[go: up one dir, main page]

PL216545B1 - Sposób wytwarzania pochodnej hydroksyalkiloskrobi, pochodna hydroksyalkiloskrobi, kompozycja farmaceutyczna - Google Patents

Sposób wytwarzania pochodnej hydroksyalkiloskrobi, pochodna hydroksyalkiloskrobi, kompozycja farmaceutyczna

Info

Publication number
PL216545B1
PL216545B1 PL374969A PL37496903A PL216545B1 PL 216545 B1 PL216545 B1 PL 216545B1 PL 374969 A PL374969 A PL 374969A PL 37496903 A PL37496903 A PL 37496903A PL 216545 B1 PL216545 B1 PL 216545B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
compound
group
functional group
hydroxyalkyl starch
epo
Prior art date
Application number
PL374969A
Other languages
English (en)
Other versions
PL374969A1 (pl
Inventor
Norbert Zander
Harald Conradt
Wolfram Eichner
Original Assignee
Fresenius Kabi Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=31995520&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL216545(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from EP02020425A external-priority patent/EP1400533A1/en
Application filed by Fresenius Kabi Gmbh filed Critical Fresenius Kabi Gmbh
Publication of PL374969A1 publication Critical patent/PL374969A1/pl
Publication of PL216545B1 publication Critical patent/PL216545B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
    • C08B31/08—Ethers
    • C08B31/12—Ethers having alkyl or cycloalkyl radicals substituted by heteroatoms, e.g. hydroxyalkyl or carboxyalkyl starch
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
    • C08B31/08—Ethers
    • C08B31/10—Alkyl or cycloalkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0021—Intradermal administration, e.g. through microneedle arrays, needleless injectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5412—IL-6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/565—IFN-beta
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/10—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
    • C08B31/003—Crosslinking of starch
    • C08B31/006—Crosslinking of derivatives of starch
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
    • C08B31/08—Ethers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
    • C08B31/18—Oxidised starch
    • C08B31/185—Derivatives of oxidised starch, e.g. crosslinked oxidised starch
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08H—DERIVATIVES OF NATURAL MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08H1/00—Macromolecular products derived from proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania pochodnej hydroksyalkiloskrobi, pochodna hydroksyaiklioskrobi otrzymana za pomocą powyższego sposobu oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca terapeutycznie skuteczną ilość wspomnianej pochodnej.
Hydroksyetyloskrobia (HES) jest pochodną naturalnie występującej amylopektyny i ulega rozpadowi pod wpływem alfa-amylazy w organizmie. HES jest podstawioną pochodną węglowodanowego polimeru amylopektyny, która jest obecna w skrobi kukurydzianej w stężeniu do 95% wag. HES wykazuje korzystne właściwości biologiczne i jest stosowana jako objętościowy środek krwiozastępczy oraz w terapii rozcieńczenia krwi w szpitalach (Sommermeyer i in., 1987, Krankenhauspharmazie, 8 (8), 271-278; i Weidler i in., 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498).
Amylopektyna składa się z ugrupowań glukozy, gdzie w głównym łańcuchu obecne są wiązania alfa-1,4-glikozydowe i w miejscach rozgałęzienia występują wiązania alfa-1,6-glikozydowe. Właściwości fizykochemiczne tej cząsteczki są przede wszystkim określone przez rodzaj wiązań glikozydowych. Na skutek „naciętego” wiązania alfa-1,4-glikozydowego, powstają struktury spiralne z około sześcioma monomerami glukozy na zwój. Fizykochemiczne, jak również biochemiczne właściwości polimeru można modyfikować poprzez podstawienie. Wprowadzenie grupy hydroksyetylowej można osiągnąć poprzez alkaliczne hydroksyetylowanie. Poprzez adaptację warunków reakcji możliwe jest wykorzystanie różnej reaktywności odpowiedniej grupy hydroksylowej w nie podstawionym monomerze glukozy w odniesieniu do reakcji hydroksyetylowania. Z powodu tego faktu, znawca z dziedziny jest w stanie w ograniczonym stopniu wpłynąć na rodzaj podstawienia.
Niektóre sposoby wytwarzania pochodnej hydroksyetyloskrobi są opisane w stanie techniki.
DE nr 26 16 086 ujawnia koniugację hemoglobiny z hydroksyetyloskrobią, gdzie w pierwszym etapie, środek sieciujący, np. bromocyjan, wiąże się z hydroksyetyloskrobią, a następnie hemoglobina łączy się z produktem pośrednim.
Jednym ważnym obszarem, w którym HES znajduje zastosowanie jest stabilizowanie polipeptydów, które są stosowane, np. w układzie krążenia, aby uzyskać szczególne działanie fizjologiczne. Jednym szczególnym przykładem takich polipeptydów jest erytropoetyna, kwasowa glikoproteina około 34000 kDa, która jest istotna w regulowaniu poziomu czerwonych krwinek w układzie krążenia.
Dobrze znanym problemem związanym z zastosowaniem polipeptydów i enzymów jest fakt, że proteiny te często wykazują niezadowalającą stabilność. Zwłaszcza erytropoetyna ma względnie krótki okres półtrwania w osoczu (Spivak i Hogans, 1989, Blood 73,90; McMahon i in., 1990, Blood 76, 1718). Oznacza to, że lecznicze poziomy w osoczu są szybko tracone i powtórne podawania dożylne muszą być wykonywane. Ponadto, w pewnych okolicznościach obserwowana jest reakcja odpornościowa na peptydy.
Zazwyczaj przyjmuje się, że stabilność polipeptydów można poprawić i reakcja odpornościowa na takie polipeptydy jest obniżona, gdy polipeptydy są sprzężone z cząsteczkami polimerowymi. WO nr 94/28024 ujawnia, że fizjologicznie aktywne polipeptydy modyfikowane polietylenoglikolem (PEG) wykazują obniżoną immunogenność i antygenowość i cyrkulują w strumieniu krwi znacznie dłużej niż niesprzężone proteiny, tj. mają dłuższy klirens. Jednak, koniugaty PEG-Iek wykazują wiele niekorzystnych cech, np. nie charakteryzują się naturalną strukturą, która może być rozpoznawana przez elementy szlaków degradacji in vivo. Zatem, poza koniugatami PEG, otrzymano inne koniugaty i polimeraty protein. Wiele sposobów sieciowania różnych protein i makrocząsteczek takich jak polimery opisano w literaturze (patrz np. Wong, Chemia koniugacji i sieciowania protein, 1993, CRCS, Inc.).
Podsumowując, wciąż istnieje potrzeba dalszych, ulepszonych polipeptydów o zwiększonej stabilności i/lub bioaktywności. Odnosi się to zwłaszcza do erytropoetyny, gdzie izoformy o wysokim stopniu kwasów sialowych, a zatem wysokiej aktywności muszą być oczyszczane z izoform o niskim stopniu kwasów sialowych (patrz: EP nr 0 428 267 B1). Zatem, byłoby wysoce korzystne, jeśli byłyby dostępne metody wytwarzania, które dostarczają wysoce aktywne polipeptydy bez wymogu dokładnego oczyszczania. Niestety, produkcja polipeptydów w bakteriach lub komórkach owadów jest często trudna, ponieważ polipeptydy często nie są wytwarzane we właściwym fałdowaniu, rodzimej konformacji i brakuje im odpowiedniej glikozylacji.
WO nr 02/08079 A2 ujawnia związki obejmujące koniugat środka aktywnego i hydroksyaikiloskrobi, w którym środek aktywny i hydroksyaiklioskrobia są bądź połączone bezpośrednio lub poprzez linker. W przypadku bezpośredniego połączenia, reakcję środka aktywnego i hydroksyaikiloskrobi prowadzi się w środowisku wodnym, które zawiera co najmniej 10% wag. wody. Nie podano żadnych
PL 216 545 B1 przykładów ukierunkowanych na pochodną hydroksyakiloskrobi, która jest połączony z grupą karbonylową zawartą w aktywnym reagencie, ani grupy aldehydowej lub ketonowej ani acetalowej lub hemiacetalowej.
W konsekwencji, celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie pochodnych hydroksyaikiloskrobi, które są zdolne do tworzenia wiązania chemicznego z dalszym związkiem, np. polipeptydem, który obejmuje, jako grupę funkcyjną, grupę tio lub grupę aldehydową, grupą ketonową, grupą hemiacetalową lub acetalową. Korzystnie, grupa aldehydowa, grupa ketonowa, grupa hemiacetalowa lub acetalowa są zawarte w ugrupowaniu węglowodanowym dalszego związku.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania pochodnej hydroksyalkiloskrobi, przy czym wspomniana hydroksyalkiloskrobia posiada strukturę według wzoru (I):
przy czym R1, R2 i R3 oznaczają niezależnie wodór lub grupę hydroksyalkilową liniową lub rozgałęzioną mającą od 1 do 6 atomów węgla, przy czym sposób ten obejmuje: a) reakcję
- hydroksyalkiloskrobi o wzorze (I) przy jej nieutlenionym końcu redukującym ze związkiem (L) o wzorze ogólnym Z1-L'-X, gdzie L' oznacza łańcuch organiczny tworzący mostek łączący Z1 i X lub w którym L' nie występuje, przy czym Z1 reaguje z nieutlenionym końcem redukującym hydroksyalkiloskrobi i przy czym L', gdy występuje, oznacza liniową lub rozgałęzioną, podstawioną lub nie podstawioną, grupę alkilową lub cykloalkilową lub arylową, lub ar alkilową, lub arylocykloalkilową, lub alkarylową, lub cykloalkiloarylową, przy czym L' może obejmować co najmniej jeden heteroatom wybrany spośród N, O i S, i przy czym L' ma od 1 do 20 atomów węgla lub
- pochodnej hydroksyalkiloskrobi otrzymanej przez reakcję hydroksyalkiloskrobi o wzorze (I) przy jej nieutlenionym końcu redukującym ze związkiem (D) o wzorze ogólnym Z1-D'-W i dalej ze związkiem (L) o wzorze ogólnym Z2-L'-X, przy czym grupa funkcyjna Z2 reaguje z grupą funkcyjną W zawartą we wspomnianej pochodnej hydroksyalkiloskrobi, gdzie D' oznacza łańcuch organiczny tworzący mostek łączący Z1 i W lub gdzie D' nie występuje i przy czym Z1 reaguje z nie utlenionym końcem redukującym hydroksyalkiloskrobi i przy czym D', gdy występuje, oznacza liniową lub rozgałęzioną, podstawioną lub nie podstawioną, grupę alkilową lub cykloalkilową, lub arylową, lub aralkilową, lub arylocykloalkilową, lub alkarylową, lub cykloalkiloarylową, przy czym D' może obejmować co najmniej jeden heteroatom wybrany spośród N, O, i S, i przy czym D' ma od 1 do 20 atomów węgla i gdzie L' jest łańcuchem organicznym tworzącym mostek łączący Z2 i X, lub gdzie L' nie występuje i przy czym L', gdy występuje, oznacza liniową lub rozgałęzioną, podstawioną lub nie podstawioną, grupę alkilową lub cykloalkilową, lub arylową, lub aralkilową, lub arylocykloalkilową, lub alkarylową, lub cykloalkiloarylową, przy czym L' może obejmować co najmniej jeden heteroatom wybrany spośród N, O I S, i przy czym L' ma od 1 do 20 atomów węgla;
(i) przy czym grupa funkcyjna W lub grupa funkcyjna Z2 oznacza -SR i grupa funkcyjna Z2 lub grupa funkcyjna W jest wybrana z grupy składającej się z:
PL 216 545 B1 przy czym Hal oznacza Cl, Br lub I, lub (ii) przy czym grupa funkcyjna W lub grupa funkcyjna Z2 jest wybrana z grupy składającej się z estru aktywowanego lub grupy karboksylowej, która jest ewentualnie przekształcona w ester aktywowany i grupa funkcyjna Z2 lub grupa funkcyjna W jest wybrana z grupy składającej się z:
przy czym G oznacza O lub S i, jeśli występuje dwukrotnie, niezależnie O lub S i r' oznacza metyl, otrzymując pochodną hydroksyalkiloskrobi obejmującą grupę funkcyjną X, przy czym Z1 jest wybrany z grupy składającej się z:
przy czym G oznacza O lub S i jeśli występuje dwukrotnie, niezależnie O lub S i R' oznacza metyl, b) sposób dalej obejmuje reakcję grupy funkcyjnej X z grupą funkcyjną Y dalszego zawiązku (M), przy czym wspomniana grupa funkcyjna Y jest wybrana z grupy składającej się z grupy aldehydowej, grupy ketonowej, grupy hemiacetalowej, grupy acetalowej, w którym grupa funkcyjna X jest wybrana z grupy składającej się z:
przy czym G oznacza O lub S i jeśli występuje dwukrotnie, niezależnie O lub S i r' oznacza metyl, lub
PL 216 545 B1 przy czym wspomniana grupa funkcyjna Y oznacza grupę tiolową i grupa funkcyjna X jest wybrana z grupy składającej się z:
przy czym Hal oznacza Cl, Br lub I i przy czym dalszy związek (M) jest polipeptydem. Korzystnie, R1, R2 i R3 oznaczają niezależnie wodór lub grupę 2-hydroksyetylową. Korzystnie, hydroksyalkiloskrobią jest hydroksyetyloskrobia.
Korzystnie, hydroksyalkiloskrobia reaguje ze związkiem (L) przez reakcję grupy funkcyjnej Z1 z nie utlenionym końcem redukującym hydroksyalkiloskrobi, a powstały produkt reakcji reaguje z dodatkowym związkiem (M) przez reakcję grupy funkcyjnej X zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną Y zawartą w związku (M).
Korzystnie, hydroksyalkiloskrobia reaguje ze związkiem (L) przez reakcję grupy funkcyjnej Z1 z nie utlenionym końcem redukującym hydroksyalkiloskrobi, w którym związek (L), przed reakcją z hydroksyalkiloskrobią, reaguje z dodatkowym związkiem (M) przez reakcję grupy funkcyjnej X zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną Y zawartą w związku (M).
Korzystnie, hydroksyalkiloskrobia reaguje ze związkiem (D) przez reakcję grupy funkcyjnej Z1 zawartej w związku (D) z nieutlenionym końcem redukującym hydroksyalkiloskrobi w celu otrzymania pierwszej pochodnej hydroksyalkiloskrobi i w którym pierwsza pochodna hydroksyalkiloskrobi reaguje ze związkiem (L) przez reakcję grupy funkcyjnej Z2 zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną W zawartą w związku (D) w celu otrzymania drugiej pochodnej hydroksyalkiloskrobi.
Korzystnie, druga pochodna hydroksyalkiloskrobi reaguje z dodatkowym związkiem (M) przez reakcję grupy funkcyjnej X zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną Y zawartą w związku (M).
Korzystnie, hydroksyalkiloskrobia reaguje ze związkiem (D) przez reakcję grupy funkcyjnej Z1 zawartej w związku (D) z nieutienionym końcem redukującym hydroksyaikiloskrobi w celu otrzymania pierwszej pochodnej hydroksyaikiloskrobi i w którym pierwsza pochodna hydroksyaikiloskrobi reaguje przez reakcję grupy funkcyjnej W zawartej w związku (O) i grupy funkcyjnej Z2 zawartej w związku (L), ze związkiem (L), gdzie związek (L), przed reakcją z pierwszą pochodną hydroksyaikiloskrobi, reaguje z dodatkowym związkiem (M) przez reakcję grupy funkcyjnej X zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną Y zawartą w związku (M).
Korzystnie, polipeptydem jest erytropoetyna.
Korzystnie, sposób obejmuje reakcję hydroksyetyloskrobi przy jej nieutienionym końcu redukującym ze związkiem (L) o następującym wzorze:
lub ze związkiem (L) o następującym wzorze:
PL 216 545 B1 i reakcję produktu reakcji z grupą aldehydową, grupą ketonową, grupą hemiacetalową lub grupą acetalową reszty końcowej bocznego łańcucha węglowodanowego erytropoetyny, którą utlenia się za pomocą nadjodanu sodu przed reakcją lub jest ona częściowo desialilowana, a następnie utleniana za pomocą nadjodanu sodu przed reakcją.
Korzystnie, hydroksyetyloskrobia przy jej końcu redukującym, który nie jest utleniony, reaguje ze związkiem (L) o następującym wzorze:
w środowisku wodnym.
Korzystnie, sposób obejmuje reakcję hydroksyetyloskrobi przy jej nieutlenionym końcu redukującym ze związkiem (D) o następującym wzorze:
lub ze związkiem (D) o następującym wzorze:
ο
Η,Ν^ ^ΝΗ, 2 Ν Ν 2
Η Η ponadto, obejmuje reakcję produktu reakcji ze związkiem (L) o następującym wzorze:
i reakcję produktu reakcji z grupą tio erytropoetyny.
Przedmiotem wynalazku jest pochodna hydroksyalkiloskrobi otrzymana za pomocą sposobu wytwarzania pochodnej hydroksyalkiloskrobi, przy czym wspomniana pochodna posiada strukturę według wzoru (I):
gdzie R1, R2 i R3 oznaczają niezależnie wodór lub grupę hydroksyalkilową liniową lub rozgałęzioną mającą od 1 do 6 atomów węgla, przy czym sposób jej wytwarzania obejmuje: a) reakcję
- hydroksyalkiloskrobi o wzorze (I) przy jej nieutlenionej końcowej grupie redukującej ze związkiem (L) o wzorze ogólnym Z1-L'-X, gdzie L' oznacza łańcuch organiczny tworzący mostek łączący Z1 i X lub gdzie L' nie występuje i przy czym Z1 reaguje z nieutlenionym końcem redukującym hydroksyalkiloskrobi i przy czym L', gdy występuje, oznacza liniową lub rozgałęzioną, podstawioną lub nie podPL 216 545 B1 stawioną grupę alkilową lub cykloalkilową, lub arylową, lub ar alkilową, lub arylocykloalkilową, lub alkarylową, lub cykloalkiloarylową, w którym L' może obejmować co najmniej jeden heteroatom wybrany spośród N, O i S, i przy czym L' ma od 1 do 20 atomów węgla lub
- pochodnej hydroksyalkiloskrobi otrzymanej przez reakcję hydroksyalkiloskrobi o wzorze (I) przy jej nieutlenionym końcu redukującym ze związkiem (D) o wzorze ogólnym Z1-D'-W i dalej ze związkiem (L) o wzorze ogólnym Z2-L''-X, przy czym grupa funkcyjna Z2 reaguje z grupą funkcyjną W zawartą we wspomnianej pochodnej hydroksyalkiloskrobi, gdzie D' oznacza łańcuch organiczny tworzący mostek łączący Z1 i W lub gdzie D' nie występuje, i przy czym Z1 reaguje z nieutlenionym końcem redukującym hydroksyalkiloskrobi i przy czym D', gdy występuje, oznacza liniową lub rozgałęzioną, podstawioną lub nie podstawioną, grupę alkilową lub cykloalkilową, lub arylową, lub aralkilową, lub arylocykloalkilową, lub alkarylową, lub cykloalkiloarylową, przy czym D' może obejmować co najmniej jeden heteroatom wybrany spośród N, O i S, przy czym D' ma od 1 do 20 atomów węgla.
i gdzie L' jest łańcuchem organicznym tworzącym mostek łączący Z2 i X, lub gdzie L' nie występuje, i przy czym L', gdy występuje, oznacza liniową lub rozgałęzioną, podstawioną lub nie podstawioną, grupę alkilową lub cykloalkilową lub arylową, lub aralkilową, lub arylocykloalkilową, lub alkarylową, lub cykloalkiloarylową, przy czym L' może obejmować co najmniej jeden heteroatom wybrany spośród N, O i S i przy czym L' ma od 1 do 20 atomów węgla, (i) przy czym grupa funkcyjna W lub grupa funkcyjna Z2 oznacza -SH i grupa funkcyjna Z2 lub grupa funkcyjna W jest wybrana z grupy składającej się z:
przy czym Hal oznacza Cl, Br lub I lub (ii) przy czym grupa funkcyjna W lub grupa funkcyjna Z2 jest wybrana z grupy składającej się z estru aktywowanego lub grupy karboksylowej, która jest ewentualnie przekształcona w ester aktywowany, a grupa funkcyjna Z2 lub grupa funkcyjna W jest wybrana z grupy składającej się z:
przy czym G oznacza O lub S i jeśli występuje dwukrotnie, niezależnie O lub S i R oznacza metyl, otrzymując pochodną hydroksyalkiloskrobi obejmującą grupę funkcyjną X, przy czym Z1 jest wybrany z grupy składającej się z:
PL 216 545 B1 przy czym G oznacza O lub S i jeśli występuje dwukrotnie, niezależnie O lub S i R' oznacza metyl. b) sposób dalej obejmuje reakcję grupy funkcyjnej X z grupą funkcyjną Y dalszego zawiązku (M),
- przy czym wspomniana grupa funkcyjna Y jest wybrana z grupy składającej się z grupy aldehydowej, grupy ketonowej, grupy hemiacetalowej, grupy acetalowej i przy czym grupa funkcyjna X jest wybrana z grupy składającej się z:
przy czym G oznacza O lub S i jeśli występuje dwukrotnie, niezależnie O lub S i R' oznacza metyl, lub przy czym wspomniana grupa funkcyjna Y oznacza grupę tiolową i grupa funkcyjna X jest wybrana z grupy składającej się z:
przy czym Hal oznacza Cl, Br lub I i przy czym dalszy związek (M) jest polipeptydem.
Korzystnie, R1, R2 i R3 oznaczają niezależnie wodór lub grupę 2-hydroksyetylową.
Korzystnie, hydroksyalkiloskrobią jest hydroksyetyloskrobia.
Korzystnie, hydroksyalkiloskrobia reaguje ze związkiem (L) przez reakcję grupy funkcyjnej Z1 z nieutlenionym końcem redukującym hydroksyalkiloskrobi, a powstały produkt reakcji reaguje z dodatkowym związkiem (M) przez reakcję grupy funkcyjnej X zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną Y zawartą w związku (M).
Korzystnie, hydroksyalkiloskrobia reaguje ze związkiem (L) przez reakcję grupy funkcyjnej Z1 z nieutlenionym końcem redukującym hydroksyalkiloskrobi, gdzie związek (L), przed reakcją z hydroksyalkiloskrobią, reaguje z dodatkowym związkiem (M) przez reakcję grupy funkcyjnej X zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną Y zawartą w związku (M).
Korzystnie, hydroksyalkiioskrobia reaguje ze związkiem (D) przez reakcję grupy funkcyjnej Z1 zawartej w związku (D) z nie utlenionym końcem redukującym hydroksyalkiloskrobi w celu otrzymania pierwszej pochodnej hydroksyalkiloskrobi i gdzie pierwsza pochodna hydroksyalkiloskrobi reaguje ze związkiem (L) przez reakcję grupy funkcyjnej Z2 zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną W zawartą w związku (D) w celu otrzymania drugiej pochodnej hydroksyalkiloskrobi.
Korzystnie, druga pochodna hydroksyalkiloskrobi reaguje z dodatkowym związkiem (M) przez reakcję grupy funkcyjnej X zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną Y zawartą w związku (M).
Korzystnie, hydroksyalkiloskrobia reaguje ze związkiem (D) przez reakcję grupy funkcyjnej Z1 zawartej w związku (D) z nie utienionym końcem redukującym hydroksyalkiloskrobi w celu otrzymania pierwszej pochodnej hydroksyalkiloskrobi i gdzie pierwsza pochodna hydroksyalkiloskrobi reaguje przez reakcję grupy funkcyjnej W zawartej w związku (D) i grupy funkcyjnej Z2 zawartej w związku (L) ze związkiem (L), gdzie związek (L), przed reakcją z pierwszą pochodną hydroksyalkiloskrobi, reaguje
PL 216 545 B1 z dodatkowym związkiem (M) przez reakcję grupy funkcyjnej X zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną Y zawartą w związku (M).
Korzystnie, polipeptydem jest erytropoetyna.
Korzystnie, hydroksyetyloskrobia przy jej nie utlenionej końcowej grupie redukującej ulega reakcji ze związkiem (L) o następującym wzorze:
lub ze związkiem (L) o następującym wzorze:
ο Η2Ν·ηΑκ,ΝΗ2 Ν Ν Η Η przy czym produkt reakcji ulega reakcji z grupą aldehydową, grupą ketonową, grupą hemiacetalową lub grupą acetalową reszty końcowej bocznego łańcucha węglowodanowego erytropoetyny, która jest utleniana za pomocą nadjodanu sodu przed reakcją lub jest ona częściowo desialilowana, a następnie utleniana za pomocą nadjodanu sodu przed reakcją.
Korzystnie, hydroksyetyloskrobia przy jej końcu redukującym, który nie jest utleniony, reaguje ze związkiem (L) o następującym wzorze:
w środowisku wodnym.
Korzystnie, hydroksyetyloskrobia przy jej nie utlenionym końcu redukującym reaguje ze związkiem (D) o następującym wzorze:
lub ze związkiem (D) o następującym wzorze:
Ο
Η Η ponadto obejmuje reakcję produktu reakcji ze związkiem (L) o następującym wzorze:
i reakcję produktu reakcji z grupą tio erytropoetyny.
PL 216 545 B1
Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca, w ilości terapeutycznie skutecznej, pochodną hydroksyalkiloskrobi otrzymaną za pomocą sposobu wytwarzania pochodnej hydroksyalkiloskrobi, przy czym wspomniana hydroksyalkiloskrobia posiada strukturę według wzoru (I):
przy czym R1, R2 i R3 oznaczają niezależnie wodór lub grupę hydroksyalkilową liniową lub rozgałęzioną mającą od 1 do 6 atomów węgla, przy czym sposób obejmuje: a) reakcję
- hydroksyalkiloskrobi o wzorze (I) przy jej nieutlenionym końcem redukującym ze związkiem (L) o wzorze ogólnym Z1-L'-X, gdzie L' oznacza łańcuch organiczny tworzący mostek łączący Z1 i X lub gdzie L' nie występuje i przy czym Z1 reaguje z nie utlenionym końcem redukującym hydroksyalkiloskrobi, i przy czym L', gdy występuje, oznacza liniową lub rozgałęzioną, podstawioną lub nie podstawioną, grupę alkilową lub cykloalkilową, lub arylową, lub aralkilową, lub arylocykloalkilową, lub alkarylową, lub cykloalkiloarylową, gdzie L' może obejmować co najmniej jeden heteroatom wybrany spośród N, O i S, i przy czym L' ma od 1 do 20 atomów węgla, lub
- pochodnej hydroksyalkiloskrobi otrzymanej przez reakcję hydroksyalkiloskrobi o wzorze (I) przy jej nieutlenionym końcu redukującym ze związkiem (D) o wzorze ogólnym Z1-D'-W i dalej ze związkiem (L) o wzorze ogólnym Z2-L'-X, przy czym grupa funkcyjna Z2 reaguje z grupą funkcyjną W zawartą we wspomnianej pochodnej hydroksyalkiloskrobi, gdzie D' oznacza łańcuch organiczny tworzący mostek łączący Z1 i W lub gdzie D' nie występuje, i przy czym Z1 reaguje z nie utlenioną końcową grupą hydroksyalkiloskrobi, i przy czym D', gdy występuje, oznacza liniową lub rozgałęzioną, podstawioną lub nie podstawioną, grupę alkilową lub cykloalkilową, lub arylową, lub aralkilową, lub arylocykloalkilową, lub alkarylową, lub cykloalkiloarylową, przy czym D' może obejmować co najmniej jeden heteroatom wybrany spośród N, O i S, przy czym D' ma od 1 do 20 atomów węgla, i gdzie L' jest łańcuchem organicznym tworzącym mostek łączący Z2 i X, lub gdzie L' nie występuje i przy czym L', gdy występuje, oznacza liniową lub rozgałęzioną, podstawioną lub nie podstawioną, grupę alkilową lub cykloalkilową, lub arylową, lub aralkilową, lub arylocykloalkilową, lub alkarylową, lub cykloalkiloarylową, gdzie L' może obejmować co najmniej jeden heteroatom wybrany spośród N, O i S, i przy czym L' ma od 1 do 20 atomów węgla, (i) przy czym grupa funkcyjna W lub grupa funkcyjna Z2 oznacza -SH i grupa funkcyjna Z2 lub grupa funkcyjna W jest wybrana z grupy składającej się z:
przy czym Hal oznacza Cl, Br lub I, lub (ii) przy czym grupa funkcyjna W lub grupa funkcyjna Z2 jest wybrana z grupy składającej się z estru aktywowanego lub grupy karboksylowej, która jest ewentualnie przekształcona w ester aktywowany, a grupa funkcyjna Z2 lub grupa funkcyjna W jest wybrana z grupy składającej się z:
PL 216 545 B1
przy czym G oznacza O lub S, i jeśli występuje dwukrotnie, niezależnie O lub S i R' oznacza metyl, otrzymując pochodną hydroksyalkiloskrobi obejmującą grupę funkcyjną X, przy czym Z1 wybiera się z grupy składającej się z:
przy czym G oznacza O lub S i jeśli występuje dwukrotnie, niezależnie O lub S i R' oznacza metyl, b) sposób dalej obejmuje reakcję grupy funkcyjnej X z grupą funkcyjną Y dalszego zawiązku (M),
- przy czym wspomniana grupa funkcyjna Y jest wybrana z grupy składającej się z grupy aldehydowej, grupy ketonowej, grupy hemiacetalowej, grupy acetalowej i w którym grupa funkcyjna X jest wybrana z grupy składającej się z
przy czym G oznacza O lub S i jeśli występuje dwukrotnie, niezależnie O lub S i R' oznacza metyl, lub - przy czym wspomniana grupa funkcyjna Y oznacza grupę tiolową i grupa funkcyjna X jest wybrana z grupy składającej się z:
PL 216 545 B1
przy czym Hal oznacza Cl, Br lub I i przy czym dalszy związek (M) jest polipeptydem.
Korzystnie, polipeptydem jest AT III.
Korzystnie, polipeptydem jest erytropoetyna.
Korzystnie, hydroksyalkiloskrobia oznacza hydroksyetyloskrobię i przy czym hydroksyetyloskrobia reaguje w środowisku wodnym ze związkiem o następującym wzorze:
a produkt reakcji reaguje z erytropoetyną.
Korzystnie, erytropoetynę utlenia się za pomocą nadjodanu sodu przed reakcją.
Korzystnie, erytropoetyna jest częściowo desialilowana, a następnie utleniana za pomocą nadjodanu sodu przed reakcją.
Korzystnie, hydroksylalkiloskrobia jest hydroksyetyloskrobią i przy czym hydroksyetyloskrobia reaguje przy jej nieutlenionym końcu redukującym ze związkiem (L) o następującym wzorze:
lub ze związkiem (L) o następującym wzorze:
i przy czym produkt reakcji ulega reakcji z grupą aldehydową, grupą ketonową, grupą hemiacetalową lub grupą acetalową reszty końcowej bocznego łańcucha węglowodanowego erytropoetyny, którą utlenia się za pomocą nadjodanu sodu przed reakcją lub jest ona częściowo desialilowana, a następnie utlenia się ją za pomocą nadjodanu sodu przed reakcją.
Korzystnie, hydroksyetyloskrobia przy jej końcu redukującym, który nie jest utleniony, reaguje ze związkiem (L) o następującym wzorze:
w środowisku wodnym.
Korzystnie, hydroksyalkiloskrobia jest hydroksyetyloskrobią i przy czym hydroksyetyloskrobia przy jej nieutlenionym końcu redukującym reaguje ze związkiem (D) o następującym wzorze:
lub ze związkiem (D) o następującym wzorze:
PL 216 545 B1 i produkt reakcji ulega reakcji ze związkiem (L) o następującym wzorze:
i produkt reakcji ulega reakcji z grupą tio erytropoetyny.
W rozumieniu niniejszego wynalazku, termin „hydroksyalkiloskrobia” (HAS) odnosi się do pochodnej skrobi, która jest podstawiona przez co najmniej jedną grupę hydroksyalkilową. Zatem, termin hydroksyalkiloskrobia stosowany w niniejszym wynalazku nie jest ograniczony do związków, w których końcowe ugrupowanie węglowodoanowe obejmuje grupy hydroksyalkilowe R1, R2 i/lub R3 jak przedstawiono, dla zwięzłości, we wzorze (I), lecz także odnosi się do związków, w których w dowolnym miejscu jest obecna co najmniej jedna grupa hydroksylowa, bądź w końcowym ugrupowaniu węglowodanowym i/lub w pozostałej części cząsteczki skrobi, HAS', podstawiona przez grupę hydroksyalkilową R1, R2 lub R3.
W tym rozumieniu, grupa alkilowa może być liniową lub rozgałęzioną grupa alkilową, która może być odpowiednio podstawiona. Ujawniono, iż grupa hydroksyalkilowa może zawierać 1 do 10 atomów węgla, przy czym według wynalazku zawiera 1 do 6 atomów węgla, korzystniej od 1 do 4 atomów węgla i jeszcze korzystniej 2-4 atomów węgla. „Hydroksyalkiloskrobia” zatem korzystnie obejmuje hydroksyetyloskrobię, hydroksypropyloskrobię i hydroksybutyloskrobię, przy czym hydroksyetyloskrobia i hydroksypropyloskrobia są szczególnie korzystne.
Hydroksyalkiloskrobia zawierająca dwie lub więcej różnych grup hydroksyalkilowych jest także zawarta w niniejszym wynalazku.
Co najmniej jedna grupa hydroksyalkilowa zawarta w HAS może zawierać dwie lub więcej grup hydroksylowych. Według korzystnego wykonania, co najmniej jedna grupa hydroksyalkilowa zawarta w HAS ma jedną grupę hydroksylową.
Wyrażenie „hydroksyalkiloskrobia” także obejmuje pochodne, w których grupa alkilowa jest mono- lub polipodstawiona. W tym rozumieniu, korzystne jest, gdy grupa alkilowa jest podstawiona przez atom chlorowca, zwłaszcza fluoru lub przez grupę arylową, pod warunkiem, że HAS pozostaje rozpuszczalna w wodzie. Ponadto, końcowa grupa hydroksylowa grupy hydroksyalkilowej może być estryfikowana lub eteryfikowana.
Ponadto, zamiast alkilu, ujawniono, iż mogą być także zastosowane liniowe lub rozgałęzione, podstawione lub nie podstawione grupy alkenowe.
Hydroksyalkiloskrobia jest eterową pochodną skrobi. Oprócz wspomnianych eterowych pochodnych, także inne pochodne skrobi mogą być użyte w rozumieniu niniejszego wynalazku. Np. przydatne są pochodne, które obejmują estryfikowane grupy hydroksylowe. Takie pochodne mogą być np. pochodnymi niepodstawionych mono- lub dikarboksylowych kwasów z 2-12 atomami węgla lub ich podstawionych pochodnych. Zwłaszcza przydatne są pochodne niepodstawionych monokarboksylowych kwasów z 2-6 atomami węgla, zwłaszcza pochodne kwasu octowego. W tym rozumieniu korzystne są acetyloskrobia, butyloskrobia i propyloskrobia.
Ponadto, korzystne są pochodne niepodstawionych kwasów dikarboksylowych z 2-6 atomami węgla.
W przypadku pochodnych kwasów dikarboksylowych, przydatne jest, gdy druga grupa karboksylowa kwasu dikarboksylowego jest także estryfikowana. Ponadto, pochodne monoalkilowych estrów kwasów dikarboksylowych są także odpowiednie w rozumieniu niniejszego wynalazku.
W przypadku podstawionych kwasów mono- lub dikarboksylowych, grupami podstawiającymi mogą być, korzystnie takie same grupy jak wspomniane wyżej dla podstawionych reszt alkilowych.
Techniki estryfikacji skrobi są znane w stanie techniki (patrz np. Klemm D. i in., Comprehensive Cellulose Chemistry, tom 2,1998,Whiley-VCH, Weinheim, New York, zwłaszcza rozdział 4,4, Esterification of Cellulose (ISBN 3-527-29489-9).
Hydroksyetyloskrobia (HES) jest najbardziej korzystna we wszystkich wykonaniach niniejszego wynalazku.
PL 216 545 B1
Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu, jak opisano powyżej, w którym hydroksyalkiloskrobią jest hydroksyetyloskrobia.
HES jest przede wszystkim scharakteryzowana przez rozkład masy cząsteczkowej i stopień podstawienia. Są dwie możliwości opisania stopienia podstawienia:
1. Stopień podstawienia można opisać w odniesieniu do części podstawionych monomerów glukozy w stosunku do wszystkich ugrupowań glukozy (OS).
2. Stopień podstawienia można opisać jako „molowe podstawienie” (MS), w którym przedstawia się liczbę grup hydroksyetylowych na ugrupowanie glukozy.
Roztwory HES występują jako kompozycje polidyspersyjne, w których każda cząsteczka różni się od drugiej stopniem polimeryzacji, liczbą i układem miejsc rozgałęzienia, i układem podstawienia. HES jest zatem mieszaniną związków o różnej masie cząsteczkowej. W konsekwencji, poszczególny roztwór HES jest scharakteryzowany średnią masą cząsteczkową za pomocą środków statystycznych. W tym rozumieniu, Mn jest obliczana jako średnia arytmetyczna zależnie od liczby cząsteczek. Alternatywnie, Mw, średnia wagowa, oznacza jednostkę, która zależy od masy HES.
W rozumieniu niniejszego wynalazku, hydroksyetyloskrobia może mieć średnią masę cząsteczkową (średnia wagowa) od 1 do 300 kDa, bardziej korzystnie średnią masę cząsteczkową od 5 do 100 kDa. Hydroksyetyloskrobia może ponadto wykazywać molowy stopień podstawienia od 0,1 do 0,8 i stosunek podstawienia C2:C6 w zakresie od 2 do 20 w odniesieniu do grup hydroksyetylowych.
Jeżeli chodzi o reszty R1, R2 i R3 we wzorze (I) ujawniono, iż nie ma żadnych specyficznych ograniczeń, pod warunkiem, że pozostaje on zdolny do reakcji ze związkiem (D) lub związkiem (L). Według wynalazku, R1, R2 i R3 są niezależnie atomami wodoru lub grupą hydroksyalkilową, mogą być także grupą hydroksyarylową, grupą hydroksyaralkilową lub grupą hydroksyalkarylową zawierającą od 1 do 10 atomów węgla. Według wynalazku oznaczają atomy wodoru i grupy hydroksyalkilowe zawierające od 1 do 6 atomów węgla. Grupa alkilowa może być liniowa lub rozgałęziona i odpowiednio podstawiona, podobnie ujawnione grupy arylowa, aralkilowa i/lub alkarylowa.
Zatem, R1, R2 i R3 mogą być hydroksyheksylem, hydroksypentylem, hydroksybutylem, hydroksypropylem takim jak 1-hydroksypropyl, 2-hydroksypropyl, 3-hydroksypropyl, 1-hydroksyizopropylem, 2-hydroksyizopropylem, hydroksyetylem takim jak 1-hydroksyetyl, 2-hydroksyetyl lub hydroksymetyl. Atom wodoru i grupy hydroksyetylowe są preferowane, zwłaszcza korzystne są atom wodoru i grupa 2-hydroksyetylowa.
Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu jaki opisano powyżej, w którym R1, R2 i R3 są niezależnie atomami wodoru lub grupą 2-hydroksyetylową.
Według niniejszego wynalazku bądź związek (D) lub związek (L) jest poddany reakcji z redukującym końcem hydroksyalkiloskrobi poprzez reakcję grupy funkcyjnej Z1 z redukującym końcem, gdzie grupa Z1 jest zawarta w związku (D) lub związku (L).
Niniejszym ujawniono, iż, związek (D) lub związek (L) może być poddany reakcji z redukującym końcem hydroksyalkiloskrobi i gdzie redukujący koniec jest utleniony przed reakcją.
To utlenianie redukującego końca prowadzi do hydroksyalkiloskrobi, w której końcowa grupa węglowodanowa obejmuje grupę laktonową lub w której końcowa grupa węglowodanowa, zależnie od warunków reakcji chemicznej i/lub środków utleniających, ma strukturę nie cykliczną obejmującą grupę karboksy.
Hydroksyalkiloskrobia, która jest utleniona przy jej redukującym końcu jest obecna jako mieszanina związku obejmującego grupę laktonową i związku obejmującego grupę karboksy. W tej mieszaninie, odpowiednie związki mogą być obecne w jakimkolwiek pomyślanym stosunku.
Niniejszym ujawniono sposób, jak opisano powyżej, w którym koniec redukujący hydroksyalkiloskrobi jest utleniony przed reakcją ze związkiem (D) lub związkiem (L), przy czym wspomniana hydroksyalkiloskrobia ma strukturę według wzoru (IIa):
PL 216 545 B1 i/lub według związku (IIb):
Utlenianie redukującego końca hydroksyalkiloskrobi może być wykonywane według każdego sposobu lub kombinacji sposobów, które prowadzą do związków mających wyżej wspomniane struktury (IIa) i/lub (IIb).
Chociaż utlenianie może być wykonywane według wszelkich odpowiednich sposobów prowadzących do utlenionego redukującego końca hydroksyalkiloskrobi, jest korzystnie wykonywane stosując zasadowy roztwór jodu jako opisano np. w 1 9628 705 A1.
W sposobie jak wspomniano powyżej, koniec redukujący może być utleniony przez zasadowy roztwór jodu. Według wynalazku, związek (D) lub związek (L) jest poddany reakcji z redukującym końcem hydroksyalkiloskrobi i redukujący koniec nie jest utleniony przed reakcją.
Tworzenie wiązania chemicznego między związkiem (L) I hydroksyalkiloskrobią lub związkiem (D) i hydroksyalkiloskrobią według wynalazku może zatem być osiągane przez reakcję grupy funkcyjnej Z1 z nieutlenionym redukującym końcem hydroksyalkiloskrobi.
Jako grupa funkcyjna Z1, może być użyta każda grupa funkcyjna, która jest zdolna do tworzenia wiązania chemicznego z nieutlenionym redukującym końcem hydroksyalkiloskrobi.
Grupa funkcyjna Z1 może obejmować strukturę chemiczną -NH-.
Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu, jak opisano powyżej, w którym grupa funkcyjna Z1 obejmuje strukturę -NH-.
Według jednego korzystnego wykonania niniejszego wynalazku, grupa funkcyjna Z1 jest grupą mającą strukturę R'-NH-, gdzie R' oznacza atom wodoru lub alkil, cykloalkil, aryl, aralkil, arylocykloalkil, alkaryl lub cykloalklloaryl, gdzie cykloalkil, aryl, aralkil, arylocykloalkil, alkaryl lub cykloalklloaryl może być połączony bezpośrednio z grupą NH lub, według innego wykonania, może być połączony przez mostek tlenowy z grupą NH. Alkil, cykloalkil, aryl, aralkil, arylocykloalkil, alkaryl, lub cykloalklloaryl może być odpowiednio podstawiony. Jako korzystne podstawniki, można wymienić chlorowce, takie jak F, Cl lub Br. Zwłaszcza korzystnymi resztami R' są atom wodoru, alkil i grupa alkoksy, a korzystniej: atom wodoru i niepodstawiony alkil i grupa alkoksy.
Spośród grup: alkil i alkoksy, grupy o 1, 2, 3, 4, 5, lub 6 atomach C są korzystne. Bardziej korzystne są: metyl, etyl, propyl, izopropyl, metoksy, etoksy, propoksy i izopropoksy. Szczególnie korzystne są: metyl, etyl, metoksy, etoksy, a szczególnie metyl lub metoksy.
Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu, jak opisano powyżej, w którym R' oznacza atom wodoru lub metyl lub grupę metoksy.
Według innego korzystnego wykonania niniejszego wynalazku, grupa funkcyjna Z1 ma strukturę R'-NH-R”-, gdzie R” korzystnie obejmuje jednostkę strukturalną -NH- i/lub jednostkę strukturalną -(C=G)- gdzie G oznacza O lub S, i/lub jednostkę strukturalną -SO2-. Według korzystniejszych wykonań, grupa funkcyjna R” jest wybrana z grupy obejmującej:
oraz gdzie, jeśli G występuje dwukrotnie, oznacza niezależnie O lub S.
PL 216 545 B1
Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu, jak wspomniano powyżej, w którym grupa funkcyjna Z1 jest wybrana z grupy obejmującej:
η2ν· η2ν'
Η
Ń
w której G oznacza O lub S i, jeśli występuje dwukrotnie, oznacza niezależnie O lub S, a R' oznacza metyl.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie pochodnej hydroksyalkiloskrobi, która obejmuje grupę funkcyjną X, która jest zdolna do reagowania z grupą funkcyjną Y dalszego związku (M) dając jako produkt reakcji pochodną hydroksyalkiloskrobi, która obejmuje hydroksyalkiloskrobię, związek (L), ewentualnie związek (D) i dalszy związek.
Co się tyczy grupy funkcyjnej X, nie ma szczególnych ograniczeń pod warunkiem, że wiązanie chemiczne można utworzyć z grupą funkcyjną Y, która jest zawarta w dalszym związku (M).
Jeśli grupa funkcyjna Y jest wybrana z grupy obejmującej grupę aldehydową, grupę ketonową, grupę hemiacetalową i grupę acetalową, grupa funkcyjna X, grupa funkcyjna X korzystnie obejmuje strukturę chemiczną -NH-.
Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu, jak opisano powyżej, w którym grupa funkcyjna Y jest wybrana z grupy obejmującej grupę aldehydową, grupę ketonową, grupę hemiacetalową i grupę acetalową, a grupa funkcyjna X obejmuje strukturę -NH-.
Według jednego korzystnego wykonania niniejszego wynalazku, grupa funkcyjna X jest grupą mającą strukturę R'-NH-, gdzie R' oznacza atom wodoru lub alkil, cykloalkil, aryl, aralkil, arylocykloalkil, alkaryl lub cykloalkiloaryl, gdzie cykloalkil, aryl, aralkil, arylocykloalkil, alkaryl lub cykloalkiloaryl może być połączony bezpośrednio z grupą NH lub, według innego wykonania, może być połączony przez mostek tlenowy z grupą NH.
Alkil, cykloalkil, aryl, aralkil, arylocykloalkil, alkaryl, lub cykloalkiloaryl może być odpowiednio podstawiony. Jako korzystne podstawniki można wymienić chlorowce, takie jak F, Cl lub Br.
Szczególnie korzystne reszty R' to atom wodoru, alkil i grupa alkoksy i jeszcze bardziej korzystne są: atom wodoru i niepodstawiony alkil i grupa alkoksy.
Spośród grup: alkil i alkoksy, grupy o 1, 2, 3, 4, 5 lub 6 atomach C są korzystne.
Bardziej korzystne są: metyl, etyl, propyl, izopropyl, metoksy, etoksy, propoksy i izopropoksy. Szczególnie korzystne są: metyl, etyl, metoksy, etoksy, a szczególnie metyl lub metoksy.
Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu, jak opisano powyżej, w którym R' oznacza atom wodoru lub metyl lub grupę metoksy.
Według innego korzystnego wykonania niniejszego wynalazku, grupa funkcyjna X ma strukturę R'-NH-R”- gdzie R” korzystnie obejmuje jednostkę strukturalną -NH- i/lub jednostkę strukturalną -(C=G)-, gdzie G oznacza O lub S, i/lub jednostkę strukturalną -SO2-.
PL 216 545 B1
Według wykonań, grupa funkcyjna R” jest wybrana z grupy obejmującej:
Η Η ζΝ\/Ν\
G oraz gdzie, jeśli G występuje dwukrotnie, oznacza niezależnie O lub S.
Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu, jak wspomniano powyżej, w którym grupa funkcyjna X jest wybrana z grupy obejmującej:
w której G oznacza O lub S i, jeśli występuje dwukrotnie, oznacza niezależnie O lub S, a R' oznacza metyl.
Jeśli grupa funkcyjna Y oznacza grupę tio, grupa funkcyjna X jest korzystnie wybrana z grup obejmujących:
w których Hal oznacza Cl, Br lub I, korzystnie Br lub I.
PL 216 545 B1
Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu, jak opisano powyżej, w którym grupa funkcyjna Y oznacza -SH i grupa funkcyjna X jest wybrana z grupy obejmującej:
w której Hal oznacza Cl, Br lub I.
Według jednego wykonania niniejszego wynalazku, hydroksyalkiloskrobia jest poddana reakcji ze związkiem (D) i uzyskany produkt reakcji jest dalej poddany reakcji ze związkiem (L), gdzie wiązanie chemiczne między związkiem (L) i produktem reakcji jest tworzone przez reakcję grupy funkcyjnej Z2 zawartej w związku (L) i grupy funkcyjnej W zawartej w związku (D) będącym częścią produktu reakcji.
Co się tyczy grup funkcyjnych Z2 i W, zazwyczaj nie ma ograniczeń pod warunkiem, że żądane wiązanie chemiczne jest tworzone.
Jako możliwe grupy funkcyjne W lub Z2, ujawniono między innymi następujące grupy funkcyjne:
- wiązania podwójne C-C- lub wiązania potrójne C-C-, lub wiązania aromatyczne C-C-;
- grupę tio lub grupy hydroksy;
- hydrazyd kwasu alkilosulfonowego, hydrazyd kwasu aryIosulfonowego;
- 1,2-diole;
- 1,2-aminoalkohole;
- grupę aminową -NH2 lub pochodne grup aminowych obejmujące jednostkę strukturalną -NH-, takie jak grupy aminoalkilowe, grupa aminoarylowa, grupy aminoaralkilowe, lub aIkaryloaminowe;
- grupę hydroksyloaminową -O-NH2 lub pochodne grupy hydroksylaminowej zawierające jednostkę strukturalną -Q-NH-, takie jak grupy hydroksyloalkiloaminowe, grupy hydroksyloaryloaminowe, grupy hydroksyloaralkiloaminowe, lub grupy hydroksalalkaryloaminowe;
- grupy alkoksyaminowe, grupy aryloksyaminowe, grupy aralkiloksyaminowe lub grupy alkaryloksyaminowe, każda zawierająca jednostkę strukturalną -NH-O-;
- reszty zawierające grupę karbonylową, -Q-C(=G)-M, gdzie G oznacza O lub S i M oznacza np.:
-OH lub -SH;
- grupę alkoksy, grupę aryloksy, grupa aralkiloksy lub grupę alkaryloksy;
- grupę alkilotio, grupę arylotio, grupę aralkilotio lub grupę alkarylotio;
- grupę alkilokarbonyloksy, grupę arylokarbonyloksy, grupę aralkilokarbonyloksy, grupę alkarylokarbonyloksy;
- aktywowane estry, takie jak estry hydroksyloamin o strukturze imidu takie jak N-hydroksysukcynimid lub zawierające jednostkę strukturalną O-N, gdzie N jest częścią związku heteroarylowego lub, bez G=O i Q, takie jak związki aryloksy z podstawioną resztą arylową takie jak pentafIuorofenyl, paranitrofenyl lub trichlorofenyl; przy czym nieobecne jest Q lub NH lub a heteroatom taki jak S lub O;
-NH-NH2 lub -NH-NH-;
- NO2;
- grupę nitrylową; grupy karbonylowe, takie jak grupa aldehydowa lub grupa ketonowa;
- grupę karboksy; grupę -N=C=O lub grupę -N=C=S;
- grupy haologenowinylu, takie jodek winylu lub bromek winylu lub winylotriflat;
-CEC-H;
- (C=NH2Cl)-O-alkil;
- grupy -(C=O)-CH2-Hal, gdzie Hal oznacza Cl, Br, lub I;
- CH=CH-SO2-;
- grupę disiarczku obejmującą strukturę -S-S-;
- grupę:
PL 216 545 B1
- grupę:
gdzie Z2 i W, odpowiednio, to grupa zdolna do tworzenia wiązania chemicznego z jedną z powyższych grup.
Według korzystnych wykonań niniejszego wynalazku, W, jak i Z2 są grupami z listy grup podanych powyżej.
Według pierwszego szczególnie korzystnego wykonania niniejszego wynalazku, Z2 lub W jest grupą tio. W tym szczególnym przypadku, grupa funkcyjna W jest korzystnie wybrana z grupy obejmującej:
w której Hal oznacza Cl, Br, lub I, korzystnie Br lub I.
Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu, jak opisano powyżej, w którym grupa funkcyjna W lub grupa funkcyjna Z2 oznacza -SH, a grupa funkcyjna Z2 lub grupa funkcyjna W jest wybrana z grupy obejmującej:
w której Hal oznacza Cl, Br lub I.
Według drugiego szczególnie korzystnego wykonania niniejszego wynalazku, Z2 lub W jest wybrany z grupy obejmującej aktywowany ester, jak opisano powyżej lub grupę karboksy, która jest ewentualnie przekształcona w aktywowany ester. W tym szczególnym przypadku, grupa funkcyjna W lub Z2, odpowiednio, obejmuje strukturę chemiczną -NH-.
Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu, jak opisano powyżej, w którym Z2 lub W jest wybrany z grupy obejmującej aktywowany ester, jak opisano powyżej lub grupę karboksy, która jest ewentualnie przekształcona w aktywowany ester i grupa funkcyjna W lub Z2, odpowiednio, obejmuje strukturę chemiczną NH-.
Według jednego korzystnego wykonania niniejszego wynalazku, grupa funkcyjna W lub Z2 obejmująca strukturę -NH- jest grupą mającą strukturę R'-NH-, gdzie R' oznacza atom wodoru lub alkil, cykloalkil, aryl, aralkil, arylocykloalkil, alkaryl lub cykloalkiloaryl, gdzie cykloalkil, aryl, aralkil, arylocykloalkil, alkaryl lub cykloalkiloaryl może być połączony bezpośrednio z grupą NH lub, według innego wykonania, może być połączony przez mostek tlenowy z grupą NH. Alkil, cykloalkil, aryl, aralkil,arylocykloalkil, alkaryl, lub cykloalkiloaryl może być odpowiednio podstawiony. Jako korzystne podstawniki, można wymienić chlorowce, takie jak F, Cl lub Br. Szczególnie korzystne reszty R' to atom wodoru, alkil i alkoksy, a jeszcze bardziej korzystne są: atom wodoru i niepodstawiony alkil i alkoksy.
Spośród grup alkil i alkoksy, grupy o 1, 2, 3, 4, 5 lub 6 atomach C są korzystne. Bardziej korzystne są: metyl, etyl, propyl, izopropyl, metoksy, etoksy, propoksy i izopropoksy. Szczególnie korzystne są: metyl, etyl, metoksy, etoksy, a szczególnie metyl lub metoksy.
PL 216 545 B1
Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu, jak opisano powyżej, w którym W lub Z2 jest wybrany z grupy obejmującej aktywowany ester, jak opisano powyżej lub grupę karboksy, która jest ewentualnie przekształcona w aktywowany ester i grupa funkcyjna W lub Z2, odpowiednio, oznacza R'-NH-, W którym R' oznacza atom wodoru lub metyl lub grupę metoksy.
Według innego korzystnego wykonania niniejszego wynalazku, grupa funkcyjna W lub Z2 ma strukturę R-NH-R”-, gdzie R” korzystnie obejmuje jednostkę strukturalną -NH- i/lub jednostkę strukturalną -(C=G)-, gdzie G oznacza O lub S, i/lub jednostkę strukturalną -SO2-.
Według korzystniejszych wykonań, grupa funkcyjna R” jest wybrana z grupy obejmującej:
oraz gdzie, jeśli G występuje dwukrotnie, oznacza niezależnie O lub S.
Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu, jak wspomniano powyżej, w którym grupa funkcyjna W lub Z2 jest wybrana z grupy obejmującej:
w której G oznacza O lub S i, jeśli występuje dwukrotnie, oznacza niezależnie O lub S, a R' oznacza metyl.
Według jeszcze innego aspektu niniejszego wynalazku, co najmniej jedna grupa funkcyjna X, Z2 i/lub W może być grupą, która nie jest zdolna do reagowania bezpośrednio z danym dalszym związkiem, lecz która może być chemicznie modyfikowana, aby być zdolną do reagowania w żądany sposób.
Jako przykład grupy funkcyjnej modyfikowanej przed reakcją z dalszym związkiem, można wymienić 1,2-aminoalkohol lub 1,2-diol, który jest modyfikowany np. przez utlenianie tworząc aldehyd lub grupę keto.
PL 216 545 B1
Inny przykład grupy funkcyjnej modyfikowanej przed reakcją z dalszym związkiem to grupa -NH2, która jest modyfikowana przez reakcję z np. związkiem według następującego wzoru:
dając strukturę o następującym wzorze:
która jest np. reaktywna względem grupy tio.
Inny przykład grupy funkcyjnej modyfikowanej przed reakcją z dalszym związkiem to grupa -NH2, która jest modyfikowana przez reakcję z np. związkiem według następującego wzoru:
dając strukturę o następującym wzorze:
która jest np. reaktywna względem grupy tio.
Jeszcze innym przykładem grupy funkcyjnej modyfikowanej przed reakcją z dalszym związkiem jest grupa aminowa, która jest poddana reakcji z bezwodnikiem bromooctowym lub jodooctanem N-sukcynimidylu.
Według korzystnego wykonania niniejszego wynalazku, związek (L) ma strukturę Z1-L'-X lub Z2-L'-X, gdzie L' to reszta organiczna oddzielająca grupy funkcyjne, ewentualnie nieobecna, przy czym struktura zależy od tego czy związek (D) jest poddany reakcji z hydroksyalkiloskrobią, czy też nie.
Według pierwszego korzystnego wykonania, nie występuje związek (D) i Y jest wybrane z grupy obejmującej grupę aldehydową, grupę ketonową, grupę hemiacetalową i grupę acetalową.
W tym szczególnym przypadku, następujące związki, między innymi, są korzystne jako związek (L) mający strukturę Z1-L'-X gdzie L' jest nieobecne:
η2ν—νη2
PL 216 545 B1
Jeśli, w tym szczególnym przypadku, L' nie jest nieobecny, L' może być liniowym lub rozgałęzionym alkilem lub cykloalkilem, lub arylem, lub aralkilem, lub arylocykloalkilem, lub alkarylem, lub cykloalkiloarylem, w którym L' może obejmować co najmniej jeden heteroatom taki jak N, O, S i w którym L' może być odpowiednio podstawiony. Wielkość grupy L' może być dostosowana do specyficznych potrzeb. Zazwyczaj grupa oddzielająca L' ma od 1 do 60, korzystnie od 1 do 40, korzystniej od 1 do 20, korzystniej od 1 do 10, korzystniej od 1 do 6, a zwłaszcza korzystnie od 1 do 4 atomów węgla, jeśli są obecne heteroatomy, oddzielająca grupa obejmuje zazwyczaj od 1 do 20, korzystnie od 1 do 8 i zwłaszcza korzystnie od 1 do 4 heteroatomów. Według szczególnie korzystnych wykonań niniejszego wynalazku, oddzielająca grupa L' obejmuje 1 do 4 atomów tlenu. Oddzielająca grupa L' może obejmować ewentualnie rozgałęziony łańcuch alkilowy lub grupę arylową, lub grupę cykloalkilową mającą np. od 5 do 7 atomów węgla, lub może być grupą aralkilową, alkarylową, gdzie część alkilowa może być liniową i/lub cykliczną grupą alkilową. Według jeszcze bardziej korzystnego wykonania, oddzielająca grupa jest łańcuchem alkilowym od 1 do 20, korzystnie od 1 do 8, korzystniej od 1 do 6, korzystniej od 1 do 4 i zwłaszcza korzystnie od 2 do 4 atomów węgla. W przypadku, gdy są obecne heteroatomy, łańcuch obejmujący 1 do 4 atomów tlenu jest szczególnie korzystny.
Co się tyczy szczególnego przypadku, gdzie Y jest wybrane z grupy obejmującej grupę aldehydową, grupę ketonową, grupę hemiacetalową i grupę acetalową, następujące związki, między innymi, są korzystne jako związek (L) mający strukturę Z1-L'-X, gdzie L' występuje:
PL 216 545 B1
Według drugiego korzystnego wykonania, związek (D) występuje.
Według dalszego korzystnego wykonania niniejszego wynalazku, związek (D) ma strukturę Z1-D'-W, gdzie D' jest resztą organiczną oddzielającą grupy funkcyjne, ewentualnie nieobecną.
W tym szczególnym przypadku, następujące związki, między innymi, są korzystne jako związek (D) mający strukturę Z1-D'-W gdzie D' jest nieobecne:
Szczególnym przykładem związku D gdzie D' jest nieobecne jest NH3.
Jeśli, w tym szczególnym przypadku D' występuje, D' może być liniowym lub rozgałęzionym alkilem lub cykloalkilem, lub arylem, lub aralkilem, lub arylocykloalkilem, lub alkarylem, lub cykloalkiloarylem, w którym D' może obejmować co najmniej jeden heteroatom, taki jak N, O, S, i w którym D' może być odpowiednio podstawiony. Wielkość grupy D' może być dostosowana do specyficznych potrzeb. Zazwyczaj oddzielająca grupa D' ma od 1 do 60, korzystnie od 1 do 40, korzystniej od 1 do 20, korzystniej od 1 do 10, korzystniej od 1 do 6 i zwłaszcza korzystnie od 1 do 4 atomów węgla. Jeśli są obecne heteroatomy, oddzielająca grupa obejmuje zazwyczaj od 1 do 20, korzystnie od 1 do 8 i zwłaszcza korzystnie od 1 do 4 heteroatomów. Według szczególnie korzystnych wykonań niniejszego wynalazku, oddzielająca grupa D' obejmuje 1 do 4 atomów tlenu. Oddzielająca grupa D' może obejmować ewentualnie rozgałęziony łańcuch alkilowy lub grupę arylową, lub grupę cykloalkilową mającą np. od 5 do 7 atomów węgla, lub być grupą aralkilową, grupą alkarylową, gdzie część alkilowa może być liniową i/lub cykliczną grupą alkilową. Według jeszcze bardziej korzystnego wykonania, oddzielająca grupa jest łańcuchem alkilowym od 1 do 20, korzystnie od 1 do 8, korzystniej od 1 do 6, korzystniej od 1 do 4 i zwłaszcza korzystnie od 2 do 4 atomów węgla. W przypadku, gdy są obecne heteroatomy, łańcuch obejmujący 1 do 4 atomów tlenu jest szczególnie korzystny.
Co się tyczy tego szczególnego przypadku, korzystne związki (D) mające strukturę Z1-D'-W, gdzie D' występuje są następujące:
PL 216 545 B1
PL 216 545 B1
Zależnie od charakteru chemicznego grupy funkcyjnej W zawartej w związku (D) i grupy funkcyjnej Y, szczególne związki (L) mogą być użyte według specyficznych potrzeb.
Jeśli, np. grupa funkcyjna Y jest grupą tio i grupa funkcyjna W obejmuje strukturę -NH-, jak opisano szczegółowo powyżej, następujące rodzaje związków (L) są, między innymi, korzystne.
Typ związku (L) Grupa funkcyjna X Grupa funkcyjna Z2
C Iodoalkil Ester N-sukcynimidu
D Bromoalkil Ester N-sukcynimidu
E Maleimido Ester N-sukcynimidu
F Pirydyloditio Ester N-sukcynimidu
G Winylosulfon Ester N-sukcynimidu
Jeśli np. grupa funkcyjna Y jest wybrana z grupy obejmującej grupę aldehydową, grupę ketonową, grupę hemiacetalową i grupę acetalową i grupa funkcyjna W jest grupą tio, następujące rodzaje związków (L) są, między innymi, korzystne.
Typ związku (L) Grupa funkcyjna X Grupa funkcyjna Z2
A Hydrazyd Maleimido
B Hydrazyd Pirydyloditio
W tabeli 1 na końcu niniejszego opisu, wymieniono pewne korzystne przykłady związków (L) według rodzajów podanych powyżej.
Oddzielające grupy L' i/lub D' mogą być odpowiednio podstawione. Korzystnymi podstawnikami są np. chlorowce, takie jak F, Cl, Br lub I.
Oddzielające grupy L' i/lub D' mogą obejmować jedno lub więcej miejsc rozszczepienia, takich jak:
które umożliwiają łatwe rozszczepienie uzyskanego związku w wyznaczonym miejscu.
Szczególnie korzystne przykłady związków (L), które mogą być połączone z hydroksyalkiloskrobią, w których uzyskana pochodna hydroksyalkiloskrobi obejmuje grupę funkcyjną X zdolną do reagowania z grupą funkcyjną Y zawartą w dalszym związku (M) i w których wspomniana grupa funkcyjna Y jest wybrana z grupy obejmującej grupę aldehydową, grupę ketonową, grupę hemiacetalową, grupę acetalową, są następujące:
przy czym związki (L):
są szczególnie korzystne.
PL 216 545 B1
Szczególnie korzystne przykłady związków (D), które mogą być połączone z hydroksyalkiloskrobią, w których uzyskana pochodna hydroksyalkiloskrobi obejmuje grupę funkcyjną W zdolną do reagowania z grupą funkcyjną Z2 zawartą w związku (L), w którym uzyskana pochodna hydroksyalkiloskrobi, która obejmuje hydroksyalkiloskrobię, związek (D) i związek (L), jest zdolna do reagowania z grupą funkcyjną Y dalszego związku (M) i w którym wspomniana grupa funkcyjna Y jest grupą tio, są następujące:
są szczególnie korzystne.
Wraz z wyżej wymienionymi korzystnymi związkami (D), następujące związki (L) są korzystne:
a związek (L):
jest szczególnie korzystny.
Zależnie od warunków reakcji, takich jak użyty rozpuszczalnik lub mieszanina rozpuszczalników, temperatura, ciśnienie lub pH mieszaniny reakcyjnej, produkt reakcji związku (D) lub związku (L) jest poddany reakcji z redukującym końcem hydroksyalkiloskrobi, który jak niniejszym również ujawniono nie jest utleniony i który może mieć różny struktury.
Według korzystnego wykonania niniejszego wynalazku, reakcja według wynalazku jest wykonywana w układzie wodnym.
PL 216 545 B1
Termin „układ wodny”, tak jak jest stosowany w kontekście niniejszego wynalazku, odnosi się do rozpuszczalnika lub mieszaniny rozpuszczalników obejmujących wodę w zakresie od co najmniej 10% wag., korzystnie co najmniej 50% wag., korzystniej co najmniej 80% wag., jeszcze korzystniej co najmniej 90% wag. lub aż do 100% wag., w oparciu o ciężar użytych rozpuszczalników. Jako dodatkowe rozpuszczalniki, można wymienić rozpuszczalniki takie jak DMSO, DMF, etanol lub metanol.
Jeśli reakcja ta jest wykonywana w układzie wodnym I grupa funkcyjna Z1 jest grupą R'-NH-, jak opisano powyżej, pochodna hydroksyalkiloskrobi może mieć strukturę według wzoru (IIIa):
Jeśli ta reakcja jest wykonywana w układzie wodnym i grupa funkcyjna Z1 jest grupą R'-NHz R'=H, jak opisano powyżej, pochodna hydroksyalkiloskrobi może mieć strukturę według wzoru (IIIa) lub wzoru (IIIb) lub być mieszaniną związków według wzorów (IIIa) i (IIIb):
Zależnie od warunków reakcji i/lub charakteru chemicznego związków (L) lub związku (D) stosowanych do tej reakcji, związki według wzoru (IIIa) mogą być obecne z atomem N w położeniu ekwatorialnym lub aksjalnym, gdzie także mieszanina obydwu form może być obecna wykazując pewien rozkład równowagi.
Zależnie od warunków reakcji i/lub charakteru chemicznego związków (L) lub (D) stosowanych do reakcji, związki według wzoru (IIIb) mogą być obecne z wiązaniem podwójnym C-N w konformacji E lub Z, gdzie także mieszanina obydwu form może być obecna wykazując pewien rozkład równowagi.
Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy także pochodnej hydroksyalkiloskrobi jak opisano powyżej mającej strukturę według wzoru (IIIb) lub według wzoru (IIIb) lub według wzorów (IIIa) i (IIIb).
W pewnych przypadkach może być pożądane, aby stabilizować związek według wzoru (IIIa). Ma to miejsce zwłaszcza, gdy związek według wzoru (IIIa) jest wytwarzany i/lub stosowany w roztworze wodnym.
Jako sposób stabilizacji, szczególnie korzystne jest acylowanie związku według wzoru (Ilia), zwłaszcza w przypadku, gdy R' oznacza atom wodoru.
PL 216 545 B1
Jako odczynnik acylujący, mogą być użyte wszelkie odpowiednie odczynniki, które prowadzą do żądanej pochodnej hydroksyalkiloskrobi według wzoru (IVa):
Według szczególnie korzystnych wykonań niniejszego wynalazku, reszta Ra będąca częścią odczynnika do acylowania jest metylem. Jako odczynnik do acylowania korzystnie stosowane są bezwodniki kwasów karboksylowych, halogenki kwasów karboksylowych i czynne estry kwasów karboksylowych.
Acylowanie wykonuje się w temperaturze w zakresie od 0 do 30°C, korzystnie w zakresie od 2 do 20°C i zwłaszcza korzystnie w zakresie od 4 do 10°C.
Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy także pochodnej hydroksyalkiloskrobi otrzymywanej sposobem jak opisano powyżej, W którym wspomniana pochodna ma strukturę według wzoru (IVa).
W innych przypadkach może być pożądane stabilizowanie związku według wzoru (IIIb). Ma to miejsce zwłaszcza, gdy związek według wzoru (IIIb) jest wytwarzany i/lub stosowany w roztworze wodnym. Jako sposób stabilizacji, obniżenie związku HS według wzoru (IIIb) jest szczególnie korzystne, zwłaszcza w przypadku, gdy R' oznacza atom wodoru. Jako odczynnik redukujący, mogą być użyte wszystkie odpowiednie odczynniki, które prowadzą do żądanej pochodnej hydroksyalkiloskrobi według wzoru (IVb):
Według szczególnie korzystnych wykonań niniejszego wynalazku, jako odczynniki redukujące stosuje się borowodorki, takie jak NaCNBH3 lub NaBH4.
Redukcję wykonuje się w temperaturze w zakresie od 4 do 100°C, korzystnie w zakresie od 10 do 90°C i zwłaszcza korzystnie w zakresie od 25 do 80°C.
Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy także pochodnej hydroksyalkiloskrobi otrzymywanej sposobem jak opisano powyżej, w którym wspomniana pochodna ma strukturę według wzoru (IVb).
Niniejszy wynalazek dotyczy ponadto mieszaniny związków mających struktury według wzorów (IIIa) i (IIIb), (IVa) i (IVb), (IIIa) i (IVa), (Ilia) i (IVb), (IIIb) i (IVa), (IIIb) i (IVb), (IIIa) i (IIIb) i (IVa), (IIIa) i (IIIb), (IVb) i (IVa), (IVb) i (IIIa), (IVa), (IVb) i (IIIb), przy czym (IIIa) i/lub (IVa) może być niezależnie obecne w konformacji, gdzie atom N jest w położeniu ekwatoriainym lub aksjalnym i/lub w którym (IIIb) może być obecny z wiązaniem podwójnym C-N w konformacji E lub Z.
W tym przypadku, stosuje się korzystnie polarne rozpuszczalniki aprotyczne, które mogą także zawierać pewną ilość wody, taką jak do 10% wag. Korzystnymi aprotycznymi rozpuszczalnikami są m. in. DMSO lub DMF. Przykładem korzystnego zakresu temperatury reakcji jest od temperatura od pokojowej (20°) do 65°C, a czasy reakcji są zazwyczaj w zakresie od 1 minuty do kilku godzin i aż do kilku dni, zależnie od charakteru chemicznego grupy funkcyjnej, która jest poddana reakcji i od innych warunków reakcji.
PL 216 545 B1
Jeśli w tym przypadku grupa funkcyjna Z1 jest grupą R'-NH-, jak opisano powyżej, pochodna hydroksyalkiloskrobi może mieć strukturę według wzoru (Va):
Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy także pochodnej hydroksyalkiloskrobi otrzymywanej sposobem jak opisano powyżej, w którym wspomniana pochodna ma strukturę według wzoru (Va).
Co się tyczy reakcji hydroksyalkiloskrobi ze związkiem (D) i/lub związkiem (L), jak również związkiem (M), wszelkie możliwe sekwencje są objęte przez niniejszy wynalazek.
Korzystne wykonanie niniejszego wynalazku dotyczy sposobu, jak opisano powyżej, w którym hydroksyaikiloskrobia jest poddana reakcji ze związkiem (L) poprzez reakcję grupy funkcyjnej Z1 z nie utienionym redukującym końcem hydroksyalkiloskrobi i uzyskany produkt reakcji jest poddany reakcji z dalszym związkiem (M) poprzez reakcję grupy funkcyjnej X zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną Y zawartą w związku (M).
Inne wykonanie niniejszego wynalazku dotyczy sposobu, jak opisano powyżej, w którym hydroksyaikiloskrobia jest poddana reakcji ze związkiem (L) poprzez reakcję grupy funkcyjnej Z1 z nie utienionym redukującym końcem hydroksyalkiloskrobi, gdzie związek (L), przed reakcją z hydroksyalkiloskrobią, jest poddany reakcji z dalszym związkiem (M) poprzez reakcję grupy funkcyjnej X zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną Y zawartą w związku (M).
Jeszcze inne wykonanie niniejszego wynalazku dotyczy sposobu, jak opisano powyżej, w którym hydroksyaikiloskrobia jest poddana reakcji ze związkiem (D) poprzez reakcję grupy funkcyjnej Z1 zawartej w związku (D), z nieutienionym redukującym końcem hydroksyalkiloskrobi dając pierwszą pochodną hydroksyalkiloskrobi i gdzie pierwsza pochodna hydroksyalkiloskrobi jest poddana reakcji ze związkiem (L) poprzez reakcję grupy funkcyjnej Z2 zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną W zawartą w związku (D) dając drugą pochodną hydroksyalkiloskrobi.
Jeszcze inne wykonanie niniejszego wynalazku dotyczy sposobu drugiego z wymienionych, w którym druga pochodna hydroksyalkiloskrobi jest poddana reakcji z dalszym związkiem (M) poprzez reakcję grupy funkcyjnej X zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną Y zawartą w związku (M).
Wciąż jeszcze inne wykonanie niniejszego wynalazku dotyczy sposobu jak opisano powyżej, w którym hydroksyalkiioskrobia jest poddana reakcji ze związkiem (D) poprzez reakcję grupy funkcyjnej Z1 zawartej w związku (D) z nie utienionym redukującym końcem hydroksyalkiioskrobi dając pierwszą pochodną hydroksyalkiioskrobi i gdzie pierwsza pochodna hydroksyalkiioskrobi jest poddana reakcji, poprzez reakcję grupy funkcyjnej W, zawartej w związku (D) i grupy funkcyjnej Z2, zawartej w związku (L), ze związkiem (L), gdzie związek (L), przed reakcją z pierwszą pochodną hydroksyalkiioskrobi, jest poddany reakcji z dalszym związkiem (M) poprzez reakcję grupy funkcyjnej X zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną Y zawartą w związku (M).
Co się tyczy warunków reakcji każdego z wyżej opisanych etapów reakcji, wszystkie parametry, takie jak temperatura, ciśnienie, pH lub rozpuszczalnik, lub mieszanina rozpuszczalników, mogą być dostosowane do specyficznych potrzeb i charakteru chemicznego reagujących związków.
Według szczególnie korzystnego wykonania niniejszego wynalazku, woda jest stosowana jako rozpuszczalnik, bądź sama lub w kombinacji z co najmniej jednym innym rozpuszczalnikiem. Jako co najmniej jeden inny rozpuszczalnik, można wymienić DMSO, DMF, metanol i etanol. Korzystne rozpuszczalniki inne niż woda to: DMSO, DMF, metanol i etanol. W tym wykonaniu, hydroksylalkiloskrobia jest korzystnie poddana reakcji poprzez nieutleniony redukujący koniec.
Jeśli hydroksyalkiloskrobia jest poddana reakcji ze związkiem (D) lub związkiem (L) w ośrodku wodnym i związek (D) lub związek (L) jest hydroksyloaminą lub hydrazydem, temperatura reakcji jest korzystnie w zakresie od 5 do 45°C, korzystniej w zakresie od 10 do 30°C i zwłaszcza korzystnie w zakresie od 15 do 25°C.
PL 216 545 B1
Jeśli hydroksyalkiloskrobia jest poddana reakcji ze związkiem (D) lub związkiem (L) w ośrodku wodnym i reakcja jest aminowaniem redukcyjnym, temperatura jest korzystnie w zakresie do 100°C, korzystniej w zakresie od 70 do 90°C i zwłaszcza korzystnie w zakresie od 75 do 85°C.
Podczas przebiegu reakcji temperatura może się zmieniać, korzystnie w wyżej podanych zakresach lub być zasadniczo stała.
Czas reakcji dla reakcji hydroksyalkiloskrobi ze związkiem (D) lub związkiem (L) może być dostosowany do specyficznych potrzeb i jest zazwyczaj w zakresie od 1 h do 7 dni.
W przypadku, gdy związek (D) lub związek (L) jest hydroksyloaminą lub hydrazydem, czas reakcji jest korzystnie w zakresie od 1 h do 3 dni i korzystniej od 2 h do 48 h.
W przypadku, gdy reakcja hydroksyalkiloskrobi ze związkiem (D) lub związkiem (L) jest aminowaniem redukcyjnym, czas reakcji jest korzystnie w zakresie od 2 h do 7 dni.
Wartość pH dla reakcji hydroksyalkiloskrobi ze związkiem (D) lub związkiem (L) może być dostosowany do specyficznych potrzeb, takich jak charakter chemiczny reagentów.
W przypadku, gdy związek (D) lub związek (L) jest hydroksyloaminą lub hydrazydem, wartość pH jest korzystnie w zakresie od 4,5 do 6,5.
W przypadku, gdy reakcja hydroksyalkiloskrobi ze związkiem (D) lub związkiem (L) jest aminowaniem redukcyjnym, wartość pH jest korzystnie w zakresie od 8 do 12.
Odpowiednie pH mieszaniny reakcyjnej może być dobrane, dla każdego etapu reakcji, przez dodanie co najmniej jednego odpowiedniego buforu. Wśród korzystnych buforów można wymienić bufor octanu sodu, bufory fosforanowy lub boranowy.
Jeśli jest to niezbędne, co najmniej jedna grupa funkcyjna X może być zabezpieczona co najmniej jedną odpowiednią grupą zabezpieczającą przed reakcją hydroksyalkiloskrobi ze związkiem (L) lub przed reakcją związku (D) ze związkiem (L), lub przed reakcją związku (L) z produktem reakcji hydroksyalkiloskrobi ze związkiem (D). W tym względzie, są możliwe wszystkie wyobrażalne grupy zabezpieczające, które zapobiegają reakcji zabezpieczonego związku (L) przed poddaniem reakcji poprzez co najmniej jedną grupę funkcyjną X. Zatem, grupa zabezpieczająca może być wybrana zależnie od charakteru chemicznego zabezpieczanej grupy funkcyjnej X, od np. rozpuszczalnika, w którym jest wykonywana reakcja lub od pH mieszaniny reakcyjnej. Korzystne grupy zabezpieczające to, między innymi, benzyloksykarbonyl, tert-butoksykarbonyl, metoksyfenyl, 2,4-dimetoksyfenyl, triarylometyl, trytyl, monometoksytrytyl, dimetoksytrytyl, mono-metylotrytyl, dimetylotrytyl, trifIuoracetyl, związki ftaliminowe, związki 2-(trialkilosilil)etoksykarbonylowe, Fmoc, tert-butyl lub trialkilosilil.
Jeśli dwie lub więcej różne grupy funkcyjne X są obecne W związku (L), co najmniej jedna grupa może być zabezpieczona, podczas gdy co najmniej jedna inna grupa może pozostać nie zabezpieczona.
Po reakcji związku (L), co najmniej jedna grupa zabezpieczająca może być pozostawiona w produkcie reakcji lub usuwana odpowiednimi metodami, takimi jak typowe metody znane znawcy z dziedziny. Jeśli dwie różne grupy funkcyjne X są zabezpieczone przez odpowiednie grupy zabezpieczające, jest możliwe, by usunąć co najmniej jedną grupę zabezpieczającą tak, by udostępnić co najmniej jedną grupę funkcyjną X dla dalszej reakcji z co najmniej jednym dalszym związkiem (M) i pozostawić co najmniej jedną inną grupę funkcyjną zabezpieczoną aż produkt reakcji obejmujący związek (L) jest poddany reakcji z dalszym związkiem (M). Następnie, grupa zabezpieczająca grupy funkcyjnej wciąż zabezpieczonej może być usunięta, by udostępnić pozostałą grupę funkcyjną X dla reakcji z jeszcze dalszym związkiem (M).
Zastosowanie co najmniej jednej grupy zabezpieczającej może być istotne dla zabezpieczenia przed reakcją prowadzącą do pochodnej hydroksyalkiloskrobi składającej się ze związku (L) lub związku (D), który przereagował z dwoma lub więcej cząsteczkami hydroksyalkiloskrobi, tj. wielokrotnie podstawionym HAS związkiem (L) lub (D). Jednak taki sam rezultat można osiągnąć przez poddanie reakcji hydroksyalkiloskrobi z nadmiarem związku (L) lub (D). Jeśli nadmiarowa ilość związku (L) lub (D) jest stosowana w procesie według niniejszego wynalazku, stosunek molowy związku (L) lub (D) do hydroksyalkiloskrobi wynosi korzystnie od około 2 do 100.
Po utworzeniu produktu reakcji odpowiedniego etapu reakcji, jak opisano powyżej, może on być wyodrębniony z mieszaniny reakcyjnej za pomocą co najmniej jednej odpowiedniej metody. Jeśli jest to konieczne, produkt reakcji można wytrącić przed wyodrębnieniem przy zastosowaniu co najmniej jednej odpowiedniej metody.
Jeżeli produkt reakcji najpierw wytrąca się, możliwe jest np. kontaktowanie mieszaniny reakcyjnej z co najmniej jednym rozpuszczalnikiem lub mieszaniną rozpuszczalników innych niż rozpuszczalPL 216 545 B1 nik lub mieszanina rozpuszczalników obecna w mieszaninie reakcyjnej w odpowiedniej temperaturze. Według szczególnie korzystnego wykonania niniejszego wynalazku tam, gdzie układ wodny jest stosowany jako rozpuszczalnik, mieszaninę reakcyjną doprowadza się do kontaktu z mieszaniną etanolu i acetonu, korzystnie mieszaniną 1:1, równych objętości wspomnianych związków, w temperaturze, korzystnie w zakresie od -20 do +50°C, a zwłaszcza korzystnie w zakresie od 0 do 25°C.
Wyodrębnienie produktu reakcji może być wykonane za pomocą odpowiedniego procesu, który może obejmować jeden lub więcej etapów. Według korzystnego wykonania niniejszego wynalazku, produkt reakcji jest najpierw wydzielany z mieszaniny reakcyjnej lub z mieszaniny produktu reakcji np. z mieszaniny etanol-aceton, w odpowiedni sposób, taki jak odwirowanie lub sączenie. W drugim etapie oddzielony produkt reakcji może być poddany dalszemu działaniu, takiemu jak obróbka następcza typu dializa, sączenie z odwirowywaniem lub sączenie ciśnieniowe, chromatografia jonowymienna, HPLC, MPLC, filtracja żelowa i/lub liofilizacja. Według jeszcze bardziej korzystnego wykonania, oddzielony produkt reakcji jest najpierw dializowany, korzystnie względem wody i następnie liofilizowany aż do momentu, gdy zawartość rozpuszczalnika w produkcie reakcji jest wystarczająco niska zgodnie z żądanymi specyfikacjami produktu. Liofilizacja może być wykonywana w temperaturze od 20 do 35°C, korzystnie od 25 do 30°C.
Według korzystnych wykonań niniejszego wynalazku, pochodna hydroksyalkiloskrobi obejmująca hydroksyalkiloskrobię i związek (L) lub obejmująca hydroksyalkiloskrobię, związek (D) i związek (L) jest dalej poddana reakcji z dalszym związkiem (M), który obejmuje co najmniej jedną grupę funkcyjną Y.
Zazwyczaj, nie ma ograniczeń odnośnie związku (M). Korzystnie, polipeptyd jest stosowany jako związek (M) w kontekście niniejszego wynalazku. Jednak, inne związki (M) są także możliwe, bądź polimery lub oligomery lub związki monomolekularne lub mieszaniny dwóch lub więcej z nich.
Termin „polipeptyd” stosowany w rozumieniu niniejszego wynalazku odnosi się do związku, który zawiera co najmniej 2 aminokwasy połączone poprzez wiązanie peptydowe, tj. wiązanie o budowie -(C=O)-NH-. Polipeptyd może być związkiem pochodzenia naturalnego lub polipeptydem, który nie występuje w przyrodzie, przy czym ten ostatni zawiera aminokwasy występujące w przyrodzie i/lub co najmniej jeden aminokwas, który nie występuje w przyrodzie. Szkielet polipeptydu, łańcuch polipeptydu, może być ponadto podstawiony przez co najmniej jeden odpowiedni podstawnik a zatem ma co najmniej jeden łańcuch boczny. Co najmniej jedna grupa funkcyjna Y może być częścią szkieletu polipeptydu lub co najmniej jednego podstawnika szkieletu, przy czym możliwe są wykonania, w których co najmniej jedna grupa funkcyjna jest częścią szkieletu polipetydu i co najmniej jedna grupa funkcyjna jest częścią jednego podstawnika szkieletu polipeptydu.
Co się tyczy polipeptydu, nie istnieją żadne ograniczenia, zakładając, że poiipeptyd zawiera co najmniej jedną grupę funkcyjną Y. Wspomniana grupa funkcyjna Y może być połączona bezpośrednio ze szkieletem polipeptydu lub być częścią bocznego łańcucha szkieletu. Zarówno boczny łańcuch, jak i grupa funkcyjna Y lub obydwie mogą być częścią naturalnie występującego polipeptydu lub mogą być wprowadzone do polipeptydu występującego w przyrodzie lub do polipeptydu, który co najmniej częściowo nie występuje w przyrodzie, przed reakcją z grupą funkcyjną X.
Dodatkowo, polipeptyd może, co najmniej częściowo, pochodzić z dowolnego źródła ludzkiego lub zwierzęcego. W korzystnym wykonaniu poiipeptyd jest pochodzenia ludzkiego.
Poiipeptyd może być cytokiną, zwłaszcza erytropoetyną, antytrombiną (AT) taką jak AT III, interleukiną, zwłaszcza interleukiną-2, IFN-beta, IFN-alfa, G-CSF, CSF, interleukiną-6 i leczniczymi przeciwciałami.
Według korzystnego wykonania, poiipeptyd jest antytrombiną (AT), korzystnie AT III (Levy J. H., Weisinger A;., Ziomek C. A., Echelard Y., Recombinant Antithrombin: Production and Role In Cardiovascular Disorder, Seminars in Thrombosis and Hemostasis 27, 4 (2001) 405-416; Edmunds T., Van Patten S. M., Pollock J., Hanson E., Bernasconi R., Higgins E., Manavalan P., Ziomek C., Meade H., McPherson J., Cole E. S., Transgenically Produced Human Antithrombin: Structural and Functional Comparison to Human Plasma-Derived Antithrombin, Blood 91, 12 (1998) 4661-4671; Minnema M. G., Chang A. C. K., Jansen P. M., Lubbers Y. T. P., Pratt B. M., Whittaker H. G., Taylor F. B., Hack C. E., Friedman B., Recombinant human antithrombin III improves survival and attenuates inflammatory responses In baboons Iethally challenged with Escherichia coli, Blood 95,4 (2000) 1117-1123; Van Patten S. M., Hanson E. H., Bernasconi R., Zhang K., Manavaln P., Cole E. S., McPherson J. M., Edmunds T., Oxidation of Methionine Residues In Antithrombin, J. Biol. Chemistry 274, 15 (1999) 10268-10276).
PL 216 545 B1
Według innego korzystnego wykonania polipeptyd jest ludzką lFN-beta, w szczególności IFN-beta 1a (por. Avonex®; REBIE® i lFN-beta 1b (por. BETASERON®).
Dalszym korzystnym polipeptydem jest ludzki G-CSE (czynnik pobudzający powstanie kolonii granulocytów), Patrz np., Nagata i in., The chromosomal gene structure and two mRNAs for human granulocyte colony-stimulating factor, EMBO J. 5: 575-581, 1986; Souza i in., Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor: effects on normal and leukemic myeloid cells. Science 232 ® (1986) 61-65; i Herman i in., Characterization, formulation and stability of Neupogen® (Eilgrastim), a recombinant human granulocyte-colony stimulating factor, w: Eormulation, characterization, and stability of protein drugs, Rodney Pearlman and Y. John Wang, ed., Plenum Press, New York, 1996, 303-328.
Jeżeli stosuje się mieszaninę co najmniej dwóch różnych polipeptydów, te co najmniej dwa polipeptydy mogą różnić się np. masą cząsteczkową, liczbą i/lub sekwencją aminokwasów, różnym stopniem glikozylacji, liczbą i/lub chemiczną budową podstawników lub liczbą łańcuchów polipeptydu połączonych przez odpowiednie wiązania chemiczne takie jak mostki disiarczkowe.
Według korzystnego wykonania niniejszego wynalazku, produkt reakcji hydroksyalkiloskrobi i związku (L) lub produkt reakcji hydroksyalkiloskrobi i związku (D), który jest dalej poddany reakcji ze związkiem (L), jest wyodrębniony, korzystnie według co najmniej jednego z wyżej wymienionych procesów i następnie poddany reakcji z polipeptydem mającym co najmniej jedną grupę funkcyjną Y. Według korzystnego wykonania niniejszego wynalazku, grupa funkcyjna Y jest zawarta w ugrupowaniu węglowodanowym polipeptydu.
W kontekście niniejszego wynalazku, termin „ugrupowanie węglowodanowe” odnosi się do hydroksyaldehydów lub hydroksyketonów jak również do ich chemicznych modyfikacji, patrz: Rompp Chemielexikon, Thieme Verlag Stuttgart, Germany, 9th edition 1990, Volume 9, strony 2281-2285 i cytowana tam literatura. Ponadto, także odnosi się do pochodnych naturalnie występujących ugrupowań węglowodanowych takich jak glukoza, galaktoza, mannoza, kwas sialowy, itp. Termin także obejmuje chemicznie utlenione, naturalnie występujące ugrupowania węglowodanowe. Struktura utlenionego ugrupowania węglowodanowego może być cykliczna lub liniowa.
Ugrupowanie węglowodanowe może być połączone bezpośrednio ze szkieletem polipeptydu. Korzystnie, ugrupowanie węglowodanowe jest częścią węglowodanowego łańcucha bocznego. Korzystniej, ugrupowanie węglowodanowe jest końcowym ugrupowaniem węglowodanowego łańcucha bocznego.
W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu, ugrupowanie węglowodanowe jest resztą galaktozową węglowodanowego łańcucha bocznego, korzystnie końcową resztą galaktozową węglowodanowego łańcucha bocznego. Tę resztę galaktozową można udostępnić dla reakcji z produktem reakcji związku (I) i związku (II) przez usuwanie końcowych kwasów sialowych, a następnie może być utlenianie, jak opisano poniżej.
W jeszcze dalszym korzystnym wykonaniu, produkt reakcji hydroksyalkiloskrobi i związku (L) lub produkt reakcji hydroksyalkiloskrobi i związku (D), który jest dalej poddany reakcji ze związkiem (L) jest połączony z resztą kwasu sialowego węglowodanowych łańcuchów bocznych, korzystnie końcową resztą kwasu sialowego węglowodanowego łańcucha bocznego.
Utlenianie końcowych ugrupowań węglowodanowych można wykonać bądź chemicznie lub enzymatycznie.
Metody chemicznego utleniania ugrupowań węglowodanowych polipeptydów są znane w stanie techniki i obejmują działanie nadjodanem (Chamów i in., 1992, J. Biol. Chem., 267,15916-15922).
Utleniając chemicznie, w zasadzie możliwe jest utlenianie jakiegokolwiek ugrupowania węglowodanowego, które jest umiejscowione na końcu. Jednak, wybierając łagodne warunki (1 mM nadjodanu, 0°C w przeciwieństwie „ciężkich” warunków: 10 mM nadjodanu, 1 h w temperaturze pokojowej), jest możliwe, by korzystnie utleniać końcowy kwas sialowy węglowodanowego łańcucha bocznego.
Alternatywnie, ugrupowanie węglowodanowe może być utlenione enzymatycznie. Enzymy do utleniania poszczególnych ugrupowań węglowodanowych są znane w stanie techniki, np. w przypadku galaktozy enzym jest oksydazą galaktozową. Jeśli jest zamierzone, by utleniać końcowe ugrupowania galaktozy, będzie ostatecznie niezbędne aby usunąć końcowe kwasy sialowe (częściowo lub zupełnie) jeśli polipeptyd wytworzono w komórkach zdolnych do przyłączania kwasów stalowych do łańcuchów węglowodanowych, np. w komórkach ssaków lub w komórkach które genetycznie zmodyfikowano, aby były zdolne do przyłączania kwasów sialowych do łańcuchów węglowodanowych. Chemiczne lub enzymatyczne metody usuwania kwasów sialowych są znane w stanie techniki (Chaplin
PL 216 545 B1 i Kennedy (red.), 1996, Carbohydrate Analysis; a practical approach, zwłaszcza Chapter 5 Montreuill, Glycoproteins, str. 175-177; IRL Press Practical approach series (ISBN 0-947946-44-3)).
Według innego korzystnego wykonania niniejszego wynalazku, grupą funkcyjną polipeptydu jest grupa tio. Zatem, produkt reakcji hydroksyalkiloskrobi i związku (L) lub produkt reakcji hydroksyalkiloskrobi i związku (D), który jest dalej poddany reakcji ze związkiem (L) może być połączony z polipeptydem poprzez grupę tioeterową, w której atom S można wyprowadzić z dowolnej grupy tio zawartej w polipeptydzie.
W kontekście tego wykonania, jest szczególnie korzystne poddanie reakcji polipeptydu z produktem reakcji hydroksyalkiloskrobi i związku (D), który jest dalej poddany reakcji ze związkiem (L).
Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu, jak opisano powyżej, w którym produkt reakcji hydroksyalkiloskrobi i związku (O) jest dalej poddany reakcji ze związkiem (L) jest poddany reakcji z polipeptydem poprzez grupę tio zawartą w polipeptydzie.
Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu, jak opisano powyżej, w którym produkt reakcji hydroksyalkiloskrobi i związku (D), który jest dalej poddany reakcji ze związkiem (L) jest poddany reakcji z polipeptydem poprzez utlenione ugrupowanie węglowodanowe i grupę tio zawartą w polipeptydzie.
Grupa tio może być obecna w polipeptydzie jako taka. Ponadto, jest możliwe by wprowadzić grupę tio do polipeptydu według odpowiedniej metody. Między innymi, można wymienić metody chemiczne. Jeśli mostek disiarczkowy jest obecny w polipeptydzie, jest możliwe, by zredukować strukturę -S-S- uzyskując grupę tio. Jest także możliwe, by przekształcić grupę aminową obecną w polipeptydzie w grupę SH przez reakcję polipeptydu poprzez grupę aminową ze związkiem, który ma co najmniej dwie różne grupy funkcyjne, z których jedna jest zdolna do reagowania z grupą aminową, a inna jest grupą SH lub prekursorem grupy SH. Tę modyfikację grupy aminowej można uważać jako przykład, gdzie proteina najpierw reaguje ze związkiem (L), który ma co najmniej dwie różne grupy funkcyjne, z których jedna jest zdolna do reagowania z grupą aminową, a inna jest grupą SH i uzyskany produkt reakcji jest następnie poddany reakcji z np. pochodną HAS obejmującą HAS i związek (D), przy czym wspomniana pochodna obejmuje grupę funkcyjną zdolną do reakcji z grupą SH. Jest także możliwe, by wprowadzić grupę SH przez mutację polipeptydu tak, jak przez wprowadzenie cysteiny lub odpowiedniego aminokwasu z grupą funkcyjną SH do polipeptydu lub tak, jak usuwać cysteinę z polipeptydu by uniemożliwić innej cysteinie w polipeptydzie utworzenie mostku disiarczkowego.
Jako szczególnie korzystny polipeptyd jest stosowana erytropoetyna (EPO).
Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu, jak opisano powyżej, w którym polipeptyd jest erytropoetyną.
EPO może być z jakiegokolwiek ludzkiego (patrz: np. Inoue, Wada, Takeuchi, 1994, An improved method for the purification of human erithropoietIn with high in vivo activity from the urine of anemic patients, Biol. Pharm. Bull. 17 (2), 180-4; Miyake, Kung, Goldwasser, 1977, Purification of human erithropoietin, J. Biol. Chem., 252 (15), 5558-64) Iub innego ssaczego źródła i może być otrzymane przez oczyszczanie z naturalnie występujących źródeł, takich jak nerki człowieka, wątroba zarodka człowieka lub zwierzęcia, korzystnie nerki małpy. Ponadto, wyrażenie „erytropoetyna” albo „EPO” obejmuje także odmianę EPO, w której jeden lub więcej aminokwasów (np. 1 do 25, korzystnie 1 do 10, korzystniej 1 do 5, najkorzystniej 1 lub 2) wymieniono na inny aminokwas i który wykazuje aktywność erytropoetyczną (patrz np. EP nr 640 619 B1).
Pomiar aktywności erytropoetycznej jest opisany w stanie techniki (odnośnie pomiaru aktywności in vitro patrz np. Fibi i in., 1991, Blood, 77, s. 1203 i dalej; Kitamura et al, 1989, J. Cell Phys.,140, 323-334; odnośnie pomiaru aktywności EPO in vivo - patrz Ph. Eur. 2001, 911-917; Ph. Eur. 2000, 1316 Erythropoietini solutio concentrata, 780-785; European Pharmacopoeia (1996/2000); European Pharmacopoeia, 1996, Erytropoietin concentrated solution, Pharmaeuropa, 8, 371- 377; Fibi, Hermentin, Pauly, Lauffer, Zettlmeissl., 1995, N- and O-glycosylation muteins of recombinant human erythropoietin secreted from BHK-21 cells. Blood, 85 (5), 1229-36; (EPO i modyfikowane formy EPO wstrzykiwano samicom myszy NMRI (równe ilości proteiny 50 ng/mysz) dnia 1, 2 i 3 próbki krwi pobrano dnia 4 i oznaczono retikulocyty)). Dalszymi publikacjami, gdzie są opisane próby pomiaru aktywności EPO są Barbone, Aparicio, Anderson, Natarajan, Ritchie, 1994, Reticulocytes measurements as a bioassay for erythropoietin, J. Pharm. Biomed. Anal., 12 (4), 515-22; Bowen, Culligan, Beguin, Kendall, Villis, 1994, Estimation of effective and total erythropoiesis in myelodysplasia using serum transferrin receptor and erythropoietin concentrations, with automated reticulocyte parameters, Leukemi, 8 (1), 151-5; Delorme, Lorenzini, Giffin, Martin, Jacobsen, Boone, Elliott, 1992, Role of glycosylation on the secre34
PL 216 545 B1 tion and biological activity of erythropoietin. Biochemistry, 31 (41), 9871-6; Higuchi, Oheda, Kuboniwa, Tomonoh, Shimonaka, Ochi, 1992; Role of sugar chains In the expression of the biological activity of human erythropoietin, J. Biol. Chem., 267 (11), 7703-9; Yamaguchi, Akai, Kawanishi, Ueda, Masuda, Sasaki, 1991, effects of site-directed removal of N-glycosylation sites in human erythropoietin on its production and biological properties, J. Biol. Chem., 266 (30), 20434-9; Takeuchi, Inoue, Strickland, Kubota, Wada, Shimizu, Hoshi, Kozutsumi, Takasaki, Kobata, 1989, Relationship between sugar chain structure and biological activity of recombinant human erythropoietin produced in Chinese hamster ovary cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 (20), 7819-22; Kurtz, Eckardt, 1989, Assay methods for erythropoietin. Nephron., 51(1), 11-4 (German); Zucali, Sulkowski, 1985, Purification of human urinary erythropoietin on controlled-pore glass and silicic acid. Exp. Hematol., 13 (3), 833-7; Krystal, 1983, Physical and biological characterization of erythroblast enhancing factor (EEF), a late acting erythropoietic stimulator in serum distinct from erythropoietin. Exp. Hematol., 11 (1),18-31.
Korzystnie, EPO jest wytwarzana rekombinacyjnie. Obejmuje to wytwarzanie w komórkach eukariotycznych lub prokariotycznych, korzystnie ssaczych, owadów, drożdży, bakterii lub w jakimkolwiek innym typie komórek, który jest dogodny do rekombinacyjnego wytwarzania EPO. Ponadto, EPO może być ekspresjonowana w zwierzętach transgenicznych (np. w płynach ustrojowych, takich jak mleko, krew itp.), w jajach ptaków transgenicznych, zwłaszcza drobiu, korzystnie kury lub w roślinach transgenicznych.
Rekombinacyjne wytwarzanie polipeptydu jest znane w stanie techniki. Zazwyczaj, to obejmuje transfekcję komórek gospodarza odpowiednim wektorem ekspresji, hodowanie komórek gospodarza w warunkach, które umożliwiają wytwarzanie polipeptydu i oczyszczanie polipeptydu z komórek gospodarza. Odnośnie szczegółowej informacji - patrz np. Krystal, Pankratz, Farber, Smart, 1986, Purification of human erythropoietin to homogeneity by a rapid five-step procedure. Blood, 67 (1), 71-9; Quelle, Caslake, Burkert, Wojchowski, 1989, High-level expression and purification of a recombinant human erythropoietin produced using a baculowirus vector. Blood, 74 (2), 652-7; EP nr 640 619 B1 i EP nr 668 351 B1. W korzystnym wykonaniu EPO ma sekwencję aminokwasów ludzkiej EPO (patrz EP nr 148 605 B2).
EPO może zawierać jeden lub więcej bocznych łańcuchów węglowodanowych, korzystnie 1 do 12, korzystniej 1 do 9, nawet korzystniej 1 do 6 i w szczególności 1 do 4, szczególnie korzystnie 4 boczne łańcuchy węglowodanowe połączone z EPO wiązaniem glikozylowym N- i/lub O-, tj. EPO jest glikozylowane. Zazwyczaj, gdy EPO jest wytwarzana w komórkach eukariotycznych, polipeptyd jest potranslacyjnie glikozylowany. W rezultacie boczne łańcuchy węglowodanowe są dołączane do EPO w czasie biosyntezy w komórkach ssaka, szczególnie człowieka, owada lub drożdży. Struktura i właściwości glikozylowanej EPO były szeroko badane (patrz EP nr 428 267 B1; EP nr 640 619 B1; Rush, Derby, Smith, Merry, Roers, Rohde, Katta, 1995, Microheterogeneity of erythropoietin carbohydrate structure. Anal Chem., 67 (8), 1442-52; Takeuchi, Kobata, 1991, Structures and functional roles of th sugar chains of human erythropoietins, Glycobiology, 1 (4), 337-46 (Review).
Dlatego pochodna hydroksyalkilowa skrobi według niniejszego wynalazku może zawierać co najmniej jedną, korzystnie 1 do 2, korzystniej 1 do 9, nawet korzystniej 1 do 6 i szczególnie korzystnie 1 do 4 cząsteczek HAS na cząsteczkę EPO. Liczba cząsteczek HAS na cząsteczkę EPO może być określona poprzez ilościową analizę składu węglowodanów przy użyciu GC-MS po hydrolizie produktu I derywatyzacjI powstających monosachkarydów (patrz Chaplin i Kennedy (eds), 1986, Carbohydrate Analysis; A practical approach, seria Practical Approach IRL Press (ISBN 0-947946-44-3), szczególnie Rozdział 1, Monosaccharides, str. 1-36; rozdział 2, Oligosaccharides, str. 37-53, rozdział 3, Neutral Polysaccharides, str. 55-96).
Zgodnie ze szczególnie korzystnym wykonaniem niniejszego wynalazku ugrupowanie węglowodanowe połączone z EPO jest częścią węglowodanowego łańcucha bocznego. Korzystniej, ugrupowanie węglowodanowe jest końcowym ugrupowaniem węglowodanowego łańcucha bocznego. W nawet bardziej korzystnym wykonaniu ugrupowanie węglowodanowe jest resztą galaktozy węglowodanowego łańcucha bocznego, korzystnie końcową resztą galaktozy węglowodanowego łańcucha bocznego. Ta reszta galaktozy może być udostępniona do reakcji z produktem reakcji związku (I) i związku (II) poprzez usunięcie końcowych kwasów sialowych, a następnie utlenienie, jak opisano poniżej. W dalszym korzystnym wykonaniu produkt reakcji związku (I) i (II) jest połączony z resztą kwasu sialowego węglowodanowego łańcucha bocznego, korzystnie końcową resztą kwasu sialowego węglowodanowego łańcucha bocznego. Kwas sialowy jest utleniany, jak opisano w tym zgłoszeniu.
PL 216 545 B1
Szczególnie korzystnie, ta reszta galaktozowa jest udostępniona dla reakcji z produktem reakcji hydroksyalkiloskrobi i związku (L) lub produktem reakcji hydroksyalkiloskrobi i związku (D), który jest dalej poddany reakcji ze związkiem (L) poprzez grupę funkcyjną X przez usuwanie końcowego kwasu sialowego, a następnie utlenianie.
Korzystniej, ta reszta galaktozowa jest udostępniona dla reakcji z produktem reakcji hydroksyalkiloskrobi i związkiem (L) lub produktem reakcji hydroksyalkiloskrobi i związkiem (D), który jest dalej poddany reakcji ze związkiem (L) poprzez grupę funkcyjną X przez utlenianie, w którym końcowy kwas sialowy nie jest usuwany.
Jak wspomniano powyżej, produkt reakcji hydroksyalkiloskrobi i związku (L) lub produkt reakcji hydroksyalkiloskrobi i związku (D), który jest dalej poddany reakcji ze związkiem (L) jest poddany reakcji z grupą tio zawartą w EPO.
Możliwe jest również przeprowadzenie reakcji produktu reakcji hydroksyalkiloskrobi i związku (L) lub produktu reakcji hydroksyalkiloskrobi i związku (D), który jest dalej poddany reakcji ze związkiem (L) z grupą tio, jak również z ugrupowaniem węglowodanowym, z których każde jest zawarte w co najmniej jednym dalszym związku, korzystnie polipeptydem, korzystniej erytropoetyną.
Zgodnie z korzystnym wykonaniem, ta grupa SH może być połączona z korzystnie utlenionym ugrupowaniem węglowodanowym, np. poprzez zastosowanie pochodnej hydroksylaminy, np. chlorowodorku 2-(aminooksy)etylomerkaptanu (Bauer L. i wsp., 1965, J. Org. Chem., 30, 949) lub poprzez zastosowanie pochodnej hydrazydu np. hydrazydu kwasu tioglikolowego (Whitesides i wsp., 1977, J. Org. Chem., 42, 332).
Zgodnie z dalszym korzystnym wykonaniem, grupa tio jest korzystnie wprowadzana do utlenionego ugrupowania węglowodanowego EPO, korzystniej utlenionego ugrupowania węglowodanowego, które jest częścią węglowodanowego łańcucha bocznego EPO.
Korzystnie, grupa tio pochodzi z naturalnie występującej cysteiny lub z cysteiny dodanej. Korzystniej, EPO ma sekwencję aminokwasową ludzkiej EPO i naturalnie występującymi cysteinami są cysteina 29 i/lub 33. W bardziej korzystnym wykonaniu, produkt reakcji hydroksyalkiloskrobi i związku (L) lub produkt reakcji hydroksyalkiloskrobi i związku (D), który jest dalej poddany reakcji ze związkiem (L) jest poddany reakcji z cysteiną 29, podczas gdy cysteina 33 jest zastąpiona przez inny aminokwas.
Alternatywnie, produkt reakcji hydroksyalkiloskrobi i związku (L) lub produkt reakcji hydroksyalkiloskrobi i związku (D), który jest dalej poddany reakcji ze związkiem (L) jest poddany reakcji z cysteiną 33, podczas gdy cysteina 29 jest zastąpiona przez inny aminokwas.
W kontekście niniejszego wynalazku określenie „dodane cysteiny” wskazuje, że polipeptydy, korzystnie EPO, zawierają resztę cysteiny, która nie jest obecna w naturalnym poiipeptydzie.
W kontekście tego aspektu wynalazku, cysteina może być dodatkowym aminokwasem dodanym na końcu N- lub C-EPO.
Ponadto, dodana cysteina może być dodana przez zamianę naturalnie występującego aminokwasu na cysteinę lub odpowiednio podstawioną cysteinę. Korzystnie, w kontekście tego aspektu wynalazku, EPO jest ludzkim EPO i zamieniona reszta aminokwasowa jest seryną 126.
Co się tyczy warunków reakcji produktu reakcji hydroksyalkiloskrobi i związku (L), ewentualnie ze związkiem (D), z dalszym związkiem (M), nie ma szczególnych ograniczeń i warunki reakcji moą być dostosowane do specyficznych potrzeb.
Według szczególnie korzystnego wykonania niniejszego wynalazku, woda jest stosowana jako rozpuszczalnik, bądź sama lub w kombinacji z co najmniej jednym innym rozpuszczalnikiem. Jako co najmniej jeden inny rozpuszczalnik można wymienić DMSO, DMF, metanol lub etanol.
Korzystne rozpuszczalniki inne niż woda to metanol i etanol. Według innych korzystnych wykonań, jako rozpuszczalnik jest stosowany DMSO lub DMF lub metanol, lub etanol, lub mieszanina dwóch, lub więcej z nich.
Jeśli np. hydroksyalkiloskrobia jest poddana reakcji ze związkiem (L) w układzie wodnym, jak to ma miejsce, np. gdy hydroksyetyloskrobia jest poddana reakcji z hydroksyaminą, taką jak O-[2-(2-aminooksyetoksy)etylo]hydroksyloamina, poprzez reakcję nieutlenionego redukującego końca skrobi i produkt reakcji jest dalej poddany reakcji z polipeptydem, korzystnie erytropoetyną, poprzez grupę aldehydową, ketonową, acetalową lub hemiacetalową, temperatura reakcji jest korzystnie w zakresie od 4 do 37°C, korzystniej od 10 do 30°C i zwłaszcza korzystnie od 15 do 25°C.
Wyodrębnienie produktu reakcji obejmującego dalszy związek (M), korzystnie polipeptyd i zwłaszcza korzystnie erytropoetynę, można wykonać stosując znane procedury oczyszczania natu36
PL 216 545 B1 ralnej i rekombinacyjnej EPO (np. chromatografia na zasadzie wykluczania, chromatografia jonowymienna, RP-HPLC, chromatografia hydroksyapatytowa, chromatografia oddziaływań hydrofobowych lub ich kombinacje).
Wyodrębnienie produktu reakcji może być wykonywane przez odpowiedni proces, który może obejmować jeden lub więcej etapów.
Według korzystnego wykonania niniejszego wynalazku, produkt reakcji jest najpierw oddzielony od mieszaniny reakcyjnej lub mieszaniny z np. mieszaniną etanol-aceton mieszaniny reakcyjnej, odpowiednim sposobem, takim jak odwirowanie lub sączenie.
W drugim etapie, oddzielony produkt reakcji może być poddany dalszej obróbce, takiej jak obróbka następcza, taka jak dializa, sączenie z odwirowywaniem lub sączenie ciśnieniowe, chromatografia jonowymienna, taka jak np. przez kolumnę zawierającą Q-Sepharose, HPLC, MPLC, filtracja żelowa i/lub liofilizacja.
Według jednego korzystnego wykonania, oddzielony produkt reakcji jest najpierw dializowany, korzystnie względem wody i następnie liofilizowany, aż zawartość rozpuszczalnika w produkcie reakcji jest wystarczająco niska według żądanych specyfikacji produktu. Liofilizacja może być wykonywana w temperaturze od 20 do 35°C, korzystnie od 25 do 30°C.
Według innego korzystnego wykonania, mieszaninę reakcyjną obejmującą m produkt reakcji wprowadza się na kolumnę zawierającą Q-Sepharose dając eluat, który jest zatężany, np. przez sączenie z odwirowywaniem.
Innym przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie pochodnych hydroksyalkiloskrobi, które są wytwarzane jednym lub więcej z powyższych sposobów.
Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy pochodnej hydroksyalkiloskrobi otrzymywanej sposobem wytwarzania pochodnej hydroksyalkiloskrobi, przy czym wspomniana hydroksyalkiloskrobia ma strukturę według wzoru (I):
obejmującym poddanie reakcji hydroksyalkiloskrobi o wzorze (I) przy jej nieutlenionym redukującym końcu lub pochodnej hydroksyalkiloskrobi, otrzymywanej przez poddanie reakcji hydroksyalkiloskrobi o wzorze (I) przy jej nieutlenionym redukującym końcu ze związkiem (D), przy czym wspomniany związek (D) obejmujący co najmniej jedną grupę funkcyjną Z1 zdolną do reagowania z nieutlenionym redukującym końcem hydroksyalkiloskrobi i co najmniej jedną grupę funkcyjną W, ze związkiem (L) obejmującym co najmniej jedną grupę funkcyjną Z1 zdolną do reagowania ze wspomnianą hydroksyloalkiloskrobią lub co najmniej jedną grupę funkcyjną Z2 zdolną do reagowania z grupą funkcyjną W zawartą we wspomnianej pochodnej hydroksyalkiloskrobi i co najmniej jedną grupę funkcyjną X zdolną do reagowania z grupą funkcyjną Y dalszego związku (M), w którym wspomniana grupa funkcyjna Y jest wybrana z grupy obejmującej grupę aldehydową, grupę ketonową, grupę hemiacetalową, grupę acetalową lub grupę tio.
Według korzystnego wykonania, niniejszy wynalazek dotyczy pochodnej hydroksyalkiloskrobi, jak opisano powyżej, w której R1, R2 i R3 oznaczają niezależnie atom wodoru lub liniowy lub rozgałęziony hydroksyalkil.
Według jeszcze bardziej korzystnego wykonania, niniejszy wynalazek dotyczy pochodnej hydroksyalkiloskrobi, jak opisano powyżej, w której R1, R2 i R3 oznaczają niezależnie atom wodoru lub 2hydroksyetyl.
Według dalszego korzystnego wykonania, niniejszy wynalazek dotyczy pochodnej hydroksyalkiloskrobi, jak opisano, w której hydroksyalkiloskrobia jest hydroksyetyloskrobią.
Według dalszego korzystnego wykonania, niniejszy wynalazek dotyczy pochodnej hydroksyalkiloskrobi, jak opisano powyżej, w któryej grupa funkcyjna Z1 obejmuje strukturę -NH-.
PL 216 545 B1
Według szczególnie korzystnego wykonania, niniejszy wynalazek dotyczy pochodnej hydroksyalkiloskrobi, jak opisano powyżej, w której Z1 jest wybrany z grupy obejmującej:
w której G oznacza O lub S i, jeśli występuje dwukrotnie, oznacza niezależnie O lub S, a R' oznacza metyl.
Według dalszego korzystnego wykonania, niniejszy wynalazek dotyczy pochodnej hydroksyalkiloskrobi, jak opisano powyżej, w której grupa funkcyjna Y jest wybrana z grupy obejmującej grupę aldehydową, grupę ketonową, grupę hemiacetalową I grupę acetalową, a grupa funkcyjna X obejmuje strukturę -NH-.
Według szczególnie korzystnego wykonania, niniejszy wynalazek dotyczy pochodnej hydroksyalkiloskrobi, jak opisano powyżej, gdzie X jest wybrany z grupy obejmującej:
w której G oznacza O lub S i, jeśli występuje dwukrotnie, oznacza niezależnie O lub S, a R oznacza metyl.
PL 216 545 B1
Według dalszego korzystnego wykonania, niniejszy wynalazek dotyczy pochodnej hydroksyalkiloskrobi, jak opisano powyżej, w której grupa funkcyjna Y oznacza SH, a grupa funkcyjna X jest wybrana z grupy obejmującej:
w której Hal oznacza Cl, Br lub I.
Według dalszego korzystnego wykonania, niniejszy wynalazek dotyczy pochodnej hydroksyalkiloskrobi, jak opisano powyżej, w której grupa funkcyjna W lub grupa funkcyjna Z2 oznacza -SH, a grupa funkcyjna Z2 lub grupa funkcyjna W jest wybrana z grupy obejmującej:
w której Hal oznacza Cl, Br lub I.
Według dalszego korzystnego wykonania niniejszy wynalazek dotyczy pochodnej hydroksyalkiloskrobi, jak opisano powyżej, w której grupa funkcyjna W lub grupa funkcyjna Z2 jest wybrana z grupy obejmującej aktywowany ester, jak opisano powyżej lub grupę karboksy, która jest ewentualnie przekształcona w aktywowany ester, a grupa funkcyjna Z2 lub grupa funkcyjna W jest wybrana z grupy obejmującej:
W której G oznacza O lub S i, jeśli występuje dwukrotnie, oznacza niezależnie O lub S, a R oznacza metyl. Według szczególnie korzystnego wykonania, niniejszy wynalazek dotyczy pochodnej hydroksyalkiloskrobi, jak opisano powyżej, w której redukujący koniec hydroksyalkiloskrobi nie jest utleniony przed reakcją ze związkiem (D) lub związkiem (L), przy czym wspomniana hydroksyalkiloskrobia ma strukturę według wzoru (I):
PL 216 545 B1
Niniejszym ujawniono także hydroksyalkiloskrobię, w której redukujący koniec hydroksyalkiloskrobi jest utleniony przed reakcją ze związkiem (D) lub związkiem (L), a wspomniana hydroksyalkiloskrobia ma strukturę według wzoru (IIa):
i/lub według wzoru (IIb):
Redukujący koniec może być utleniony przez zasadowy roztwór jodu.
Według dalszego korzystnego wykonania, niniejszy wynalazek dotyczy pochodnej hydroksyalkiloskrobi, jak opisano powyżej, w której hydroksyalkiloskrobia jest poddana reakcji ze związkiem (L) poprzez reakcję grupy funkcyjnej Z1 z nie utlenionym redukującym końcem hydroksyalkiloskrobi i uzyskany produkt reakcji jest poddany reakcji z dalszym związkiem (M) poprzez reakcję grupy funkcyjnej X zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną Y zawartą w związku (M).
Według jeszcze dalszego korzystnego wykonania, niniejszy wynalazek dotyczy pochodnej hydroksyalkiloskrobi, jak opisano powyżej, w której hydroksyalkiloskrobia jest poddana reakcji ze związkiem (L) poprzez reakcję grupy funkcyjnej Z1 z nie utlenionym redukującym końcem hydroksyalkiloskrobi, gdzie związek (L), przed reakcją z hydroksyalkiloskrobią, jest poddany reakcji z dalszym związkiem (M) poprzez reakcję grupy funkcyjnej X zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną Y zawartą w związku (M).
Według jeszcze dalszego korzystnego wykonania, niniejszy wynalazek dotyczy pochodnej hydroksyalkiloskrobi, jak opisano powyżej, w której hydroksyalkiloskrobia jest poddana reakcji ze związkiem (D) poprzez reakcję grupy funkcyjnej Z1 zawartej W związku (D), z nie utlenionym redukującym końcem hydroksyalkiloskrobi dając pierwszą pochodną hydroksyalkiloskrobi i gdzie pierwsza pochodna hydroksyalkiloskrobi jest poddana reakcji ze związkiem (L) poprzez reakcję grupy funkcyjnej Z2 zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną W zawartą w związku (D) dając drugą pochodną hydroksyalkiloskrobi.
Według szczególnie korzystnego wykonania, niniejszy wynalazek dotyczy uprzednio wspomnianej pochodnej i hydroksyalkiloskrobi, w której druga pochodna hydroksyalkiloskrobi jest poddana reakcji z dalszym związkiem (M) poprzez reakcję grupy funkcyjnej X zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną Y zawartą w związku (M).
PL 216 545 B1
Według dalszego korzystnego wykonania, niniejszy wynalazek dotyczy pochodnej hydroksyalkiloskrobi, jak opisano powyżej, w której hydroksyalkiloskrobia jest poddana reakcji ze związkiem (D) poprzez reakcję grupy funkcyjnej Z1 zawartej w związku (D) z nie utlenionym redukującym końcem hydroksyalkiloskrobi dając pierwszą pochodną hydroksyalkiloskrobi i gdzie pierwsza pochodna hydroksyalkiloskrobi jest poddana reakcji, poprzez reakcję grupy funkcyjnej W, zawartej w związku (D) i grupy funkcyjnej Z2, zawartej w związku (L), ze związkiem (L), gdzie związek (L), przed reakcją z pierwszą pochodną hydroksyalkiloskrobi jest poddany reakcji z dalszym związkiem (M) poprzez reakcję grupy funkcyjnej X zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną Y zawartą w związku (M).
Według szczególnie korzystnego wykonania, niniejszy wynalazek dotyczy pochodnej hydroksyalkiioskrobi, jak opisano powyżej, w której co najmniej jeden dalszy związek (M) jest polipeptydem.
Według szczególnie korzystnego wykonania, niniejszy wynalazek dotyczy pochodnej hydroksyalkiloskrobi, jak opisano powyżej, w której polipeptydem jest erytropoetyna.
Pochodna hydroksyalkiioskrobi, która poniżej jest zwana koniugatem HAS-EPO i która jest tworzona przez reakcję hydroksyalkiioskrobi ze związkiem (L) i ewentualnie związkiem (D) i erytropoetyną, ma tę zaletę, że wykazuje zwiększoną stabilność biologiczną w porównaniu z erytropoetyną przed koniugacją. Ponadto, wykazuje wyższą aktywność biologiczną niż BRP - wzorzec EPO. Ma to miejsce głównie wskutek faktu, że ta pochodna hydroksyalkiloskrobi jest mniej rozpoznawana lub nawet nierozpoznawana przez układy usuwające wątroby i nerek, a zatem pozostaje w układzie krążenia przez dłuższy okres czasu. Ponadto, ponieważ HAS jest przyłączany specyficznie względem miejsca, ryzyko zniszczenia aktywności biologicznej in vivo EPO przez koniugację HAS do EPO jest zminimalizowane.
Koniugat HAS-EPO według wynalazku może wykazywać zasadniczo tę samą aktywność biologiczną in vitro co rekombinacyjny rodzimy EPO, ponieważ aktywność biologiczna in vitro mierzy jedynie powinowactwo wiązania do receptora EPO. Metody określania aktywności biologicznej in vitro są znane według stanu techniki.
Ponadto, HAS-EPO wykazuje większą aktywność in vivo niż EPO stosowane jako materiał wyjściowy do koniugacji (nieskoniugowana EPO). Metody określania aktywności biologicznej in vivo są znane według stanu techniki.
Koniugat HAS-EPO może wykazywać aktywność in vivo od 110% do 500%, korzystnie od 300 do 400% lub korzystnie od 110 do 300%, korzystniej od 110% do 200%, korzystniej od 110% do 180% lub od 110 do 150%, najkorzystniej od 110% do 140%, jeśli aktywność in vivo nie skoniugowanej EPO jest określona jako 100%.
W porównaniu z wysoce sialilowaną EPO firmy Amgen (patrz: EP nr 428 267 B1), HAS-EPO wykazuje korzystnie co najmniej 50%, korzystniej co najmniej 70%, jeszcze korzystniej co najmniej 85% lub co najmniej 95%, co najmniej 150%, co najmniej 200% lub co najmniej 300% aktywności in vivo wysoce sialilowanej EPO, jeśli aktywność in vivo wysoce sialilowanej EPO jest określona jako 100%. Najkorzystniej, wykazuje co najmniej 95% aktywności in vivo wysoce sialilowanej EPO.
Wysoka aktywność biologiczna in vivo koniugatu HAS-EPO według wynalazku wynika głównie z faktu, że koniugat HAS-EPO pozostaje dłużej w krążeniu niż nie skoniugowana EPO, ponieważ jest mniej rozpoznawane przez układy usuwania wątroby i ponieważ kiirens nerkowy jest obniżony wskutek wyższej masy cząsteczkowej. Metody oznaczania czasu półtrwania in vivo EPO w krążeniu są znane według stanu techniki (Sytkowski, Lunn, Davis, Feldman, Siekman, 1998, Human erythropoietin dimers with markedly enhanced in vivo activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 (3), 1184-8).
W konsekwencji, dużą korzyścią niniejszego wynalazku jest to, że jest dostarczony koniugat HAS-EPO, który może być podawany mniej często niż preparaty EPO dostępne handlowo w chwili obecnej. Podczas gdy standardowe preparaty EPO muszą być podawane co najmniej co 3 dni, koniugat HAS-EPO według wynalazku jest korzystnie podawany dwukrotnie na tydzień, korzystniej raz na tydzień.
Ponadto, sposób według wynalazku ma tę zaletę, że skuteczną pochodną EPO można wytwarzać po obniżonych kosztach, ponieważ sposób nie obejmują dokładnych i czasochłonnych etapów oczyszczania prowadząc do niskiej wydajności końcowej, np. nie jest niezbędne oczyszczanie z nie całkowicie sialilowanych form EPO, co do których wiadomo, że wykazują niską lub nie wykazują wcale aktywności biologicznej in vivo. Zwłaszcza przykład 8,11 (d) pokazuje, że HES-EPO wytwarzany z niewieloma etapami modyfikacji wykazuje 3-krotną aktywność względem standardowej EPO BRP.
Jeszcze innym przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie kompozycji farmaceutycznej, która obejmuje, w ilości terapeutycznie skutecznej, koniugat HAS-EPO według niniejszego wynalazku.
PL 216 545 B1
Ponadto, niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej obejmującej, w ilości terapeutycznie skutecznej, koniugat HAS-polipeptyd, korzystnie koniugat HAS- EPO, korzystniej koniugat HES-EPO według niniejszego wynalazku. W korzystnym wykonaniu kompozycja farmaceutyczna obejmuje ponadto co najmniej jeden farmaceutycznie dopuszczalny rozcieńczalnik, adiuwant i/lub nośnik przydatny w terapii erytropoetyną.
Zatem, niniejszy wynalazek dotyczy także kompozycji farmaceutycznej obejmującej, w ilości terapeutycznie skutecznej, pochodną hydroksyalkiloskrobi otrzymywaną sposobem wytwarzania pochodnej hydroksyalkiloskrobi, przy czym wspomniana hydroksyalkiloskrobia ma strukturę według wzoru (I):
obejmującym poddanie reakcji:
- hydroksyalkiloskrobi o wzorze (I) przy jej nieutlenionym redukującym końcu lub
- pochodnej hydroksyalkiloskrobi, otrzymywanej przez poddanie reakcji hydroksyalkiloskrobi o wzorze (I) przy jej nie utlenionym redukującym końcu ze związkiem (D), przy czym wspomniany związek (D) obejmuje:
- co najmniej jedną grupę funkcyjną Z1 zdolną do reagowania z nieutlenionym redukującym końcem hydroksyalkiloskrobi i
- co najmniej jedną grupę funkcyjną W, ze związkiem (L) obejmującym
- co najmniej jedną grupę funkcyjną Z1 zdolną do reagowania ze wspomnianą hydroksyalkiloskrobią lub co najmniej jedną grupę funkcyjną Z2 zdolną do reagowania z grupą funkcyjną W zawartą we wspomnianej pochodnej hydroksyalkiloskrobi i
- co najmniej jedną grupę funkcyjną X zdolną do reagowania z grupą funkcyjną Y dalszego związku (M), przy czym wspomniana grupa funkcyjna Y jest wybrana z grupy obejmującej grupę aldehydową, grupę ketonową, grupę hemiacetalową, grupę acetalową lub grupę tio, a wspomniany sposób wytwarzania pochodnej hydroksyalkiloskrobi ponadto obejmuje poddanie reakcji produktu reakcji obejmującego hydroksyalkiloskrobię, związek (L) i ewentualnie związek (D) z dalszym związkiem (M), przy czym co najmniej jeden dalszy związek jest polipeptydem.
Ponadto, niniejszy wynalazek dotyczy stosowania pochodnej hydroksyalkiloskrobi, jak opisano dla preparatu środka leczniczego dla leczenia chorób niedokrwistości lub dysfunkcji hematopoetycznej lub chorób pokrewnych.
Według korzystnego wykonania, niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej, jak opisano powyżej, w której polipeptyd jest antytrombiną (AT), korzystnie AT III (Levy J. H., Weisinger A., Ziomek C. A., Echelard Y., Recombinant Antithrombin: Production and Role In Cardiovascular Disorder, Seminars in Thrombosis and Hemostasis 27, 4 (2001) 405-416; Edmunds T., Van Patten S. M., Pollock J., Hanson E., Bernasconi R., Higgins E., Manavalan P., Ziomek C., Meade H., McPherson J., Cole E. S., Transgenically Produced Human Antithrombin: Structural and Functional Comparison to Human Plasma-Derived Antithrombin, Blood 91, 12 (1998) 4661-4671; Minnema M. C., Chang A. C. K., Jansen P. M., Lubbers Y. T. P. Pratt B. M., Whittaker B. G., Taylor F. E., Hack C. E., Friedman B., Recombinant human antithrombin III improves survival and attenuates inflammatory responses in baboons Iethally challenged with Escherichia coli. Blood 95, 4 (2000) 1117-1123; Van Patten S. M., Hanson E. H., Bernasconi R., Zhang, Manavaln P., Cole E. S., McPherson J. M., Edunds T., Oxidation of Methionine Residues in Antithrombin, J. Biol. Chemistry 274, 15 (1999) 10268-10276).
Według innych korzystnych wykonań, niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznych, w których polipeptydem jest G-CSF lub IFN-beta.
Według szczególnie korzystnego wykonania, niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej, jak opisano powyżej, w której polipeptydem jest erytropoetyna.
PL 216 545 B1
Według dalszego wykonania, niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej, jak opisano powyżej, w której grupa funkcyjna Y oznacza -SH i związek (L) jest związkiem o wzorze ogólnym Z1-L'-X, gdzie grupa funkcyjna Z1 jest wybrana z grupy obejmującej:
w której G oznacza O lub S i, jeśli występuje dwukrotnie, oznacza niezależnie O lub S, a R' oznacza metyl i gdzie grupa funkcyjna X jest wybrana z grupy obejmującej:
w której Hal oznacza Cl, Br lub I i gdzie L' oznacza organiczny łańcuch mostkujący Z1 i X lub gdzie L' jest nieobecne.
Według wykonania, niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej, jak opisano powyżej, w której grupa funkcyjna Y jest wybrana z grupy obejmującej grupę aldehydową, grupę ketonową, grupę hemiacetalową i grupę acetalową, i związek (L) jest związkiem o wzorze ogólnym Z1-L'-X, gdzie grupa funkcyjna Z1 jest wybrana z grupy obejmującej:
PL 216 545 B1 w której G oznacza O lub S i, jeśli występuje dwukrotnie, oznacza niezależnie O lub S, a R' oznacza metyl, i gdzie grupa funkcyjna X jest wybrana z grupy obejmującej:
w której G oznacza O lub S i, jeśli występuje dwukrotnie, oznacza niezależnie O lub S, a R' oznacza metyl, i gdzie L' oznacza organiczny łańcuch mostkujący Z1 i X lub gdzie L' jest nieobecne.
Według innego wykonania, niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej, jak opisano powyżej, w której grupa funkcyjna Y oznacza -SH, związek (D) jest związkiem o wzorze ogólnym
Z1-D'-W i związek (L) jest związkiem o wzorze ogólnym Z2-L'-X, gdzie grupa funkcyjna Z1 jest wybrana z grupy obejmującej:
w której G oznacza O lub S i, jeśli występuje dwukrotnie, oznacza niezależnie O lub S, a R' oznacza metyl, gdzie grupa funkcyjna X jest wybrana z grupy obejmującej:
PL 216 545 B1 w której Hal oznacza Cl, Br lub I, gdzie grupa funkcyjna W lub grupa funkcyjna Z2 oznacza -SH, a grupa funkcyjna Z2 lub grupa funkcyjna W jest wybrana z grupy obejmującej:
w której Hal oznacza Cl, Br lub I lub gdzie grupa funkcyjna W lub grupa funkcyjna Z2 jest wybrana z grupy obejmującej aktywowany ester, jak opisano powyże, lub grupę karboksy, która jest ewentualnie przekształcona w aktywowany ester i grupa funkcyjna Z2 lub grupa funkcyjna W jest wybrana z grupy obejmującej:
w której G oznacza O lub S I, jeśli występuje dwukrotnie, oznacza niezależnie O lub S, a R' oznacza metyl i gdzie D' jest organicznym łańcuchem mostkującym Z1 i W lub gdzie D' jest nieobecne i gdzie L' jest organicznym łańcuchem mostkującym Z2 i X lub gdzie L' jest nieobecne.
Według jeszcze innego wykonania, niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej, jak opisano powyżej, w której grupa funkcyjna Y jest wybrana z grupy obejmującej grupę aldehydową, grupę ketonową, grupę hemiacetalową i grupę acetalową, związek (D) jest związkiem o wzorze ogólnym Z1-D'-W i związek (L) jest związkiem o wzorze ogólnym Z2-L'-X, gdzie grupa funkcyjna Ζ1 jest wybrana z grupy obejmującej:
PL 216 545 B1 w której G oznacza O lub S i, jeśli występuje dwukrotnie, oznacza niezależnie O lub S, a R' oznacza metyl, gdzie grupa funkcyjna X jest wybrana z grupy obejmującej:
w której G oznacza O lub S i, jeśli występuje dwukrotnie, oznacza niezależnie O lub S, a R' oznacza metyl, grupa funkcyjna W lub grupa funkcyjna Z2 oznacza -SH, a grupa funkcyjna Z2 lub grupa funkcyjna W jest wybrana z grupy obejmującej:
w której Hal oznacza Cl, Br lub I lub gdzie grupa funkcyjna W lub grupa funkcyjna Z2 jest wybrana z grupy obejmującej aktywowany ester, jak opisano powyżej, lub grupę karboksy, która jest ewentualnie przekształcona w aktywowany ester i grupa funkcyjna Z2 lub grupa funkcyjna W jest wybrana z grupy obejmującej:
ο η2ν^ II Ν—SΗ || ο
PL 216 545 B1 w której G oznacza O lub S i, jeśli występuje dwukrotnie, oznacza niezależnie O lub S, a R' oznacza metyl i gdzie D' oznacza organiczny łańcuch mostkujący Z1 i W lub gdzie D' jest nieobecne i gdzie L' jest organicznym łańcuchem mostkującym Z2 i X lub gdzie L' jest nieobecne.
Według szczególnie korzystnego wykonania, niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej, jak opisano powyżej, w której hydroksyetyloskrobia jest poddana reakcji w ośrodku wodnym ze związkiem według następującego wzoru:
i produkt reakcji jest poddany reakcji z erytropoetyną.
Według jeszcze bardziej korzystnego wykonania, niniejszy wynalazek dotyczy wyżej wspomnianej kompozycji farmaceutycznej, w której erytropoetyna jest przed reakcją utleniona nadjodanem sodu.
Według dalszego korzystnego wykonania, niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej, jak opisano powyżej, w której erytropoetyną jest częściowo desialilowana i następnie przed reakcją jest utleniona nadjodanem sodu.
Według dalszego korzystnego wykonania niniejszego wynalazku, są wykluczone kompozycje obejmujące pochodną hydroksyalkiloskrobi, które są wytwarzane na podstawie zupełnie zredukowanego Tio-EPO według przykładu 6.
Wyżej wspomniana kompozycja farmaceutyczna jest zwłaszcza odpowiednia w leczeniu chorób niedokrwistości lub dysfunkcji hematopoetycznej, lub chorób pokrewnych.
„Terapeutycznie skuteczna ilość” tak jak jest to stosowane w niniejszym zgłoszeniu odnosi się do takiej ilości, która dostarcza efekt terapeutyczny dla danego stanu i trybu podawania. Podawanie izoform erytropoetyny korzystnie odbywa się pozajelitowo. Szczególna droga wybrana będzie zależeć od stanu poddawanego leczeniu. Podawanie izoform erytropoetyny korzystnie jest wykonywane jako część preparatu zawierającego odpowiednie nośnik, taki jak albumina surowicy ludzkiej, odpowiedni rozcieńczalnik, taki jak buforowany roztwór soli i/lub odpowiednie adiuwant.
Wymagane dawkowane będzie w ilościach wystarczających do podniesienia hematokrytu chorych i będzie ulegać zmianie zależnie od ciężkości leczonego stanu, stosowanego sposobu podawania, itp. Celem leczenia kompozycją farmaceutyczną według wynalazku jest korzystnie wzrost wartości hemoglobiny do ponad 6,8 mmol/l we krwi. W tym celu, kompozycja farmaceutyczna może być podawana w taki sposób, że wartość hemoglobiny wzrasta między 0,6 mmol/l i 1,6 mmol/I na tydzień. Jeśli wartość hemoglobiny przekracza 8,7 mmol/l, leczenie powinno być korzystnie przerwane aż wartość hemoglobiny będzie poniżej 8,1 mmol/l.
Kompozycja według wynalazku jest korzystnie stosowana w preparacie odpowiednim do iniekcji podskórnej lub dożylnej, lub pozajelitowej. W tym celu, odpowiednimi zaróbkami i nośnikami są np. diwodorofosforan sodu, wodorofosforan disodowy, chloran sodu, polisorbat 80, HSA i woda do iniekcji. Kompozycja może być podawana trzy razy na tydzień, korzystnie dwa razy na tydzień, korzystniej raz na tydzień i najkorzystniej co dwa tygodnie.
Korzystnie, kompozycja farmaceutyczna jest podawana w ilości 0,01-10 μg/kg wagi ciała pacjenta, korzystniej 0,1 do 5 μg/kg, 0,1 do 1 μg/kg lub 0,2-0,9 μg/kg, najkorzystniej 0,3-0,7 μg/kg i najkorzystniej 0,4-0,6 μg/kg wagi ciała. Zazwyczaj, korzystnie podaje się między 10 μg i 200 μg, korzystnie między 15 μg i 100 μg na dawkę.
Wynalazek ponadto dotyczy polipeptydu HAS według niniejszego wynalazku do stosowania w sposobie leczenia organizmu ludzkiego lub zwierzęcego.
Wynalazek ponadto dotyczy zastosowania koniugatu HAS-EPO według niniejszego wynalazku dla wytwarzania środka leczniczego dla leczenia chorób niedokrwistości lub dysfunkcji hematopoetycznej lub chorób pokrewnych.
W przypadku, gdy związek (L) stosowany według niniejszego wynalazku obejmuje jeden lub więcej centrów chiralnych, związek (II) może być obecny w konformacji R lub w konformacji S, lub jako związek racemiczny względem każdego centrum chiralnego.
W przypadku, gdy związek (D) ewentualnie stosowany w niniejszym wynalazku obejmuje jedno lub więcej centrów chiralnych, związek (D) może być obecny w konformacji R lub w konformacji S, lub jako racemiczny związek względem każdego centrum chiralnego.
PL 216 545 B1
Wynalazek jest dalej zilustrowany przez poniższe przykłady, tabele i figury, które w żaden sposób w zamierzeniu nie ograniczają zakresu niniejszego wynalazku.
Krótki opis figur Figura 1
Figura I przedstawia analizę SDS-PAGE koniugatu HES-EPO, wytwarzanego według przykładu 5.1.
Pasek A: marker protein Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe, D); masy cząsteczkowe (w kDa) markera protein od góry do dołu: 245, 123, 77, 42, 30, 25,4 i 17.
Pasek B: surowy produkt po koniugacji według przykładu 5.1.
Pasek C: materiał wyjściowy EPO.
Figura 2
Figura 2 przedstawia analizę SDS-PAGE koniugatu HES-EPO, wytwarzanego według przykładu 5.3.
Pasek A: surowy produkt po koniugacji według przykładu 5.3.
Pasek B: materiał wyjściowy EPO.
Pasek C: marker protein Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe, D); masy cząsteczkowe (w kDa) markera protein od góry do dołu; 245, 123, 77, 42, 30, 25,4 i 17.
Figura 3
Figura 3 przedstawia analizę SDS-PAGE koniugatu HES-EPO, wytwarzanego według przykładu 5.4 i 5,5.
Pasek A: marker protein Roti®-Mark PRESTAINED (Carl RothGmbH + Co, Karlsruhe, D); masy cząsteczkowe (w kDa) markera protein od góry do dołu: 245, 123, 77, 42, 30, 25,4 i 17.
Pasek B: surowy produkt po koniugacji według przykładu 5.4.
Pasek C: surowy produkt po koniugacji według przykładu 5.5.
Pasek D: materiał wyjściowy EPO.
Figura 4
Figura 4 przedstawia analizę SDS-PAGE koniugatów HES-EPO, wytwarzanych według przykładów 7.1 i 7,4.
Pasek A: marker protein Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe, D); masy cząsteczkowe (w kDa) markera protein od góry do dołu: 245, 123, 77, 42, 30, 25,4 i 17.
Pasek B: surowy produkt po koniugacji według przykładu 7.4.
Pasek C: surowy produkt po koniugacji według przykładu 7.1.
Pasek D: materiał wyjściowy EPO.
Figura 5
Figura 5 przedstawia analizę SDS-PAGE koniugatów HES-EPO, wytwarzanych według przykładów 7.2, 7.3, 7.5, i 7.6.
Pasek A: marker protein Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe, D); masy cząsteczkowe (w kDa) markera protein od góry do dołu: 245, 123, 77, 42, 30, 25,4 I 17.
Pasek B: surowy produkt po koniugacji według przykładu 7.6, w oparciu o przykład 1.3 b).
Pasek C: surowy produkt po koniugacji według przykładu 7.5, w oparciu o przykład 1.1 b).
Pasek D: surowy produkt po koniugacji według przykładu 7.6, w oparciu o przykład 1.3 a).
Pasek E: surowy produkt po koniugacji według przykładu 7.5, w oparciu o przykład 1.1 a).
Pasek F: surowy produkt po koniugacji według przykładu 7.2.
Pasek G: surowy produkt po koniugacji według przykładu 7.3.
Pasek K: materiał wyjściowy EPO.
Figura 6
Figura 6 przedstawia analizę SDS-PAGE koniugatów HES-EPO, wytwarzanych według przykładów 7,7, 7,8, 7,9, 7,10, 7,11 i 7,12.
Pasek A: marker protein Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe, D); masy cząsteczkowe (w kDa) markera protein od góry do dołu: 245, 123, 77, 42, 30, 25,4 i 17.
Pasek B: surowy produkt po koniugacji według przykładu 7.11.
Pasek C: surowy produkt po koniugacji według przykładu 7.10.
Pasek D: surowy produkt po koniugacji według przykładu 7.7.
Pasek E: surowy produkt po koniugacji według przykładu 7.8.
Pasek F: surowy produkt po koniugacji według przykładu 7.12.
PL 216 545 B1
Pasek G: materiał wyjściowy EPO.
Pasek K: surowy produkt po koniugacji według przykładu 7.9.
Figura 7
Analizy SDS-PAGE EPO-GT-1 poddanego łagodnemu działaniu kwasu przez 5 min. = pasek 2; 10 min. = pasek 3; 60 min. = pasek 4 i EPO nie poddanej działaniu = pasek 1; przedstawiono przesunięcie ruchliwości EPO po usuwaniu N-glikanów (+ PNGASE).
Figura 8
Szablon HPAEC-PAD oligosacharydów wyodrębnionych z EPO nie poddanej działaniu i z EPO inkubowanej przez 5 min, 10 min i 60 min. w warunkach łagodnej hydrolizy kwasowej. Liczby rzymskie I-V wskazują pozycję wymywania; I = desialilowana struktura diantenarna, II = trisialilowane struktury triantenarne (dwa izomery), III = tetrasialilowana struktura tetraantenarna + powtórzenia 2N-acetylolaktozaminy, IV = tetrasialilowana struktura tetraantenarna + powtórzenie 1N-acetylolaktozaminy; V = tetrasialilowana struktura tetraantenarna + bez powtórzenia N-acetylolaktozaminy. Obszar wymywania struktur oligosacharydów bez, z kwasem 1-4 sialowym wskazano przez nawiasy.
Figura 9
HPAEC-PAD N-połączonych oligosacharydów po desialilowaniu; pokazano pozycję wymywania kwasu N-acetyloneuraminowego; liczby 1-9 wskazują pozycję wymywania standardowych oligosacharydów: 1 = diantenarny; 2 = triantenarny (izomer 2-4), 3 = triantenarny (izomer 2-6); 4 = tetraantenarny; 5 = triantenarny plus i powtórzenie; 6 = tetraantenarny plus i powtórzenie; 7 = triantenarny plus 2 powtórzenia; 8 = tetraantenarny plus 2 powtórzenia i 9 = tetraantenarny plus 3 powtórzenia.
Figura 10
Analiza SDS-PAGE EPO poddanego łagodnemu działaniu i EPO nie poddanej działaniu, którą poddano utlenianiu nadjodanem reszt kwasu sialowego. 1 = utleniana nadjodanem bez działania kwasem; 2 = utleniana nadjodanem, 5 min. działania kwasem; 3 = utleniana nadjodanem i działanie kwasem 10 min; 4 = utleniana nadjodanem bez działania kwasem; 5 = BRP - wzorzec EPO bez nadjodanu i bez działania kwasem.
Figura 11
Szablon HPAEC-PAD rodzimych oligosacharydów wyodrębnionych z EPO nie poddanej działaniu i z EPO inkubowanej przez 5 min i 10 min w warunkach łagodnej hydrolizy kwasowej i następnie działania nadjodanem. Obszar wymywania struktur oligosacharydów bez i z 1-4 kwasem sialowym wskazano przez nawiasy 1-5.
Figura 12
Analiza SDS-PAGE przebiegu czasowego modyfikacji HES EPO-GT-1-A: 20 μg próbki EPO-GT-1-A poddano reakcji z modyfikowaną hydroksyloaminą pochodną HES X przez 30 min, 2, 4 i 17 godz. Pasek 1 = 30 min czas reakcji; pasek 2 = 2 h czas reakcji; pasek 3 = 4 godz czas reakcji; pasek 4 = 17 godz czas reakcji; pasek 5 = EPO-GT-1-A bez modyfikacji HES. Lewa figura przedstawia przesunięcie ruchliwości EPO-GT-1-A wraz ze zwiększaniem czasu inkubacji w obecności modyfikowanej hydroksyloaminą pochodnej HES (szybkość przepływu: 1 ml-min-1) X: pasek 1 = 30 min czas reakcji; pasek 2 = 2 godz czas reakcji; pasek 3= 4 godz czas reakcji, psek 4 = 17 godz czas reakcji; pasek 5 = EPO-GT-1-A z modyfikacją HES. Figura po prawej przedstawia analizę tych samych próbek po działaniu N-glikozydazą.
Figura 13
Analiza SDS-PAGE frakcji Q-Sepharose koniugatów HES-EPO. Każdy 1% przepływu i 1% frakcji wymywanej przy wysokich stężeniach soli zatężono w zatężaczu Speed Vac i wprowadzono na żele w buforze próbki. Proteinę EPO wybarwiono za pomocą Coomassie Blue. A = próbka I; B = próbka II; C = próbka III; K = próbka kontrolna EPO-GT-1; A1, B1, C1 i K1 wskazały frakcję nie wiązaną; A2, B2, C2 i K2 wskazuje frakcję wymywaną przy wysokim stężeniu soli.
Figura 14a
Analiza SDS-PAGE modyfikowanej HES próbki EPO A2 (patrz: fig. 13), próbka kontrolna EPO K2 i preparat EPO EPO-GT-1-A wytrawiono w obecności N-glikozydazy aby usunąć N-połączone oligosacharydy. Wszystkie próbki EPO pokazały przesunięcie ruchliwości w kierunku form o niskiej masie cząsteczkowej nie zawierających lub zawierających O-glikan. Niższy stosunek pasma proteiny
O-glikozylowanej i nieglikozylowanej zaobserwowano dla modyfikowanej HES próbki EPO A2 po de-N-glikozylacji i rozmyte pasmo proteiny wykryto wokół 30 kDa, które prawdopodobnie odpowiadało modyfikacji HES przy kwasie sialowym reszty O-glikanowej (patrz: strzałka oznaczona gwiazdką).
PL 216 545 B1
Figura 14b
Analiza SDS-PAGE po łagodnej hydrolizie modyfikowanej HES próbki EPO A2 (patrz: fig. 13), próbka kontrolna EPO K2 i EPO-GT-1A, których nie poddano działaniu lub trawieniu w obecności N-glikozydazy, aby usunąć N-połączone oligosacharydy (patrz: figura 14a). Zarówno forma o wysokiej masie cząsteczkowej A2 przed i A po działaniu N-glikozydazą (patrz: nawiasy z i bez strzałki) znikły po działaniu kwasem na próbki. Wzorzec EPO - BRP, który wprowadzono dla porównania nie był poddany łagodnemu działaniu kwasem.
Figura 15
Analiza HPAEC-PAD materiału N-połączonych oligosacharydów wyzwolonego z modyfikowanej HES próbki A, z EPO-GT-1-A i z próbki kontrolnej EPO inkubowanej niemodyfikowanym HES (K). Liczby rzymskie I-V wskazują pozycję wymywania: I = disialilowana struktura diantenarna, II = trisialilowane struktury triantenarne (dwa izomery), III = tetrasialilowana struktura tetraantenarna + 2 powtórzenia N-acetylolaktozaminy, IV = tetrasialilowana struktura tetraantenarna + 1 powtórzenie N-acetylolaktozaminy, V = tetrasialilowana struktura tetraantenarna + bez powtórzenia N-acetylolaktozaminy; nawiasy wskazują obszar wymywania N-glikanów di-, tri- i tetrasialilowanych, jak podano w objaśnieniach fig. 6 1 9.
Figura 16
Analiza HPAEC-PAD materiału N-połączonego oligosacharydu wyzwolonego z modyfikowanej HES próbki A, z EPO-GT-1A i z próbki kontrolnej EPO (K) inkubowanej niemodyfikowanym HES. Podano czasy retencji mieszaniny standardowych oligosacharydów: liczby 1-9 wskazują pozycję wymywania standardowych oligosacharydów: 1 = diantenarny; 2 = triantenarny (izomer 2-4); 3 = triantenarny (izomer 2-6); 4 = tetraantenarny; 5 = triantenarny plus I powtórzenie; 6 = tetraantenarny plus i powtórzenie; 7 = triantenarny plus 2 powtórzenia; 8 = tetraantenarny plus 2 powtórzenia 19 = tetraantenarny plus 3 powtórzenia.
Figury 17 do 23
Figury 17 do 23 przedstawiają widma masowe MALDI/TOF wyzwolonych enzymatycznie i desialilowanych chemicznie N-glikanów wyodrębnionych z preparatów; modyfikowanej HES EPO i kontrolnej EPO. Główne sygnały przy m/z 1809,7, 2174,8, 2539,9, 2905,0 i 3270,1 ([M + Na]+) odpowiadają strukturom N-glikanu typu kompleksu di- do tetraantenarnego bez, z jednym lub dwoma powtórzeniami N-acetylolaktozaminy, czemu towarzyszą słabe sygnały wskutek utraty fukozy lub galaktozy, wskutek warunków hydrolizy kwasowej zastosowanych do desialilowania próbek do analizy MS.
Figura 17 - widmo MALDI/TOF; desialilowane oligosacharydy modyfikowanego HES EPO A2.
Figura 18 - widmo MALDI/TOF; desialilowane oligosacharydy EPO GT-1-A.
Figura 19 - widmo MALDI/TOF; desialilowany oligosacharydy EPO K2.
Figura 20 - widmo MALDI/TOF: desialilowane oligosacharydy EPO-GT-1.
Figura 21 - widmo MALDI/TOF: desialilowane oligosacharydy EPO-GT-1 poddane hydrolizie kwaśnej przez 5 min.
Figura 22 - widmo MALDI/TOF: desialilowane oligosacharydy EPO-GT-1 poddane hydrolizie kwaśnej przez 10 min.
Figura 23 - widmo MALDI/TOF; desialilowane oligosacharydy EPO-GT-1 poddane hydrolizie kwaśnej przez 60 min.
Figura 24
Figura 24 przedstawia analizę SDS-PAGE dwóch koniugatów HES- EPO;
mw: marker;
Pasek 1: HES-EPO wytwarzane według przykładowego protokołu 8: EPO jest skoniugowane z hydrazydo-HES 12KD L;
Pasek 2: HES-EPO wytwarzane według przykładowego protokołu 9: EPO jest skoniugowane z hydroksyloamino-HES 12 KD K;
C: próbka kontrolna (nie skoniugowana EPO); górne pasmo przedstawia dimer EPO.
Figura 25
Figura 25 pokazuje, że HES jest skoniugowane z ugrupowaniem węglowodanowym węglowodanowego łańcucha bocznego przez pokazanie trawienia form EPO modyfikowanych przez HAS N-glikozydazą polipeptydową.
Pasek 1: HES-EPO wytwarzane według przykładowego protokołu 8 po trawieniu N-glikozydazą.
Pasek 2: HES-EPO wytwarzane według przykładowego protokołu 9 po trawieniu N-glikozydazą.
PL 216 545 B1
Pasek 3: Wzorzec EPO-BRP.
Pasek 4: Wzorzec EPO-BRP po trawieniu N-glikozydazą.
mw: marker (Bio-Rad - wzorce o niskim zakresie SDS-PAGE, catalog no 161-0305, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).
P r z y k ł a d y P r z y k ł a d 1
Tworzenie pochodnych hydroksyetyloskrobi przez aminowanie redukcyjne nie utlenionego redukującego końca
P r z y k ł a d 1.1
Reakcja hydroksyetyloskrobi z 1,3-diamino-2-hydroksypropanem
a) Do roztworu 200 mg hydroksyetyloskrobi (HES18/0,4 (m. cz. = 18000 Da, DS = 0,4)) w 5 ml wody dodano 0,83 mmoli 1,3-diamino-2-hydroksypropanu (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) i 50 mg cyjanoborowodorku sodu NaCNBH3. Uzyskaną mieszaninę inkubowano w 80°C przez 17 h. Mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml zimnej mieszaniny 1:1 acetonu i etanolu (v/v). Osad zebrano przez odwirowanie i dializowano przez 4 dni względem wody (rurka do dializy SnakeSkin, próg 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) i liofilizowano.
b) Inkubacja mieszaniny powstałej przez dodanie 0,83 mmoli 1,3-diamino-2-hydroksypropanu i 50 mg cyjanoborowodorku sodu NaCNBH3 do roztworu 200 mg hydroksyetyloskrobi także była możliwa i została wykonana w 25°C przez 3 dni.
P r z y k ł a d 1.2
Reakcja hydroksyetyloskrobi z 1,2-dihydroksy-3-aminopropanem
OH
a) Do roztworu 200 mg hydroksyetyloskrobi (HES18/0,4 (m. cz.= 18000 Da, DS. = 0,4)) w 5 ml wody, dodano 0,83 mmoli 1,2-dihydroksy-3-aminopropanu (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) i 50 mg cyjanoborowodorku sodu NaCNBH3. Uzyskaną mieszaninę inkubowano w 80°C przez 17 h. Mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml zimnej mieszaniny 1:1 acetonu i etanolu (v/v). Osad zebrano przez odwirowanie I dializowano przez 4 dni względem wody (rurka do dializy SnakeSkin, próg 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) i liofilizowano.
b) Inkubacja mieszaniny powstałej przez dodanie 0,83 mmoli 1,2-dihydroksy-3-aminopropanu i 50 mg cyjanoborowodorku sodu NaCNBH3 do roztworu 200 mg hydroksyetyloskrobi także była możliwa i została wykonana w 25°C przez 3 dni. Reakcję 1,2-dihydroksy-3-aminopropanu z HES potwierdzono pośrednio przez oznaczenie ilościowe formaldehydu, powstałego w wyniku utleniającego rozszczepienia 1,2-diolu w produkcie reakcji za pomocą nadjodanu jak opisano w G. Avigad, Anal. Biochem. 134 (1983) 449-504.
P r z y k ł a d 1.3
Reakcja hydroksyetyloskrobi z 1,4-diaminobutanem
a) Do roztworu 200 mg hydroksyetyloskrobi (HES18/0,4 (m. cz.= 18000 Da, DS = 0,4)) w 5 ml wody, dodano 0,83 mmoli 1,4- diaminobutanu (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) i 50 mg cyjanoborowodorku sodu NaCNBH3. Uzyskaną mieszaninę inkubowano w 80°C przez 17 h. Mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml zimnej mieszaniny 1:1 acetonu i etanolu (v/v). Osad zebrano przez odwirowanie i dializowano przez 4 dni względem wody (rurka do dializy SnakeSkin, próg 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) i liofilizowano.
PL 216 545 B1
b) Inkubacja mieszaniny powstałej przez dodanie 0,83 mmoli 1,4-diaminobutanu i 50 mg cyjanoborowodorku sodu NaCNBH3 do roztworu 200 mg hydroksyetyloskrobi także była możliwa i została wykonana w 25°C przez 3 dni.
P r z y k ł a d 1.4
Reakcja hydroksyetyloskrobi z 1-merkapto-2-aminoetanem
a) Do roztworu 200 mg hydroksyetyloskrobi (HES18/0,4 (m. cz.= 18000 Da, DS. = 0,4)) w 5 ml wody, dodano 0,83 mmoli 1-merkapto-2-aminoetanu (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) i 50 mg cyjanoborowodorku sodu NaCNBH3. Uzyskaną mieszaninę inkubowano W 80°C przez 17 h. Mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml zimnej mieszaniny 1:1 acetonu i etanolu (v/v). Osad zebrano przez odwirowanie i dializowano przez 4 dni względem wody (rurka do dializy SnakeSkin, próg 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) i liofilizowano.
b) Inkubacja mieszaniny powstałej przez dodanie 0,83 mmoli 1-merkapto-2-aminoetanu i 50 mg cyjanoborowodorku sodu NaCNBH3 do roztworu 200 mg hydroksyetyloskrobi także była możliwa i wykonana w 25°C przez 3 dni.
P r z y k ł a d 2
Tworzenie pochodnych hydroksyetyloskrobi przez koniugację z nie utlenionym redukującym końcem
P r z y k ł a d 2.1
Reakcja hydroksyetyloskrobi z karbohydrazydem
0,96 g HES18/0,4 (m. cz. = 18000 Da, DS = 0,4) rozpuszczono w 8 ml wodnego 0,1M buforu octanu sodu, pH 5,2 i dodano 8 mmoli karbohydrazydu (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D). Po mieszaniu przez 18 h w 25°C, mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml zimnej 1:1 mieszaniny acetonu i etanolu (v/v). Wytrącony produkt zebrano przez odwirowanie, ponownie rozpuszczono w 40 ml wody i dializowano przez 3 dni względem wody (rurka do dializy SnakeSkin, próg 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) i liofilizowano.
P r z y k ł a d 2.2
Reakcja hydroksyetyloskrobi z dihydrazydem adypinowym
0,96 g HES18/0,4 (m. cz. = 18000 Da, DS = 0,4) rozpuszczono w 8 ml wodnego 0,1M buforu octanu sodu, pH 5,2 i dodano 8 ramoli dihydrazydu adypinowego (Lancaster Synthesis, Frankfurt/Main, D). Po mieszaniu przez 18 h w 25°C, mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml zimnej mieszaniny 1:1 acetonu i etanolu (v/v). Wytrącony produkt zebrano przez odwirowanie, ponownie rozpuszczono w 40 ml wody i dializowano przez 3 dni względem wody (rurka do dializy SnakeSkin, próg
3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) i liofilizowano.
PL 216 545 B1
P r z y k ł a d 2.3
Reakcja hydroksyetyloskrobi z 1,4-fenyleno-bis-3-tiosemikarbazydem
0,96 g HES 18/0,4 (m. cz. = 1800 Da, DS = 0,4) rozpuszczono w 8 ml wodnego 0,1M buforu octanu sodu, pH 5,2 i dodano 8 mmoli 1,4-fenyleno-bis-3-tiosemikarbazydu (Lancaster Synthesis, Frankfurt/Main, D). Po mieszaniu przez 18 h w 25°C, do mieszaniny reakcyjnej dodano 8 ml wody i zawiesinę odwirowano przez 15 min przy 4500 obr/min. Klarowny supernatant zdekantowano i następnie dodano do 160 ml zimnej mieszaniny 1:1 acetonu i etanolu (v/v). Wytrącony produkt zebrano przez odwirowanie, ponownie rozpuszczono w 40 ml wody i odwirowano przez 15 min przy 4500 obr/min. Klarowny supernatant dializowano przez 3 dni względem wody (rurka do dializy SnakeSkin, próg 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) i liofilizowano.
P r z y k ł a d 2.4
Reakcja hydroksyetyloskrobi z O-[2-(2-aminooksyetoksy)etylo]hydroksyloaminą
O-[2-(2-aminooksyetoksy)etylo]hydroksyloaminę zsyntetyzowano w 2 etapach z handlowo dostępnych materiałów, jak opisano w Boturyn i in., Tetrahedron 53 (1997) str. 5485-5492. 0,96 g HES18/0,4 (m. cz. = 18000 Da, DS = 0,4) rozpuszczono w 8 ml wodnego 0,1M buforu octanu sodu, pH 5,2 i dodano 8 mmoli O-[2-(2-arainooksyetoksy)etylo]hydroksyloaminy. Po mieszaniu przez 18 h w 25°C, mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml zimnej mieszaniny 1:1 acetonu i etanolu (v/v). Wytrącony produkt zebrano przez odwirowanie, ponownie rozpuszczono w 40 ml wody i dializowano przez 3 dni względem wody (rurka do dializy SnakeSkin, próg 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) i liofilizowano.
P r z y k ł a d 3
Tworzenie pochodnych hydroksyetyloskrobi przez reakcję z utlenionym redukującym końcem
P r z y k ł a d 3.1
Reakcja hydroksyetyloskrobi z karbohydrazydem
0,12 mmoli Okso-HES 10/0,4 (m. cz. = 10000 Da, DS = 0,4, wytwarzane według DE 196 28 705 A1) rozpuszczono w 3 ml absolutnego dimetylosulfotlenku (DMSO) i dodano kroplami w atmosferze azotu do mieszaniny 15 mimoli karbohydrazydu (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) w 15 ml DMSO. Po mieszaniu przez 88 h w 65°C, mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml zimnej mieszaniny 1:1 acetonu i etanolu (v/v). Osad zebrano przez odwirowanie i dializowano przez 4 dni względem wody (rurka do dializy SnakeSkin, próg 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) i liofilizowano.
PL 216 545 B1
P r z y k ł a d 3.2
Reakcja hydroksyetyloskrobi z 1,4-fenyleno-bis-3-tiosemikarbazydem
0,12 mmoli Okso-HES 10/0,4 (m. cz. = 10000 Da, DS = 0,4, wytwarzane według DE 196 28 705
A1) rozpuszczono w 3 ml absolutnego dimetylosulfotlenku (DMSO) i dodano kroplami w atmosferze azotu do mieszaniny 15 mmoli 1,4-fenyleno-bis-3-tiosemikarbazydu (Lancaster Synthesis, Frankfurt/-Main, D) w 15 ml DMSO. Po mieszaniu przez 88 h w 65°C, mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml zimnej mieszaniny 1:1 acetonu i etanolu (v/v). Osad zebrano przez odwirowanie i dializowano przez 4 dni względem wody (rurka do dializy SnakeSkin, próg 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) i liofilizowano.
P r z y k ł a d 3.3
Reakcja hydroksyetyloskrobi z hydrazyną
H2N-NH2
1,44 g (0,12 mmol) Okso-HES 10/0,4 (m. cz. = 10000 Da, DS = 0,4, wytwarzane według DE 196 28705 A1) rozpuszczono w 3 ml absolutnego dimetylosulfotlenku (DMSO) i było dodane kroplami w atmosferze azotu do mieszaniny 0,47 ml (15 mmol) hydrazyny w 15 ml DMSO. Po mieszaniu przez 19 h w 40°C mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml mieszaniny 1:1 etanolu i acetonu (v/v). Wytrącony produkt zebrano przez odwirowanie, ponownie rozpuszczono w 40 ml wody i dializowano przez 2 dni względem 0,5% (v/v) roztworu trietyloaminy w wodzie i przez 2 dni względem wody (rurka do dializy SnakeSkin, próg 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Germany) i liofilizowano.
P r z y k ł a d 3.4
Reakcja hydroksyetyloskrobi z hydroksyloaminą
O-[2-(2-aminooksyetoksy)etylo]hydroksyloaminę zsyntetyzowano w 2 etapach z handlowo dostępnych materiałów, jak opisali Boturyn i in. (Boturyn, Boudali, Constant, Defrancq, Lhomme, 1997,
Tetrahedron, 53, 5485).
1,44 g (0,12 mmol) Okso-HES 10/0,4 (m. cz. = 10000 Da, DS = 0,4, wytwarzane według DE
196 28 705 A1) rozpuszczono w 3 ml absolutnego dimetylosulfotlenku (DMSO) i dodano kroplami w atmosferze azotu do mieszaniny 2,04 g (15 mcmoi) O-[2-(2-aminooksyetoksy)etylo]hydroksyloaminy w 15 ml DMSO. Po mieszaniu przez 48 h w 65°C mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml mieszaniny 1:1 etanolu i acetonu (v/v). Wytrącony produkt zebrano przez odwirowanie, ponownie rozpuszczono w 40 ml wody i dializowano przez 4 dni względem wody (rurka do dializy SnakeSkin, próg 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy) i liofilizowano.
P r z y k ł a d 3.5
Reakcja hydroksyetyloskrobi z dihydrazydem adypinowym
PL 216 545 B1
1,74 g (15 mmol) dihydrazydu adypinowego (Lancaster Synthesis, Frankfurt/Main, D) rozpuszczono w 20 ml absolutnego dimetylosulfotlenku (DMSO) w 65°C i dodano kroplami w atmosferze azotu 1,44 g (0,12 mmol) Okso-HES 10/0,4 (m. cz. = 10000 Da, DS = 0,4, wytwarzanego według DE nr 196 28 705 A1) rozpuszczonego w 3 ml absolutnego DMSO. Po mieszaniu przez 68 h w 60°C mieszaninę reakcyjną dodano do 200 ml wody. Roztwór zawierający produkt reakcji dializowano przez 2 dni względem 0,5% (v/v) roztworu trietyloaminy w wodzie i przez 2 dni względem wody (rurka do dializy SnakeSkin, próg 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy) i liofilizowano.
P r z y k ł a d 3.6
Reakcja hydroksyetyloskrobi z 1,4-diaminobutanem
1,44 g (0,12 mmol) Okso-HES 10/0,4 (m. cz. = 10000 Da, DS = 0,4, wytwarzane według DE nr 196 28 705 A1) rozpuszczono w 3 ml suchego dimetylosulfotlenku (DMSO) i dodano kroplami w atmosferze azotu do mieszaniny 1,51 ml (15 mmol) 1,4-diaminobutanu (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) w 15 ml DMSO. Po mieszaniu przez 19 h w 40°C mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml mieszaniny 1:1 etanolu i acetonu (v/v). Osad amino-HES 10 KD/0,4 zebrano przez odwirowanie, ponownie rozpuszczono w 40 ml wody i dializowano przez 4 dni względem wody (rurka do dializy SnakeSkin, próg
3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy) i liofilizowano.
P r z y k ł a d 4
Utlenianie erytropoetyny
Utlenioną erytropoetynę wytworzono jak opisano w przykładzie 8. Jako utlenioną erytropoetynę zastosowano EPO-GT-1-A jak opisano w przykładzie 8.11 (c) (EPO-GT-1 bez hydrolizy kwasowej, poddane łagodnemu utlenianiu nadjodanem).
P r z y k ł a d 5
Koniugacja pochodnych hydroksyetyloskrobi z utlenioną erytropoetyną z przykładu 4
P r z y k ł a d 5.1
Reakcja utlenionej erytropoetyny z produktem reakcji z przykładu 2.1
Utlenioną EPO (1,055 μg/μl) w 20 mM buforu PBS doprowadzono do pH 5,3 stosując 5M bufor octanu sodu o pH 5,2. Do 19 μl roztworu EPO, dodano 18 μl roztworu pochodnej HES wytworzonej według przykładu 2.1 (m. cz. 18 kDa; 18,7 μg/μl w 0,1M buforu octanu sodu, pH 5,2) i mieszaninę inkubowano przez 16 h w 25°C. Po liofilizacji, surowy produkt poddano analizie SDS- PAGE stosując NuPAGE 10% bis-tris gels/bufor MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel wybarwiono odczynnikiem wybarwiającym Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) przez noc. Wynik doświadczalny przedstawiono na fig. 1. Przesunięcie pasma proteiny do wyższych mas cząsteczkowych wskazuje na pomyślną koniugację. Zwiększona szerokość pasma to skutek rozkładu masy cząsteczkowej stosowanych pochodnych HES i liczby pochodnych HES połączonych z proteiną.
P r z y k ł a d 5.2
Reakcja utlenionej erytropoetyny z produktem reakcji z przykładu 2.3
Utlenione EPO (1,055 μg/μl) w 20 mM buforu PBS doprowadzono do pH 5,3 stosując 5 M bufor octanu sodu, pH 5,2. Do 19 μl roztworu EPO, dodano 18 μl roztworu pochodnej HES wytworzonej według przykładu 2.3 (m.cz. 18 kDa; 18,7 μg/μl w 0,1 M buforu octanu sodu, pH 5,2) i mieszaninę inkubowano przez 16 h w 25°C. Po liofilizacji surowy produkt poddano analizie SDS-PAGE stosując NuPAGE - 10% bis-tris gels/bufor MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen.
Przykład 5.3 Reakcja utlenionej erytropoetyny z produktem reakcji z przykładu 2.4
Utlenioną EPO (1,055 μς/μθ w 20 mM buforu PBS doprowadzono do pH 5,3 stosując 5 M bufor octanu sodu o pH 5,2. Do 19 μl roztworu EPO, dodano 18 μl roztworu pochodnej HES wytworzonej według przykładu 2.4 (m. cz. 18 kDa; 18,7 μg/μl w 0,1M buforu octanu sodu, pH 5,2) i mieszaninę inkubowano przez 16 h w 25°C. Po liofilizacji surowy produkt poddano analizie SDS-PAGE stosując NuPAGE 10% bis-tris gels/bufor MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel wybarwiono odczynnikiem wybarwiającym Roti-Blue Coomassie (Roth,
PL 216 545 B1
Karlsruhe, D) przez noc. Wynik doświadczalny przedstawiono na fig. 2. Przesunięcie pasma proteiny do wyższych mas cząsteczkowych wskazuje na pomyślną koniugację. Zwiększona szerokość pasma to skutek rozkładu masy cząsteczkowej stosowanych pochodnych HES i liczby pochodnych HES połączonych z proteiną.
P r z y k ł a d 5.4
Reakcja utlenionej erytropoetyny z produktem reakcji z przykładu 3.1
Utlenioną EPO (1,055 μg/μl) w 20 mM buforu PBS doprowadzono do pH 5,3 stosując 5M bufor octanu sodu o pH 5,2. Do 19 μl roztworu EPO, dodano 18 μl roztworu pochodnej HES wytworzonej według przykładu 3.1 (m. cz. 10 kDa; 18,7 μg/μl w 0,1M buforu octanu sodu, pH 5,2) i mieszaninę inkubowano przez 16 h w 25°C. Po liofilizacji surowy produkt poddano analizie SDS-PAGE stosując NuPAGE 10% bis-tris gels/bufor MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel wybarwiono stosując odczynnik wybarwiający Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) przez noc. Wynik doświadczalny przedstawiono na fig. 3. Przesunięcie pasma proteiny do wyższych mas cząsteczkowych wskazuje na pomyślną koniugację. Zwiększona szerokość pasma to skutek rozkładu masy cząsteczkowej stosowanych pochodnych HES i liczby pochodnych HES połączonych z proteiną.
P r z y k ł a d 5.5
Reakcja utlenionej erytropoetyny z produktem reakcji z przykładu 3.2
Utlenione EPO (1,055 μg/μl) w 20 mM buforu PBS doprowadzono do pH 5,3 stosując 5M bufor octanu sodu, pH 5,2. Do 19 μl roztworu EPO, dodano 18 μl roztworu pochodnej HES wytworzonej według przykładu 3.1 (m. cz. 10 kDa; 18,7 μg/μl w 0,1 M buforu octanu sodu, pH 5. 2) i mieszaninę inkubowano przez 16 h w 25°C. Po liofilizacji surowy produkt poddano analizie SDS-PAGE stosując NuPAGE 10% bis-tris gels/bufor MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel wybarwiono stosując odczynnik wybarwiający Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) przez noc. Wynik doświadczalny przedstawiono na fig. 3. Przesunięcie pasma proteiny do wyższych mas cząsteczkowych wskazuje na pomyślną koniugację. Zwiększona szerokość pasma to skutek rozkładu masy cząsteczkowej stosowanych pochodnych HES i liczby pochodnych HES połączonych z proteiną.
P r z y k ł a d 6
Tworzenie Tio-EPO przez redukcję erytropoetyny
241,5 μg erytropoetyny (EPO-GT-1, patrz przykład 8) w 500 μl 0,1M buforu boranu sodu, 5 mM EDTA, 10 mM DTT (Lancaster, Morcambe, UK), pH 8,3, inkubowano przez 1 h w 37°C. DTT usunięto przez sączenie z odwirowywaniem stosując zatężacz 0,5 ml VIVASPIN, 10 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) przy 13000 obr/min, następnie przemywając 3 razy buforem boranowym i dwukrotnie buforem fosforanowym (0,1M, 9,15M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2). Żel wybarwiono stosując odczynnik wybarwiający Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) przez noc.
P r z y k ł a d 7
Koniugacja pochodnych hydroksyetyloskrobi z tioerytropoetyną stosując związek sieciujący
W każdym z poniższych przykładów zastosowano ester N-(alfa-maleimidoacetoksy)sukcynimidu (AMAS)
jako związek sieciujący.
PL 216 545 B1
P r z y k ł a d 7.1
Reakcja tio-erytropoetyny z produktem reakcji z przykładu 2.1 i związkiem sieciującym
Do 50 nmoli pochodnej HES wytworzonej według przykładu 2.1 i rozpuszczonej w 200 μl 0,1M buforu fosforanu sodu (0,1M, 9,15M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2) dodano 10 μl roztworu 2,5 μmoli AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) w DMSO. Klarowny roztwór inkubowano przez 80 min w 25°C i 20 min w 40°C. Pozostały AMAS usunięto przez sączenie z odwirowywaniem stosując zatężacz 0,5 ml VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) przy 13000 obr/min, przemywanie 4 razy i 30 min buforem fosforanowym.
Do pozostałego roztworu dodano 15 μg TioEPO wytworzonego według przykładu 5 (1 μg/μl w buforze fosforanowym) i mieszaninę inkubowano przez 16 h w 25°C. Po liofilizacji surowy produkt poddano analizie SDS-PAGE stosując NuPAGE 10% bis-tris gels/bufor MOPS (Invitrogen, Carlsbad, USA) jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel wybarwiono stosując środek wybarwiający Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) przez noc.
Wynik doświadczalny przedstawiono na fig. 4. Przesunięcie pasma proteiny do wyższych mas cząsteczkowych wskazuje na pomyślną koniugację. Zwiększona szerokość pasma to skutek rozkładu masy cząsteczkowej stosowanych pochodnych HES i liczby pochodnych HES połączonych z proteiną.
P r z y k ł a d 7.2
Reakcja tio-erytropoetyny z produktem reakcji z przykładu 2.2 i związkiem sieciującym
Do 50 nmoli pochodnej HES wytworzonej według przykładu 2.2 i rozpuszczonej w 200 μl 0,1M buforu fosforanu sodu (0,1M, 9,15M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2), dodano 10 μl roztworu 2,5 μmoli AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) w DMSO. Klarowny roztwór inkubowano przez 80 min w 25°C i 20 min w 40°C. Pozostały AMAS usunięto przez sączenie z odwirowywaniem stosując zatężacz 0,5 ml VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) przy 13000 obr/min, przemywanie 4 razy i 30 min buforem fosforanowym.
Do pozostałego roztworu dodano 15 μg TioEPO wytworzonego według przykładu 5 (1 μg/μl w buforze fosforanowym) i mieszaninę inkubowano przez 16 h w 25°C. Po liofilizacji surowy produkt poddano analizie SDS-PAGE stosując NuPAGE 10% bis-tris gels/bufor MOPS (Invitrogen, Carlsbad, USA) jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel wybarwiono stosując środek wybarwiający Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) przez noc.
Wynik doświadczalny przedstawiono na fig 5. Przesunięcie pasma proteiny do wyższych mas cząsteczkowych wskazuje na pomyślną koniugację. Zwiększona szerokość pasma to skutek rozkładu masy cząsteczkowej stosowanych pochodnych HES i liczby pochodnych HES połączonych z proteiną.
P r z y k ł a d 7.3
Reakcja tio-erytropoetyny z produktem reakcji z przykładu 2.3 i związkiem sieciującym
Do 50 nmoli pochodnej HES wytworzonej według przykładu 2.3 i rozpuszczonej w 200 μl 0,1M buforu fosforanu sodu (0,1M, 9,15M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2), dodano 10 μl roztworu 2,5 μmoli AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) w DMSO. Klarowny roztwór inkubowano przez 80 min w 25°C i 20 min w 40°C. Pozostały AMAS usunięto przez sączenie z odwirowywaniem stosując zatężacz 0,5 ml VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) przy 13000 obr/min, przemywanie 4 razy i 30 min buforem fosforanowym.
Do pozostałego roztworu, dodano 15 μg TioEPO wytworzonego według przykładu 5 (1 μg/μl w buforze fosforanowym) i mieszaninę inkubowano przez 16 h w 25°C. Po liofilizacji, surowy produkt poddano analizie SDS-PAGE stosując NuPAGE 10% bis-tris gels/bufor MOPS (Invitrogen, Carlsbad, USA) jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel wybarwiono stosując środek wybarwiający Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) przez noc.
Wynik doświadczalny przedstawiono na fig. 5. Przesunięcie pasma proteiny do wyższych mas cząsteczkowych wskazuje na pomyślną koniugację. Zwiększona szerokość pasma to skutek rozkładu masy cząsteczkowej stosowanych pochodnych HES i liczby pochodnych HES połączonych z proteiną.
P r z y k ł a d 7.4
Reakcja tio-erytropoetyny z produktem reakcji z przykładu 2.4 i związkiem sieciującym
Do 50 nmoii pochodnej HES wytworzonej według przykładu 2.4 i rozpuszczonej w 200 μl 0,1M buforu fosforanu sodu (0,1M, 9,15M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2), dodano 10 μl roztworu 2,5 μmoli AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) w DMSO. Klarowny roztwór inkubowano przez 80 min w 25°C i 20 min w 40°C. Pozostały AMAS usunięto przez sączenie z odwirowywaniem stosując zatężacz 0,5 ml VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) przy 13000 obr/min, przemywanie 4 razy i 30 min buforem fosforanowym.
PL 216 545 B1
Do pozostałego roztworu dodano 15 μg TioEPO wytworzonej według przykładu 5 (1 μg/μl w buforze fosforanowym) i mieszaninę inkubowano przez 16 h w 25°C. Po Iiofilizacji, surowy produkt poddano analizie SDS-PAGE stosując NuPAGE 10% bis-tris gels/bufor MOPS (Invitrogen, Carlsbad, USA) jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel wybarwiono stosując środek wybarwiający Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) przez noc.
Wynik doświadczalny przedstawiono na fig 4. Przesunięcie pasma proteiny do wyższych mas cząsteczkowych wskazuje na pomyślną koniugację. Zwiększona szerokość pasma to skutek rozkładu masy cząsteczkowej stosowanych pochodnych HES i liczby pochodnych HES połączonych z proteiną.
P r z y k ł a d 7.5
Reakcja tio-erytropoetyny z produktem reakcji z przykładu 1.1 i związkiem sieciującym
Do 50 nmoli pochodnej HES wytworzonej według przykładu 1.1, w warunkach inkubacji 80°C i 17 h, jak również 25°C i 3 dni i rozpuszczonej w 200 μΐ 0,1M buforu fosforanu sodu (0,1M, 9,15M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2), dodano 10 μl roztworu 2,5 μmoli AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) w DMSO. Klarowny roztwór inkubowano przez 80 min w 25°C i 20 min w 40°C, Pozostały AMAS usunięto przez sączenie z odwirowywaniem stosując zatężacz 0,5 ml VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) przy 13000 obr/min, przemywanie 4 razy i 30 min buforem fosforanowym.
Do pozostałego roztworu, dodano 15 μg TioEPO wytworzonej według przykładu 5 (1 μg/l μl w buforze fosforanowym) i mieszaninę was inkubowano przez 16 h w 25°C. Po liofilizacji, surowy produkt poddano analizie SDS-PAGE stosując NuPAGE 10% bis-tris gels/bufor MOPS (Invitrogen, Carlsbad, USA) jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel wybarwiono stosując środek wybarwiający Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) przez noc.
Wynik doświadczalny przedstawiono na fig. 5. Przesunięcie pasma proteiny do wyższych mas cząsteczkowych wskazuje na pomyślną koniugację. Zwiększona szerokość pasma to skutek rozkładu masy cząsteczkowej stosowanych pochodnych HES i liczby pochodnych HES połączonych z proteiną.
P r z y k ł a d 7.6
Reakcja tio-erytropoetyny z produktem reakcji z przykładu 1.3 i związkiem sieciującym
Do 50 nmoli pochodnej HES wytworzonej według przykładu 1.3, w warunkach inkubacji 80°C i 17 h, jak również 25°C i 3 dni i rozpuszczonej w 200 μl 0,1M buforu fosforanu sodu (0,1M 9,15M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2), dodano 10 μl roztworu 2,5 μmoli AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) w DMSO. Klarowny roztwór inkubowano przez 80 min w 25°C i 20 min w 40°C. Pozostały AMAS usunięto przez sączenie z odwirowywaniem stosując zatężacz 0,5 ml VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) przy 13000 obr/min, przemywanie 4 razy i 30 min buforem fosforanowym.
Do pozostałego roztworu, dodano 15 μq TioEPO wytworzonej według przykładu 5 (1 μς^ w buforze fosforanowym) i mieszaninę inkubowano przez 16 h w 25°C. Po liofilizacji surowy produkt poddano analizie SDS-PAGE stosując NuPAGE 10% bis-tris gels/bufor MOPS (Invitrogen, Carlsbad, USA) jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel wybarwiono stosując środek wybarwiający Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) przez noc.
Wynik doświadczalny przedstawiono na fig 5. Przesunięcie pasma proteiny do wyższych mas cząsteczkowych wskazuje na pomyślną koniugację. Zwiększona szerokość pasma to skutek rozkładu masy cząsteczkowej stosowanych pochodnych HES i liczby pochodnych HES połączonych z proteiną.
P r z y k ł a d 7.7
Reakcja tio-erytropoetyny z produktem reakcji z przykładu 3.1 i związkiem sieciującym
Do 50 nmoli pochodnej HES, wytwarzanej według przykładu 3.1 i rozpuszczonej w 200 μl buforu fosforanowego (0,1M, 9,15M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2), dodano 10 μl roztworu 2,5 μmoli AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) w DMSO i klarowny roztwór inkubowano przez 80 min w 25°C i 20 min w 40°C. AMAS usunięto przez sączenie z odwirowywaniem stosując zatężacz 0,5 ml VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Niemcy) przy 13000 obr/min i przemywanie 4 razy przez 30 min buforem fosforanowym.
Do pozostałego roztworu, dodano 15 μg Tio-EPO (I Qg/Zl w buforze fosforanowym) i mieszaninę inkubowano przez 16 h w 25°C. Po liofilizacji surowy produkt poddano analizie SDS-PAGE stosując NuPAGE 10% bis-tris gels/bufor MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel wybarwiono stosując odczynnik wybarwiający Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) przez noc.
Wynik doświadczalny przedstawiono na fig 6. Przesunięcie pasma proteiny do wyższych mas cząsteczkowych wskazuje na pomyślną koniugację. Zwiększona szerokość pasma to skutek rozkładu masy cząsteczkowej stosowanych pochodnych HES i liczby pochodnych HES połączonych z proteiną.
PL 216 545 B1
P r z y k ł a d 7.8
Reakcja tio-erytropoetyny z produktem reakcji z przykładu 3.2 i związkiem sieciującym
Do 50 nmoli pochodnej HES, wytwarzanej według przykładu 3.2 i rozpuszczonej w 200 μl buforu fosforanowego (0,1M, 9,15M NaCl, 50 mM EDTA, pH 1,2), dodano 10 μl roztworu 2,5 μmoli AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) w DMSO i klarowny roztwór inkubowano przez 80 min w 25°C i 20 min w 40°C. AMAS usunięto przez sączenie z odwirowywaniem stosując zatężacz 0,5 ml VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Niemcy) przy 13000 obr/min i przemywanie 4 razy przez 30 min buforem fosforanowym.
Do pozostałego roztworu, dodano 15 μg Tio-EPO (1 μg/μl w buforze fosforanowym) i mieszaninę inkubowano przez 16 h w 25°C. Po liofilizacji surowy produkt poddano analizie SDS-PAGE stosując NuPAGE 10% bis-tris gels/bufor MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel wybarwiono stosując odczynnik wybarwiający Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) przez noc.
Wynik doświadczalny przedstawiono na fig 6. Przesunięcie pasma proteiny do wyższych mas cząsteczkowych wskazuje na pomyślną koniugację. Zwiększona szerokość pasma to skutek rozkładu masy cząsteczkowej stosowanych pochodnych HES i liczby pochodnych HES połączonych z proteiną.
P r z y k ł a d 7.9
Reakcja tio-erytropoetyny z produktem reakcji z przykładu 3.3 i związkiem sieciującym
Do 50 nmoii pochodnej HES, wytwarzanej według przykładu 3.3 i rozpuszczonej w 200 μl buforu fosforanowego (0,1M, 9,15M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2), dodano 10 μl roztworu 2,5 μmoli AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) w DMSO i klarowny roztwór inkubowano przez 80 min w 25°C i 20 min w 40°C. AMAS usunięto przez sączenie z odwirowywaniem stosując zatężacz 0,5 ml VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Niemcy) przy 13000 obr/min i przemywanie 4 razy przez 30 min buforem fosforanowym.
Do pozostałego roztworu, dodano 15 μg Tio-EPO (1 μg/μl w buforze fosforanowym) i mieszaninę inkubowano przez 16 h w 25°C. Po liofilizacji surowy produkt poddano analizie SDS-PAGE stosując NuPAGE 10% bis-tris gels/bufor MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel wybarwiono stosując odczynnik wybarwiający Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) przez noc.
Wynik doświadczalny przedstawiono na fig 6. Przesunięcie pasma proteiny do wyższych mas cząsteczkowych wskazuje na pomyślną koniugację. Zwiększona szerokość pasma to skutek rozkładu masy cząsteczkowej stosowanych pochodnych HES I liczby pochodnych HES połączonych z proteiną.
P r z y k ł a d 7.10
Reakcja tio-erytropoetyny z produktem reakcji z przykładu 3.4 i związkiem sieciującym
Do 50 nmoli pochodnej HES, wytwarzanej według przykładu 3.4 i rozpuszczonej w 200 μl buforu fosforanowego (0,1M, 9,15M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2) dodano 10 μl roztworu 2,5 μmoli AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) w DMSO i klarowny roztwór inkubowano przez 80 min w 25°C i 20 min w 40°C. AMAS usunięto przez sączenie z odwirowywaniem stosując zatężacz 0,5 ml VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Niemcy) przy 13000 obr/min i przemywanie 4 razy przez 30 min buforem fosforanowym.
Do pozostałego roztworu, dodano 15 μg Tio-EPO (1 μg/μl w buforze fosforanowym) i mieszaninę inkubowano przez 16 h w 25°C. Po liofilizacji, surowy produkt poddano analizie SDS- PAGEwith NuPAGE 10% bis-tris gels/bufor MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel wybarwiono stosując odczynnik wybarwiający Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) przez noc.
Wynik doświadczalny przedstawiono na fig 6. Przesunięcie pasma proteiny do wyższych mas cząsteczkowych wskazuje na pomyślną koniugację. Zwiększona szerokość pasma to skutek rozkładu masy cząsteczkowej stosowanych pochodnych HES i the number pochodne HES połączony z proteiną.
P r z y k ł a d 7.11
Reakcja tio-erytropoetyny z produktem reakcji z przykładu 3.5 i związkiem sieciującym
Do 50 nmoli pochodnej HES, wytwarzanej według przykładu 3.5 i rozpuszczonej w 200 μl buforu fosforanowego (0,1M, 9,15M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2), dodano 10 μl roztworu 2,5 μmoli AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) w DMSO I klarowny roztwór inkubowano przez 80 min w 25°C i 20 min w 40°C. AMAS usunięto przez sączenie z odwirowywaniem stosując zatężacz 0,5 ml VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Niemcy) przy 13000 obr/min i przemywanie 4 razy przez 30 min buforem fosforanowym.
PL 216 545 B1
Do pozostałego roztworu, dodano 15 μg Tio-EPO (1 μq/μl w buforze fosforanowym) i mieszaninę inkubowano przez 16 h w 25°C. Po liofilizacji surowy produkt poddano analizie SDS-PAGE stosując NuPAGE 10% bis-tris gels/bufor MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel wybarwiono stosując odczynnik wybarwiający Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) przez noc.
Wynik doświadczalny przedstawiono na fig 6. Przesunięcie pasma proteiny do wyższych mas cząsteczkowych wskazuje na pomyślną koniugację. Zwiększona szerokość pasma to skutek rozkładu masy cząsteczkowej stosowanych pochodnych HES i liczby pochodnych HES połączonych z proteiną.
P r z y k ł a d 7.12
Reakcja tio-erytropoetyny z produktem reakcji z przykładu 3.6 i związkiem sieciującym
Do 50 nmoli pochodnej HES, wytwarzanej według przykładu 3.6 i rozpuszczonej w 200 μl buforu fosforanowego (0,1M, 9,15M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2), dodano 10 μl roztworu 2,5 μmoli AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D) w DMSO i klarowny roztwór inkubowano przez 80 min w 25°C i 20 min w 40°C. AMAS usunięto przez sączenie z odwirowywaniem stosując zatężacz 0,5 ml VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Niemcy) przy 13000 obr/min i przemywanie 4 razy przez 30 min buforem fosforanowym.
Do pozostałego roztworu, dodano 15 μg Tio-EPO (1 μg/μl w buforze fosforanowym) i mieszaninę inkubowano przez 16 h w 25°C. Po liofilizacji surowy produkt poddano analizie SDS-PAGEwith NuPAGE 10% bis-tris gels/bufor MOPS (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel wybarwiono stosując odczynnik wybarwiający Roti-Blue Coomassie (Roth, Karlsruhe, D) przez noc.
Wynik doświadczalny przedstawiono na fig 6. Przesunięcie pasma proteiny do wyższych mas cząsteczkowych wskazuje na pomyślną koniugację. Zwiększona szerokość pasma to skutek rozkładu masy cząsteczkowej stosowanych pochodnych HES i liczby pochodnych HES połączonych z proteiną.
P r z y k ł a d 8
Preparatywne wytwarzanie koniugatów HES-EPO
Streszczenie
Koniugaty HES-EPO zsyntetyzowano przez sprzęganie pochodnych HES (przeciętna m. cz. = 18000 Da; stopień podstawienia hydroksyetylem 0,4) z częściowo (łagodny nadjodan) utlenionymi resztami kwasu sialowego na łańcuchach oligosacharydowych rekombinacyjnej ludzkiej EPO. W oparciu o analizę strukturalną węglowodanów, wprowadzone modyfikacje nie wpłynęły na integralność strukturalną łańcuchów oligosacharydowych rdzenia, ponieważ MALDI/TOE-MS glikanów modyfikowanych HES, na które łagodnie podziałano kwasem, ujawnił nienaruszone neutralne łańcuchy typu N-acetylolaktozaminy, które były nierozróżnialne od obserwowanych w niemodyfikowanym produkcie EPO. Otrzymane wyniki wskazują, że co najmniej 3 modyfikowane reszty HES są przyłączone na cząsteczkę EPO w przypadku preparatu EPO, który poddano modyfikacji bez uprzedniego częściowego usuwania kwasu sialowego. Odmiana EPO, w której brakowało około 50% reszt kwasu sialowego poprzedniej proteiny wykazała podobną widoczną wysoką ruchliwość masy cząsteczkowej w SDS-PAGE (60-110 kDa względem 40 kDa dla BRP - wzorca EPO). EPO modyfikowana przez HES jest trwała w standardowych warunkach chromatografii jonowymiennej w temperaturze pokojowej przy pH 3-10. Biopróba EPO w układzie myszy normocytemicznych wskazuje, że EPO modyfikowana przez HES ma 2,5-3,0-krotnie wyższą aktywność specyficzną (lU/mg) w tej próbie w porównaniu do międzynarod owego wzorca odniesienia EPO-BRP w oparciu o oznaczenie proteiny stosując wartość absorpcji UV z European Pharmacopeia i metodę oznaczenia proteiny EPO RP-HPLC kalibrowaną względem preparatu wzorcowego EPO-BRP.
P r z y k ł a d 8.1
Materiały i metody (a) Uwolnienie N-połączonych oligosacharydów przez trawienie N-glikozydazą
Próbki inkubowano 25 jednostkami (według specyfikacji wytwórcy, Roche Diagnostics, Niemcy) rekombinacyjnego PNGase F przez noc w 37°C. Pełne trawienie monitorowano przez specyficzne przesunięcie ruchliwości proteiny w SDS-PAGE. Uwolnione N-glikany były oddzielane od polipeptydu przez dodanie 3 objętości zimnego 100% etanolu i inkubację w -20°C przez co najmniej 2 godz. (Schroeter S. i in., 1999). Wytrąconą proteinę usunięto przez odwirowanie przez 10 minut w 4°C przy 13000 obr/min. Grudkę następnie poddano dwóm dodatkowym przemyciom 500 μl lodowatego 75% etanolu. Oligosacharydy w zebranych supernatantach były suszone w wirówce próżniowej (zatężacz Speed Vac, Savant Instruments Inc., USA). Próbki glikanu odsalano stosując kartridże Hypercarb
PL 216 545 B1 (25 mg lub 100 mg HyperCarb) przed użyciem, jak następuje: kolumny przemywano 3 x 500 μΐ 80% acetonitrylu (v/v) w 0,1% TFA, a następnie przemywano 3 x 500 μΐ wody. Próbki rozcieńczono wodą do końcowej objętości 300-600 μΐ przed wprowadzeniem na kartridż, który następnie dokładnie przemyto wodą. Oligosacharydy wymywano 1,2 ml (kartridże 25 mg; 1,8 ml w przypadku kartridży 100 mg) 25% acetonitrylu w wodzie zawierającej 0,1% kwasu trifIuorooctowego (v/v). Wymywane oligosacharydy były zobojętniane 2 M NH4OH i suszone w zatężaczu Speed Vac. W pewnych przypadkach wykonano odsalanie oligosacharydów uwolnionych przez N-glikozydazę przez adsorpcję mieszaniny trawiącej z próbek < 100 μg całkowitej (gliko) proteiny na 100 mg kartridże Hypercarb.
(b) Analiza oligosacharydów za pomocą spektrometrii masowej z użyciem desorpcjI/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą z analizą czasu przelotu (MALDI/TOF/TOF-MS)
Zastosowano analizator czasu przelotu ULTRAFLEX firmy Bruker (TOF/TOF): rodzime desialilowane oligosacharydy były analizowane stosując kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy jako materiał absorbujący UV w trybie jonu dodatniego, jak i w trybie jonu ujemnego w obydwu przypadkach stosując reflektron. Dla analiz MS-MS, wybrane jony macierzyste poddano indukowanej laserem dysocjacji (LID) i uzyskane fragmenty jonowe oddzielono przez drugi etap TOF (LIFT) przyrządu. Roztwory pró-1 bek o objętości 1 μl i przybliżonym stężeniu 1-10 pmol · μΓ zmieszano z równymi ilościami odpowiedniej matrycy. Mieszaninę tę naniesiono na płytkę ze stali nierdzewnej i przed analizą suszono w temperaturze pokojowej.
P r z y k ł a d 8.2
Wytwarzanie i charakterystyka rekombinacyjnej ludzkiej EPO (EPO-GT-1)
EPO ekspresjonowano z komórek rekombinacyjnego CHO, jak opisano w: (Mueller P. P. i in., 1999, Dorner A. J. i in., 1984) i preparaty były scharakteryzowane według metody opisanej w Eur. Phar. (Ph. Eur. 4, Monography 01/2002: 1316: Erythropoietin concentrated solution). Końcowy produkt miał zawartość kwasu sialowego wynoszącą 12 nmoli (± 1,5 nmol) na nmoli proteiny. Struktury N-połączonych oligosacharydów były oznaczone przez HPAEC-PAD i MALDI/TOF-MS, jak opisano (Nimtz i in., 1999, Grabenhorst, 1999). Preparaty EPO, które otrzymano, zawierały di-, tri- i tetrasiaiilowane oligosacharydy (odpowiednio 2-12%, 15-28% i 60-80%, sulfonowane i pentasialilowane łańcuchy były obecne w małych ilościach). Całkowita charakterystyka glikozylowania preparatów EPO była podobna do międzynarodowego preparatu wzorcowego EPO-BRP. Izoelektryczny szablon ogniskujący rekombinacyjnej EPO był porównywalny do międzynarodowego preparatu wzorcowego EPO-BRP wykazując odpowiednie izoformy. 25% proteiny EPO brakowało O-glikozylacji przy Ser126 łańcucha polipeptydu.
P r z y k ł a d 8.3
Wytwarzanie form EPO częściowo desialilowanych
Proteinę EPO GT-1 (2,84 mg/ml) ogrzewano do 80°C w 20 mM buforze fosforanowym sodu o pH 7,0 i następnie dodano 100 μl 1N H2SO4 na 1 ml roztworu EPO; inkubację kontynuowano przez odpowiednio 5 min, 10 min i 60 min, dostarczając preparaty EPO o różnym stopniu sialilowania. Oznaczenie ilościowe oligosacharydów przy użyciu 0-4 kwasów sialowych wykonano po uwolnieniu oligosacharydów N-glikozydazą polipeptydową i wyodrębnienie łańcuchów N-połączonych wykonano przez odsalanie stosując kartridże Hypercarb (25 mg HyperSep Hypercarb; ThermoHypersil-Keystone, UK). Preparaty EPO zobojętniono przez dodanie 1N NaOH, zamrożono w ciekłym N2 i przechowywano w -20°C do czasu dalszego użycia.
P r z y k ł a d 8.4
Utlenianie nadjodanem form sialilowej EPO
Do 10 mg EPO niepoddanej działaniu lub poddanej łagodnemu działaniu kwasem, rozpuszczonej w 3,5 ml 20 mM buforu fosforanowego sodu o pH 7,0, dodano 1,5 ml 0,1 M buforu octanu sodu o pH 5,5 i mieszaninę schłodzono do 0°C w łaźni lodowej; dodano 500 μl 10 mM nadjodanu sodu i mieszaninę reakcyjną utrzymywano w ciemności przez 60 min w 0°C. Następnie dodano 10 μl gliceryny i inkubację kontynuowano przez dalsze 10 min w ciemności. Częściowo utlenione formy EPO oddzielono od odczynników przez odsalanie stosując zatężacze VIVASPIN (10000 MWCO, PES Vivascience AG, Hannover, Niemcy) według zaleceń wytwórcy przy 3000 obr/min w wirówce laboratoryjnej wyposażonej w wirnik o stałym kącie. Po zamrożeniu w ciekłym azocie preparaty EPO przechowywano w końcowej objętości 4 ml w -20°C. 100 μg próbki częściowo utlenionego preparatu EPO poddano działaniu N-glikozydazy i oligosacharydy wyodrębniono stosując kartridże Hypercarb, jak opisano. Oligosacharydy desialilowano przez łagodne działanie kwasem i analizowano przez HPAECPL 216 545 B1
PAD a ich czasy retencji porównano z czasami autentycznych standardowych oligosacharydów, jak opisano (Nimtz i in., 1990 i 1993).
P r z y k ł a d 8.5
Redukcja disiarczków EPO ditioerytreitolem mg EPO-GT-1 inkubowano w 5 ml 0,1M buforu Tris/HCl pH 8,1 w obecności 30 mM ditioerytreitolu (DTT) w 37°C przez 60 minut; usunięcie DTT osiągnięto stosując zatężacz Vivaspin w 4°C, przy 4 cyklach wymiany buforu. Końcowy zredukowany preparat EPO zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w -20°C w 50 mM buforze octanu sodu o pH 5,5.
P r z y k ł a d 8.6
Oznaczenie proteiny EPO
Ilościowe oznaczenie proteiny EPO wykonano przez pomiar absorpcji UV przy 280 nm według Eur. Phar. (European Pharmacopeia 4, Monography 01/2002: 1316; erythropoietin concentrated solution) w kuwecie o długości drogi 1 cm. Ponadto, EPO oznaczono ilościowo przez zastosowanie metody RP-HPLC stosując kolumnę RP-C4 (Vydac Protein C4, Cat. # 214TP5410, Grace Vydac, Ca, US); metodę HPLC skalibrowano stosując wzorzec odniesienia erytropoetyny BRP 1 (European Pharmacopeia, Conseil de I'Europe B. P. 907-F67029, Strasbourg Cedex 1).
P r z y k ł a d 8.7
Utlenianie desialilowanej EPO oksydazą galaktozową
4,485 mg całkowicie desialilowanej EPO inkubowano w 20 mM buforu fosforanowego sodu o pH 6,8, w obecności 16 μΐ katalazy (6214 jedn./200 ml) i 80 μΐ oksydazy galaktozowej (2250 jedn./ml z Dactylium dendroides (Sigma-Aldrich, Steinheim, Niemcy); inkubacja w 37°C odbyła się przez noc;
dwa razy po 20 μΐ oksydazy galaktozowej dodano po 4 godz. i po 8 godz. po rozpoczęciu inkubacji.
P r z y k ł a d 8.8
Wytworzenie próbek EPO dla bioprób
Oczyszczanie EPO z inkubacji preparatów proteiny EPO utlenionych nadjodanem lub oksydazą galaktozową z aktywowanym HES
Oczyszczanie próbek EPO (usuwanie nieprzereagowanych pochodnych HES) wykonano w temperaturze pokojowej. Mieszaniny inkubacyjne EPO (około 5 mg proteiny EPO) rozcieńczono 1:10 buforem A (20 mM kwas N-morfolinopropanosulfonowy [MOPS/NaOH] w H2O podwójnie destylowanej, pH 8,0) i wprowadzono na kolumnę zawierającą 3 ml Q-Sepharose HP (Kod Pharmacia 17-1014-03, partia nr 220211) doprowadzoną do stanu równowagi 10 objętościami kolumny (CV) bufora A stosując szybkość przepływu 0,5 ml/min. Kolumnę przemyto 6-8 CV bufora A (szybkość przepływu = 0,8 ml/min) i wymywanie wykonano stosując bufor B (20 mM kwas morfolinoetanosulfonowy [MES/NaOH], 0,5M NaCl w H2O podwójnie destylowanej, pH 6,5) przy szybkości przepływu 0,5 ml/min. EPO wykryto przez absorpcję UV przy 280 nm i wymywano przy około 6 ml. Kolumnę regenerowano stosując 3 CV bufora C (20 mM MES, 1,5 M NaCl w H2O doprowadzonej do pH 6,5) i ponownie doprowadzono do stanu równowagi stosując 10 CV bufora A (szybkość przepływu = 0,7 ml/min). Wymianę buforu eluatów EPO otrzymanych z etapu Q-Sepharose wykonano stosując zatężacze Vivaspin i roztwór soli buforowany fosforanem (PBS) przy 3 cyklach odwirowania na próbkę; próbki doprowadzono do 2 ml stosując PBS i przechowywano w -20°C. Jedynie < 25% częściowo desialilowanych i następnie łagodnie utlenianych nadjodanem form EPO, które poddano modyfikacji HES otrzymano z eluatu Q-Sepharose, ponieważ w zastosowanych warunkach zasadowe formy EPO nie wiązały się z Q-Sepharose i znajdowały się w przepływającej fazie ruchomej razem z nie przereagowanymi pochodnymi HES.
P r z y k ł a d 8.9
Anionowymienna chromatografia o wysokim pH z impulsową detekcją amperometryczną (HPAEC-PAD)
Oczyszczone rodzime i desialilowane oligosacharydy analizowano za pomocą chromatografii anionowymiennej o wysokim pH (HPAE) stosując układ BioLC Dionex (Dionex, USA) wyposażony w kolumnę CarboPac PAl (0,4 x 25 cm) w kombinacji z impulsowym detektorem amperometrycznym (PAD) (Schroter i in., 1999; Nimtz i in., 1999). Potencjały (E) i czasy trwania impulsów (T) detektora wynosiły; E1; +50 mV, T1: 480 ms; E2: +500 mV, T2: 120 ms; E3: -500 mV, T3: 60 ms, a zakres wyjściowy wynosił 500-1500 nA. Oligosacharydy były następnie wstrzykiwane na kolumnę CarboPac PAl, którą doprowadzono do stanu równowagi stosując 100% rozpuszczalnik A. Wymywanie desialilowa-1 nych oligosacharydów (szybkość przepływu: 1 ml-min-1) wykonano stosując gradient liniowy (0-20%) rozpuszczalnika B przez okres 40 min, a następnie liniowy wzrost od 20-100% rozpuszczalnika B
PL 216 545 B1 przez 5 min. Rozpuszczalnikiem A było 0,2 M NaOH W podwójnie destylowanej H2O, rozpuszczalnik B składał się z 0,6M NaOAc w rozpuszczalniku A. W przypadku rodzimych oligosacharydów kolumnę doprowadzono do stanu równowagi stosując 100% rozpuszczalnik C (0,1M NaOH w podwójnie destylowanej H2O) i wymywanie (szybkość przepływu: 1 ml-min-1) wykonano stosując gradient liniowy (0-35%) rozpuszczalnika D przez okres 48 min, a następnie liniowy wzrost od 35-100% rozpuszczalnika D przez 10 min. Rozpuszczalnik D składał się z 0,6M NaAc w rozpuszczalniku C.
P r z y k ł a d 8.10
Analiza składu monosacharydów dla N-glikanów, N-glikanów modyfikowanych HES i proteiny EPO za pomocą GC-MS
Monosacharydy analizowano jako odpowiednie metyloglikozydy po metanolizie, N-reacetylacji i trimetylosililowaniu za pomocą GC/MS [Chaplin, M. F. (1982) A rapid and sensitive method for the analysis of carbohydrate. Anal. Blochem. 123, 336-341]. Analizy wykonano na spektrometrze masowym z pułapką jonów Finnigan GCQ (Finnigan MAT corp., San Jose, CA) pracując w trybie EI jonu dodatniego, wyposażonym w kolumnę kapilarną DB5 (30 m). Program temperatury: 2 min izoterma w 80°C, a następnie 10 stopni min-1 do 300°C. Monosacharydy zidentyfikowano przez ich czas retencji i charakterystyczny szablon fragmentacji. Nieskorygowane wyniki elektronicznej integracji piku zastosowano do oznaczenia ilościowego. Monosacharydy dające więcej niż jeden pik wskutek anomeryczności i/lub obecności form furanoidu i piranoidu były oznaczone ilościowo przez dodanie wszystkich głównych pików. 0,5 μg myo-inozytoiu użyto jako wzorzec wewnętrzny.
P r z y k ł a d 8.11
Wyniki
P r z y k ł a d 8.11 (a)
Charakterystyka glikanów EPO-GT-1 (częściowo desialilowanego) po łagodnym działaniu kwasem
Preparaty EPO-GT-1 poddane łagodnemu działaniu kwasem przez 5, 10 lub 60 min. analizowano za pomocą SDS-PAGE przed i po uwolnieniu N-połączonych oligosacharydów przez inkubację N-glikozydazą, jak przedstawiono na figurze 7. N-połączone oligosacharydy poddano mapowaniu oligosacharydów HPAEC-PAD (figura 8). Nie poddany działaniu EPO-GT-1 zawierał > 90% N-połączonych oligosacharydów z 3 lub 4 resztami kwasu sialowego, podczas gdy po 5 min. inkubacji w obecności łagodnego kwasu < 40% łańcuchów węglowodanowych miało 3 lub 4 reszty kwasu sialowego. HPAEC-PAD desialilowanych N-glikanów ujawniło stosunek neutralnych oligosacharydów, które były wykryte dla EPO-GT-1 nie poddanego działaniu i pozostały stabilne w preparatach poddanych działaniu kwasu przez 5, 10 lub 60 min. MALDI/TOF-MS desialilowanych glikanów ujawniło, że < 90% proksymalnej fukozy było obecne po łagodnym działaniu kwasem na proteinę.
P r z y k ł a d 8.11 (b)
Charakterystyka EPO-GT-1, na który działano nadjodanem
Ruchliwość SDS-PAGE form EPO poddanych łagodnemu działaniu nadjodanem, które były uprzednio poddane 5 i 10 minutowemu działaniu kwasem lub nie były poddane temu działaniu porównano na figurze 10. Warunki stosowane dla utleniania nadjodanem kwasów sialowych nie zmieniły szablonu SDS-PAGE preparatów EPO (por. fig. 1). Utlenianie kwasów sialowych doprowadziło do przesunięcia oligosacharydów w analizie HPAEC-PAD do wcześniejszych czasów wymywania.
(aa) Przebieg czasowy modyfikacji HES EPO-GT-1-A modyfikowaną hydroksyloaminą pochodną HES X, wytwarzanej według przykładu 2.4
400 μg modyfikowanej hydroksyloaminą pochodnej HES X dodano do 20 μg EPO-GT-1-A (łagodnie utleniany nadjodanem EPO, niehydrolizowany kwasem przed łagodnym utlenianiem nadjodanem) w 20 μl 0,5M buforu NaOAc pH 5,5 i reakcję zatrzymano po 30 min, 2, 4 i 17 godz., odpowiednio, przez zamrażanie próbek w ciekłym azocie. Następnie, próbki przechowywano w -20°C aż do dalszej analizy.
Dodano bufor próbki SDS-PAGE i próbki były ogrzewane do 90°C i nanoszone na żele SDS. Jak przedstawiono na figurze 12, zwiększanie czasów inkubacji doprowadziło do zwiększonego przesunięcia w kierunku wyższej masy cząsteczkowej proteiny. Po 17 godz. inkubacji w obecności modyfikowanej hydroksyloaminą pochodnej HES X wykryto rozmyte pasmo proteiny wybarwione przez Coomassie migrujące w obszarze między 60 i 11 kDa, W oparciu o położenie wzorców masy cząsteczkowej (patrz lewa część fig. 12). Po działaniu N-glikozydazą większość proteiny była przesunięta w kierunku położenia de-N-glikozylowanej EPO (patrz fig. 12, żel po prawej stronie) strzałka A wskazuje przesunięcie N-glikozydazy, strzałka B wskazuje przesunięcie de-N-glikozylowanej EPO; rozmyte
PL 216 545 B1 pasmo proteiny widoczne w obszarze między 28 kDa i 36 kDa wzorców masy cząsteczkowej prawdopodobnie odpowiada formom EPO, które są modyfikowane przez HES i miejsce O-glikozylacjI cząsteczki. Ze względu na specyficzność N-glikozydazy z tego wyniku wnioskujemy, że w istocie modyfikacja HES następuje przy utlenianych nadjodanem resztach kwasu sialowego glikanów proteiny EPO.
(bb) Charakterystyka koniugatów HES-EPO
Koniugaty HES-EPO I (pochodzące z EPO-GT-1 po łagodnym utlenianiu nadjodanem, tzn. z EPO-GT-1-A), II (powstałe z EPO- GT-1 poddanego przez 5 min hydrolizie kwasowej i łagodnemu utlenianiu nadjodanem), III (powstałe z EPO-GT-1 poddanego przez 10 min hydrolizie kwasowej i łagodnemu utlenianiu nadjodanem) zsyntetyzowano, jak opisano uprzednio.
Włączono kontrolną inkubację (K) zawierającą niemodyfikowany EPO-GT-1 w tych samych warunkach buforu, do którego dodano równoważną ilość niemodyfikowanego HES. Mieszaniny inkubacyjne poddano dalszemu oczyszczaniu w celu następującej po tym analizy biochemicznej pochodnych HES-EPO.
Inkubacje koniugatów HES-EPO I, II i III, jak również inkubację kontrolną K poddano etapowi oczyszczania Q-Sepharose jak opisano w punkcie „Materiały i Metody” (przykład 8.8), aby usunąć nadmiar nieprzereagowanego odczynnika HES, którego spodziewano się w przepływie przez kołumnę jonowymienną.
Wskutek dużych ilości zasadowych form EPO zawartych w próbkach II i III uprzednio poddanych działaniu kwasu, spodziewaliśmy się znacznych ilości modyfikowanego produktu EPO z tych inkubacji, przepływających z fazą ruchomą. Jak przedstawiono na figurze 13, niemal cały materiał EPO z próbek I był zatrzymany przez kolumnę Q-Sepharose, podczas gdy jedynie około 20-30% próbek III i II zostało odzyskane we frakcji wymywanej przy dużym stężeniu soli. Cały materiał proteinowy z inkubacji pochodną HES X, zarówno we frakcji niezwiązanej, jak i we frakcjach wymywanych przy dużym stężeniu soli, miał widoczną wyższą masę cząsteczkową w SDS-PAGE w porównaniu z EPO kontrolnym.
Aby scharakteryzować bardziej szczegółowo modyfikowane HES próbki EPO A i K (patrz figura 11) porównano z utlenianą nadjodanem formą EPO-GT-1-A. Próbki poddano działaniu N-glikozydazy i jak przedstawiono na figurach 14a i 14b, uwolnienie N-glikanów doprowadziło do dwóch pasm o niskiej masie cząsteczkowej w położeniu formy O-glikozylowanej i nieglikozylowanej EPO standardowego preparatu EPO.
W przypadku próbki A wykryto dalsze pasmo migrujące w położeniu 28 kDa wzorca masy cząsteczkowej sugerując modyfikację HES przy O-glikanie tej odmiany EPO (por. przykład 8.11 (c) (aa)). Pasmo to (a także poważnie modyfikowana HES forma N-glikozylowanej EPO o dużej masie cząsteczkowej, patrz fig. 14a i 14b) zanikło po poddaniu próbek łagodnej hydrolizie, co jest zgodne z poglądem, że modyfikację HES osiągnięto przy utlenianych nadjodanem resztach kwasu sialowego erytropoetyny.
Próbki mieszanin inkubacyjnych N-glikozydazy hydrolizowano stosując warunki umożliwiające pełne usuwanie reszt kwasów sialowych (i pochodnej HES połączonej z kwasem sialowym) z oligosacharydów; po zobojętnieniu, mieszaniny następnie absorbowano na małych kolumnach Hypercarb w celu ich odsalania.
Kolumny przemywano dokładnie wodą, a następnie wymywano związane neutralne oligosacharydy 40% acetonitrylem w H2O zawierającym 0,1% kwasu trifIuorooctowego. Uzyskane oligosacharydy poddawano MALDI/TOF-MS.
Widma frakcji desialilowanych oligosacharydów z próbki A, EPO-GT-1 -A i próbki K pokazały identyczne masy dla oligosacharydów typu kompleksu przy m/z = 1810 Da (diantenarny), 2175 = triantenarny, 2540 = tetraantenarny, 2906 = tetraantenarny plus 1 powtórzenie N-acetylolaktozaminy i 3271 = tetraantenarny plus 2 powtórzenia N-acetylolaktozaminy; wykryto małe sygnały odpowiadające brakowi fukozy (-146) i galaktozy (minus 162), które przypisuje się warunkom hydroiiza kwasowej stosowanym do usuwania kwasu sialowego (patrz figury MALDI 17, 18 i 19).
W równoległym doświadczeniu mieszaninę trawiącą N-glikozydazy zaabsorbowano na 1 ml kartridżu RP-C18 (bez uprzedniej hydrolizy kwasowej oligosacharydów) i wymywanie wykonano 5% acetonitrylem w wodzie zawierającej 0,1% TFA; w tych warunkach proteinę EPO zupełnie zatrzymano na materiale RF i oligosacharydy wymyto z kolumny 5% acetonitrylem w wodzie zawierającej 0,1% TFA. De-N-glikozylowaną proteinę EPO wymyto 70% acetonitrylem w H2O zawierającej 0,1% TFA. Frakcje oligosacharydowe z etapu RP-ClB próbki A poddanej działaniu N-glikozydazy, EPOGT-1-A i próbki K zneutralizowano i poddano odsalaniu stosując kartridże Hypercarb, jak opisano uprzednio.
PL 216 545 B1
Wyodrębnione oligosacharydy poddano mapowaniu HPAEC-PAD przed (patrz figura 15) i po łagodnym działaniu kwasem w warunkach umożliwiających ilościowe usuwanie kwasów sialowych z glikanów (patrz figura 16).
Profil HPAEC-PAD dla rodzimego materiału otrzymanego z modyfikowanej HES próbki A pokazał jedynie zaniedbywalne sygnały dla oligosacharydów, podczas gdy oligosacharydy wyprowadzone z EPO-GT-1-A wykazały ten sam profil glikonowy, co przedstawiony na fig. 11 (próbka zwana EPO-GT-1 po łagodnym działaniu nadjodanem). Profil wymywania oligosacharydów otrzymany z próbki kontrolnej EPO (K) dał spodziewany szablon (por. profil na figurze 8). Dla porównania, profil rodzimego oligosacharydu międzynarodowego wzorca EPO-BRP jest zawarty dla porównania i jako wzorzec odniesienia.
Po łagodnej hydrolizie kwasowej, wszystkie preparaty oligosacharydowe pokazały identyczny profil wymywania struktur neutralnych oligosacharydów (patrz figura 16) ze spodziewanym jakościowym i ilościowym składem łańcuchów węglowodanowych typu kompleksu di-, tri- i tetraantenarnego, jak opisano w dziale poświęconym metodom dla preparatu EPO, który zastosowano jako materiał wyjściowy w obecnym badaniu. Wynik ten pokazuje, że modyfikacja HES próbki EPO prowadzi wiązania kowalencyjnego pochodnej HES, która jest odłączona od proteiny EPO przez N-glikozydazę i jest Iabiina względem kwasu, ponieważ jest usuwana z N-glikanu stosując warunki łagodnego działania kwasu, o których wiadomo, że desialilują węglowodany (patrz figury 14 a + b).
(cc) Analiza składu monosacharydów HES-EPO i HES-EPO N-glikanów przez GC-MS
Aby dalej potwierdzić modyfikację HES EPO przy N-glikanach cząsteczki, próbki EPO wytrawiono N-glikozydazą i proteinę EPO zaadsorbowano na kartridżach RP-C18, podczas gdy materiał oligosacharydowy wymyto jak opisano powyżej. Jak przedstawiono w tablicy 2, pochodne hydroksyetylowanej glukozy i glukozy wykryto jedynie w proteinie EPO, którą poddano modyfikacji HES przy resztach cysteinowych i we frakcjach oligosacharydowych próbki EPO A2.
P r z y k ł a d 8.11 (d)
Próba in vivo aktywności biologicznej EPO modyfikowanego przez HES
Biopróbę EPO w układzie myszy normocytemicznych wykonano według procedury opisanej w Farmakopei Europejskiej; laboratorium, które wykonało próbę EPO stosowało preparat międzynarodowego wzorca odniesienia EPO-BRP. Dla modyfikowanego przez HES preparatu EPO A2 oznaczono średnią wartość aktywności specyficznej 294600 jednostek na mg proteiny EPO, co wskazuje na około 3-krotnie wyższą aktywność specyficzną w porównaniu do preparatu międzynarodowego wzorca odniesienia włączonego do próbek wysłanych do prób aktywności. Wyniki badania zestawiono w tablicy 3.
Odsyłacze literaturowe dla przykładów 1-8
Nimtz M., Noll G., Paques E. P., Conradt HS.
Carbohydrate structures of a human tissue plasminogen activator ekspresjonowanexpressed In recombinant Chinese hamster ovary cells.
FEBS Lett. 1990 Oct. 1; 271 (1-2): 14-8
Dorner A. J., Wasley L. C., Kaunnan R. J.
Increased synthesis of secreted proteins induces expression of glucose-regulated proteins In butyrate-treated Chinese hamster ovary cells.
J. Biol. Chem. 1989 Dec 5; 264 (34): 20602-7
Mueller P. P., Schlenke P., Nimtz M., Conradt H. S., Hauser H.
Recombinant glycoprotein quality in proliferation-controlled BHK-21 cells.
Biotechnol. Bioeng. 1999 Dec 5; 65 (5): 529-36
Nimtz M., Martin W., Wray V., Kloppel K. D., Augustin J., Conradt H. S.
Structures of sialylated oligosaccharide of human erythropoietin expressed in recobminant BHK-21 cells.
Eur. J. Biochem. 1993 Apr, 1; 213 (1): 39-56
Hermentin P., Witzel R. ,Vliegenthart J. F., Kamerling J. P., Nimtz M., Conradt H. S.
A strategy for the mapping of N-glycans by high pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection.
Anal. Blochem. 1992 Jun; 203 (2): 281-9.
Schroter S., Derr P., Conradt H. S., Nimtz M., Hale G., Kirchhoff C.
Male specific modification of human CD52.
J. Biol. Chem. 1999 Oct,15; 274 (42): 29862-73
PL 216 545 B1
P r z y k ł a d 9
Wytwarzanie rekombinacyjnej EPO
A) Wytwarzanie w komórkach ssaków
Rekombinacyjną EPO wytworzono w komórkach CHO następująco.
Plazmid zawierający cDNA ludzkiej EPO sklonowane do eukariotycznego wektora ekspresji (pCR3 i nazwany od niego pCREPO). Ukierunkowaną na miejsce mutagenezę wykonano stosując standardowe procedury jak opisano w: Grabenhorst, Nimtz, Costa i in., 1998, In vivo specificity of human alpha 1,3/4-fucosyltransferases III-VII in the biosynthesis of Lewis (x) and sialyl Lewis (x) motifs on complex-type N-glycans Coexpression studies from BHK-21 cells together with human betatrace protein, J. Biol. Chem., 273 (47), 30985-30994).
Komórki CHO trwale ekspresjonujące ludzki EPO lub jego odmiany aminokwasowe (np. Cys-29->Ser/Ala lub Cys-33->Ser/Ala, Ser- 126->Ala itd.) wytworzono stosując metodę wytrącania fosforanu wapnia i wybrano G418-siarczanem jak opisano w: (Grabenhorst i in.). Trzy dni po transfekcji, komórki subkultywowano 1:5 i wyselekcjonowano w DMEM zawierającym 10% FBS i 1,5 g/litr G418-siarczanu.
Stosując tę procedurę wyboru, zwykle 100-500 klonów przeżyło i reprodukowało w pożywce selekcji przez dalszy okres czasu 2-3 tygodni. Hodowlę komórkową supernatantów konfIuentnie rosnących monowarstw następnie analizowano na poziomy ekspresji EPO za pomocą analizy Western blot i analizy lEF/Western Blot.
EPO wytworzono z trwałych subklonów w kolbach typu „spinner” lub w 2-litrowych reaktorach perfuzyjnych. Różne glikoformy EPO z różnymi ilościami NeuAc (np. reszty 2-8, 4-10, 8-12 NeuAc) wyodrębniono według opublikowanych protokołów stosując kombinacje różnych procedur chromatograficznych, jak opisano poniżej.
Literatura
Grabenhorst, Conradt, 1999, The cytoplasmic, transmembrane, and stem regions of glikosyltransferases specify their in vivo functional sublocalization and stability in the Golgi., J. Biol. Chem., 274 (51), 36107-16;
Grabenhorst, Schlenke, Pohl, Nimtz, Conradt, 1999, Genetic engineering of recombinannt glycoproteins and the glycosylation pathway In mammalian host cells, Glycoconj J., 16 (2), 81-97;
Mueller, Schlenke, Nimtz, Conradt, Hauser, 1999, Recombinant glycoprotein product quality in proliferation-controlled BHK-21 cells. Biotechnology and bioengineering, 65 (5), 529-536;
Schlenke, Grabenhorst, Nimtz, Conradt, 1999, Construction and characterization of stably transfected BHK-21 cells with human-type sialilation characteristic, Cytotechnology,30 (1-3), 17-25.
B) Wytwarzanie w komórkach owadów
Rekombinacyjne ludzkie EPO wytworzono z owadzich linii komórkowych SF9 i SF 21 po infekcji komórek wektorem rekombinacyjnego bakulowirusa zawierającego ludzki cDNA EPO pod kontrolą promotera polihedrynowego, jak opisano w literaturze.
Komórki wyrosłe w pożywce hodowli pozbawionej surowicy zainfekowano przy gęstości komórek 2 x 106 lub x 107 komórek na ml i miana EPO oznaczano każdego dnia w supernatantach hodowli komórkowej. EPO oczyszczono za pomocą chromatografii z użyciem Blue sepharose, chromatografii jonowymiennej na Q-Sepharose i, na koniec, RP-HPLC na fazie C4.
Czystość produktu sprawdzono za pomocą SDS-PAGE i N-końcowego sekwencjonowania. Szczegółową analizę strukturalną węglowodanów (N- i O-glikozylacja) wykonano według opublikowanej procedury.
Literatura
Grabenhorst, Hofer, Nimtz, Jager, Conradt, 1993, Biosynthesis and secretion of human interleukin 2 glycoprotein variants from baculovirus-infected Sf21 cells.
Characterization of polypeptides and posttranslational modifications, Eur. J. Blochem., 215 (1), 189-97;
Quelle, Caslake, Burkert, Wojchowski, 1989, High-level expression and purification of a recombinant human erythropoietin produced using a baculovirus vector. Blood, 74 (2), 652-7.
P r z y k ł a d 10
Tworzenie reaktywnych pochodnych HES
1. SH-reaktywne HES
PL 216 545 B1
0,144 g (0,012 mmol) Okso-HES12KD (Eresenius, Patent Niemiecki nr DE 196 28 705 A1) rozpuszczono w 0,3 ml absolutnego dimetylosulfotlenku (DMSO) i dodano kroplami w atmosferze azotu do mieszaniny 34 mg (0,15 mmol) EMCH (Perbio Science, Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy) w 1,5 ml DMSO. Po mieszaniu przez 19 h w 60°C mieszaninę reakcyjną dodano do 16 ml mieszaniny etanolu i acetonu (1:1).
Osad zebrano przez odwirowanie, ponownie rozpuszczono w 3 ml DMSO i ponownie wytrącono jak opisano. SH-reaktywne HES12KD B otrzymano przez odwirowanie i suszenie in vacuo. Reakcję koniugacji z Tio-EPO opisano w przykładzie 11,2.2.
Alternatywy
W tej reakcji, mogą być użyte wszystkie środki sieciujące, które wykazują grupę hydrazydową i maleimidową, oddzielone przez rozpórkę. Dalsze przykłady cząsteczek tej grupy, dostępne z Perbio Science, Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy, przedstawiono w tablicy 1; oznaczone przez „A”. Ponadto, może także być użyta inna grupa środków sieciujących wykazujących aktywowaną grupę funkcyjną disiarczkową zamiast grupy funkcyjnej maleimidowej.
1,2 Pochodne chlorowcoacetamidowe glikozyloamin HES 1
a) Tworzenie glikozyloaminy1 mg próbki HES12KD rozpuszczono w 3 ml nasyconego wodorowęglanu amonu. Następnie, dodano jeszcze stały wodorowęglanu amonu, by utrzymać nasycenie roztworu podczas inkubacji przez 120 h w 30°C. Amino-HES12KD C odsolono przez bezpośrednią liofilizację mieszaniny reakcyjnej.
b) Acylowanie glikozyloaminy C bezwodnikiem kwasu chlorooctowego mg próbki Amino-HES 12KD C rozpuszczono w 1 ml 1M wodorowęglanu sodu i chłodzono na lodzie. Do tego dodano kryształ stałego bezwodnika kwasu chlorooctowego (~ 5 mg) i mieszaninę reakcyjną pozostawiono do ogrzania do temperatury pokojowej. pH monitorowano i dodano jeszcze zasady, jeśli pH spadło poniżej 7,0. Po dwóch godz. w temperaturze pokojowej, dodano drugą próbkę zasady i bezwodnika. Po sześciu godzinach produkt - chloroacetamid-HES D1 (X = Cl) odsolono przez przejście przez mieszane złoże żywic jonowymiennych Amberlite MB-3 (H) (OH).
2
c) Acylowanie glikozyloaminy bezwodnikiem bromooctowym1 2 3
Bezwodnik bromooctowy wytworzono jak opisał Thomas3. 1 mg próbki amino-HES12KD C rozpuszczono w 0,1 ml suchego DMF i ochłodzono na lodzie oraz dodano 5 mg bezwodnika bromooctowego. Mieszaninę reakcyjną powoli doprowadzono do temperatury pokojowej i roztwór mieszano przez 3 godz. Mieszaninę reakcyjną dodano do 1 ml mieszaniny 1:1 etanolu i acetonu w -20°C. Osad zebrano przez odwirowanie, ponownie rozpuszczono w 0,1 ml DMF i ponownie wytrącono jak opisano. Bromoacetamido-HES D2 (X = Br) otrzymano przez odwirowanie i suszenie pod obniżonym ciśnieniem. Reakcję koniugacji z Tio-EPO opisano w przykładzie 11, 1.2.
1 Manger, Wong, Rademacher, Dwek, 1992, Biochemistry, 31, 10733-10740, Manger, Rademacher, Dwek, 1992, Biochemistry, 31,10724-10732 2 Black, Kiss, Tulil Withers, 1993, Carbohydr, Res., 250, 195 3 'Thomas, 1977, Methodes Enzymol, 46, 362
PL 216 545 B1
d) Odpowiednią jodopochodną D3 (X = I) zsyntetyzowano tak, jak opisano dla bezwodnika bromooctowego użyto jodoctan N-sukcynimidylu
D2. Zamiast
i wszystkie etapy wykonano w ciemności.
Alternatywy
W celu acylowania grup aminowych, mogą być użyte inne aktywowane formy kwasów chlorowcokwasowych, np.:
- bromki lub chlorki;
- estry, np. ester N-hydroksysukcynimidowy, estry z podstawionymi fenolami (p-nitrofenol, pentafIuorofenol, trichlorofenol itp.).
Ponadto, mogłyby być użyte wszystkie środki sieciujące posiadające reaktywną grupę aminową oraz grupę chlorowcoacetyiową, oddzieloną przez rozpórkę.
Przykładem jest SBAP. Ta cząsteczka oraz inne są dostępne z Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy.
W tablicy 1 oznaczono je przez „D”. Odnośnie stosowania jako środki sieciujące dla ligacji amino-HES z tio-EPO bez wyodrębniania pochodnych chlorowcoacetamido-HES - patrz uwagi w przykładzie 11, 1.2.
1
1,3 Pochodne chlorowcoacetamidowe Amino-HES E1
a) Reakcja 1,4-diaminobutanu z Okso-HES12KD, by otrzymać amino-HES12KD E4
1,44 g (0,12 mmol) Okso-HES12KD rozpuszczono w 3 ml suchego dimetylosulfotlenku (DMSO) i dodano kroplami w atmosferze azotu do mieszaniny 1,51 ml (15 mmol) 1,4-diaminobutanu w 15 ml DMSO.
Po mieszaniu przez 19 h w 40°C mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml mieszaniny etanolu i acetonu (1:1).
Osad Amino-HES12KD E zebrano przez odwirowanie, ponownie rozpuszczono w 40 ml wody i dializowano przez 4 dni względem wody (rurka do dializy SnakeSkin, próg 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy) i liofilizowano.
b) Chloroacetamido-HES12KD F1 wytworzono jak opisano dla Chloroacetamido-HES12KD D1 w 1,3, powyżej.
c) Bromoacetamido-HES12KD F2 (X = Br) wytworzono jak opisano dla Bromoacetamido-HES12KD D2 w 1,3, powyżej. Reakcję koniugacji z Tio-EPO opisano w przykładzie 11,1,2.
d) Odpowiedniej jodo-pochodnej F3 (X = 1) nie wyodrębniono przed jej reakcją z Tio-EPO. Doświadczenie opisano w przykładzie 11,1.1.
Alternatywy Patrz 1.2, powyżej.
S. Fric, Diplomarbeit, Fachhochschule Hamburg, 1998
PL 216 545 B1
2. CHO-reaktywne HES
2.1 Hydrazydo-HES
a) Reakcja hydrazyny z Okso-HES 12KD
1,44 g (0,12 mmol) Okso-HES12KD rozpuszczono w 3 ml absolutnego dimetylosulfotlenku (DMSO) i dodano kroplami w atmosferze azotu do mieszaniny 0,47 ml (15 mmol) hydrazyny w 15 ml DMSO. Po mieszaniu przez 19 h w 40°C mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml mieszaniny 1:1 etanolu i acetonu. Wytrącony produkt J zebrano przez odwirowanie, ponownie rozpuszczono w 40 ml wody i dializowano przez 2 dni względem 0,5% (v/v) trietyloaminy w roztworze wodnym i przez 2 dni względem wody (rurka do dializy SnakeSkin, próg 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy) i liofilizowano. Reakcję koniugacji z utlenioną Gliko-EPO opisano w przykładzie 12, 2.2.
b) Reakcja dihydrazydu adypowego z Okso-HES 12KD
1,74 g (15 mmol) dihydrazydu adepowego rozpuszczono w 20 ml absolutnego dimetylosulfotlenku (DMSO) w 65°C i 1,44 g (0,12 mmol) Okso-HES 12KD, rozpuszczonego w 3 ml absolutnego DMSO, dodano kroplami w atmosferze azotu. Po mieszaniu przez 68 h w 60°C mieszaninę reakcyjną dodano do 200 ml wody. Roztwór zawierający L dializowano przez 2 dni względem 0,5% (v/v) roztworu trietyloaminy w wodzie i przez 2 dni względem wody (rurka do dializy SnakeSkin, próg 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy) i liofilizowano. Reakcję koniugacji z utlenionym Gliko-EPO opisano w przykładzie 12, 2.2.
Alternatywy
Ponadto, można użyć pochodne, w których 2 grupy hydrazydowe są oddzielone przez dowolną rozpórkę.
3. Dalsze pochodne 7vinino-HES12KD I oraz H1
Amonolizę D lub F wykonano oddzielnie przez rozpuszczenie 1 mg próbki każdego chlorowcoacetamidu w 0,1 ml nasyconego węglanu amonu. Następnie, dodano dalszy stały węglan amonu, by utrzymać nasycenie roztworu podczas inkubacji przez 120 h w 30°C. Mieszaninę reakcyjną dodano do 1 ml mieszaniny etanolu i acetonu (1:1) w -20°C. Osad zebrano przez odwirowanie, ponownie rozpuszczono w 0,05 ml wody i ponownie wytrącono, jak opisano. Produkt - aminoHES H lub I otrzymano przez odwirowanie I suszenie pod obniżonym ciśnieniem. Reakcję koniugacji z utlenionym Gliko-EPO opisano w przykładzie 12, 4.1.
PL 216 545 B1
4. Modyfikowane hydroksyloaminą HES12KD K
O-[2-(2-aminooksyetoksy)etylo]hydroksyloaminę zsyntetyzowano jak opisali Boturyn i in. w 2 eta5 pach z handlowo dostępnych materiałów5. 1,44 g (0,12 mmol) Okso-HES12KD rozpuszczono w 3 ml absolutnego dimetylosulfotlenku (DMSO) i dodano kroplami w atmosferze azotu do mieszaniny 2,04 g (15 mmol) O-[2-(2-aminooksyetoksy)etylo]hydroksyloaminy w 15 ml DMSO. Po mieszaniu przez 48 h w 65°C mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml mieszaniny 1:1 etanolu i acetonu. Wytrącony produkt K zebrano przez odwirowanie, ponownie rozpuszczono w 40 ml wody i dializowano przez 4 dni względem wody (rurka do dializy SnakeSkin, próg 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy) i liofilizowano. Reakcję koniugacji z utlenioną Gliko-EPO opisano w Przykładzie 12, 3.1.
Alternatywy
Ponadto, można użyć pochodne, w których dwie grupy hydroksyloaminowe są oddzielone przez dowolną rozpórkę.
5. Tio-HES12KD
5.1 Addycja do Okso-HES12KD
1,44 g (0,12 mmol) Okso-HES12KD rozpuszczono w 3 ml absolutnego dimetylosulfotlenku (DMSO) i dodano kroplami do mieszaniny 1,16 g (15 mmol) cysteaminy w 15 ml DMSO w atmosferze azotu. Po mieszaniu przez 24 h w 40°C mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml mieszaniny etanolu i acetonu (1:1). Wytrącony produkt M zebrano przez odwirowanie, ponownie rozpuszczono w 40 ml 5 Boturyn, Boudai, Constant, Defrancq,Lhomme, 1997, Tetrahedron, 53, 5485
PL 216 545 B1 wody i dializowano przez 2 dni względem 0,5% (v/v) trietyloaminy w roztworze wodnym i przez 2 dni względem wody (rurka do dializy SnakeSkin, próg 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy) i liofilizowano. Reakcję koniugacji z utlenioną Gliko-EPO opisano w przykładzie 12, 2.1.
Alternatywy
Można użyć pochodne, w których grupa aminowa i grupa tio są oddzielone przez dowolną rozpórkę. Ponadto, grupę aminową w pochodnych można zastąpić przez hydrazynę, hydrazyd lub hydroksyloaminę. Grupa tio może być zabezpieczona w formie np. disiarczku lub pochodnej trytylowej. Jednak, w tym przypadku, dalszy etap odbezpieczenia musi być wykonany przed koniugowaniem, które uwolniłoby składnik analogiczny do M.
5.2 Modyfikacja Amino-HES12KD E, H lub I a) Modyfikacja przy użyciu SATA/SATP
1,44 g (0,12 mmol) Amino-HES12KD E, H lub I rozpuszczono w 3 ml absolutnego dimetylosulfotlenku (DMSO) i dodano kroplami do mieszaniny 139 mg (0,6 mmol) SATA w 5 ml DMSO w atmosferze azotu. Po mieszaniu przez 24 h w temperaturze pokojowej mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml mieszaniny etanolu i acetonu (1:1). Wytrącony produkt N zebrano przez odwirowanie, ponownie rozpuszczono w 40 ml wody i dializowano przez 2 dni względem wody (rurka do dializy SnakeSkin, próg 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy) i liofilizowano.
Odbezpieczenie wykonano w 50 mM buforze fosforanu sodu, zawierającym 25 mM EDTA i 0,5M hydroksyloaminy, pH 7,5, przez 2 godz. w temperaturze pokojowej i produkt O oczyszczono przez dializę względem 0,1M buforu octanu sodu, pH 5,5, zawierającego 1 mM EDTA. Reakcję odbezpieczenia wykonano bezpośrednio przed reakcją koniugacji, którą opisano w przykładzie 12, 2.1.
b) Modyfikacja przy użyciu SPDP
1,44 g (0,12 mmol) Amino-HES 12KD E, H lub I rozpuszczono w 3 ml absolutnego dimetylosulfotlenku (DMSO) i kroplami dodano do mieszaniny 187 mg (0,6 mmol) SPDP w 5 ml DMSO w atmosferze azotu. Po mieszaniu przez 24 h w temperaturze pokojowej mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml mieszaniny 1:1 etanolu i acetonu. Wytrącony produkt P zebrano przez odwirowanie, ponownie rozpuszczono w 40 ml wody, dializowano przez 2 dni względem wody (rurka do dializy SnakeSkin, próg 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy) i liofilizowano.
Odbezpieczenie wykonano w roztworze 12 mg ditiotreitolu (DTT) na 0,5 ml 100 mM buforu octanu sodu, zawierającego 100 mM chlorku sodu przy pH 4,5 przez 30 min w temperaturze pokojoPL 216 545 B1 wej i produkt Q oczyszczono przez dializę względem 0,1M buforu octanu sodu, pH 5,5, zawierającego 1 mM EDTA. Reakcję odbezpieczenia wykonano bezpośrednio przed reakcją koniugacji, którą opisano w przykładzie 12, 2.1.
Alternatywy
Odnośnie przemiany grup aminowych w tiolowe, w postaci wolnej lub zabezpieczonej, dostępne jest szereg reagentów. Po modyfikacji, produkty można wyodrębnić. Alternatywnie, jak dopuszczono w przypadku stosowania środków sieciujących, mogą one być bezpośrednio stosowane do reakcji sprzęgania, korzystnie po etapie oczyszczania. W celu wyodrębnienia i przechowywania pochodnych tio-HES, może być przydatna synteza pochodnych tio-HES w postaci zabezpieczonej. W tym celu można stosować wszelkie pochodne, które są analogiczne do SATA, które mają aktywną grupę estrową i grupę tioestrową, oddzielone przez dowolną rozpórkę. SATP, będący dalszym elementem tej grupy jest w tablicy 1 oznaczony przez „H”. Pochodne analogiczne do SPDP mogą mieć aktywną grupę estrową i grupę disiarczkową, oddzielone przez dowolną rozpórkę. Dalsze elementy tych grup są w tablicy 1 oznaczone przez „F”. Dalsze analogiczne pochodne mogą mieć aktywną grupę estrową i grupę tiolową, zabezpieczoną jako pochodna trytylowa, oddzielone przez dowolną rozpórkę.
P r z y k ł a d 11
Reakcje koniugacji z Tio-EPO
1. Reakcja Tio-EPO z modyfikowanym chlorowcoacetamidem SH-reaktywnym HES
1.1 Przykładowy protokół 1
Koniugacja TioEPO do Amino-HESl2KD (E, H lub I) ze środkiem sieciującym zawierającym NHS-aktywny ester i grupę jodoacetamidową, np.SIA6.
Materiały
A. Bufor boranowy. Skład: 50 mM boranu sodu, pH 8. 3,5 mM EDTA.
B. PBS, roztwór soli buforowany fosforanem:10 mM fosforanu sodu, 150 mM NaCl, pH 7,4.
C. AminoHES 12KD E, H lub I. Wytwarzane przy 1 mg/ml w buforze boranowym.
D. Roztwór podstawowy środka sieciującego: 14 mg SIA rozpuszczono w 1 ml DMSO.
E. Kolumny odsalające D-Salt™ Dekstran, 2 x 5 ml - objętość złoża (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy).
®
F. Środek do badania zawartości proteiny Coomassie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy).
G. Roztwór TioEPO: 5 mg/ml TioEPO 1 w buforze boranowym.
H. Mikrozatężacz: Microcon YM-3 (amicon, Milipore GmbH, Eschborn, Niemcy).
Metoda
100 μl roztworu SIA dodano do 400 μl roztworu aminoHES12KD E i pozostawiono do przereagowania z mieszaniem przez 0,5 godz. w temperaturze pokojowej. Nadmiar środka sieciującego usunięto przez odwirowywanie próbki przy 14000 x g przez 60 minut stosując mikrozatężacz. Po odwirowywaniu próbkę doprowadzono do pierwotnej objętości w buforze boranowym i proces ten powtórzono jeszcze dwa razy. Resztkowy roztwór dodano do 1 ml roztworu TioEPO i mieszaninę reakcyjną inkubowano przez 16 h w temperaturze pokojowej. Reaktywność nadmiaru jodoacetamidu „zgaszono” przy końcu okresu inkubacji przez dodanie cysteiny do końcowego stężenia 10 mM. Mieszaninę reakcyjną wprowadzono na kolumnę odsalającą doprowadzoną do równowagi przy użyciu buforu PBS i zawartość protein we frakcjach monitorowano za pomocą odczynnika do zawartości protein Coomassie. Wszystkie frakcje zawierające koniugat proteinowy zebrano i koniugat otrzymano przez liofilizację po dializie względem wody przez noc.
Alternatywy
W tej reakcji mogą być użyte wszystkie środków sieciujących, które mają grupę sukcynimidową lub sulfosukcynimidową i grupę jodoacetamidową oddzielone przez rozpórkę.
Dalsze przykłady podano w tablicy 1. Są one oznaczone przez „C” i są dostępne z Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy.
1.2 Przykładowy protokół 2
Koniugacja TioEPO do SH-reaktywnego HES12KD bromoacetamidu D2, F2 lub jodoacetamidu D37.
6 Cumber, Forrester,Foxwell, Ross,Thorpe, 1985, Methods Enzymol., 112, 207 7 deValasco, Merkus, Anderton, Verheul, Lizzio, Van der Zee, van Eden, Hoffmami, Verhoef, Snippe, 1995, Infect. Immun., 63, 961
PL 216 545 B1
Materiały
A. Bufor fosforanowy - skład; 100 mM fosforanu sodu, pH 6,1, 5 mM EDTA.
B. PBS, roztwór soli buforowany fosforanem: 10 mM fosforanu sodu, 150 mM NaCl, pH 7,4.
C. SH-reaktywny HES12KD bromoacetamid D2. Wytwarzane przy 10 mg/ml w buforze fosforanowym.
D. Kolumny odsalające D-Salt™ Dekstran, objętość złoża - 2 x 5 ml (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy).
®
E. Środek do badania zawartości proteiny Coomassie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy).
F. Roztwór TioEPO: 5 mg/ml TioEPO 1 w buforze fosforanowym.
Metoda ml roztworu SH-reaktywnego HES12KD bromoacetamidu D2 i 1 ml roztworu TioEPG połączono i mieszaninę reakcyjną inkubowano przez 48 godz. w temperaturze pokojowej. Reaktywność nadmiaru bromoacetamid „zgaszono” przy końcu okresu inkubacji przez dodanie cysteiny do końcowego stężenia 10 mM. Mieszaninę reakcyjną wprowadzono na kolumnę odsalającą, doprowadzoną do równowagi buforem PBS. Zawartość protein we frakcjach monitorowano stosując środek do bada® nia zawartości proteiny Coomassie®, przy czym wszystkie frakcje zawierające koniugat proteinowy zebrano i koniugat otrzymano przez liofilizację po dializie względem wody przez noc.
Alternatywy
Zamiast wyodrębnienia SH-reaktywnego HES12KD-bromoacetamidu D2, aminoHES12KD (E, H, I) może być połączony ze środkiem sieciującym poprzez grupę sukcynimidową i bromoacetamidową (patrz: 1,1 powyżej). SBAP jest elementem tej grupy środków sieciujących i jest w tablicy 1 oznaczony przez „D”.
2. Reakcja Tio-EPO z modyfikowanym przez maleimid SH- reaktywnym HES
2.1. Przykładowy protokół 4
Koniugacja TioEPO z Maleimido-HES12KD B.
Materiały
A. Maleimido-HES12KD B: 10 mg/ml w 0,1M buforu octanu sodu, pH 5,5.
B. Roztwór TioEPO: 5 mg/ml TioEPO w buforze fosforanowym/NaCl.
C. Eosforan/NaCl: 0,1M fosforan sodu, 50 mM NaCl, pH 7,0.
®
D. Kolumna filtracji żelowej: np. Sephadex® G-200 (1,5 x 45 cm).
®
E. Środek do badania zawartości proteiny Coomassie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy).
F. PBS, roztwór soli buforowany fosforanem: 10 mM fosforanu sodu, 150 mM NaCl, pH 7,4.
Metoda ml roztworu SH-reaktywnego HES12KD B i 1 ml roztworu TioEPO 1 połączono i mieszaninę reakcyjną inkubowano przez 2 godz. w temperaturze pokojowej. Reaktywność nadmiaru maleimidów „zgaszono” przy końcu okresu inkubacji przez dodanie cysteiny do końcowego stężenia 10 mM. Mie® szaninę reakcyjną wprowadzono na kolumnę Sephadex® G-200 (1,5 x 45 cm) doprowadzoną do równowagi przy użyciu buforu PBS i zebrano 1-ml frakcje. Zawartość protein frakcji monitorowano za pomocą odczynnika do zawartości protein Coomassie. Wszystkie frakcje zawierające koniugat proteinowy zebrano i koniugat otrzymano przez liofilizację po dializie względem wody przez noc.
2.2 Przykładowy protokół 12
Koniugacja TioEPO do aminoHES12KD (E, H, I) ze środkiem sieciującym zawierającym NHS-aktywny-ester i grupę maleimidową, np. SMCC.
Materiały
A: Mikrozatężacz: Mikrocon YM-10 (Amicon, Milipore GmbH, Eschborn, Niemcy).
B. PBS, roztwór soli buforowany fosforanem: 10 mM fosforanu sodu, 150 mM NaCl, pH 7,4.
C. AminoHES 12KD E, H lub I. Wytwarzane przy 10 mg/ml w buforze PBS.
D. Roztwór SMCC: 1 mg SMCC rozpuszczono w 50 μl DMSO.
E. Kolumny odsalające D-Salt™ Dekstran, objętość złoża - 2 x 5 ml (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy).
®
F. Środek do badania zawartości proteiny Coomassie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy).
G. Roztwór TioEPO 1: 5 mg/ml TioEPO 1 w buforze PBS.
PL 216 545 B1
Metoda
Do 50 μl roztworu SMCC dodano 400 μl roztworu aminoHES12KD E i mieszaninę reakcyjną pozostawiono do przereagowania mieszając przez 80 min w temperaturze pokojowej i przez 10 min w 46°C. Nadmiar środka sieciującego usunięto przez odwirowanie mieszaniny reakcyjnej przez mikrozatężacz przy 14000 x g przez 60 min. Objętość doprowadzono do 450 μl przy użyciu buforu PBS i proces powtórzono jeszcze dwukrotnie. Po ostatnim odwirowaniu, resztkowy roztwór doprowadzono do 450 μl stosując PBS i dodano do 1 ml roztworu TioEPO i mieszaninę reakcyjną inkubowano przez 16 godz. w temperaturze pokojowej. Reaktywność nadmiaru maleimidu „zgaszono” przy końcu okresu inkubacji przez dodanie cysteiny do końcowego stężenia 10 mM. Mieszaninę reakcyjną wprowadzono na kolumnę odsalającą doprowadzoną do równowagi buforem PBS. Zawartość protein we frakcjach monitorowano za pomocą odczynnika do zawartości protein Coomassie, przy czym wszystkie frakcje zawierające koniugat proteinowy zebrano i koniugat otrzymano przez liofilizację po dializie względem wody przez noc.
Alternatywy
W tej reakcji, mogą być użyte wszystkie środki sieciujące, które mają grupę sukcynimidową lub sulfosukcynimidową i maleimidową, oddzielone przez rozpórkę. Dalsze przykłady tej grupy cząsteczek, dostępne z Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy, podano w tablicy 1 jako oznaczone przez „E”.
Istnieje dalsza grupa środków sieciujących, które zamiast grupy maleimidowej mają aktywowaną grupę disiarczkową. Te środki sieciujące także mogą być użyte do koniugacji. Jednak disiarczkowe wiązanie koniugatu jest rozszczepialne w warunkach redukcyjnych. Elementy tej grupy podano w tablicy 1 jako „F”. Trzecia grupa środków sieciujących stosuje, zamiast grupy maleimidowej, grupę winylosulfonową jako grupę SH-reaktywną. Element tej grupy „SVSB” oznaczono w tablicy 1 przez „G”.
P r z y k ł a d 12
Reakcje koniugacji z utlenionym EPO
1. Utlenianie Gliko-EPO
1.1 Utlenianie Gliko-EPO przy użyciu meta-nadjodanu sodu: przykładowy protokół 5
Materiały
A. Roztwór Gliko-EPO: 10 mg/ml Gliko-EPO w buforze octanowym.
B. Roztwór meta-nadjodanu sodu: 10 mM lub 100 mM nadjodanu sodu w buforze octanowym, wytwarzane na świeżo. Trzymać w ciemności. Stosując te roztwory, końcowe stężenie nadjodanu sodu w mieszaninie utleniającej wynosi 1 mM lub 10 mM, odpowiednio.
C. Bufor octanowy: 0,1M buforu octanu sodu, pH 5,5.
D. Gliceryna.
E. Mikrozatężacz: Mikrocon YM-3 (amicon, Milipore GmbH, Eschborn, Niemcy).
Metoda
Wszystkie etapy wykonano w ciemności.
Do 1 ml zimnego roztworu Gliko-EPO dodano 0,1 ml zimnego roztworu meta-nadjodanu sodu i pozostawiono, by reakcja utleniania przebiegała przez Ihw ciemności. Jeśli Gliko-EPO przeznaczony do utleniania zawierał reszty kwasu sialowego, wtedy warunki utleniania były następujące: 1 mM nadjodanu sodu, 0°C. W przeciwnym razie stosowano: 10 mM nadjodanu sodu w temperaturze pokojowej. Aby zatrzymać utlenianie dodano glicerynę do końcowego stężenia 15 mM i inkubowano przez 5 minut w 0°C. Nadmiarowe odczynniki i produkty uboczne usunięto przez odwirowywanie produktu przy 14000 x g przez 60 minut stosując mikrozatężacz. Po odwirowaniu, próbkę doprowadzono do pierwotnej objętości w buforze stosowanym w następnym etapie modyfikacji, np. w buforze octanowym. Proces ten powtórzono jeszcze dwukrotnie.
1.2 Enzymatyczne utlenianie Gliko-EPO: przykładowy protokół 6
Enzymatyczne utlenianie EPO opisano gdzie indziej (Chamów i in., 1992, J. Biol. Chem., 267, 15916-15922).
2. Koniugacja z pochodnymi hydrazyny/hydrazydu
2.1 Przykładowy protokół 7
Koniugacja utlenionego Gliko-EPO do Tio-HES12KD M, O lub Q ze środkiem sieciującym zawierającym grupę hydrazydową i maleimidową, np. M2C2H (Perbio Science, Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy).
PL 216 545 B1
Materiały
A. Roztwór podstawowy M2C2H; 10 mg/ml M2C2H w DMSO, wytwarzany na świeżo.
B. Roztwór utlenionego Gliko-EPO z 6.1.1: 5 mg/ml Gliko-EPO w buforze octanowym.
C. Tio-HES 12KD M, O lub Q: 10 mg/ml w buforze fosforanowym/NaCl.
D. Bufor octanowy; 0,1M buforu octanu sodu, pH 5,5.
E. Fosforan/NaCl: 0,1M fosforan sodu, 50 mM NaCl, pH 7,0.
E. Mikrozatężacz: Mikrocon YM-3 (Amicon, Milipore GmbH, Eschborn, Niemcy).
®
G. Kolumna filtracji żelowej: np. Sephadex® G-200 (1,5 x 45 cm).
®
H. Środek do badania zawartości proteiny Coomassie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy).
I. PBS, roztwór soli buforowany fosforanem: 10 miM fosforanu sodu, 150 mM NaCl, pH 7,4.
Metoda
Roztwór podstawowy M2C2H dodano do 1 ml utlenionego Gliko-EPO do końcowego stężenia 1 mM i pozostawiono do przereagowania mieszając 2 godz. w temperaturze pokojowej. Nadmiar środka sieciującego usunięto przez odwirowywanie próbki przy 14000 x g przez 60 minut stosując mikrozatężacz. Po odwirowywaniu próbkę doprowadzono do jej pierwotnej objętości w buforze fosforanowym/NaCl i proces ten powtórzono jeszcze dwukrotnie. Do modyfikowanego przez M2C2H Gliko-EPO dodano 1 ml roztworu Tio-HES12KD M, O lub Q i mieszaninę reakcyjną inkubowano przez 16 godz. w temperaturze pokojowej. Reaktywność nadmiaru maleimidów „zgaszono” przy końcu okresu inkubacji przez dodanie cysteiny. Mieszaninę reakcyjną wprowadzono na kolumnę Sephadex G-200 (1, 5 x 45 cm) doprowadzoną do równowagi za pomocą PBS i zbierano 1-ml frakcje. Zawartość protein we frakcjach monitorowano za pomocą odczynnika do zawartości protein Coomassie, przy czym wszystkie frakcje zawierające koniugat proteinowy zebrano i koniugat otrzymano przez liofilizację po dializie względem wody przez noc.
Uwagi dotyczące postępowania
Addukt hydrazonowy jest nieco mniej trwały przy skrajnym pH. W zastosowaniach, które mogą wiązać się z operacjami przy niskim pH, zredukowaliśmy hydrazon przez działanie 30 mM cyjanoborowodorku sodu w buforze PBS do hydrazyny. W większości zastosowań ten dodatkowy etap jest zbędny.
2.2 Przykładowy protokół 8
Bezpośrednia koniugacja utlenionego Gliko-EPO z hydrazydo-HES12KD L
Materiały
A. Roztwór utlenionego Gliko-EPO z 6.1.1: 5 mg/ml Gliko-EPO w buforze octanowym.
B. Hydrazydo-HESlSKD L lub J: 10 mg/ml w buforze octanowym.
C. Bufor octanowy: 0,1M buforu octanu sodu, pH 5,5.
D. Kolumna filtracji żelowej: Np. Sephadex G-200 (1,5 x 45 cm).
®
E. Środek do badania zawartości proteiny Coomassie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy).
F. PBS, roztwór soli buforowany fosforanem: 10 mM fosforanu sodu, 150 mM NaCl, pH 7,4.
Metoda ml roztworu hydrazydo-HES12KD L i 1 ml roztworu utlenionego Gliko-EPO połączono i mieszaninę reakcyjną pozostawiono do przereagowania mieszając przez 16 godz. w temperaturze poko® jowej. Mieszaninę reakcyjną wprowadzono na kolumnę Sephadex® G-200 (1,5 x 45 cm) doprowadzoną do równowagi za pomocą PBS i zbierano 1-ml frakcje. Zawartość protein we frakcjach monitorowano za pomocą odczynnika do zawartości protein Coomassie, wszystkie frakcje zawierające koniugat proteinowy zebrano i koniugat otrzymano przez liofilizację po dializie względem wody przez noc. Rezultat koniugacji przedstawiono na figurze 24. Obserwowane przesunięcie molekularne pokazuje, że koniugacja była pomyślna. „Rozmazanie” wynika z heterogeniczności HES. Figura 25 pokazuje, że HES jest skoniugowane z ugrupowaniem węglowodanowym węglowodanowego łańcucha bocznego.
Uwagi dotyczące postępowania
Addukt hydrazonowy jest nieco mniej trwały przy skrajnym pH. W zastosowaniach, które mogą wiązać się z operacjami przy niskim pH, zredukowaliśmy hydrazon przez działanie 30 mM cyjanoborowodorku sodu w buforze PBS do hydrazyny. W większości zastosowań ten dodatkowy etap jest zbędny.
PL 216 545 B1
3. Koniugacja z pochodnymi hydroksyloaminy8
3.1 Przykładowy protokół 9
Koniugacja utlenionego Gliko-EPO do hydroksyloamino-HES12KD K
Materiały
A. Roztwór utlenionego Gliko-EPO z 6.1.1: 5 mg/ml Gliko-EPO w buforze octanowym.
B. Hydroksyloamino-HES12KD K: 10 mg/ml w buforze octanowym.
C. Bufor octanowy: 0,1M buforu octanu sodu, pH 5,5.
D. Kolumna filtracji żelowej: Np. Sephadex G-200 (1,5 x 45 cm).
®
E. Środek do badania zawartości proteiny Coomassie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy).
E. PBS, roztwór soli buforowany fosforanem: 10 mM fosforanu sodu, 150 mM NaCl, pH 7,4.
Metoda ml roztworu hydroksyloamino-HES12KD K i 1 ml roztworu utlenionego Gliko-EPO połączono i mieszaninę reakcyjną pozostawiono do przereagowania mieszając przez 16 godz. w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną wprowadzono na kolumnę Sephadex G-200 (1,5 x 45 cm) doprowadzoną do równowagi za pomocą PBS 1 zbierano 1-ml frakcje.
Zawartość protein we frakcjach monitorowano za pomocą odczynnika do zawartości protein Coomassie i zebrano wszystkie frakcje zawierające koniugat proteinowy, a koniugat otrzymano przez liofilizację po dializie względem wody przez noc.
Rezultat koniugacji przedstawiono na figurze 24. Obserwowane przesunięcie molekularne na pasku 2 pokazuje, że koniugacja była pomyślna. „Rozmazanie” wynika z heterogeniczności HES. Figura 25 pokazuje, że HES jest skoniugowane z ugrupowaniem węglowodanowym węglowodanowego łańcucha bocznego.
P r z y k ł a d 13
Charakterystyka oksydazy galaktozowej poddanej działaniu EPO N-glikanów
Rekombinacyjne EPO lub częściowo desialilowane formy EPO (utworzone przez ograniczoną łagodną hydrolizę kwasową) inkubowano oksydazą galaktozową w obecności katalazy w 37°C od 30 min - 4 godz. w 37°C w 0,05M buforze fosforanowym Na, pH 7,0.
Postęp reakcji monitorowano przez usuwanie 50 μg próbki EPO i następne działanie na proteinę polipeptydem N-glikanazy. Uwolnione N-połączone oligosacharydy (monitorowane przez detekcję SDS-PAGE de-N-glikozylowanego polipeptydu) poddano mapowaniu HPAEC-PAD, jak opisano (Grabenhorst i in., 1999, Nimtz i in., 1993/1994; Schlenke i in., 1999) przed i po usuwaniu kwasów sialowych.
Oznaczenie ilościowe reszt utlenionej galaktozy w poszczególnych oligosacharydach EPO wykonano przez typowe przesunięcie obserwowane w HPAEC-PAD i także zweryfikowano przez MALDI/TOF MS mieszanin oligosacharydu.
P r z y k ł a d 14
Charakterystyka EPO modyfikowanego przez HAS
Rozdział form EPO modyfikowanych przez HAS od nieprzereagowanej EPO oraz cząsteczek prekursora HAS osiągnięto przez filtrację żelową stosując np. Ultrogel AcA 44/54 lub podobne ośrodki filtracji żelowej. Alternatywnie, nie przereagowane HAS usunięto przez wyodrębnienie EPO na zasadzie powinowactwa immunologicznego na 4-ml kolumnie zawierającej przeciwciało monoklonalne sprzężone z Affigel (BioRad) i następnie oddzielenie niemodyfikowanej EPO przez filtrację żelową (np. stosując matrycę umożliwiającą oddzielenie protein globularnych o względnej masie cząsteczkowej między 20 kDa i 200 kDa).
EPO modyfikowane przez HAS zidentyfikowano za pomocą analizy SDS-PAGE (stosując żele akrylamidowe 12,5 lub 10%) przez detekcję ich wyższej masy cząsteczkowej w porównaniu z niemodyfikowanym EPO po wybarwieniu żeli za pomocą Coomassie Brillant Blue.
Wyższą masę cząsteczkową polipeptydów EPO modyfikowanych przez HAS także zidentyfikowano za pomocą analizy Western Blot próbek stosując przeciwciało poliklonalne przeciw rekombinacyjnemu ludzkiemu EPO.
Modyfikację N-glikanową form EPO pokazano przez ich pomyślne usuwanie z proteiny EPO N-glikanazą polipeptydową (rekombinacyjna N-glikozydaza z firmy Roche, Niemcy stosując 25 jedn./mg proteiny EPO w 37°C przez 16 godz); Analiza SDS- PAGE doprowadziła do typowego 8 Rose, 1994, Am. Chem. Soc., 116, 30
PL 216 545 B1 przesunięcia proteiny EPO do przesunięcia niemodyfikowanej EPO o około 20 kDa, na które działano N-glikozydazą.
Modyfikację pojedynczego desialilowanego i poddanego działaniu oksydazy glakatozowej O-glikanu EPO przy Ser 126 pokazano przez migrację SDS-PAGE de-N-glikozylowanego produktu przez detekcję jego przesunięcia w porównaniu do nieprzereagowanego de-N-glikozylowanej EPO. Jeśli było to wymagane, modyfikowane EPO poddano frakcjonowaniu przez RP-HPLC na fazie CS przed analizą SDS-PAGE.
Modyfikację HAS O-glikanu EPO także poddano analizie przez β-eliminację O-glikanu i detekcję de-O-glikozylowanej formy EPO w Western blot stosując przeciwciało poliklonalne względem rekombinacyjnej ludzkiej EPO.
P r z y k ł a d 15
Oznaczenie ilościowe EPO i modyfikowanych form EPO
Formy EPO oznaczono ilościowo przez pomiary UV, jak opisano w: Ph. Eur (2000, Erythropoetini solutio concentrata, 1316, 780-785) i porównano z BRP - międzynarodowym wzorcem odniesienia EPO. Alternatywnie, stężenia EPO oznaczono przez próbę RP-HPLC stosując kolumnę RP 04 i absorpcję przy 254 nm stosując 20, 40, 80 i 120 μg BRP - wzorca odniesienia EPO do kalibracji.
P r z y k ł a d 16
Aktywność biologiczna in vitro modyfikowanej przez HES rekombinacyjnej ludzkiej EPO
Oczyszczone, modyfikowane przez HES EPO zbadano na aktywność stosując próbę bioaktywności erytropoetyny opisaną przez Krystal (Krystal, 1984, Exp. Heamatol., 11, 649-660).
Anemię indukowano u myszy NMRI przez działanie chlorowodorkiem fenylohydrazyny; zebrano komórki śledziony i stosowano jak opisano w: (Fibi i in.,1991, Blood, 77, s.1203 i dalsze).
5
Rozcieńczenia EPO inkubowano 3 x 105 komórkami/zagłębienie na płytkach do mikromiareczkowania o 96 zagłębieniach. Po 24 godz. w 37°C w atmosferze nawilgoconej (5% CO2) komórki zna3 kowano przez 4 godz. 1 μφ H-tymidyny na zagłębienie.
Włączoną radioaktywność oznaczono przez zliczanie scyntylacji w cieczy. Dla porównania stosowano BRP - międzynarodowy wzorzec odniesienia EPO.
Alternatywnie, bioaktywność EPO zmierzono przez próbę in vitro stosując wrażliwą na EPO linię komórkową TE-1 [Kitamura i in., (J. Cell Phys., 140, 323-334)].
Rosnące wykładniczo komórki przemywano do pozbawienia czynników wzrostu i inkubowano w obecności rozcieńczeń seryjnych EPO przez dalsze 48 godz.
Proliferację komórek oceniono stosując próbę redukcji MTT jak opisano w: (Mosman, 1983,
J. Immunol. Methods, 65,55-63).
P r z y k ł a d 17
Oznaczenie aktywności in vivo EPO i form EPO modyfikowanych przez HAS
Oznaczenia aktywności in vivo wykonano u normocytemicznych myszy przez pomiar wzrostu retikulocytów po 4 dniach, po tym jak zwierzęta otrzymały przewidzianą dawkę EPO lub modyfikowanych form EPO.
Próby wykonano stosując BRP międzynarodowy wzorzec odniesienia EPO, który kalibrowano względem wzorca EPO WHO w próbie myszy policytemicznych.
Próbki EPO rozcieńczono w roztworze soli buforowanej fosforanem zawierającej 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (Sigma).
0,5 ml roztworu badanej EPO w buforowanym roztworze soli Dulbecco (odpowiadającym równoważnikowi proteiny EPO 100, 80, 40 lub 20 lU/ml BRP - wzorca EPO) na zwierzę zainfekowano podskórnie.
Próbki krwi pobrano 4 dni po iniekcji i retikulocyty wybarwiono oranżem akrydynowym; oznaczenie ilościowe retikulocytów wykonano za pomocą cytometrii prze pływowej przez zliczanie ogółem 30000 komórek krwi w ciągu 5 godz. po pobraniu próbki krwi (patrz Ph. Eur, 2000, Erythropoietini solutio concentrata, 1316, strony 780-785) i European Pharmacopoeia (1996/2000, suplement 2002).
P r z y k ł a d 18
Oznaczenie czasu półtrwania in vivo
Królikom wstrzykiwano dożylnie wyszczególnione ilości EPO niemodyfikowanego lub modyfikowanego przez HAS. Próbki krwi uzyskiwano w wyszczególnionych punktach czasowych i przyg otowywano surowicę.
PL 216 545 B1
Poziomy erytropoetyny w surowicy oznaczono przez biopróbę in vitro lub przez specyficzną względem EPO handlowo dostępną próbę ELISA.
P r z y k ł a d 19
Farmakokinetyka in vivo
U myszy: każde zwierzę otrzymało 300 IU EPO/kg podskórnie. Siedem dni po działaniu oznaczono hematokryt każdego zwierzęcia.
Zaobserwowano zasadniczy wzrost hematokrytu u wszystkich zwierząt, na które działano modyfikowanym EPO, co było wynikiem spodziewanym ze względu na względnie krótki okres półtrwania EPO niepoddanego działaniu.
Średnia zmiana hematokrytu grupy, na którą działano modyfikowanym EPO była znacząco różna od tej dla grupy EPO niepoddanego działaniu i dla grupy kontrolnej.
U królików: na króliki działano pojedynczą dawką EPO nie modyfikowanego lub modyfikowanego przez HAS odpowiadającego 200 lub do 800 ng/kg wagi ciała.
Próbki krwi po 2, 6, 16, 24 i 48 godz. analizowano stosując dostępną handlowo próbę ELISA specyficzną względem EPO do oznaczenia stężeń w osoczu.
Oznaczono średnie stężenia EPO w osoczu i obliczono przeciętne początkowe czasy półtrwania (faza □) oraz końcowe czasy półtrwania (faza α) z wartości ELISA jak opisano w: (Zettlmissl i in.,1989, J. Biol. Chem., 264, 21153-21159).
Literatura
Sytkowski, Lunn, Risinger i Davis, 1999, An Erythropoietin Fusion Protein Comprised of Identical Repeating Domains Exhibitis Enhanced Biological Properties, J. Biol. Chem., 274, 24773-24778.
P r z y k ł a d 20
Ocena aktywności biologicznej in vitro modyfikowanego przez HES rekombinacyjnego ludzkiego IL-2
Modyfikowane IL2 uzyskano przez filtrację żelową na Ultrogel AcA 54. Próbki odpowiedniej frakcji sączono sterylnie i oznaczono bioaktywność IL2 stosując zależną od IL2 mysią linię komórkową CTLL-2 (Gillis, Ferm, On, Smith, 1978, J. Immunol., 120, 2027-2032). Aktywność odniesiono do preparatu międzynarodowego wzorca odniesienia IL2.
PL 216 545 B1
Tabela
PL 216 545 B1
PL 216 545 B1
\ ζ V/ '-„..Am a > 4 ο ρ W €Χ ν° cr° χ 0 ο' ·ο ο O-xp ο ο Μ 7.Χ-=' Χ4
7 ο c::.·:·/ J Ρ C =ο
ο= Ζ·Χ 4 X
°ρ V χ> ο ο Cr
ο.
κ Ω ο ο ω ω
EH
2
rp
>
Ρ τ>
φ
ι—i
□ >
1— ω Ρ
>1 λ; >Ί
3 Τ5 ο 0
1— *Ρ ϋ 2
>1 £ Ρ ι—{
0 ϋ -Ρ Φ >1 η
rp -Γ-) C Λί Ό
> ρ >1 | -Ρ Ρ
T? υ rp φ
-Η ρ | Ή 0
ε ΪΡ Ρ Ο α Ρ
•Γ-ί U Φ Ρ > φ
Ρ i Φ ο to
£3 3 ω Pi
ο ¢0 2χί □ Φ
0? Ρ Φ to χί
Ρ β Φ Λ !
Φ (β ο Ρ
1 -p Φ rp φ Ο
3 Ρ Ρ 0 χί rp Τ!
Ο ,—ι Ν >1 'to
Ρ Ή >1 Ρ Ο φ ε
Φ 0-, Ό φ 1 ε φ
Ή ο Η Χί —S Ρ
Ρ Ρ S ϋ Ο Ο ο
ο a Ή Ρ rp Ή
-Ρ Ρ •Ρ >, >1 a
α 0 >1 Ρ Ρ β 0
Ο Ό υ Φ φ φ Μ
Φ Μ Ή β <4-1 a
c ft ε Ρ 0 ο 0 0
Ν I 03 Ł0 Γ- Ό 2 U
u 0 •Ρ Ł •Ρ f—i -ρ
'Ρ -Η Φ 3 -Ρ ε >ι β β
e 4J 0 4) Η Ό -Ρ
Φ Ο Φ Ρ υ φ -Η φ φ
rL-ł ι—1 0 φ φ rp
υ >1 Η -Ρ ϋ Φ ·Ρ φ φ
4J 0 υ Τ5 Ε β S X
φ Φ Ρ ο Ο 1 >ι 1 !
& u ο <“3 υ
Ν < Ό
Φ 1 I ο 1 2 1 i
X. ω ΓΟ 3, --^ to *s^ (Ο
-Ρ
Ό Ó4 0-1 Ω ο ω κ
Μ Η < dl C υ Ω Ρ-1
2κί < Μ Ε S Ξ
ω ω ω ΕΛ W ω ω LO
PL 216 545 B1
PL 216 545 B1
PL 216 545 B1
T a b e l a 2
Analiza składu monosacharydów glikanów próbek EPO modyfikowanego przez HES i próbek kontrolnych
**Monosacharyd I. Glikany z A2 II. Glikany z EPO- GT-1A III. Glikany z K2 III. Glikany z A2 IV. Glikany z EPO- GT-1A V. Glikany z K2 VI. Proteina EPO modyfikowana cysteiną*
Fukoza 1935 3924 2602 2246 4461 2601 2181
Mannoza 6028 11020 9198 6379 11668 6117 6260
Galaktoza 8886 19935 14427 10570 16911 11555 10386
Glukoza 17968 - - 21193 ślad ślad 33021
GlcNAc 7839 21310 14440 11360 15953 10503 10498
GlcHe1 5583 - - 5926 - - 14857
GlcHe2 1380 - - 1552 - - 3775
NeuNAc 5461 822 4504 3895 4871 13562 13003
Inozytol 1230 2310 1620 2050 1320 1134 1087
* Równoważnik proteiny EPO modyfikowanej Cys-HES poddano analizie składu; Proteinę EPO wyodrębniono z mieszaniny inkubacji HES przez chromatografię na kolumnie Q-Sepharose jak opisano powyżej i odsolono przez odwirowanie stosując urządzenie do oddzielania Vivaspin 5 ** Oznaczenia monosacharydu wykonano z pojedynczego przebiegu GC metyloglikozydów pertrimetylosililowanych; wartości integracji elektronicznej pików podano bez poprawki na straty podczas procedury derywatyzacjI i odzysk każdego związku
T a b e l a 3
Próbka nr Opis próbki Obliczona specyficzna aktywność próbki EPO (w oparciu o A280 nm i oznaczenie RP-HPLC)
850247 1. Modyfikowane przez HES- EPO A2 344000 U/mg
850248 2. EPO-GT-1-A 82268 U/mg
850249 3. Próbka kontrolna EPO K2 121410 U/mg
850250 4. Wzorzec EPO-BRP 86702 U/mg
850251 1. rozcieńczony 4 obj. PBS 309129 U/mg
850252 2. rozcieńczony 4 obj. PBS 94500 U/mg
850253 3. rozcieńczony 4 obj. PBS 114100 U/mg
850254 4. rozcieńczony 4 obj. PBS 81200 U/mg
850255 1. rozcieńczony 4 obj. PBS 230720 U/mg
Zastrzeżenia patentowe

Claims (33)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wytwarzania pochodnej hydroksyalkiloskrobi, przy czym wspomniana hydroksyalkiloskrobia posiada strukturę według wzoru (I):
    PL 216 545 B1 przy czym R1, R2 i R3 oznaczają niezależnie wodór lub grupę hydroksyalkilową liniową lub rozgałęzioną mającą od 1 do 6 atomów węgla, znamienny tym, że sposób ten obejmuje: a) reakcję
    - hydroksyalkiloskrobi o wzorze (I) przy jej nieutlenionym końcu redukującym ze związkiem (L) o wzorze ogólnym Z1-L'-X, gdzie L' oznacza łańcuch organiczny tworzący mostek łączący Z1 i X lub w którym L' nie występuje, przy czym Z1 reaguje z nieutlenionym końcem redukującym hydroksyalkiloskrobi i przy czym L', gdy występuje, oznacza liniową lub rozgałęzioną, podstawioną lub nie podstawioną, grupę alkilową lub cykloalkilową lub arylową, lub aralkilową, lub arylocykloalkilową, lub alkarylową, lub cykloalkiloarylową, przy czym L' może obejmować co najmniej jeden heteroatom wybrany spośród N, O i S, i przy czym L' ma od 1 do 20 atomów węgla lub
    - pochodnej hydroksyalkiloskrobi otrzymanej przez reakcję hydroksyalkiloskrobi o wzorze (I) przy jej nieutlenionym końcu redukującym ze związkiem (D) o wzorze ogólnym Z1-D'-W i dalej ze związkiem (L) o wzorze ogólnym Z2-L'-X, przy czym grupa funkcyjna Z2 reaguje z grupą funkcyjną W zawartą we wspomnianej pochodnej hydroksyalkiloskrobi, gdzie D' oznacza łańcuch organiczny tworzący mostek łączący Z1 i W lub gdzie D' nie występuje i przy czym Z1 reaguje z nieutlenionym końcem redukującym hydroksyalkiloskrobi, i przy czym D', gdy występuje, oznacza liniową lub rozgałęzioną, podstawioną lub nie podstawioną, grupę alkilową lub cykloalkilową, lub arylową, lub aralkilową, lub arylocykloalkilową, lub alkarylową, lub cykloalkiloarylową, przy czym D' może obejmować co najmniej jeden heteroatom wybrany spośród N, O, i S, i przy czym D' ma od 1 do 20 atomów węgla i gdzie L' jest łańcuchem organicznym tworzącym mostek łączący Z2 i X, lub gdzie L' nie występuje i przy czym L', gdy występuje, oznacza liniową lub rozgałęzioną, podstawioną lub nie podstawioną, grupę alkilową lub cykloalkilową, lub arylową, lub aralkilową, lub arylocykloalkilową, lub alkarylową, lub cykloalkiloarylową, przy czym L' może obejmować co najmniej jeden heteroatom wybrany spośród N, O I S, i przy czym L' ma od 1 do 20 atomów węgla;
    (i) przy czym grupa funkcyjna W lub grupa funkcyjna Z2 oznacza -SR i grupa funkcyjna Z2 lub grupa funkcyjna W jest wybrana z grupy składającej się z:
    przy czym Hal oznacza Cl, Br lub I, lub (ii) przy czym grupa funkcyjna W lub grupa funkcyjna Z2 jest wybrana z grupy składającej się z estru aktywowanego lub grupy karboksylowej, która jest ewentualnie przekształcona w ester aktywowany i grupa funkcyjna Z2 lub grupa funkcyjna W jest wybrana z grupy składającej się z:
    przy czym G oznacza O lub S,i jeśli występuje dwukrotnie, niezależnie O lub S i r' oznacza metyl, otrzymując pochodną hydroksyalkiloskrobi obejmującą grupę funkcyjną X, przy czym Z1 jest wybrany z grupy składającej się z:
    PL 216 545 B1 przy czym G oznacza O lub S i jeśli występuje dwukrotnie, niezależnie O lub S i r' oznacza metyl,
    b) sposób dalej obejmuje reakcję grupy funkcyjnej X z grupą funkcyjną Y dalszego zawiązku (M), przy czym wspomniana grupa funkcyjna Y jest wybrana z grupy składającej się z grupy aldehydowej, grupy ketonowej, grupy hemiacetalowej, grupy acetalowej, i w którym grupa funkcyjna X jest wybrana z grupy składającej się z:
    przy czym G oznacza O lub S i jeśli występuje dwukrotnie, niezależnie O lub S i r' oznacza metyl, lub przy czym wspomniana grupa funkcyjna Y oznacza grupę tiolową i grupa funkcyjna X jest wybrana z grupy składającej się z:
    przy czym Hal oznacza Cl, Br lub I, i przy czym dalszy związek (M) jest polipeptydem.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że R1, R2 i R3 oznaczają niezależnie wodór lub grupę 2-hydroksyetylową.
  3. 3. Sposób według jednego z zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że hydroksyalkiloskrobią jest hydroksyetyloskrobia.
    PL 216 545 B1
  4. 4. Sposób według jednego z zastrz. 1 do zastrz. 3, znamienny tym, że hydroksyalkiloskrobia reaguje ze związkiem (L) przez reakcję grupy funkcyjnej Z1 z nie utlenionym końcem redukującym hydroksyalkiloskrobi, a powstały produkt reakcji reaguje z dodatkowym związkiem (M) przez reakcję grupy funkcyjnej X zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną Y zawartą w związku (M).
  5. 5. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 3, znamienny tym, że hydroksyalkiloskrobia reaguje ze związkiem (L) przez reakcję grupy funkcyjnej Ζ1 z nie utlenionym końcem redukującym hydroksyalkiloskrobi, w którym związek (L), przed reakcją z hydroksyalkiloskrobią, reaguje z dodatkowym związkiem (M) przez reakcję grupy funkcyjnej X zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną Y zawartą w związku (M).
  6. 6. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 3, znamienny tym, że hydroksyalkiloskrobia reaguje ze związkiem (D) przez reakcję grupy funkcyjnej Z1 zawartej w związku (D) z nie utlenionym końcem redukującym hydroksyalkiloskrobi w celu otrzymania pierwszej pochodnej hydroksyalkiloskrobi i w którym pierwsza pochodna hydroksyalkiloskrobi reaguje ze związkiem (L) przez reakcję grupy funkcyjnej Z2 zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną W zawartą w związku (D) w celu otrzymania drugiej pochodnej hydroksyalkiloskrobi.
  7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że druga pochodna hydroksyalkiloskrobi reaguje z dodatkowym związkiem (M) przez reakcję grupy funkcyjnej X zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną Y zawartą w związku (M).
  8. 8. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 3, znamienny tym, że hydroksyaikiloskrobia reaguje ze związkiem (D) przez reakcję grupy funkcyjnej Z1 zawartej w związku (D) z nie utlenionym końcem redukującym hydroksyalkiloskrobi w celu otrzymania pierwszej pochodnej hydroksyalkiloskrobi i w którym pierwsza pochodna hydroksyalkiloskrobi reaguje przez reakcję grupy funkcyjnej W zawartej w związku (D) i grupy funkcyjnej Z2 zawartej w związku (L), ze związkiem (L), gdzie związek (L), przed reakcją z pierwszą pochodną hydroksyalkiloskrobi, reaguje z dodatkowym związkiem (M) przez reakcję grupy funkcyjnej X zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną Y zawartą w związku (M).
  9. 9. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 8, znamienny tym, że polipeptydem jest erytropoetyna.
  10. 10. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że obejmuje reakcję hydroksyetyloskrobi przy jej nie utlenionym końcu redukującym ze związkiem (L) o następującym wzorze:
    lub ze związkiem (L) o następującym wzorze:
    i reakcję produktu reakcji z grupą aldehydową, grupą ketonową, grupą hemiacetalową lub grupą acetalową reszty końcowej bocznego łańcucha węglowodanowego erytropoetyny, którą utlenia się za pomocą nadjodanu sodu przed reakcją lub jest ona częściowo desialilowana, a następnie utleniana za pomocą nadjodanu sodu przed reakcją.
  11. 11. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że hydroksyetyloskrobia przy jej końcu redukującym, który nie jest utleniony, reaguje ze związkiem (L) o następującym wzorze:
    w środowisku wodnym.
  12. 12. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że obejmuje reakcję hydroksyetyloskrobi przy jej nie utlenionym końcu redukującym ze związkiem (D) o następującym wzorze:
    PL 216 545 B1 lub ze związkiem (D) o następującym wzorze:
    ο
    H,bk ZNH, 2 N N 2
    Η H ponadto obejmuje reakcję produktu reakcji ze związkiem (L) o następującym wzorze:
    i reakcję produktu reakcji z grupą tio erytropoetyny.
  13. 13. Pochodna hydroksyalkiloskrobi otrzymana za pomocą sposobu wytwarzania pochodnej hydroksyalkiloskrobi, przy czym wspomniana pochodna posiada strukturę według wzoru (I):
    gdzie R1, R2 i R3 oznaczają niezależnie wodór lub grupę hydroksyalkilową liniową lub rozgałęzioną mającą od 1 do 6 atomów węgla, znamienna tym, sposób jej wytwarzania obejmuje: a) reakcję
    - hydroksyalkiloskrobi o wzorze (I) przy jej nieutlenionej końcowej grupie redukującej ze związkiem (L) o wzorze ogólnym Z1-L'-X, gdzie L' oznacza łańcuch organiczny tworzący mostek łączący Z1 i X lub gdzie L' nie występuje i przy czym Z1 reaguje z nieutlenionym końcem redukującym hydroksyalkiloskrobi i przy czym L', gdy występuje, oznacza liniową lub rozgałęzioną, podstawioną lub nie podstawioną, grupę alkilową lub cykloalkilową lub arylową lub aralkilową lub arylocykloalkilową lub alkarylową lub cykloalkiloarylową, w którym L' może obejmować co najmniej jeden heteroatom wybrany spośród N, O i S, i przy czym L' ma od 1 do 20 atomów węgla lub
    - pochodnej hydroksyalkiloskrobi otrzymanej przez reakcję hydroksyalkiloskrobi o wzorze (I) przy jej nieutlenionym końcu redukującym ze związkiem (D) o wzorze ogólnym Z1-D'-W i dalej ze związkiem (L) o wzorze ogólnym Z2-L''-X, przy czym grupa funkcyjna Z2 reaguje z grupą funkcyjną W zawartą we wspomnianej pochodnej hydroksyalkiloskrobi, gdzie D' oznacza łańcuch organiczny tworzący mostek łączący Z1 i W lub gdzie D' nie występuje, i przy czym Z1 reaguje z nieutlenionym końcem redukującym hydroksyalkiloskrobi i przy czym D', gdy występuje, oznacza liniową lub rozgałęzioną, podstawioną lub nie podstawioną, grupę alkilową lub cykloalkilową, lub arylową, lub aralkilową, lub arylocykloalkilową, lub alkarylową, lub cykloalkiloarylową, przy czym D' może obejmować co najmniej jeden heteroatom wybrany spośród N, O i S, przy czym D' ma od 1 do 20 atomów węgla.
    i gdzie L' jest łańcuchem organicznym tworzącym mostek łączący Z2 i X, lub gdzie L' nie występuje, i przy czym L', gdy występuje, oznacza liniową lub rozgałęzioną, podstawioną lub nie podstawioną, grupę alkilową lub cykloalkilową lub arylową, lub aralkilową, lub arylocykloalkilową, lub alkarylową, lub cykloalkiloarylową, przy czym L' może obejmować co najmniej jeden heteroatom wybrany spośród N, O i S i przy czym L' ma od 1 do 20 atomów węgla,
    PL 216 545 B1 (i) przy czym grupa funkcyjna W lub grupa funkcyjna Z2 oznacza -SH i grupa funkcyjna Z2 lub grupa funkcyjna W jest wybrana z grupy składającej się z:
    przy czym Hal oznacza Cl, Br lub I lub (ii) przy czym grupa funkcyjna W lub grupa funkcyjna Z2 jest wybrana z grupy składającej się z estru aktywowanego lub grupy karboksylowej, która jest ewentualnie przekształcona w ester aktywowany, a grupa funkcyjna Z2 lub grupa funkcyjna W jest wybrana z grupy składającej się z:
    przy czym G oznacza O lub S i jeśli występuje dwukrotnie, niezależnie O lub S i R oznacza metyl, otrzymując pochodną hydroksyalkiloskrobi obejmującą grupę funkcyjną X, przy czym Z1 jest wybrany z grupy składającej się z:
    przy czym G oznacza O lub S i jeśli występuje dwukrotnie, niezależnie O lub S i R' oznacza metyl. b) sposób dalej obejmuje reakcję grupy funkcyjnej X z grupą funkcyjną Y dalszego zawiązku (M),
    - przy czym wspomniana grupa funkcyjna Y jest wybrana z grupy składającej się z grupy aldehydowej, grupy ketonowej, grupy hemiacetalowej, grupy acetalowej i przy czym grupa funkcyjna X jest wybrana z grupy składającej się z:
    PL 216 545 B1 przy czym G oznacza O lub S i jeśli występuje dwukrotnie, niezależnie O lub S i R' oznacza metyl, lub przy czym wspomniana grupa funkcyjna Y oznacza grupę tiolową i grupa funkcyjna X jest wybrana z grupy składającej się z:
    przy czym Hal oznacza Cl, Br lub I i przy czym dalszy związek (M) jest polipeptydem.
  14. 14. Pochodna hydroksyalkiloskrobi według zastrz. 13, znamienna tym, że R1, R2 i R3 oznaczają niezależnie wodór lub grupę 2-hydroksyetylową.
  15. 15. Pochodna hydroksyalkiloskrobi według zastrz. 13 albo 14, znamienna tym, że hydroksyalkiloskrobią jest hydroksyetyloskrobia.
  16. 16. Pochodna hydroksyalkiloskrobi według jednego z zastrz. 13 do 15, znamienna tym, że hydroksyalkiloskrobia reaguje ze związkiem (L) przez reakcję grupy funkcyjnej Z1 z nie utlenionym końcem redukującym hydroksyalkiloskrobi, a powstały produkt reakcji reaguje z dodatkowym związkiem (M) przez reakcję grupy funkcyjnej X zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną Y zawartą w związku (M).
  17. 17. Pochodna hydroksyalkiloskrobi według jednego z zastrz. 13 do 15, znamienna tym, że hydroksyalkiloskrobia reaguje ze związkiem (L) przez reakcję grupy funkcyjnej Z1 z nie utlenionym końcem redukującym hydroksyalkiloskrobi, gdzie związek (L), przed reakcją z hydroksyalkiloskrobią, reaguje z dodatkowym związkiem (M) przez reakcję grupy funkcyjnej X zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną Y zawartą w związku (M).
  18. 18. Pochodna hydroksyalkiloskrobi według jednego z zastrz. 13 do 15, znamienna tym, że hydroksyalkiloskrobia reaguje ze związkiem (D) przez reakcję grupy funkcyjnej Z1 zawartej w związku (D) z nie utlenionym końcem redukującym hydroksyalkiloskrobi w celu otrzymania pierwszej pochodnej hydroksyalkiloskrobi, i gdzie pierwsza pochodna hydroksyalkiloskrobi reaguje ze związkiem (L) przez reakcję grupy funkcyjnej Z2 zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną W zawartą w związku (O) w celu otrzymania drugiej pochodnej hydroksyalkiloskrobi.
  19. 19. Pochodna hydroksyalkiloskrobi według zastrz. 18, znamienna tym, że druga pochodna hydroksyalkiloskrobi reaguje z dodatkowym związkiem (M) przez reakcję grupy funkcyjnej X zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną Y zawartą w związku (M).
  20. 20. Pochodna hydroksyalkiloskrobi według jednego z zastrz. 13 do 15, znamienna tym, że hydroksyalkiloskrobia reaguje ze związkiem (O) przez reakcję grupy funkcyjnej Z1 zawartej w związku (D) z nie utlenionym końcem redukującym hydroksyalkiloskrobi w celu otrzymania pierwszej pochodnej hydroksyalkiloskrobi i gdzie pierwsza pochodna hydroksyalkiloskrobi reaguje przez reakcję grupy funkcyjnej W zawartej w związku (D) i grupy funkcyjnej Z2 zawartej w związku (L) ze związkiem (L), gdzie związek (L), przed reakcją z pierwszą pochodną hydroksyalkiloskrobi, reaguje z dodatkowym związkiem (M) przez reakcję grupy funkcyjnej X zawartej w związku (L) z grupą funkcyjną Y zawartą w związku (M).
  21. 21. Pochodna hydroksyalkiloskrobi według jednego z zastrz. 13 do 20, znamienna tym, że polipeptydem jest erytropoetyna.
  22. 22. Pochodna hydroksyalkiloskrobi według zastrz. 15, znamienna tym, że hydroksyetyloskrobia przy jej nieutlenionej końcowej grupie redukującej ulega reakcji ze związkiem (L) o następującym wzorze:
    lub ze związkiem (L) o następującym wzorze:
    O h’nnA'nh’
    Η H
    PL 216 545 B1 przy czym produkt reakcji ulega reakcji z grupą aldehydową, grupą ketonową, grupą hemiacetalową lub grupą acetalową reszty końcowej bocznego łańcucha węglowodanowego erytropoetyny, która jest utleniana za pomocą nadjodanu sodu przed reakcją lub jest ona częściowo desialilowana, a następnie utleniana za pomocą nadjodanu sodu przed reakcją.
  23. 23. Pochodna hydroksyalkiloskrobi według zastrz. 15, znamienna tym, że hydroksyetyloskrobia przy jej końcu redukującym, który nie jest utleniony, reaguje ze związkiem (L) o następującym wzorze:
    w środowisku wodnym.
  24. 24. Pochodna hydroksyalkiloskrobi według zastrz. 15, znamienna tym, że hydroksyetyloskrobia przy jej nie utlenionym końcu redukującym reaguje ze związkiem (D) o następującym wzorze:
    lub ze związkiem (D) o następującym wzorze:
    ponadto obejmuje reakcję produktu reakcji ze związkiem (L) o następującym wzorze:
    i reakcję produktu reakcji z grupą tio erytropoetyny.
  25. 25. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca, w ilości terapeutycznie skutecznej, pochodną hydroksyalkiloskrobi otrzymaną za pomocą sposobu wytwarzania pochodnej hydroksyalkiloskrobi, przy czym wspomniana hydroksyalkiloskrobia posiada strukturę według wzoru (I):
    przy czym R1, R2 i R3 oznaczają niezależnie wodór lub grupę hydroksyalkilową liniową lub rozgałęzioną mającą od 1 do 6 atomów węgla, znamienny tym, że sposób obejmuje: a) reakcję
    - hydroksyalkiloskrobi o wzorze (I) przy jej nieutlenionym końcem redukującym ze związkiem (L) o wzorze ogólnym Z1-L'-X, gdzie L' oznacza łańcuch organiczny tworzący mostek łączący Z1 i X lub gdzie L' nie występuje i przy czym Z1 reaguje z nie utlenionym końcem redukującym hydroksyalkiloskrobi, i przy czym L', gdy występuje, oznacza liniową lub rozgałęzioną, podstawioną lub nie podstawioną, grupę alkilową lub cykloalkilową, lub arylową, lub ar alkilową, lub arylocykloalkilową, lub alkarylową, lub cykloalkiloarylową, gdzie L' może obejmować co najmniej jeden heteroatom wybrany spośród N, O i S, i przy czym L' ma od 1 do 20 atomów węgla, lub
    PL 216 545 B1
    - pochodnej hydroksyalkiloskrobi otrzymanej przez reakcję hydroksyalkiloskrobi o wzorze (I) przy jej nieutlenionym końcu redukującym ze związkiem (D) o wzorze ogólnym Ζι-D^W i dalej ze związkiem (L) o wzorze ogólnym Z2-L'-X, przy czym grupa funkcyjna Z2 reaguje z grupą funkcyjną W zawartą we wspomnianej pochodnej hydroksyalkiloskrobi, gdzie D' oznacza łańcuch organiczny tworzący mostek łączący Z1 i W lub gdzie D' nie występuje, i przy czym Z1 reaguje z nie utlenioną końcową grupą hydroksyalkiloskrobi, i przy czym D', gdy występuje, oznacza liniową lub rozgałęzioną, podstawioną lub nie podstawioną, grupę alkilową lub cykloalkilową, lub arylową, lub aralkilową, lub arylocykloalkilową, lub alkarylową, lub cykloalkiloarylową, przy czym D' może obejmować co najmniej jeden heteroatom wybrany spośród N, O i S, przy czym D' ma od 1 do 20 atomów węgla, i gdzie L' jest łańcuchem organicznym tworzącym mostek łączący Z2 i X, lub gdzie L' nie występuje i przy czym L', gdy występuje, oznacza liniową lub rozgałęzioną, podstawioną lub nie podstawioną, grupę alkilową lub cykloalkilową, lub arylową, lub ar alkilową, lub arylocykloalkilową, lub alk arylową, lub cykloalkiloarylową, gdzie L' może obejmować co najmniej jeden heteroatom wybrany spośród N, O i S, i przy czym L' ma od 1 do 20 atomów węgla, (i) przy czym grupa funkcyjna W lub grupa funkcyjna Z2 oznacza -SH i grupa funkcyjna Z2 lub grupa funkcyjna W jest wybrana z grupy składającej się z:
    przy czym Hal oznacza Cl, Br lub I lub (ii) przy czym grupa funkcyjna W lub grupa funkcyjna Z2 jest wybrana z grupy składającej się z estru aktywowanego lub grupy karboksylowej, która jest ewentualnie przekształcona w ester aktywowany, a grupa funkcyjna Z2 lub grupa funkcyjna W jest wybrana z grupy składającej się z:
    przy czym G oznacza O lub S, i jeśli występuje dwukrotnie, niezależnie O lub S i R' oznacza metyl, otrzymując pochodną hydroksyalkiloskrobi obejmującą grupę funkcyjną X, przy czym Z1 wybiera się z grupy składającej się z:
    przy czym G oznacza O lub S i jeśli występuje dwukrotnie, niezależnie O lub S i R' oznacza metyl,
    PL 216 545 B1
    b) sposób dalej obejmuje reakcję grupy funkcyjnej X z grupą funkcyjną Y dalszego zawiązku (M),
    - przy czym wspomniana grupa funkcyjna Y jest wybrana z grupy składającej się z grupy aldehydowej, grupy ketonowej, grupy hemiacetalowej, grupy acetalowej i w którym grupa funkcyjna X jest wybrana z grupy składającej się z przy czym G oznacza O lub S i jeśli występuje dwukrotnie, niezależnie O lub S i R' oznacza metyl, lub - przy czym wspomniana grupa funkcyjna Y oznacza grupę tiolową i grupa funkcyjna X jest wybrana z grupy składającej się z:
    przy czym Hal oznacza Cl, Br lub I i przy czym dalszy związek (M) jest polipeptydem.
  26. 26. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 25, znamienna tym, że polipeptydem jest AT III.
  27. 27. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 25, znamienna tym, że polipeptydem jest erytropoetyna.
  28. 28. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 27, znamienna tym, że hydroksyalkiloskrobia oznacza hydroksyetyloskrobię i przy czym hydroksyetyloskrobia reaguje w środowisku wodnym ze związkiem o następującym wzorze:
    a produkt reakcji reaguje z erytropoetyną.
  29. 29. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 28, znamienna tym, że erytropoetynę utlenia się za pomocą nadjodanu sodu przed reakcją.
  30. 30. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 29, znamienna tym, że erytropoetyną jest częściowo desialilowana, a następnie utleniana za pomocą nadjodanu sodu przed reakcją.
  31. 31. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 25, znamienna tym, że hydroksylalkiloskrobia jest hydroksyetyloskrobią i przy czym hydroksyetyloskrobia reaguje przy jej nie utlenionym końcu redukującym ze związkiem (L) o następującym wzorze:
    lub ze związkiem (L) o następującym wzorze:
    ο Η2Ν-.,Α.,.ΝΗ2 Ν Ν Η Η
    PL 216 545 B1 i przy czym produkt reakcji ulega reakcji z grupą aldehydową, grupą ketonową, grupą hemiacetalową lub grupą acetalową reszty końcowej bocznego łańcucha węglowodanowego erytropoetyny, którą utlenia się za pomocą nadjodanu sodu przed reakcją lub jest ona częściowo desialilowana, a następnie utlenia się ją za pomocą nadjodanu sodu przed reakcją.
  32. 32. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 31, znamienna tym, że hydroksyetyloskrobia przy jej końcu redukującym, który nie jest utleniony, reaguje ze związkiem (L) o następującym wzorze:
    w środowisku wodnym.
  33. 33. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 25, znamienna tym, że hydroskualkiloskrobia jest hydroksyetyloskrobią i przy czym hydroksyetyloskrobia przy jej nie utienionym końcu redukującym reaguje ze związkiem (D) o następującym wzorze:
    lub ze związkiem (D) o następującym wzorze:
    ο /NH, 2 N N 2 Η H i produkt reakcji ulega reakcji ze związkiem (L) o następującym wzorze:
    i produkt reakcji ulega reakcji z grupą tio erytropoetyny.
PL374969A 2002-09-11 2003-08-08 Sposób wytwarzania pochodnej hydroksyalkiloskrobi, pochodna hydroksyalkiloskrobi, kompozycja farmaceutyczna PL216545B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US40978102P 2002-09-11 2002-09-11
EP02020425A EP1400533A1 (en) 2002-09-11 2002-09-11 HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL374969A1 PL374969A1 (pl) 2005-11-14
PL216545B1 true PL216545B1 (pl) 2014-04-30

Family

ID=31995520

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL374969A PL216545B1 (pl) 2002-09-11 2003-08-08 Sposób wytwarzania pochodnej hydroksyalkiloskrobi, pochodna hydroksyalkiloskrobi, kompozycja farmaceutyczna
PL374490A PL217085B1 (pl) 2002-09-11 2003-08-08 Koniugat hydroksyalkiloskrobi i polipeptydu, sposób wytwarzania koniugatu hydroksyalkiloskrobi i polipeptydu, zastosowanie koniugatu hydroksyalkiloskrobi i polipeptydu oraz kompozycja farmaceutyczna koniugatu hydroksyalkiloskrobi i polipeptydu
PL03375037A PL375037A1 (pl) 2002-09-11 2003-08-08 Pochodne hydroksyalkiloskrobi

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL374490A PL217085B1 (pl) 2002-09-11 2003-08-08 Koniugat hydroksyalkiloskrobi i polipeptydu, sposób wytwarzania koniugatu hydroksyalkiloskrobi i polipeptydu, zastosowanie koniugatu hydroksyalkiloskrobi i polipeptydu oraz kompozycja farmaceutyczna koniugatu hydroksyalkiloskrobi i polipeptydu
PL03375037A PL375037A1 (pl) 2002-09-11 2003-08-08 Pochodne hydroksyalkiloskrobi

Country Status (24)

Country Link
US (5) US7815893B2 (pl)
EP (8) EP2017287A3 (pl)
JP (4) JP2006516534A (pl)
KR (3) KR101045401B1 (pl)
CN (2) CN1681844A (pl)
AR (3) AR041097A1 (pl)
AT (3) ATE449112T1 (pl)
AU (6) AU2003255406B2 (pl)
BR (3) BR0314227A (pl)
CA (2) CA2495242A1 (pl)
CY (1) CY1109813T1 (pl)
DE (7) DE60330098D1 (pl)
DK (3) DK1398322T3 (pl)
ES (4) ES2213506T3 (pl)
IL (5) IL166506A0 (pl)
MX (4) MXPA05002593A (pl)
NO (2) NO20051427L (pl)
PL (3) PL216545B1 (pl)
PT (3) PT1398327E (pl)
RU (3) RU2328505C2 (pl)
SI (2) SI1398327T1 (pl)
TW (1) TW200418875A (pl)
WO (3) WO2004024761A1 (pl)
ZA (1) ZA200600651B (pl)

Families Citing this family (159)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10112825A1 (de) * 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
DE10209822A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10242076A1 (de) * 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh HAS-Allergen-Konjugate
EP1400533A1 (en) * 2002-09-11 2004-03-24 Fresenius Kabi Deutschland GmbH HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin
PL216545B1 (pl) 2002-09-11 2014-04-30 Fresenius Kabi Gmbh Sposób wytwarzania pochodnej hydroksyalkiloskrobi, pochodna hydroksyalkiloskrobi, kompozycja farmaceutyczna
WO2004032971A1 (en) 2002-10-08 2004-04-22 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Pharmaceutically active oligosaccharide conjugates
DE10256558A1 (de) * 2002-12-04 2004-09-16 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Ester von Polysaccharid Aldonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zur Kopplung an pharmazeutische Wirkstoffe
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
BRPI0412671A (pt) * 2003-08-08 2006-10-03 Fresenius Kabi De Gmbh conjugados de um polìmero e uma proteìna ligados por um grupo de ligação de oxima
WO2005014050A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and g-csf
SG145746A1 (en) * 2003-08-08 2008-09-29 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and g-csf
US8754031B2 (en) 2004-03-08 2014-06-17 Oncolix, Inc. Use of prolactin receptor antagonists in combination with an agent that inactivates the HER2/neu signaling pathway
SG151261A1 (en) * 2004-03-11 2009-04-30 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination
WO2005092369A2 (en) * 2004-03-11 2005-10-06 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyethyl starch and erythropoietin
WO2005092391A2 (en) * 2004-03-11 2005-10-06 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
US7589063B2 (en) 2004-12-14 2009-09-15 Aplagen Gmbh Molecules which promote hematopoiesis
WO2006094826A2 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Method for coupling enzymatically activated glycoconjugates to a hydroxyalkyl starch
JP2008532966A (ja) * 2005-03-11 2008-08-21 フレゼニウス・カビ・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング 不活性出発物質からの生理活性糖タンパク質の生成
EP1762250A1 (en) * 2005-09-12 2007-03-14 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and an active substance, prepared by chemical ligation via thiazolidine
JP2009541398A (ja) 2006-06-30 2009-11-26 アンドレ コルターマン， 医薬目的のための新規な多官能性化合物
JP2009544680A (ja) * 2006-07-25 2009-12-17 リポクセン テクノロジーズ リミテッド ポリサッカライドによるタンパク質のｎ末端誘導体化
WO2008065372A2 (en) 2006-11-28 2008-06-05 Nautilus Biotech, S.A. Modified erythropoietin polypeptides and uses thereof for treatment
BRPI0720282B8 (pt) * 2006-12-15 2021-05-25 Baxalta GmbH construção proteica, composição farmacêutica, e, kit
DK2121713T3 (da) 2007-01-18 2013-06-24 Genzyme Corp Oligosaccharider, omfattende en aminooxygruppe, og konjugater deraf
CA2701032C (en) 2007-09-27 2021-01-26 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
EP3381445B1 (en) 2007-11-15 2023-10-25 Amgen Inc. Aqueous formulation of antibody stablised by antioxidants for parenteral administration
EP2070950A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation
EP2070951A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Method for producing a hydroxyalkyl starch derivatives with two linkers
CN104888263B (zh) 2008-01-14 2018-11-30 北京环球利康科技有限公司 生物相容性止血、防粘连、促愈合、外科封闭的变性淀粉材料
AU2009206306B2 (en) 2008-01-25 2013-06-06 Amgen Inc. Ferroportin antibodies and methods of use
WO2009134344A1 (en) * 2008-04-28 2009-11-05 Surmodics, Inc. POLY-α(1→4)GLUCOPYRANOSE-BASED MATRICES WITH HYDRAZIDE CROSSLINKING
US9315577B2 (en) 2008-05-01 2016-04-19 Amgen Inc. Anti-hepcidin antibodies and methods of use
EP2166085A1 (en) 2008-07-16 2010-03-24 Suomen Punainen Risti Veripalvelu Divalent modified cells
EP3225248B1 (en) 2008-07-23 2023-06-07 Ambrx, Inc. Modified bovine g-csf polypeptides and their uses
WO2010033240A2 (en) * 2008-09-19 2010-03-25 Nektar Therapeutics Carbohydrate-based drug delivery polymers and conjugates thereof
CA2742871C (en) 2008-11-13 2018-10-23 Herb Lin Methods and compositions for regulating iron homeostasis by modulation of bmp-6
WO2010063491A2 (de) 2008-12-06 2010-06-10 B. Braun Melsungen Ag Transportvermittelnde kolloid-arzneistoffverbindungen
WO2010099003A2 (en) 2009-02-26 2010-09-02 Oncolix, Inc. Compositions and methods for visualizing and eliminating cancer stem cells
US8648046B2 (en) 2009-02-26 2014-02-11 Oncolix, Inc. Compositions and methods for visualizing and eliminating cancer stem cells
CN102365099A (zh) 2009-03-31 2012-02-29 B·布朗·梅尔松根有限公司 胺化多糖粘合制品
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
KR102068133B1 (ko) 2009-07-27 2020-01-20 박스알타 인코퍼레이티드 혈액 응고 단백질 복합체
PL2459224T3 (pl) 2009-07-27 2017-08-31 Baxalta GmbH Koniugaty białka związanego z krzepnięciem krwi
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
SG178051A1 (en) * 2009-07-27 2012-03-29 Lipoxen Technologies Ltd Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
AU2010310457B2 (en) 2009-10-23 2015-07-02 Amgen Inc. Vial adapter and system
EP2516454A4 (en) 2009-12-21 2013-05-22 Ambrx Inc MODIFIED BOVINE SOMATOTROPIN POLYPEPTIDES AND ITS USES
EP2516455A4 (en) 2009-12-21 2013-05-22 Ambrx Inc MODIFIED SWINE SOMATOTROPIN POLYPEPTIDES AND THEIR USES
WO2011098095A1 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Aplagen Gmbh Peptides binding the tpo receptor
AU2011265005B2 (en) 2010-06-07 2015-04-09 Amgen Inc. Drug delivery device
US20140088298A9 (en) * 2010-07-09 2014-03-27 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates comprising hydroxyalkyl starch and a cytotoxic agent and process for their preparation
US20140073602A9 (en) 2010-07-09 2014-03-13 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Nitric oxide delivering hydroxyalkyl starch derivatives
WO2012004009A1 (en) * 2010-07-09 2012-01-12 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates comprising hydroxyalkyl starch and a cytotoxic agent and process for their preparation
WO2012004007A1 (en) * 2010-07-09 2012-01-12 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates comprising hydroxyalkyl starch and a cytotoxic agent and process for their preparation
KR102269494B1 (ko) 2010-07-30 2021-06-25 박스알타 인코퍼레이티드 옥심 결합용 친핵성 촉매
AR083006A1 (es) 2010-09-23 2013-01-23 Lilly Co Eli Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) bovino y variantes de las mismas
BR112013015898A2 (pt) 2010-12-22 2018-06-26 Baxter International Inc. derivado de ácido graxo solúvel em água, e, métodos para preparar um derivado de ácido graxo e uma proteína terapêutica conjugada.
MX341790B (es) 2011-03-31 2016-09-02 Amgen Inc Adaptador de viales y sistema.
EP4074355A1 (en) 2011-04-20 2022-10-19 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
WO2012166622A1 (en) 2011-05-27 2012-12-06 Baxter International Inc. Therapeutic proteins with increased half-life and methods of preparing same
US20150044714A1 (en) * 2011-06-07 2015-02-12 Philadelphia Health & Education Corporation D/B/A Drexel University College Of Medicine sPLA2 MONITORING STRIP
WO2013021056A1 (en) 2011-08-10 2013-02-14 Ludwig-Maximilians-Universität München Method for the controlled intracellular delivery of nucleic acids
PL3045189T3 (pl) 2011-10-14 2018-09-28 Amgen Inc. Wstrzykiwacz i sposób montażu
WO2013113503A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and an oligonucleotide
AU2013204754C1 (en) 2012-05-16 2018-10-11 Takeda Pharmaceutical Company Limited Nucleophilic Catalysts for Oxime Linkage
ES2951440T3 (es) 2012-11-21 2023-10-20 Amgen Inc Dispositivo de administración de fármacos
EP2926829B1 (en) * 2012-11-30 2018-07-25 Glytech, Inc. Sugar chain-attached linker, compound containing sugar chain-attached linker and physiologically active substance or salt thereof, and method for producing same
BR112015022042B1 (pt) 2013-03-15 2023-01-10 Amgen Inc Injetor para injetar um produto terapêutico
US10092703B2 (en) 2013-03-15 2018-10-09 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
NZ631098A (en) 2013-03-15 2016-09-30 Intrinsic Lifesciences Llc Anti-hepcidin antibodies and uses thereof
TWI639453B (zh) 2013-03-15 2018-11-01 美商安美基公司 用於注射器之匣盒
EP2976366A1 (en) * 2013-03-20 2016-01-27 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives as reactants for coupling to thiol groups
AU2014234271A1 (en) * 2013-03-20 2015-10-08 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Process for the preparation of thiol functionalized hydroxyalkyl starch derivatives
AU2014234270A1 (en) * 2013-03-20 2015-10-08 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Hydroxyalkyl starch derivatives as reactants for coupling to thiol groups
IL292270B2 (en) 2013-03-22 2024-04-01 Amgen Inc Injector and method of assembly
WO2015046183A1 (ja) 2013-09-24 2015-04-02 味の素株式会社 糖アミノ酸およびその用途
AU2014340174B2 (en) 2013-10-24 2019-09-12 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
EP3060275B1 (en) 2013-10-24 2019-07-03 Amgen Inc. Injector and method of assembly
US10994112B2 (en) 2014-02-05 2021-05-04 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
KR20160120320A (ko) * 2014-02-10 2016-10-17 허니웰 인터내셔날 인코포레이티드 액체상 불소화를 위한 반응기 설계
WO2015132724A1 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Pfizer Inc. Improved muteins of clotting factor viii
MX388536B (es) 2014-05-07 2025-03-20 Amgen Inc Autoinyector con elementos reductores del shock.
KR20170016335A (ko) 2014-06-03 2017-02-13 암겐 인코포레이티드 약물 전달 디바이스의 사용자를 보조하기 위한 디바이스들 및 방법들
CN104072608A (zh) * 2014-06-23 2014-10-01 山东齐都药业有限公司 含羧基羟乙基淀粉衍生物修饰的牛血清白蛋白偶联物及其制备方法
US10323088B2 (en) 2014-09-22 2019-06-18 Intrinsic Lifesciences Llc Humanized anti-hepcidin antibodies and uses thereof
WO2016061220A2 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audio indicators
US10799630B2 (en) 2014-12-19 2020-10-13 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
WO2016100055A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
JP6484345B2 (ja) 2015-02-17 2019-03-20 アムジエン・インコーポレーテツド 固定及び／または戻りが真空によって支援された薬物送達装置
EP3981450A1 (en) 2015-02-27 2022-04-13 Amgen, Inc Drug delivery device having a needle guard mechanism with a tunable threshold of resistance to needle guard movement
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
WO2017100501A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
WO2017160799A1 (en) 2016-03-15 2017-09-21 Amgen Inc. Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices
WO2017189089A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
AU2017263558B2 (en) 2016-05-13 2022-12-22 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
WO2017200989A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
KR20190012189A (ko) 2016-05-20 2019-02-08 옥타파마 아게 약동학이 개선된 글리코실화 vwf 융합 단백질
GB201609083D0 (en) 2016-05-24 2016-07-06 Syntab Therapeutics Gmbh Synthetic compound
US11541176B2 (en) 2016-06-03 2023-01-03 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
US11285266B2 (en) 2016-07-01 2022-03-29 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
WO2018081234A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Amgen Inc. On-body injector
WO2018136398A1 (en) 2017-01-17 2018-07-26 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
US11369736B2 (en) 2017-02-17 2022-06-28 Amgen Inc. Cannula insertion and retraction mechanisms
US11752258B2 (en) 2017-02-17 2023-09-12 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
EP3592403A1 (en) 2017-03-06 2020-01-15 Amgen Inc. Drug delivery device with activation prevention feature
JP2020509839A (ja) 2017-03-07 2020-04-02 アムジエン・インコーポレーテツド 超過圧力による針の挿入
CA3052310A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Amgen Inc. Insertion mechanism for drug delivery device
JP2020511499A (ja) 2017-03-20 2020-04-16 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 赤血球生成刺激タンパク質のインビトロでの糖鎖改変のための方法
LT3600491T (lt) 2017-03-28 2023-10-10 Amgen Inc. Stūmoklio koto ir švirkšto konstrukcinė sistema ir būdas
US11590294B2 (en) 2017-06-08 2023-02-28 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
JP7200134B2 (ja) 2017-06-08 2023-01-06 アムジエン・インコーポレーテツド トルク駆動式薬物送達デバイス
MA49447A (fr) 2017-06-22 2020-04-29 Amgen Inc Réduction des impacts/chocs d'activation d'un dispositif
WO2018237225A1 (en) 2017-06-23 2018-12-27 Amgen Inc. Electronic drug delivery device comprising a cap activated by a switch assembly
EP3651832B1 (en) 2017-07-14 2023-12-13 Amgen Inc. Needle insertion-retraction system having dual torsion spring system
JP7649105B2 (ja) 2017-07-21 2025-03-19 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物容器のためのガス透過性シーリング部材及び組立方法
JP7242562B2 (ja) 2017-07-25 2023-03-20 アムジエン・インコーポレーテツド 容器アクセスシステムを有する薬物送達デバイス及び関連する組立方法
US11617837B2 (en) 2017-07-25 2023-04-04 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
EP3664863A2 (en) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc. Hydraulic-pneumatic pressurized chamber drug delivery system
US11077246B2 (en) 2017-08-18 2021-08-03 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
US11759565B2 (en) 2017-10-04 2023-09-19 Amgen Inc. Flow adapter for drug delivery device
EP4257164A3 (en) 2017-10-06 2024-01-17 Amgen Inc. Drug delivery device with interlock assembly and related method of assembly
MA50348A (fr) 2017-10-09 2020-08-19 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament comprenant un ensemble d'entraînement et procédé d'assemblage associé
US11305026B2 (en) 2017-11-03 2022-04-19 Amgen Inc. Systems and approaches for sterilizing a drug delivery device
US12053618B2 (en) 2017-11-06 2024-08-06 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
US20200261648A1 (en) 2017-11-06 2020-08-20 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
CN116832271A (zh) 2017-11-10 2023-10-03 安进公司 用于药物递送装置的柱塞
MX2020004996A (es) 2017-11-16 2020-08-27 Amgen Inc Un mecanismo de pestillo de puerta para un dispositivo de administracion de farmacos.
EP3710089A1 (en) 2017-11-16 2020-09-23 Amgen Inc. Autoinjector with stall and end point detection
CN108403641B (zh) * 2018-02-08 2020-03-20 华中科技大学 一种载药纳米材料及其制备方法
CN108503718B (zh) * 2018-02-08 2020-03-20 华中科技大学 一种羟烷基淀粉偶联物及其制备方法和应用
CN108219019B (zh) * 2018-02-08 2020-03-20 华中科技大学 一种巯基化羟乙基淀粉及其修饰的纳米材料和制备方法
EA202090767A1 (ru) * 2018-05-04 2020-08-03 Борис Славинович ФАРБЕР Фармацевтическая композиция на основе полимиксина для лечения инфекционных заболеваний
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
US12303677B2 (en) 2018-07-24 2025-05-20 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with optional grip portion and related method of preparation
CA3103681A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
MA53375A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
MA53320A (fr) 2018-07-31 2021-11-03 Amgen Inc Ensemble de trajet de fluide pour dispositif d'administration de médicament
US20210346601A1 (en) 2018-09-24 2021-11-11 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
IL281469B2 (en) 2018-09-28 2024-08-01 Amgen Inc Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
MA53815A (fr) 2018-10-02 2022-01-05 Amgen Inc Systèmes d'injection pour administration de médicament avec transmission de force interne
JP7547325B2 (ja) 2018-10-05 2024-09-09 アムジエン・インコーポレーテツド 投薬量インジケータを有する薬物送達デバイス
JP2022504805A (ja) 2018-10-15 2022-01-13 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達デバイスのプラットフォーム式組み立てプロセス
KR20210076935A (ko) 2018-10-15 2021-06-24 암젠 인크 댐핑 메커니즘을 갖는 약물 전달 장치
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
WO2020091981A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
US11213620B2 (en) 2018-11-01 2022-01-04 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
CN111157736A (zh) * 2018-11-08 2020-05-15 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于化学酶促的人血清o糖基化鉴定方法
AU2020263289B2 (en) 2019-04-24 2025-05-22 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
MX2022002149A (es) 2019-08-23 2022-03-17 Amgen Inc Dispositivo de suministro de farmacos con componentes de acoplamiento de capuchon de aguja configurable y metodos relacionados.
CN117320964A (zh) 2021-05-21 2023-12-29 美国安进公司 优化药物容器的灌装方案的方法
KR20250099137A (ko) 2022-11-02 2025-07-01 에프. 호프만-라 로슈 아게 당단백질 조성물의 생산 방법
AR131133A1 (es) 2023-05-24 2025-02-19 Ambrx Inc INTERFERÓN l BOVINO PEGILADO Y MÉTODOS DE USO DEL MISMO

Family Cites Families (159)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE279486C (pl)
US3191291A (en) * 1959-01-21 1965-06-29 Continental Can Co Art of producing very thin steel and like sheets in wide strips
NL269801A (nl) 1960-10-04 1964-03-10 Farbwerke Höchst Ag Werkwijze ter bereiding van in water onoplosbare kleurstoffen
GB1385403A (en) 1971-07-14 1975-02-26 Unilever Ltd Process for preparing oxidised carbohydrates
GB1419080A (en) 1972-12-29 1975-12-24 Cheminova As Chemical compounds having juvenile hormone activity
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4125492A (en) * 1974-05-31 1978-11-14 Pedro Cuatrecasas Affinity chromatography of vibrio cholerae enterotoxin-ganglioside polysaccharide and the biological effects of ganglioside-containing soluble polymers
US4061736A (en) 1975-02-02 1977-12-06 Alza Corporation Pharmaceutically acceptable intramolecularly cross-linked, stromal-free hemoglobin
US4001200A (en) 1975-02-27 1977-01-04 Alza Corporation Novel polymerized, cross-linked, stromal-free hemoglobin
US4001401A (en) * 1975-02-02 1977-01-04 Alza Corporation Blood substitute and blood plasma expander comprising polyhemoglobin
US4053590A (en) * 1975-02-27 1977-10-11 Alza Corporation Compositions of matter comprising macromolecular hemoglobin
CA1055932A (en) 1975-10-22 1979-06-05 Hematech Inc. Blood substitute based on hemoglobin
DE2616086C2 (de) * 1976-04-13 1986-04-03 Dr. Eduard Fresenius, Chemisch-pharmazeutische Industrie KG, 6380 Bad Homburg Substanz zur Verwendung in einem kolloidalen Blutvolumenersatzmittel aus Hydroxyethylstärke und Hämoglobin
GB1578348A (en) * 1976-08-17 1980-11-05 Pharmacia Ab Products and a method for the therapeutic suppression of reaginic antibodies responsible for common allergic
FR2378094A2 (fr) 1977-01-24 1978-08-18 Inst Nat Sante Rech Med Nouveaux reactifs biologiques constitues par des supports solides sur lesquels sont couples des composes organiques comportant un residu glucidique
EP0019403B1 (en) * 1979-05-10 1985-07-31 American Hospital Supply Corporation Hydroxyalkyl-starch drug carrier
DE3029307A1 (de) * 1980-08-01 1982-03-04 Dr. Eduard Fresenius, Chemisch-pharmazeutische Industrie KG, 6380 Bad Homburg Haemoglobin enthaltendes blutersatzmittel
US4454161A (en) 1981-02-07 1984-06-12 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Process for the production of branching enzyme, and a method for improving the qualities of food products therewith
JPS57206622A (en) * 1981-06-10 1982-12-18 Ajinomoto Co Inc Blood substitute
IE56026B1 (en) 1982-10-19 1991-03-27 Cetus Corp Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
IE58011B1 (en) 1983-05-27 1993-06-16 Texas A & M Univ Sys Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
FR2553099B1 (fr) 1983-10-11 1989-09-08 Fidia Spa Fractions d'acide hyaluronique ayant une activite pharmaceutique, procedes pour leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4703008A (en) 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4952496A (en) * 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
IL77081A (en) 1984-12-04 1999-10-28 Genetics Inst Dna sequence encoding human erythropoietin process for the preparation thereof and a pharmaceutical composition of human erythropoietin
SK46598A3 (en) * 1985-01-03 2000-05-16 Genetics Inst Recombinant dna plasmid vector, mammalian cell transformed with this vector, recombinant human erythropoietin, and method of its production
DE3501616A1 (de) 1985-01-17 1986-07-17 Schering AG, 1000 Berlin und 4709 Bergkamen Verfahren zur herstellung von hydroxylamin-derivaten
US4667016A (en) 1985-06-20 1987-05-19 Kirin-Amgen, Inc. Erythropoietin purification
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4863964A (en) * 1985-07-02 1989-09-05 Biomedical Frontiers, Inc. Method for the stabilization of deferoxamine to chelate free ions in physiological fluid
US5217998A (en) * 1985-07-02 1993-06-08 Biomedical Frontiers, Inc. Composition for the stabilization of deferoxamine to chelate free ions in physiological fluid
GB8610551D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Hoffmann La Roche Polypeptide & protein derivatives
IT1203814B (it) 1986-06-30 1989-02-23 Fidia Farmaceutici Esteri dell'acido alginico
FR2600894B1 (fr) 1986-07-02 1989-01-13 Centre Nat Rech Scient Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications
US5214132A (en) * 1986-12-23 1993-05-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
US5362853A (en) * 1986-12-23 1994-11-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
JP2594123B2 (ja) 1987-09-12 1997-03-26 株式会社林原生物化学研究所 減感作剤
EP0307827A3 (en) 1987-09-15 1989-12-27 Kuraray Co., Ltd. Novel macromolecular complexes, process for producing same and medicinal use of such complexes
IL84252A (en) 1987-10-23 1994-02-27 Yissum Res Dev Co Phospholipase inhibiting compositions
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
DK110188D0 (da) 1988-03-02 1988-03-02 Claus Selch Larsen High molecular weight prodrug derivatives of antiinflammatory drugs
FR2630329B1 (fr) 1988-04-20 1991-07-05 Merieux Inst Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications
IT1219942B (it) 1988-05-13 1990-05-24 Fidia Farmaceutici Esteri polisaccaridici
US4900780A (en) 1988-05-25 1990-02-13 Masonic Medical Research Laboratory Acellular resuscitative fluid
US4925677A (en) 1988-08-31 1990-05-15 Theratech, Inc. Biodegradable hydrogel matrices for the controlled release of pharmacologically active agents
US5420105A (en) 1988-09-23 1995-05-30 Gustavson; Linda M. Polymeric carriers for non-covalent drug conjugation
US5218092A (en) * 1988-09-29 1993-06-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains
DE3836600A1 (de) * 1988-10-27 1990-05-03 Wolff Walsrode Ag Kohlensaeureester von polysacchariden und verfahren zu ihrer herstellung
ATE135370T1 (de) 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US6261800B1 (en) * 1989-05-05 2001-07-17 Genentech, Inc. Luteinizing hormone/choriogonadotropin (LH/CG) receptor
DE19975071I2 (de) * 1989-06-16 2000-02-03 Fresenius Ag Hydroxyethylstaerke als Plasmaexpander Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung als kolloidales Plasmaersatzmittel
JP2896580B2 (ja) 1989-08-25 1999-05-31 チッソ株式会社 アミロース―リゾチームハイブリッドと活性化糖およびその製造法
JP2838800B2 (ja) 1989-09-02 1998-12-16 株式会社林原生物化学研究所 減感作剤
JP2983629B2 (ja) 1989-10-13 1999-11-29 キリン―アムジエン・インコーポレイテツド エリスロポエチンイソフォーム
JP2975632B2 (ja) 1990-03-30 1999-11-10 生化学工業株式会社 グリコサミノグリカン修飾プロテイン
US5169784A (en) 1990-09-17 1992-12-08 The Texas A & M University System Baculovirus dual promoter expression vector
DK130991D0 (da) * 1991-07-04 1991-07-04 Immunodex K S Polymere konjugater
US5281698A (en) * 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
DE4130807A1 (de) 1991-09-17 1993-03-18 Wolff Walsrode Ag Verfahren zur herstellung von polysaccharidcarbonaten
US6172208B1 (en) 1992-07-06 2001-01-09 Genzyme Corporation Oligonucleotides modified with conjugate groups
AU5098193A (en) * 1992-09-01 1994-03-29 Berlex Laboratories, Inc. Glycolation of glycosylated macromolecules
GB2270920B (en) * 1992-09-25 1997-04-02 Univ Keele Alginate-bioactive agent conjugates
CA2110543A1 (en) 1992-12-09 1994-06-10 David E. Wright Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives thereof
FI935485A7 (fi) * 1992-12-09 1994-06-10 Ortho Pharma Corp PEG-hydratsoni- ja PEG-oksiimisidoksen muodostavat reagenssit ja niiden proteiinijohdannaiset
NZ250375A (en) 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
EP0601417A3 (de) 1992-12-11 1998-07-01 Hoechst Aktiengesellschaft Physiologisch verträglicher und physiologisch abbaubarer, Kohlenhydratrezeptorblocker auf Polymerbasis, ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung
US5581476A (en) * 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
CN1046292C (zh) 1993-03-16 1999-11-10 赫姆索尔公司 化学修饰用作血液替代物中氧转运者的血红蛋白的方法
WO1994028024A1 (en) * 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
CN1057534C (zh) 1993-08-17 2000-10-18 柯瑞英-艾格公司 促红细胞生成素类似物
US5840900A (en) 1993-10-20 1998-11-24 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
JPH07188291A (ja) 1993-12-27 1995-07-25 Hayashibara Biochem Lab Inc 蛋白質とその製造方法並びに用途
US5876980A (en) * 1995-04-11 1999-03-02 Cytel Corporation Enzymatic synthesis of oligosaccharides
US6214331B1 (en) 1995-06-06 2001-04-10 C. R. Bard, Inc. Process for the preparation of aqueous dispersions of particles of water-soluble polymers and the particles obtained
WO1996040662A2 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Cellpro, Incorporated Aminooxy-containing linker compounds and their application in conjugates
US5736533A (en) 1995-06-07 1998-04-07 Neose Technologies, Inc. Bacterial inhibition with an oligosaccharide compound
US5981507A (en) 1995-12-14 1999-11-09 Advanced Magnetics, Inc. Polymeric carriers linked to nucleotide analogues via a phosphoramide bond
US5723589A (en) * 1995-12-21 1998-03-03 Icn Pharmaceuticals Carbohydrate conjugated bio-active compounds
IL126179A (en) 1996-03-12 2003-04-10 Pg Txl Co Lp Pharmaceutical compositions containing anti-tumor drug conjugates
US5696152A (en) 1996-05-07 1997-12-09 Wisconsin Alumni Research Foundation Taxol composition for use as organ preservation and cardioplegic agents
TW517067B (en) * 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
DE19628705A1 (de) * 1996-07-08 1998-01-15 Fresenius Ag Neue Sauerstoff-Transport-Mittel, diese enthaltende Hämoglobin-Hydroxyethylstärke-Konjugate, Verfahren zu deren Herstellung, sowie deren Verwendung als Blutersatzstoffe
US5770645A (en) 1996-08-02 1998-06-23 Duke University Medical Center Polymers for delivering nitric oxide in vivo
US5851984A (en) 1996-08-16 1998-12-22 Genentech, Inc. Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides
US6011008A (en) * 1997-01-08 2000-01-04 Yissum Research Developement Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Conjugates of biologically active substances
US5952347A (en) 1997-03-13 1999-09-14 Merck & Co., Inc. Quinoline leukotriene antagonists
US6299881B1 (en) * 1997-03-24 2001-10-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
WO1999007719A1 (en) * 1997-08-07 1999-02-18 University Of Utah Prodrugs and conjugates of thiol- and selenol- containing compounds and methods of use thereof
US5847110A (en) 1997-08-15 1998-12-08 Biomedical Frontiers, Inc. Method of reducing a schiff base
US6875594B2 (en) 1997-11-13 2005-04-05 The Rockefeller University Methods of ligating expressed proteins
US6624142B2 (en) 1997-12-30 2003-09-23 Enzon, Inc. Trimethyl lock based tetrapartate prodrugs
EP1048301A4 (en) * 1998-01-16 2005-03-09 Takeda Chemical Industries Ltd COMPOSITIONS WITH DELAYED ACTIVE INGREDIENTS, PROCESS FOR THEIR PREPARATION AND THEIR USE
DE19808079A1 (de) 1998-02-20 1999-08-26 Schering Ag Hydroxyethylstärke-Konjugate, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Mittel
EP1063317B1 (en) 1998-03-05 2003-07-30 Asahi Glass Company Ltd. Sputtering target, transparent conductive film, and method for producing the same
CA2233725A1 (en) 1998-03-31 1999-09-30 Hemosol Inc. Hemoglobin-hydroxyethyl starch complexes
US6153655A (en) 1998-04-17 2000-11-28 Enzon, Inc. Terminally-branched polymeric linkers and polymeric conjugates containing the same
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6261594B1 (en) 1998-11-25 2001-07-17 The University Of Akron Chitosan-based nitric oxide donor compositions
EP1035137A1 (en) * 1999-03-12 2000-09-13 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Method for the reductive amination of polysaccharides
CZ299516B6 (cs) 1999-07-02 2008-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem
US7279176B1 (en) 1999-09-02 2007-10-09 Rice University Nitric oxide-producing hydrogel materials
US20020065410A1 (en) 1999-12-02 2002-05-30 Antrim Richard L. Branched starches and branched starch hydrolyzates
US6555660B2 (en) * 2000-01-10 2003-04-29 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
US6749865B2 (en) 2000-02-15 2004-06-15 Genzyme Corporation Modification of biopolymers for improved drug delivery
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
JP2001294601A (ja) 2000-04-11 2001-10-23 Akita Prefecture 高度分岐澱粉と該高度分岐澱粉の製造方法
JP2002003398A (ja) 2000-04-17 2002-01-09 Ltt Institute Co Ltd 徐放製剤、その製造法及びワクチン
DE10023051B4 (de) * 2000-05-11 2004-02-19 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur Herstellung von Fluoresceinisothiocyanat-Sinistrin, dessen Verwendung und Fluoresceinisothiocyanat-Sinistrin enthaltende diagnostische Zubereitung
FR2811967B1 (fr) 2000-07-24 2002-12-13 Cebal Tube muni d'une tete de fixation pour divers bouchages et les divers bouchages munis de moyens de fixation sur ledit tube
US6417347B1 (en) 2000-08-24 2002-07-09 Scimed Life Systems, Inc. High yield S-nitrosylation process
DE10041541A1 (de) 2000-08-24 2002-03-14 Michael Duchene Rekombinante Allergene aus der Motte Plodia interpunctella
YU17603A (sh) 2000-09-08 2006-05-25 Gryphon Sciences Sintetički proteini koji stimulišu eritropoezu
DE10105921A1 (de) 2001-02-09 2002-08-14 Braun Melsungen Ag An Kolloide gebundene Arzneiwirkstoffe
DE10112825A1 (de) 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
DE10126158A1 (de) 2001-05-30 2002-12-12 Novira Chem Gmbh Eine Methode zur Synthese von Gemischen einfach aktivierter und nicht aktivierter Polyoxyalkylene zur Modifizierung von Proteinen
DE10129369C1 (de) 2001-06-21 2003-03-06 Fresenius Kabi De Gmbh Wasserlösliches, einen Aminozucker aufweisendes Antibiotikum in Form eines Pol ysaccharid-Konjugats
DE10135694A1 (de) 2001-07-21 2003-02-06 Supramol Parenteral Colloids Amphiphile Stärke-und Hydroxyethylstärke-Konjugate
US7125843B2 (en) 2001-10-19 2006-10-24 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugates including more than one peptide
US7179617B2 (en) * 2001-10-10 2007-02-20 Neose Technologies, Inc. Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX
EP1438321B1 (de) 2001-10-26 2010-05-26 Noxxon Pharma AG Modifizierte l-nukleinsäure
US6375846B1 (en) 2001-11-01 2002-04-23 Harry Wellington Jarrett Cyanogen bromide-activation of hydroxyls on silica for high pressure affinity chromatography
DE10155098A1 (de) 2001-11-09 2003-05-22 Supramol Parenteral Colloids Mittel zur Prävention von mykotischen Kontaminationen bei der Zell- und Gewebekultur bakteriellen, pflanzlichen, animalischen und humanen Ursprungs, bestehend aus Polyen-Makrolid-Konjugaten mit Polysacchariden
US6916962B2 (en) 2001-12-11 2005-07-12 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
DE10207072A1 (de) * 2002-02-20 2003-08-28 Supramol Parenteral Colloids Stärkederivate, ihre Konjugate und Verfahren zur Herstellung derselben
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209822A1 (de) * 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
JP4272537B2 (ja) 2002-03-13 2009-06-03 北京鍵▲凱▼科技有限公司 Ｙ型分鎖親水性ポリマー誘導体、それらの調製方法、前記誘導体および薬剤分子の結合生成物、ならびに前記結合生成物を含む医薬組成物
DE10217994A1 (de) 2002-04-23 2003-11-06 Supramol Parenteral Colloids Konjugate von hyperverzweigten Polysacchariden
US7183118B2 (en) 2002-06-03 2007-02-27 The Institute For Systems Biology Methods for quantitative proteome analysis of glycoproteins
US20040101546A1 (en) 2002-11-26 2004-05-27 Gorman Anne Jessica Hemostatic wound dressing containing aldehyde-modified polysaccharide and hemostatic agents
EP1591467A1 (en) 2002-09-09 2005-11-02 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugate between a polyethylene glycol having a terminal alkanal group and a human growth hormone
GEP20074193B (en) 2002-09-09 2007-09-10 Nektar Therapeutics Al Corp Water-soluble polymer alkanals
DE10242076A1 (de) 2002-09-11 2004-03-25 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh HAS-Allergen-Konjugate
PL216545B1 (pl) 2002-09-11 2014-04-30 Fresenius Kabi Gmbh Sposób wytwarzania pochodnej hydroksyalkiloskrobi, pochodna hydroksyalkiloskrobi, kompozycja farmaceutyczna
EP1400533A1 (en) 2002-09-11 2004-03-24 Fresenius Kabi Deutschland GmbH HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin
WO2004032971A1 (en) 2002-10-08 2004-04-22 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Pharmaceutically active oligosaccharide conjugates
DE10254745A1 (de) 2002-11-23 2004-06-03 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Imidazolide von Polysaccharid Aldonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zur Kopplung an pharmazeutische Wirkstoffe
DE10256558A1 (de) 2002-12-04 2004-09-16 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Ester von Polysaccharid Aldonsäuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zur Kopplung an pharmazeutische Wirkstoffe
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
WO2005014050A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and g-csf
BRPI0412671A (pt) 2003-08-08 2006-10-03 Fresenius Kabi De Gmbh conjugados de um polìmero e uma proteìna ligados por um grupo de ligação de oxima
SG145746A1 (en) 2003-08-08 2008-09-29 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and g-csf
CA2556169C (en) 2004-01-29 2011-11-22 Andrew Lees Use of amino-oxy functional groups in the preparation of vaccines
DE102004009783A1 (de) 2004-02-28 2005-09-15 Supramol Parenteral Colloids Gmbh Hyperverzweigte Stärkefraktion, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Konjugate mit pharmazeutischen Wirkstoffen
WO2005092369A2 (en) 2004-03-11 2005-10-06 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyethyl starch and erythropoietin
WO2005092391A2 (en) 2004-03-11 2005-10-06 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
SG151261A1 (en) 2004-03-11 2009-04-30 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination
US20050265958A1 (en) 2004-05-14 2005-12-01 West Jennifer L Nitric oxide releasing compositions and associated methods
JP2008532966A (ja) 2005-03-11 2008-08-21 フレゼニウス・カビ・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング 不活性出発物質からの生理活性糖タンパク質の生成
EP1762250A1 (en) 2005-09-12 2007-03-14 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and an active substance, prepared by chemical ligation via thiazolidine
US7928079B2 (en) 2005-10-31 2011-04-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Polysaccharide-derived nitric oxide-releasing carbon-bound diazeniumdiolates
JP2009093397A (ja) 2007-10-09 2009-04-30 Panasonic Corp タッチパネル及びこれを用いた入力装置
EP2070951A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Method for producing a hydroxyalkyl starch derivatives with two linkers
EP2070950A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation
US9434610B2 (en) 2008-10-07 2016-09-06 Rexahn Pharmaceuticals, Inc. HPMA—docetaxel conjugates and uses therefore

Also Published As

Publication number Publication date
EP1398322B1 (en) 2006-04-19
US20060019877A1 (en) 2006-01-26
SI1398327T1 (sl) 2009-02-28
EP2316850A3 (en) 2011-11-09
CN1681844A (zh) 2005-10-12
US20100317609A1 (en) 2010-12-16
EP2143736A1 (en) 2010-01-13
AU2009238372A1 (en) 2009-12-17
EP1398328A1 (en) 2004-03-17
CA2495242A1 (en) 2004-03-25
CA2496317C (en) 2014-02-18
US20050234230A1 (en) 2005-10-20
NO20051419L (no) 2005-05-30
AU2003255406A1 (en) 2004-04-30
EP1398322A1 (en) 2004-03-17
HK1063475A1 (en) 2004-12-31
HK1136226A1 (en) 2010-06-25
KR20050061466A (ko) 2005-06-22
PL374969A1 (pl) 2005-11-14
TW200418875A (en) 2004-10-01
AU2003253399A1 (en) 2004-04-30
IL166506A (en) 2010-02-17
IL166931A (en) 2012-06-28
AU2011200219B2 (en) 2012-05-17
MXPA05002594A (es) 2005-05-27
KR101045401B1 (ko) 2011-06-30
AR045235A1 (es) 2005-10-19
AR045234A1 (es) 2005-10-19
US8618266B2 (en) 2013-12-31
RU2005110412A (ru) 2006-01-20
RU2329274C2 (ru) 2008-07-20
CN1681846A (zh) 2005-10-12
ATE406387T1 (de) 2008-09-15
ATE449112T1 (de) 2009-12-15
EP2154160A1 (en) 2010-02-17
DK1398322T3 (da) 2006-08-21
US8475765B2 (en) 2013-07-02
RU2326891C2 (ru) 2008-06-20
DE60304640T2 (de) 2007-05-16
EP2143736B1 (en) 2012-11-07
AU2011200158A1 (en) 2011-02-03
EP2017287A2 (en) 2009-01-21
US20120046240A9 (en) 2012-02-23
DE60323192D1 (de) 2008-10-09
CA2496317A1 (en) 2004-03-25
SI1398328T1 (sl) 2010-02-26
RU2005110423A (ru) 2006-01-20
DK1398328T3 (da) 2010-03-08
DE60304640D1 (de) 2006-05-24
ES2213506T1 (es) 2004-09-01
AR041097A1 (es) 2005-05-04
US20110054152A1 (en) 2011-03-03
BR0314227A (pt) 2005-10-25
AU2003260393A1 (en) 2004-04-30
JP2006516534A (ja) 2006-07-06
MXPA05002593A (es) 2005-05-27
PT1398327E (pt) 2008-10-31
JP2010265464A (ja) 2010-11-25
MX2010006175A (es) 2010-07-05
DE60330098D1 (de) 2009-12-31
US7815893B2 (en) 2010-10-19
DE20321836U1 (de) 2011-04-07
CN100348618C (zh) 2007-11-14
DE03020423T1 (de) 2004-07-15
ATE323723T1 (de) 2006-05-15
US20050238723A1 (en) 2005-10-27
NO20051427L (no) 2005-05-31
AU2003255406B2 (en) 2009-09-10
BR0314106A (pt) 2005-07-19
AU2003260393B2 (en) 2009-10-01
EP1398327A1 (en) 2004-03-17
ZA200600651B (en) 2007-04-25
PL375037A1 (pl) 2005-11-14
JP2010248528A (ja) 2010-11-04
KR101174510B1 (ko) 2012-08-16
PT1398322E (pt) 2006-08-31
WO2004024776A1 (en) 2004-03-25
PL217085B1 (pl) 2014-06-30
WO2004024777A1 (en) 2004-03-25
IL200150A0 (en) 2011-07-31
HK1063478A1 (en) 2004-12-31
RU2005110415A (ru) 2006-08-27
EP1398328B1 (en) 2009-11-18
AU2009238372B2 (en) 2012-08-23
WO2004024761A1 (en) 2004-03-25
AU2011200158B2 (en) 2012-08-02
ES2213505T1 (es) 2004-09-01
EP2017287A3 (en) 2009-11-04
ES2213507T1 (es) 2004-09-01
PT1398328E (pt) 2010-02-19
WO2004024777A8 (en) 2005-03-24
MXPA05002591A (es) 2005-09-20
DE03020425T1 (de) 2004-07-15
EP2272865A3 (en) 2014-06-18
ES2399006T3 (es) 2013-03-25
ES2213506T3 (es) 2009-02-16
JP5455821B2 (ja) 2014-03-26
KR101045422B1 (ko) 2011-06-30
EP2316850A2 (en) 2011-05-04
KR20050072417A (ko) 2005-07-11
BR0314107A (pt) 2005-07-19
ES2213507T3 (es) 2010-04-15
DE03020424T1 (de) 2004-07-15
PL374490A1 (pl) 2005-10-31
CY1109813T1 (el) 2014-09-10
AU2011200219A1 (en) 2011-02-10
JP5275293B2 (ja) 2013-08-28
ES2213505T3 (es) 2006-11-16
EP1398327B1 (en) 2008-08-27
RU2328505C2 (ru) 2008-07-10
DK1398327T3 (da) 2008-11-10
KR20050075336A (ko) 2005-07-20
HK1063477A1 (en) 2004-12-31
JP2011089125A (ja) 2011-05-06
IL166930A (en) 2012-08-30
IL166506A0 (en) 2006-01-15
EP2272865A2 (en) 2011-01-12
AU2003253399B2 (en) 2010-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1398327B1 (en) Method of producing hydroxyalkyl starch derivatives
JP4688494B2 (ja) ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法
EP1681303B1 (en) HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin
HK1063477B (en) Method of producing hydroxyalkyl starch derivatives
HK1149030A (en) Method of producing hydroxyalkyl starch derivatives
HK1153493A (en) Hasylated polypeptides, especially hasylated erythropoietin
HK1063475B (en) Hasylated polypeptides, especially hasylated erythropoietin

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20140808