium has been observed on other media on which M. rosaria has been grown either. Incidentally, this is one of the main characteristics of the genus Micromonospora, about which in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7th edition, page 822, it is stated that it does not form an actual aerial mycelium at any point in time.

Med hensyn til sporedannelse hos M. rosaria, opptrer denne ved dyrkning på et medium hvor der kan iakttaes god vekst, som Bennett<*>s agar, og med hensyn til konidienes morfologi er denne i det vesentlige den samme som på et medium hvor der opptrer sparsom vekst. Den følgende beskrivelse av morfologien av konidiene hos M. rosaria, iakttatt under et elektronmikroskop, ble oppnådd ved anvendelse av et medium, hvorpå der opptrådte sparsom vekst, men der var tale om sporedannelse, en betingelse, som av tekniske grunner er ønskelig i eLektronmikroskoppreparatet. Dette medium besto av: 0,1% "Difco" gjærekstrakt, 0,1% "Difco" oppløselig stivelse, 0,1% dextrose, With regard to spore formation in M. rosaria, this occurs when cultured on a medium where good growth can be observed, such as Bennett<*>'s agar, and with regard to the morphology of the conidia, this is essentially the same as on a medium where sparse growth occurs. The following description of the morphology of the conidia of M. rosaria, observed under an electron microscope, was obtained by using a medium on which sparse growth occurred, but there was spore formation, a condition which, for technical reasons, is desirable in the electron microscope preparation. This medium consisted of: 0.1% "Difco" yeast extract, 0.1% "Difco" soluble starch, 0.1% dextrose,

0,1% CaCO„ og 1,5% agar. Kulturen ble iakttatt efter 21 dagers mkuberxng ved 28 oC 0.1% CaCO„ and 1.5% agar. The culture was observed after 21 days of incubation at 28 oC

Beskrivelse av kolonien: Vekst noenlunde til sparsom, flat, Description of the colony: Growth roughly to sparse, flat,

sporedannelsen god, farve sort. spore formation good, color black.

Beskrivelse av sporer: Sporer-kuleformet til ellipsoide og gjennomsnittlig l,2|i i diameter. Sporeoverflaten dekket med stumpe pigger med en gjennomsnittlig lengde på 0,l|i. De stumpe pigger frem-trer som en del av sporeveggen og ikke overfladisk som en del av Description of spores: Spores-globose to ellipsoid and average l.2|in in diameter. Spore surface covered with blunt spines with an average length of 0.l|i. The blunt spikes appear as part of the spore wall and not superficially as part of it

sporehylsteret. Sporene er.dannet enkeltvis på enden av korte eller lange sporoforer. the spore casing. The spores are formed singly at the end of short or long sporophores.

Andre vekstegenskaper av Micromonospora rosaria på angitte medier fremgår av tabell I nedenfor. Hvor annet ikke er angitt, ble de angitte vekstegenskaper iakttatt på kulturer dyrket i 2 uker ved 24 - 26°C. Other growth characteristics of Micromonospora rosaria on specified media appear in table I below. Where not otherwise stated, the stated growth characteristics were observed on cultures grown for 2 weeks at 24-26°C.

I nedenstående tabell II er Micromonospora rosaria sammen-lignet med andre Micromonosporaarter. In table II below, Micromonospora rosaria is compared with other Micromonospora species.

Micromonospora rosaria er istand til å utnytte en rekke carbon- og nitrogenkilder. Micromonospora rosaria is able to utilize a number of carbon and nitrogen sources.

Tabell III nedenfor angir iakttagelser om carbohydratutnytt-else uttrykt ved iakttatte vekstégenskaper av M. rosaria på et medium inneholdende det angitte carbohydrat . I hvert tilfelle besto mediet av 1% av det angitte carbohydrat, 0,5% gjærekstrakt og 1,5% agar, idet resten var destillert vann. Table III below indicates observations on carbohydrate utilization expressed by observed growth characteristics of M. rosaria on a medium containing the stated carbohydrate. In each case the medium consisted of 1% of the specified carbohydrate, 0.5% yeast extract and 1.5% agar, the remainder being distilled water.

Tabell IV nedenfor angir iakttagelser om nitrogenutnyttelse uttrykt ved iakttagelse av vekstegenskaper av M. rosaria på et medium inneholdende den angitte nitrogenkilde. I hvert tilfelle besto mediet av den angitte mengde av nitrogenkilden, 1% glucose, 1,5% agar, og resten destillert vann. Table IV below indicates observations on nitrogen utilization expressed by observation of growth characteristics of M. rosaria on a medium containing the specified nitrogen source. In each case, the medium consisted of the indicated amount of the nitrogen source, 1% glucose, 1.5% agar, and the remainder distilled water.

( 1) Fremstilling av antibiotikumet ( 1) Preparation of the antibiotic

Produksjon av antibiotikum 67-694 utføres passende ved dyrkning av mikroorganismen M. rosaria i et vandig næringsmedium under aerobe, fortrinnsvis submerst aerobe, betingelser. For produksjonen av små mengder (som mikrogram til milligram mengder) av antibiotikum 67-694, kan overflatekultur i flasker eller rystekolber bekvemt anvendes. For produksjon i større målestokk, vil i alminnelighet submers dyrkning av mikroorganismen i rystekolber, eller spesielt tankfermentering være mere egnet. Production of antibiotic 67-694 is conveniently carried out by growing the microorganism M. rosaria in an aqueous nutrient medium under aerobic, preferably sub-aerobic, conditions. For the production of small amounts (such as microgram to milligram amounts) of antibiotic 67-694, surface culture in flasks or shake flasks can be conveniently used. For production on a larger scale, submerged cultivation of the microorganism in shaking flasks, or especially tank fermentation, will generally be more suitable.

Næringsmediet (nedenfor av og til betegnet som fermenteringsmediet) som anvendes ved produksjon av antibiotikum 67-694, er.. typisk en væske inneholdende en assimilerbar carbonkilde, som et carbohydrat, og en assimilerbar nitrogenkilde, som et protein-holdig materiale. For å fremme god vekst av mikroorganismen, og derved god antibiotikumproduksjon, vil der bli anvendt en kombinasjon av en carbonkilde og en nitrogenkilde på hvilke mikroorganismen vokser godt. Følgelig innbefatter foretrukne carbonkilder glucose, mannitol, levulose, sucrose, stivelse og ribose, og de foretrukne nitrogenkilder innbefatter maisstøpvæske, gjærekstrakt, soyabønnemel, kjøttpeptoner, caseinhydrolysat og oksekjøttekstrakt. Andre like egnede carbon- og nitrogenkilder kan likeledes anvendes, idet egnetheten av en spesiell kilde lett bestemmes ved å iaktta vekstegenskapene av M. rosaria med den kilde. The nutrient medium (hereinafter sometimes referred to as the fermentation medium) used in the production of antibiotic 67-694 is.. typically a liquid containing an assimilable carbon source, such as a carbohydrate, and an assimilable nitrogen source, such as a protein-containing material. In order to promote good growth of the microorganism, and thereby good antibiotic production, a combination of a carbon source and a nitrogen source will be used on which the microorganism grows well. Accordingly, preferred carbon sources include glucose, mannitol, levulose, sucrose, starch, and ribose, and preferred nitrogen sources include corn liquor, yeast extract, soybean meal, meat peptones, casein hydrolyzate, and beef extract. Other equally suitable carbon and nitrogen sources can likewise be used, the suitability of a particular source being easily determined by observing the growth characteristics of M. rosaria with that source.

Mediene A, B og C nedenfor er spesielle eksempler på medier som kan anvendes ved fremstilling av antibiotikum 67-694: Media A, B and C below are special examples of media that can be used in the production of antibiotic 67-694:

Medium A Medium A

Medium B :, ',,•; Medium B :, ',,•;

Medium C Medium C

Produksjon av antibiotikum 67-694 utføres ved temperaturer som gir en tilfredsstillende vekst av mikroorganismen. Passende anvendes temperaturer som ligger i området fra 20°C til 40°C og fortrinnsvis i området fra 27° til 37°C. Under vekst av mikroorganismen og dermed følgende fermentering, bør mediets pH ligge i området fra 6,0 til 8,5, fortrinnsvis i området fra 7>0 til 8,0. Fermenteringsmediet kan innstilles på den ønskede pH før sterilis-ering og inokulering av mediet, og derpå innstilles periodisk under den efterfølgende fermentering, efter behov. Alternativt kan puffere som calciumcarbonat , innbefattes i fermenteringsmediet for å holde mediet ved den ønskede pH, eller for å lette en slik opprettholdelse. I alminnelighet vil en vekstperiode på fra 2 til 7 dager føre til optimal produksjon av antibiotikum 67-694. Production of antibiotic 67-694 is carried out at temperatures that give satisfactory growth of the microorganism. Temperatures in the range from 20°C to 40°C and preferably in the range from 27° to 37°C are suitably used. During growth of the microorganism and thus the subsequent fermentation, the pH of the medium should lie in the range from 6.0 to 8.5, preferably in the range from 7>0 to 8.0. The fermentation medium can be adjusted to the desired pH before sterilization and inoculation of the medium, and then adjusted periodically during the subsequent fermentation, as needed. Alternatively, buffers such as calcium carbonate can be included in the fermentation medium to keep the medium at the desired pH, or to facilitate such maintenance. In general, a growth period of from 2 to 7 days will lead to optimal production of antibiotic 67-694.

Produksjon av antibiotikum 67-694, spesielt i teknisk målestokk som f. eks. ved tankfermentering, utføres fortrinnsvis i en 2-trinns prosess. i første trinn, spiringstrinnet, fremstilles et vegetativt inokulum av M. rosaria ved å inokulere et passende medium med en skråkultur eller lyofilisert kultur av M. rosaria og derpå dyrke mediet i tilstrekkelig tid til å gi et vegetativt inokulum, hvilket vanligvis tar fra 24 til 120 timer, idet 72 til 96 timer foretrekkes. I det annet trinn, fermenteringstrinnet, innføres det vegetative inokulum erholdt i spiringstrinnet i det valgte næringsmedium i en mengde ekvivalent med ca. 5 vol%, beregnet på volumet av næringsmedium som skal anvendes i dette fer-menter ingst rinn. Production of antibiotic 67-694, especially on a technical scale such as e.g. in tank fermentation, is preferably carried out in a 2-stage process. in the first step, the germination step, a vegetative inoculum of M. rosaria is prepared by inoculating a suitable medium with a slant culture or lyophilized culture of M. rosaria and then culturing the medium for a sufficient time to produce a vegetative inoculum, which usually takes from 24 to 120 hours, with 72 to 96 hours being preferred. In the second step, the fermentation step, the vegetative inoculum obtained in the germination step is introduced into the selected nutrient medium in an amount equivalent to approx. 5 vol%, calculated on the volume of nutrient medium to be used in this fermenter.

Mediet og betingelsene som anvendes i spiringstrinnet, vil i alminnelighet være lik de som anvendes i fermenteringstrinnet. The medium and conditions used in the germination step will generally be similar to those used in the fermentation step.

Et hvilket som helst medium og betingelser som gir god vekst av mikroorganismen, kan imidlertid anvendes. Når der i spiringstrinnet eller i gjæringstrinnet oppstår for sterk skumning, kan dette reguleres ved å anvende et passende antiskumningsmiddel, som det som selges under handelsbetegnelsen "Dow Corning B". However, any medium and conditions which give good growth of the microorganism can be used. When too much foaming occurs in the germination stage or in the fermentation stage, this can be controlled by using a suitable anti-foaming agent, such as that sold under the trade name "Dow Corning B".

I fermenteringstrinnet vil dyrkningen av mikroorganismen In the fermentation step, the cultivation of the microorganism will

vanligvis bli opprettholdt i en tid som er tilstrekkelig til å gi optimal eller topp-produksjon av antibiotikum 67-694. Produksjon av antibiotikumet kan lett følges ved f .eks . periodisk å ta prøver av mediet og analysere prøvene. Topp eller optimal produksjon av antibiotikumet vil vanligvis nåes i løpet av fra 24 til 100 timer. usually be maintained for a time sufficient to give optimal or peak production of antibiotic 67-694. Production of the antibiotic can be easily followed by e.g. periodically to take samples of the medium and analyze the samples. Peak or optimal production of the antibiotic will usually be reached within 24 to 100 hours.

Som tidligere nevnt, utføres dyrkningen av M. rosaria med den derav følgende produksjon av antibiotikum 67-694 under aerobe betingelser. Slike betingelser kan oppnåes på en hvilken som helst bekvem måte. Således kan f.eks. ved tankfermentering hvor sumbers vekst av mikroorganismen kreves, de nødvendige aerobe betingelser bekvemt oppnåes ved å føre luft gjennom næringsmediet. As previously mentioned, the cultivation of M. rosaria with the consequent production of antibiotic 67-694 is carried out under aerobic conditions. Such conditions can be achieved in any convenient way. Thus, e.g. in tank fermentation where rapid growth of the microorganism is required, the necessary aerobic conditions are conveniently achieved by passing air through the nutrient medium.

( 3) - Isolering og rensning av antibiotikumet ( 3) - Isolation and purification of the antibiotic

Isolering av det antibiotisk aktive produkt fra fermenteringsmediet kan utføres ved å ekstrahere mediet under alkaliske betingelser, fortrinnsvis ved en pH på ca. 9, 5, med et med vann ublandbart organisk oppløsningsmiddel. Den krevede grad av alkalinitet kan oppnåes ved å tilsette til det fermenterte medium en hvilken som helst passende base som et alkalimetall- eller jordalkalimetall-hydroxyd, fortrinnsvis natriumhydroxyd. Typiske med vann ublandbare organiske oppløsningsmidler som kan anvendes, er benzen, toluen, n-butanol, methylenklorid, kloroform, ethylacetat, amyl-acetat og lignende, idet ethylacetat er et foretrukket oppløsnings-middel . Isolation of the antibiotic active product from the fermentation medium can be carried out by extracting the medium under alkaline conditions, preferably at a pH of approx. 9, 5, with a water-immiscible organic solvent. The required degree of alkalinity can be achieved by adding to the fermented medium any suitable base such as an alkali metal or alkaline earth metal hydroxide, preferably sodium hydroxide. Typical water-immiscible organic solvents that can be used are benzene, toluene, n-butanol, methylene chloride, chloroform, ethyl acetate, amyl acetate and the like, ethyl acetate being a preferred solvent.

Det totale volum av oppløsningsmiddel som anvendes, vil selv-sagt avhenge av slike faktorer som den relative oppløselighet av antibiotikumet, mengden av antibiotikum som kreves ekstrahert, og måten hvorpå ekstraksjonen utføres, og denne mengde kan lett bestemmes i ethvert spesielt tilfelle. Som illustrasjon kan imidlertid nevnes at i et typisk tilfelle hvor ethylacetat er det anvendte oppløsningsmiddel, har et samlet volum svarende til 4 til 10 ganger volumet av det fermenterte medium, anvendt i porsjoner svarende til 2 ganger volumet av det fermenterte medium, vist seg å gi tilfredsstillende separasjon. The total volume of solvent employed will of course depend on such factors as the relative solubility of the antibiotic, the amount of antibiotic required to be extracted, and the manner in which the extraction is carried out, and this amount can be readily determined in any particular case. By way of illustration, however, it may be mentioned that in a typical case where ethyl acetate is the solvent used, a total volume corresponding to 4 to 10 times the volume of the fermented medium, used in portions corresponding to 2 times the volume of the fermented medium, has been shown to give satisfactory separation.

Det dannede antibiotikum kan utvinnes fra det organiske ekstrakt ved f.eks. følgende metode: Det organiske oppløsnings-middelekstrakt konsentreres, fortrinnsvis i vakuum, til et bekvemt volum (passende ca. 1/50 av volumet av fermenteringsmediet) og ekstraheres så med en vandig 0,1 N svovelsyreoppløsning. På denne måte fåes en delvis eller betraktelig separasjon av antibiotisk produkt fra de mange mindre bestanddeler som samtidig da.nnes ved fermenteringen. Effektiviteten av denne separasjon kan følges ved å bestemme den relative mengde av samtidig dannede mindre kompon-enter i produktet under anvendelse av kromatografiske metoder, og ekst raksjonsprosessen kan om nødvendig gjentaes inntil en betraktelig separasjon er oppnådd. Ved gjentagelse av ekstraksjons-prosessen gjøres det opprinnelige svovelsyreekstrakt alkalisk, den dannede blanding ekstraheres med det organiske vann-ublandbare oppløsningsmiddel og derpå ekstraheres det organiske ekstrakt i sin tur med 0,1 N svovelsyre. Når først det antibiotiske produkt er blitt i det vesentlige skilt fra de samtidig dannede mindre bestanddeler , gjøres svovelsyreekstraktet alkalisk, reekstraheres med det organiske med vann ublandbare oppløsningsmiddel, og ekstraktet konsentreres så i vakuum (passende til et volum svarende til ca. l/lOOO av volumet av det opprinnelige fermenteringsmedium). The antibiotic formed can be recovered from the organic extract by e.g. following method: The organic solvent extract is concentrated, preferably in vacuo, to a convenient volume (suitably about 1/50 of the volume of the fermentation medium) and then extracted with an aqueous 0.1 N sulfuric acid solution. In this way, a partial or considerable separation of the antibiotic product is obtained from the many smaller components that are simultaneously formed during the fermentation. The effectiveness of this separation can be followed by determining the relative amount of simultaneously formed minor components in the product using chromatographic methods, and the extraction process can be repeated if necessary until a considerable separation is achieved. By repeating the extraction process, the original sulfuric acid extract is made alkaline, the resulting mixture is extracted with the organic water-immiscible solvent and then the organic extract is extracted in turn with 0.1 N sulfuric acid. Once the antibiotic product has been substantially separated from the minor constituents formed at the same time, the sulfuric acid extract is made alkaline, re-extracted with the organic water-immiscible solvent, and the extract is then concentrated in vacuo (suitable to a volume corresponding to approx. l/lOOO of the volume of the original fermentation medium).

Det konsentrerte ekstrakt tilsettes så under kraftig røring til IO ganger sitt volum av en diethylether-hexanblanding bestående av 6 volumdeler diethylether og 4 volumdeler hexan. Det således dannede utfelte materiale frafiltreres , vaskes sparsomt med en ytterligere mengde diethylether-hexanblanding og kastes. Filtratet og vaskevæskene forenes og inndampes til et residuum. Residuet oppløses i et organisk, med vann ublandbart oppløsnings-middel, oppløsningen vaskes flere ganger med vann og tørres så over et passende middel som vannfritt natriumsulfat, Efter filtrering inndampes oppløsningen til et residuum, residuet oppløses i en minimal mengde diethylether, oppløsningen filtreres og tilsettes så under omrøring til petrolether (kokepunkt 30 - 60°). Den erholdte felning er antibiotikum 67-694-produkt og er vanligvis gråhvitt til brungult av farve. Dette bunnfall frafiltreres, vaskes sparsomt med en porsjon petrolether og tørres så i vakuum ved ca. 4o°C. Ved anvendelse av ovenstående metode har man fått antibiotikum 67-694-produkter som bestemt ved den nedenfor beskrevne bestemmelsesmetode har en styrke på ca. 700 ug/mg. The concentrated extract is then added with vigorous stirring to 10 times its volume of a diethyl ether-hexane mixture consisting of 6 parts by volume diethyl ether and 4 parts by volume hexane. The thus formed precipitated material is filtered off, washed sparingly with a further amount of diethyl ether-hexane mixture and discarded. The filtrate and washing liquids are combined and evaporated to a residue. The residue is dissolved in an organic, water-immiscible solvent, the solution is washed several times with water and then dried over a suitable agent such as anhydrous sodium sulphate, After filtration, the solution is evaporated to a residue, the residue is dissolved in a minimal amount of diethyl ether, the solution is filtered and added then with stirring to petroleum ether (boiling point 30 - 60°). The precipitate obtained is an antibiotic 67-694 product and is usually grey-white to brown-yellow in colour. This precipitate is filtered off, washed sparingly with a portion of petroleum ether and then dried in a vacuum at approx. 4o°C. By applying the above method, antibiotic 67-694 products have been obtained which, determined by the determination method described below, have a strength of approx. 700 µg/mg.

Bestemmelsesmetoden som anvendes i foreliggende tilfelle for The determination method used in the present case for

å bestemme den relative styrke av et antibiotisk aktivt produkt, er en sylindrisk kopp-bestemmelsesmetode under anvendelse av Bacillus subtilis ATCC 6633 som forsøksorganisme. to determine the relative potency of an antibiotic active product is a cylindrical cup determination method using Bacillus subtilis ATCC 6633 as a test organism.

Metoden er i det vesentlige som beskrevet for erythromycin i "Assay Methods of Antibiotics" - Grove og Randall, Medical Encyclopedia Inc., New York (1955), side 96-IO3, under anvendelse av et grunnskikt på 21 ml og et podningsskikt på 4 ml antibiotisk medium nr .;5• En standardkurve settes opp under anvendelse av følgende konsentrasjoner av antibiotikum (ug/mg) i en 0,1 M fosfatpuffer (pH 8,0): 0,64, 0,8, 1,0, 1,25 og 1,56. En styrke på 1000lig/mg tilskrives det materiale for hvilket 1 ug/mg i 1,0 ml 0,1 M fosfatpuffer gir en inhiberingssone på 17,8 t 1,0 mm overfor forsøksorganismen B. subtilis ATCC 6633. The method is essentially as described for erythromycin in "Assay Methods of Antibiotics" - Grove and Randall, Medical Encyclopedia Inc., New York (1955), pages 96-103, using a 21 ml base layer and a 4 ml antibiotic medium no.;5• A standard curve is set up using the following concentrations of antibiotic (ug/mg) in a 0.1 M phosphate buffer (pH 8.0): 0.64, 0.8, 1.0, 1.25 and 1.56. A strength of 1000 lig/mg is attributed to the material for which 1 ug/mg in 1.0 ml of 0.1 M phosphate buffer gives an inhibition zone of 17.8 h 1.0 mm against the test organism B. subtilis ATCC 6633.

Det rå antibiotikum 67-694 med en styrke på ca. 700 |ig/mg, kan renses ytterligere, for eksempel ved følgende metode. Antibiotikum 67-694 oppløses i en blanding bestående av 9 volumdeler av et halogenert lavere alkan, som kloroform, og 1 volumdel alkohol, som methanol. Oppløsningen føres gjennom en kolonne inneholdende et fast adsorpsjonsmiddel som kiselsyre, aluminiumoxyd, magnesium-silicat, diatoméjord eller cellulose eller lignende, og derpå elueres kolonnen med en blanding bestående av 4 volumdeler av et klorert lavere alkan, som kloroform, og 1 volumdel lavere alkohol, som methanol. Fraksjoner av eluatet oppsamles, og nærværet av antibiotisk aktivt materiale i fraksjonene påvises ved å skiveteste en prøve av fraksjonen mot Staphylococcus aureus. På denne måte følges produksjonen fra kolonnen. The crude antibiotic 67-694 with a strength of approx. 700 µg/mg, can be further purified, for example by the following method. Antibiotic 67-694 is dissolved in a mixture consisting of 9 parts by volume of a halogenated lower alkane, such as chloroform, and 1 part by volume of alcohol, such as methanol. The solution is passed through a column containing a solid adsorbent such as silicic acid, aluminum oxide, magnesium silicate, diatomaceous earth or cellulose or the like, and then the column is eluted with a mixture consisting of 4 parts by volume of a chlorinated lower alkane, such as chloroform, and 1 part by volume lower alcohol, such as methanol. Fractions of the eluate are collected, and the presence of antibiotic active material in the fractions is demonstrated by disc testing a sample of the fraction against Staphylococcus aureus. In this way, the production from the column is monitored.

De fraksjoner som inneholder antibiotisk aktivt materiale, testes videre ved å kromatografere to prøver pr. fraksjon på silicagel-tynnskiktsplater under anvendelse av oppløsningsmiddelbland-ingen anvendt ved kolonnekromatografiseparasjonen. Plaiten på hvilken den første prøve kromatograferes, besprøytes med en passende dusj som en methanol-svovelsyreblanding, og oppvarmes for å påvise nærværet og stedet for ocganisk materiale på kromatogrammet (som en mørk flekk). Den annen prøve og plate anvendes for bioautografi mot Sarcina lutea for å påvise nærværet og stedet (uttrykt her som en R^.-verdi) av antibiotisk aktivt materiale. Ved den siste prøve under anvendelse av en kloroform-methanolblanding (4:1 i volum) og ved å utføre kromatogrammet i ca. 1 time, har antibiotikum 67-694 en R^-verdi på fra 0,4 til 0,5'. The fractions containing antibiotic active material are further tested by chromatographing two samples per fraction on silica gel thin-layer plates using the solvent mixture used in the column chromatography separation. The plate on which the first sample is chromatographed is sprayed with a suitable shower such as a methanol-sulphuric acid mixture, and heated to detect the presence and location of organic material on the chromatogram (as a dark spot). The second sample and plate is used for bioautography against Sarcina lutea to detect the presence and location (expressed here as an R 2 value) of antibiotic active material. In the last test using a chloroform-methanol mixture (4:1 by volume) and by performing the chromatogram for approx. 1 hour, antibiotic 67-694 has an R^ value of from 0.4 to 0.5'.

Fraksjoner inneholdende antibiotisk aktivt materiale med samme R^-verdi forenes og inndampes i vakuum til et residuum. Residuet erholdt fra fraksjoner inneholdende materiale med en R^ fra 0,4 til 0,5, oppløses i aceton og tilsettes så til petrolether. Det således erholdte bunnfall fjernes ved filtrering eller ved sentrifugering og kastes, mens filtratet eller den overstående væske inndampes til tørrhet, hvorved man får et fast residuum som er antibiotikum 67-694, som ved den ovenfor beskrevne bestemmelsesmetode, viser en styrke på 1000 \ xg/ mg. Fractions containing antibiotic active material with the same R^ value are combined and evaporated in vacuum to a residue. The residue obtained from fractions containing material with an R^ from 0.4 to 0.5 is dissolved in acetone and then added to petroleum ether. The precipitate thus obtained is removed by filtration or by centrifugation and discarded, while the filtrate or the supernatant liquid is evaporated to dryness, whereby a solid residue is obtained which is antibiotic 67-694, which, by the above-described determination method, shows a strength of 1000 µg / mg.

Ved en alternativ metode for å isolere og rense antibiotikum 67-694 blir det første ekstrakt erholdt ved å ekstrahere det fermenterte medium med det med vann ublandbare organiske oppløsnings-middel, inndampet til et residuum som taes opp i et passende opp-løsningsmiddelsystem og kromatograferes. Fraksjonene inneholdende antibiotikum 67-694, behandles så på den ovenfor beskrevne måte for å få det rensede antibiotikum 67-694- In an alternative method for isolating and purifying antibiotic 67-694, the first extract is obtained by extracting the fermented medium with the water-immiscible organic solvent, evaporated to a residue which is taken up in a suitable solvent system and chromatographed. The fractions containing antibiotic 67-694 are then treated in the manner described above to obtain the purified antibiotic 67-694-

Rått antibiotikum 67-694 kan også renses ved å fremstille Crude antibiotic 67-694 can also be purified by preparing

et salt og isolere og, om nødvendig, ytterligere rense dette. a salt and isolate and, if necessary, further purify this.

Når det frie antibiotikum ønskes, regenereres dette så fra When the free antibiotic is desired, this is then regenerated from it

saltet . Eksempler på passende salter er de som dannes med syrer som saltsyre, svovelsyre, fosforsyre, eddiksyre og ravsyre. the salt. Examples of suitable salts are those formed with acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, acetic acid and succinic acid.

L 3) - Kjemiske og fysikalske egenskaper av antibiotikum 67- 694 L 3) - Chemical and physical properties of antibiotics 67-694

For antibiotikum 67-964 med en styrke på 1000 ug/mg ifølge den ovenfor beskrevne bestemmelsesmetode, har man funnet følgende kjemiske og fysikalske egenskaper. For antibiotic 67-964 with a strength of 1000 ug/mg according to the determination method described above, the following chemical and physical properties have been found.

I. Kromatografiske konstanter - R^.-verdier I. Chromatographic constants - R^.-values

De iakttatte R^-verdier for antibiotikum 67-694 i angitte oppløsningsmiddelsystemer og bestemt mot S. lutea, er angitt i tabell V. Antibiotikum 67-694 ble kromatografert på tynnskikts-silicagelplate (250 mikron i tykkelse, GF) som er tilgjengelige unde handelsnavnet "Uniplate", under anvendelse av agar podet med S. lutea. I tabell V er de angitte R^-verdier uttrykt ved inhiber ings sonen-. The observed R^ values for antibiotic 67-694 in indicated solvent systems and determined against S. lutea are shown in Table V. Antibiotic 67-694 was chromatographed on thin-layer silica gel plates (250 microns in thickness, GF) available under the trade name "Uniplate", using agar inoculated with S. lutea. In table V, the indicated R^ values are expressed in terms of the zone of inhibition.

II. Bestemte kjemiske og fysikalske data II. Determined chemical and physical data

III. Infrarødt absorpsjonsspektrum III. Infrared absorption spectrum

Det angitte infrarøde absorpsjonsspektrum for antibiotikum 67-694 som en mineraloljepasta, er angitt i fig. 1 hvor ?i angir bølgelengden i mikron, ^ er frekvensen i cm ^, og T er prosent t ransmittans. The indicated infrared absorption spectrum for antibiotic 67-694 as a mineral oil paste is shown in fig. 1 where ?i indicates the wavelength in microns, ^ is the frequency in cm ^, and T is percent t ransmittance.

Hovedtoppene og -båndene er angitt i tabell VIhvor forkortels-ene har følgende betydning: S = sterk, M = middels, W = svak og brd. = bred, og de angitte tall er i mikron. I tabell Vier toppene som skyldes mineralolje sløyfet - The main peaks and bands are indicated in table VI, where the abbreviations have the following meanings: S = strong, M = medium, W = weak and broad. = wide, and the numbers given are in microns. In table Vie the peaks due to the mineral oil loop -

IV. Kjernemagnetisk resonansspektrum IV. Nuclear magnetic resonance spectrum

Det kjernemagnetiske resonansspektrum for antibiotikum 67-694 er angitt i fig. 2. Spektret ble erholdt med et "Varian A-60-A"-spektrometer for en oppløsning av 40 mg antibiotikum 67-694 oppløst i 0,4 ml deuterert kloroform inneholdende en liten mengde deuterium-oxyd. Spektret er angitt, med hensyn til £- og ^-verdier, i deler pr. million (dpm) fra tetramethylsilan, den interne standard. I fig. 2 ville innskuddet ved ca. 6,8 dpm i spektrumdelen (som vises over det fulle spektrum), vanligvis opptre ved ca. 9,8 dpm, men ville være utenfor området for det registrerte spektrum. For å registrere toppen ble spekt rometeret forskjøvet l80 Hertz (cykler pr. sekund) som er ekvivalent med ca. 3 dpm. I lys av intensiteten av toppen ansees den for å være vesentlig for en nøyaktig tolkning av spektret. The nuclear magnetic resonance spectrum for antibiotic 67-694 is shown in fig. 2. The spectrum was obtained with a "Varian A-60-A" spectrometer for a solution of 40 mg of antibiotic 67-694 dissolved in 0.4 ml of deuterated chloroform containing a small amount of deuterium oxide. The spectrum is indicated, with regard to £ and ^ values, in parts per million (dpm) from tetramethylsilane, the internal standard. In fig. 2 would deposit at approx. 6.8 dpm in the part of the spectrum (which appears over the full spectrum), usually occurring at approx. 9.8 dpm, but would be outside the range of the recorded spectrum. To record the peak, the spectrometer was shifted by 180 Hertz (cycles per second), which is equivalent to approx. 3 dpm. In light of the intensity of the peak, it is considered to be essential for an accurate interpretation of the spectrum.

V. Oppløselighet V. Solubility

VI. pH- st ab il it et WE. pH- st ab il it et

Ingen vesentlig forandring i styrke ble iakttatt når antibiotikum 67-694 ble oppløst i ethanol, fortynnet med en passende puffer og oppvarmet til en temperatur av 100°C i 30 minutter for et pH-område av 2 til IO. No significant change in potency was observed when antibiotic 67-694 was dissolved in ethanol, diluted with an appropriate buffer and heated to a temperature of 100°C for 30 minutes for a pH range of 2 to 10.

VII. Stabilitet mot enzymer VII. Stability against enzymes

Antibiotikum 67-694 ble prøvet på stabilitet mot trjjpsin, chymotrypsin, pepsin og a-amylase. Oppløsninger av enzymene ble fremstilt ved 1 mg/ml i Mcllvaines puffere ved den optimale pH for enzymet (dvs. trypsin og chymotrypsin pH 8, pepsin pH 2,2, og a-amylase pH 4)- 200 ug antibiotikum ble oppløst i 0,5 ml vann, blandet med 0,5 ml enzymcppløsning og inkubert ved 37°C i 24 timer. Oppløsningene ble skive-bestemt mot Escherichia coli og Staphylococcus aureus efter 0, 1, 2,5 og 24 timers inkube::ing. Enzymene bevirket intet vesentlig tap i styrke av antibiotikumet i løpet av 24 timer. Antibiotic 67-694 was tested for stability against trypsin, chymotrypsin, pepsin and α-amylase. Solutions of the enzymes were prepared at 1 mg/ml in Mcllvaine's buffers at the optimal pH for the enzyme (ie, trypsin and chymotrypsin pH 8, pepsin pH 2.2, and α-amylase pH 4) - 200 µg of antibiotic was dissolved in 0, 5 ml of water, mixed with 0.5 ml of enzyme solution and incubated at 37°C for 24 hours. The solutions were disc determined against Escherichia coli and Staphylococcus aureus after 0, 1, 2.5 and 24 hours of incubation. The enzymes caused no significant loss in potency of the antibiotic over 24 hours.

VIII. Farveprøver VIII. Color samples

Antibiotikum 67-694 gir en positiv farvereaksjon i Molisch stivelse-Kl og Elson Morgan-prøvene, en negativ farvereaksjon i biuret-, ninhydrin- og Sakaguchi-prøvene. Antibiotic 67-694 gives a positive color reaction in the Molisch starch-Kl and Elson Morgan tests, a negative color reaction in the biuret, ninhydrin and Sakaguchi tests.

Av det infrarøde absorpsjonsspektrum (fig. 1), det kjernemagnetiske resonansspektrum (fig. 2) og de ovenfor angitte kjemiske og fysikalske data, synes antibiotikum 67-694 å tilhøre makrolid-gruppen med en tertiær aminogruppe. Videre har den minst to for-esterbare hydroxygrupper, hvorav en kan forestres selektivt. Det kjernemagnetiske resonansspektrum indikerer nærvær av en aldehyd-gruppe. From the infrared absorption spectrum (Fig. 1), the nuclear magnetic resonance spectrum (Fig. 2) and the above-mentioned chemical and physical data, antibiotic 67-694 appears to belong to the macrolide group with a tertiary amino group. Furthermore, it has at least two esterifiable hydroxy groups, one of which can be selectively esterified. The nuclear magnetic resonance spectrum indicates the presence of an aldehyde group.

På basis av ovenstående fysikalsk-kjemiske data antaes det at antibiotikum 67-694 (rosamicin) har følgende planformel, idet ingen stereokjemiske angivelser er antydet ved strukturen: On the basis of the above physicochemical data, it is assumed that antibiotic 67-694 (rosamicin) has the following planar formula, as no stereochemical indications are indicated by the structure:

Oppfinnelsen omfatter også fremstillingen av farmasøytisk godtagbare (dvs. ikke-giftige) salter av antibiotikum 67~694- Typiske salter er syreaddisjonssalter avledet av uorganiske syrer som saltsyre, svovelsyre eller fosforsyre, eller reaktive derivater derav, som et syresalt, eller organiske syrer som eddiksyre, ravsyre, citronsyre, melkesyre, malinsyre, malonsyre, maleinsyre, vinsyre, glutarsyre, laurinsyre, adamantansyre, kanelsyre, kamfersyre, paimi-tinsyre, stearinsyre, undecylensyre og lignende syrer. Slike salter kan fremstilles ved å omsette antibiotikum 67-694 med deri passende syre, eller et reaktivt derivat derav, og isolere det dannede salt. The invention also encompasses the preparation of pharmaceutically acceptable (ie non-toxic) salts of antibiotic 67~694- Typical salts are acid addition salts derived from inorganic acids such as hydrochloric, sulfuric or phosphoric acid, or reactive derivatives thereof, such as an acid salt, or organic acids such as acetic acid , succinic acid, citric acid, lactic acid, malic acid, malonic acid, maleic acid, tartaric acid, glutaric acid, lauric acid, adamantic acid, cinnamic acid, camphoric acid, paimitic acid, stearic acid, undecylenic acid and similar acids. Such salts can be prepared by reacting antibiotic 67-694 with an acid suitable therein, or a reactive derivative thereof, and isolating the formed salt.

( 4) - Biologiske egenskaper for antibiotikum 67- 694 ( 4) - Biological properties of antibiotic 67-694

I. In vit ro- aktivitet I. In vitro activity

In vitro-aktiviteten av antibiotikum 67-694 med en styrke på 775 ug/mg ble bestemt ved konvensjonelle rørfortynningsmetoder under anvendelse av gjær-kjøttekstraktmedium ved pH 7»4- Rørene ble inkubert i 18 timer ved 37°C før bedømmelse. Resultatene av bestemmelsene er angitt i tabell VE og viser at antibiotikumet oppviser et noe bredt ant ibakterielt spektrum., in vitro med en større virkning på gram-positive bakterier..• The in vitro activity of antibiotic 67-694 at a potency of 775 µg/mg was determined by conventional tube dilution methods using yeast-meat extract medium at pH 7-4. The tubes were incubated for 18 hours at 37°C before evaluation. The results of the determinations are shown in table VE and show that the antibiotic exhibits a somewhat broad antibacterial spectrum, in vitro with a greater effect on gram-positive bacteria..•

II . In vivo- aktivitet II. In vivo activity

Den beskyttende aktivitet av antibiotikum 67-694 med en styrke på lOOO ug/mg ble prøvet på CF-1 (Carworth Farms) hanmUs som veiet ca. 20 g hver. Antibiotikumet ble gitt som en suspensjon eller en oppløsning i et vandig medium inneholdende 0, 5% carboxy-methylcellulose i to doser, en kort før og en 4 timer efter intra-peritoneal infeksjon med bakteriene. Infiserte ikke-behandlede mus (kontroller) døde i alminnelighet i løpet av 18 timer. Antall overlevende i den behandlede gruppe ble bestemt 48 timer efter infeksjon. Resultatene av in vivo-prøvene under anvendelse av en representativ gram-positiv og en representativ gram-negativ organisme er angitt i tabell VIII: The protective activity of antibiotic 67-694 at a strength of 1000 ug/mg was tested on CF-1 (Carworth Farms) male mice weighing approx. 20 g each. The antibiotic was given as a suspension or a solution in an aqueous medium containing 0.5% carboxymethylcellulose in two doses, one shortly before and one 4 hours after intra-peritoneal infection with the bacteria. Infected untreated mice (controls) generally died within 18 hours. The number of survivors in the treated group was determined 48 hours after infection. The results of the in vivo tests using a representative Gram-positive and a representative Gram-negative organism are set forth in Table VIII:

III. Akutt toksisitet III. Acute toxicity

Den akutte toksisitet, uttrykt som LD^Q, for antibiotikum 67-694 er angitt i tabell IX. The acute toxicity, expressed as LD₂Q, for antibiotic 67-694 is given in Table IX.

Antibiotikum 67-694 og farmasøytisk godtagbare salter Antibiotic 67-694 and pharmaceutically acceptable salts

derav kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre antibakterielle midler for å forhindre veksten av eller å nedsette antallet av påvirkelige organismer, særlig de gram-positive organismer angitt i tabell VII. Således kan antibiotikum 67-694 og farmasøytisk godtagbare salter derav anvendes i vaskeoppløsninger til sanitære formål, som ved rensning av labora-torieglass-saker og -utstyr, og kan anvendes ved klesvask, f .eks. som en bakteriostatisk skylling for laboratorietøy. Dessuten kan antibiotikum 67-694 og farmasøytisk godtagbare salter of which can be used alone or in combination with other antibacterial agents to prevent the growth of or reduce the number of susceptible organisms, especially the gram-positive organisms listed in Table VII. Thus, antibiotic 67-694 and pharmaceutically acceptable salts thereof can be used in washing solutions for sanitary purposes, such as when cleaning laboratory glass cases and equipment, and can be used for laundry, e.g. as a bacteriostatic rinse for labware. In addition, antibiotic 67-694 and pharmaceutically acceptable salts may

derav anvendes ved behandling av laboratoriedyr og husdyr som er infisert med påvirkelige organismer. of which is used in the treatment of laboratory animals and domestic animals infected with susceptible organisms.

Oppfinnelsen vil nu bli ytterligere belyst ved følgende eksempler hvor eksempel 1 og 2 illustrerer dyrkningen av Micromonospora rosaria (idet den betegnet med NRRL 3718 ble anvendt) og produksjonen av antibiotikum 67-694. Eksempel 3 til 5 illustrerer isoleringen og rensningen av antibiotikum 67-694. Eksempel 6 og 7 illustrerer fremstillingen av angitte salter av antibiotikum 67-694- The invention will now be further illustrated by the following examples, where examples 1 and 2 illustrate the cultivation of Micromonospora rosaria (as it was designated with NRRL 3718 was used) and the production of antibiotic 67-694. Examples 3 to 5 illustrate the isolation and purification of antibiotic 67-694. Examples 6 and 7 illustrate the preparation of indicated salts of antibiotic 67-694-

Eksempel 1 Example 1

Rystekolbefermentering Shaker flask fermentation

A. Formeringstrinn A. Propagation stage

Under aseptiske betingelser tilsettes en løkkefull (f.eks. 0,5 ml) av en Micromonospora rosaria kultur fra en skråagar eller en lyofilisert kultur av M. rosaria til 100 ml av et sterilt medium i en 300 ml Erlenmeyerkolbe av følgende sammensetning: Under aseptic conditions, add a loopful (e.g. 0.5 ml) of a Micromonospora rosaria culture from an agar slant or a lyophilized culture of M. rosaria to 100 ml of a sterile medium in a 300 ml Erlenmeyer flask of the following composition:

Innholdet av kolben inkuberes ved 35° C i 72 timer på en roterende ryster. The contents of the flask are incubated at 35° C. for 72 hours on a rotary shaker.

B. Fermenteringstrinn B. Fermentation step

5 ml av inoculumet fremstilt i det ovenstående formerings - trinn ble overført aseptisk til hver enkelt av en rekke 500 ml Erlenmeyerkolber inneholdende 100 ml av et sterilt medium av sammensetning : 5 ml of the inoculum prepared in the above propagation step was transferred aseptically to each of a series of 500 ml Erlenmeyer flasks containing 100 ml of a sterile medium of composition:

Innholdet av kolbene inkuberes ved 28°C i fra 72 til 100 timer på en roterende ryster. The contents of the flasks are incubated at 28°C for from 72 to 100 hours on a rotary shaker.

Efter de første 24 timer taes periodiske prøver av de fermenterte medier for bestemmelse av antibiotisk aktivitet slik at topp-produksjon, dvs. det stadium på hvilket den antibiotiske aktivitet av det fermenterte medium når en topp, kan bestemmes. After the first 24 hours, periodic samples are taken of the fermented media to determine antibiotic activity so that peak production, i.e. the stage at which the antibiotic activity of the fermented medium reaches a peak, can be determined.

Når fermenteringen er effektivt fullstendig, som det fremgår av topp-produksjon, kan innholdene av kolbene bekvemt forenes for på-følgende isolering av det antibiotisk aktive produkt. When the fermentation is effectively complete, as evidenced by peak production, the contents of the flasks can be conveniently combined for subsequent isolation of the antibiotic active product.

Under formeringen og fermenteringen holdes næringsmediets pH tilstrekkelig innenfor det foretrukne pH-område ved puffervirkningen av calciumcarbonat-bestanddelen. Dyrkningen utføres under submerst aerobe betingelser. During the propagation and fermentation, the pH of the nutrient medium is kept sufficiently within the preferred pH range by the buffering effect of the calcium carbonate component. Cultivation is carried out under mostly aerobic conditions.

Eksempel 2 Example 2

Tankfermentering Tank fermentation

A. Formeringstrinn A. Propagation stage

Under aseptiske betingelser tilsettes 25 ml av et inokulum, fremstilt som beskrevet i eksempel IA, til 500 ml av et sterilt medium av sammensetning som angitt i eksempel IA og anbrakt i en 2-liters Erlenmeyerkolbe. Innholdet av kolben inkuberes ved 28°C Under aseptic conditions, 25 ml of an inoculum, prepared as described in Example IA, is added to 500 ml of a sterile medium of composition as indicated in Example IA and placed in a 2-liter Erlenmeyer flask. The contents of the flask are incubated at 28°C

i 72 timer på en roterende ryster. for 72 hours on a rotary shaker.

B. Fermenteringstrinn B. Fermentation step

Hele produktet fra det ovenstående formeringstrinn overføres til en l4-liters fermentator inneholdende 9, 5 1 av mediet anvendt i eksempel IB. 6 ml antiskumningsmiddel (som det som selges under handels - betegnelsen "Dow-Corning B") tilsettes, og blandingens pH innstilles på ca. 7>0 under anvendelse av enten fortynnet (1 N) vandig natriumhydroxyd eller fortynnet (IN) vandig svovelsyre efter behov. Blandingen fermenteres ved 28°C inntil topp-antibiotisk aktivitet The entire product from the above propagation step is transferred to a 14-liter fermenter containing 9.5 l of the medium used in Example IB. 6 ml of antifoam agent (such as that sold under the trade name "Dow-Corning B") is added, and the pH of the mixture is adjusted to approx. 7>0 using either dilute (1 N) aqueous sodium hydroxide or dilute (IN) aqueous sulfuric acid as required. The mixture is fermented at 28°C until peak antibiotic activity

er oppnådd, hvilket vanligvis inntrer efter fermentering i fra 72 til 100 timer. Under fermentering opprettholdes passende aerobe betingelser ved å føre luft gjennom fermenteringsmediet (spesielt har innføring av luft ved en hastighet på ca. 3»5 l/min vist seg å være tilfredsstillende). is achieved, which usually occurs after fermentation for from 72 to 100 hours. During fermentation, suitable aerobic conditions are maintained by passing air through the fermentation medium (in particular, introducing air at a rate of about 3-5 l/min has been found to be satisfactory).

Eksempel 3 Example 3

Isolering av antibiotikum 67- 694 Isolation of antibiotic 67- 694

pH av et fermentert medium erholdt ved fremgangsmåten i eksempel 2 innstilles på ca. 9, 5 med 1 N natriumhydroxydoppløsning og mediet ekstraheres så med 20-liters porsjoner av ethylacetat inntil det antibiotisk aktive produkt er effektivt fjernet (2 til 5 ekstraksjoner er vanligvis tilstrekkelig) . Ethylacetatekst raktene forenes og inndampes i vakuum til ca. 200 ml. Det biologisk aktive materiale tilbakeekstraheres fra ethylacetatekstraktet med ca. The pH of a fermented medium obtained by the method in example 2 is set to approx. 9.5 with 1 N sodium hydroxide solution and the medium is then extracted with 20 liter portions of ethyl acetate until the antibiotic active product is effectively removed (2 to 5 extractions are usually sufficient). The ethyl acetate extracts are combined and evaporated in vacuo to approx. 200 ml. The biologically active material is back-extracted from the ethyl acetate extract with approx.

200 ml 0,1 N vandig svovelsyre. pH av det sure ekstrakt innstilles på ca. 9,5 under anvendelse av fortynnet natriumhydroxyd, og reekstraheres med ethylacetat. Ekstraktene forenes og inndampes i vakuum til ca. 10 ml. Konsentratet tilsettes til ca. 100 ml av en kraftig omrørt blanding av 6 volum diethylether og 4 volum hexan. Bunnfallet frafiltreres, vaskes sparsomt med en frisk porsjon diethylether-hexanblanding, og bunnfallet kastes. Diethylether-hexanfilt ratet og vaskingene forenes og inndampes i vakuum til et residuum. Residuet oppløses i ca. 5 ml diethylether, oppløsningen filtreres og tilsettes under omrøring til 50 ml petrolether (kokepunkt 30 - 60°C). Det dannede gråhvite til brungule bunnfall frafiltreres og vaskes sparsomt med petrolether. Bunnfallet tørres ved 200 ml of 0.1 N aqueous sulfuric acid. The pH of the acidic extract is set to approx. 9.5 using dilute sodium hydroxide, and re-extracted with ethyl acetate. The extracts are combined and evaporated in a vacuum to approx. 10 ml. The concentrate is added to approx. 100 ml of a vigorously stirred mixture of 6 volumes of diethyl ether and 4 volumes of hexane. The precipitate is filtered off, washed sparingly with a fresh portion of diethyl ether-hexane mixture, and the precipitate is discarded. The diethylether-hexane fraction and the washings are combined and evaporated in vacuo to a residue. The residue dissolves in approx. 5 ml of diethyl ether, the solution is filtered and added with stirring to 50 ml of petroleum ether (boiling point 30 - 60°C). The grey-white to brown-yellow precipitate formed is filtered off and washed sparingly with petroleum ether. The precipitate is dried with wood

ZfO°C i vakuum. Det antibiotisk aktive produkt (rått antibiotikum 67-694) erholdt på denne måte viser vanligvis en styrke på ca. ZfO°C in vacuum. The antibiotically active product (crude antibiotic 67-694) obtained in this way usually shows a potency of approx.

700 ug/mg ved den ovenfor beskrevne bestemmelsesmetode. 700 ug/mg by the above-described determination method.

Eksempel 4 Example 4

Rensning av antibiotikum 67- 694 Antibiotic purification 67-694

Antibiotikum 67-694-produktet erholdt i eksempel 3 oppløses i en blanding av 9 volumdeler kloroform og 1 volumdel methanol. Den således erholdte oppløsning tilsettes til en kolonne inneholdende 250 g kiselsyre, og kolonnen elueres så med en blanding av kloroform (8 volumdeler) og methanol (2 volumdeler). 5 ml fraksjoner oppsamles med en hastighet på ca. 0,5 ml/min. Hver fraksjon prøve-taes og skive-prøves mot Staphylococcus aureus. En prøve av hver fraksjon kromatograferes på silicagel GF plater (tykkelse 250 micron) kommersielt tilgjengelige under varemerket "Uniplate". Fraksjoner inneholdende antibiotikum 67-694 har en R^-verdi på ca. 0,4 til 0,5- Fraksjonene med en R^-verdi innen dette område forenes og inndampes i vakuum til et residuum. Residuet oppløses i aceton og derpå tilsettes diethylether. De dannede bunnfall fraskilles ved filtrering eller ved sentrifugering og kastes. Filtratet eller den overstående væske inndampes i vakuum til et fast residuum. Det således erholdte antibiotisk aktive produkt er antibiotikum 67-694 som viser en styrke på 1000 ug/mg ved den ovenfor beskrevne bestemmelsesmetode, og har følgende fysikalske konstanter : The antibiotic 67-694 product obtained in example 3 is dissolved in a mixture of 9 parts by volume of chloroform and 1 part by volume of methanol. The solution thus obtained is added to a column containing 250 g of silicic acid, and the column is then eluted with a mixture of chloroform (8 parts by volume) and methanol (2 parts by volume). 5 ml fractions are collected at a rate of approx. 0.5 ml/min. Each fraction is sampled and slice-tested against Staphylococcus aureus. A sample of each fraction is chromatographed on silica gel GF plates (thickness 250 micron) commercially available under the trademark "Uniplate". Fractions containing antibiotic 67-694 have an R^ value of approx. 0.4 to 0.5 - The fractions with an R^ value within this range are combined and evaporated in vacuo to a residue. The residue is dissolved in acetone and then diethyl ether is added. The formed precipitates are separated by filtration or by centrifugation and discarded. The filtrate or the supernatant liquid is evaporated in vacuum to a solid residue. The antibiotic active product thus obtained is antibiotic 67-694, which shows a strength of 1000 ug/mg by the above-described determination method, and has the following physical constants:

sm.p. = HO - 114°C sm.p. = HO - 114°C

[a]^ = -33,4° (konsentrasjon = 3% i ethanol) [a]^ = -33.4° (concentration = 3% in ethanol)

e}% = 238 (ved 240 nm) e}% = 238 (at 240 nm)

l cm ' l cm'

Infrarødt spektrum som vist i fig. 1. Infrared spectrum as shown in fig. 1.

Kjernemagnetisk resonansspektrum som vist i fig. 2. Nuclear magnetic resonance spectrum as shown in fig. 2.

Andre fysikalske og kjemiske egenskaper far et slikt produkt er som beskrevet under avsnittet "Antibiotikumet". Other physical and chemical properties of such a product are as described under the section "The antibiotic".

Eksempel 5 Example 5

Alternativ metode for isolering og rensning av antibiotikum 67- 694 Alternative method for isolation and purification of antibiotics 67-694

pH av et fermentert medium fremstilt som i eksempel 2 innstilles på ca. 9,5 under anvendelse av 1 N vandig natriumhydroxyd- The pH of a fermented medium prepared as in example 2 is set to approx. 9.5 using 1 N aqueous sodium hydroxide

oppløsning. Det fermenterte medium ekstraheres med 2o liters porsjoner ethylacetat inntil det antibiotisk aktive produkt er effektivt fjernet (2 til 5 ekst raksjoner er vanligvis tilstrekkelig), og de forenede ethylacetatekstrakter inndampes så i vakuum til et residuum. Residuet oppløses i en kloroform-methanolblanding (9 volumdeler kloroform og 1 volumdel methanol) og oppløsningen tilsettes til en kiselsyrekolonne. Kolonnen elueres så med en kloroform-methanolblanding bestående av 8 volumdeler kloroform og 2 volumdeler methanol. 5 ml fraksjoner oppsamles og hver fraksjon prøvetaes. Hver fraksjon skive-prøves mot Staphylococcus aureus, og en prøve av hver fraksjon kromatograferes på en "Uniplate". resolution. The fermented medium is extracted with 20 liter portions of ethyl acetate until the antibiotic active product is effectively removed (2 to 5 extractions are usually sufficient), and the combined ethyl acetate extracts are then evaporated in vacuo to a residue. The residue is dissolved in a chloroform-methanol mixture (9 parts by volume chloroform and 1 part by volume methanol) and the solution is added to a silicic acid column. The column is then eluted with a chloroform-methanol mixture consisting of 8 parts by volume of chloroform and 2 parts by volume of methanol. 5 ml fractions are collected and each fraction is sampled. Each fraction is disk-tested against Staphylococcus aureus, and a sample of each fraction is chromatographed on a "Uniplate".

Fraksjoner med tilsvarende R^.-verdier forenes. De som inneholder antibiotikum 67-694, har en R^-verdi på ca. 0,4 til 0,5, og disse fraksjoner forenes og inndampes så i vakuum til et residuum. Residuet oppløses i aceton, og derpå tilsettes diethylether. Det dannede bunnfall fraskilles ved filtrering eller sentrifugering og kastes. Filtratet eller den overstående væske inndampes i vakuum til et fast residuum. Det således erholdte antibiotisk aktive produkt er antibiotikum 67-694 med en styrke på ca. lOOO ug/mg og med fysikalske konstanter i det vesentlige som angitt i eksempel 4. Fractions with corresponding R^. values are combined. Those containing antibiotic 67-694 have an R^ value of approx. 0.4 to 0.5, and these fractions are combined and then evaporated in vacuo to a residue. The residue is dissolved in acetone, and then diethyl ether is added. The precipitate formed is separated by filtration or centrifugation and discarded. The filtrate or the supernatant liquid is evaporated in vacuum to a solid residue. The antibiotic active product thus obtained is antibiotic 67-694 with a strength of approx. lOOO ug/mg and with physical constants essentially as stated in Example 4.

Eksempel 6 Example 6

Ant ibiot ikum 67- 694- kaliumdihydrogenfosfat salt Ant ibiot ikum 67- 694- potassium dihydrogen phosphate salt

500 mg antibiotikum 67-694 tilsettes til 13 ml vann. 130 mg kaliumdihydrogenfosfat tilsettes og omrøres ved værelsetemperatur i 2 timer. Ca. 50 mg avfarvende trekull tilsettes og omrøres i ytterligere 15 minutter. Oppløsningen filtreres og lyofiliseres for å få tittelproduktet. Add 500 mg of antibiotic 67-694 to 13 ml of water. 130 mg of potassium dihydrogen phosphate are added and stirred at room temperature for 2 hours. About. 50 mg of decolorizing charcoal is added and stirred for a further 15 minutes. The solution is filtered and lyophilized to obtain the title product.

Sm.p. 118 - 121°C, [a]p° = -21,2° (0,3% i vann). Sm.p. 118 - 121°C, [a]p° = -21.2° (0.3% in water).

Ved å anvende i det vesentlige den samme metode som i dette eksempel og ved å anvende ekvivalente mengder av syrer som er betraktelig oppløselige i vann som saltsyre, svovelsyre, fosforsyre, eddiksyre, ravsyre, citronsyre, melkesyre, eplesyre, malonsyre, maleinsyre og lignende, kan de tilsvarende farmasøytisk godtagbare syreaddisjonssalter fremstilles. I alminnelighet oppviser slike salter in vitro og in vivo antibakterielle spektra som er temmelig like, om ikke identiske, med den for den frie nitrogenbase. Hvor forskjeller opptrer kan de vanligvis tilskrives forskjeller i opp-løselighet . på grunn av deres oppløselighet i vandige medier er de ovennevnte salter særlig vel egnet for anvendelse i vandige preparater og oppløsninger for oral og parenteral administrasjon. By applying essentially the same method as in this example and by using equivalent amounts of acids that are considerably soluble in water such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, acetic acid, succinic acid, citric acid, lactic acid, malic acid, malonic acid, maleic acid and the like, the corresponding pharmaceutically acceptable acid addition salts can be prepared. In general, such salts exhibit in vitro and in vivo antibacterial spectra that are quite similar, if not identical, to that of the free nitrogen base. Where differences do occur, they can usually be attributed to differences in solubility. due to their solubility in aqueous media, the above-mentioned salts are particularly well suited for use in aqueous preparations and solutions for oral and parenteral administration.

Eksempel 7 Example 7

Antibiotikum 67- 694- tartratsalt Antibiotic 67- 694- tartrate salt

1 g antibiotikum 67-694 oppløses i 50 ml diethylether, og der tilsettes en oppløsning av 250 mg vinsyre i 1,5 ml ethanol. Den dannede blanding omrøres i ca. 15 minutter, og det utfelte salt fra filtreres så. Bunnfallet vaskes med diethylether, og tørres, hvorved man får tittelproduktet. 1 g of antibiotic 67-694 is dissolved in 50 ml of diethyl ether, and a solution of 250 mg of tartaric acid in 1.5 ml of ethanol is added there. The resulting mixture is stirred for approx. 15 minutes, and the precipitated salt is then filtered. The precipitate is washed with diethyl ether and dried, whereby the title product is obtained.

Smp. 129 - 134°C, [a]p° = -12° (0,3% i vann). Temp. 129 - 134°C, [a]p° = -12° (0.3% in water).

Ved å anvende i det vesentlige den i dette eksempel beskrevne fremgangsmåte og ved å anvende ekvivalente mengder av syrer med betraktelig oppløselighet i ether-alkoholblandinger som glutarsyre, laurinsyre, adamantansyre, kanelsyre, kamfersyre, palmitinsyre, stearinsyre og undecylensyre, kan de respektive farmasøytisk godtagbare syreaddisjonssalter fremstilles. På grunn av deres molekylvekt og oppløselighetsegenskaper er disse salter i alminnelighet særlig godt egnet for anvendelse i lokale preparater som kremer og salver. By using substantially the method described in this example and by using equivalent amounts of acids with considerable solubility in ether-alcohol mixtures such as glutaric acid, lauric acid, adamantic acid, cinnamic acid, camphoric acid, palmitic acid, stearic acid and undecylenic acid, the respective pharmaceutically acceptable acid addition salts can is produced. Due to their molecular weight and solubility properties, these salts are generally particularly well suited for use in local preparations such as creams and ointments.

Antibiotikumet opparbeides til preparater, bortsett fra The antibiotic is processed into preparations, except

lokale preparater, som er beregnet på å tillate administrering av fra ca. 5 til 50 mg antibiotikum (som den frie base) pr. kg legemsvekt pr. dag. Det er tenkt at medikamentene skal administreres opptil ca. 8 ganger i løpet av døgnet. De lokale preparater er beregnet på å påføres på de infiserte områder ca. 2 til 4 ganger daglig. local preparations, which are intended to allow the administration of from approx. 5 to 50 mg of antibiotic (as the free base) per kg body weight per day. It is intended that the drugs will be administered up to approx. 8 times during the day. The local preparations are intended to be applied to the infected areas approx. 2 to 4 times daily.

Det bør imidlertid merkes at størrelsen av den administrerte dose However, it should be noted that the size of the administered dose

og hyppigheten av administrasjonen i stor utstrekning v;Ll avhenge av typen av infeksjon, graden av infeksjon og de individuelle egenskaper av dyrearten som behandles. and the frequency of administration will largely depend on the type of infection, the degree of infection and the individual characteristics of the species being treated.

Claims

1. Procedure for the production of a hitherto unknown antibiotic active substance designated as antibiotic 67-694 ("rosamicin") or antibiotically active salts thereof, which antibiotic in its free form has the overall structural formula: characterized in that a microorganism of the species Micromonospora rosaria is cultivated in a nutrient medium under aerobic conditions, and that the active substance is optionally isolated, and optionally transferred to a salt.

2. Method according to claim 1, characterized in that the strain designated as NRRL 3718- is used as a microorganism of the species Micromonospora rosaria