JP2008532966A

JP2008532966A - 不活性出発物質からの生理活性糖タンパク質の生成

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Publication number: JP2008532966A
Application number: JP2008500129A
Authority: JP
Inventors: ロナルト・フランク; ハラルト・コンラート; エッカルト・グラーベンホルスト; ノルベルト・ツァンダー
Original assignee: Fresenius Kabi Deutschland GmbH
Current assignee: Fresenius Kabi Deutschland GmbH
Priority date: 2005-03-11
Filing date: 2006-03-09
Publication date: 2008-08-21
Also published as: CA2598528A1; EP1861124A2; WO2006094810A3; KR20070110902A; AU2006222187A1; WO2006094810A2; CN101137396A; US20100062973A1

Abstract

本発明は、糖タンパク質およびポリマーもしくは前記ポリマーの誘導体を含む共役複合体の製造方法であって、その中で該ポリマーはヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）であり、
ａ）糖タンパク質および修飾ポリオールの間の共有結合の形成を触媒することができるトランスフェラーゼの存在下、前記糖タンパク質を、共有結合によって結合した官能基Ｚを有する前記修飾ポリオールと反応させて、共有結合によって結合した少なくとも一つの官能基Ｚを有するポリオールに共有結合した糖タンパク質を生じる段階、並びに
ｂ）該ポリマーまたはその誘導体の少なくとも一つの官能基Ａを、段階ａ）の間に前記糖タンパク質に加えた糖タンパク質の少なくとも一つの官能基Ｚと反応させ、それによって共有結合を形成する段階を含むことを特徴とする方法に関する。

Description

緒言
エリスロポエチンは、約３４，０００Ｄの酸性糖タンパク質ホルモンである。ヒトエリスロポエチンは、単量体として天然に存在する１６６アミノ酸のポリペプチドである(Lin et al., 1985, PNAS 82, 7580-7584, EP 148 605 B2, EP 411 678 B2)。エリスロポエチンをコードする遺伝子の同定、クローニングおよび発現は、例えば、米国特許4,703,008に記載されている。組換えエリスロポエチンプラスミドを含む哺乳類細胞の増殖を支える細胞培地からの組換えエリスロポエチンの精製は、例えば、米国特許4,667,016に記載されている。

この技術分野では、インビボでのＥＰＯの生物活性が、主にＥＰＯに結合したシアル酸の数に依存すると一般に考えられている（例えばEP 428 267 B1参照）。理論的には、Ｎ−グリコシル化部位およびＯ−グリコシル化部位に結合した糖側鎖の末端で、１４分子のシアル酸が１分子のＥＰＯに結合しうる。しかしながら、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）から組換えで発現されたヒトの分子の試料である、国際ＥＰＯ標準試料(international EPO standard preparation)（ＢＲＰ−ＥＰＯ標準バッチＩＩ(BRP-EPO standard batch II)）において、１０〜１４または１５シアル酸残基を有するＥＰＯアイソフォームが存在している。ＥＰＯの適当なインビボ生物活性を保証するために、その複合型Ｎ−グリカン部位の末端をシアル酸でマスクしたガラクトース残基の数は重要である。

薬物適用に使用する他の糖タンパク質についても同様のことが当てはまる。ＩＦＮ−β、抗体、ｈｃｇ、ＦＳＨ、およびＬＨのような糖タンパク質のインビボ生理活性はまた、シアル酸でのこれらのＮ−グリカンおよびＯ−グリカンの適当なキャッピングに依存するとも考えられる。

ＥＰＯの場合、十分に高いインビボ生物活性を示す組換え源(recombinant source)から高度にシアル酸付加されたＥＰＯ試料を得るためには、高度に洗練された精製段階が必要である。したがって、細胞によって培地中に分泌される全ＥＰＯのかなりの割合が、最終的な目的の生成物の高活性型から分離されなければならない。通常は薬物適用に適していないとして廃棄されるＥＰＯの不十分なシアル酸付加型（および一般の他の糖タンパク質の不十分なシアル酸付加型）を利用することは有利なこととなる。

本発明によって、このような不十分なシアル酸付加糖タンパク質試料を、薬物適用にいかに有用にするかの温和な方法が記載される。酵素を使用して官能基を糖タンパク質に導入し、続いて導入された官能基で共有結合的にＨＥＳ修飾することによって、適当にシアル酸付加された糖タンパク質型のものと同程度、またはさらに高いインビボ活性を有する修飾糖タンパク質が生じる。末端シアル酸残基が大幅に不足しているＥＰＯ試料は、修飾されて、ＥＰＯ１分子あたり合計１４シアル酸を含む試料と同程度のインビボ生理活性の試料を生じうることが、ヒトＥＰＯを実施例として用いて本明細書に記載されている。

（発明の詳細な開示）
したがって、本発明は、糖タンパク質およびポリマーもしくは前記ポリマーの誘導体を含む共役複合体の製造方法であって、その中で該ポリマーはヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）であり、
ａ）糖タンパク質および修飾ポリオールの間の共有結合の形成を触媒することができるトランスフェラーゼの存在下、前記糖タンパク質を、共有結合によって結合した官能基Ｚを有する前記修飾ポリオールと反応させて、共有結合によって結合した少なくとも一つの官能基Ｚを有するポリオールに共有結合した糖タンパク質を生じる段階、並びに
ｂ）該ポリマーまたはその誘導体の少なくとも一つの官能基Ａを、段階ａ）の間に前記糖タンパク質に加えた糖タンパク質の少なくとも一つの官能基Ｚと反応させ、それによって共有結合を形成する段階を含むことを特徴とする方法に関する。

一般に、官能基ＡおよびＺについて特に制限はないが、但しＡとＺを反応させることによって共有結合が形成されうる。例えば、以下の化学基Ａが考えられる：
− Ｃ−Ｃ二重結合もしくはＣ−Ｃ三重結合または芳香族Ｃ−Ｃ結合；
− チオ基またはヒドロキシ基；
− アルキルスルホン酸ヒドラジド、アリールスルホン酸ヒドラジド；
− １，２−ジオール類；
− １，２−アミノチオアルコール類；
− １，２−アミノアルコール類；
− アミノ基−ＮＨ_２または構造単位−ＮＨ−を含むアミノ基の誘導体、例えばアミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリルアミノ基(alkarlyaminogroup)；
− ヒドロキシルアミノ基−Ｏ−ＮＨ_２、または構造単位−Ｏ−ＮＨ−を含むヒドロキシルアミノ基の誘導体、例えばヒドロキシルアルキルアミノ基、ヒドロキシルアリールアミノ基、ヒドロキシルアラルキルアミノ基、またはヒドロキシルアルカリルアミノ基(hydroxalalkarylaminogroup)；
− 各々が構造単位−ＮＨ−Ｏ−を含む、アルコキシアミノ基、アリールオキシアミノ基、アラルキルオキシアミノ基、またはアルカリルオキシアミノ基；
− カルボニル基を有する残基、−Ｑ−Ｃ（＝Ｇ）−Ｍ
［式中、Ｇは、ＯまたはＳであって、Ｍは、例えば、
−− −ＯＨまたは−ＳＨ；
−− アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、またはアルカリルオキシ基；
−− アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルチオ基、またはアルカリルチオ基；
−− アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、アラルキルカルボニルオキシ基、アルカリルカルボニルオキシ基；
−− 活性化エステル、例えばイミド構造を有するヒドロキシルアミン（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド）のエステル、または構造単位Ｏ−Ｎ（Ｎはヘテロアリール化合物の一部である）を有するヒドロキシルアミンのエステル、あるいはＧ＝Ｏであって、Ｑが不存在である、例えば置換アリール残基（例えばペンタフルオロフェニル、パラニトロフェニルまたはトリクロロフェニル）を有するアリールオキシ化合物の活性化エステル；
であり、Ｑは不存在またはＮＨあるいはヘテロ原子（例えばＳまたはＯ）である］；
− −ＮＨ−ＮＨ_２、または−ＮＨ−ＮＨ−；
− −ＮＯ_２；
− ニトリル基；
− カルボニル基、例えばアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基；
− カルボキシ基；
− −Ｎ＝Ｃ＝Ｏ基または−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基；
− ハロゲン化ビニル基（例えばヨウ化ビニル基または臭化ビニル基）あるいはトリフレート；
− −Ｃ≡Ｃ−Ｈ；
− −（Ｃ＝ＮＨ_２Ｃｌ）−Ｏアルキル
− −（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ_２−Ｈａｌ基［式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである］；
− −ＣＨ＝ＣＨ−ＳＯ_２−；
− 構造−Ｓ−Ｓ−を含むジスルフィド基；
− 化学基：

− 化学基：

したがって、官能基Ｚは、官能基Ａ、好ましくは上述の官能基の一つである官能基Ａと共有化学結合を形成することができる化学基である。さらに好ましくは、Ｚは上述の化学基から選択される。

段階ｂ）は、好ましくは、該ポリマーまたはその誘導体の少なくとも一つの官能基Ａを、段階ａ）で化学基Ｚの導入によって修飾された糖タンパク質の少なくとも一つの官能基Ｚと反応させ、それによって共有結合を形成することによって行われ、その中でＺは、アミノ基、チオール基、アルデヒド基、ヘミアセタール基、ケト基、マレイミド基、およびチオエステル基からなる群から選択される。

より好ましくは、段階ｂ）は、該ポリマーまたはその誘導体の少なくとも一つの官能基Ａを、段階ａ）の間に前記糖タンパク質に加えた糖タンパク質の少なくとも一つの官能基Ｚと反応させ、それによって共有結合を形成することによって行われ、その中でＺは、アミノ基、チオール基、アルデヒド基、ヘミアセタール基、ケト基、マレイミド基、およびチオエステル基からなる群から選択され、
−Ｚがアルデヒド基またはケト基である場合、ＡはＺとの前記結合を形成するアミノ基を含み、
−Ｚがアミノ基である場合、Ａは反応性カルボキシ基およびアルデヒド基、ケト基もしくはヘミアセタール基からなる群から選択され、
−Ｚがマレイミド基である場合、ＡはＺとの前記結合を形成するチオール基を含み、
−−Ａがアルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基である場合、該方法は、ポリマー中にＡを導入してポリマー誘導体を得ることをさらに特徴とし、
−−−それは該ポリマーを少なくとも二官能性の化合物と反応させることによって行い、その一方の官能基は該ポリマーと反応し、その他方の官能基の少なくとも一つは、アルデヒド基、ケト基もしくはヘミアセタール基であるか、またはアルデヒド基、ケト基もしくはヘミアセタール基が得られるようにさらに化学修飾された官能基であり、あるいは
−−−それは該ポリマーを酸化して少なくとも一つ、特に少なくとも二つのアルデヒド基を得ることによって行い；あるいは
−−Ａが反応性カルボキシ基である場合、該方法は、ポリマー中にＡを導入してポリマー誘導体を得ることをさらに特徴とし、
−−−それは該ポリマーをその還元末端で選択的に酸化させ、生じたカルボキシ基を活性化させることによって行い、あるいは
−−−それは該ポリマーをその酸化されていない還元末端で炭酸ジエステルと反応させることによって行い；あるいは
−Ｚがチオール基である場合、ＡはＺとの前記結合を形成するマレイミド基またはハロゲンアセチル基を含む。

糖タンパク質への官能基Ｚの酵素転移は、非常に温和であり、酸化的条件および／または酸性条件を回避するという利点を有し、それはメチオニン残基の酸化および／またはグルタミン／アスパラギン残基の脱アミド化(desamidation)をもたらしうる。さらに、このような官能基Ｚは糖タンパク質に結合しうるが、それは通常タンパク質中に存在せず、そのため官能基Ａとの後続反応は、潜在的に非常に部位特異的となる。温和な条件下で互いに反応するように、糖タンパク質に結合した官能基Ｚおよびヒドロキシアルキルデンプンに結合したＡを選択する。特に、
− Ｚがアルデヒド基またはケト基である場合、ＡはＺとの前記結合を形成するアミノ基を含み、
− Ｚがマレイミド基である場合、Ａはチオールを含み、並びに
− Ｚがアミノ基である場合、Ａは反応性カルボキシ基およびアルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基からなる群から選択される。

本発明の方法は、ポリマーの中に官能基Ａを導入して、段階ａ）で官能基Ｚを加えた後に修飾糖タンパク質と反応させることができるポリマー誘導体を得ることをさらに特徴とする。

したがって、Ａがアルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基である場合、該方法は、ポリマー中にＡを導入してポリマー誘導体を得ることをさらに特徴とし、
−−− それは該ポリマーを少なくとも二官能性の化合物と反応させることによって行い、その一方の官能基は該ポリマーと反応し、その他方の官能基の少なくとも一つは、アルデヒド基、ケト基もしくはヘミアセタール基であるか、またはアルデヒド基、ケト基もしくはヘミアセタール基が得られるようにさらに化学修飾された官能基であり、あるいは
−−− それは該ポリマーを酸化させて、少なくとも一つ、特に少なくとも二つのアルデヒド基を得ることによって行う。

したがって、Ａが反応性カルボキシ基である場合、該方法は、ポリマー中にＡを導入してポリマー誘導体を得ることをさらに特徴とし、
−−− それは該ポリマーをその還元末端で選択的に酸化させ、生じたカルボキシ基を活性化させることによって行い、あるいは
−−− それは該ポリマーをその酸化されていない還元末端で炭酸ジエステルと反応させることによって行う。

Ｚがチオール基である場合、ＡはＺとの前記結合を形成するマレイミド基またはハロゲンアセチル基を含む。段階ａ）の間のチオール基Ｚの導入は、糖タンパク質それ自身が、化学基Ａとの反応に利用できる有離チオール基を有していない場合に好まれる。例えば、これは分泌糖タンパク質である場合が多く、その場合すべてのシステイン残基がタンパク質内のシステイン架橋に拘束されていることが多い。

Ｚがマレイミド基である場合、ＡはＺとの前記結合を形成するチオール基を含む。糖タンパク質それ自身は通常、Ａとの反応に利用できるような官能基を有してないので、段階ａ）の間のマレイミド基Ｚの導入は好ましい態様である。

Ｚがアミノ基である場合、Ａは、反応性カルボキシ基、アルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基を含む。糖タンパク質それ自身は通常、Ａとの反応に利用できるような官能基を有してないので、特にＺがヒドロキシルアミノ基またはヒドラジド基である場合、段階ａ）の間のアミノ基の導入は好ましい態様である。

本発明の方法のさらなる利点は、その個々の段階および該方法全体の収率が高いことである。したがって、本発明はまた、段階ａ）から得られた修飾糖タンパク質の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％が、段階ｂ）の間に生成物の共役複合体に変換される、上記に記載された方法にも関する。生成物の共役複合体には、投入した糖タンパク質およびポリマーもしくはポリマー誘導体が含まれる。ポリマーまたはポリマー誘導体は、修飾ポリオールの化学基Ｚと該ポリマーまたはポリマー誘導体の化学基Ａの間で形成される共有結合を通して、糖タンパク質に結合しうる。好ましくは、該ポリマーまたはポリマー誘導体は、修飾ポリオールの化学基Ｚと該ポリマーまたはポリマー誘導体の化学基Ａの間で形成される共有結合を通して、糖タンパク質に排他的に結合し、すなわち、該ポリマーまたは該ポリマー誘導体は、該ポリオールを糖タンパク質へ加えることによって与えられる官能基とのみ反応する。

したがって、本発明はまた、出発（すなわち無修飾の）糖タンパク質の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％が、段階ａ）において、修飾糖タンパク質（すなわち共有結合によって結合した少なくとも一つの官能基Ｚを有するポリオールに共有結合した糖タンパク質）に変換される、上記に記載された方法にも関する。

糖タンパク質に転移されるポリオール基質およびトランスフェラーゼ反応に用いられるトランスフェラーゼは、WO03/031464に開示されるすべてのポリオールおよびすべてのトランスフェラーゼでありうる。本明細書で用いられる修飾ポリオールは、修飾されるいずれのポリオールでもよいが、やはりグリコシルトランスフェラーゼの適当な基質である。好ましい態様において、修飾ポリオールは、修飾糖ヌクレオチド、詳細には、修飾フコースヌクレオチド、修飾グルコースヌクレオチド、修飾マンノースヌクレオチド、修飾Ｎ−アセチルグルコサミンヌクレオチド、修飾Ｎ−アセチルガラクトサミンヌクレオチドまたは修飾ガラクトースヌクレオチド、より詳細には、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ、ＧＤＰ−Ｍａｎ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＵＤＰ−Ｇｌｃ、またはＧＤＰ−Ｆｕｃである。

修飾ポリオール、特に修飾糖ヌクレオチドは、ポリオール骨格の炭素原子に直接結合した官能基Ｚ（例えばグルコース残基のＣ６に結合したチオール基）を運んでもよく、あるいは官能基Ｚはリンカー分子を通して結合してもよい。とりわけ、該リンカーは適宜置換されていてもよく、直鎖、分枝鎖および／または環状炭化水素残基であってもよい。一般に、炭化水素残基は、６０個まで、好ましくは４０個まで、より好ましくは２０個まで、より好ましくは１０個まで、より好ましくは６個まで、特に好ましくは４個までの炭素原子を有する。もしヘテロ原子が存在していたら、分離した化学基には、一般に１から２０個、好ましくは１から８個、より好ましくは１から６個、より好ましくは１から４個、特に好ましくは１から２個のヘテロ原子が含まれる。ヘテロ原子としては、Ｏが好ましい。炭化水素残基には、例えば、５から７個の炭素原子を有する適宜分枝したアルキル鎖もしくはアリール基またはシクロアルキル基が含まれていてもよく、あるいはアルキル部分が直鎖および／または環状アルキル基でありうるアラルキル基、アルカリル基であってもよい。本発明のさらに好ましい態様によれば、リンカーは４個の炭素原子を有する直鎖の炭化水素鎖である。本発明の別の好ましい態様によれば、リンカーは４個の炭素原子および少なくとも一つ、好ましくは一つのヘテロ原子、特に好ましくは酸素原子を有する直鎖の炭化水素鎖である。このような修飾およびリンカー修飾ポリオールは、例えば「Carbohydrates in Chemistry and Biology part I, Vols. 1+2, B.Ernst, G.W. Hart and P.Sinay eds. Published 2000, Whiley-VCH Weinheim-New York-Chichester-Brisbane-Toronto, ISBN 3-527-29511-9」に記載されている、有機化学合成によって製造されうる。

本発明の方法の段階ａ）において有用な好ましいトランスフェラーゼは、ＥＣクラス２．４．１のグリコシルトランスフェラーゼであり、特にその中で該トランスフェラーゼは、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ、α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼからなる群から選択される。

本発明の文脈において、用語「グリコシル化タンパク質」または「糖タンパク質」、すなわち「糖側鎖」を有するタンパク質とは、炭水化物部分、例えばヒドロキシアルデヒドまたはヒドロキシケトンを含むタンパク質並びにその化学修飾をいう（Roempp Chemielexikon, Thieme Verlag Stuttgart, Germany, 9th edition 1990, Volume 9, pages 2281-2285およびその中で引用されている文献を参照）。さらに、それはまた、自然発生した炭水化物部分、例えばガラクトース、Ｎ−アセチルノイラミン酸、およびＮ−アセチルガラクトサミンなどの誘導体をいう。

本発明に従って共役複合されうる好ましい糖タンパク質は、以下のように特徴付けられうる：

エリスロポエチン：ＥＰＯは、ヒト（例えばInoue, Wada, Takeuchi, 1994, An improved method for the purification of human erythropoietin with high in vivo activity from the urine of anemic patients, Biol Pharm Bull. 17(2), 180-4; Miyake, Kung, Goldwasser, 1977, Purification of human erythropoietin., J Biol Chem., 252(15), 5558-64）または別の哺乳類源のいずれのものであってもよく、ヒト腎臓、ヒト胎生肝または動物、好ましくはサル腎臓のような自然発生源からの精製によって得られてもよい。さらに、表現「エリスロポエチン」または「ＥＰＯ」には、一つ以上のアミノ酸（例えば１から２５個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から５個、最も好ましくは１または２個）が別のアミノ酸によって交換されており、エリスロポエチン活性（例えばEP 640 619 B1参照）を示すＥＰＯ変異体もまた含まれる。エリスロポエチン活性の測定は、当該技術分野で記載されている（インビトロ活性の測定についてはFibi et al.,1991, Blood, 77, 1203 ff; Kitamura et al., 1989, J. Cell Phys., 140, 323-334を参照；ＥＰＯインビボ活性の測定についてはPh. Eur. 2001, 911-917; Ph. Eur. 2000, 1316 Erythropoietini solutio concentrata, 780- 785; European Pharmacopoeia (1996/2000); European Pharmacopoeia, 1996, Erythropoietin concentrated solution, Pharmaeuropa., 8, 371-377; Fibi, Hermentin, Pauly, Lauffer, Zettlmeissl., 1995, N- and O-glycosylation muteins of recombinant human erythropoietin secreted from BHK-21 cells, Blood, 85(5), 1229-36を参照；（ＥＰＯおよび修飾ＥＰＯ型をメスのＮＭＲＩマウスに注入し（等量のタンパク質５０ｎｇ／マウス）１、２および３日目に血液サンプルを採血し、４日目に網状赤血球を測定した））。ＥＰＯの活性の測定についての試験が記載されている、さらなる出版は、Barbone, Aparicio, Anderson, Natarajan, Ritchie, 1994, Reticulocytes measurements as a bioassay for erythropoietin, J. Pharm. Biomed. Anal., 12(4), 515-22; Bowen, Culligan, Beguin, Kendall, Villis, 1994, Estimation of effective and total erythropoiesis in myelodysplasia using serum transferrin receptor and erythropoietin concentrations, with automated reticulocyte parameters, Leukemi, 8(1), 151-5; Delorme, Lorenzini, Giffin, Martin, Jacobsen, Boone, Elliott, 1992, Role o glycosylation on the secretion and biological activity of erythropoietin, Biochemistry, 31(41), 9871-6; Higuchi, Oh-eda, Kuboniwa, Tomonoh, Shimonaka, Ochi, 1992;Role of sugar chains in the expression of the biological activity of human erythropoietin, J. Biol. Chem., 267(11), 7703-9; Yamaguchi, Akai, Kawanishi, Ueda, Masuda, Sasaki, 1991, Effects of site-directed removal of N-glycosylation sites in human erythropoietin on its production and biological properties, J. Biol. Chem., 266(30), 20434-9; Takeuchi, Inoue, Strickland, Kubota, Wada, Shimizu, Hoshi, Kozutsumi, Takasaki, Kobata, 1989, Relationship between sugar chain structure and biological activity of recombinant human erythropoietin produced in Chinese hamster ovary cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85(20), 7819-22; Kurtz, Eckardt, 1989, Assay methods for erythropoietin, Nephron., 51(1), 11-4 (German); Zucali, Sulkowski, 1985, Purification of human urinary erythropoietin on controlled-pore glass and silicic acid, Exp. Hematol., 13(3), 833-7; Krystal, 1983, Physical and biological characterization of erythroblast enhancing factor (EEF), a late acting erythropoetic stimulator in serum distinct from erythropoietin, Exp. Hematol., 11(1), 18-31である。

ＨＣＧは卵巣を刺激して、妊娠維持のために不可欠なステロイドを合成する。それは、サイロトロピン、ルトロピン、フォリトロピンおよびゴナドトロピンに生物学的特異性を与える共通のアルファ鎖およびユニークなベータ鎖の胎盤分泌ヘテロダイマーである。それは、第１三半期の胎盤によって生成される。それはノバレル(Novarel)（フェリング(Ferring)）およびプロファシ(Profasi)（セロノ(Serono)）の名で、市販品として入手可能である。ＨＣＧは肥満の治療において補助的療法として用いられる。ベータ鎖は、２つのＮ−グリコシル化部位および４つのＯ−グリコシル化部位を含む。ＨＣＧは、糖タンパク質ホルモンベータ鎖ファミリーに属する。ＨＣＧは、胎盤によって放出されるホルモン（「妊娠ホルモン」）並びに様々な腫瘍によって放出されるホルモンであるが、局所的に生成され、精巣および他の組織の中でも働いている。それは糖タンパク質ホルモン（ＧＰＨ）ファミリーのメンバーであり、その他は下垂体ホルモン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）である。これらの各々は、共通のアルファおよびホルモン特異的ベータサブユニットからなるヘテロダイマーである。該サブユニットは、主に三次構造に関して、互いに部分的に相同である。ｈＣＧの結晶構造の最近の解明によって、すべてのこれらのサブユニットが、例えば、神経（ＮＧＦ）、血小板由来（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング（ＴＧＦベータ）成長因子などの成長因子と、いわゆるシスチンノット構造モチーフ(cystin-knot structural motif)を共有し、そうでなければＧＰＨとは無関係であることが明らかとなっている。ｈＣＧのベータサブユニットは、ＬＨのものと極めて類似している（Lapthorn, A J, Harris, D.C., Littlejohn, A, Lustbader, J W, Canfield, R E, Machin, K J, Morgan, F J, Isaacs, N W: Crystal structure of human chorionic gonadotropin. Nature, 369, 455-461, 1994）。

ＬＨは、精巣および卵巣を刺激してステロイドを合成することによって、精子形成および排卵を促進する。それは脳下垂体によって分泌され、サイロトロピン、ルトロピン、フォリトロピンおよびゴナドトロピンに生物学的特異性を与える共通のアルファ鎖およびユニークなベータ鎖のヘテロダイマーである。ＬＨＢにおける欠損は、性腺機能低下症、不妊症および偽雌雄同体によって特徴付けられる疾患の原因である。ＬＨは、糖タンパク質ホルモンベータ鎖ファミリーに属する（Weisshaar G., Hiyama J., Renwick A.G.C., Nimtz M.;「NMR investigations of the N-linked oligosaccharides at individual glycosylation sites of human lutropin.」; Eur. J. Biochem. 195:257-268(1991)）。

ＦＳＨは、サイロトロピン、ルトロピン、フォリトロピンおよびゴナドトロピンに生物学的特異性を与える共通のアルファ鎖およびユニークなベータ鎖のヘテロダイマーである。それは、ゴナール−Ｆ(Gonal-F)またはメトロジンＨＰ(Metrodin HP)（セロノ）およびピュレゴン(Puregon)（オルガノン）の名で、市販品として入手可能であり、下垂体機能低下症と判明した女性またはクロミフェンに応答していない女性の不妊症の治療；あるいは補助受胎（例えばインビトロ受精）のための過排卵処理に用いられる。メトロジンＨＰはまた、精子形成の刺激のため、男性の低ゴナドトロピン性の性腺機能低下症の治療にも用いられる（Fujiki Y., Rathnam P., Saxena B.B.;「Studies on the disulfide bonds in human pituitary follicle-stimulating hormone.」; Biochim. Biophys. Acta 624:428-435(1980)およびKeene J.L., Matzuk M.M., Otani T., Fauser B.C.J.M., Galway A.B., Hsueh A.J.W., Boime I.;「Expression of biologically active human follitropin in Chinese hamster ovary cells.」; J. Biol. Chem. 264:4769-4775 (1989)）。

抗体融合タンパク質は治療剤として公知であり、臨床試験、例えば、乳癌に対して宿主防御系を増大および増強する試みから公知である。ＩＬ２、ＩＬ１２、ＧＭＣＳＦと、適当なターゲット（例えば、ターゲッティングの特異性を有し、モノクローナル抗体の送達が容易なＴ細胞免疫刺激を媒介するターゲット）に対するヒトＩｇＧのＦｃ部分または単鎖の可変領域（ｓｃＦｖ）の組合せが開発されてきた。典型的には、抗体融合タンパク質はＦｃ部分でＮ−グリコシル化部位を有し、分子のサイトカイン部分でＮ−グリコシル化部位およびＯ−グリコシル化部位を含みうる（Antibody Fusion Proteins 312 pages Editor: Steven M. Chamow; Editor: Avi Ashkenazi; John Wiley & Sons, Inc）。

インターロイキン、特にインターロイキン２またはインターロイキン６は、抗原刺激または分裂刺激に応答してＴ細胞によって生成され、このタンパク質は、免疫応答の制御に不可欠なＴ細胞増殖および他の活性に必要である。Ｂ細胞、単球、リンホカイン活性化キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、およびグリオーマ細胞を刺激しうる。インターロイシン２(Interleucine 2)は、ＴＮＦＲＳＦ１７およびＩＬ２を含む染色体転座t(4;16)(q26;p13)によって、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）の一種に関与する。それは、プロロイシン(Proleucin)（カイロン(Chiron)）の名で市販品として入手可能であり、腎細胞癌または転移性黒色腫を有する患者に用いられる。J. Biol. Chem. 264:17368-17373(1989)。

インターロイキン６は、様々な生物学的機能を有するサイトカインである：それはＢ細胞のＩｇ分泌細胞への最終的な分化に必須の役割を果たし、骨髄腫および形質細胞腫の増殖を誘導し、肝細胞において神経細胞分化を誘導し、急性期反応物質を誘導する J. Mol. Cell. Immunol. 4:203-211(1989)。

顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子は、２つの関連する血液白血球群、すなわち顆粒球および単球−マクロファージの産生、分化および機能を制御することによって、血球新生で作用するサイトカインである。Ｇ−ＣＳＦは、顆粒球を誘導する。シグナル開裂成熟タンパク質(signal cleaved mature protein)の分子量は１９０４６ダルトンである。それは、Ｏ−グリコシル化部位を一つ含む。Ｇ−ＣＳＦは、ニューポジェン(Neupogen)またはグラニュロカイン(Granulokine)（アムジェン／ロシュ）およびグラノサイト(Granocyte)（ローヌ・プーラン）の名で入手可能である。Ｇ−ＣＳＦは、好中球減少（血液中の好中球の数が極めて低いことによって特徴付けられる障害）を治療するのに用いられる。

インターフェロンは、ウイルス感染および他の生物学的誘導因子への応答において、抗ウイルス活性、抗増殖活性、および免疫調節活性を媒介するサイトカインである。ヒトインターフェロンベータのアミノ酸配列が、例えばEP 0 218 825 A1において与えられる。インターフェロンベータの有用な市販製剤は、アボネックスおよびレビフ(Rebif)（ＩＦＮベータ１ａ）である。インターフェロンベータ１ａは、ヒトインターフェロンベータ遺伝子が導入されている遺伝子改変チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を用いて組換えＤＮＡ技術によって生成される。ＩＦＮベータ１ａのアミノ酸配列は、天然の線維芽細胞由来ヒトインターフェロンベータのものと同一である。天然のインターフェロンベータおよびインターフェロンベータ１ａはグリコシル化され、各々Ａｓｎ８０で１個のＮ結合型複合糖部位を含む。インターフェロンベータ薬は、再発寛解型多発性硬化症の治療に用いられる。

ＩＦＮアルファ型は、ウイルス、核酸、グルココルチコイドホルモン、および他の誘導因子による誘導後に、単球／マクロファージ、リンパ芽球様細胞、線維芽細胞および多くの異なる細胞型によって、天然に生成される。少なくとも２３個の異なった変異体のＩＦＮアルファが知られている。個々のタンパク質は１９〜２６ｋＤの間の分子量を有し、１５６〜１６６または１７２アミノ酸の長さのタンパク質からなる。すべてのＩＦＮアルファサブタイプは、アミノ酸位置１１５〜１５１の間の共通保存配列領域を有するが、アミノ末端は変化しやすい。多くのＩＦＮアルファサブタイプは、一つまたは二つの位置のみでその配列が異なる。ジスルフィド結合は、１／９８および２９／１３８の位置でのシステイン間で形成される。ジスルフィド結合２９／１３８は生物活性に必須であるが、１／９８結合は生物活性に影響を及ぼさずに還元されうる。すべてのＩＦＮアルファ型は、潜在的なグリコシル化部位を含む。グリコシル化ＩＦＮアルファ型は、本発明に有益である。

ヒトＩＦＮ−γは、活性化Ｔ、ＢおよびＮＫ細胞によって生成される〜２０ｋＤａの因子であり、抗ウイルスサイトカインおよび抗寄生虫サイトカインである。該分子は、二つの潜在的なＮ−グリコシル化部位を含む。他のサイトカイン、例えばＴＮＦ−αと相乗作用するＩＦＮ−γは、正常細胞および形質転換細胞の増殖を阻害する。ＩＦＮ−γの免疫調節効果によって、ＩＦＮ−γについての高親和性受容体を発現する広範囲の細胞型が働く。ＩＦＮ−γのグリコシル化は、その生物活性に影響を及ぼさない。それはアクトイミューン(Actimmune)（ジェネンテック）の名で入手可能である。慢性肉芽腫症に関連する重篤感染症の頻度および重症度を減少するために用いられる（Am J Ther. 1996 Feb;3(2):109-114）

アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）は、トロンビンおよび第Ｘａ因子を阻害するセリンプロテアーゼインヒビターである（Travis, Annu. Rev. Biochem. 52: 655, 1983）。程度は下がるものの、第ＩＸａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、ｔＰＡ、ウロキナーゼ、トリプシン、プラスミンおよびカリクレインもまた阻害される（Menache, Semin. Hematol. 28:1, 1991; Menache, Transfusion 32:580, 1992; Lahiri, Arch. Biochem. Biophys. 175:737, 1976）。ヒトＡＴＩＩＩは、約５８．０００Ｄの分子量（ＭＷ）を有する４３２アミノ酸の一本鎖糖タンパク質として、肝臓で合成される。その正常な血漿濃度は１４〜２０ｍｇ／ｄＬの範囲にある（Rosenberg, Rev. Hematol. 2:351,1986; Murano, Thromb. Res. 18:259, 1980）。該タンパク質は、３つのジスルフィド架橋（Ｃｙｓ８〜１２８、Ｃｙｓ２１〜９５、Ｃｙｓ２４７〜４３０）および全質量の１５％を占める４つのＮ結合型糖鎖（Ａｓｎ９６、−１３５、−１５５、−１９２）を有する（Franzen, J. Biol. Chem. 255:5090, 1980; Peterson, The Physiological Inhibitions of Blood Coagulation and Fibrinolysis, Elsevier/ North-Holland Biomedical Press 1979, p. 43）。ＡＴＩＩＩは、古典的なヒト血漿分画技法に従って生成されうる。ＡＴＩＩＩに対するヘパリンの高い親和性を用いたアフィニティークロマトグラフィー（ヘパリン−セファロース）と、それに続くウイルス不活性化のための熱処理が、血漿からの分離に用いられる。ＡＴＩＩＩ生成のために利用可能な最近の代替法は組換え生成技術(recombinant production technique)であり、それによってこの治療タンパク質をより安全に入手することができる（Levi, Semin Thromb Hemost 27:405, 2001）。ＡＴｒｙｎ（登録商標）は、ジェンザイムトランスジェニックス社（ＧＴＣ）によってトランスジェニックヤギで生成される組換えヒトＡＴＩＩＩ（ｒｈＡＴＩＩＩ）である。欧州の病院市場では以下のＡＴＩＩＩ薬を入手可能である。（出典：ＩＭＳ−ＡＴＣグループ２００１）：カイバーニン(Kybernin)（アベンティスベーリング）、ＡＴＩＩＩ（バクスター、グリフォールズ(Grifols)）、アテナティブ(Atenativ)（ファーマシア(Pharmacia)）、アクロチン(Aclotine)（ＬＦＢ）、グリフォールズ(Grifols)（アンビン(Anbin)）。

第ＶＩＩ因子は、プロテイナーゼの内因性血液凝固カスケードに関与し、凝固カスケードの外因性経路を活性化することによって止血を促進する。ＦＶＩＩは、第Ｘａ因子、第ＸＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、またはトロンビンにより、小タンパク質分解によって第ＶＩＩａ因子に変換される。組織因子およびカルシウムイオンの存在下で、第ＶＩＩａ因子は、次いでタンパク質限定加水分解により、第Ｘ因子を第Ｘａ因子に変換する。第ＶＩＩａ因子はまた、組織因子およびカルシウムの存在下で、第ＩＸ因子を第ＩＸａ因子にも変換する。第ＶＩＩ因子は、４０６アミノ酸残基からなるビタミンＫ依存性糖タンパク質である（ＭＷ５０ｋダルトン）。第ＶＩＩ因子は、献血されたヒト血漿からの通常の抽出によって生産され、または最近では、組換え系を用いて生産される。ノボノルディスクは、ノボセブン（登録商標）の生産に、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞を使用する。５５ｋＤａの公称分子量を有する４０６アミノ酸の一本鎖タンパク質として発現される（Thim, L. et al., Biochemistry 27:7785-7793 (1988)）。該分子は４つの糖側鎖を有する。Ｓｅｒ５２、６０での２つのＯ結合型糖側鎖と、Ａｓｎ１４５、３２２での２つのＮ結合型糖側鎖である（Thim, L. et al., Biochemistry 27:7785-7793 (1988)）。

第ＶＩＩＩ因子は、プロテイナーゼの内因性血液凝固カスケードに関与し、第Ｘ因子を活性型の第Ｘａ因子に変換する第ＩＸａ因子の反応において補因子として役立ち、これは最後にフィブリン塊の形成をもたらす。第ＶＩＩＩ因子の欠如または不安定性は、よく見られる劣性ｘ連鎖凝固障害血友病Ａをもたらす。第ＶＩＩＩ因子は、献血されたヒト血漿からの通常の抽出によって生産され、または最近では、組換え系を用いて生産される。バイエル(Bayer)は、コージネイト(Kogenate)の生産にベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞を使用し、一方バクスターは、２６７ｋＤａの公称分子量を有する２３５１アミノ酸の完全な一本鎖タンパク質として（Toole et al., 1984, Nature 312: 342）、あるいはより安定で、生産に高収率をもたらす製品を得るために、完全なＢドメインまたはその一部が欠失された異なる形で（Bhattacharyya et al., 2003, CRIPS 4/3: 2-8）、その製品リコネイト(Recombinate)にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用する。ＨＥＳ化タンパク質は、低程度の免疫原性を有することが期待され、そのためこの合併症を軽減しうる。

第ＩＸ因子は、Ｃａ（２＋）イオン、リン脂質、および第ＶＩＩＩａ因子の存在下、第Ｘ因子をその活性型に変換させることによって血液凝固の内因性経路に関与する、ビタミンＫ依存性血漿タンパク質である。第ＩＸ因子は、一本鎖において４１５アミノ酸からなる分子量約５５，０００Ｄａの分子量を有する糖タンパク質である（Yoshitake S. et al., Biochemistry 24:3736-3750 (1985)）。第ＩＸ因子は、献血されたヒト血漿からの通常の抽出によって生産され、または最近では、組換え系を用いて生産される。ワイスは、ベネフィックス(BeneFIX)（登録商標）の生産に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用している。それは、血漿由来第ＩＸ因子のＡｌａ^１４８対立形質と同一の一次アミノ酸配列を有し、内在性第ＩＸ因子のものに類似する構造上および機能上の特徴を有する。該タンパク質は８つの糖側鎖を有する。Ｓｅｒ５３、６１およびトレオニン１５９、１６９、１７２、１７９での６つのＯ結合型糖側鎖、ならびにＡｓｎ１５７、１６７での２つのＮ結合型糖側鎖（Yoshitake S. et al., Biochemistry 24:3736-3750 (1985); Balland A. et al., Eur J Biochem. 1988; 172(3):565-72）。

ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｈＧＭ−ＣＳＦ）は、造血前駆細胞の制御および分化のため、並びに成熟細胞集団の機能的活性化を刺激するために必須の、初期に作用する因子(early acting factor)である。それは、酵母、細菌、昆虫、植物および哺乳類細胞でクローン化および発現されており、構造、組成、血中半減期およびインビボの機能が異なるタンパク質がもたらされる（Donahue, R. E.; Wang, E. A.; Kaufman, R. J.; Foutch, L.; Leary, A. C.; Witek-Giannetti, J. S.; Metzeger, M.; Hewick, R. M.; Steinbrink, D. R.; Shaw, G.; Kamen, R.; Clark, S. C. Effects of N-linked carbohydrates on the in vivo properties of human GM-CSF. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1986, 51, pp. 685-692）。天然の哺乳類細胞由来ｈＧＭ−ＣＳＦは、１２７アミノ酸のタンパク質であり、それはＮ−グリカンとＯ−グリカンの両方を含む。このリンホカインは、免疫不全を患い、あるいは疾患または放射線照射および／または化学療法によって抑制されている患者において、骨髄性白血病の治療の可能性、並びに顆粒球およびマクロファージ生成を刺激する能力があるため、臨床上興味深い（Moonen, P.; Mermod, J.J.; Ernst, J.F.; Hirschi, M.; DeLamarter, J.F. Increased biological activity of deglycosylated recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor produced by yeast or animal cells. Proc. Natl. Acad. Sci. US. 1987, 84, pp. 4428 4431によって概説されている）。ＧＭ−ＣＳＦ製剤は、リューカイン(Leukine)（イミュネクス(Immunex)）およびロイコマックス(Leucomax)（ノバルティス）の名で、入手可能である。ＧＭ−ＣＳＦは、骨髄移植、骨髄移植生着の失敗または遅延、流動(mobilization)後、自家末梢血前駆細胞(autologous peripheral blood progenitor cell)の移植後、並びに急性骨髄性白血病を有する高齢者における術前化学療法後の骨髄再構成(myeloid reconstitution)に用いられる。

アルファ１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ、アルファ１−プロテイナーゼインヒビターともいう）は、実質的にすべての哺乳類セリンプロテイナーゼ、例えば、好中球エラスターゼ、トロンビン、第Ｘａ因子および第ＸＩａ因子を阻害することが示されているプロテイナーゼインヒビターである（Travis Ann. Rev. Biochem. 52 (1983) p.655）。Ａ１ＡＴは、３９４個のアミノ酸および５３ｋＤの分子量を有する、肝臓で合成される一本鎖糖タンパク質である。血漿濃度は１〜１．３ｇ／ｌの範囲にある。タンパク質全体にシステインが一つしか存在しないので、分子内ジスルフィド架橋を形成することはできない。該分子は、分子量の１２％に相当する三つの糖側鎖を有する（Ａｓｎ４６、８３、２４７）（Mega J. Biol. Chem. 255 (1980) p.4057；Mega J. Biol. Chem. 255 (1980) p.4053；Carell FEBS Letters 135 (1981) p.301；Hodges Biochemistry 21 (1982) p.2805）。重要な機能は、好中球エラスターゼの活性制御である（Travis Ann. Rev. Biochem. 52 (1983) p.655）。無制御なエラスターゼ活性は上皮組織への攻撃を引き起こして、回復不能な損傷をもたらす。不活性化の過程で、Ａ１ＡＴはエラスターゼの基質として作用し、該プロテーゼの活性中心に結合し、続いてこの複合体形成によって該プロテーゼを不活性化する。Ａ１ＡＴが欠乏すると、例えば肺上皮の損傷に関係する肺気腫が引き起こされる。Ａ１ＡＴの３つのＮ−グリコシル化部位に対するＡ１ＡＴの２タイプの糖側鎖の分布は、Ａ１ＡＴのアイソタイプごとに異なる。Ａ１ＡＴの古典的生産は、異なったアフィニティークロマトグラフィー段階を用いて、ヒト血漿分画で行われる。しかしながら、最近のＡ１ＡＴ生産法では組換え技術が使用される。ＰＰＬセラピューティクス(PPL Therapeutics)は、トランスジェニックヒツジの乳汁から組換えヒトＡ１ＡＴ（ｒＨＡ１ＡＴ）を回収させる方法を開発した（Olman Biochem. Soc. Symp. 63 (1998) p.141；Tebbutt Curr. Opin. Mol. Ther. 2 (2000) p.199；Carver Cytotechnology 9 (1992) p.77；Wright Biotechnology (NY) 9 (1991) p.830）。

組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）は、クロット溶解(clot lysis)に重要なトリプシン様セリンプロテアーゼである。フィブリンクロットの存在下で、ｔＰＡはプラスミノーゲンをプラスミンに変換し、それがフィブリンを分解する。ｔＰＡは、フィブリンの存在下で亢進した活性を示し、結果としてフィブリン特異的プラスミノーゲン活性化を引き起こす（M.W.Spellman, L.J.Basa, C.K.Leonard, J.A.Chakel, J.V.O'Connor, The Journal of Biological Chemistry 264 (1989) p.14100）。プラスミンは、フィブリンを可溶化してフィブリン分解生成物を生じる。正のフィードバック機構を通して、フィブリンは、ｔＰＡを介したプラスミノーゲン活性化を刺激することによって、それ自身の分解を亢進する（R.J. Stewart et al., The Journal of Biological Chemistry 275 (2000) pp.10112-10120）。ｈｔＰＡは、異なったタイプの組織に存在する線維素溶解の生理的アクチベーターである。それは約６８ｋＤの分子量を有する糖タンパク質である。ネイティブ型の場合、ｔＰＡは単鎖型（一本鎖組織型プラスミノーゲンアクチベーター、ｓｃｔＰＡ）として存在し、それはペプチド結合Ａｒｇ２７５−Ｉｌｅ２７６でのプラスミンの開裂によって、二本鎖構造（二本鎖組織型プラスミノーゲンアクチベーター，ｔｃｔＰＡ）に変換されうる。線維素溶解の治療のため、それはｒｔＰＡ（組換え組織型プラスミノーゲンアクチベーター）として組換え生産される。異なるタイプのｔＰＡが存在し、それは糖鎖構造において構造的相違を示す。Ｉ型ｔＰＡは、アミノ酸Ａｓｎ１１７、Ａｓｎ１８４およびＡｓｎ４４８にＮ結合型オリゴ糖を有する。ＩＩ型ｔＰＡは、Ａｓｎ１１７およびＡｓｎ４４８でグリコシル化される。どちらの型も、Ｔｈｒ６１にＯ結合型フコース残基を含む（K. Mori et al., The Journal of Biological Chemistry 270 (1995) pp.3261-3267）。ｔＰＡのインビボクリアランスが、糖鎖構造、特にＡｓｎ１１７の部位に結合した高マンノースオリゴ糖によって影響を受けることが、いくつかの結果によって示される。提案された別のクリアランス機構には、肝細胞上の高親和性受容体によるＴｈｒ６１でのＯ結合型フコース残基の認識が関与する。ＴＮＫ−ｔｐＡは、テネクテプラーゼ（登録商標）（Boehringer Ingelheim）として市販されており、単回静脈内ボーラスとして投与されうるが、ｔＰＡは、ボーラスに続いて注入によって投与されなければならない。

活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）は、重症敗血症関連の凝固および炎症のモジュレーターである。活性化タンパク質Ｃは、トロンボモジュリンに結合したトロンビンによってその不活性前駆体（タンパク質Ｃ）から変換される。この複合体は、タンパク質Ｃの重鎖から短いＮ末端活性化ペプチドを切り落として、活性化タンパク質Ｃをもたらす。ドロトレコギン・アルファ(Drotrecogin alpha)（活性型）は、血漿由来の活性化タンパク質Ｃと同一のアミノ酸配列を有し、類似する特性を有する、組換えヒト活性化タンパク質Ｃ（ｒｈＡＰＣ）である。活性化タンパク質Ｃは、Eli Lillyによりザイグリス(Xigris)（登録商標）として市販されている。それは、タンパク質Ｃ発現ベクターが導入されたヒト細胞株（ＨＥＫ２９３）で生産される。この特定の細胞株が用いられたのは、機能活性に必要な、正しい一連の複合体翻訳後修飾を行う能力のためである。組換えヒト活性化タンパク質Ｃは、４つのＮ−グリコシル化部位と１２個のジスルフィド結合を含む二本鎖糖タンパク質である。重鎖は２５０アミノ酸を含み、そのうち７残基がシステインであり、それは３つのＮ結合型グリコシル化部位を有する（Ａｓｎ−２４８、Ａｓｎ−３１３およびＡｓｎ−３２９）。７個のシステイン残基は、重鎖内で３つのジスルフィド結合を形成し、鎖間に一つのジスルフィド結合を形成する。軽鎖は、一つのＮ結合型グリコシル化部位（Ａｓｎ−９７）および１７個のシステイン残基を含み、それは軽鎖内に８個のジスルフィド結合を形成し、重鎖に対して一つのジスルフィド結合を形成する。活性化タンパク質Ｃは、セリンプロテアーゼファミリーに属するプロテアーゼであり、凝固の制御に主要な役割を果たす。活性化タンパク質Ｃの抗血栓機能の基礎は、そのトロンビン機能を阻害する能力である。また、活性化タンパク質Ｃは、重症敗血症関連の炎症の重要なモジュレーターである。その短い生理的半減期および薬物動態学的半減期のため、活性化タンパク質Ｃは、敗血症治療において臨床に使用する場合、ある速度で連続的に注入されて、望ましい血漿濃度を維持する。活性化タンパク質Ｃの薬物動態学的プロファイルを改善するために、いくつかの努力がなされている。例えばD.T.Berg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 (2003) pp.4423-4428には、延長された血漿半減期を有する、活性化タンパク質Ｃの改変された変異体が記載されている。

グリコシル化タンパク質として、ＩＦＮベータのグリコシル化型（例えば天然ヒトＩＦＮベータまたはＩＦＮベータ１ａ）、Ｎ−グリカンとＯ−グリカンの両方を含有する天然または真核細胞由来ｈＧＭ−ＣＳＦ、４個のＮ−グリコシル化部位を含む２本鎖糖タンパク質である組換えヒト活性化タンパク質Ｃ（ｒｈＡＰＣ）、ヒトｔＰＡ（ｈｔＰＡ）または組換えヒトｔＰＡ（ｒｈｔＰＡ）（例えばアミノ酸Ａｓｎ１１７、Ａｓｎ１８４およびＡｓｎ４４８でＮ結合型オリゴ糖を有するＩ型ｔＰＡあるいはＡｓｎ１１７およびＡｓｎ４４８でグリコシル化されているＩＩ型ｔＰＡ、血漿由来Ａ１ＡＴまたは組換えヒトＡ１ＡＴ（ｐｄＡ１ＡＴまたはｒｈＡ１ＡＴ）、組換えヒトＡＴＩＩＩ（ｒｈＡＴＩＩＩ）、エリスロポエチン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子並びに第ＩＸ因子が好ましい。ＥＰＯ、ＩＦＮベータ、ＡＴＩＩＩおよびＧＭ−ＣＳＦのグリコシル化型が特に好ましい。本発明はまた、本発明の方法によって得られる共役複合体にも関する。

本発明の文脈において、用語「ヒドロキシアルキルデンプン」（ＨＡＳ）とは、少なくとも一つのヒドロキシアルキル基によって置換されているデンプン誘導体をいう。本発明の好ましいヒドロキシアルキルデンプンは、式（Ｉ）：

（I）
［式中、デンプン分子の還元末端は非酸化型で示され、末端糖単位はアセタール型で示され、それは例えば溶媒に依存し、アルデヒド型との平衡状態にありうる］
の構造を有する。

本発明で用いられる用語ヒドロキシアルキルデンプンは、式（Ｉ）に簡潔に描いたような、末端糖部位がヒドロキシアルキル基Ｒ_１、Ｒ_２、および／またはＲ_３を含む化合物に限らないが、それはまた、末端糖部位中および／または該デンプン分子の残りの部分ＨＡＳ’中のどこかに存在する少なくとも一つのヒドロキシ基が、ヒドロキシアルキル基Ｒ_１、Ｒ_２、またはＲ_３で置換されている化合物も指す。二つ以上の異なるヒドロキシアルキル基を含むヒドロキシアルキルデンプンもまたありうる。

ＨＡＳに含まれる少なくとも一つのヒドロキシアルキル基には、二つ以上のヒドロキシ基が含まれうる。好ましい態様によれば、ＨＡＳに含まれる少なくとも一つのヒドロキシアルキル基には、一つのヒドロキシ基が含まれる。表現「ヒドロキシアルキルデンプン」にはまた、アルキル基が一置換または多置換される誘導体も含まれる。この文脈において、該アルキル基がハロゲン、特にフッ素で置換されるか、またはアリール基で置換されるのが好ましい。さらに、ヒドロキシアルキル基の末端ヒドロキシ基は、エステル化またはエーテル化されうる。さらに、アルキルの代わりに、直鎖または分岐鎖の置換または無置換アルケン基もまた使用されうる。

ヒドロキシアルキルデンプンはデンプンのエーテル誘導体である。前記エーテル誘導体の他に、他のデンプン誘導体もまた、本発明の文脈において用いられうる。例えばエステル化されたヒドロキシ基を含む誘導体は有用である。これらの誘導体は、例えば２〜１２個の炭素原子を有する無置換モノカルボン酸の誘導体または無置換ジカルボン酸の誘導体あるいはその置換誘導体の誘導体でありうる。特に有用なのは、２〜６個の炭素原子を有する無置換モノカルボン酸の誘導体、特に酢酸の誘導体である。この文脈において、アセチルデンプン、ブチリルデンプンおよびプロピオニルデンプンが好ましい。さらに、２〜６個の炭素原子を有する無置換ジカルボン酸の誘導体が好ましい。

ジカルボン酸の誘導体の場合、ジカルボン酸の第二のカルボキシ基もまたエステル化されることが有益である。さらに、本発明の文脈において、ジカルボン酸のモノアルキルエステルの誘導体もまた適当である。置換モノカルボン酸または置換ジカルボン酸について、置換基は、好ましくは置換アルキル残基について上述のものと同じでありうる。デンプンのエステル化のための技術は、当該技術分野で公知である（例えば、Klemm D. et al., Comprehensive Cellulose Chemistry Vol. 2, 1998, Whiley-VCH, Weinheim, New York, 特に4.4章, Esterification of Cellulose (ISBN 3-527-29489-9)を参照）。

本発明の好ましい態様によれば、式（Ｉ）のヒドロキシアルキルデンプンが用いられる。式（Ｉ）において、明示的に記載された糖環と、ＨＡＳ’と表示された残基を合わせて、好ましいヒドロキシアルキルデンプン分子を表す。ＨＡＳ’に含まれる他の糖環構造は、明示的に記載された糖環と同じであってもよいし、異なっていてもよい。

式（Ｉ）の残基Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３に関する限り、特に制約はない。好ましい態様によれば、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は独立して、水素、あるいはそれぞれのアルキル残基中に２〜１０個の炭素原子を有するヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基またはヒドロキシアルカリル基、あるいは−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｈ基［式中、ｎは整数、好ましくは１、２、３、４、５または６である］である。水素および２〜１０個を有するヒドロキシアルキル基が好ましい。より好ましくは、ヒドロキシアルキル基は２〜６個の炭素原子、より好ましくは２〜４個の炭素原子、より一層好ましくは２〜４個の炭素原子を有する。好ましい態様において、式（Ｉ）のＲ_１、Ｒ_２およびＲ_３はすべて、同じ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｈ基［式中、ｎは整数、好ましくは１、２または３である］である。したがって、「ヒドロキシアルキルデンプン」には、好ましくは、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプンおよびヒドロキシブチルデンプンが含まれ、その中でヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンが特に好ましく、ヒドロキシエチルデンプンが最も好ましい。

アルキル、アリール、アラルキルおよび／またはアルカリル基は、直鎖または分枝鎖であり、適宜適当に置換されうる。したがって、本発明はまた、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３が独立して、水素または１〜６個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖のヒドロキシアルキル基である、上述の方法にも関する。したがって、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は、好ましくは、ヒドロキシヘキシル、ヒドロキシペンチル、ヒドロキシブチル、ヒドロキシプロピル（例えば２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシイソプロピル）、ヒドロキシエチル（例えば２−ヒドロキシエチル）、水素でありうるが、２−ヒドロキシエチル基は特に好ましい。

したがって、本発明はまた、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３が独立して、水素または２−ヒドロキシエチル基である、上記の方法および共役複合体にも関し、少なくとも一つの残基Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３が２−ヒドロキシエチルである態様は特に好ましい。ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）は、本発明のすべての態様にとって最も好ましい。したがって本発明は、ポリマーがヒドロキシエチルデンプンであり、ポリマー誘導体がヒドロキシエチルデンプン誘導体である、上記の方法および共役複合体に関する。

ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）は天然に生じたアミロペクチンの誘導体であり、体内でアルファ−アミラーゼによって分解される。ＨＥＳは、コーンスターチ中に９５重量％までの濃度で存在する、糖ポリマーアミロペクチンの置換誘導体である。ＨＥＳは有利な生物学的性質を示し、血液用補液剤(blood volume replacement agent)として診療所における血液希釈療法に用いられる（Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278；およびWeidler et al., 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498）。

アミロペクチンは、主鎖にアルファ−１，４−グリコシド結合が存在し、分枝部位にはアルファ−１，６−グリコシド結合が見られるグルコース部分からなる。この分子の物理化学的性質は、主にグリコシド結合のタイプによって決定される。ニックが入ったアルファ−１，４−グリコシド結合のため、１回転あたり約６個のグルコースモノマーを有するへリックス構造が生成される。ポリマーの物理化学的性質並びに生化学的性質は、置換によって修飾されうる。ヒドロキシエチル基の導入は、アルカリヒドロキシエチル化によって達成されうる。反応条件を適合させることにより、ヒドロキシエチル化に関して無置換グルコースモノマー中の各ヒドロキシ基の異なる反応性を利用することができる。この事実のおかげで、当業者は限られた程度で置換パターンに影響を及ぼすことができる。

ＨＥＳは、主に分子量分布および置換度によって特徴付けられる。置換度を記載する方法は二つ考えられる：
１．置換度は、全グルコース部分に関して置換グルコースモノマーの割合に対して記載されうる。
２．置換度は、１グルコース部分あたりのヒドロキシエチル基の数が記述される、モル置換として記載されうる。本発明の文脈中、ＤＳと表示される置換度は、上記のモル置換に関する（上記で引用されたSommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278（特にp. 273）もまた参照）。ＨＥＳ溶液は、各分子が、重合度、分枝部位の数およびパターン、並びに置換パターンに関して他の分子と異なっている、多分散組成物として存在している。したがって、ＨＥＳは異なる分子量を有する化合物の混合物である。その結果として、特定のＨＥＳ溶液は、統計的手段を活用して平均分子量によって決定される。この文脈において、Ｍ_ｎは、分子数に依存する算術平均として計算される。あるいは、加重平均Ｍ_Ｗ（またはＭＷ）は、ＨＥＳの質量に依存する単位を表す。

本発明の文脈において、ヒドロキシエチルデンプンは、好ましくは、１〜３００ｋＤの平均分子量（加重平均）を有しうる。ヒドロキシエチルデンプンは、さらに０．１〜０．８の好ましいモル置換度、およびヒドロキシエチル基に関して２〜２０の範囲の好ましいＣ_２：Ｃ_６置換比を示しうる。

本発明の文脈において用いられる用語「平均分子量」は、Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278; およびWeidler et al., 1991, Arzneim.-Forschung/ Drug Res., 41, 494-498に記載されているＬＡＬＬＳ（低角レーザー光散乱）−ＧＰＣ法に従って決定される重量に関する。１０ｋＤ以下の平均分子量については、さらに、ＬＡＬＬＳ−ＧＰＣによって予め検定された標準とともに較正を行った。

本発明の好ましい態様によれば、用いられるヒドロキシエチルデンプンの平均分子量は、１〜３００ｋＤ、好ましくは２〜２００ｋＤ、より好ましくは３〜１３０ｋＤ、より好ましくは４〜１００ｋＤ、最も好ましくは４〜９０ｋＤである。約１３０ｋＤの平均分子量を有するＨＥＳの例は、０．２〜０．８（例えば０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、または０．８）の置換度、好ましくは０．４〜０．７（例えば０．４、０．５、０．６、または０．７）の置換度を有するＨＥＳである。

約１３０ｋＤの平均分子量を有するＨＥＳの例は、フレゼニウスのボルベン(Voluven)（登録商標）である。ボルベン(Voluven)（登録商標）は、例えば、血液量減少の治療および予防のための治療指標に補液として用いられる人工コロイドである。ボルベン(Voluven)（登録商標）の特徴は、平均分子量１３０，０００＋／−２０，０００Ｄ、モル置換０．４、およびＣ２：Ｃ６比約９：１である。

したがって、本発明はまた、ヒドロキシアルキルデンプンが、４〜１００ｋＤ、好ましくは４〜９０ｋＤ、より好ましくは４〜７０ｋＤの平均分子量を有するヒドロキシエチルデンプンである、上記の方法および共役複合体にも関する。好ましい平均分子量の範囲は、例えば、４〜９０ｋＤまたは１０〜９０ｋＤまたは１２〜９０ｋＤまたは１８〜９０ｋＤまたは５０〜９０ｋＤまたは７０〜９０ｋＤまたは４〜７０ｋＤまたは１０〜７０ｋＤまたは１２〜７０ｋＤまたは１８〜７０ｋＤまたは５０〜７０ｋＤまたは４〜５０ｋＤまたは１０〜５０ｋＤまたは１２〜５０ｋＤまたは１８〜５０ｋＤまたは４〜１８ｋＤまたは１０〜１８ｋＤまたは１２〜１８ｋＤまたは４〜１２ｋＤまたは１０〜１２ｋＤまたは４〜１０ｋＤである。

本発明の特に好ましい態様によれば、用いられるヒドロキシエチルデンプンの平均分子量は、４ｋＤ超〜９０ｋＤ未満の範囲、例えば約１０ｋＤ、または９〜１０ｋＤもしくは１０〜１１ｋＤもしくは９〜１１ｋＤの範囲、または約１２ｋＤ、または１１〜１２ｋＤもしくは１２〜１３ｋＤもしくは１１〜１３ｋＤの範囲、または約１８ｋＤ、または１７〜１８ｋＤもしくは１８〜１９ｋＤもしくは１７〜１９ｋＤの範囲、または約３０ｋＤ、または２９〜３０の範囲、または３０〜３１ｋＤ、または約５０ｋＤ、または４９〜５０ｋＤもしくは５０〜５１ｋＤもしくは４９〜５１ｋＤの範囲にある。

置換度（ＤＳ）に関する限り、ＤＳは、好ましくは少なくとも０．１、より好ましくは少なくとも０．２、より好ましくは少なくとも０．４である。ＤＳの好ましい範囲は、０．１〜３、より好ましくは０．２〜１．５、より好ましくは０．３〜１．０、より好ましくは０．２〜０．８、より好ましくは０．３〜０．８、より一層好ましくは０．４〜０．８、さらに一層好ましくは０．１〜０．７、より好ましくは０．２〜０．７、より好ましくは０．３〜０．７、より好ましくは０．４〜０．７である。ＤＳの特に好ましい値は、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８、with ０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８がより好ましく、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８がより一層好ましく、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８がさらに一層好ましく、例えば０．４および０．７が特に好ましい。

モル置換度（ＤＳ）の上限に関しては、３．０までの値、例えば０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または２．０もまたありうるが、２．０未満の値が好ましく、１．５未満の値がより好ましく、１．０未満の値、例えば０．７、０．８または０．９がより一層好ましい。

したがって、モル置換度の好ましい範囲は、０．１〜２または０．１〜１．５または０．１〜１．０または０．１〜０．９または０．１〜０．８である。モル置換度のより好ましい範囲は、０．２〜２または０．２〜１．５または０．２〜１．０または０．２〜０．９または０．２〜０．８である。モル置換度のより一層好ましい範囲は、０．３〜２または０．３〜１．５または０．３〜１．０または０．３〜０．９または０．３〜０．８である。モル置換度のさらに一層好ましい範囲は、０．４〜２または０．４〜１．５または０．４〜１．０または０．４〜０．９または０．４〜０．８である。

本発明の文脈において、モル置換度の所定の値、例えば０．８は正確な値、または０．７５から０．８４の範囲にあると理解されうる。したがって、例えば、所定の値０．１は、０．１の正確な値、または０．０５から０．１４の範囲にあり、所定の値０．４は、０．４の正確な値、または０．３５から０．４４の範囲にあり、あるいは所定の値０．７は、０．７の正確な値、または０．６５から０．７４の範囲にある。

ヒドロキシアルキルデンプン、好ましくはヒドロキシエチルデンプンの分子量、およびその置換度ＤＳの特に好ましい組合せは、例えば、１０ｋＤおよび０．４あるいは１０ｋＤおよび０．７あるいは１２ｋＤおよび０．４あるいは１２ｋＤおよび０．７あるいは１８ｋＤおよび０．４あるいは１８ｋＤおよび０．７あるいは３０ｋＤおよび０．４あるいは３０ｋＤおよび０．７,あるいは５０ｋＤおよび０．４あるいは５０ｋＤおよび０．７あるいは１００ｋＤおよび０．７である。

Ｃ_２：Ｃ_６置換比に関する限り、前記置換は、好ましくは２から２０の範囲、より好ましくは２から１５の範囲、およびより一層好ましくは３から１２の範囲にある。

本発明のさらなる態様によれば、異なる平均分子量および／または異なる置換度および／または異なるＣ_２：Ｃ_６置換比を有するヒドロキシエチルデンプンの混合物もまた用いられうる。したがって、異なる平均分子量および異なる置換度および異なるＣ_２：Ｃ_６置換比を有し、あるいは異なる平均分子量および異なる置換度および同じもしくはほぼ同じＣ_２：Ｃ_６置換比を有し、あるいは異なる平均分子量および同じもしくはほぼ同じ置換度および異なるＣ_２：Ｃ_６置換比を有し、あるいは同じもしくはほぼ同じ平均分子量および異なる置換度および異なるＣ_２：Ｃ_６置換比を有し、あるいは異なる平均分子量および同じもしくはほぼ同じ置換度および同じもしくはほぼ同じＣ_２：Ｃ_６置換比を有し、あるいは同じもしくはほぼ同じ平均分子量および異なる置換度および同じもしくはほぼ同じＣ_２：Ｃ_６置換を有し、あるいは同じもしくはほぼ同じ平均分子量および同じもしくはほぼ同じ置換度および異なるＣ_２：Ｃ_６置換比を有し、あるいはほぼ同じ平均分子量およびほぼ同じ置換度およびほぼ同じＣ_２：Ｃ_６置換比を有する、ヒドロキシエチルデンプンの混合物が用いられうる。

本発明の異なる共役複合体および／または異なる方法において、異なるヒドロキシアルキルデンプン、好ましくは異なるヒドロキシエチルデンプンおよび／または異なるヒドロキシアルキルデンプン混合物、好ましくは異なるヒドロキシエチルデンプン混合物が用いられうる。さらに一層好ましい態様において、官能基Ａを含むポリマーまたはポリマー誘導体は、上記の共役複合体の製造方法の段階ａ）の間に糖タンパク質中に導入された修飾ポリオールに結合する。

真核細胞において生成され、そのため翻訳後にグリコシル化されているタンパク質のオリゴ糖パターンは、ヒト由来のタンパク質と同一ではない。さらに、多くのグリコシル化タンパク質は、さらなる糖部位（例えばガラクトース残基）をマスクする、望ましい数の末端シアル酸残基を有していない。しかしながら、これらのさらなる糖部位（例えばガラクトース残基）がマスクされなければ、不利益（例えば、薬物としてのタンパク質の活用可能性において、タンパク質の血漿中の半減期が短くなること）の原因となりうる。驚くべきことに、本発明の温和な方法によって、タンパク質の糖側鎖の糖部位に直接的または少なくとも一つのリンカー化合物（例えば一つもしくは二つのリンカー化合物）を通して共有結合したヒドロキシアルキルデンプンポリマー、好ましくはヒドロキシエチルデンプンポリマーによって形成されるタンパク質共役複合体を提供することによって、少なくとも上述の不利益を克服しうることが分かった。それゆえ、ヒドロキシアルキルデンプンポリマーまたはその誘導体、好ましくはヒドロキシエチルデンプンポリマーまたはその誘導体を、修飾ポリオールを通してグリコシル化タンパク質の少なくとも一つの糖側鎖とカップリングさせることによって、糖側鎖に位置する適当な末端糖残基の欠如が補償されると考えられる。本発明の別の態様によれば、上記の酸化された糖部位とカップリングしたヒドロキシアルキルデンプンポリマーまたはその誘導体、好ましくはヒドロキシエチルデンプンポリマーまたはその誘導体を有する各共役複合体を提供することによって、該不利益を補償するだけではなく、目的の使用分野において、それぞれの天然に生じたタンパク質よりも優れた特徴を有するタンパク質共役複合体が提供される。したがって、本発明の各共役複合体は、タンパク質において補償効果および相乗効果までも有する。ヒトのタンパク質と一致するか、またはヒトのタンパク質であるタンパク質でさえもまた、天然に生じた糖部位で、望ましい数の適当なマスキング末端糖残基（例えばシアル酸残基）を有していないということも起こりうる。このような場合、上記の酵素的に導入した修飾ポリオールとカップリングしたヒドロキシアルキルデンプンポリマーまたはその誘導体、好ましくはヒドロキシエチルデンプンポリマーまたはその誘導体を有する各共役複合体を提供することによって、人工的に生成されたタンパク質の不利益が克服および補償されるだけでなく、天然に生じたタンパク質の特徴が改善される。導入された修飾ポリオールとカップリングしたヒドロキシアルキルデンプン、好ましくはヒドロキシエチルデンプン、またはその誘導体の官能基については、以下に開示される官能基Ａへの引用がなされる。この一般的な概念は、グリコシル化Ｇ−ＣＳＦに適用できるだけでなく、主として末端糖残基の前記欠如を有するすべてのグリコシル化にも適用できる。とりわけ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、ｔＰＡ、Ａ１ＡＴ、ＡＴＩＩＩ、ＨＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、抗体融合タンパク質、治療抗体、インターロイキン、特にインターロイキン２もしくはインターロイキン６、ＩＦＮ−α、ＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、および第ＩＸ因子が挙げられる。

したがって、本発明はまた、ヒドロキシアルキルデンプン、好ましくはヒドロキシエチルデンプン、またはその誘導体を、糖タンパク質に酵素的に結合した少なくとも一つの修飾ポリオールと共有結合的にカップリングさせることによって、天然に生じるか、または翻訳後に結合したタンパク質の糖部位において、末端糖残基、好ましくはシアル酸残基の欠如を補うための、該デンプンまたはその誘導体の使用にも関する。

したがって、本発明はまた、ヒドロキシアルキルデンプン、好ましくはヒドロキシエチルデンプン、またはその誘導体を、糖タンパク質に酵素的に結合した少なくとも一つの修飾ポリオールと共有結合的にカップリングさせることによって、天然に生じるか、または翻訳後に結合したタンパク質の糖部位において、末端糖残基、好ましくはシアル酸残基の欠如を補う方法にも関する。

さらに、本発明はまた、糖タンパク質が、天然源から単離されるか、または真核細胞（例えば哺乳類、昆虫または酵母細胞）における発現によって生成され、前記糖タンパク質に酵素的に結合した修飾ポリオールが少なくとも一つの官能基Ｚを有し、その中で共役複合体が、目的の使用分野、好ましくは薬物の使用分野において、それぞれの修飾されていないタンパク質と同じかまたはそれより優れた特徴を有する、ヒドロキシアルキルデンプン、好ましくはヒドロキシエチルデンプン、またはその誘導体の、糖タンパク質に酵素的に結合した少なくとも一つの前記修飾ポリオールへの共有結合によって形成される共役複合体にも関する。

本発明の一つの態様によれば、修飾ポリオールの官能基Ｚは、アルデヒド基、ヘミアセタール基またはケト基である。したがって、本発明は、修飾ポリオールの官能基Ｚが、アルデヒド基、ヘミアセタール基またはケト基である、上記の方法および共役複合体に関する。

修飾ポリオールの官能基Ｚが、アルデヒド基、ヘミアセタール基またはケト基である場合、ポリマーまたはその誘導体の官能基Ａには、構造−ＮＨ−のアミノ基が含まれる。

したがって、本発明はまた、適宜酸化されたポリマーの還元末端と反応することができる官能基Ａが構造−ＮＨ−のアミノ基を含む、上記の方法および共役複合体にも関する。

本発明の一つの好ましい態様によれば、この官能基Ａは、構造Ｒ’−ＮＨ−を有する化学基であって、Ｒ’は水素であるか、あるいはアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリルまたはシクロアルキルアリール残基であり、該シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリルまたはシクロアルキルアリール残基は、ＮＨ基に直接結合していてもよく、あるいは別の態様によれば、酸素架橋によってＮＨ基に結合していてもよい。アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリル、またはシクロアルキルアリール残基は、適当に置換されていてもよい。好ましい置換基として、ハロゲン（例えばＦ、ＣｌまたはＢｒ）を挙げることができる。特に好ましい残基Ｒ’は、水素、アルキルおよびアルコキシ基であり、より一層好ましいのは、水素並びに無置換アルキル基および無置換アルコキシ基である。

アルキル基およびアルコキシ基の中では、１、２、３、４、５、または６個のＣ原子を有する基が好ましい。より好ましいのは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、およびイソプロポキシ基である。特に好ましいのは、メチル、エチル、メトキシ、エトキシであり、メチルまたはメトキシはとりわけ好ましい。したがって、本発明はまた、Ｒ’が水素あるいはメチル基またはメトキシ基である、上記の方法および共役複合体にも関する。

本発明の別の好ましい態様によれば、官能基Ａは構造Ｒ’−ＮＨ−Ｒ”−を有し、ここでＲ”には、好ましくは構造単位−ＮＨ−および／または構造単位−（Ｃ＝Ｇ）−［式中、ＧはＯまたはＳである］、および／または構造単位−ＳＯ_２−が含まれる。より好ましい態様によれば、該官能基Ｒ”は、

［Ｇが二つ存在する場合、それは独立してＯまたはＳである］
からなる群から選択される。したがって、アミノ基−ＮＨ_２を含む好ましい官能基Ａは、例えば、

［式中、ＧはＯまたはＳであり（二つ存在する場合は、独立してＯまたはＳである）、Ｒ’はメチルである］
である。

アミノ基を含む特に好ましい官能基Ａは、アミノオキシ基

（Ｈ_２Ｎ−Ｏ−が特に好ましい）、およびヒドラジド基

［式中、Ｇは、好ましくはＯである］
である。

したがって、本発明はまた、修飾ポリオールの官能基Ｚが、アルデヒド基、ヘミアセタール基またはケト基であって、官能基Ａが、アミノオキシ基またはヒドラジド基である、上記の方法にも関する。本発明の特に好ましい態様によれば、Ａはアミノオキシ基である。

したがって、本発明はまた、修飾ポリオールの官能基Ｚが、アルデヒド基またはケト基であって、官能基Ａが、アミノオキシ基またはヒドラジド基である、上記の共役複合体にも関する。本発明の特に好ましい態様によれば、Ａはアミノオキシ基である。

ポリマーまたはポリマー誘導体のアミノオキシ基を、段階ａ）の間に糖タンパク質上へ移されている修飾ポリオールのアルデヒド基またはケト基と反応させる場合、オキシム結合が形成される。

したがって、本発明はまた、修飾ポリオールとポリマーまたはポリマー誘導体の間の共有結合が、該修飾ポリオールの官能基Ｚ（前記官能基Ｚは、アルデヒド基、ヘミアセタール基またはケト基である）と、該ポリマーまたはポリマー誘導体の官能基Ａ（前記官能基Ａはアミノオキシ基である）との反応によって形成されるオキシム結合である、上記の共役複合体にも関する。ポリマーまたはポリマー誘導体のヒドラジド基を、修飾ポリオールのアルデヒド基またはケト基と反応させる場合、ヒドラゾン結合が形成される。

したがって、本発明はまた、修飾ポリオールとポリマーまたはポリマー誘導体の間の共有結合が、該修飾ポリオールの官能基Ｚ（前記官能基Ｚは、アルデヒド基、ヘミアセタール基またはケト基である）と、該ポリマーまたはポリマー誘導体の官能基Ａ（前記官能基Ａはヒドラジド基である）との反応によって形成されるヒドラゾン結合である、上記の共役複合体にも関する。ポリマー中に官能基Ａを導入するために、ポリマー誘導体が官能基Ａを含む結果となるのであれば、特に制限は存在しない。

本発明の好ましい態様によれば、官能基Ａは、ポリマーを少なくとも二官能性の化合物と反応させることによって該ポリマー中に導入され、その一方の官能基は該ポリマーの少なくとも一つの官能基と反応することができ、少なくとも二官能性の化合物の他方の官能基の少なくとも一つは官能基Ａであるか、または官能基Ａが得られるように化学修飾されうる。より一層好ましい態様によれば、ポリマーは、その適宜酸化された還元末端で、少なくとも二官能性の化合物と反応する。

ポリマーがその酸化されていない還元末端で反応する場合、該ポリマーは、好ましくは構造：

（I）
［式中、式（Ｉ）において、酸化されていない還元末端のアルデヒド型が含まれる］
を有する。ポリマーがその酸化された還元末端で反応する場合、該ポリマーは、好ましくは式（ＩＩａ）：

（IIa）
および／または、式（ＩＩｂ）

（IIb）
の構造を有する。

ポリマー、好ましくはヒドロキシエチルデンプンの還元末端の酸化は、上述の構造（ＩＩａ）および／または（ＩＩｂ）を有する化合物をもたらす各方法または方法の組合せに従って実行されうる。

酸化は、ヒドロキシアルキルデンプンの酸化された還元末端をもたらすすべての適当な方法に従って実行されうるが、それは好ましくは、例えばDE 196 28 705 A1（そのそれぞれの内容（実施例Ａ、第９欄、６〜２４行）は、本明細書に引用される）に記載されているように、アルカリ性ヨウ素溶液を用いて実行される。

ポリマーの適宜酸化された還元末端と反応することができる少なくとも二官能性の化合物の官能基として、ヒドロキシアルキルデンプンの適宜酸化された還元末端と化学結合を形成することができる各官能基が用いられうる。

本発明の好ましい態様によれば、この官能基には、化学構造−ＮＨ−が含まれる。

したがって、本発明はまた、少なくとも二官能性の化合物の官能基（前記官能基は、ポリマーの適宜酸化された還元末端と反応することができる）に構造−ＮＨ−が含まれる、上記の方法および共役複合体にも関する。

本発明の一つの好ましい態様によれば、少なくとも二官能性の化合物のこの官能基は、構造Ｒ’−ＮＨ−を有する化学基であって、Ｒ’は水素であるか、あるいはアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリルまたはシクロアルキルアリール残基であり、該シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリルまたはシクロアルキルアリール残基は、ＮＨ基に直接結合していてもよく、あるいは別の態様によれば、酸素架橋によってＮＨ基に結合していてもよい。アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリル、またはシクロアルキルアリール残基は、適当に置換されていてもよい。好ましい置換基として、ハロゲン（例えばＦ、ＣｌまたはＢｒ）を挙げることができる。特に好ましい残基Ｒ’は、水素、アルキルおよびアルコキシ基であり、より一層好ましいのは、水素並びに無置換アルキル基および無置換アルコキシ基である。

本発明の別の好ましい態様によれば、少なくとも二官能性の化合物の官能基は、構造Ｒ’−ＮＨ−Ｒ”−を有し、ここでＲ”には、好ましくは構造単位−ＮＨ−および／または構造単位−（Ｃ＝Ｇ）−［式中、ＧはＯまたはＳである］、および／または構造単位−ＳＯ_２−が含まれる。より好ましい態様によれば、該官能基Ｒ”は、

［Ｇが二つ存在する場合、それは独立してＯまたはＳである］
からなる群から選択される。

したがって、本発明はまた、少なくとも二官能性の化合物の官能基（前記官能基は、ポリマーの適宜酸化された還元末端と反応することができる）が、

［式中、ＧはＯまたはＳであり（二つ存在する場合は、独立してＯまたはＳである）、Ｒ’はメチルである］
からなる群から選択される、上記の方法および共役複合体にも関する。

本発明のより一層好ましい態様によれば、少なくとも二官能性の化合物の官能基（前記官能基は、ポリマーの適宜酸化された還元末端と反応することができ、アミノ基を含む）は、アミノオキシ基

（Ｈ_２Ｎ−Ｏ−が特に好ましい）、またはヒドラジド基

［式中、Ｇは好ましくはＯである］
である。

したがって、本発明はまた、修飾ポリオールの官能基Ｚが、アルデヒド基、ヘミアセタール基またはケト基であって、少なくとも二官能性の化合物の官能基（前記官能基は、ポリマーの適宜酸化された還元末端と反応することができる）が、アミノオキシ基またはヒドラジド基、好ましくはアミノオキシ基である、上記の方法および共役複合体にも関する。

したがって、本発明はまた、修飾ポリオールの官能基Ｚが、アルデヒド基、ヘミアセタール基またはケト基であって、少なくとも二官能性の化合物の官能基（前記官能基は、ポリマーの適宜酸化された還元末端と反応することができる）が、アミノオキシ基またはヒドラジド基、好ましくはアミノオキシ基である、上記の共役複合体にも関する。本発明のより一層好ましい態様によれば、少なくとも二官能性の化合物は、その酸化されていない還元末端でポリマーと反応する。

本発明のさらに別の好ましい態様によれば、ポリマーの適宜酸化された還元末端と反応する少なくとも二官能性の化合物には、官能基Ａが含まれる。少なくとも二官能性の化合物は、最初にポリマーと反応してポリマー誘導体を得、続いてタンパク質と官能基Ａを通して反応しうる。少なくとも二官能性の化合物を、官能基Ａを通して最初に修飾ポリオールと反応させて修飾糖タンパク質誘導体を得、続いて該タンパク質誘導体に含まれる少なくとも二官能性の化合物の残基の少なくとも一つの官能基を通して、ポリマーと反応させることもまた可能である。

本発明の好ましい態様によれば、少なくとも二官能性の化合物は、最初にポリマーと反応する。したがって、本発明は、Ａを含むポリマー誘導体とＺを含む修飾ポリオールの反応の前に、該ポリマーを、その酸化されていない還元末端で、ポリマーの酸化されていない還元末端およびＡ基と反応させることができる官能基を含む少なくとも二官能性の結合化合物と反応させることをさらに特徴とする方法である、上記の方法および共役複合体に関する。

ポリマーと反応する少なくとも二官能性の結合化合物の官能基、および修飾ポリオールの官能基Ｚと反応する少なくとも二官能性の結合化合物の官能基Ａは、いずれの適当なスペーサーによっても分離されうる。とりわけ、該スペーサーは、適宜置換された、直鎖、分枝鎖および／または環状炭化水素残基でありうる。一般に、該炭化水素残基は、６０個まで、好ましくは４０個まで、より好ましくは２０個まで、より好ましくは１０個まで、より好ましくは６個まで、特に好ましくは４個までの炭素原子を有する。もしヘテロ原子が存在しているなら、該分離基には、一般に１個から２０個、好ましくは１個から８個、より好ましくは１個から６個、より好ましくは１個から４個、特に好ましくは１個から２個のヘテロ原子が含まれる。ヘテロ原子としては、Ｏが好まれる。該炭化水素残基には、例えば、５個から７個の炭素原子を有する適宜分枝したアルキル鎖またはアリール基もしくはシクロアルキル基が含まれ、あるいはアラルキル基、アルキル部位が直鎖および／または環状アルキル基でありうるアルカリル基でありうる。本発明のより一層好ましい態様によれば、該官能基は、４個の炭素原子を有する直鎖の炭化水素鎖によって分離される。本発明の別の好ましい態様によれば、該官能基は、４個の炭素原子および少なくとも一つ、好ましくは一つのヘテロ原子、特に好ましくは酸素原子を有する直鎖の炭化水素鎖によって分離される。

さらに好ましい態様によれば、少なくとも二官能性の結合化合物は、ホモ二官能性の結合化合物である。したがって、本発明はまた、少なくとも二官能性の結合化合物がホモ二官能性の化合物である、上記の共役複合体を生成する方法にも関する。

したがって、該結合化合物の上述の好ましい官能基に関して、前記のホモ二官能性の結合化合物には、好ましくは二つのアミノオキシ基Ｈ_２Ｎ−Ｏ−または二つのアミノオキシ基Ｒ’−Ｏ−ＮＨ−または二つのヒドラジド基Ｈ_２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｇ）−が含まれ、該アミノオキシ基Ｈ_２Ｎ−Ｏ−および該ヒドラジド基Ｈ_２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−は好ましく、アミノオキシ基Ｈ_２Ｎ−Ｏ−は特に好ましい。

二つのヒドラジド基Ｈ_２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−を含むすべての考えられるホモ二官能性の化合物の中で、二つのヒドラジド基が、６０個まで、好ましくは４０個まで、より好ましくは２０個まで、より好ましくは１０個まで、より好ましくは６個まで、特に好ましくは４個までの炭素原子を有する炭化水素残基によって分離される場合に、ヒドラジドが好ましい。より好ましくは、炭化水素残基は、１個から４個の炭素原子、例えば１、２、３、または４個の炭素原子を有する。最も好ましくは、該炭化水素残基は４個の炭素原子を有する。したがって、式：

のホモ二官能性の化合物が好まれる。

修飾ポリオールのアルデヒド基またはケト基が二つのヒドラジド基Ｈ_２Ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−を含む化合物と反応する上記の態様において、特に好ましいヒドロキシエチルデンプンは、例えば、約１０ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンである。例えば,約１０ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１８ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約５０ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約５０ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１２ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１２ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１８ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約３０ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約３０ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約５０ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約５０ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１００ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンもまた考えられる。平均分子量およびＤＳのこれらの組合せの各々について、約０．８のＤＳ値もまた好まれる。

本発明のより一層好ましい態様によれば、二官能性の結合化合物は、カルボヒドラジド

である。

タンパク質のアルデヒド基またはケト基がカルボヒドラジドと反応する上記の態様において、特に好ましいヒドロキシエチルデンプンは、例えば、約１０ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンである。例えば、約１０ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１８ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約５０ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約５０ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１２ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１２ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１８ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約３０ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約３０ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約５０ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約５０ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１００ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンもまた考えられる。平均分子量およびＤＳのこれらの組合せの各々について、約０．８のＤＳ値もまた好まれる。

上記のように、本発明はまた、少なくとも二官能性の結合化合物がホモ二官能性の化合物であって、二つのアミノオキシ基を含む、上記の方法および共役複合体にも関する。それゆえ、本発明はまた、少なくとも二官能性の結合化合物がホモ二官能性化合物であって、二つのアミノオキシ基Ｈ_２Ｎ−Ｏ−を含む、上記の方法および共役複合体にも関する。

上記のように、ポリマーは、好ましくは、二官能性の結合化合物と反応する前に酸化されていないその還元末端で反応する。したがって、二つのアミノオキシ基Ｈ_２Ｎ−Ｏ−を含む好ましいホモ二官能性化合物を該ポリマーと反応させることによって、オキシム結合を含むポリマー誘導体がもたらされる。

したがって、修飾ポリオールの官能基Ｚは、好ましくはポリマー誘導体のアミノオキシ基と反応するアルデヒド、ヘミアセタールまたはケト基なので、本発明はまた、共役複合体がポリマーおよび糖タンパク質を含み、その中で該ポリマーおよび該修飾ポリオールは、オキシムまたは環状アミナール結合によって結合化合物と各々共有結合する、上記の共役複合体にも関する。

二つのアミノオキシ基Ｈ_２Ｎ−Ｏ−を含むすべての考えられるホモ二官能性の化合物の中では、該二つのアミノオキシ基が、１から６０個、好ましくは１から４０個、より好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、より好ましくは１から６個、特に好ましくは１から４個の炭素原子を有する炭化水素残基によって分離されている二官能性の化合物が好ましい。より好ましくは、該炭化水素残基は、１から４個の炭素原子、例えば１、２、３、または４個の炭素原子を有する。最も好ましくは、該炭化水素残基は４個の炭素原子を有する。より一層好ましくは、該炭化水素残基は、少なくとも一つのヘテロ原子、より好ましくは一つのヘテロ原子、および最も好ましくは一つの酸素原子を有する。式：

の化合物Ｏ−［２−（２−アミノオキシエトキシ）−エチル］ヒドロキシルアミンが特に好ましい。

したがって、本発明は、共役複合体が式：

の構造を有し、ＨＡＳ’が好ましくはＨＥＳ’である、上記の共役複合体に関する。特に好ましいヒドロキシエチルデンプンは、例えば、約１０ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１０ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１２ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１２ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１８ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１８ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約３０ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約３０ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約５０ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約５０ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１００ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンである。平均分子量およびＤＳのこれらの組合せの各々について、約０．８のＤＳ値もまた好まれる。

修飾ポリオールのアルデヒド基またはケト基が、ポリマーまたはポリマー誘導体のヒドロキシルアミノ基と反応する上記の態様において、特に好ましいヒドロキシエチルデンプンは、例えば、約１０ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプン並びに約１０ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプン並びに約１８ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプン並びに約５０ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプン並びに約５０ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンである。例えば、約１２ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１２ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいはン約１８ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプあるいは約３０ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約３０ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約５０ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約５０ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１００ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンもまた可能である。平均分子量およびＤＳのこれらの組合せの各々について、約０．８のＤＳ値もまた好まれる。

糖タンパク質としては、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＦＮベータ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、ｔＰＡ、Ａ１ＡＴ、ＡＴＩＩＩ、ＨＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、ＩＬ−１５、抗体融合タンパク質、治療抗体、インターロイキン、特にインターロイキン２またはインターロイキン６、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、並びに第ＩＸ因子が好まれる。

その酸化されていない還元末端での、ポリマーと結合化合物との反応は、特に前記結合化合物が二つのアミノオキシ基Ｈ_２Ｎ−Ｏ−を含むホモ二官能性の結合化合物である場合、好ましくは水溶液系において行われる。

本発明の文脈において用いられる用語「水溶液系」とは、関与する溶媒の重量に基づき、少なくとも１０重量％から、好ましくは少なくとも５０重量％から、より好ましくは少なくとも８０重量％から、より一層好ましくは少なくとも９０重量％から、または１００重量％までの範囲の水を含有する溶媒または溶媒の混合物をいう。好ましい反応溶媒は水である。

別の態様によれば、ＨＡＳ、好ましくはＨＥＳが溶解できる少なくとも一つの他の溶媒が用いられうる。これらの溶媒の例は、例えば、ＤＭＦ、ジメチルアセトアミドまたはＤＭＳＯである。

反応の間適用される温度に関する限り、もし該反応によって目的のポリマー誘導体がもたらされるのであれば、とくに制限は存在しない。ポリマーが二つのアミノオキシ基Ｈ_２Ｎ−Ｏ−、好ましくはＯ−［２−（２−アミノオキシエトキシ）−エチル］ヒドロキシルアミンを含むホモ二官能性の結合化合物と反応する場合、温度は、好ましくは０から４５℃の範囲内、より好ましくは４から３７℃の範囲内、特に好ましくは１５から２５℃の範囲内である。

二つのアミノオキシ基Ｈ_２Ｎ−Ｏ−、好ましくはＯ−［２−（２−アミノオキシエトキシ）−エチル］ヒドロキシルアミンを含むホモ二官能性の結合化合物と、ポリマーとの反応についての反応温度は、特定のニーズに適合され、一般に１時間から７日間の範囲内、好ましくは１時間から３日間の範囲内、およびより好ましくは２時間から４８時間でありうる。

二つのアミノオキシ基Ｈ_２Ｎ−Ｏ−、好ましくはＯ−［２−（２−アミノオキシエトキシ）−エチル］ヒドロキシルアミンを含むホモ二官能性の結合化合物と、ポリマーとの反応についてのｐＨ値は、特定のニーズ、例えば反応物の化学的性質に適合されうる。ｐＨ値は、好ましくは４．５から６．５の範囲内である。上述の反応条件の具体例は、例えば、約２５℃の反応温度および約５．５のｐＨである。

反応混合物の適切なｐＨ値は、少なくとも一つの適当な緩衝液を加えることによって調整されうる。好ましい緩衝液のうち、酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液またはホウ酸緩衝液を挙げることができる。一旦、ポリマーおよびそれに結合した二官能性の結合化合物を含むポリマー誘導体が形成されると、それは少なくとも一つの適当な方法によって反応混合物から単離されうる。必要であれば、ポリマー誘導体を、少なくとも一つの適当な方法によって単離される前に沈殿させてもよい。

ポリマー誘導体をまず沈殿させる場合は、例えば反応混合物を、反応混合物中に存在する溶媒または溶媒混合物以外の少なくとも一つの溶媒または溶媒混合物と、適切な温度で接触させることができ、例えば、適当な体積／体積の比（例えば１／１ｖ／ｖ）におけるアセトン／エタノール混合物と、あるいは適当な温度（例えば−２０℃から５０℃または０℃から２５℃）でのイソプロパノールと接触させることができる。水溶媒、好ましくは水が溶媒として用いられる場合の本発明の特に好ましい態様によれば、反応混合物を、２−プロパノールの混合物と、好ましくは−２０から＋５０℃の範囲内、特に好ましくは０から２５℃の範囲内の温度で接触させる。

ポリマー誘導体の単離は、一段階以上を含みうる適当な過程によって行われうる。本発明の好ましい態様によれば、ポリマー誘導体をまず反応混合物、または反応混合物と例えば２−プロパノール水混合物との混合物から、適当な方法（例えば遠心分離または濾過）によって分離する。第２段階において、分離したポリマー誘導体は、さらなる処理、例えば透析、遠心濾過もしくは加圧濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ＭＰＬＣ、ゲル濾過および／または凍結乾燥のような後処理に付されうる。より一層好ましい態様によれば、最初に、分離したポリマー誘導体を（好ましくは水に対して）透析し、次いで、目的の生成物の仕様(specification)に応じて、反応生成物の溶媒含量が十分に低くなるまで凍結乾燥する。凍結乾燥は２０から３５℃、好ましくは２０から３０℃の温度で行われうる。凍結乾燥は２０から３５℃、好ましくは２０から３０℃の温度で行われうる。

したがって、単離したポリマー誘導体を、次いでさらに修飾ポリオールの官能基Ｚ（Ｚはアルデヒド基、ヘミアセタールまたはケト基である）と官能基Ａを通して反応させる。ポリマー誘導体と修飾ポリオールの間でオキシム結合が得られるように、Ａがアミノオキシ基Ｈ_２Ｎ−Ｏ−である特に好ましい場合において、反応を、好ましくは水溶媒（好ましくは水）中で、０から４０℃、より好ましくは１から２５℃、特に好ましくは１５から２５℃または１から１５℃の範囲内の好ましい温度で行う。反応溶媒のｐＨ値は、好ましくは４から１０の範囲内、より好ましくは５から９の範囲内、特に好ましくは５から７の範囲内である。反応時間は、好ましくは１から７２時間の範囲内、より好ましくは１から４８時間の範囲内、特に好ましくは４から２４時間の範囲内である。

共役複合体は、さらなる処理、例えば透析、遠心濾過もしくは加圧濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ＭＰＬＣ、ゲル濾過および／または凍結乾燥のような後処理に付されうる。

本発明は、ポリオールの官能基Ｚと官能基Ａが、式（Ｉ）：

（I）
［式中、Ｙは、ＯおよびＳからなる群から選択されるヘテロ原子］
の化学基によって結合され、チオエステル基：
−（Ｃ＝Ｙ）−Ｓ−Ｒ’
［Ｒ’は、水素、適宜適当に置換された、直鎖状、環状および／または分枝状アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、およびヘテロアラルキル基、好ましくはベンジルからなる群から選択される］
であるＺ基を、アルファ−Ｘベータ−アミノ基：

であるＺ基と反応させることを特徴とする、上記の方法に関する。

したがって、本発明の文脈に用いられる用語「アルファ−Ｘベータ−アミノ基」とは、Ｘが炭素原子に結合し、一級アミノ基が隣接する炭素原子に結合したエチレン基をいう。

上記の式（Ｉ）の化学部位において、−（Ｃ＝Ｙ）基は、チオエステル基−（Ｃ＝Ｙ）−Ｓ−Ｒ’から誘導され、ＨＮ−ＣＨ−ＣＨ_２−Ｘ基は、アルファ−Ｘベータ−アミノ基から誘導される。

本発明はまた、Ｚ基とＡ基の位置が逆であり、特に、本発明の方法の段階ａ）の間に糖タンパク質に導入された官能基がアミノ基を含む化学基であって、ポリマーまたはポリマー誘導体の反応基Ｚが、アルデヒド基、ヘミアセタール基またはケト基である、２０ページから３４ページに記載された態様にも関する。Ｚ基が、上記のヒドロキシルアミン、ヒドラジン、ヒドラジドまたはヒドラジド誘導体から選択されるのが特に好ましい。Ｚが、ヒドロキシルアミノ基またはヒドラジド基である場合において、段階ｂに用いられるポリマー（例えばＨＡＳ）は、段階ａ）から得られる糖タンパク質との共有結合を形成しうるためには、修飾されないことが必要である。

本発明の別の態様によれば、修飾ポリオールの官能基Ｚはアミノ基であり、糖タンパク質は、好ましくは、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＦＮベータ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、ｔＰＡ、Ａ１ＡＴ、ＡＴＩＩＩ、ＨＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、ＩＬ−１５、抗体融合タンパク質、治療抗体、インターロイキン、特にインターロイキン２またはインターロイキン６、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、並びに第ＩＸ因子からなる群から選択される。

したがって、本発明は、タンパク質の官能基Ｚがアミノ基であって、該タンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＦＮベータ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、ｔＰＡ、Ａ１ＡＴ、ＡＴＩＩＩ、ＨＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、ＩＬ−１５、抗体融合タンパク質、治療抗体、インターロイキン、特にインターロイキン２またはインターロイキン６、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、並びに第ＩＸ因子からなる群から選択される、上記の方法および共役複合体に関する。

本発明の特に好ましい態様によれば、アミノ基である官能基Ｚと反応させる官能基Ａは、反応性カルボキシ基である。したがって、本発明はまた、官能基Ｚがアミノ基であって、ポリマーまたはポリマー誘導体の官能基Ａが反応性カルボキシ基である、上記の方法および共役複合体にも関する。修飾ポリオールのアミノ基を、ポリマーまたはポリマー誘導体の反応性カルボキシ基と反応させる上記の態様において、特に好ましいヒドロキシエチルデンプンは、例えば、約１０ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンである。約１０ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプン並びに約１８ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプン並びに約５０ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約５０ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１２ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１２ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１８ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約３０ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約３０ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約５０ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約５０ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１００ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンもまた可能である。平均分子量およびＤＳのこれらの組合せの各々については、約０．８のＤＳ値もまた好ましい。

反応性ポリマーと、段階ａ）の間に糖タンパク質に結合した修飾ポリオールとの反応は、少なくとも１０、より好ましくは少なくとも３０、より一層好ましくは少なくとも５０重量パーセントの反応性ポリマーを含む、反応性ポリマーの調製の反応混合物を（すなわち反応性ポリマーを単離せずに）、タンパク質の水溶液と混合することによって行われうる。タンパク質の好ましい水溶液には、０．０５から１０、より好ましくは０．５から５、特に好ましくは０．５から２重量パーセントのタンパク質が、５．０から９．０の好ましいｐＨ、６．０から９．０のより好ましいｐＨ、７．５から８．５の特に好ましいｐＨで含まれる。

本発明によれば、反応性ポリマーを、少なくとも一つの適当な沈殿剤、例えば無水エタノール、イソプロパノールおよび／またはアセトンによる少なくとも１回、好ましくは多数回の沈殿によって精製して、少なくとも１０、より好ましくは少なくとも３０、より一層好ましくは少なくとも５０重量パーセントの反応性ポリマーを含む固形物を得ることもまた可能である。

精製した反応性ポリマーは、修飾糖タンパク質の水溶液に加えられうる。精製した反応性ポリマーの溶液を、修飾糖タンパク質の水溶液へ加えることもまた可能である。

本発明の好ましい態様によれば、反応性ポリマーをタンパク質と反応させてアミド結合を得ることは、０から４０℃、より好ましくは１から２５℃、特に好ましくは１５から２５℃または１から１５℃の温度で、好ましくは７．０から９．０、好ましくは７．５から９．０、特に好ましくは７．５から８．５のｐＨで、好ましくは０．１から１２時間、より好ましくは０．５から５時間、より好ましくは０．５から３時間、より一層好ましくは０．５から２時間、特に好ましくは０．５から１時間の反応時間で、反応性ポリマーのモル比（エステル：タンパク質）が、好ましくは１：１から７０：１、より好ましくは５：１から５０：１、特に好ましくは１０：１から５０：１で行われる。

本発明のさらに特に好ましい態様によれば、アミノ基である官能基Ｚと反応する官能基Ａは、アルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基である。したがって、本発明はまた、官能基Ｚがアミノ基であって、ポリマーまたはその誘導体の官能基Ａが、アルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基である、上記の方法および共役複合体にも関する。好ましくは、糖タンパク質は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＦＮベータ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、ｔＰＡ、Ａ１ＡＴ、ＡＴＩＩＩ、ＨＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、ＩＬ−１５、抗体融合タンパク質、治療抗体、インターロイキン、特にインターロイキン２またはインターロイキン６、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、並びに第ＩＸ因子からなる群から選択される。

特に好ましい態様によれば、官能基Ｚと官能基Ａは、還元的アミノ化によって反応する。

この好ましい態様によれば、ポリマーを、その適宜酸化された還元末端で、アミノ基Ｍおよび官能基Ｑを含む少なくとも二官能性の化合物と反応させるのが好ましく、その中で、前記アミノ基Ｍを、ポリマーの適宜酸化された還元末端と反応させ、該官能基Ｑを化学修飾して官能基Ａ誘導体を含むポリマーを得、それを還元的アミノ化によってアミノ基Ｚと反応させる。

本発明の文脈に用いられる用語「ポリマーを還元末端を通して反応させる」または「ポリマーを酸化された還元末端を通して反応させる」とは、ヒドロキシアルキルデンプンを主にその（選択的に酸化された）還元末端を通して反応させる過程をいう。該ポリマーはヒドロキシアルキルデンプンであり、特にヒドロキシエチルデンプンである。

この用語「主にその（選択的に酸化された）還元末端を通して」とは、所定の反応に用いられるポリマー分子のうち、統計的に５０％を超える量、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より一層好ましくは少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を、１ポリマー分子あたり少なくとも一つの（選択的に酸化された）還元末端を通して反応させる過程をいい、その中で、少なくとも一つの還元末端を通して反応させる所定のポリマー分子は、前記ポリマー分子に含まれ、還元末端でない少なくとも一つのさらなる適当な官能基を通して、同じ所定の反応において、反応させることができる。一つ以上のポリマー分子を、少なくとも一つの還元末端を通して反応させると同時に、この（これらの）ポリマー分子に含まれ、還元末端でない少なくとも一つのさらなる適当な官能基を介して反応させる場合は、これらのポリマー分子の反応させる全官能基（前記官能基は還元末端を含む）のうち、統計的に好ましくは５０％を超える量、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より一層好ましくは少なくとも９５％、例えば９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が、還元末端である。

本発明の文脈に用いられる用語「還元末端」とは、ポリマー分子の末端アルデヒド基をいい、それはアルデヒド基として、および／または対応するアセタール型として存在しうる。還元末端が酸化される場合、アルデヒド基またはアセタール基は、カルボキシ基型および／または対応するラクトン型をとる。

官能基Ｑについては、とりわけ、以下の官能基が挙げられる：
− Ｃ−Ｃ二重結合もしくはＣ−Ｃ三重結合または芳香族Ｃ−Ｃ結合；
− チオ基またはヒドロキシ基；
− アルキルスルホン酸ヒドラジド、アリールスルホン酸ヒドラジド；
− １，２−ジオール類；
− １，２−アミノチオアルコール類；
− １，２−アミノアルコール類；
− アミノ基−ＮＨ_２または構造単位−ＮＨ−を含むアミノ基の誘導体、例えばアミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリルアミノ基；
− ヒドロキシルアミノ基−Ｏ−ＮＨ_２、または構造単位−Ｏ−ＮＨ−を含むヒドロキシルアミノ基の誘導体、例えばヒドロキシルアルキルアミノ基、ヒドロキシルアリールアミノ基、ヒドロキシルアラルキルアミノ基、またはヒドロキシルアルカリルアミノ基；
− 各々が構造単位−ＮＨ−Ｏ−を含む、アルコキシアミノ基、アリールオキシアミノ基、アラルキルオキシアミノ基、またはアルカリルオキシアミノ基；
− カルボニル基を有する残基、−Ｑ−Ｃ（＝Ｇ）−Ｍ
［式中、Ｇは、ＯまたはＳであって、Ｍは、例えば
−− −ＯＨまたは−ＳＨ；
−− アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、またはアルカリルオキシ基；
−− アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルチオ基、またはアルカリルチオ基；
−− アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、アラルキルカルボニルオキシ基、アルカリルカルボニルオキシ基；
−− 活性化エステル、例えばイミド構造を有するヒドロキシルアミン（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド）のエステル、または構造単位Ｏ−Ｎ（Ｎはヘテロアリール化合物の一部である）を有するヒドロキシルアミンのエステル、あるいはＧ＝Ｏであって、Ｑが不存在である、例えば置換アリール残基（例えばペンタフルオロフェニル、パラニトロフェニルまたはトリクロロフェニル）を有するアリールオキシ化合物の活性化エステル；
であり、Ｑは不存在またはＮＨあるいはヘテロ原子（例えばＳまたはＯ）である］；
− −ＮＨ−ＮＨ_２、または−ＮＨ−ＮＨ−；
− −ＮＯ_２；
− ニトリル基；
− カルボニル基、例えばアルデヒド基またはケト基；
− カルボキシ基；
− −Ｎ＝Ｃ＝Ｏ基または−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基；
− ハロゲン化ビニル基（例えばヨウ化ビニル基または臭化ビニル基）あるいはトリフレート；
− −Ｃ≡Ｃ−Ｈ；
− −（Ｃ＝ＮＨ_２Ｃｌ）−Ｏアルキル
− −（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ_２−Ｈａｌ基［式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである］；
− −ＣＨ＝ＣＨ−ＳＯ_２−；
− 構造−Ｓ−Ｓ−を含むジスルフィド基；
− 化学基：

− 化学基：

本発明の好ましい態様によれば、用語「官能基Ｑ」とは、化学構造−ＮＨ−（例えば−ＮＨ_２）、または構造単位−ＮＨ−を含むアミノ基の誘導体（例えばアミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリルアミノ基）を含む官能基Ｑをいう。

本発明の好ましい一態様によれば、官能基Ｍは、構造Ｒ’−ＮＨ−を有する化学基であって、Ｒ’は水素であるか、またはアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリルもしくはシクロアルキルアリール残基であり、ここで該シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリルもしくはシクロアルキルアリール残基は、ＮＨ基に直接結合していてもよいし、あるいは別の態様によれば、酸素架橋によってＮＨ基に結合していてもよい。該アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリル、またはシクロアルキルアリール残基は、適当に置換されていてもよい。好ましい置換基として、Ｆ、ＣｌまたはＢｒのようなハロゲンを挙げることができる。特に好ましい残基Ｒ’は、水素、アルキル基およびアルコキシ基であり、より一層好ましいのは、水素並びに無置換アルキル基および無置換アルコキシ基である。

アルキル基およびアルコキシ基の中では、１、２、３、４、５、または６個のＣ原子を有する化学基が好ましい。より好ましいのはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、およびイソプロポキシ基である。特に好ましいのはメチル、エチル、メトキシ、エトキシであり、メチルまたはメトキシはとりわけ好ましい。

本発明の別の態様によれば、官能基Ｍは構造Ｒ’−ＮＨ−Ｒ”を有し、ここでＲ”は、好ましくは構造単位−ＮＨ−および／または構造単位−（Ｃ＝Ｇ）−［式中、ＧはＯまたはＳである］および／または構造単位−ＳＯ_２−を含む。官能基Ｒ”の具体例は、

［Ｇが二つ存在する場合、それらは独立してＯまたはＳである］
である。

したがって本発明はまた、官能基Ｍが

［式中、ＧはＯまたはＳ（二つ存在する場合は、独立してＯまたはＳ）であり、Ｒ’はメチルである］
からなる群から選択される、上述の方法および共役複合体にも関する。

本発明の特に好ましい態様によれば、官能基Ｍはアミノ基−ＮＨ_２である。第１の選択肢によれば、アミノ基ＮＨ_２である官能基Ｍを、ポリマーの酸化された還元末端と反応させて、ポリマーとＭおよびＱを含む化合物とを結合するアミド基を得る。

第２の選択肢によれば、アミノ基ＮＨ_２である官能基Ｍを、還元的アミノ化によってポリマーの酸化されていない還元末端と反応させてイミノ基を生じ、続いてそれを、好ましくは水素化してアミノ基を得、イミノ基およびアミノ基は、それぞれポリマーとＭおよびＱを含む化合物とを結合する。この場合、官能基Ｑはアミノ基でありうる。生じたポリマー誘導体を、後述するようにカルボキシ基または反応性カルボキシ基を介して、あるいはアミノ基と反応させるべき少なくとも二官能性の化合物の別の化学基を介して、少なくとも二官能性の化合物との後続の反応に付す場合、ＭおよびＱを含む化合物は、官能基としてアミノ基を一つだけ含む一級アミンであることが好ましい。この具体例において、化合物は官能基を一つしか含まないが、それはＭおよびＱを含む二官能性の化合物とみなされ、その中で、Ｍは、ポリマーの還元末端との還元的アミノ化に付される化合物に含まれるアミノ基であり、並びにＱは、還元的アミノ化とそれに続く水素化の結果として生じる二級アミノ基である。

第３の選択肢によれば、ポリマーの酸化されていない還元末端を、還元的アミノ化によってアンモニアと反応させて、ポリマーの末端イミノ基を生じ、続いてそれを、好ましくは水素化してポリマーの末端アミノ基を得、したがって末端一級アミノ基を得る。この具体例において、アンモニアはＭおよびＱを含む二官能性の化合物とみなされ、その中で、Ｍは用いられるアンモニアに含まれるＮＨ_２であり、Ｑは還元的アミノ化とそれに続く水素化の結果として生じる一級アミノ基である。

用語「アミノ基Ｑ」とは、化学構造−ＮＨ−（例えば、−ＮＨ_２）または構造単位−ＮＨ−を含むアミノ基の誘導体（例えばアミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリルアミノ基）を含む官能基Ｑをいう。

本発明の好ましい態様によれば、官能基Ｑは構造Ｒ’−ＮＨ−を有する化学基であって、ここでＲ’は水素であるか、またはアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリルもしくはシクロアルキルアリール残基であり、該シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリルもしくはシクロアルキルアリール残基は、ＮＨ基に直接結合していてもよいし、あるいは別の態様によれば、酸素架橋によってＮＨ基に結合していてもよい。アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリル、またはシクロアルキルアリール残基は、適当に置換されていてもよい。好ましい置換基として、Ｆ、ＣｌまたはＢｒのようなハロゲンを挙げることができる。特に好ましい残基Ｒ’は、水素、アルキル基およびアルコキシ基であり、より一層好ましくは、水素並びに無置換アルキル基および無置換アルコキシ基である。

アルキル基およびアルコキシ基の中では、１、２、３、４、５、または６個のＣ原子を有する化学基が好ましい。より好ましいのは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、およびイソプロポキシ基である。特に好ましいのは、メチル、エチル、メトキシ、エトキシであり、メチルまたはメトキシはとりわけ好ましい。

本発明の別の態様によれば、官能基Ｑは構造Ｒ’−ＮＨ−Ｒ”を有し、Ｒ”は好ましくは、構造単位−ＮＨ−および／または構造単位−（Ｃ＝Ｇ）−［式中、ＧはＯまたはＳである］および／または構造単位−ＳＯ_２−を含む。より好ましい態様によれば、官能基Ｒ”は、

［Ｇが二つ存在する場合、それらは独立してＯまたはＳである］
からなる群から選択される。

したがって、本発明はまた、官能基Ｑが

本発明の特に好ましい態様によれば、官能基Ｑはアミノ基−ＮＨ_２である。本発明のさらにより一層好ましい態様によれば、ＭとＱは両方ともアミノ基−ＮＨ−を含む。特に好ましい態様によれば、ＭとＱは両方ともアミノ基−ＮＨ_２である。

本発明の好ましい態様によれば、ＭおよびＱを含む化合物はホモ二官能性の化合物であり、より好ましくは、官能基ＭおよびＱとして、最も好ましくはアミノ基−ＮＨ_２を含むホモ二官能性の化合物であるか、あるいは別の態様によれば、ヒドロキシアミノ基−Ｏ−ＮＨ_２または

［式中、Ｇは好ましくはＯである］
を含むホモ二官能性の化合物である。ＭおよびＱを含むこれらの化合物の具体例は、

である。

ＭとＱの両方ともアミノ基−ＮＨ_２である場合、ＭおよびＱはいずれの適当なスペーサーによっても分離されうる。とりわけ、該スペーサーは、適宜置換された直鎖、分枝鎖および／または環状炭化水素残基でありうる。一般に、炭化水素残基は、１から６０個、好ましくは１から４０個、より好ましくは１から２０個、より好ましくは２から１０個、より好ましくは２から６個、特に好ましくは２から４個の炭素原子を有する。ヘテロ原子が存在する場合、分離基には一般に、１から２０個、好ましくは１から８個、特に好ましくは１から４個のヘテロ原子が含まれる。炭化水素残基には、例えば５から７個の炭素原子を有する、適宜分枝したアルキル鎖またはアリール基もしくはシクロアルキル基が含まれうるか、あるいはアルキル部分が直鎖および／または環状アルキル基であるアラルキル基、アルカリル基でありうる。より一層好ましい態様によれば、炭化水素残基は、１から２０個、好ましくは２から１０個、より好ましくは２から６個、特に好ましくは２から４個の炭素原子のアルキル鎖である。

したがって、本発明はまた、ポリマーを１，４−ジアミノブタン、１，３−ジアミノプロパンまたは１，２−ジアミノエタンと反応させてポリマー誘導体を得る、上記の方法および共役複合体にも関する。

ＭおよびＱを含む少なくとも二官能性の化合物とポリマーとの反応は、好ましくは、０から１００℃、より好ましくは４から８０℃、特に好ましくは２０から８０℃の温度で行なわれ；反応時間は、好ましくは４時間から７日間、より好ましくは１０時間から５日間、特に好ましくは１７から４時間の範囲である。少なくとも二官能性の化合物のモル比：ポリマーは、好ましくは１０から２００、特に５０から１００の範囲にある。

少なくとも二官能性の化合物とポリマーとの反応の溶媒としては、少なくとも一つの非プロトン性溶媒、特に好ましくは、０．５重量パーセントを超えない（好ましくは０．１重量パーセントを超えない）含水率を有する無水非プロトン性溶媒が好ましい。適当な溶媒は、とりわけ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびそれらの二つ以上の混合物である。

少なくとも二官能性の化合物とポリマーとの反応の溶媒としては、水溶媒もまた用いられうる。好ましい態様によれば、ポリマーと少なくとも二官能性の化合物とを含むポリマー誘導体を、遊離の官能基Ｑで化学修飾して、アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基Ａを含むポリマー誘導体を得る。この態様によれば、官能基Ｑと反応させることができる官能基、並びにアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を含む、少なくとも一つの少なくとも二官能性の化合物と、ポリマー誘導体を反応させることが好ましい。

少なくとも二官能性の化合物としては、アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基、並びにポリマー誘導体の官能基Ｑとの結合を形成することができる少なくとも一つの官能基を有する各化合物が、適当である。少なくとも一つの官能基は、Ｑと同じ官能基群から選択され、Ｑと反応させることができるように選ばれる。Ｑがアミノ基−ＮＨ_２、または構造単位−ＮＨ−を含む該アミノ基の誘導体、例えば、アミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリルアミノ基である好ましい場合において、アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基の他に、少なくとも一つのカルボキシ基または少なくとも一つの反応性カルボキシ基（好ましくは一つのカルボキシ基または一つの反応性カルボキシ基）を有する化合物を用いることが好ましい。アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基、並びにカルボキシ基または反応性カルボキシ基は、いずれの適当なスペーサーによっても分離されうる。とりわけ、スペーサーは適宜置換された直鎖、分枝鎖および/または環状炭化水素残基でありうる。一般に、該炭化水素残基は、１から６０個、好ましくは１から４０個、より好ましくは１から２０個、より好ましくは２から１０個、より好ましくは２から６個、特に好ましくは２から４個の炭素原子を有する。ヘテロ原子が存在する場合、分離基は、一般に１から２０個、好ましくは１から８個、特に好ましくは１から４個のヘテロ原子を含む。炭化水素残基は、例えば５から７個の炭素原子を有する、適宜分岐したアルキル鎖またはアリール基もしくはシクロアルキル基を含みうるか、あるいはアルキル部分が直鎖および／または環状アルキル基であるアラルキル基、アルカリル基でありうる。

好ましい態様によれば、炭化水素残基は２から６個、好ましくは２から４個の炭素原子を有するアルキル基である。アルデヒド基またはケト基とカルボキシ基の間に炭素原子が存在しないこともまた可能である。あるいは、炭化水素残基は、３から１１個、好ましくは３から６個または３から５個の炭素原子を有する置換または無置換環状炭化水素基でありうる。環状炭化水素基が置換される場合、置換基は、置換もしくは無置換アミノ基または置換もしくは無置換アルコキシ基からなる群から選択されうる。置換基が存在する場合、置換基の数は好ましくは１から３個である。さらに、アルキル基および／または環状炭化水素基には、一つ以上のヘテロ原子（例えばＯまたはＳ、特にＯ）が含まれうる。この場合、好ましくは１から３個、特に１から２個のヘテロ原子が存在する。この文脈において好ましい化合物は、以下の化合物群から選択される。

さらに一層好ましい態様によれば、炭化水素残基は５から７個、好ましくは６個の炭素原子を有するアリール残基である。最も好ましくは、炭化水素残基はベンゼン残基である。この好ましい態様によれば、カルボキシ基およびアルデヒド基は、ベンゼン環の１，４位、１，３位または１，２位に位置することができ、１，４位は好ましい。

反応性カルボキシ基としては、反応性エステル、イソチオシアネートまたはイソシアネートを挙げることができる。好ましい反応性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド類（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドもしくはスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、適当に置換されたフェノール類（例えばｐ−ニトロフェノール、ｏ，ｐ−ジニトロフェノール、ｏ，ｏ’−ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、例えば２，４，６−トリクロロフェノールもしくは２，４，５−トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、例えば２，４，６−トリフルオロフェノールもしくは２，４，５−トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、ペンタフルオロフェノール）、またはヒドロキシアゾール類（例えばヒドロキシベンゾトリアゾール）から誘導される。特に好ましいのはＮ−ヒドロキシスクシンイミド類であり、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドは特に好ましい。すべてのアルコール類は、単独またはその二つ以上の適当な組合せとして用いられうる。反応性エステルとしては、ペンタフルオロフェニルエステルおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが特に好ましい。

具体的な態様によれば、官能基Ｑ（Ｑは、好ましくはＮＨ_２、あるいは構造単位−ＮＨ−を含むアミノ基の誘導体、例えばアミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリルアミノ基であり、特にＮＨ_２である）と化学結合を形成することができる官能基は、反応性カルボキシ基である。

この場合、官能基Ｑと化学結合を形成することができ、カルボキシ基である官能基を適当に反応させて、上記の反応性カルボキシ基を得る。したがって、カルボキシ基並びにアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を含む少なくとも一つの少なくとも二官能性の化合物を、カルボキシ基が反応性カルボキシ基に変換される反応に付すことが好ましく、生じた少なくとも二官能性の化合物を精製し、ポリマー誘導体の官能基Ｑと反応させる。

反応性カルボキシ基を得るために反応させることができるカルボキシ基を含む少なくとも二官能性の化合物の具体例は、上の一覧の化合物１から化合物１１である。この文脈において、用語「カルボキシ基」はまた、ラクトン、およびジカルボン酸化合物の分子内無水物にも関する。

したがって、好ましい態様によれば、本発明は、Ｑ（Ｑは、アミノ基−ＮＨ_２、あるいは構造単位−ＮＨ−を含むアミノ基の誘導体、例えばアミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリルアミノ基である）を含むポリマー誘導体を、ホルミル安息香酸とさらに反応させる、上記の方法および共役複合体に関する。

別の態様によれば、本発明は、Ｑ（Ｑはアミノ基である）を含むポリマー誘導体を、ホルミル安息香酸ペンタフルオロフェニルエステルとさらに反応させる、上記の方法および共役複合体に関する。さらに別の態様によれば、本発明は、Ｑ（Ｑはアミノ基である）を含むポリマー誘導体を、ホルミル安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとさらに反応させる、上記の方法および共役複合体に関する。

さらに別の態様によれば、本発明は、Ｑ（Ｑはアミノ基である）を含むポリマー誘導体を、４−（４−ホルミル−３，５−ジメトキシフェノキシ）酪酸とさらに反応させる、上記の方法および共役複合体に関する。

別の好ましい態様によれば、本発明は、Ｑ（Ｑはアミノ基−ＮＨ_２である）を含むポリマー誘導体を、アルファ−ケトカルボン酸、シアル酸またはその誘導体、並びにピリドキサールリン酸からなる群から選択される生体適合性化合物である二官能性の化合物と反応させる、上記の方法および共役複合体に関する。

アルファ−ケトカルボン酸について、これらは好ましくは、アミノ酸から誘導されるアルファ−ケトカルボン酸であり、ほとんどの場合、人体にもまた見られうる。アミノ酸から誘導される好ましいアルファ−ケトカルボン酸は、ケト−バリン、ケト−ロイシン、ケト−イソロイシンおよびケト−アラニンからなる群から選択される。アルファ−ケトカルボン酸のカルボキシ基を、アミノ基であるポリマーのＱ基と反応させる。それによってアミド基が形成される。アルファ−ケトカルボン酸の残余の遊離ケト基を、次いでタンパク質の官能基、特にアミノ基と反応させてもよい。それによってイミノ基が形成され、それは水素化されうる。

したがって、本発明は、Ｑ（Ｑはアミノ基である）を含むポリマー誘導体を、アルファ−ケトカルボン酸と反応させる、上記の方法および共役複合体に関する。

シアル酸またはその誘導体について、これらは好ましくは生体適合性であり、特にこれらは人体に見られる糖類であって、Ｎ−および／またはＯ−アセチル化されている。好ましい態様において、シアル酸はＮ−アセチルノイラミン酸である。これらの化合物は、該ピラノース構造ゆえに、スペーサーとしての機能を満たすために、望ましい剛性を示す。他方、選択的酸化によってこれらの化合物にアルデヒド基を導入することは可能でありうる。シアル酸は人体において、例えばグリコシル化タンパク質のグリカン鎖中の末端単糖として見られる。好ましい態様において、シアル酸はアルデヒド基に選択的に酸化されうる。

シアル酸を選択的に酸化する方法は、例えばL.W. Jaques, B.F. Riesco, W. Weltner, Carbohydrate Research, 83 (1980), 21-32、およびT. Masuda, S. Shibuya, M. Arai, S. Yoshida, T. Tomozawa, A. Ohno, M. Yamashita, T. Honda, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 13 (2003), 669-673から、当該技術分野で公知である。好ましくは、ポリマーのアミノ基との反応の前に、シアル酸の酸化が行われうる。

適宜酸化されたシアル酸を、次いでそのカルボン酸基を通して、ポリマーのアミノ基と反応させてもよい。生じた化合物はアルデヒド基を含み、それは次いで、還元的アミノ化によってタンパク質のアミノ基とさらに反応させてもよい。

したがって、本発明は、Ｑ（Ｑはアミノ基である）を含むポリマー誘導体を、適宜酸化されたシアル酸と反応させる、上記の方法および共役複合体に関する。

ピリドキサールリン酸（ＰｙＰ）について、これは高い生体適合性を有する二官能性の化合物であり、ビタミンＢ６とも呼ばれる。ＰｙＰは、アミノ基転移、脱炭酸、ラセミ化、およびアミノ酸側鎖の多数の修飾に関与する補酵素である。すべてのＰｙＰ要求酵素は、アミノ酸と補酵素の間のシッフ塩基の形成を通して作用する。

ＰｙＰのリン酸基を、ポリマー、好ましくはヒドロキシアルキルデンプン、特にヒドロキシエチルデンプンのアミノ基と反応させて、ホスホルアミドを形成しうる。次いで、ＰｙＰのアルデヒド基をタンパク質のアミノ基と反応させて、シッフ塩基を形成し、それを次いで還元しうる。好ましい態様において、共役複合体の構造は、ＨＥＳ−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−（ピリドキサール）−ＣＨ−ＮＨ−タンパク質である。ＰｙＰの場合、ポリマーの官能基は、好ましくは上記のジアミノ化合物を使用することによって、ポリマーに導入される。

したがって、本発明は、Ｑ（Ｑはアミノ基である）を含むポリマー誘導体を、ピリドキサールリン酸と反応させる、上記の方法および共役複合体に関する。アミノ基を含むポリマー誘導体と、例えば、ホルミル安息香酸の反応の溶媒としては、少なくとも一つの非プロトン性溶媒または少なくとも一つの極性溶媒が好ましい。適当な溶媒は、とりわけ、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびそれらの二つ以上の混合物である。

アミノ基を含むポリマー誘導体と、カルボキシ基をふくむ少なくとも二官能性の化合物との反応の溶媒としては、水溶媒を用いることもまた可能である。本発明のこの文脈で用いられる用語「水溶媒」は、関与する溶媒の重量に基づいて、少なくとも１０重量％または少なくとも２０重量％または少なくとも３０重量％または少なくとも４０重量％または少なくと５０重量％または少なくとも６０重量％または少なくとも７０重量％または少なくとも８０重量％または少なくとも９０重量％または１００重量％までの範囲の水を含む溶媒または溶媒の混合物に関する。

反応は、好ましくは０から４０℃、より好ましくは０から２５℃、特に好ましくは１５から２５℃の温度で、好ましくは０．５から２４時間、特に好ましくは１から１７時間の反応時間で行われる。好ましい態様によれば、反応は活性化剤の存在下で行われる。適当な活性化剤は、とりわけ、カルボジイミド類、例えばジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド類（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）であり、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）は特に好ましい。

生じたポリマー誘導体は、少なくとも一つの適当な方法によって、反応混合物から精製されうる。必要であれば、少なくとも一つの適当な方法により、単離前にポリマー誘導体を沈殿させてもよい。

最初にポリマー誘導体を沈殿させる場合は、例えば反応混合物を、反応混合物中に存在する溶媒または溶媒混合物以外の少なくとも一つの溶媒または溶媒混合物と、適当な温度で接触させることが可能である。水溶媒（好ましくは水）を溶媒として用いる本発明の特に好ましい態様によれば、反応混合物を、２−プロパノールまたはアセトンとエタノールの混合物（好ましくは１：１混合物（ｖ／ｖ）、すなわち等体積の前記化合物）と、好ましくは−２０から＋５０℃の範囲、特に好ましくは−２０から２５℃の範囲の温度で接触させる。

ポリマー誘導体の単離は、一段階以上を含みうる適当な過程によって行われうる。本発明の好ましい態様によれば、最初にポリマー誘導体を、反応混合物、または反応混合物と例えば２−プロパノール水混合物との混合物から、遠心分離または濾過のような適当な方法によって分離する。第２段階では、分離したポリマー誘導体をさらなる処理、例えば透析、遠心濾過もしくは加圧濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ＭＰＬＣ、ゲル濾過および／または凍結乾燥のような後処理に付してもよい。より一層好ましい態様によれば、最初に、分離したポリマー誘導体を（好ましくは水に対して）透析し、次いで、目的の生成物の仕様(specification)に応じて、反応生成物の溶媒含量が十分に低くなるまで凍結乾燥する。凍結乾燥は２０から３５℃、好ましくは２０から３０℃の温度で行われうる。

アルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を有する生じたポリマー誘導体を、続いて還元的アミノ化によってタンパク質のアミノ酸と反応させる。

ポリマーまたはポリマー誘導体が、少なくとも一つのアルデヒド基またはケト基またはヘミアセタール基を通して、修飾糖タンパク質の少なくとも一つのアミノ基（好ましくは本発明の方法の段階ａ）の間に官能基Ｚとして導入されたアミノ基）に共有結合される、本発明の還元的アミノ化反応は、好ましくは０から４０℃、より好ましくは０から３７℃、より好ましくは０から２５℃、特に４から２１℃（但し、特に好ましくは０から２１℃）の温度で行なわれる。反応時間は、好ましくは０．５から７２時間、より好ましくは２から４８時間、特に好ましくは４から７時間の範囲である。反応の溶媒としては、水溶媒が好ましい。

したがって、本発明はまた、還元的アミノ化が０から２１℃の温度で行われる、上記の方法および共役複合体にも関する。したがって、本発明はまた、還元的アミノ化が水溶媒で行われる、上記の方法および共役複合体にも関する。

したがって、本発明はまた、還元的アミノ化が水溶媒中、０から２１℃の温度で行われる、上記の方法および共役複合体にも関する。

本発明の文脈に用いられる用語「水溶媒」は、関与する溶媒の重量に基づいて、少なくとも１０重量％から、より好ましくは少なくとも２０重量％から、より好ましくは少なくとも３０重量％から、より好ましくは少なくとも４０重量％から、より好ましくは少なくとも５０重量％から、より好ましくは少なくとも６０重量％から、より好ましくは少なくとも７０重量％から、より好ましくは少なくとも８０重量％から、より一層好ましくは少なくとも９０重量％から、１００重量％までの範囲の水を含む溶媒または溶媒の混合物に関する。好ましい反応溶媒は水である。

反応溶媒のｐＨ値は、一般に４から９または４から８または４から７．３の範囲にある。本発明の好ましい態様によれば、還元的アミノ化反応を行うｐＨは、１０未満、好ましくは７．５未満、好ましくは７．３未満、より好ましくは７以下、最も好ましくは７未満（すなわち酸性領域）である。したがって好ましい範囲は３から７未満、より好ましくは３．５から６．５、より一層好ましくは４から６、より一層好ましくは４．５から５．５、特に好ましくは約５．０、すなわち４．６または４．７または４．８または４．９または５．０または５．１または５．２または５．３または５．４である。好ましい範囲は、とりわけ、３から６．９または３から６．５または３から６または３から５．５または３から５または３から４．５または３から４または３から３．５または３．５から６．９または３．５から６．５または３．５から６または３．５から５．５または３．５から５または３．５から４．５または３．５から４または４から６．９または４から６．５または４から６．または４から５．５または４から５または４から４．５または４．５から６．９または４．５から６．５または４．５から６または４．５から５．５または４．５から５または５から６．９または５から６．５または５から６または５から５．５または５．５から６．９または５．５から６．５または５．５から６または６から６．９または６から６．５または６．５から６．９である。

反応に用いられるポリマー誘導体：タンパク質のモル比は、好ましくは、２００：１から５：１、より好ましくは１００：１から１０：１、特に好ましくは７５：１から２０：１の範囲にある。

本発明はまた、Ｚ基とＡ基の位置が逆であって、特に、本発明の方法の段階ａ）の間に糖タンパク質に導入された官能基が、反応性カルボキシ基あるいはアルデヒド基、ヘミアセタール基またはケト基を含む化学基であって、その中でポリマーまたはポリマー誘導体の反応基Ａがアミノ基である、上記の態様にも関する。Ａ基が、上記のヒドロキシルアミン、ヒドラジン、ヒドラジドまたはヒドラジド誘導体から選択されるのが特に好ましい。

本発明の別の好ましい態様によれば、ポリマーまたはポリマー誘導体の官能基Ａと反応させるべき修飾ポリオールの官能基Ｚは、チオール基である。好ましくは、糖タンパク質は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＦＮベータ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、ｔＰＡ、Ａ１ＡＴ、ＡＴＩＩＩ、ＨＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、ＩＬ−１５、抗体融合タンパク質、治療抗体、インターロイキン、特にインターロイキン２またはインターロイキン６、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、並びに第ＩＸ因子からなる群から選択される。チオール基は、トランスフェラーゼ反応において、チオール−修飾ポリオールを使用することによって段階ａ）に導入される。

第一の態様によれば、修飾ポリオールの官能基Ｚはチオール基であって、ポリマーの官能基Ａはハロゲンアセチル基であって、その中で、ポリマーを、その適宜酸化された還元末端で、各々がアミノ基を含む少なくとも二つの官能基を有する少なくとも二官能性の化合物と反応させることによってＡが導入されて、アミノ基を含む少なくとも一つの官能基を有するポリマー誘導体を得、該ポリマー誘導体を、モノハロゲン置換酢酸および／または反応性モノハロゲン置換酢酸誘導体と反応させる。

各々がアミノ基を含む少なくとも二つの官能基を有する少なくとも二官能性の化合物については、その適宜酸化された還元末端でポリマーと反応させて、アミノ基を含むポリマー誘導体を得ることができ、それをモノハロゲン置換酢酸および／または反応性モノハロゲン置換酢酸誘導体と反応させることができる、すべての化合物が考えられる。

好ましい態様によれば、少なくとも二官能性の化合物の一つの官能基（前記官能基は、ポリマーの適宜酸化された還元末端と反応させる）は、

［式中、ＧはＯまたはＳ（二つ存在する場合は、独立してＯまたはＳ）であり、Ｒ’はメチルである］
からなる群から選択される。

本発明の特に好ましい態様によれば、少なくとも二官能性の化合物の官能基（前記官能基は、適宜酸化された還元末端と反応させる）は、アミノ基−ＮＨ_２である。より一層好ましい態様によれば、この官能基（最も好ましくはアミノ基）を、ポリマーの酸化された還元末端と反応させる。

本発明の好ましい態様によれば、少なくとも二官能性の化合物の官能基（前記官能基は、モノハロゲン置換酢酸および／または反応性モノハロゲン置換酢酸誘導体と反応させる）は、アミノ基−ＮＨ_２である。

少なくとも二官能性の化合物の官能基（好ましくは、両方ともアミノ基−ＮＨ_２であって、前記官能基は、その適宜酸化された還元末端、好ましくは酸化された還元末端でポリマーと反応させる）、およびモノハロゲン置換酢酸および／または反応性モノハロゲン置換酢酸誘導体は、いずれの適当なスペーサーによっても分離されうる。とりわけ、スペーサーは、適宜置換された、直鎖、分枝鎖および／または環状炭化水素残基でありうる。適当な置換基は、とりわけ、アルキル、アリール、アラルキル、アルカリル、ハロゲン、カルボニル、アシル、カルボキシ、カルボキシエステル、ヒドロキシ、チオ、アルコキシおよび／またはアルキルチオ基である。一般に、炭化水素残基は、１から６０個、好ましくは１から４０個、より好ましくは１から２０個、より好ましくは２から１０個、より好ましくは２から６個、特に好ましくは２から４個の炭素原子を有する。ヘテロ原子が存在している場合、分離基には一般に、１から２０個、好ましくは１から８個、特に好ましくは１から４個のヘテロ原子が含まれる。炭化水素残基には、例えば、５から７個の炭素原子を有する適宜分枝したアルキル鎖またはアリール基もしくはシクロアルキル基が含まれ、あるいはアルキル部位が直鎖および／または環状アルキル基でありうるアラルキル基、アルカリル基でありうる。より一層好ましい態様によれば、炭化水素残基は、１から２０個、好ましくは２から１０個、特に好ましくは２から８個の炭素原子のアルキル鎖である。したがって、好ましい少なくとも二官能性の化合物は、二官能性のアミノ化合物、特に好ましくは１，８−ジアミノオクタン、１，７−ジアミノヘプタン、１，６−ジアミノヘキサン、１，５−ジアミノペンタン、１，４−ジアミノブタン、１，３−ジアミノプロパン、および１，２−ジアミノエタンである。さらに好ましい態様によれば、少なくとも二官能性の化合物はジアミノポリエチレングリコール、好ましくは式：
Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｍ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２
［式中、ｍは整数であり、ｍは好ましくは１、２、３、または４である］
のジアミノポリエチレングリコールである。

したがって、本発明はまた、ポリマーを、その酸化された還元末端で、１，８−ジアミノオクタン、１，７−ジアミノヘプタン、１，６−ジアミノヘキサン、１，５−ジアミノペンタン、１，４−ジアミノブタン、１，３−ジアミノプロパン、および１，２−ジアミノエタンと反応させて、式：

［式中、ｎ＝２、３、４、５、６、７、または８であり、ポリマーは特に好ましくはＨＥＳである］
のポリマー誘導体を得る、上記の方法および共役複合体にも関する。

したがって、本発明はまた、ポリマーを、その酸化された還元末端で、Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｍ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２と反応させて（ｍは、１、２、３、または４である）、式：

［式中、ｎ＝２、３、または４であり、ポリマーは特に好ましくはＨＥＳである］
のポリマー誘導体を得る、上記の方法および共役複合体にも関する。

ポリマー、好ましくはヒドロキシエチルデンプンの還元末端の酸化は、構造（ＩＩａ）および／または構造（ＩＩｂ）：

（IIa）

（IIb）
を有する化合物をもたらす各々の方法または方法の組合せに従って行われうる。

酸化は、ヒドロキシアルキルデンプンの酸化された還元末端をもたらす、いずれの適当な方法に従っても行われうるが、好ましくは、例えばDE 196 28 705 A1（そのそれぞれの内容（実施例Ａ、第９欄、６から２４行）は本明細書に引用される）に記載されている、アルカリ性ヨウ素溶液を用いて行われる。

ポリマーと、少なくとも二官能性の化合物との反応から生じるポリマー誘導体を、モノハロゲン置換酢酸および／または反応性モノハロゲン置換酢酸誘導体とさらに反応させる。モノハロゲン置換酢酸または反応性酸としては、Ｃｌ置換、Ｂｒ置換およびＩ置換酢酸が好ましい。

ハロゲン置換酸がそのように用いられる場合、活性化剤の存在下で、該酸をポリマー誘導体と反応させるのが好ましい。適当な活性化剤は、とりわけ、カルボジイミド類、例えばジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド類（DCC）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）であり、ジシクロヘキシルカルボジイミド類（ＤＣＣ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）は特に好ましい。

したがって、本発明はまた、ポリマー（好ましくはＨＥＳ）を、ジアミノ化合物、好ましくは２から８個の炭素原子を有するジアミノアルカンまたはＨ_２Ｎ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｍ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２［式中、ｍ＝１、２、３、または４］と反応させて、生じたポリマー誘導体を、活性化剤（好ましくはＥＤＣ）の存在下でＢｒ置換およびＩ置換酢酸と反応させる、上記の方法および共役複合体にも関する。

したがって、本発明はまた、式：

［式中、Ｘ＝Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり、ｎ＝２、３、４、５、６、７、または８であり、並びにポリマーは特に好ましくはＨＥＳである］
のポリマー誘導体、あるいは式：

［式中、Ｘ＝Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり、ｍ＝１、２、３、または４であり、並びにポリマーは特に好ましくはＨＥＳである］
のポリマー誘導体にも関する。

ポリマー誘導体とハロゲン置換酢酸との反応は、好ましくは、ＤＭＦ中または水溶液系（好ましくは水）で、３．５から５．５、より好ましくは４．０から５．０、特に好ましくは４．５から５．０の好ましいｐＨで；
４から３０℃、より好ましくは１５から２５℃、特に好ましくは２０から２５℃の好ましい反応温度で；
１から８時間、より好ましくは２から６時間、特に好ましくは３から５時間の好ましい反応時間で行われる。

ポリマー、少なくとも二官能性の化合物およびハロゲン置換酢酸を含むポリマー誘導体を含む反応混合物は、そのように段階ａ）から得られた修飾糖タンパク質との反応に用いられうる。本発明の好ましい態様によれば、ポリマー誘導体は、好ましくは限外濾過に続いて、沈殿させ、適宜洗浄および減圧乾燥することによって、反応混合物から分離される。

ポリマー誘導体とタンパク質との反応は、６．５から８．５、より好ましくは７．０から８．５、特に好ましくは７．５から８．５の好ましいｐＨで；
０から４０℃、より好ましくは１から２５℃、特に好ましくは１５から２５℃、あるいは１から１５℃の好ましい反応温度で；
０．５から８時間、より好ましくは１から６時間、特に好ましくは２から５時間の好ましい反応時間で行われる。

ポリマー誘導体と、修飾ポリオールのチオール基との反応によって、ポリマー誘導体と、糖タンパク質に結合した修飾ポリオールとの間のチオエステル結合がもたらされる。

したがって、本発明はまた、ポリマー（好ましくはＨＥＳ）を、ジアミノ化合物、好ましくは２から８個の炭素原子を有するジアミノアルカンまたはＨ_２Ｎ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｍ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２［式中、ｍ＝１、２、３、または４］と反応させて、生じたポリマー誘導体を、活性化剤（好ましくはＥＤＣ）の存在下でＢｒ置換およびＩ置換酢酸と反応させて、生じたポリマー誘導体をタンパク質のチオール基と反応させて、該タンパク質と該ポリマー誘導体の間のチオエステル結合を含む共役複合体を得る、上記の方法および共役複合体にも関する。

したがって、本発明はまた、式：

［式中、ｎ＝２、３、４、５、６、７、または８であり、ポリマーは、特に好ましくはＨＥＳであり、糖タンパク質は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＦＮベータ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、ｔＰＡ、Ａ１ＡＴ、ＡＴＩＩＩ、ＨＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、ＩＬ−１５、抗体融合タンパク質、治療抗体、インターロイキン、特にインターロイキン２またはインターロイキン６、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、並びに第ＩＸ因子からなる群から選択され、Ｓ原子は修飾ポリオールから誘導される］

［式中、ｍ＝１、２、３、または４であり、ポリマーは、特に好ましくはＨＥＳであり、糖タンパク質は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＦＮベータ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、ｔＰＡ、Ａ１ＡＴ、ＡＴＩＩＩ、ＨＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、ＩＬ−１５、抗体融合タンパク質、治療抗体、インターロイキン、特にインターロイキン２またはインターロイキン６、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、並びに第ＩＸ因子からなる群から選択され、Ｓ原子は修飾ポリオールから誘導される］
の共役複合体にも関する。

ヒドロキシエチルデンプンは、好ましくは約１０ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１０ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１２ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１２ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１８ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１８ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約３０ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約３０ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約５０ｋＤの平均分子量および約０．４のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約５０ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンあるいは約１００ｋＤの平均分子量および約０．７のＤＳを有するヒドロキシエチルデンプンである。平均分子量およびＤＳのこれらの組合せの各々については、約０．８のＤＳ値もまた好ましい。

第二の態様によれば、修飾ポリオールの官能基Ｚはチオール基であり、ポリマーの官能基Ａにはマレイミド基が含まれる。この態様によれば、共役複合体を生成するためにはいくつかの可能性が存在する。一般に、ポリマーを、その適宜酸化された還元末端で少なくとも一つの少なくとも二官能性の化合物と反応させ、その中でこの少なくとも二官能性の化合物には、ポリマーの適宜酸化された還元末端と反応することができる一つの官能基、並びにマレイミド基を含むか、またはマレイミド基を含むポリマー誘導体が得られるように化学修飾される少なくとも一つの官能基が含まれる。好ましい態様によれば、前記官能基は、マレイミド基を含むポリマー誘導体が得られるように化学修飾される。

したがって、本発明は、マレイミド基を含むポリマー誘導体を、修飾ポリオールのチオール基と反応させることによる方法であって、ポリマーを、その適宜酸化された還元末端で、適宜酸化された還元末端と反応することができる官能基Ｕを含む少なくとも二官能性の化合物と反応させることを特徴とする方法であって、少なくとも二官能性の化合物には、マレイミド基が得られるように化学修飾されうる官能基Ｗがさらに含まれ、マレイミド基が得られるように官能基Ｗを化学修飾することをさらに特徴とする、上記の方法および共役複合体に関する。

官能基Ｕについては、ポリマーの適宜酸化された還元末端と反応することができる各々の官能基が考えられる。本発明の好ましい態様によれば、官能基Ｕには、化学構造−ＮＨ−が含まれる。したがって、本発明はまた、官能基Ｕに構造−ＮＨ−が含まれる上記の方法および共役複合体にも関する。

本発明の一つの好ましい態様によれば、官能基Ｕは、構造Ｒ’−ＮＨ−を有する化学基であって、Ｒ’は水素であるか、またはアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリルもしくはシクロアルキルアリール残基であり、ここで、該シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリルもしくはシクロアルキルアリール残基は、ＮＨ基に直接結合していてもよいし、または別の態様によれば、酸素架橋によってＮＨ基に結合していてもよい。アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル、アルカリル、またはシクロアルキルアリール残基は、適当に置換されていてもよい。好ましい置換基としては、Ｆ、ＣｌまたはＢｒのようなハロゲンを挙げることができる。特に好ましい残基Ｒ’は、水素、アルキル基およびアルコキシ基であり、より一層好ましくは、水素並びに無置換アルキル基および無置換アルコキシ基である。

アルキルおよびアルコキシ基の中では、１、２、３、４、５、または６個のＣ原子を有する化学基が好ましい。より好ましいのは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、およびイソプロポキシ基である。特に好ましいのは、メチル、エチル、メトキシ、エトキシであり、メチルまたはメトキシはとりわけ好ましい。したがって、本発明はまた、Ｒ’が水素またはメチルまたはメトキシ基である、上記の方法および共役複合体にも関する。

本発明の別の好ましい態様によれば、官能基Ｕは構造Ｒ’−ＮＨ−Ｒ”−を有し、ここでＲ”には、好ましくは構造単位−ＮＨ−および／または構造単位−（Ｃ＝Ｇ）−［ＧはＯまたはＳである］および／または構造単位−ＳＯ_２−が含まれる。より好ましい態様によれば、官能基Ｒ”は

［Ｇが二つ存在する場合、それらは独立して、ＯまたはＳである］
からなる群選択される。

したがって、本発明はまた、官能基Ｕが

［式中、ＧはＯまたはＳ（二つ存在する場合は、独立してＯまたはＳ）であり、Ｒ’はメチルである］
からなる群から選択される、上記の方法および共役複合体にも関する。

本発明のより一層好ましい態様によれば、Ｕにはアミノ基−ＮＨ_２が含まれる。本発明の態様によれば、少なくとも二官能性の化合物の官能基Ｗは、Ｗを含むポリマー誘導体を、Ｗと反応することができる官能基を含み、マレイミド基をさらに含む、さらなる少なくとも二官能性の化合物と反応させることによって化学修飾される。

官能基Ｗ、およびＷと反応することができる前記のさらなる少なくとも二官能性の化合物の官能基については、とりわけ、以下の官能基を挙げることができる：
− Ｃ−Ｃ二重結合もしくはＣ−Ｃ三重結合または芳香族Ｃ−Ｃ結合；
− チオ基またはヒドロキシ基；
− アルキルスルホン酸ヒドラジド、アリールスルホン酸ヒドラジド；
− １，２−ジオール類；
− １，２−アミノアルコール類；
− １，２−アミノチオアルコール類；
− アミノ基−ＮＨ_２または構造単位−ＮＨ−を含むアミノ基の誘導体、例えばアミノアルキル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリルアミノ基；
− ヒドロキシルアミノ基−Ｏ−ＮＨ_２、または構造単位−Ｏ−ＮＨ−を含むヒドロキシルアミノ基の誘導体、例えばヒドロキシルアルキルアミノ基、ヒドロキシルアリールアミノ基、ヒドロキシルアラルキルアミノ基、またはヒドロキシルアルカリルアミノ基；
− 各々が構造単位−ＮＨ−Ｏ−を含む、アルコキシアミノ基、アリールオキシアミノ基、アラルキルオキシアミノ基、またはアルカリルオキシアミノ基；
− カルボニル基を有する残基、−Ｑ−Ｃ（＝Ｇ）−Ｍ
［式中、Ｇは、ＯまたはＳであって、Ｍは、例えば、
−− −ＯＨまたは−ＳＨ；
−− アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、またはアルカリルオキシ基；
−− アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルチオ基、またはアルカリルチオ基；
−− アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、アラルキルカルボニルオキシ基、アルカリルカルボニルオキシ基；
−− 活性化エステル、例えばイミド構造を有するヒドロキシルアミン（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド）のエステル、または構造単位Ｏ−Ｎ（Ｎはヘテロアリール化合物の一部である）を有するヒドロキシルアミンのエステル、あるいはＧ＝Ｏであって、Ｑが不存在である、例えば置換アリール残基（例えばペンタフルオロフェニル、パラニトロフェニルまたはトリクロロフェニル）を有するアリールオキシ化合物の活性化エステル；
であり、Ｑは不存在またはＮＨあるいはヘテロ原子（例えばＳまたはＯ）である］；
− −ＮＨ−ＮＨ_２、または−ＮＨ−ＮＨ−；
− −ＮＯ_２；
− ニトリル基；
− カルボニル基、例えばアルデヒド基またはケト基；
− カルボキシ基；
− −Ｎ＝Ｃ＝Ｏ基または−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基；
− ハロゲン化ビニル基（例えばヨウ化ビニル基または臭化ビニル基）あるいはトリフレート；
− −Ｃ≡Ｃ−Ｈ；
− −（Ｃ＝ＮＨ_２Ｃｌ）−Ｏアルキル
− −（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ_２−Ｈａｌ基［式中、ＨａｌはＣｌ、Ｂｒ、またはＩである］；
− −ＣＨ＝ＣＨ−ＳＯ_２−；
− 構造−Ｓ−Ｓ−を含むジスルフィド基；
− 化学基：

− 化学基：

ここで、Ｗおよびさらなる少なくとも二官能性の化合物の官能基は、それぞれ上述の化学基の一つと化学結合を形成することができる化学基である。

本発明のより一層好ましい態様によれば、Ｗにはアミノ基−ＮＨ_２が含まれる。本発明の好ましい態様によれば、Ｗともう一方の官能基の両方とも、上記の化学基の一覧からの化学基である。

本発明の一つの態様によれば、これらの官能基の一つはチオ基である。この特定の場合において、もう一方の官能基は、好ましくは

［式中、Ｈａｌは、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ、好ましくはＢｒまたはＩである］
からなる群から選択される。

本発明の特に好ましい態様によれば、これらの官能基の一つは、反応性エステル、例えばイミド構造を有するヒドロキシルアミン（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド）のエステル、または構造単位Ｏ−Ｎ（Ｎはヘテロアリール化合物の一部である）を有するヒドロキシルアミンのエステル、あるいは、例えば置換アリール残基（例えばペンタフルオロフェニル、パラニトロフェニルまたはトリクロロフェニル）を有するアリールオキシ化合物、あるいは反応性エステルに適宜変換されるカルボキシ基からなる群から選択される。この特定の場合において、もう一方の官能基には化学構造−ＮＨ−が含まれる。

本発明の特に好ましい態様によれば、Ｗには構造−ＮＨ−が含まれ、さらなる少なくとも二官能性の化合物には反応性エステルおよびマレイミド基が含まれる。

構造−ＮＨ−を含む官能基Ｗについては、ＷがＵと同じか、またはＵと異なっていてもよい上記の官能基が引用されうる。本発明の好ましい態様によれば、ＵとＷは同じである。より好ましくは、ＵとＷの両方ともに、アミノ基が含まれる。特に好ましくは、ＵとＷの両方ともアミノ基−ＮＨ_２である。

本発明の一つの態様によれば、水溶媒中、ポリマーをその酸化されていない還元末端で、ＵおよびＷを含む少なくとも二官能性の化合物と反応させてもよい。ＵとＷの両方がアミノ基である好ましい態様によれば、反応は、酸化型の還元末端を有するポリマーを用いて、少なくとも一つの非プロトン性溶媒、特に好ましくは、０．５重量パーセントを超えない（好ましくは０．１重量％を超えない）含水率を有する無水非プロトン性溶媒中で行われる。適当な溶媒は、とりわけ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびそれらの二つ以上の混合物である。

特にＵとＷの両方ともアミノ基−ＮＨ_２である場合、ＵおよびＷはいずれの適当なスペーサーによっても分離されうる。とりわけ、スペーサーは、適宜置換された、直鎖、分枝鎖および／または環状炭化水素残基でありうる。適当な置換基は、とりわけ、アルキル、アリール、アラルキル、アルカリル、ハロゲン、カルボニル、アシル、カルボキシ、カルボキシエステル、ヒドロキシ、チオ、アルコキシおよび／またはアルキルチオ基である。一般に、炭化水素残基は、１から６０個、好ましくは１から４０個、より好ましくは１から２０個、より好ましくは２から１０個、より好ましくは２から６個、特に好ましくは２から４個の炭素原子を有する。ヘテロ原子が存在する場合、分離基には、一般に１から２０個、好ましくは１から８個、特に好ましくは１から４個のヘテロ原子が含まれる。炭化水素残基には、例えば５から７個の炭素原子を有する適宜分枝したアルキル鎖またはアリール基またはシクロアルキル基が含まれるか、あるいはアルキル部分が直鎖および／または環状アルキル基でありうるアラルキル基、アルカリル基でありうる。より一層好ましい態様によれば、炭化水素残基は、１から２０個、好ましくは２から１０個、より好ましくは２から６個、特に好ましくは２から４個の炭素原子のアルキル鎖である。

したがって、本発明はまた、ポリマーをその酸化された還元末端で、１，４−ジアミノブタン、１，３−ジアミノプロパンまたは１，２−ジアミノエタンと反応させて、式：

［式中、ｎ＝２、３、または４であり、ポリマーは好ましくはＨＥＳである］
のポリマー誘導体を得る、上記の方法および共役複合体にも関する。

上述の好ましい態様によれば、アミノ基を含むポリマー誘導体を、反応性エステル基およびマレイミド基を含む少なくとも二官能性の化合物とさらに反応させる。反応性エステル基およびマレイミド基は、適当なスペーサーによって分離されうる。このスペーサーについては、官能基ＵとＷの間のスペーサーが引用されうる。本発明の好ましい態様によれば、反応性エステル基およびマレイミド基は、１から１０個、好ましくは１から８個、より好ましくは１から６個、より好ましくは１から４個、より好ましくは１から２個、特に好ましくは１個の炭素原子を有する炭化水素鎖によって分離される。より一層好ましい態様によれば、反応性エステルはスクシンイミドエステルであり、特に好ましい態様によれば、マレイミド基および反応性エステル基を含む少なくとも二官能性の化合物は、Ｎ−（アルファ−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステルである。

したがって、本発明はまた、式：

［式中、ｎ＝２、３、または４であり、ポリマーは好ましくはＨＥＳである］
のポリマー誘導体にも関する。

マレイミド基を含むポリマー誘導体を、修飾ポリオールのチオール基とさらに反応させて、チオエーテル基を通して修飾糖タンパク質の修飾ポリオールと結合したポリマー誘導体を含む共役複合体を得る。

したがって、本発明はまた、式：

［式中、ｎ＝２、３、または４（好ましくは４）であり、ポリマーは好ましくはＨＥＳであり、糖タンパク質は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＦＮベータ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、ｔＰＡ、Ａ１ＡＴ、ＡＴＩＩＩ、ＨＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、ＩＬ−１５、抗体融合タンパク質、治療抗体、インターロイキン、特にインターロイキン２またはインターロイキン６、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、並びに第ＩＸ因子からなる群から選択される］
の糖タンパク質、修飾ポリオールおよびポリマーを含む、共役複合体にも関する。

マレイミド基を含むポリマー誘導体と、タンパク質のチオール基との反応は、好ましくは緩衝水溶液系で、５．５から８．５、より好ましくは６から８、特に好ましくは６．５から７．５の好ましいｐＨで、０から４０℃、より好ましくは１から２５℃、特に好ましくは１５から２５℃、あるいは１から１５℃の好ましい反応温度で、０．５から２４時間、より好ましくは１から２０時間、特に２から１７時間の好ましい反応時間で行われる。反応混合物の適当なｐＨ値は、少なくとも一つの適当な緩衝液を加えることによって調整されうる。好ましい緩衝液の中で、緩衝剤、酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸またはホウ酸緩衝液を挙げることができる。

共役複合体を、さらなる処理、例えば透析、遠心濾過もしくは加圧濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ＭＰＬＣ、ゲル濾過および／または凍結乾燥のような後処理に付してもよい。

本発明はまた、ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）であって、糖タンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＦＮベータ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、ｔＰＡ、Ａ１ＡＴ、ＡＴＩＩＩ、ＨＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、ＩＬ−１５、抗体融合タンパク質、治療抗体、インターロイキン、特にインターロイキン２またはインターロイキン６、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、並びに第ＩＸ因子からなる群から選択される糖タンパク質であって、共役複合体が、式：

［式中、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は独立して、水素、または２から１０個の炭素原子を有するヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基もしくはヒドロキシアルカリル基、好ましくは水素またはヒドロキシアルキル基、より好ましくは水素またはヒドロキシエチル基であり、並びに
Ｌは、適宜置換された直鎖、分枝鎖および／または環状炭化水素残基であって、少なくとも一つのヘテロ原子が適宜含まれ、アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、および／またはヘテロアラルキル部分が含まれ、前記残基は２から６０個、好ましくは２から４０個、より好ましくは２から２０個、より好ましくは２から１０個の炭素原子を有し、並びに
硫黄原子は修飾ポリオールのチオール基から誘導される］
の構造を有する、糖タンパク質およびポリマーもしくはその誘導体を含む共役複合体にも関する。

本発明はまた、−Ｌ−が、
−［（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍＧ］_ｎ［ＣＲ_ｃＲ_ｄ］_ｏ−
［式中、Ｒ_ａ；Ｒ_ｂ、Ｒ_ｃ、Ｒ_ｄは独立して、水素、アルキル、アリール、好ましくは水素であって、
Ｇは、ＯおよびＳ（好ましくはＯ）からなる群から選択され、並びに
ｍは、１、２、３または４、最も好ましくは２であって、その中で残基Ｒ_ａおよびＲ_ｂは、ｍ個の化学基（ＣＲ_ａＲ_ｂ）の中で、同じであるか、または異なっていてもよく；
ｎは、１から２０、好ましくは１から１０、最も好ましくは１、２、３、または４であり；
ｏは、１から２０、好ましくは１から１０、より好ましくは１、２、３、４、５、より好ましくは１または２、最も好ましくは１であって、その中で残基Ｒ_ｃおよびＲ_ｄは、ｏ個のＣＲ_ｃＲ_ｄ基の中で、同じであるか、または異なっていてもよく；あるいは
ｎは０であり、並びに
ｏは、２から２０、好ましくは２から１０、より好ましくは２、３、４、５、６、７、または８であって、その中で残基Ｒ_ｃおよびＲ_ｄは、ｏ個のＣＲ_ｃＲ_ｄ基の中で、同じであるか、または異なっていてもよい］
である、上記の共役複合体にも関する。

［式中、Ｒ_１、Ｒ_２およびＲ_３は独立して、水素、または２から１０個の炭素原子を有するヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基もしくはヒドロキシアルカリル基、好ましくは水素またはヒドロキシアルキル基、より好ましくは水素またはヒドロキシエチル基であり、並びに
Ｌは、適宜置換された直鎖、分枝鎖および／または環状炭化水素残基であって、少なくとも一つのヘテロ原子が適宜含まれ、アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、および／またはヘテロアラルキル部分が含まれ、前記残基は２から６０個、好ましくは２から４０個、より好ましくは２から２０個、より好ましくは２から１０個の炭素原子を有し、並びに
硫黄原子は修飾ポリオールのチオール基から誘導される］
の構造を有する、糖タンパク質、修飾ポリオールおよびポリマーもしくはその誘導体を含む共役複合体にも関する。

本発明はまた、ヒドロキシアルキルデンプンがヒドロキシエチルデンプンである、上記の共役複合体にも関する。本発明はまた、ヒドロキシエチルデンプンが、２から２００ｋＤ、好ましくは４から１３０ｋＤ、より好ましくは４から７０ｋＤの分子量を有する、上記の共役複合体にも関する。

Ｚ基とＡ基の位置が逆であって、すなわち、本発明の方法の段階ａ）の間に糖タンパク質に導入された官能基Ｚが、マレイミド基またはハロゲンアセチル基を含む化学基であって、その中でポリマーまたはポリマー誘導体の反応基Ａがチオール基である、上記の態様にも関する。

本発明の別の態様によれば、修飾ポリオールの官能基Ｚはマレイミド基であって、ポリマーの官能基Ａにはチオール基が含まれる。

この態様によれば、共役複合体を生成するためにいくつかの可能性が存在する。一般に、ポリマーをその適宜酸化された還元末端で少なくとも一つの二官能性の化合物と反応させ、その中でこの少なくとも二官能性の化合物には、ポリマーの適宜酸化された還元末端、およびチオール基を含む少なくとも一つの官能基Ａと反応することができる一つの官能基が含まれる。この態様のために有用な二官能性の化合物の例は、

［式中、ｎは、整数、好ましくは１、２、３、４、５、または６である］
からなる群から選択されうる。ポリマー（好ましくはＨＥＳ）を化合物３と反応させる場合は、形成された共有結合は既に上記に記載されたオキシムである。ポリマー（好ましくはＨＥＳ）を化合物１と反応させる場合は、それを好ましくは上記のように、還元的アミノ化によって反応させる。あるいは、適宜選択的に、酸化されたポリマー（好ましくはＨＥＳ）を化合物１と反応させてもよく、それによってラクトン開環が行われる。ポリマー（好ましくはＨＥＳ）を化合物２と反応させる場合は、それを好ましくは還元的アミノ化によって反応させ、続いて−Ｓ−Ｓ−架橋を、例えばＴＣＥＰまたはＤＴＴによって開裂させる。適宜選択的に、酸化されたポリマー（好ましくはＨＥＳ）を化合物２と反応させる場合は、それを好ましくはラクトン開環によって反応させ、続いて−Ｓ−Ｓ−架橋を、例えばＴＣＥＰまたはＤＴＴによって開裂させる（ｎ＝２およびｎ＝３について、上記の構造はBauer et al. J.Org. Chem. 1965, 30, 949に従って合成されうる）。

マレイミド基である修飾ポリオールの官能基Ｚは、いずれの都合のよい方法によっても修飾ポリオールに導入されうる。

したがって、本発明は、チオール基を含むポリマー誘導体を、タンパク質での修飾ポリオールのマレイミド基と反応させることによる方法であって、ポリマーを、その適宜酸化された還元末端で、適宜酸化された還元末端と反応させることができる官能基Ｕを含む少なくとも二官能性の化合物と反応させることを特徴とする方法であって、その少なくとも二官能性の化合物が、チオール基をさらに含み、その得られたＨＡＳ誘導体をマレイミド基を含むタンパク質と反応させる、上記の方法および共役複合体に関する。

本発明の共役複合体を製造するための方法において、上記の方法における変換率は、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、より一層好ましくは少なくとも８０％、特に９５％以上、例えば少なくとも９８％または９９％でありうる。さらなる態様によれば、本発明は、特に人体または動物の体の治療方法に使用するための、上記の共役複合体または上記の方法によって得られる共役複合体に関する。

本発明の共役複合体は、少なくとも純度５０％、より一層好ましくは少なくとも純度７０％、より一層好ましくは少なくとも純度９０％、特に少なくとも純度９５％または少なくとも純度９９％でありうる。最も好ましい態様において、共役複合体は純度１００％であり得、すなわち他の副生成物は存在しない。

したがって、別の態様によれば、本発明はまた、本発明の共役複合体が含まれうる組成物であって、共役複合体の量が少なくとも５０重量％、より一層好ましくは少なくとも７０重量％、より一層好ましくは少なくとも９０重量％、特に少なくとも９５重量％または少なくとも９９重量％でありうる組成物にも関する。最も好ましい態様において、組成物は共役複合体からなり得、すなわち共役複合体の量は１００重量％である。本発明の特に温和な方法によって、酸化および／または脱アミド化による共役複合体の糖タンパク質部分への損傷がほとんどない共役複合体が得られる。

特に、少なくとも一つの遊離アスパラギン側鎖および／またはグルタミン側鎖を含む糖タンパク質の少なくとも８０％は、最終の共役複合体においてすべてのアスパラギン側鎖およびグルタミン側鎖についてアミド基が損なわれていない。９０％超、９５％超またはさらに９９％超の糖タンパク質が、最終の共役複合体においてすべてのアミド基が損なわれていないのが好ましい。脱アミド化グルタミンおよび／またはアスパラギン残基が、最終の共役複合体において質量分析によって検出されないのが最も好ましい。脱アミド化アスパラギンおよび／またはグルタミン残基の割合は、「Usefulness of Glycopeptide Mapping by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry in Comparability Assessment of Glycoprotein Products」, Miyako Ohta, Nana Kawasaki, Satsuki Itoh and Takao Hayakawa, Biologicals Volume 30, Issue 3 , September 2002, Pages 235-244に従ってＬＣ−ＭＳによって決定されうる。

特に、少なくとも一つのメチオニン側鎖を含む糖タンパク質の少なくとも８０％は、最終の共役複合体においてそのすべてのメチオニン残基を非酸化型で保持する。９０％超、９５％超またはさらに９９％超の糖タンパク質が、最終の共役複合体においてすべてのそのメチオニン残基を非酸化型で保持するのが好ましい。最終の共役複合体において、酸化されたメチオニン残基が質量分析によって検出されないのが最も好ましい。酸化されたメチオニン残基の割合は、「Usefulness of Glycopeptide Mapping by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry in Comparability Assessment of Glycoprotein Products」, Miyako Ohta, Nana Kawasaki, Satsuki Itoh and Takao Hayakawa, Biologicals Volume 30, Issue 3 , September 2002, Pages 235-244に従ってＬＣ−ＭＳによって決定されうる。

メチオニン酸化とグルタミン／アスパラギン脱アミド化の両方とも回避されるのが最も好ましい。

さらに、本発明は、上記の共役複合体または上記の方法によって得られる共役複合体を治療上の有効量で含む医薬組成物に関する。

本発明のすべての糖タンパク質−ＨＡＳ共役複合体は、適当な方法、例えば、好ましくはｉ．ｖ．、ｓ．ｃ．またはｉ．ｍ．経路によって投与される経腸的方法、非経口的方法または肺性の方法(pulmonary method)によって投与される。選択される具体的経路は、治療される症状に依存する。好ましくは、共役複合体は、適当な担体、例えば当該技術分野で公知のもの（例えば第１世代／無修飾生物製剤に使用されるものであって、アルブミンを含まないもの、または賦形剤としてアルブミンを含むもの）、適当な希釈剤、例えばｉ．ｖ．、ｉ．ｍ．、またはｓ．ｃ．用の滅菌溶液とともに投与される。必要量は、治療される症状の重症度、患者個人の応答、使用される投与方法などに依存する。当業者は、その一般知識に基づいた正しい投与量を確定することができる。

別の態様によれば、本発明はまた、血友病Ａの治療剤の製造のための、タンパク質が第ＶＩＩＩ因子である、上記のＨＡＳ−（好ましくはＨＥＳ−）タンパク質共役複合体、または上記の方法によって得られるＨＡＳ−（好ましくはＨＥＳ−）タンパク質共役複合体の使用にも関する。

別の態様によれば、本発明はまた、ＡＴＩＩＩ遺伝的欠損、静脈閉塞症、熱傷および冠状動脈バイパス手術(coronary arterial bypass Graft (CABG) surgery)におけるヘパリン耐性、外傷または胃腸の手術から生じる腸穿孔；播種性血管内凝固（ＤＩＣ）および／または敗血症の治療用薬剤、並びに人工呼吸療法(ventilation therapy)に関連するマイクロクロット(micro-clot)形成の予防用薬剤の製造のための、上記のＨＡＳ−ＡＴＩＩＩ共役複合体または上記の方法によって得られるＨＡＳ−タンパク質共役複合体の使用にも関する。したがって、本発明のＨＡＳ−ＡＴＩＩＩ共役複合体を含む医薬組成物は、これらの目的に使用されうる。

別の態様によれば、本発明はまた、肺気腫、嚢胞性線維症、アトピー性皮膚炎、および／または気管支炎の治療用薬剤の製造のため、タンパク質がＡ１ＡＴである、上記のＨＡＳ−（好ましくはＨＥＳ−）タンパク質共役複合体、または上記の方法によって得られるＨＡＳ−（好ましくはＨＥＳ−）タンパク質共役複合体の使用にも関する。本発明のＨＡＳ−Ａ１ＡＴ−共役複合体を含む本発明の医薬組成物もまた、これらの目的に使用されうる。

別の態様によれば、本発明はまた、心筋梗塞（心臓発作）、血栓症、血栓塞栓症または閉塞性疾患、特に閉塞性動脈疾患の治療用薬剤の製造のため、タンパク質がｔＰＡである、上記のＨＡＳ−（好ましくはＨＥＳ−）タンパク質共役複合体、または上記の方法によって得られるＨＡＳ−（好ましくはＨＥＳ−）タンパク質共役複合体の使用にも関する。

別の態様によれば、本発明はまた、重症敗血症、血栓症、血栓塞栓症または閉塞性疾患、特に閉塞性動脈疾患の治療用薬剤の製造のため、タンパク質がＡＰＣである、上記のＨＡＳ−（好ましくはＨＥＳ−）タンパク質共役複合体、または上記の方法によって得られるＨＡＳ−（好ましくはＨＥＳ−）タンパク質共役複合体の使用にも関する。

別の態様によれば、本発明はまた、白血病（例えば有毛細胞白血病、慢性骨髄性白血病）、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、癌（例えばカルチノイド腫瘍、悪性黒色腫）および肝炎（例えば慢性Ｂ型肝炎および慢性Ｃ型肝炎）の治療用薬剤の製造のため、タンパク質がＩＦＮアルファである、上記のＨＡＳ−（好ましくはＨＥＳ−）タンパク質共役複合体、または上記の方法によって得られるＨＡＳ−（好ましくはＨＥＳ−）タンパク質共役複合体の使用にも関する。

別の態様によれば、本発明はまた、多発性硬化症、好ましくは再発性型の多発性硬化症の治療用薬剤の製造のため、タンパク質がＩＦＮベータである、上記のＨＡＳ−（好ましくはＨＥＳ−）タンパク質共役複合体、または上記の方法によって得られるＨＡＳ−（好ましくはＨＥＳ−）タンパク質共役複合体の使用にも関する。

本発明はさらに、急性骨髄性白血病、骨髄移植生着の失敗または遅延、流動を有する高齢者における骨髄移植または術前化学療法後の骨髄再構成、並びに自家末梢血前駆細胞の移植後の骨髄再構成用薬剤の製造のための、上記のＧＭ−ＣＳＦ−ＨＡＳ共役複合体の使用に関する。

本発明はまた、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子へのインヒビターを有する血友病Ａまたは血友病Ｂ患者におけるエピソードの治療用薬剤の製造のための、ＨＡＳ−第ＶＩＩ因子共役複合体の使用にも関する。

本発明はまた、血友病Ｂ（例えば先天性第ＩＸ因子欠乏症またはクリスマス病）を有する患者における出血性エピソードの制御および予防、例えば手術環境(surgical setting)における出血の制御および予防用薬剤の製造のための、ＨＡＳ−第ＩＸ因子共役複合体の使用にも関する。

本発明はさらに、共役複合体生成のための上述の温和な方法で、特に酵素酸化および／または側鎖の脱アミド化を回避するような方法でのトランスフェラーゼの使用に関する。

本発明はまた、糖タンパク質とポリマーまたはポリマー誘導体の間の共役複合体形成の第二の温和な方法にも関する。この第二の温和な方法によって、以下の段階を通してヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）と糖タンパク質（ＧＰＯ）の間の共役複合体が生成される：
ａ）少なくとも一つ、より好ましくは少なくとも二つの末端ガラクトース残基を含むＧＰＯを提供し、
ｂ）酵素ガラクトースオキシダーゼ（または関連酵素）の作用によって末端ガラクトース残基を酸化させて、反応性アルデヒド基を含む末端ガラクトース残基を形成し、
ｃ）段階ｂ）において得られるアルデヒド基と共有結合を形成することができる修飾ＨＡＳを提供し、並びに
ｄ）段階ｂ）のＧＰＯを段階ｃ）のＨＡＳと反応させる。このようにして、糖タンパク質の１分子あたり一つ以上のＨＡＳ分子を含むＨＡＳ−ＧＰＯ（各ＨＡＳは、糖タンパク質のＮ−グリカンまたはＯ−グリカンのガラクトース残基を通してＧＰＯと共役複合する）が生成される。そのようにして得られた共役複合体のグリカンには、シアル酸残基でない少なくとも一つの末端糖部位が含まれる。

この第二の温和な方法の段階ｂ）から得られる酸化されたガラクトース残基を有するＧＰＯは、本発明の第一の温和な方法の段階ｂ）のための適当な基質である。この場合において、官能基Ｚはアルデヒド基であり、そのためポリマーまたはその誘導体の官能基Ａには、構造−ＮＨ−のアミノ基が含まれうる。したがって、この第二の温和な方法の段階ｂ）から得られる酸化されたガラクトース残基を有するＧＰＯは、Ｚがアルデヒドである、例えば本明細書の２１から３５ページに記載されているいずれの方法においても用いられうる。そのため本発明はまた、本発明の第一の温和な方法の段階ｂ）において、この第二の温和な方法の段階ｂ）から得られる酸化されたガラクトース残基を有するＧＰＯを用いることによって得られうるすべてのＨＡＳ−ＧＰＯ共役複合体にも関する。

したがって、本発明はまた、Ｚがアルデヒドである、例えば本明細書の２１から３５ページに記載されている（特にその中で、ポリマーの適宜酸化された還元末端と反応することができる官能基Ａに、構造−ＮＨ−のアミノ基が含まれる）いずれの方法によっても得られうる方法および共役複合体にも関する。

ＧＰＯが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＦＮベータ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、ｔＰＡ、Ａ１ＡＴ、ＡＴＩＩＩ、ＨＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、ＩＬ−１５、抗体融合タンパク質、治療抗体、インターロイキン、特にインターロイキン２またはインターロイキン６、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、並びに第ＩＸ因子からなる群から選択され、好ましくはＧＰＯがＥＰＯであり、特にＥＰＯがヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有するのが好ましい。

好ましくは、グリコシル化ＥＰＯは組換えで生産される。これには、真核細胞、好ましくは哺乳類、昆虫、酵母またはグリコシル化ＥＰＯの組換え生産に都合のよいいずれの他の細胞型における生産も含まれる。さらに、ＥＰＯは、トランスジェニック動物において（例えば乳汁、血液などのような体液において）、トランスジェニック鳥（特に家禽、好ましくはひな鳥）の卵において、またはトランスジェニック植物において発現されうる。

グリコシル化ポリペプチドの組換え生産は、当該分野で公知である。一般に、これには、適当な発現ベクターを有する宿主細胞のトランスフェクション、グリコシル化ポリペプチドの生産が可能な条件下での宿主細胞の培養、および宿主細胞からのポリペプチドの精製が含まれる。詳細な情報については、Krystal, Pankratz, Farber, Smart, 1986, Purification of human erythropoietin to homogeneity by a rapid five-step procedure, Blood, 67(1), 71-9; Quelle, Caslake, Burkert, Wojchowski, 1989, High-level expression and purification of a recombinant human erythropoietin produced using a baculovirus vector, Blood, 74(2), 652-7; EP 640 619 B1およびEP 668 351 B1を参照。

好ましい態様において、ＥＰＯはヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有する（EP 148 605 B2参照）。ＥＰＯには、Ｎ結合型グリコシル化および／またはＯ結合型グリコシル化を通してＥＰＯに結合した一つ以上の糖側鎖（好ましくは１から４個、好ましくは４個）が含まれ、すなわちＥＰＯはグリコシル化されうる。通常、ＥＰＯが真核細胞において生産される場合、ポリペプチドは翻訳後にグリコシル化される。その結果、糖側鎖は、哺乳類（特にヒト）、昆虫または酵母細胞における生合成の間にＥＰＯに結合されうる。グリカンの末端シアル酸残基によるキャッピングが不足している宿主中でＥＰＯが生成されるのが好ましく、それによって末端ガラクトース残基が十分なＥＰＯが生成される。この不十分なシアル酸付加ＥＰＯは、本発明の第二の温和な方法における出発物質として、直接的に用いられうる。

ＥＰＯは、本発明の共役複合体のＧＰＯの例としてみなされるべきなので、もちろん、本発明のこの第二の温和な方法による共役複合体形成のための出発物質として用いられるべき他のＧＰＯの不十分なシアル酸付加型もまた、このような宿主中で生成されうる。エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＦＮベータ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、ｔＰＡ、Ａ１ＡＴ、ＡＴＩＩＩ、ＨＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、ＩＬ−１５、抗体融合タンパク質、治療抗体、インターロイキン、特にインターロイキン２またはインターロイキン６、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、並びに第ＩＸ因子からなる群から選択される糖タンパク質が特に好ましい。

本発明の温和な第二の方法（並びに本発明の第一の方法の段階ｂを合わせた、本発明の第二の方法の段階ａおよびｂの組合せ）によってもまた、酸化および／または脱アミド化による共役複合体の糖タンパク質部分への損傷がほとんどない共役複合体が生成される。

ＥＰＯの場合において、ペプチドマッピングによるこのような試験は、Eur. Phar. 4th edition (01/2002: 1316) pages 1123-1128に記載されている。メチオニン酸化とグルタミン／アスパラギン脱アミド化の両方とも回避されるのが最も好ましい。ＨＡＳは、ＥＰＯのようなＧＰＯに直接的に共役複合され、あるいはリンカー分子を通して共役複合されうる。適当なリンカー分子は、上記に記載されている。

本発明のＨＡＳ−ＧＰＯ共役複合体の好ましい態様によれば、該ＨＡＳを、結合したＮ−グリカンまたはＯ−グリカンのガラクトース残基を通して、ＧＰＯに共役複合させる。さらに、ＨＡＳ−ＧＰＯ（例えばＨＡＳ−ＥＰＯ）は、ＧＰＯ（例えばＥＰＯ）よりも大きなインビボ活性を示し、共役複合（非共役複合型ＧＰＯ）のための出発物質として用いられうる。インビボ生物活性の決定方法は、当該技術分野で公知である（上記を参照）。

非共役複合型ＧＰＯ（例えば非共役複合型ＥＰＯ）のインビボ活性を１００％に設定した場合に、ＨＡＳ−ＧＰＯ（例えばＨＡＳ−ＥＰＯ）共役複合体は、１１０％から３００％、好ましくは１１０％から２００％、より好ましくは１１０％から１８０％または１１０％から１５０％、最も好ましくは１１０％から１４０％のインビボ活性を示しうる。

アムジェンの十分にシアル酸付加されたＥＰＯ（EP 428 267 B1参照）と比較して、十分にシアル酸付加されたＥＰＯのインビボ活性を１００％に設定した場合に、ＨＡＳ−ＥＰＯは、十分にシアル酸付加されたＥＰＯの、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、より一層好ましくは少なくとも８５％または少なくとも９５％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％または少なくとも３００％のインビボ活性を示す。最も好ましくは、それは十分にシアル酸付加されたＥＰＯの少なくとも９５％のインビボ活性を示す。

いずれの理論にも結びつけられることは望んでいないが、本発明のＨＡＳ−ＥＰＯ共役複合体の高インビボ生物活性は、おそらくＨＡＳ−ＥＰＯ共役複合体が非共役複合型ＥＰＯよりも長く循環し続けるという事実に起因する。なぜなら、それは肝臓の除去系による認識が少なく、より高分子量のために腎クリアランスが減少されるからである。さらに、カップリングの温和な方法によって糖タンパク質部分への構造上の損傷が回避される。循環しているＥＰＯのインビボ半減期の決定方法は、当該技術分野で公知である(Sytkowski, Lunn, Davis, Feldman, Siekman, 1998, Human erythropoietin dimers with markedly enhanced in vivo activity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(3), 1184-8)。

本発明はさらに、人体または動物の体の治療方法に使用するための本発明のＨＡＳ−ＧＰＯ（例えばＨＡＳ−ＥＰＯ）に関する。さらに本発明は、本発明のＨＡＳ−ＧＰＯ（例えばＨＡＳ−ＥＰＯ）を含む医薬組成物に関する。好ましい態様において、医薬組成物にはエリスロポエチン療法に有用なさらなる少なくとも一つの医薬的に許容される希釈剤、添加剤および／または担体が含まれる。ＨＡＳ−ＧＰＯの濃度が１ｎＭより高いのが好ましい。より好ましくは、ＨＡＳ−ＧＰＯは、存在する全タンパク質の５％超、好ましくは１０％超、１５％超、２０％超、２５％超およびさらに５０％超を構成する。

このようなＧＰＯ試料が用いられうることが本発明の特別な利点であり、そうでなければそれは医薬製剤に使用するのに不適当であるとして廃棄される。特に、本発明は、医薬組成物の使用に適した修飾ＧＰＯの製造方法における出発物質として、十分にシアル酸付加された型のＧＰＯ（例えばＥＰＯ）と比較してわずか７０％のインビボ生理活性を有する、前記ＧＰＯ（特にＥＰＯ）の使用に関する。

ＥＰＯの場合において、このことは、European Pharmacopeia 4, Monography 01/2002:1316に記載されている手順に従った正常ヘム細胞マウス系(normocytohaemic mouse system)によって測定されるように、１０００００Ｕ／ｍｇ未満、またはさらに６００００Ｕ／ｍｇ未満、例えば５００００Ｕ／ｍｇ未満、またはさらに４００００Ｕ／ｍｇ未満、例えば３００００Ｕ／ｍｇ未満または２００００Ｕ／ｍｇ未満のＥＰＯタンパク質のインビボ生理活性を示すか、あるいは検出可能なインビボ生理活性さえも示さない出発物質としてでも、ＥＰＯ試料が用いられうることを意味する。

本発明のＧＰＯ−ＨＡＳ共役複合体は、不十分なシアル酸付加出発物質のＧＰＯと比較してインビボ生理活性における著しい増加を示す。該増加は、典型的には１，５〜２５倍の範囲内、より典型的には２〜１０倍の範囲内であるが、大部分は３〜８倍である。しかしながら、本発明の方法によって、検出可能なインビボ生理活性を示さない不十分なシアル酸付加型が、十分にシアル酸付加されたＧＰＯに匹敵するか、またはそれより高いインビボ生理活性を示すＧＰＯ−ＨＡＳ共役複合体にまで変換されうることが指摘される。

本明細書に用いられる「治療上の有効量」とは、所定の症状および投与計画について治療上の効果を与える量をいう。エリスロポエチンアイソフォームの投与は、好ましくは非経口経路によってなされる。選択される具体的経路は、治療される症状に依存する。

ＥＰＯの場合において、エリスロポエチンアイソフォームの投与は、適当な担体（例えば、ヒト血清アルブミン）、適当な希釈剤（例えば、緩衝生理食塩水）、および／または適当な添加剤を含む製剤の一部として行うのが好ましい。必要な用量は、患者のヘマトクリットを増大するのに十分な量であり、治療される症状の重症度、用いられる投与方法などに依存して変わる。

本発明の医薬ＥＰＯ組成物による治療の目的は、好ましくは血液中のヘモグロビン値を６．８ｍｍｏｌ／ｌ以上に増大させることである。このために、該医薬組成物は、ヘモグロビン値が一週間あたり０．６ｍｍｏｌ／ｌから１．６ｍｍｏｌ／ｌの間で増大する方法で投与されうる。ヘモグロビン値が８．７ｍｍｏｌ／ｌを超える場合、該療法は、好ましくはヘモグロビン値が８．１ｍｍｏｌ／ｌ未満になるまで中断されるべきである。

本発明の組成物は、皮下、静脈内、または非経口の注射に適当な製剤で使用されるのが好ましい。このために、適当な賦形剤および担体は、例えばリン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、塩素酸ナトリウム、ポリソルベート８０、ＨＳＡ、および注射用の水である。該組成物は、週３回、好ましくは週２回、より好ましくは週１回、および最も好ましくは２週間ごとに投与されうる。

好ましくは、該医薬組成物は、０．０１〜１０μｇ／ｋｇ（患者の体重）、より好ましくは０．１〜５μｇ／ｋｇ、０．１〜１μｇ／ｋｇ、または０．２〜０．９μｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．３〜０．７μｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．４〜０．６μｇ／ｋｇ（体重）の量で投与される。一般に、好ましくは１０μｇから２００μｇの間、好ましくは１５μｇから１００μｇの間で、１用量当たり投与される。

本発明はさらに、貧血性障害もしくは造血機能不全障害またはその関連疾患の治療剤の製造のための、本発明のＨＡＳ−ＥＰＯの使用に関する。本発明はさらに、実施例によって以下に記載され、それは本発明のいずれの方法に限られるものと解釈されるべきではない。

実施例
Ａ．物質
Ａ１．化学物質
Ｈ_２ＳＯ_４(#K027.1)、ＮａＯＨ(#K021.1)、リン酸水素二ナトリウム二水和物(#4984.1)およびリン酸二水素ナトリウム二水和物(#T879.2)をCarl Roth GmbH Karlsruhe, Germanyから入手し、ガラクトースオキシダーゼ（４５０ユニット；#7907）およびカタラーゼ（１，４ｍｇ／ｍｌ；５５６００ユニット／ｍｇ；#C-3556）をシグマから入手し、Ｌ−メチオニン(#64391)をFlukaから入手し、プロテアーゼインヒビターロイペプチン(#1017101)、ペプスタチン(#253286)、アプロチニン(#236624)、ＴＬＣＫ(#874485)およびプレファブロックＳＣ(Prefabloc SC)(#429868)をロシュから入手した。

プレファブロックＳＣ溶液を用いる場合、それを使用直前に製造した。以下に明記される量を、４６μｌプロテアーゼインヒビター混合物を製造するために用いた（ロイペプチン水溶液（１ｍｇ／ｍｌ、３μｌ）、ペプスタチンのエタノール溶液（１ｍｇ／ｍｌ、１５μｌ）、アプロチニン水溶液（２ｍｇ／ｍｌ、０，５μｌ）、ＴＬＣＫ水溶液（２０ｍｇ／ｍｌ、２，５μｌ）およびプレファブロックＳＣ水溶液（４０ｍｇ／ｍｌ、２５μｌ、調製直後の溶液）。

Ｂ．方法
Ｂ１．ＥＰＯ（糖タンパク質）の限定的な／完全な酸加水分解のための手順（マスクされていない（末端）ガラクトース残基の生成について）
ＥＰＯの低濃度緩衝液（０．５〜２．５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍＭＮａ−リン酸ｐＨ７．０）を、水浴セット中８０℃で加熱する；それに並行して、校正された温度計を備えているバイアルをインキュベートする；温度が７５℃に達した後、該サンプルを、１ＮＨ_２ＳＯ_４で０．１ＮＨ_２ＳＯ_４に入れる。この温度でのインキュベーションを、０、４、１０および６０分間行い、その時間の後、該サンプルを１ＮＮａＯＨを用いて中和し、水浴中で０℃まで冷却する。該サンプルを直ちにさらなる工程段階のために用いるか、または液体窒素中で凍結した後−８０℃で保管する。

Ｂ２．ビバスピン濃縮ユニットを用いた緩衝液交換
ガラクトースオキシダーゼ段階の前に、ＥＰＯサンプルを、ビバスピン濃縮ユニットを用いてＮａ−リン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．２）への緩衝液交換に付す（１０，０００Ｄａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ））。６ｍｌまたは２０ｍｌ体積を、「メガフュージ(Megafuge)１．Ｒ」遠心分離機(Kendro)を用いて４０００ｒｐｍで、または類似の装置を用いて４〜８℃で製造者の指示書に従って処理する。遠心分離の前にタンパク質サンプルをＮａ−リン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．２）で調整することをそれぞれ行って、少なくとも３回ビバスピン遠心分離段階を行う。最終のＥＰＯサンプルを、SOP-AA-018-01/02に従ってＥＵＲ．ＰＨａｒ法を使用することによって濃縮する。

Ｂ３．糖タンパク質のシアル酸含有量の決定
組換えヒトＥＰＯのシアル酸含有量の定量のために記載される方法が用いられ（Ｅｕｒ．Ｐｈａｒ）、それを標準操作手順書SOP-AA-052-01/00に従って行う。６０分間加水分解に付されるＥＰＯについて予想される低いシアル酸の値については補正はしない。Ｅｕｒ．Ｐｈａｒ．に従った比色試験によって、シアル酸含有量についてＨＰＡＥＣ−ＰＡＤマッピングよりも高い値が得られることが分かったが、これはおそらく該方法の一定の非特異性によるものであろう。

Ｂ４．ＥＰＯサンプルのガラクトースオキシダーゼ処理
Ｂ４．１ガラクトースオキシダーゼのプレインキュベーション
市販のガラクトースオキシダーゼには、イオン交換クロマトグラフィーによって除去できる特定のプロテアーゼが含まれうる。あるいは、これらのタンパク質分解酵素は、以下のように、上述のプロテアーゼインヒビター混合物の存在下でのプレインキュベーションによって不活性化される：ガラクトースオキシダーゼ４００〜４５０Ｕ／ｍｌの一定分量（５００μｌ）（製造者の指示書に従った）を、プロテアーゼインヒビター混合物（４６μｌ）に混合し、３７℃で１時間インキュベートした。

このインキュベーション段階の後、該プロテアーゼインヒビターをビバスピン濃縮器を用いて部分的に除去した（１０．０００ＤａＭＷＣＯ）。プレインキュベートしたガラクトースオキシダーゼを、Ｎａ−リン酸緩衝液（４５０μｌ、２０ｍＭ、ｐＨ７．２）で二度沈降させた。続いて濃縮ユニットをＮａ−リン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．２）ですすぎ、次いで溶液を４５０ユニットのガラクトースオキシダーゼ／４００μｌに調整した。次の段階について、ＥＰＯサンプル１ｍｌあたり、２３．５μｌのガラクトースオキシダーゼ（４５０ユニット／４００μｌ）（＝２６．４ユニット）のＮａ−リン酸緩衝溶液（２０ｍＭ、ｐＨ７．２）を用いた。

Ｂ４．２ガラクトースオキシダーゼ反応
ＥＰＯサンプルを、１０ｍＭメチオニンの最終濃度まで調整し（ポリペプチド酸化に対する保護のため）、カタラーゼ（２．３５μｌ、６２００ユニット／２００μｌ）およびプレインキュベートしたガラクトースオキシダーゼ（２３．５μｌ）を加え、３７℃で１２〜１８時間インキュベートした。インキュベーション後、一定分量の該サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけた。該サンプルを次いでイオン交換クロマトグラフィーに付した。

Ｂ５．ＥＰＯおよびＥＰＯ誘導体の精製のためのイオン交換クロマトグラフィー：
ＥＰＯサンプルの精製を、ポンプＰ−９０３、０．６ｍｌのチャンバーを備えたミキサーＭ−９２５、１０ｍｍのフローセルを備えたモニターＵＶ−９００、モニターｐＨ／Ｃ−９００、フラクションコレクターＦｒａｃ−９００、サンプルループ（２ｍｌ）、並びにユニコーンソフトウェア(Unicorn software)バージョン３．２１からなるＡＫＴＡエクスプローラー１０システム（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて、室温で行った。Ｑ−セファロースファーストフロー(Q-Sepharose Fast Flow)（５ｍｌ）を含むカラムを、１０ＣＶの緩衝液Ａ（２０ｍＭＮ−モルフォリノプロパンスルホン酸／ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ８．０）と平衡にした。ＥＰＯサンプルを、緩衝液Ａで１：１０に希釈して最終的にｐＨ７．８〜８．２まで調整し、流速１ｍｌ／分でサンプルポンプを用いて注入した。緩衝液Ａ（１０ｍＬ）でサンプルポンプを洗浄した後、カラムを６ＣＶの緩衝液Ａを用いて流速１．０ｍｌ／分でさらに洗浄した。続いて、流速０．８ｍｌ／分で４容積の緩衝液Ｂ（２０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ６．５）で洗浄し、ＥＰＯを、急勾配の０〜４０％緩衝液Ｃ（０．５ＭＮａＣｌの２０ｍＭリン酸Ｎａ溶液、ｐＨ６．５）を用いて３７分以内に溶離した。溶離プロファイルを、２０６、２６０および２８０ｎｍ吸光度で記録した。溶離の完了後、カラムを緩衝液Ｃ（２５ｍｌ）によって流速１ｍｌ／分で再生した。最後に、カラムを１ＭＮａＯＨを用いて６０分間動かし、緩衝液Ｃで再生し(reconditioned)、さらなる使用まで保管した。ＥＰＯを含む画分の３〜４プールをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。

Ｂ６．イオン交換クロマトグラフィー後のＥＰＯからの緩衝塩の除去
後のＨＥＳ修飾反応のためのＥＰＯ濃縮および緩衝液交換のために、イオン交換クロマトグラフィーの後に得られるＥＰＯサンプルを、段落Ｂ２で記載したものに類似するビバスピン脱塩処理に付した。ＥＰＯサンプルを、３〜５ｍｇ／ｍｌの最終的なタンパク質濃度まで濃縮し、４容積の酢酸Ｎａ（０，１Ｍ、ｐＨ５．５）で３倍に希釈し、各希釈段階の後にビバスピン濃縮器（６ｍｌまたは２０ｍｌ濃縮ユニット）を用いて４０００ｒｐｍで再濃縮した。タンパク質を次いで濃縮ユニットから除去し、２〜４ｍｇ／ｍｌに調整した。最終的に生じるタンパク質濃度を、Ｅｕｒ．Ｐｈａｒに従って決定した（ＯＤ２８０ｎｍ）。該タンパク質を２４時間以内にＨＥＳ修飾に用い、そのときまで０℃で氷水中に保管した。（より長時間のサンプルの保管のために、無菌化濾過(sterile filtration)を要求してもよく、あるいはサンプルをＰＢＳ中でｐＨ７．２まで調整した後、液体窒素中で凍結し、その後−８０℃で冷凍保存しうる）。

Ｂ７．ヒドロキシルアミノＨＥＳ５０／０．７の合成
ＨＥＳ５０／０．７（５ｇ、Ｌｏｔ．３０４、ＭＷ＝４７０００Ｄ、ＤＳ＝０．７６、超分子の非経口コロイド GmbH, Rosbach-Rodheim, D）を、酢酸ナトリウム緩衝液（４０ｍｌ、０．１Ｍ、ｐＨ５．２）に溶解し、Ｏ−［２−（２−アミノオキシエトキシ）−エチル］−ヒドロキシルアミン（１０ｍｍｏｌ）を加えた。２６時間２２℃で振動させた後、反応混合物を２００ｍｌの氷冷したアセトンおよびエタノールの１：１混合物（ｖ／ｖ）にゆっくり加えた。沈殿した生成物を０℃で遠心分離によって収集し、３０ｍｌの氷冷したアセトンおよびエタノールの１：１混合物（ｖ／ｖ）で洗浄し、水（５０ｍｌ）に再溶解し、水に対して２日間透析し（スネークスキン(SnakeSkin)透析用チューブ、３．５ｋＤカットオフ、Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D）、凍結乾燥した。単離した生成物の収率は７９％であった。

Ｂ８．ヒドロキシルアミノＨＥＳ５０／０．７のＥＰＯへの共役複合
段階Ｂ６の酸化されたＥＰＯの酢酸ナトリウム緩衝溶液（２．４５ｍｌ、０．１Ｍ、ｐＨ５．５、１．６３３ｍｇ／ｍｌ）に、ヒドロキシルアミノＨＥＳ５０／０．７（３３３ｍｇ、段階Ｂ７から）の同じ緩衝溶液（２．４５ｍｌ）を加え、混合物を２３．５時間２２℃で穏やかに振動させた。反応混合物を次いでＦＰＬＣによって精製し、ゲル電気泳動法によって分析した。

Ｂ９．ビバスピン濃縮器を用いた緩衝液交換
ＨＥＳ修飾ＥＰＯおよび適当なコントロールのインキュベーションからのＥＰＯを、上記のようにビバスピン濃縮器（５ｍｌ、１０，０００ＤａＭＷＣＯ）および４０００ｒｐｍ、６℃での遠心分離を用いて緩衝液交換に付した。サンプル（１〜５ｍｇのＥＰＯタンパク質）を０．５〜１．５ｍｌまで濃縮し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．１±０．２）で５ｍｌまで希釈し、遠心分離によって１０倍の濃縮に付した。各サンプルを、濃縮と希釈のサイクルに３回付した。最終的に、サンプルを取り出し、濃縮ユニットをＰＢＳ（２ｘ０．５ｍｌ）で洗浄した。サンプルを液体窒素中、約１．２ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で凍結した。最終的なＥＰＯ溶液中のタンパク質濃度を、欧州薬局方（エリスロポエチン濃縮溶液、４版、２００２、１１２３−１１２８頁）に記載されているように、７．４３の特定の吸光度値を用いて２８０ｎｍで吸光度を測定することによって決定した。あるいはタンパク質濃度を、国際ＢＲＰバッチＩＩリファレンスＥＰＯ試料(International BRP batch II reference EPO preparation)を標準として用いたＲＰ−ＨＰＬＣによっても決定した。

Ｂ１０．組換えポリペプチドＮ−グリコシダーゼ（Roche, Penzberg, Germany）によるＮ結合型オリゴ糖の遊離
一定分量（２００〜６００μｇ）の天然の、完全もしくは部分的に脱シアル化されたＥＰＯサンプル、またはガラクトースオキシダーゼ処理したＥＰＯサンプルのリン酸Ｎａ緩衝溶液（５０ｍＭ、ｐＨ７．２）に、組換えポリペプチドＮ−グリコシダーゼ（２５μｌ）を加えた（Roche, Penzberg, Germany；２５０ユニット／２５０μｌ）。反応混合物を３７℃で１２〜２４時間インキュベートした。インキュベーションを開始して１２〜１４時間後に、時折、ポリペプチドＮ−グリコシダーゼ（５〜１０μｌ）を加えた。Ｎ−グリコシド結合したオリゴ糖の放出を、還元条件下でのタンパク質（５〜１０μｇ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に続いて、クマシー・ブルー（Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany）によるタンパク質バンドの染色によって調べ、それによってＥＰＯタンパク質バンドの、脱Ｎ−グリコシル化ＥＰＯ型の泳動位置への明確なシフトが検出された。

Ｂ１１．ＲＰ−ＨＰＬＣによる脱Ｎ−グリコシル化ＥＰＯタンパク質からのＮ結合型オリゴ糖およびＨＥＳ修飾グリカンの分離
Ｐ６８０ＡＨＰＧポンプ、デガシス(Degasys) ＤＧ１２１０脱気システム、オートサンプラー(Automated Sample Injector ASI-100)、サンプルループ（２５０μｌ）、カラムサーモスタッターデパートメントＴＣＣ１００(column thermostatter department TCC 100)、並びにＵＶ／Ｖｉｓ−ＤｅｔｅｋｔｏｒＵＶＤ１７０Ｕからなる、Dionex GmbH(Idstein, Germany)によって提供されるＨＰＬＣシステムを用いて、ＨＥＳ修飾および無修飾ＥＰＯタンパク質サンプルからのすべての脱Ｎ−グリコシル化ＥＰＯサンプルの分離を室温で行った。より多くの量のタンパク質（＞１ｍｇ）については、ポンプＰ−９０３、０．６ｍｌのチャンバーを備えたミキサーＭ−９２５、モニターｐＨ／Ｃ−９００、ポンプＰ−９５０（サンプルポンプ）並びにソフトウェアユニコーン(Software Unicorn)バージョン３．２１を備えているＡＫＴＡエクスプローラー１０システムを用いた。１０ｍｍのフローセルを備えたモニターＵＶ−９００を用いて、ピークの検出は２８０、２２０および２０６ｎｍであった。

ＨＥＳ化ＥＰＯ（０．１〜０．６ｍｇ）のＰＮＧアーゼ消化の一定分量を、プレカラム（例えば、ＣＣ８／４ヌクレオシル(Nucleosil) １２０−５Ｃ４, Macherey-Nagel, Kat. Nr. 721889.40）を備えているＥＣ２５０／４．６ヌクレオシル１２０−５Ｃ４ＲＰカラム(Macherey-Nagel, Germany Cat. Nr. 720096.46)に注入した。

カラムを５％溶離液Ｂ（０．１％ＴＦＡ、９０％アセトニトリル）の２−４ＣＶと平衡にした。脱Ｎ−グリコシル化ＥＰＯ型のサンプル（２５０μｌ）を次いで注入し、サンプルループを５％溶離液Ｂ（８ｍｌ）で洗浄した。５％溶離剤Ｂの０．２ＣＶによるカラムの洗浄後、溶離液Ｂを５％から５０％に直線的に１８分かけてグラジエントをかけた。カラムの溶離をグラジエントで６６％溶離液Ｂまで継続し（２０分かけて）、その後１００％の溶離液Ｂを３分かけて流し、該カラムを１００％溶離液Ｂでさらに５分間洗浄した。画分を１分ごとに（１ｍｌ）収集した。

無修飾のオリゴ糖を貫流から回収し、約２５％溶離液Ｂの濃度で溶離する画分からのＨＥＳ化ＥＰＯの場合は、ＨＥＳ化Ｎ−グリカンが含まれていた。該タンパク質は５３％の濃度の溶離液Ｂ４〜６ｍｌで溶離した。

オリゴ糖を含む画分を中和し、スピードバック(speed-vac)濃縮器中で濃縮するか、または凍結乾燥した。グリカンサンプルをハイパーカーブ(HyperCarb)カートリッジ（１００または２００ｍｇ）を用いて以下のように脱塩した：使用前に、該カートリッジを０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡの８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル溶液（５００μｌ）で３回洗浄し、続いて水（５００μｌ）で３回洗浄した。カートリッジに注入する前に、サンプルを少なくとも３００μｌの最終的な体積まで水で希釈した。これらを水で厳密に洗浄した。オリゴ糖を０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡを含有する２５％アセトニトリル（１．２ｍｌ）で溶離した。溶離したオリゴ糖を２ＭＮＨ_４ＯＨで中和し、スピードバック濃縮器中で乾燥した。これらをさらなる使用まで−８０℃でＨ_２Ｏ中に保管した。

ＨＥＳ修飾Ｎ−グリカンを中和し、スピードバック濃縮器中で乾燥するか、または凍結乾燥し、これらをビバスピン濃縮ユニット（５，０００ｋＤａカットオフ）を用いて脱塩し、物質を水（２００〜５００μｌ）に溶解し、さらなる分析的使用まで保管した。

結果
１末端シアル酸残基の除去のための十分にシアル酸付加されたＥＰＯサンプルの酸処理
医薬品グレードＥＰＯのサンプルを実施例Ｂ１に記載されるように処理し、反応を様々な時点で止めた。サンプルＦ４８ａ−ＩＩ（最終生成物Ｆ９９を生じる）を６０分間処理し、サンプルＦ４８ａ−ＩＩＩを１０分間酸処理し（Ｇ０１）、サンプルＦ４８ａ−ＩＶを４分間処理し（Ｇ０２）、サンプルＦ４８ａ−Ｖを０分間処理し（Ｇ０３）、およびサンプルＦ４８ａ−ＶＩを酸処理に付さないでコントロールとして用いた（Ｇ０４）。実施例Ｂ２に記載される緩衝液交換の後、一定分量の酸処理したＥＰＯサンプルをＢ１０に記載されるように分析し、サンプルＧＴ０１２ａ−Ｉ、すなわち非常に低いインビボ生理活性を有する組換えＥＰＯ試料からの不十分なシアル酸付加副画分(side fraction)と比較した。図２に示されるように、酸処理によって分子量におけるシフトがもたらされ（レーンＣをＤと比較し、およびレーンＥをＦと比較せよ）、このことは酸処理が末端シアル酸残基の除去に有効であることを示している。

２脱Ｎ−グリコシル化ＥＰＯポリペプチドから遊離したＮ−グリカンのＲＰ−ＨＰＬＣ分離
上述の一定分量を、Ｂ９に記載される緩衝液交換およびＢ１０に記載されるＰＮＧアーゼ処理に付した。脱Ｎ−グリコシル化ＥＰＯ型を、遊離したＮ−グリカンからＲＰ−ＨＰＬＣによって分離し（実施例Ｂ１１に記載されているように）、生じたオリゴ糖画分をさらなる分析に付した。ＰＮＧアーゼ処理したＥＰＯ型のＲＰ−ＨＰＬＣ後に得られたオリゴ糖画分を脱塩し、０，５〜３ナノモルに対応する一定分量を、実施例Ｂ１１に記載されるＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析に付した。無処理のＥＰＯのＮ−グリカンのマッピングによって、図１、パネル４に示されるオリゴ糖パターンが生じた。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにおけるピーク応答に基づいて、０．５％のオリゴ糖ピーク領域をシアル酸付加されていないグリカンの領域において検出し（１２．５〜１８分）、モノシアル酸付加グリカン（２１〜２５分）、１１．３％ジシアル酸付加グリカン（２６〜３０．５分）、２８．１％トリシアル酸付加グリカン（３３〜３８分）および５８．７％テトラシアル酸付加グリカン（３９〜４５分）の領域において、１．３％のオリゴ糖ピーク領域を検出した。

Ｆ９８サンプル（図１のパネル１）において、生じたＮ−グリカンは以下のように溶離した：非シアロに１．５％、モノシアロに１８．８％、ジシアロに４１．２％、トリシアロに３２．２％、およびテトラシアロにわずか６．４％。

これらの値は、酸を介したシアル酸除去に４分間付したサンプル（Ｇ０２、図１のパネル３）に非常に類似している。Ｆ９８サンプルにおいて、生じたＮ−グリカンは以下のように溶離した：非シアロに２．８％、モノシアロに１７．５％、ジシアロに３４．９％、トリシアロに３１．６％、およびテトラシアロに１３．１％。

それと比較して、６０分間の酸を介したシアル酸除去によって、末端シアル酸残基はほとんど完全に除去される（図１のパネル２）。Ｆ９９サンプルにおいて、生じたＮ−グリカンは以下のように溶離した：非シアロに９３％、モノシアロに４．８％、ジシアロに２．３％。トリシアロおよびテトラシアロにおけるシグナルは無視できるものであった。

上記のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析によってサンプルのシアル酸含有量について得られる値は、Ｐｈａｒ．Ｅｕｒ．標準方法で得られる値から幾分はずれている。この方法で得られる値を以下の表に示す：
表：後のガラクトースオキシダーゼおよびＨＥＳ修飾のためのＥＰＯ試料のシアル酸決定

事前の酸処理がなくても、無処理のサンプルＧＴＯ０１２ａ−Ｉが不十分なシアル酸付加糖タンパク質型の高い値を示すことは興味深い（パネル４）。このことは、この型には末端シアル酸残基の代わりに末端ガラクトース残基が含まれうることを意味している。

３ＨＥＳ化に備えたＥＰＯサンプルのガラクトースオキシダーゼ処理
ＨＥＳ化ガラクトース酸化ＥＰＯ画分（段階Ｂ１０の後）を、精製および無菌化濾過された最終ＥＰＯ試料の比較ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって分析した。

図３から理解されうるように、サンプルＢ、Ｃ、Ｄ、およびＥを効率よくＨＥＳ化した。共有結合的にＨＥＳ修飾されていることを除いて、これらの異なるシアル酸含有量のため、これらはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてわずかに異なる分子量分布を有する。サンプルＥにおいて、微量の無修飾ＥＰＯに対応するかすかなバンドが見える。十分にシアル酸付加されたＥＰＯ型Ｇ０３およびＧ０４（レーンＦおよびレーンＧ）はＨＥＳ修飾されていない。サンプルＦ９８およびＧ０２は、十分な（テトラシアル酸付加）Ｎ−グリカンをいくつか有しており、これらのＥＰＯ試料の一部は、１つ（または２つ）のＮ−グリコシル化部位でＨＥＳ修飾が不足し、それによってＦ９９およびＧ０１と比較して低分子量のＨＥＳ修飾型が生じると考えられる。

４Ｎ−グリカンでの修飾ＥＰＯ型のＨＥＳ化
ガラクトースオキシダーゼ処理に続いて、緩衝液交換（段階Ｂ６）した後に得られるＥＰＯ画分を、ヒドロキシルアミノＨＥＳ５０／０．７と共役複合させ（段階Ｂ８）、緩衝液交換によるさらなる分析のために調製した（段階Ｂ９）。図４において、Ｎ−グリカンでＨＥＳ修飾が起こることが確認された。一定分量のサンプルを、ポリペプチドＮ−グリコシダーゼ（ＰＮＧアーゼ）処理によって脱Ｎ−グリコシル化に付した（実施例Ｂ１０を参照）。ＰＮＧアーゼ処理前および処理後の一定分量のサンプル（５〜１０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に付した。図４に示されるように、サンプルＦ９８、Ｆ９９、Ｇ０１、Ｇ０２、Ｇ０３およびＧ０４は、ＰＮＧアーゼとともにインキュベーションした後、Ｏ−グリコシル化ＥＰＯ型を生じた。脱Ｎ−グリコシル化ＥＰＯ型のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンにおける変化は、Ｆ９８、Ｆ９９、Ｇ０１〜Ｇ０４におけるＯ−グリカン部位の脱シアリル化の程度が異なっているためである。

結論として、ガラクトースオキシダーゼで酸化されたＥＰＯのＨＥＳ化の成功は、以前は末端シアル酸残基を除去する酸段階によって処理されていなかったサンプルＦ９８の場合であっても可能であった。したがって、アミノ基含有ＨＡＳとの共役複合に利用できるガラクトースオキシダーゼによる処理の後に、このＥＰＯサンプル（標準のシアル酸含有量よりも低い含有量を有するＥＰＯ試料）には、遊離のアルデヒド基を与えるかなりの量の末端が露出したガラクトース残基が含まれていることが分かった。該インビボデータによって、約２０００００Ｕ／ｍｇのこの共役複合体の特定の活性についての値が得られ、そのため、これは十分にシアル酸付加された型のＥＰＯ（１２００００〜１３００００Ｕ／ｍｇ）よりもさらに高い。したがって、「がらくた」の画分のＥＰＯを、治療上の使用に適した高活性タンパク質へと変換させることができた。

図１は、酸処理によるシアル酸残基の除去を受けた（２および３）、または受けていない（１および４）ＥＰＯ試料から得られる、天然のＮ結合型オリゴ糖のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析を示す。１は、ＥＰＯ試料Ｆ９８から得られる全Ｎ結合型オリゴ糖を表す。２は、ＥＰＯ試料Ｆ９９から得られるオリゴ糖を表す。３は、ＥＰＯ試料Ｇ０２から得られるオリゴ糖を表す。４は、ＥＰＯ試料Ｇ０４から得られるオリゴ糖を表す。図１において、太字のローマ数字は、以下を表す：０は、中性(neutral)のオリゴ糖画分を表し、Ｉは、モノ付加オリゴ糖画分（１シアル酸）を表し、ＩＩは、ジ付加オリゴ糖画分（２シアル酸）を表し、ＩＩＩは、トリ付加オリゴ糖画分（３シアル酸）を表し、ＩＶは、テトラ付加オリゴ糖画分（４シアル酸）を表す。

図２は、実施例Ｂ４に記載されるガロックス(Galox)による酸化前および酸化後の、異なるＥＰＯ試料のＳＤＳページ分析を示す。ゲル電気泳動法については、エクセルシュアロックミニセル(XCell Sure Lock Mini Cell)（Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D）システムを用いた。還元条件で、ＭＯＰＳＳＤＳランニング緩衝液(MOPS SDS running buffer)とともに、１０％ビス−トリスゲル（NP0301BOX）を（両方ともInvitrogen GmbH, Karlsruhe, D）、供給者の指示に従って用いた。レーンは以下を表す：ＭＷＳｔｄ：タンパク質着色マーカーＳＤＳ−ＰＡＧＥスタンダード（Bio-RAD, cat. 161-0305, lot 99393）；上から下までの分子量マーカー：１０９ｋＤ、９４ｋＤ、５１，７ｋＤ、３５．９ｋＤ、２９．５ｋＤ、２１．８ｋＤ；ＡおよびＢ：ガロックス後（Ａ）およびガロックス前（Ｂ）のＥＰＯ試料Ｆ９８Ａ；ＣおよびＤ：ガロックス後（Ｃ）およびガロックス前（Ｄ）のＥＰＯ試料Ｆ９９；ＥおよびＦ：ガロックス後（Ｅ）およびガロックス前（Ｆ）のＥＰＯ試料Ｇ０１；ＧおよびＨ：ガロックス後（Ｇ）およびガロックス前（Ｈ）のＥＰＯ試料Ｇ０２；ＩおよびＪ：ガロックス後（Ｉ）およびガロックス前（Ｊ）のＥＰＯ試料Ｇ０３

図３は、実施例３に従って製造されたＨＥＳ−ＥＰＯ共役複合体のＳＤＳページ分析を示す。ゲル電気泳動法については、エクセルシュアロックミニセル（Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D）システムを用いた。還元条件で、ＭＯＰＳＳＤＳランニング緩衝液とともに、１０％ビス−トリスゲル（NP0301BOX）を（両方ともInvitrogen GmbH, Karlsruhe, D）、供給者の指示に従って用いた。レーンは以下を表す：Ａ：タンパク質着色マーカーＳＤＳ−ＰＡＧＥスタンダード（Bio-RAD, cat. 161-0305, lot 99393）上から下までの分子量マーカー：１０９ｋＤ、９４ｋＤ、５１，７ｋＤ、３５．９ｋＤ、２９．５ｋＤ、２１．８ｋＤ；Ｂ：ＥＰＯ試料Ｆ９８Ｃ：ＥＰＯ試料Ｆ９９Ｄ：ＥＰＯ試料Ｇ０１Ｅ：ＥＰＯ試料Ｇ０２Ｆ：ＥＰＯ試料Ｇ０３Ｇ：ＥＰＯ試料Ｇ０４Ｈ：分子量スタンダード（レーンＡを参照）。

図４は、ポリペプチドＮ−グリコシダーゼによるＮ結合型オリゴ糖の除去前および除去後の、Ｑ−セファロース精製ＨＥＳ修飾ＥＰＯ試料Ｆ９８−Ｇ０４のＳＤＳページ分析を示す。エクセルシュアロックミニセル（Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D）システムを用いた。還元条件で、ＭＯＰＳＳＤＳランニング緩衝液とともに、１０％ビス−トリスゲル（NP0301BOX）を（インビトロジェン GmbH, Karlsruhe, Dによる供給）、供給者の指示に従って用いた。レーンは以下を表す：レーンＭＷＳｔｄ：タンパク質着色マーカーＳＤＳ−ＰＡＧＥスタンダード（Bio-RAD, cat. 161-0305, lot 99393）上から下までの分子量：１０９ｋＤ、９４ｋＤ、５１，７ｋＤ、３５．９ｋＤ、２９．５ｋＤ、２１．８ｋＤ、ＡおよびＢ：Ｎ−グリコシダーゼによる処理前（Ａ）および処理後（Ｂ）のＥＰＯ試料Ｆ９８；ＣおよびＤ：Ｎ−グリコシダーゼによる処理前（Ｃ）および処理後（Ｄ）のＥＰＯ試料Ｆ９９；ＥおよびＦ：Ｎ−グリコシダーゼによる処理前（Ｅ）および処理後（Ｆ）のＥＰＯ試料Ｇ０１；Ｇ：Ｎ−グリコシダーゼによる処理をしないＥＰＯＢＲＰスタンダードバッチＩＩ；ＨおよびＩ：Ｎ−グリコシダーゼによる処理前（Ｈ）および処理後（Ｉ）のＥＰＯ試料Ｇ０２；ＪおよびＫ：Ｎ−グリコシダーゼによる処理前（Ｊ）および処理後（Ｋ）のＥＰＯ試料Ｇ０３；ＬおよびＭ：Ｎ−グリコシダーゼによる処理前（Ｌ）および処理後（Ｍ）のＥＰＯ試料Ｇ０４；Ｎ：Ｎ−グリコシダーゼによる処理をしないＥＰＯＢＲＰスタンダードバッチＩＩ

Claims

糖タンパク質およびポリマーもしくは前記ポリマーの誘導体を含む共役複合体の製造方法であって、その中で該ポリマーはヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）であり、
ａ）糖タンパク質と修飾ポリオールの間の共有結合の形成を触媒することができるトランスフェラーゼの存在下、前記糖タンパク質を、共有結合によって結合した官能基Ｚを有する前記修飾ポリオールと反応させて、共有結合によって結合した少なくとも一つの官能基Ｚを有するポリオールに共有結合した糖タンパク質を生じる段階、並びに
ｂ）該ポリマーまたはその誘導体の少なくとも一つの官能基Ａを、段階ａ）の間に前記糖タンパク質に加えた糖タンパク質の少なくとも一つの官能基Ｚと反応させ、それによって共有結合を形成する段階を含むことを特徴とする方法であって、
前記段階ｂ）は、好ましくは、該ポリマーまたはその誘導体の少なくとも一つの官能基Ａを、段階ａ）の間に前記糖タンパク質に加えた糖タンパク質の少なくとも一つの官能基Ｚと反応させ、それによって共有結合を形成することによって行われ、その中でＺは、アミノ基、チオール基、アルデヒド基、ヘミアセタール基、ケト基、マレイミド基、およびチオエステル基からなる群から選択され、
−Ｚがアルデヒド基またはケト基である場合、ＡはＺとの前記結合を形成するアミノ基を含み、
−Ｚがアミノ基である場合、Ａは反応性カルボキシ基およびアルデヒド基、ケト基もしくはヘミアセタール基からなる群から選択され、
−Ｚがマレイミド基である場合、ＡはＺとの前記結合を形成するチオール基を含み、
−−Ａがアルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基である場合、該方法は、ポリマー中にＡを導入してポリマー誘導体を得ることをさらに特徴とし、
−−−それは該ポリマーを少なくとも二官能性の化合物と反応させることによって行い、その一方の官能基は該ポリマーと反応し、その他方の官能基の少なくとも一つは、アルデヒド基、ケト基もしくはヘミアセタール基であるか、またはアルデヒド基、ケト基もしくはヘミアセタール基が得られるようにさらに化学修飾された官能基であり、あるいは
−−−それは該ポリマーを酸化して少なくとも一つ、特に少なくとも二つのアルデヒド基を得ることによって行い；あるいは
−−Ａが反応性カルボキシ基である場合、該方法は、ポリマー中にＡを導入してポリマー誘導体を得ることをさらに特徴とし、
−−−それは該ポリマーをその還元末端で選択的に酸化させ、生じたカルボキシ基を活性化させることによって行い、あるいは
−−−それは該ポリマーをその酸化されていない還元末端で炭酸ジエステルと反応させることによって行い；あるいは
−Ｚがチオール基である場合、ＡはＺとの前記結合を形成するマレイミド基またはハロゲンアセチル基を含むことを特徴とする方法。
段階ａ）において、出発糖タンパク質の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％が、共有結合によって結合した少なくとも一つの官能基Ｚを有するポリオールに共有結合した糖タンパク質に変換される、請求項１の方法。
段階ａ）において、修飾ポリオールが修飾糖ヌクレオチド、詳細には、修飾フコースヌクレオチド、修飾グルコースヌクレオチド、修飾マンノースヌクレオチド、修飾Ｎ−アセチルグルコサミンヌクレオチド、修飾Ｎ−アセチルガラクトサミンヌクレオチド、修飾シアル酸ヌクレオチドまたは修飾ガラクトースヌクレオチド、より詳細には、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ、ＧＤＰ−Ｍａｎ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＵＤＰ−Ｇｌｃ、またはＧＤＰ−Ｆｕｃである、請求項１の方法。
官能基Ｚが、ヒドラジド基、ヒドロキシルアミン、チオール基、アルデヒド基、ヘミアセタール基、ケト基、マレイミド基およびチオエステル基からなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一つの方法。
官能基Ｚが、リンカー分子、例えば適宜置換された直鎖、分枝鎖および／または環状炭化水素残基を通して糖ヌクレオチドのＣ−６ヒドロキシル基に結合する、請求項４の方法。
トランスフェラーゼが、クラスＥＣ２．４．１のグリコシルトランスフェラーゼ、特にその中で、該トランスフェラーゼが、β１−４ガラクトシルトランスフェラーゼ、β１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ、β１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項１から５のいずれか一つの方法。
糖タンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、ｔＰＡ、Ａ１ＡＴ、ＡＴＩＩＩ、ＨＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、抗体融合タンパク質、治療抗体、インターロイキン、特にインターロイキン２またはインターロイキン６、ＩＦＮ−α、ＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、並びに第ＩＸ因子からなる群から選択される、請求項１から６のいずれか一つの方法。
段階ｂ）において、段階ａ）の後に得られる修飾糖タンパク質の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％が、糖タンパク質およびポリマーもしくは前記ポリマーの誘導体を含む共役複合体に変換される、請求項１から７のいずれか一つの方法。
ヒドロキシアルキルデンプンがヒドロキシエチルデンプンである、請求項１から８のいずれかの方法。
ヒドロキシエチルデンプンが、２から２００ｋＤ、好ましくは４から１３０ｋＤ、より好ましくは４から９０ｋＤの分子量を有する、請求項９の方法。
Ａを含むポリマー誘導体とＺを含むタンパク質の反応の前に、該ポリマーを、その酸化されていない還元末端で、ポリマーの酸化されていない還元末端および化学基Ａと反応させることができる官能基を含む少なくとも二官能性の結合化合物と反応させることをさらに特徴とする、請求項１から１０のいずれか一つの方法。
Ａがアミノオキシ基またはヒドラジド基である、請求項１から１１のいずれか一つの方法。
少なくとも二官能性の結合化合物がホモ二官能性化合物である、請求項１１または１２の方法。
ホモ二官能性化合物が二つのアミノオキシ基を含む、請求項１２の方法。
ホモ二官能性化合物がＯ−［２−（２−アミノオキシエトキシ）−エチル］ヒドロキシルアミンである、請求項１４の方法。
ポリマーと少なくとも二官能性の結合化合物との反応が水溶媒中で実行される、請求項１１から１５のいずれかの方法。
ポリマーと少なくとも二官能性の結合化合物との反応によって、オキシム結合および／またはオキシアミノ結合がもたらされる、請求項１４から１６のいずれかの方法。
Ｚがアミノ基であり、タンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、ｔＰＡ、Ａ１ＡＴ、ＡＴＩＩＩ、ＨＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、抗体融合タンパク質、治療抗体、インターロイキン、特にインターロイキン２またはインターロイキン６、ＩＦＮ−α、ＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、並びに第ＩＸ因子からなる群から選択される、請求項１から１７のいずれか一つの方法。
ポリマーをその還元末端で選択的に酸化させ、その酸化されたポリマーを、その酸化された還元末端で炭酸Ｎ，Ｎ’−ジサクシンイミジルと反応させて、反応性カルボキシ基Ａを含むポリマー誘導体を得ることをさらに特徴とする、請求項１８の方法。
還元末端が酸化されていないポリマーの少なくとも一つのヒドロキシ基を炭酸ジエステルと反応させて、反応性カルボキシ基Ａを得ることをさらに特徴とする、請求項１８の方法。
炭酸ジエステルが対称性ジエステルである、請求項２０の方法。
エステルのアルコール構成要素が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、スルホン化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、並びにニトロ置換フェノールおよびハロゲン置換フェノールからなる群から選択される、請求項２０または２１の方法。
ハロゲン置換フェノールが、ニトロフェノール、ジニトロフェノール、トリクロロフェノール、トリフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、およびペンタフルオロフェノールからなる群から選択される、請求項２２の方法。
還元末端が酸化されていないポリマーの少なくとも一つのヒドロキシ基を炭酸ジエステルと反応させて、反応性エステル基Ａを得ることを、無水非プロトン性極性溶媒中で実行する、請求項２０から２３のいずれかの方法。
溶媒がジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミドまたはその混合物である、請求項２４の方法。
Ａが、アルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基である、請求項１８の方法であって、ポリマーを少なくとも二官能性の化合物の官能基Ｍと反応させて、ポリマー誘導体を得ることをさらに特徴とし、その少なくとも二官能性の化合物が、アルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基Ａである少なくとも一つの他の官能基Ｑをさらに含む方法。
Ｍがアミノ基を含む、請求項２６の方法。
Ａが、アルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基である請求項２６の方法であって、ポリマーを少なくとも二官能性の化合物の官能基Ｍと反応させて、ポリマー誘導体を得ることをさらに特徴とし、その少なくとも二官能性の化合物が、アルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基でない少なくとも一つの他の官能基Ｑをさらに含み、該官能基Ｑを少なくとも一つの適当な化合物と反応させて、アルデヒド基、ケト基またはヘミアセタール基Ａを含むポリマー誘導体を得ることをさらに特徴とする方法。
ＭおよびＱがアミノ基を含む、請求項２７の方法。
少なくとも一つの適当な化合物が、カルボキシ基およびアルデヒド基、ケト基もしくはヘミアセタール基を含む、請求項２８または２９の方法。
少なくとも一つの適当な化合物が、ホルミル安息香酸または４−（４−ホルミル−３，５−ジメトキシフェノキシ）酪酸である、請求項３０の方法。
Ｍがアミノ基を含み、Ｑがベータヒドロキシアミノ基を含む、請求項２８または２９の方法。
ポリマーを、その酸化された還元末端で少なくとも二官能性の化合物の官能基Ｍと反応させる、請求項３２の方法。
ベータヒドロキシアミノ基を酸化させて、アルデヒド基を得ることをさらに特徴とする、請求項３２の方法。
過ヨウ素酸を用いて酸化反応を実行する、請求項３４の方法。
過ヨウ素酸を用いて、ポリマーに開環酸化反応を受けさせて、少なくとも一つ、特に少なくとも二つのアルデヒド基Ａを有するポリマー誘導体を得る、請求項１８の方法。
ポリマーまたは該ポリマー誘導体のタンパク質との反応が還元的アミノ化である、請求項２６から３６のいずれかの方法。
還元的アミノ化をＮａＣＮＢＨ_３の存在下で実行する、請求項３７の方法。
還元的アミノ化を７以下のｐＨで実行する、請求項３７または３８の方法。
ｐＨが６以下である、請求項３９の方法。
還元的アミノ化を０から２５℃の温度で実行する、請求項３７から４０のいずれかの方法。
還元的アミノ化を水溶媒中で実行する、請求項３７から４１のいずれかの方法。
Ｚがチオール基である、請求項１から１１のいずれかの方法。
タンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、ｔＰＡ、Ａ１ＡＴ、ＡＴＩＩＩ、ＨＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、抗体融合タンパク質、治療抗体、インターロイキン、特にインターロイキン２またはインターロイキン６、ＩＦＮ−α、ＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、並びに第ＩＸ因子からなる群から選択される、請求項４３の方法。
Ａがハロゲンアセチル基を含む、請求項４２または４３の方法であって、ポリマーを、その適宜酸化された還元末端で、各々がアミノ酸を含む少なくとも二つの官能基を有する少なくとも二官能性の化合物と反応させて、アミノ基を含む少なくとも一つの官能基を有するポリマー誘導体を得ることをさらに特徴とする方法であって、該ポリマー誘導体をモノハロゲン置換酢酸および／または反応性モノハロゲン置換酢酸誘導体と反応させることをさらに特徴とする方法。
ハロゲンがＢｒまたはＩである、請求項４３の方法。
少なくとも二官能性の化合物が、２から１０個の炭素原子を有するジアミノアルカンである、請求項４３から４５のいずれかの方法。
少なくとも二官能性の化合物が、１から５個のアルキレン単位を有するジアミノポリエチレングリコールである、請求項４３から４５のいずれかの方法。
ポリマーを、その酸化された還元末端で少なくとも二官能性の化合物と反応させる、請求項４３から４８のいずれかの方法。
ジメチルホルムアミドおよび水の混合物を含む溶媒の存在下で、ハロゲンアセチル基を含むポリマー誘導体を糖タンパク質と反応させる、請求項４３から４８のいずれかの方法。
Ａがマレイミド基を含む、請求項４３または４４の方法であって、ポリマーを、その適宜酸化された還元末端で、適宜酸化された還元末端と反応させることができる官能基Ｕを含む少なくとも二官能性の化合物と反応させることをさらに特徴とする方法であって、その少なくとも二官能性の化合物が、マレイミド基が得られるように化学修飾されうる官能基Ｗをさらに含み、マレイミド基が得られるように官能基Ｗを化学修飾することをさらに特徴とする方法。
Ｕがアミノ基を含む、請求項５１の方法。
Ｗがアミノ基を含む、請求項５１または５２の方法。
Ｗを含むポリマー誘導体を、Ｗと反応させることができる官能基を含み、さらにマレイミド基を含む少なくとも二官能性の化合物と反応させる、請求項５０から５３のいずれかの方法。
少なくとも二官能性の化合物がＮ−（アルファ−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステルである、請求項５４の方法。
例えば、糖タンパク質の細胞内タンパク質分解のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析を用いることによって、少なくとも一つの遊離アスパラギンおよび／またはグルタミン側鎖を含む糖タンパク質の少なくとも８０％が、すべてのアスパラギンおよびグルタミン側鎖において無処理のアミド基を保持している、請求項１から５５のいずれかの方法によって得られる共役複合体を含む組成物。
Ａが反応性カルボキシ基であり、その中でＡは、ポリマーの少なくとも一つのヒドロキシ基を炭酸ジエステルと反応させることによって、還元末端が酸化されていないポリマー中に導入され、前記共役複合体が、一つのポリマー分子、およびアミド結合を通して該ポリマーと結合した少なくとも一つ、特に１から１０個の糖タンパク質分子を含む、請求項５６の組成物。
タンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、ｔＰＡ、Ａ１ＡＴ、ＡＴＩＩＩ、ＨＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、抗体融合タンパク質、治療抗体、インターロイキン、特にインターロイキン２またはインターロイキン６、ＩＦＮ−α、ＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、並びに第ＩＸ因子からなる群から選択される、請求項５７の方法。
ヒトまたは動物の体の治療方法に使用するための、請求項５６から５８のいずれかの組成物。
治療上の有効量の中に、請求項１から５５のいずれかの方法によって得られる共役複合体を含む医薬組成物、または特に共役複合体が濃度約１ｎＭで存在している、請求項５６から５８のいずれかの組成物。
請求項６０の医薬組成物であって、少なくとも一つの医薬的に許容される希釈剤、添加剤、または担体をさらに含み、特にその中で共役複合体が、該医薬組成物中に存在している全タンパク質の少なくとも５％、より好ましくは少なくとも２５％、さらに好ましくは５０％以上を構成する医薬組成物。
白血病（例えば有毛細胞白血病、慢性骨髄性白血病）、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、癌（例えばカルチノイド腫瘍、悪性黒色腫）および肝炎（例えば慢性Ｂ型肝炎および慢性Ｃ型肝炎）の治療用薬剤の製造のため、タンパク質がＩＦＮアルファである、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
多発性硬化症、好ましくは再発性型の多発性硬化症の治療用薬剤の製造のため、タンパク質がＩＦＮベータである、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
急性骨髄性白血病、骨髄移植生着の失敗または遅延、流動を有する高齢者における骨髄移植または術前化学療法後の骨髄再構成、並びに自家末梢血前駆細胞の移植後の骨髄再構成用薬剤の製造のため、タンパク質がＧＭ−ＣＳＦである、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
重症敗血症、血栓症、血栓塞栓症または閉塞性疾患、特に閉塞性動脈疾患の治療用薬剤の製造のため、タンパク質がＡＰＣである、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
心筋梗塞（心臓発作）、血栓症、血栓塞栓症または閉塞性疾患、特に閉塞性動脈疾患の治療用薬剤の製造のため、タンパク質がｔＰＡである、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
肺気腫、嚢胞性線維症、アトピー性皮膚炎、および／または気管支炎の治療用薬剤の製造のため、タンパク質がＡ１ＡＴである、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
遺伝的欠損、静脈閉塞症、熱傷および冠状動脈バイパス手術におけるヘパリン耐性、人工呼吸療法に関連するマイクロクロット形成の予防、外傷または胃腸の手術から生じる腸穿孔；播種性血管内凝固（ＤＩＣ）および／または敗血症の治療用薬剤の製造のため、タンパク質がＡＴＩＩＩである、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子へのインヒビターを有する血友病Ａまたは血友病Ｂ患者におけるエピソードの治療用薬剤の製造のため、タンパク質が第ＶＩＩ因子である、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
血友病Ａの治療用薬剤の製造のため、タンパク質が第ＶＩＩＩ因子である、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
血友病Ｂ、好ましくは先天性第ＩＸ因子欠乏症またはクリスマス病を有する患者における出血性エピソードの制御および予防、例えば手術環境における出血の制御および予防用薬剤の製造のため、タンパク質が第ＩＸ因子である、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
貧血障害または造血機能不全障害あるいはその関連疾患の治療用薬剤の製造のため、タンパク質がＥＰＯである、請求項１１２のＨＡＳ−タンパク質共役複合体、好ましくはＨＥＳ−タンパク質共役複合体または請求項５６から５８もしくは１１３のいずれかの組成物の使用。
ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）であり、その中で糖タンパク質の本質的にすべてのアスパラギンおよびグルタミン側鎖が無処理のアミド基を保持している、糖タンパク質およびポリマーあるいはその誘導体を含む共役複合体の存在下でのトランスフェラーゼの使用。
ポリマーがヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）であり、その中で共役複合体の本質的にどのメチオニン側鎖も酸化型でない、糖タンパク質および該ポリマーあるいはその誘導体を含む共役複合体の存在下でのトランスフェラーゼの使用。
一つ以上のＨＡＳ分子を含むヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）−糖タンパク質（ＧＰＯ）−共役複合体（ＨＡＳ−ＧＰＯ）であって、その中で各ＨＡＳが、糖タンパク質のＮ−グリカンまたはＯ−グリカンのガラクトース部位を通してＧＰＯと共役複合し、特に、前記Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンが、シアル酸残基でない少なくとも一つの末端の糖部位をさらに含む共役複合体。
ＧＰＯが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＡＰＣ、ｔＰＡ、Ａ１ＡＴ、ＡＴＩＩＩ、ＨＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、抗体融合タンパク質、治療抗体、インターロイキン、特にインターロイキン２またはインターロイキン６、ＩＦＮ−α、ＣＳＦ、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、並びに第ＩＸ因子からなる群から選択され、最も好ましくはその中で、ＥＰＯがヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有する、請求項７５のＨＡＳ−ＧＰＯ。
ＧＰＯの本質的にすべてのアスパラギンおよびグルタミン側鎖が無処理のアミド基を保持している、請求項７５または７６のいずれかのＨＡＳ−ＧＰＯ。
ＧＰＯの本質的にどのメチオニン側鎖も酸化型でない、請求項７５または７７のいずれか一つのＨＡＳ−ＧＰＯ。
ＧＰＯが、少なくとも一つの末端ガラクトース部位を含む少なくとも一つのＮ−グリカンまたはＯ−グリカンを含む、請求項７５から７８のいずれかのＨＡＳ−ＧＰＯ。
ＧＰＯが、少なくとも二つの末端ガラクトース部位を各々含む二つまたは三つのＮ−グリカンを含むＥＰＯである、請求項７９のＨＡＳ−ＧＰＯ。
ＧＰＯが、哺乳類、昆虫、酵母細胞または遺伝子改変細胞、特にヒト細胞由来である、請求項７５から８０のいずれかのＨＡＳ−ＧＰＯ。
ＨＡＳがリンカー分子を通してＧＰＯと共役複合した、請求項７５から８１のいずれかのＨＡＳ−ＧＰＯ。
ＥＰＯ１分子あたり１〜１２個、好ましくは１〜６個または１〜３個、最も好ましくは１〜４個のＨＡＳ分子を含む、請求項７５から８２のいずれかのＨＡＳ−ＧＰＯ。
ＨＡＳが、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプンおよびヒドロキシブチルデンプンからなる群から選択される、請求項７５から８３のいずれかのＨＡＳ−ＧＰＯ。
ＨＡＳがヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である、請求項８４のＨＡＳ−ＧＰＯ。
ＨＥＳが、１から３００ｋＤａ、好ましくは５から１００ｋＤａの分子量を有する、請求項８５のＨＡＳ−ＥＰＯ。
ＨＥＳが、ヒドロキシエチル基に関して０．１から０．８のモル置換度および２〜２０の範囲内のＣ_２：Ｃ_６置換比を示す、請求項８５または８６のいずれかのＨＡＳ−ＥＰＯ。
請求項７５から８７のいずれか一つのヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）−糖タンパク質（ＧＰＯ）−共役複合体（ＨＡＳ−ＧＰＯ）の生成方法であって、
ａ）ガラクトース残基である少なくとも二つの末端糖部位を含むＧＰＯを提供し、
ｂ）酵素ガラクトースオキシダーゼの作用によって末端ガラクトース残基を酸化させて、反応性アルデヒド基を含む末端ガラクトース残基を形成し、
ｃ）段階ｂ）のＧＰＯと反応させることができる修飾ＨＡＳを提供し、並びに
ｄ）段階ｂ）のＧＰＯを段階ｃ）のＨＡＳと反応させ、それによって一つ以上のＨＡＳ分子を含むＨＡＳ−ＧＰＯ（各ＨＡＳは、糖タンパク質のＮ−グリカンまたはＯ−グリカンのガラクトース部位を通して該ＧＰＯと共役複合し、前記Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンは、シアル酸残基でない少なくとも一つの末端糖部位をさらに含む）を生成する段階を含むことを特徴とする方法。
ＧＰＯがＥＰＯであり、特にその中で、該ＥＰＯがヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有する、請求項８８の方法。
請求項１３の方法の前およびその間に、ＧＰＯが、常に３．０から９．０の間のｐＨで保たれ、それによってＨＡＳ−ＧＰＯが生成され、その中で該ＧＰＯの本質的にすべてのアスパラギンおよびグルタミン側鎖が無処理のアミド基を保持している、請求項８８の方法。
ＧＰＯが哺乳類、昆虫または酵母細胞、あるいは遺伝子改変細胞、特にヒト細胞由来である、請求項８８から９０のいずれかの方法。
末端ガラクトース単位が、末端シアル酸の部分的または完全な酵素的除去の後に酸化される、請求項９０の方法。
段階ｄ）において、修飾ＨＡＳを、酸化された末端サッカライド単位と共役複合させる、請求項９１または９２の方法。
請求項１３の段階ｃ）のＨＡＳを、それが遊離ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、またはセミカルバジド官能基を含むように修飾する、請求項８８から９３のいずれかの方法。
段階ｄ）が、少なくとも１０重量％のＨ_２Ｏを含む反応溶媒中で行われる、請求項８８から９４のいずれかの方法。
ＨＡＳが、リンカー分子を通してＧＰＯ、特にＥＰＯと共役複合した、請求項８８から９５のいずれかの方法。
ＨＡＳが、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプンまたはヒドロキシブチルデンプン、好ましくはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）である、請求項８８から９６のいずれかの方法。
ＨＥＳが、請求項８６または８７のいずれかで定義された特性を有する、請求項９７の方法。
請求項８８から９８のいずれかの方法によって得られるＨＡＳ−ＧＰＯ。
請求項７５から８７のいずれかで定義される特徴を有するＨＡＳ−ＧＰＯ、特に請求項９９のＨＡＳ−ＥＰＯ。
ヒトまたは動物の体の治療方法に使用するための、請求項７５から８７、９９または１００のいずれかのＨＡＳ−ＧＰＯ、特にＨＡＳ−ＥＰＯ。
請求項７５から８７、９９または１００のいずれかのＨＡＳ−ＧＰＯ、特にＨＡＳ−ＥＰＯを含む医薬組成物であって、特にその中でＨＡＳ−ＥＰＯが濃度約１ｎＭで存在している医薬組成物。
少なくとも一つの医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項１０２の医薬組成物であって、特にその中でＨＡＳ−ＧＰＯが、該医薬組成物中に存在している全タンパク質の少なくとも５％、より好ましくは少なくとも２５％、さらに好ましくは５０％以上を構成する医薬組成物。
貧血障害または造血機能不全障害の治療用薬物の製造のための、請求項７５から８７、９９または１００のいずれかのＨＡＳ−ＥＰＯの使用。
２０００００Ｕ／ｍｇより高いタンパク質の生理活性を有するＥＰＯの製造方法において、出発物質として４００００Ｕ／ｍｇより低いタンパク質のインビボ生理活性を有するＥＰＯの使用。
医薬組成物中の使用に適した修飾ＧＰＯの製造方法において、出発物質としてガラクトース残基である少なくとも二つの末端糖部位を含むＧＰＯの使用。
医薬組成物中の使用に適した修飾ＧＰＯの製造方法において、出発物質として十分なシアル酸付加型のものと比較して７０％以上のインビボ生理活性を有するＧＰＯの使用。
修飾ＧＰＯがＨＡＳ−ＧＰＯ、詳細にはＨＥＳ−ＧＰＯ、より詳細にはＨＥＳ−ＥＰＯである、請求項１０５から１０７のいずれか一つの使用。
医薬組成物の製造に使用するのに適した修飾ＧＰＯの生成方法であって、
ａ）ガラクトース残基である少なくとも二つの末端糖部位を含むＧＰＯの画分が、全タンパク質の少なくとも１０％である、タンパク質の組成物を提供し、
ｂ）酵素ガラクトースオキシダーゼの作用によって末端ガラクトース残基を酸化させて、反応性アルデヒド基を含む末端ガラクトース残基を形成し、
ｃ）段階ｂ）のＧＰＯと反応させることができる修飾ＨＡＳを提供し、並びに
ｄ）段階ｂ）のＧＰＯを段階ｃ）のＨＡＳと反応させ、それによって医薬組成物中の使用に適したＨＡＳ−ＧＰＯを生成する段階を含むことを特徴とする方法。
修飾ＧＰＯがＨＡＳ−ＧＰＯ、詳細にはＨＥＳ−ＧＰＯ、より詳細にはＨＥＳ−ＥＰＯである、請求項１０９の方法。
ＥＰＯがヒトＥＰＯのアミノ酸配列を有する、請求項１１０の方法。
請求項１から５５のいずれか一つの方法によって得られる共役複合体。
請求項１１２の共役複合体を含む組成物。
ヒトまたは動物の体の治療方法に使用する、請求項１１３の組成物。
ヒトまたは動物の体の治療方法に使用する、請求項１１２の共役複合体。