PL82003B1 - - Google Patents

Description

Pierwszenstwo: 03.08.1971 Japonia Zgloszenie ogloszono: 30.05.1973 Opis patentowy opublikowano: 31.08.1976 82003 MKP C12d 9/14 Int. Cl.2 C12D 9/14 Twórcy wynalazku: Mamoru Arai, Tatsuo Haneishi, Hisashi Kayamori, Yoo Takiguchi, Noritoshi Kitano, Susumu Kaneko Uprawniany z patentu: Sankyo Company Limited, Tokio (Japonia) Sposób wytwarzania nowego antybiotyku aspikulamycyny Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania nowego antybiotyku aspikulamycyny o wzorze struktural¬ nym, przedstawionym na rysunku.Sposób wedlug wynalazku polega na hodowli Streptomyces toyocaensis var. aspiculamyceticus, szczepu nr 1040, który po raz pierwszy wyizolowany zostal z próbki gleby zebranej w Hirazumi, Iwate, Japonia.Wytworzona aspikulamycyne izoluje sie metoda ekstrakcji z przesaczu hodowlanego i oczyszcza.Charakterystyczne dla tego antybiotyku jest dzia¬ lanie przeciwpasozytnicze skierowane glównie prze¬ ciw pasozytom zwierzecym, takim jak owsiki i in¬ ne, chociaz wykazuje równiez slabe dzialanie prze- ciwbakteryjne na bakterie Gram dodatnie oraz Gram ujemne, jak i na bakterie gruzlicy.Cechy morfologiczne szczepu nr 1040 z obser¬ wacji pod mikroskopem sa nastepujace.Grzybnia powietrzna rozrasta sie z dobrze roz- 10 15 galezionej grzybni podstawowej, przy czym na szczycie grzybni powietrznej tworzy sie lancuch zarodników. Grzybnia powietrzna tworzy szereg rozgalezien podobnych do peczków. Strzepki grzyb¬ ni powietrznej zakonczone sa spiralami w formie splotów o 5 do 20 skretach. Lancuchy zarodników posiadaja po 50 i wiecej zarodników kazdy. Po¬ wierzchnia zarodników jest sprezysta. Zarodniki maja ksztalt sferyczny.do eliptycznego o wymia¬ rach 0,4—0,6X0,7—1,0 \i.Hodowla szczepu na róznych pozywkach (obser¬ wacje dokonane po dwutygodniowej hodowli w temperaturze 27°C) dala wyniki podane w tab¬ licy 1. Na ogól strzepki grzybni powietrznej i za¬ rodniki sa w postaci proszku, a grzybni jest nie¬ wiele. Barwy okreslano zgodnie z „Guide to Color Standard" (wydanie Nippon Shikisai Kenkyusho, Japonia).Pozywka Agar azotano¬ wy z sacharoza Agar aspara¬ ginowy z glu¬ koza Wzrost umiarkowany obfity Tablica 1 Grzybnia powietrzna blado brazowa blado brazowa Grzybnia podstawowa bezbarwna brazowawo biala Strona^ spodnia (reverse) blado brazowa zóltawo szara Pigment rozpuszczalny brak brak82 003 3 4 c d. itaib. 1 Pozywka Agar aspara¬ ginowy z gli¬ ceryna Agar skrobio¬ wy z solami Agar z tyrozyna Agar odzywczy Agar slodowy z drozdzami Agar z maka owsiana Wzrost obfity obfity obfity dobry obfity obfity Grzybnia powietrzna brazowawo szara brazowawo szfera jasno brazowawa biala szarawo brazowa brazowawo szara Grzybnia podstawowa brazowawo biala / brazowawo biala zóltawo szara zóltawo szara blado zóltawo brazowa zóltawo szara Strona spodnia (reyerse) zóltawo szara zóltawo szara blado zóltawo brazowa blado zóltawo brazowa blado zóltawo brazowa zóltawo szara Pigment rozpuszczalny brak brak brak brak brak /' brak grzybni powietrznej i podstawowej, rosnac na róz- 20 nych pozywkach. Szczep nr 1040 wytwarza nowy antybiotyk aspikulamycyne.Na podstawie powyzszych danych szczep nr 1040 zidentyfikowany zostal jako jeden z wariantów Streptomyces toyocaensis i nazwany Streptomyces 25 toyocaensis var. aspiculamyceticus. Szczep nr 1040 zdeponowany zostal pod nr rejestracyjnym 1036 w Technical Research Institute of Microbial Industry, Agency of Industrial Science and Technology, Ja¬ ponia. 30 Hodowle szczepu wedlug wynalazku prowadzi sie metoda stosowana przy uzyciu promieniowców. Ko¬ rzystnie, gdy drobnoustrój szczepi sie w plynnej pozywce w przyblizeniu w pH obojetnym i hodo¬ wla przebiega w temperaturze 25—35°C, stosujac 35 mieszanie powietrzem. Pozywka jako zródlo wegla moze zawierac skrobie, glukoze, gliceryne i inne.Jako zródlo azotu ekstrakt miesny, pepton, namok kukurydzany, make sojowa, drozdze, make z nasion bawelny i inne. Jako sól nieorganiczna stosuje sie 40 np. chlorek sodu, chlorek potasu, weglan wapnia, fosforany i inne. Zwykle ilosc wytworzonej w brzeczce hodowlanej aspikulamycyny osiaga swe maksimum po uplywie 40—120 godzin fermentacji.Do izolowania aspikulamycyny z brzeczki fer- 45 mentacyjnej stosuje sie znane sposoby w izolowa¬ niu produktów naturalnych. Np. taka metoda mo¬ ze byc sposób, wykorzystujacy róznice w rozpusz¬ czalnosci oraz zdolnosci adsorpcji na wymienia¬ czach jonowych aspikulamycyny oraz zanieczysz- 50 czen.Aspikulamycyne mozna izolowac metoda saczenia brzeczki fermentacyjnej, po uprzednim jej zobo¬ jetnieniu, razem z ziemia okrzemkowa usuwajac grzybnie, przepuszczajac przesacz przez wymieniacz 55 jonowy, na którym antybiotyk zostaje zaadsorbo- wany i nastepnie eluujac zaadsorbowany antybio¬ tyk odpowiednim kwasem, roztworem alkalicznym lub roztworem soli nieorganicznej. W takim przy¬ padku mozna rozdzielic równoczesnie dwa anty- 60 biotyki przeciwgrzybowe, to jest tetraen oraz toyo¬ kamycyne od aspikulamycyny, poniewaz tetraen nie zostaje zaadsorbowany na kationowej zywicy jonowymiennej, natomiast toyokamycyne eluuje sie przy nizszym pH niz aspikulamycyne.. Aspiku- 65 lamycyne mozna równiez izolowac metoda adsorp- Cechy fizjologiczne szczepu sa nastepujace: Temperatura wzrostu: 10—40°C Uplynnianie zelatyny: + umiarkowane Hydroliza skrobi: + umiarkowana Koagulacja mleka odtluszczonego: + w tempera¬ turze 25°C oraz 37°C Peptonizacja mleka odtluszczonego: + w tempera¬ turze 25°C oraz 37°C (pH = 6,6) Tworzenie melaminy: na pozywce agarowej z tyrozyna — na pozywce agarowej z peptonem, drozdzami i zelazem — Redukcja azotanów + Wykorzystywanie zródla wegla na pozywce aga¬ rowej wg Pridhama i Gottlieba podano w tabli¬ cy 2\ L-arabinoza D-ksyloza D-glukoza D-fruktoza Sacharoza Inozytol Rafinoza D-mannitol L-ramnoza Celuloza + ± ++ ++ — +++ — ++ + Wsród znanych szczepów o wlasciwosciach po¬ dobnych do szczepu nr 1040 mozna wymienic Strep¬ tomyces toyocaensis, który opisany zostal w „The Actimonymecetes", tom 2 (Waksman, 1961). W opar¬ ciu o to, ze szczep nr 1040 wytwarza równoczesnie antybiotyk toyokamycyne, oraz nowy antybiotyk aspikulamycyne w ten sam sposób jak Streptomy¬ ces toyocaensis uznano, ze szczep nr 1040 nalezy do rodzaju Streptomyces gatunku Streptomyces toyo¬ caensis. Szczep nr 1040 jednakze rózni sie od Strep¬ tomyces toyocaensis nastepujacymi cechami. Szczep nr 1040 tworzy dlugie spiralne nitki podczas gdy Streptomyces toyocaensis krótkie spirale. Szczep nr 1040 tworzy spiralne wlókna na pozywce zawie¬ rajacej skrobie i sole nieorganiczne, podczas gdy Streptomyces toyocaensis nie tworzy. Szczep nr 1040 na kazdej pozywce rosnie bardzo dobrze w porównaniu ze Streptomyces toyocaensis. Obydwa szczepy róznia sie nieco od siebie zabarwieniem5 82 óós * cji przesaczu hodowlanego na weglu aktywnym, przy wartosci pH od kwasnego do obojetnego, eks¬ trahujac aspikulamycyne zakwaszonym wodnym roztworem metanolu lub uwodnionym acetonem.Zageszczony plyn hodowlany mozna dalej oczysz- 5 czac stosujac kationowe lub anionowe zywice jo¬ nowymienne. Po zageszczeniu wodnego roztworu zawierajacego wyekstrahowana, wyizolowana i oczy¬ szczona aspikulamycyne, roztwór poddaje sie lio¬ filizacji lub wytraceniu organicznym rozpuszczalni- io kiem, takim jak metanol, etanol, aceton i inne, przy czym aspikulamycyne otrzymuje sie w posta¬ ci bialego proszku, który krystalizuje z uwodnio¬ nym acetonem.Nowy antybiotyk wytworzony sposobem wedlug 15 wynalazku, nazwany aspikulamycyna posiada wzór strukturalny, przedstawiony na rysunku.Aspikulamycyna ma nizej podane wlasciwosci fi¬ zykochemiczne.Krysztaly w postaci bialychigiel. 20 Temperatura topnienia.Rozklad rozpoczyna sie stopniowo poczynajac od temperatury okolo 200°C.Analiza elementarna dla CioHaoOioNg • V* H20 Obliczono: C 42,37, H 5,58, N 20,82, O 31,22% 25 Znaleziono: C 42,63, H 5,78, N 20,52, O 31,07% Ciezar czasteczkowy: 490,5 mierzony metoda pomia¬ ru cisnienia pary i 530,0 obliczony na podstawie wzoru czasteczkowego.Skrecalnosc wlasciwa: [a]20 =+54,9° (C = l, w 30 wodzie).Widmo w nadfiolecie.Jak podano na fig. 1, wartosci maksimum ab¬ sorpcji w wodzie oraz w 0,05 N roztworze NaOH wynosi 236 m\i (Ej% =156) oraz 268 mu (E*% - 35 1cm n 1 cm- = 164) odpowiednio, a wartosc w 0,05 N roztworze HC1 wynosi 276 mu (El% =214).T lem Widmo w podczerwieni mierzone w nujolu poda¬ no na fig. 2. 40 Maksima absorpcji przy 3350, 3200, 1690, 1660, 1610, 1530, 1495, 1290, 1210, 1090, 1030, 940, 850, 790 cm-1. Rozpuszczalnosc.Aspikulamycyna jest latwo rozpuszczalna w wo¬ dzie, ale nierozpuszczalna w metanolu, etanolu, ace- 45 tonie, chloroformie i innych.Reakcja barwna.Dodatnia w reakcji z ninhydryna oraz 2,4-dwuni- trofenylohydrazyna. Ujemna w reakcji Molischa, Anthrona, Fehlinga; nie redukuje azotanu srebra. 50 Substancja zasadowa z pKai 3,90 : pKa2 8,24.Chromatografia.Na chromatogramie bibulowym (Toyo Filter Paper No 51) rozwijanym woda, aspikulamycyna daje plame o wartosci Rf = 0,37, natomiast na 55 chromatogramie rozwijanym butanolem wysyconym woda wartosc Rf = 0. Na chromatogramie cienko¬ warstwowym (Eastman chromatogram Sheet 6065) rozwijanym mieszanina n-butanolu, kwasu octowe¬ go i wody (4:1:1) wartosc Rf = 0,05, natomiast 60 rozwijanym mieszanina n-propanolu, pirydyny, kwasu octowego i wody (15 :10 : 3 :10) wartosc Rf = 0,4.Aktywnosc biologiczna aspikulamycyny ilustruje tablica 3, w której przedstawiono najmniej- 65 sze stezenie aspikulamycyny hamujace wzaost róznych bakterii, grzybów, drozdzaków oraz pato- gennych drobnoustrojów roslinnych. Aktywnosc wobec bakterii oznaczano na agarze odzywczym po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C.W przypadku paleczek gruzlicy oznaczenie przepro¬ wadzono po 48 godzinach inkubacji w temperatu¬ rze 37°C na agarze odzywczym z gliceryna, nato¬ miast w przypadku grzybów i drozdzaków oznacze¬ nie wykonano na agarze Sabouraud, zas w odnie¬ sieniu do patogennych grzybów roslinnych oznacze¬ nie wykbn/aino na agarze ziemniaczanym z sacharo¬ za inkubowanym w ciagu 48 godzin w temperatu¬ rze 25°C.Tablica 3 Drobnoustrój Staphylococcus aureus 209P »» » 56 „ 1557 193 „ 52-34 Bacillus subtilis Sarcina lutea Corynebacterium xerosis Aeromonas punclata Pseudomonas aeruginosa Proteus vulgaris Escherichia coli NIHJ Escherichia coli K-12 Escherichia coli (oporna na strepto- trycyne) Escherichia coli (oporna na strepto¬ mycyne) Escherichia coli (oporna na kana- mycyne) Escherichia coli (oporna na chlo¬ ramfenikol oraz tetracykline) Escherichia coli 97 (oporna na sze¬ reg antybiotyków) i Mycobacterium smegmatis 607 Candida albicans Yu 1200 Saccharomyces cerevisiae Trichophyton interdigitale Cryptococcus neoformans Aspergillus niger Penicillium chrysogenum Hormodendrum pedrosoi Botorytis cinerea Fusarium moniriforme 1 Gloesporium kaki | Minimalne stetenie hamujace | (K-g/ml) 400 400 400 400 200 200 400 400 400 400 200 200 200 100 50 50 400 50 400 400 400 400 400 400 400 400 400 400 | Minimalne stezenie aspikulamycyny hamujace wzrost Mycoplasma podano w ponizszej tablicy.Tablica 4 Mycoplasma Mycoplasma mycoides var. mycoides „ agalactiae „ mycoides var. capri „ arthritidis „ laidlawii „ bovigenitalium „ pulmonis „ gailisepticum „ canis felis „ hyorhinis | „ hominis typ 1 i *—^~~1 Minimalne stezenie hamujace (L*-g/ml) 25 1,56 1,56 6,25 25 6,25 1,56 1,56 13,5 3,12 0,78 3,12 162 0ÓS 8 Badajac ostra toksycznosc u myszy po dozylnej injekcji antybiotyku stwierdzono, ze 3/5 zginelo po dawce 25 mg/kg, a 3/5 przezylo dawke 10 mg/kg.Po podaniu doustnym 2/5 myszy zginelo po dawce 125 mg/kg.Aspikulamycyna wykazuje znaczna aktywnosc hamowania pasozytów zwierzecych zarówno w sta¬ dium owulacji, jak i pasozytobójcza. W tablicy 5 podano wyniki hamowania w stadium owulacji u owsików takich, jak Syphacia obvelate oraz Aspi- cularis tetraptera u myszy. Myszy na diecie zasad¬ niczej podzielono na 3 grupy po 5 myszy. Grupe pierwsza zywiono zasadnicza dieta bez aspikulamy- cyny, a grupom drugiej i trzeciej podawano zasad¬ nicza diete z dodatkiem 100 mg i 50 mg aspikula- mycyny na kg podstawowej diety odpowiednio.Test ten mial na celu obserwacje postepu owu¬ lacji w ciagu 4 tygodni po podaniu leku oraz prze¬ badanie w tym samym czasie dzialania pasozyto- bójczego przez przeliczenie ilosci pasozytów w je¬ licie na podstawie autopsji.Jak wynika z tablicy 5 bardzo dobre hamowanie owulacji mialo„miejsce w ciagu 4 tygodni w oby¬ dwu przypadkach po dawkach 100 mg i 50 mk/kg, a wyniki otrzymane z autopsji potwierdzily bardzo dobre dzialanie pasozytobójcze. 10 15 25 nie hodowla wstepna szczepi sie 60 1 pozywki znajdujacej sie w tankach o pojemnosci 100 1 i miesza z szybkoscia 150 obrotów na minute, prze¬ puszczajac jalowe powietrze z szybkoscia 60 l/min.Najwyzsza ilosc wytworzonej aspikulamycyny uzy¬ skuje sie po uplywie okolo 90 godzin. W przesaczu otrzymanej w ten sposób brzeczki fermentacyjnej znajduja sie równoczesnie dwa antybiotyki. Jed¬ nym jest antybiotyk z grupy tetraenów wykazu¬ jacy przeciwbakteryjna aktywnosc wobec bakterii Gram dodatnich i drozdzaków, a drugim toyoka¬ mycyna.Przyklad II. Ekstrakcja i oczyszczanie aspi¬ kulamycyny.Do 5 1 brzeczki hodowlanej, otrzymanej zgodnie z wyzej opisanym sposobem w kolbie Sakaguchi, dodaje sie 10% ziemi okrzemkowej i mieszanine saczy sie. Otrzymany przesacz, do którego dodano 2% wegla aktywnego, wytrzasa sie i saczy. Wegiel aktywny przemywa sie 2 1 wody i ekstrahuje dwu¬ krotnie 1 1 50% acetonu doprowadzonego do war¬ tosci pH = 2 dodatkiem kwasu solnego. Po zobo¬ jetnieniu uzyskany ekstrakt zageszcza sie pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci 500 ml, w którym znajduje sie aspikulamycyna wraz z toyokamycyna. Aspikulamycyne obecna w tak Dzien rozpo¬ czecia ipoda- wania 4 t 14 21 26 Ilosc owsi¬ ków po autopsji Grupa 1 1 ++ :+ — + 6 2 .+ + — + + + 7 3 -Hf — rh + + 9 4 ++ +++ + — 0 5 +¦+ — — 6r Tablica 5 Grupa 2 1 + — — 0 1 1 2 1 + — — 0 3 +hh — — 0 4 +:+ — — 0 5 + — ,— 0 1 + + + + 0 Grupa * 2 ! 3 -H- ++.+ — 0 ¦ + + — — — 0 * 4 +.+ +;++ +,++ +¦++ 0 5 + — — — —. 0 W ten sposób potwierdzono, ze aspikulamycyny jest nowym antybiotykiem, biorac pod uwage fakt, ze zaden z antybiotyków o takich wlasciwosciach fizyko-chemicznych i biologicznych dotychczas nie byl znany.Przytoczone przyklady ilustruja sposób wedlug wynalazku nie ograniczajac jego zakresu.Przyklad I. Plynna pozywke zawierajaca 3% skrobi, 1% ekstraktu miesnego, 1,5% pharmamedia oraz 2,0% namoku kukurydzy doprowadza sie do wartosci pH = 7,6, po czym wyjalawia w tempera¬ turze 120°C w ciagu 30 min. Pozywke zaszczepia sie Streptomyces toyocaensis var. aspiculamyceticus i miesza, wprowadzajac powietrze. Hodowle pro¬ wadzi sie do czasu uzyskania najwyzszej mocy oznaczonej przy uzyciu Escherichia coli NIHJ jako drobnoustroju testowego. Hodowle inokulum pro¬ wadzi sie zwykle 5 do 6 dni po czym 100 ml po¬ zywki przenosi sie do kolb Sakaguchi o pojemno¬ sci 500 ml i wytrzasa w ciagu 48 godzin. Nastep- otrzymanym koncentracie oczyszcza sie w kolum¬ nie chromatograficznej wypelnionej Amberlitem IRC-50, który jest slabo kwasna kationowa zywica jonowymienna. Koncentrat podaje sie na Amberlit 50 IRC-50 typu NH4+, a zawarta w mieszaninie toyo¬ kamycyna jest usuwana wraz z nieadsorbujaca sie czescia. Po przemyciu woda prowadzi sie elucje 0,5 n amoniakiem. Nastepnie zageszczajac frakcje aktywne i po usunieciu amoniaku zanieczyszczenia 65 usuwa sie przez adsorpcje na Dowex 1X1 rodzaju OH~, który jest silnie zasadowa anionowa zywica jonowymienna. Otrzymane frakcje aktywne zagesz¬ cza sie i liofilizuje otrzymujac 0,8 g aspikulamycyn w postaci bialego proszku. 60 Przyklad III. Przesacza sie 60 litrów brzeczki fermentacyjnej razem z 6 kg ziemi okrzemkowej, przesacz przepuszcza przez kolumne wypelniona 6 1 Amberlitu IRC-50 typu H+, usuwa tetraen, a zaadsorbowane frakcje eluuje 1 n amoniakiem. 65 Najpierw eluuje sie toyokamycyna, a nastepnie82003 9 aspikulamycyna. Frakcje zawierajace aspikulamy- cyne zageszcza sie. 2 1 koncentratu adsorbuje na Amberlicie CG-50, przez który uprzednio przepusz¬ czono buforowy roztwór siarczanu amonu o war¬ tosci pH = 7 i eluuje 0,05 molarnym kwasnym fosforanem dwuamonowym. Frakcje aktywne za¬ wierajace aspikulamycyne adsorbuje sie na Amber¬ licie CG-50 typu H + , przemywa woda, eluuje 0,5 n amoniakiem i odsala. Po zageszczeniu wytraca sie acetonem i osad oddziela przez odwirowanie. Na¬ stepnie zebrany osad rozpuszcza sie w wodzie i lio¬ filizuje otrzymujac 2,5 g aspikulamycyny w postaci 10 10 bialego proszku. Do roztworu 1 g proszku rozpusz¬ czonego w 10 ml wody dodaje sie 40 ml acetonu, przy czym wykrystalizowuje aspikulamycyny z wy¬ dajnoscia 200 mg. PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania nowego antybiotyku aspiku¬ lamycyny o wzorze przedstawionym na rysunku, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie przy uzy¬ ciu szczepu Streptomyces toyocaensis var. aspicula- myceticus, szczep 1040, a nastepnie aspikulamycyne izoluje sie z brzeczki fermentacyjnej. Fio 7 220 240 Z60 .... 280 300^ 3500 3000 2000 1600 1600 1400 1200 1000 800 c^_182 003 H,N0C H0CH2-CHOC-HN OH NN-C0-CH(CH20H)NH-CO-CH2-MH-CH3 hlzdr- PZG Bydg., zam. 424/76, nakl. 105+20 Cena 10 zl PL