PL218235B1

PL218235B1 - Nośnik fibrynowy autologiczny i allogeniczny, sposób jego otrzymywania i zastosowanie nośnika fibrynowego do przeszczepu komórek, zwłaszcza ludzkich

Info

Publication number: PL218235B1
Application number: PL396313A
Authority: PL
Inventors: Henryk Bursig; Stanisław Dyląg; Fabian Kępski; Dorota Król; Patrycja Sitek; Aleksandra Wysocka-Wycisk; Jolanta Żyła
Original assignee: Henryk Bursig; Stanisław Dyląg; Fabian Kępski; Dorota Król; Regionalne Ct Krwiodawstwa I Krwiolecznictwa; Patrycja Sitek; Wysocka Wycisk Aleksandra; Jolanta Żyła
Priority date: 2011-09-12
Filing date: 2011-09-12
Publication date: 2014-10-31
Also published as: PL396313A1; WO2013039411A1

Description

Przedmiotem wynalazku jest nośnik fibrynowy autologiczny i allogeniczny, sposób otrzymywania nośnika fibrynowego autologicznego i allogenicznego komórek ssaczych oraz zastosowanie go do przeszczepu wyhodowanych komórek, zwłaszcza ludzkich.

Fibrynogen jest białkiem osocza krwi, z którego powstaje fibryna, czyli włóknik - końcowy produkt procesu krzepnięcia krwi. Polimeryzacja fibrynogenu w nierozpuszczalną fibrynę zachodzi w obecności trombiny, jonów wapnia i czynnika XII. Powstająca fibryna wykazuje zdolność wiązania się z wieloma czynnikami wzrostu ochraniając je przed denaturacją i proteolizą. Dlatego też fibrynę można stosować jako system kontrolująco-regulujący uwalniania czynników wzrostowych, cytokin lub innych molekuł bioaktywnych, które mają wpływ na adhezję, proliferację, migrację, różnicowanie i produkcję macierzy zewnątrzkomórkowej.

Stąd też zaczęto stosować fibrynogen do przeszczepów komórek. Główną cechą fibrynogenu jest plastyczność, dzięki, której można dostosować przygotowany przeszczep do wielkości ubytku oraz dobra tolerancja przez pacjentów. Duża zdolność do polimeryzacji ze stanu ciekłego w żel sprawia, że można przygotować dowolnego kształtu trwałe podłoże do zawieszania komórek i czynników wzrostu.

Znany jest z polskiego opisu patentowego nr 54175 sposób otrzymywania czystego fibrynogenu uzyskiwanego przy frakcjonowaniu osocza polegający na tym, że za stałą pozostałość otrzymaną przez rozpuszczenie osadu z I frakcji Cohna w temperaturze +30°C w roztworze wodnym zawierającym 0,9% NaCl i 1% glikozy zastosowanym w ilości odpowiadającej 1/5 objętości osocza wyjściowego, w czasie 1-2 minut w temperaturze +30°C, następnie przez inkubacje i odwirowanie w temperaturze 0°C rozpuszcza się mieszając w temperaturze +30°C w roztworze wodnym stabilizatora, zawierającym w 1000 ml 6,72 g dwuwodnego cytrynianu trójsodowego, 3,4 g NaCl i 13 g glukozy zakwaszonej stężonym kwasem solnym do pH = 6,3. Otrzymany roztwór natychmiast zamraża się do temperatury -40°C i liofilizuje. Do rozpuszczania pozostałości uzyskanej z 400 - 500 ml osocza wyjściowego stosuje się 75 ml roztworu stabilizatora. Otrzymany po liofilizacji czysty fibrynogen rozpuszcza się przed stosowaniem leczniczym apirogenną wodą destylowaną.

Ponadto znany jest ze zgłoszenia nr P-383247 sposób otrzymywania fibrynogenu, zwłaszcza do otrzymywania kleju tkankowego oraz sposób jego wytwarzania. Zgodnie z wynalazkiem sposób otrzymywania fibrynogenu, zwłaszcza do otrzymywania kleju tkankowego, złożony z pobrania donacji krwi do potrójnego pojemnika do krwi, wirowania pobranej krwi, oddzielania osocza od elementów komórkowych oraz dwukrotnego zamrażania i rozmrażania z ludzkiej krwi osocza polega na tym, że oddzielone osocze przelewa się do pojemnika transferowego pustego, poddaje się zamrażaniu w temperaturze -30°C, przechowuje w temperaturze poniżej -25°C w ciągu 12 - 24 godzin, a następnie z zamrażarki przenosi się do łaźni wodnej i rozmraża się w temperaturze +4°C w ciągu do 2 godzin. Następnie osocze ponownie zamraża się w temperaturze -30°C i przechowuje w temperaturze poniżej -25°C w ciągu 12 - 24 godzin. Po tej operacji pojemnik z osoczem wyjmuje się z zamrażarki i łączy się z pustym pojemnikiem transferowym, dren zabezpiecza się zaciskiem a następnie zanurza się w medium płynnym o temperaturze +4°C. Pojemnik z osoczem zawierającym precypitat poddaje się wirowaniu, a po odwirowaniu pojemnik umieszcza się w prasie ręcznej i szybko oddziela nadsącz od osadu, zwalniając zacisk, pojemnik z osadem fibrynogenu przenosi się do zamrażarki i przechowuje w temperaturze poniżej -25°C.

Celem i zadaniem wynalazku jest opracowanie nośnika fibrynowego, sposobu otrzymywania nośnika fibrynowego bardziej uniwersalnego dla przeszczepów autologicznych i allogeniczny dla wszystkich komórek ssaczych, w tym chondrocytów charakteryzującego się lepszymi właściwościami użytkowymi i leczniczymi takimi jak: większa stabilność, zwiększone możliwości wzrostowo-zdrowotne oraz stwarzającego możliwość rezygnacji z dodatkowych czynników sieciujących, przykładowo trombina ksenogeniczna, która może wywołać odczyn alergiczny oraz czynników antyfibrynolitycznych: kwas traneksamowy, aprotynina.

Ponadto celem wynalazku jest zastosowanie nośnika fibrynowego do przeszczepu komórek ssaczych. Okazało się, że wprowadzenie do fibrynogenu dodatkowego środka krwiopochodnego nie tylko nie spowodowało degradacji żelu, lecz wpłynęło korzystnie na stabilizację przeszczepu i jego szybsze oddziaływanie na komórki.

Wytyczone zagadnienie rozwiązuje nośnik fibrynowy autologiczny i allogeniczny, charakteryzujący się tym, że stanowi żelowatą mieszaninę fibrynogenu i osocza bogatopłytkowego połączonych

PL 218 235 B1 w stosunku 0,1 - 2 do 0,1 - 2, korzystnie 1:1 udziałów objętościowych oraz chlorku wapnia w roztworze o stężeniu od 0,1 - 99%, korzystnie 10%-wego roztworu w stosunku 0,1 - 2 do 0,1 - 2 korzystnie 1:1 względem mieszaniny fibrynogenu z osoczem bogatopłytkowym. Nośnik fibrynowy autologiczny i allogeniczny stanowi żelowatą mieszaninę fibrynogenu i osocza bogatopłytkowego połączonych w stosunku 0,1 - 2 do 0,1 do 2, korzystnie 1:1 udziałów objętościowych oraz roztwór trombiny z chlorkiem wapnia we wzajemnym stosunku dogodnie 1:1 a względem mieszaniny fibrynogenu z osoczem bogatopłytkowym jak 0,1 - 2 do 0,1 - 2 korzystnie 1:1. Jako fibrynogen stosuje się fibrynogen krioprecypitat, otrzymany z donacji krwi biorcy lub dawcy, gotowy fibrynogen komercyjny.

Jako osocze bogatopłytkowe stosuje się osocze bogatopłytkowe otrzymane z donacji krwi biorcy lub dawcy, osocze otrzymane bezpośrednio z krwi od pacjenta za pomocą aparatury, gotowe oso56 cze bogatopłytkowe. Osocze bogatopłytkowe zawiera od 4,6 x 10 /μ| do 2 x 10 /μ| krwinek płytkowych.

Sposób otrzymywania nośnika fibrynowego autologicznego obejmujący pobieranie krwi, oddzie|enie osocza od e|ementów komórkowych krwi, zamrażanie i rozmrażanie osocza, charakteryzujący się tym, że z pobranej od biorcy donacji krwi, oddzie|one przez wirowanie w temperaturze +20 do +24°C przez 5 do 15 minut, przy si|e wirowania od 700 do 2000 x g od koncentratu krwinek: erytrocytów, |eukocytów, który się usuwa, - osocze przeciska się do pustego pojemnika sate|itarnego, po czym z osocza przez wirowanie w temperaturze +20 do +24°C przez 5 - 15 minut przy si|e wirowania od 2100 do 5000 x g oddzie|a się osocze bogatopłytkowe, które przechowuje się w pojemnikach, dogodnie pojemnikach oddychających w warunkach kołysania najwyżej 7 dób dogodnie 3 doby. Z pozostałego osocza ubogopłytkowego przygotowuje się fibrynogen w postaci krioprecypitatu przez dwukrotne zamrożenie osocza do temperatury -30°C do -90°C i rozmrożenie w temperaturze około +4°C, przykładowo w łaźni wodnej, następnie wirowanie w temperaturze około +4°C przez 5 - 20 minut przy si|e wirowania od 1000 do 5000 x g, po czym usuwa się nadsącz, a otrzymany krioprecypitat miesza się z osoczem bogatopłytkowym z pojemnika, w stosunku od 0,1 - 2 do 0,1 - 2, korzystnie 1:1 i ze związkiem wapnia w roztworze dogodnie 10% roztworem ch|orku wapnia w stosunku korzystnie 1:1 wzg|ędem mieszaniny fibrynogenu z osoczem bogatopłytkowym. Natomiast sposób otrzymywania nośnika fibrynowego a||ogenicznego charakteryzuje się tym, że z pobranej donacji krwi, co najmniej od dwóch dawców, oddzie|one przez wirowanie w temperaturze + 20 do + 24°C przez 5 do 15 minut przy si|e wirowania od 700 do 2000 x g od koncentratu krwinek: erytrocytów, |eukocytów, który się usuwa - osocze przeciska się do pustego pojemnika sate|itarnego, po czym przez wirowanie w temperaturze +20 do +24°C przez 5 - 10 minut przy si|e wirowania od 750 do 2000 x g oddzie|a się osocze bogatopłytkowe, które się przechowuje w pojemnikach, dogodnie pojemnikach oddychających w warunkach kołysania przez najwyżej 7 dób dogodnie 3 doby. Z pozostałego osocza ubogopłytkowego przygotowuje się fibrynogen w postaci krioprecypitatu przez dwukrotne zamrożenie osocza do temperatury 30°C do -90°C i rozmrożenie w temperaturze około +4°C przykładowo w łaźni wodnej, następnie wirowanie w temperaturze około +4°C przez 5 - 15 minut przy si|e wirowania od 1000 do 5000 x g, po czym usuwa się nadsącz a otrzymany krioprecypitat miesza się z osoczem bogatopłytkowym przechowywanym w pojemniku w stosunku od 0,1 - 2 do 0,1 - 2, korzystnie 1:1 i ze związkiem wapnia w roztworze dogodnie 10% roztworem ch|orku wapnia w stosunku korzystnie 1:1 wzg|ędem mieszaniny fibrynogenu z osoczem bogatopłytkowym. Fibrynogen przygotowuje się z osocza innego dawcy, zamrożonego w temperaturze -30°C do -90°C i po 16 tygodniowej karencji przez rozmrożenie w temperaturze około +4°C, przykładowo w łaźni wodnej, ponowne zamrożenie w temperaturze -30°C do -90°C i rozmrożenie w temperaturze około +4°C, następnie wirowanie w temperaturze około +4°C przez 5 do 15 minut przy si|e wirowania od 1000 do 5000 x g, po czym usuwa się nadsącz a otrzymany krioprecypitat miesza się z osoczem bogatopłytkowym z pojemnika w stosunku od 0,1 - 2 do 0,1 - 2 korzystnie 1:1 i ze związkiem wapnia w roztworze, dogodnie 10% roztworem ch|orku wapnia w stosunku od 0,1 - 2 do 0,1 - 2 korzystnie 1:1 wzg|ędem mieszaniny fibrynogenu z osoczem bogatopłytkowym. Oddzie|anie osocza zostaje zakończone na poziomie 0,1 cm do 1 cm nad powierzchnią koncentratu krwinek: erytrocytów, |eukocytów. Oddzie|anie osocza bogatopłytkowego zostaje zakończone, gdy nad jego powierzchnią pozostaje od 10 do 100 m| osocza.

Ponadto istotę wyna|azku stanowi okreś|one zastosowanie nośnika fibrynowego auto|ogicznego i a||ogenicznego. Zastosowanie nośnika fibrynowego auto|ogicznego do otrzymania że|owatego przeszczepu - czy|i nośnika powstałego przez zmieszanie fibrynogenu i osocza bogatopłytkowego uzyskanych z krwi biorcy, korzystnie z jednej donacji, wzg|ędnie - gotowego fibrynogenu o odpowiednim fenotypie i osocza bogatopłytkowego pobranego bezpośrednio z donacji krwi za pomocą aparatury na b|oku operacyjnym od pacjenta-biorcy, przy czym w trakcie otrzymywania nośnika, przed dodaniem

PL 218 235 B1 roztworu chlorku wapnia o stężeniu 0,1 - 99% w stosunku 0,1 - 2 do 0,1 - 2, korzystnie 1:1 udziałów objętościowych względem mieszaniny fibrynogenu z osoczem bogatopłytkowym dodaje się od 5 tyś. do 100 mln komórek od biorcy względnie allogenicznych i ksenogenicznych w znany sposób wyhodowanych i poddanych w dniu przeszczepu obróbce polegającej na trypsynizowaniu, płukaniu w pożywce z surowicą, liczeniu i ocenie żywotności.

Zastosowanie nośnika fibrynowego autologicznego do otrzymania żelowatego przeszczepu czyli nośnika powstałego przez zmieszanie w specjalnej formie fibrynogenu i osocza bogatopłytkowego uzyskanych z krwi biorcy, korzystnie z jednej donacji, względnie gotowego fibrynogenu o odpowiednim fenotypie i osocza bogatopłytkowego pobranego bezpośrednio z donacji krwi za pomocą aparatury na bloku operacyjnym od pacjenta - biorcy, przy czym w trakcie otrzymywania nośnika przed dodaniem roztworu chlorku wapnia o stężeniu 0,1 - 99% w stosunku 0,1 - 2 do 0,1 - 2, korzystnie 1:1 udziałów objętościowych względem mieszaniny fibrynogenu z osoczem bogatopłytkowym dodaje się od 5 tyś. do 100 mln uzyskanych od biorcy komórek oddzielonych mechanicznie bądź enzymatycznie od otaczających je tkanek.

Zastosowanie nośnika fibrynowego allogenicznego do otrzymania żelowatego przeszczepu, zatem nośnika powstałego przez zmieszanie fibrynogenu i osocza bogatopłytkowego uzyskanych z krwi dawcy, co najmniej dwóch donacji, względnie z fibrynogenu od jednego dawcy a osocza bogatopłytkowego od drugiego dawcy, względnie z fibrynogenu gotowego i osocza bogatopłytkowego gotowego, przy czym, w trakcie otrzymywania nośnika - przed dodaniem roztworu chlorku wapnia o stężeniu 0,1 - 99% i w stosunku 0,1 - 2 do 0,1 - 2, korzystnie 1:1 udziałów objętościowych względem mieszaniny fibrynogenu z osoczem bogatopłytkowym - dodaje od 5 tyś. do 100 mln komórek od biorcy względnie allogenicznych, ksenogenicznych w znany sposób wyhodowanych i poddanych w dniu przeszczepu obróbce polegającej na trypsynizowaniu, płukaniu w pożywce z surowicą, liczeniu i ocenie żywotności.

Zastosowanie nośnika fibrynowego allogenicznego do otrzymywania żelowatego przeszczepu, zatem nośnika fibrynowego powstałego przez zmieszanie fibrynogenu i osocza bogatopłytkowego uzyskanych z krwi dawcy, co najmniej dwóch donacji, względnie fibrynogenu od jednego dawcy a osocza bogatopłytkowego od drugiego dawcy, względnie z fibrynogenu gotowego i osocza bogatopłytkowego gotowego, przy czym w trakcie otrzymywania nośnika - przed dodaniem roztworu chlorku wapnia o stężeniu 0,1 - 99% w stosunku 0,1 - 2 do 0,1 - 2, korzystnie 1:1 udziałów objętościowych względem mieszaniny fibrynogenu z osoczem bogatopłytkowym - dodaje się od 5 tyś. do 100 mln pozyskanych od biorcy komórek oddzielonych mechanicznie bądź enzymatycznie od otaczających je tkanek.

Nośnik fibrynowy - według wynalazku - wzbogacony o osocze bogatopłytkowe stanowi mocniejsze rusztowanie biologiczne o synergicznych właściwościach wzrostowych wskutek pobudzenia czynników wzrostu - płytkowozależnych. Skutkuje to szybszym procesem regeneracji tkanek, gojenia się ran. Ponadto ulepszony nośnik fibrynowy posiada szerokie zastosowanie: do przeszczepów autologicznych i allogenicznych oraz do wszelkiego rodzaju komórek, zarówno ludzkich jak i zwierzęcych. Można go też stosować zewnętrznie w postaci żelu, sprayu itp.

Sposób otrzymywania nośnika fibrynowego cechuje łatwość przygotowania, możliwość pełnego wykorzystania składników krwi - przykładowo z jednej donacji oraz stosunkowo niewysokie koszty produkcji.

Korzystną cechą wynalazku jest też możliwość rezygnacji z używania trombiny pochodzenia odzwierzęcego, co może skutkować reakcją alergiczną, a także możliwością zakażenia chorobą odzwierzęcą.

P r z y k ł a d 1

Nośnik fibrynowy autologiczny zawiera:

krioprecypitat FBG o stężeniu autologicznego fibrynogenu 65 g/l -9 ml autologiczne osocze bogatopłytkowe KKP o zawartości 0,70 x 10¹¹ krwinek płytkowych -9 ml 10% roztwór chlorku wapnia -18 ml P r z y k ł a d 2

Nośnik fibrynowy allogeniczny zawiera:

krioprecypitat FBG o stężeniu allogenicznego fibrynogenu 80 g/l -9 ml allogeniczne osocze bogatopłytkowe KKP o zawartości 0,70 x 10¹¹ krwinek płytkowych -50 ml roztwór soli wapnia z przeliczeniem na jony Ca⁺² -9 ml

PL 218 235 B1

P r z y k ł a d 3

Z 450 ml krwi, czyli 1 donacji krwi pobranej od pacjenta - biorcy na 3 doby przed przeszczepem do pojemnika z płynem konserwującym CPD oddziela się przez wirowanie w temperaturze około +22°C przez 8 minut przy sile wirowania 1400 x g, około 280 ml koncentratu krwinek: erytrocytów i leukocytów KKCz, od 200 ml osocza zawierającego płytki, które przeciska się przez prasę do pustego pojemnika satelitarnego.

Proces oddzielania osocza jest zakończony, gdy nad powierzchnią KKCz pozostaje około 1,0 cm osocza. Koncentrat krwinek czerwonych KKCz usuwa się. Natomiast osocze poddaje się wirowaniu w temperaturze około +22°C przez 9 minut przy sile wirowania 5000 x g. Po wirowaniu oddziela się osocze bogatopłytkowe KKP w ilości około 50 ml, nad którego powierzchnią pozostaje 0,5 cm osocza a następnie przechowuje się w pojemniku oddychającym w warunkach kołysania przez 3 doby. Z kolei ze 150 ml pozostałego osocza ubogopłytkowego przygotowuje się przez 2 doby fibrynogen w postaci krioprecypitatu przez zamrożenie osocza do temperatury 60°C i przechowywanie w pojemniku w zamrażarce przez okres 14 godzin, a następnie rozmrożenie w temperaturze +4°C w łaźni wodnej. Powtórne zamrożenie w temperaturze -72°C i przechowywanie w pojemniku w zamrażarce przez okres 12 godzin a następnie rozmrożenie w temperaturze +4°C. Rozmrożone osocze poddaje się wirowaniu w temperaturze +4°C przez 9 minut przy sile wirowania 5000 x g. Po wirowaniu i po usunięciu nadsączu uzyskuje się krioprecypitat w ilości 5 - 10 ml. Do 1 ml krioprecypitatu dodaje się 1 ml osocza bogatopłytkowego KKP i miesza się. Następnie do otrzymanej mieszaniny w ilości 2 ml dodaje się 2 ml 10% roztworu chlorku wapnia i otrzymuje się 4 ml zawiesiny nośnika fibrynowego autologicznego.

P r z y k ł a d 4

Z 1 jednostki zamrożonego osocza ok. 270 ml po 16 tygodniowej karencji pochodzącej z 1 donacji krwi honorowego dawcy, przygotowuje się fibrynogen allogeniczny w postaci krioprecypitatu przez zamrożenie w temperaturze -55°C, przechowywane w pojemniku w zamrażarce przez 15 godzin, rozmrożenie w temperaturze około +4°C i powtórzenie procesu. Rozmrożone osocze poddaje się wirowaniu w temperaturze +4°C przez 9 minut przy sile wirowania 1000 x g. Po wirowaniu usuwa się nadsącz i uzyskuje krioprecypitat w ilości 5 do 10 ml. Niezależnie, na około 3 doby przed przeszczepem z 1 donacji, czyli 450 ml krwi pochodzącej od honorowego dawcy oddziela się przez wirowanie w temperaturze +22°C przez 8 minut przy sile wirowania 1400 x g około 280 ml koncentratu krwinek czerwonych leukocytów, KKCz, które się usuwa, od 195 ml osocza zawierającego płytki, które przeciska się przez prasę do pustego pojemnika satelitarnego. Aby uniknąć wprowadzenia do pojemnika satelitarnego krwinek KKCz proces oddzielania osocza kończy się, gdy nad powierzchnią KKCz pozostaje około 1,0 cm osocza. Otrzymane osocze zawierające płytki poddaje się wirowaniu w temperaturze +22°C przy sile wirowania 2300 x g przez 15 minut. Po wirowaniu oddziela się ok. 50 ml osocza bogatopłytkowego KKP od osocza ubogopłytkowego, które się usuwa. Następnie otrzymane osocze bogatopłytkowe z pozostawionymi nad jego powierzchnię 60 mm osocza, przechowuje się przez 3 doby w pojemniku w warunkach kołysania. Do 1 ml krioprecypitatu dodaje się 1 ml osocza bogatopłytkowego KKP i miesza się. Następnie do otrzymanej zawiesiny w ilości 2 ml dodaje się 2 ml 10% roztworu chlorku wapnia i otrzymuje się 4 ml nośnika fibrynowego allogenicznego.

P r z y k ł a d 5

Do 1,8 ml zawiesiny otrzymanej przez połączenie 0,9 ml krioprecypitatu o stężeniu FBG 50 g/l z 0,9 ml osocza bogatopłytkowego KKP o zawartości 0,80 x 106 ul krwinek płytkowych otrzymanych z 1 donacji krwi biorcy, w specjalnej formie dodaje się 30 min komórek od biorcy w znany sposób wyhodowanych, które w dniu przeszczepu poddaje się trypsynizowaniu, płukaniu w pożywce z surowicą liczeniu i ocenie żywotności. Następnie dodaje się 1,8 ml 10%-wego wodnego roztworu chlorku wapnia. Formę zaciska się z dwóch stron, tak, aby grubość uzyskanego żelowego przeszczepu z nośnikiem fibrynowym autologicznym wyniosła 1 cm.

P r z y k ł a d 6

Tak jak w Przykładzie 5 do zawiesiny krioprecypitatu i osocza dodaje się 35 mln komórek otrzymanych z fragmentu tkanki pobranego od biorcy, po mechanicznym oddzieleniu komórek od otaczających je tkanek Następnie dodaje się 6 ml wodnego 10%-wego roztworu chlorku wapnia i otrzymuje się żelowy przeszczep zawierający nośnik fibrynowy autologiczny.

P r z y k ł a d 7

Do 5 ml zawiesiny otrzymanej przez połączenie 2,5 ml krioprecypitatu o stężeniu fibrynogenu 57 g/l i 2,5 ml osocza bogatopłytkowego KKP o liczbie krwinek płytkowych w osoczu 0,65 x 106 krwinek

PL 218 235 B1 płytkowych /ul otrzymanych z dwóch donacji, dwóch różnych dawców dodaje się, w specjalnej formie 30 milionów komórek otrzymanych z fragmentu tkanki pobranego od biorcy po mechanicznym oddzieleniu ich od otaczających tkanek.

Następnie dodaje się 5 ml 10%-wego wodnego roztworu chlorku wapnia. Formę zaciska się z dwóch stron tak, aby grubość uzyskanego żelu zwanego fibrograftem wyniosła 1 cm.

Wykaz przebadanej literatury patentowej

1. Pat nr 54174 MPKA61K 23/00

2. Pat nr 54175 MPKA61K 23/00

3. Pat nr 167173 Int. Cl⁶ A61K35/16

4. Pat nr 171788 Int. Cl⁶ C12P21/00 i C12N5/00 i C12N15/12

5. Pat nr 174426 Int. Cl⁶ A61K35/38

6. Pat nr 177555 Int. Cl⁶ A61K35/16 i GON33/48

7. Pat nr 191497 Int. Cl⁶ A61L27/24

8. Pat nr 194109 A61L31/04 i A61K31/702 i A614P41/00

9. Pat nr 194316 A61L24/10iA61K38/39

10. Pat nr 196844 C12N15/40 i A61K39/12 i C12Q1/68 i A61K39/95

11. Pat nr 206261 Int Cl⁷ A61L 27/24

12. Pat nr 208538 Int Cl⁷ A61L31/04

13. P-296052A61L25/00

14. P-317022 A61K39/00 i A61P37/06

15. P-328922 A61L25/00, A61K39/12 i C12N5/00 i C07K14/505

16. P-340141 A61L27/60 i A61L27/38 i A61L27/22

17. P-346653 A61L31/04 i A61L27/38

18. P-349595 Int. Cl⁷A61L27/22 i A61L27/22 i A61L27/04 i A61K38/18

19. P-357234 Int. Cl⁷A61L27/24

20. P-368749 C12N5/00 i C12P21/02 i C07K14/505

21. P-383248 A61F2/30 i A61L24/00 i A61K38/32 i C12Q1/56

Claims

1. Nośnik fibrynowy autologiczny i allogeniczny, znamienny tym, że stanowi żelowatą mieszaninę fibrynogenu i osocza bogatopłytkowego połączonych w stosunku 0,1 - 2 do 0,1 - 2, korzystnie 1:1 udziałów objętościowych oraz chlorku wapnia w roztworze o stężeniu od 0,1 - 99%, korzystnie 10%-wego roztworu w stosunku 0,1 - 2 do 0,1 - 2 korzystnie 1:1 względem mieszaniny fibrynogenu z osoczem bogatopłytkowym.

2. Nośnik fibrynowy autologiczny i allogeniczny, znamienny tym, że stanowi żelowatą mieszaninę fibrynogenu i osocza bogatopłytkowego połączonych w stosunku 0,1-2 do 0,1 do 2, korzystnie 1:1 udziałów objętościowych oraz roztwór trombiny z chlorkiem wapnia we wzajemnym stosunku dogodnie 1:1 a względem mieszaniny fibrynogenu z osoczem bogatopłytkowym jak 0,1 - 2 do 0,1 - 2 korzystnie 1:1.

3. Nośnik według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako fibrynogen stosuje się fibrynogen krioprecypitat, otrzymany z donacji krwi biorcy lub dawcy, gotowy fibrynogen komercyjny.

4. Nośnik według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako osocze bogatopłytkowe stosuje się osocze bogatopłytkowe otrzymane z donacji krwi biorcy lub dawcy, osocze otrzymane bezpośrednio z krwi od pacjenta za pomocą aparatury, gotowe osocze bogatopłytkowe.

5. Nośnik według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że osocze bogatopłytkowe zawiera od 4,6 x 10⁵ do 2 x 10⁶ krwinek płytkowych /μ|.

6. Sposób otrzymywania nośnika fibrynowego autologicznego obejmujący pobieranie krwi, oddzie|enie osocza od elementów komórkowych krwi, zamrażanie i rozmrażanie osocza, znamienny tym, że z pobranej od biorcy donacji krwi, oddzielone przez wirowanie w temperaturze +20 do +24°C przez 5 do 15 minut, przy sile wirowania od 700 do 2000 x g od koncentratu krwinek: erytrocytów, leukocytów, który się usuwa, - osocze przeciska się do pustego pojemnika sate|itarnego, po czym z osocza przez wirowanie w temperaturze +20 do +24°C przez 5 - 15 minut przy si|e wirowania od 2100 do 5000 x g oddziela się osocze bogatopłytkowe, które przechowuje się w pojemnikach, dogodnie pojemnikach oddychających w warunkach kołysania najwyżej 7 dób dogodnie 3 doby a z pozostałego

PL 218 235 B1 osocza ubogopłytkowego przygotowuje się fibrynogen w postaci krioprecypitatu przez dwukrotne zamrożenie osocza do temperatury -30°C do -90°C i rozmrożenie w temperaturze około +4°C, przykładowo w łaźni wodnej, następnie wirowanie w temperaturze około +4°C przez 5 - 20 minut przy sile wirowania od 1000 do 5000 x g, po czym usuwa się nadsącz, a otrzymany krioprecypitat miesza się z osoczem bogatopłytkowym z pojemnika, w stosunku od 0,1 - 2 do 0,1 - 2, korzystnie 1:1 i ze związkiem wapnia w roztworze dogodnie 10% roztworem chlorku wapnia w stosunku korzystnie 1:1 względem mieszaniny fibrynogenu z osoczem bogatopłytkowym.

7. Sposób otrzymywania nośnika fibrynowego allogenicznego obejmujący pobieranie krwi, oddzielanie osocza od elementów komórkowych krwi, zamrażanie i rozmrażanie osocza, znamienny tym, że z pobranej donacji krwi, co najmniej od dwóch dawców, oddzielone przez wirowanie w temperaturze +20 do +24°C przez 5 do 15 minut przy sile wirowania od 700 do 2000 x g od koncentratu krwinek: erytrocytów, leukocytów, który się usuwa - osocze przeciska się do pustego pojemnika satelitarnego, po czym z osocza przez wirowanie w temperaturze +20 do +24°C przez 5 - 10 minut przy sile wirowania od 750 do 2000 x g oddziela się osocze bogatopłytkowe, które się przechowuje w pojemnikach, dogodnie pojemnikach oddychających w warunkach kołysania przez najwyżej 7 dób dogodnie 3 doby, a z pozostałego osocza ubogopłytkowego przygotowuje się fibrynogen w postaci krioprecypitatu przez dwukrotne zamrożenie osocza do temperatury -30°C do -90°C i rozmrożenie w temperaturze około +4°C przykładowo w łaźni wodnej, następnie wirowanie w temperaturze około +4°C przez 5 - 15 minut przy sile wirowania od 1000 do 5000 x g, po czym usuwa się nadsącz a otrzymany krioprecypitat miesza się z osoczem bogatopłytkowym przechowywanym w pojemniku w stosunku od 0,1 - 2 do 0,1 - 2, korzystnie 1:1 i ze związkiem wapnia w roztworze dogodnie 10% roztworem chlorku wapnia w stosunku korzystnie 1:1 względem mieszaniny fibrynogenu z osoczem bogatopłytkowym.

8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że fibrynogen przygotowuje się z osocza innego dawcy, zamrożonego w temperaturze -30°C do -90°C i po 16 tygodniowej karencji przez rozmrożenie w temperaturze około +4°C, przykładowo w łaźni wodnej, ponowne zamrożenie w temperaturze -30°C do -90°C i rozmrożenie w temperaturze około +4°C, następnie wirowanie w temperaturze około +4°C przez 5 do 15 minut przy sile wirowania od 1000 do 5000 x g, po czym usuwa się nadsącz a otrzymany krioprecypitat miesza się z osoczem bogatopłytkowym z pojemnika w stosunku od 0,1 - 2 do 0,1 - 2 korzystnie 1:1 i ze związkiem wapnia w roztworze, dogodnie 10% roztworem chlorku wapnia w stosunku od 0,1 - 2 do 0,1 - 2 korzystnie 1:1 względem mieszaniny fibrynogenu z osoczem bogatopłytkowym.

9. Sposób według zastrz. 5 albo 6, znamienny tym, że oddzielanie osocza zostaje zakończone na poziomie 0,1 cm do 1 cm nad powierzchnią koncentratu krwinek: erytrocytów, leukocytów.

10. Sposób według zastrz. 5 albo 6, znamienny tym, że oddzielanie osocza bogatopłytkowego zostaje zakończone gdy nad jego powierzchnią pozostaje od 10 do 100 mm osocza.

11. Zastosowanie nośnika fibrynowego autologicznego określonego w zastrzeżeniu 1 do otrzymania żelowatego przeszczepu - czyli nośnika powstałego przez zmieszanie fibrynogenu i osocza bogatopłytkowego uzyskanych z krwi biorcy, korzystnie z jednej donacji, względnie - gotowego fibrynogenu o odpowiednim fenotypie i osocza bogatopłytkowego pobranego bezpośrednio z donacji krwi za pomocą aparatury na bloku operacyjnym od pacjenta-biorcy, przy czym w trakcie otrzymywania nośnika, przed dodaniem roztworu chlorku wapnia o stężeniu 0,1 - 99% w stosunku 0,1 - 2 do 0,1 - 2, korzystnie 1:1 udziałów objętościowych względem mieszaniny fibrynogenu z osoczem bogatopłytkowym dodaje się od 5 tysięcy do 100 milionów komórek od biorcy względnie allogenicznych i ksenogenicznych w znany sposób wyhodowanych i poddanych w dniu przeszczepu obróbce polegającej na trypsynizowaniu, płukaniu w pożywce z surowicą, liczeniu i ocenie żywotności.

12. Zastosowanie nośnika fibrynowego autologicznego określonego w zastrzeżeniu 1 do otrzymania żelowatego przeszczepu - czyli nośnika powstałego przez zmieszanie w specjalnej formie fibrynogenu i osocza bogatopłytkowego uzyskanych z krwi biorcy, korzystnie z jednej donacji, względnie gotowego fibrynogenu o odpowiednim fenotypie i osocza bogatopłytkowego pobranego bezpośrednio z donacji krwi za pomocą aparatury na bloku operacyjnym od pacjenta - biorcy, przy czym w trakcie otrzymywania nośnika - przed dodaniem roztworu chlorku wapnia o stężeniu 0,1 - 99% i w stosunku 0,1 - 2 do 0,1 - 2, korzystnie 1:1 udziałów objętościowych względem mieszaniny fibrynogenu z osoczem bogatopłytkowym - dodaje się od 5 tysięcy do 100 milionów uzyskanych od biorcy komórek oddzielonych mechanicznie bądź enzymatycznie od otaczających je tkanek.

13. Zastosowanie nośnika fibrynowego allogenicznego określonego w zastrzeżeniu 1 do otrzymania żelowatego przeszczepu, zatem nośnika powstałego przez zmieszanie fibrynogenu i osocza

PL 218 235 B1 bogatopłytkowego uzyskanych z krwi dawcy, co najmniej dwóch donacji, względnie z fibrynogenu od jednego dawcy a osocza bogatopłytkowego od drugiego dawcy, względnie z fibrynogenu gotowego i osocza bogatopłytkowego gotowego, przy czym, w trakcie otrzymywania nośnika - przed dodaniem roztworu chlorku wapnia o stężeniu 0,1 - 99% i w stosunku 0,1 - 2 do 0,1 - 2, korzystnie 1:1 udziałów objętościowych względem mieszaniny fibrynogenu z osoczem bogatopłytkowym - dodaje od 5 tyś. do 100 mln komórek od biorcy względnie allogenicznych, ksenogenicznych w znany sposób wyhodowanych i poddanych w dniu przeszczepu obróbce polegającej na trypsynizowaniu, płukaniu w pożywce z surowicą, liczeniu i ocenie żywotności.

14. Zastosowanie nośnika fibrynowego allogenicznego określonego w zastrzeżeniu 1 do otrzymywania żelowatego przeszczepu zatem nośnika fibrynowego powstałego przez zmieszanie fibrynogenu i osocza bogatopłytkowego uzyskanych z krwi dawcy, co najmniej dwóch donacji, względnie fibrynogenu od jednego dawcy a osocza bogatopłytkowego od drugiego dawcy, względnie z fibrynogenu gotowego i osocza bogatopłytkowego gotowego, przy czym w trakcie otrzymywania nośnika przed dodaniem roztworu chlorku wapnia o stężeniu 0,1 - 99% w stosunku 0,1 - 2 do 0,1 - 2, korzystnie 1:1 udziałów objętościowych względem mieszaniny fibrynogenu z osoczem bogatopłytkowym dodaje się od 5 tyś. do 100 mln pozyskanych od biorcy komórek oddzielonych mechanicznie bądź enzymatycznie od otaczających je tkanek.