PL214985B1 - Pirazolopirydyny podstawione karbaminianem, sposób ich wytwarzania, leki je zawierajace oraz ich zastosowanie do wytwarzania leków - Google Patents

Description

Przedmiotem niniejszego wynalazku są związki, stanowiące pirazolopirydyny podstawione karbaminianem, które stymulują rozpuszczalną cyklazę guanylową, ich wytwarzanie, leki je zawierające oraz ich zastosowanie do wytwarzania leków, zwłaszcza leków do leczenia chorób naczyniowo-sercowych i/lub zaburzeń seksualnych.

Jednym spośród najważniejszych komórkowych układów przekazywania sygnału w komórkach ssaczych jest cykliczny guanozynomonofosforan (cGMP). cGMP razem z tlenkiem azotu (NO), który uwalniany jest ze śródbłonka i przekazuje sygnały hormonalne i mechaniczne tworzą układ NO/cGMP. Cyklazy guanylanowe katalizują biosyntezę cGMP z guanozynotrifosforanu (GTP). Ujawnionych do tej pory przedstawicieli tej rodziny można podzielić, zarówno według cech strukturalnych jak i według typu ligandów, na dwie grupy: związane z błoną cyklazy guanylanowe (ang. particulate guanalate cyclases), które mogą być stymulowane przez peptydy natriuretyczne oraz rozpuszczalne cyklazy guanylanowe, które mogą być stymulowane przez NO. Rozpuszczalne cyklazy guanylanowe składają się z dwóch podjednostek i najprawdopodobniej zawierają jedną cząsteczkę hemu na heterodimer, który jest częścią miejsca regulatorowego. Ten ostatni ma zasadnicze znaczenie w mechanizmie aktywacji. NO zdolny jest do łączenia się z atomem żelaza cząsteczki hemu, a zatem znacznie podwyższa aktywność enzymu. Przeciwnie, preparaty pozbawione hemu nie mogą być stymulowane przez NO. Również CO jest zdolny do przyłączania się do centralnego atomu żelaza cząsteczki hemu, lecz stymulacja przez CO jest wyraźnie słabsza od stymulacji przez NO.

Dzięki wytwarzaniu cGMP i uzyskanej przez to regulacji fosfodiesteraz, kanałów jonowych i kinaz białkowych, cyklaza guanylanowa odgrywa podstawową rolę w różnych procesach fizjologicznych, w szczególności w relaksacji i proliferacji komórek mięśni gładkich, w agregacji i adhezji płytek krwi oraz w przekazywaniu sygnałów nerwowych i w zaburzeniach spowodowanych przez upośledzenie wymienionych wcześniej procesów. W stanach patofizjologicznych, układ NO/cGMP może ulec osłabieniu, co może prowadzić np. do wysokiego ciśnienia krwi, aktywacji płytek krwi, zwiększonej proliferacji komórkowej, zaburzenia czynności śródbłonka, miażdżycy naczyń, dusznicy bolesnej, niewydolności krążenia, zakrzepic, udaru, zaburzenia czynności seksualnych i zawału mięśnia sercowego.

Obiecującym podejściem jest możliwy sposób leczenia takich zaburzeń, niezależny od NO i ukierunkowany na oddziaływanie na szlak przenoszenia sygnału przez cGMP w organizmach, ze względu na dużą jego skuteczność i niewielką liczbę spodziewanych działań niepożądanych.

Do chwili obecnej, do terapeutycznej stymulacji rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej stosowano wyłącznie związki, takie jak organiczne azotany, których działanie opiera się na NO. NO powstaje w wyniku biokonwersji i aktywuje rozpuszczalną cyklazę guanylanową poprzez przyłączenie do centralnego atomu żelaza cząsteczki hemu. Oprócz działań niepożądanych, jednym spośród decydujących wad tego sposobu leczenia jest powstawanie tolerancji.

W ostatnich latach opisano pewne substancje, które bezpośrednio stymulują cyklazę guanylową, t.j. bez uprzedniego uwalniania NO, takie jak np. 3-(5'-hydroksymetylo-2'-furylo)-1-benzyloindazol (YC-1, Wu i in., Blood 84 (1994), 4226; M^sch i in., Brit. J. Pharmacol. 120 (1997), 681), kwasy tłuszczowe (Goldberg et al, J. Biol. Chem. 252 (1977), 1279), heksafluorofosforan difenylojodoniowy (Pettibone i in., Eur. J. Pharmacol. 116 (1985), 307), izolikwiritygenina (izoliquiritigenin) (Yu i in., Brit. J. Pharmacol. 114 (1995), 1587) i różne podstawione pochodne pirazolu (WO 98/16223).

Ponadto, w międzynarodowych zgłoszeniach patentowych WO 98/16507, WO 98/23619, WO 00/06567, WO 00/06568, WO 00/06569, WO 00/21954 WO 02/42299, WO 02/42300, WO 02/42301, WO 02/42302, WO 02/092596 i WO 03/004503 opisano pochodne pirazolopirydyny jako stymulatory rozpuszczalnej cyklazy guanylowej. Opisano tam między innymi także pirazolopirydyny zawierające w pozycji 3 resztę pirymidyny. Związki tego typu wykazują bardzo wysoką aktywność stymulowania rozpuszczalnej cyklazy guanylowej w badaniach in vitro. Okazało się jednak, że in vivo takie właściwości tych związków jak np. oddziaływanie na wątrobę, właściwości farmakokinetyczne, zależności dawka-odpowiedź lub szlaki metaboliczne obarczone są wadami.

Dlatego też celem niniejszego wynalazku jest opracowanie dalszych pochodnych pirazolopirydyny, które działają jako stymulatory rozpuszczalnej cyklazy guanylowej lecz nie posiadają wymienionych powyżej wad związków znanych ze stanu techniki.

Cel ten został osiągnięty poprzez opracowanie związków o wzorze (I) według wynalazku. Ta nowa klasa pochodnych pirazolopirydyny wyróżnia się tym, że w pozycji 3 znajduje się reszta pirymiPL 214 985 B1 dyny ze szczególnym układem podstawników, a mianowicie posiadająca grupę karbaminianową w pozycji 5 pierścienia pirymidynowego i grupę aminową w pozycji 4 pierścienia pirymidynowego.

Niniejszy wynalazek specyficznie dotyczy związków o wzorze (I).

w którym

R¹ oznacza -NR³C(=O)OR⁴, ₂

R² oznacza atom wodoru lub NH2, ₃

R³ oznacza atom wodoru lub (C1-C4)-alkil,

R⁴ oznacza (C1-C6)-alkil, i ich soli.

Korzystnymi związkami o wzorze (I) są związki, w których

R¹ oznacza -NR³C(=O)OR⁴, ₂

R² oznacza atom wodoru lub NH2,

R³ oznacza (C1-C4)-alkil,

R⁴ oznacza (C1-C4)-alkil, i ich sole.

Szczególnie korzystnymi związkami o wzorze (I) są związki, w których

R¹ oznacza -NR³C(=O)OR⁴, ₂

R² oznacza NH2, ₃

R³ oznacza metyl lub etyl,

R⁴ oznacza metyl, etyl lub izopropyl, i ich sole.

Szczególnie korzystnym jest związek z Przykładu 8: 4,6-diamino-2-[1-(2-fluorobenzyIo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyn-3-ylo]-5-pirymidynylo(metylo)karbaminian metylu

Szczególnie korzystnym jest też związek z Przykładu 5:

PL 214 985 B1

4,6-diamino-2-[1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyn-3-ylo]-5-pirymidynylokarbaminian metylu.

i jego sole.

Związki według wynalazku o wzorze (I) mogą także występować w postaci soli. Generalnie wymienić można sole z kwasami organicznymi lub nieorganicznymi.

Dla celów niniejszego wynalazku korzystnymi są fizjologicznie dopuszczalne sole. Fizjologicznie dopuszczalnymi solami związków według wynalazku są ich sole z kwasami mineralnymi, kwasami karboksylowymi lub kwasami sulfonowymi. Szczególnie korzystnymi przykładami są sole z takimi kwasami jak kwas chlorowodorowy, kwas bromowodorowy, kwas siarkowy, kwas fosforowy, kwas metanosulfonowy, kwas etanosulfonowy, kwas p-toluenosulfonowy, kwas benzenosulfonowy, kwas naftalenodisulfonowy, kwas octowy, kwas propionowy, kwas mlekowy, kwas winowy, kwas cytrynowy, kwas fumarowy, kwas maleinowy lub kwas benzoesowy.

Termin alkil oznacza liniowy lub rozgałęziony rodnik alkilowy zawierający, jako reguła, od 1 do 6, korzystnie od 1 do 4, szczególnie korzystnie od 1 do 3 atomów węgla, przykładowo i korzystnie jest to metyl, etyl, n-propyl, izopropyl, tert-butyl, n-pentyl i n-heksyl.

Termin atom fluorowca oznacza dla celów wynalazku fluor, chlor, brom i jod.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania związków o wzorze (I). Związki te wytwarza się

[A] poddając związki o wzorze (Ia)

w którym znaczenie R⁴ zdefiniowano powyżej,

PL 214 985 B1 w reakcji ze związkami o wzorze (II)

R³ - X¹ (II) w którym znaczenie R³ zdefiniowano powyżej i ₁

X¹ oznacza grupę opuszczającą taką jak np. atom fluorowca, korzystnie jod, lub mezylan, którą przeprowadza się w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym z oziębianiem otrzymując związki o wzorze (I), lub

[B] poddając związki o wzorze (III)

reakcji ze związkami o wzorze (IV)

(IV) , w którym znaczenie R⁴ zdefiniowano powyżej, którą prowadzi się w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym otrzymując związki o wzorze (Ia), lub

[C] poddając związki o wzorze (V)

reakcji ze związkami o wzorze (VI')

PL 214 985 B1 w którym znaczenia R³ i R⁴ zdefiniowano powyżej, którą prowadzi się w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym z ogrzewaniem otrzymując związki o wzorze (Ib)

w którym znaczenia R³ i R⁴ zdefiniowano powyżej.

Następnym przedmiotem wynalazku jest lek zawierający powyższy związek o wzorze (I) i co najmniej jeden dalszy rozczynnik.

Następnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie powyższych związków o wzorze (I) do wytwarzania leków do leczenia zaburzeń sercowo-naczyniowych.

Następnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie powyższych związków o wzorze (I) do wytwarzania leków do leczenia nadciśnienia.

Następnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie powyższych związków o wzorze (I) do wytwarzania leków do leczenia zaburzeń zakrzepowo-zatorowych i niedokrwień.

Następnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie powyższych związków o wzorze (I) do wytwarzania leków do leczenia zaburzeń seksualnych, zwłaszcza zaburzeń erekcji i zaburzeń seksualnych u kobiet.

Związki o wzorach (II) i (IV) są dostępne w handlu lub opisane są w literaturze, lub można je wytworzyć sposobem znanym specjalistom.

Związek o wzorze (III) można otrzymać tak jak pokazano na następującym schemacie reakcji:

PL 214 985 B1

Związek (III) otrzymuje się w dwuetapowej syntezie w reakcji związku (V) ze związkiem (VII) prowadzącej do otrzymania związku (VIII) zgodnie z procesem przedstawionym w [C] i późniejszym uwodornieniu związku (VIII) wobec uwodnionego niklu Raneya. Reakcję uwodornienia prowadzi się w rozpuszczalniku organicznym np. w dimetyloformamidzie, korzystnie przy podwyższonym ciśnieniu np. 50 do 70 barów, korzystnie pod ciśnieniem 65 barów, mieszając mieszaninę reakcyjną przez kilka godzin, np. przez 22 godziny, w podwyższonej temperaturze, np. w temperaturze od 40 do 80°C, korzystnie w temperaturze od 60°C do 65°C.

Związek (VII) można wytworzyć sposobem analogicznym do podanego w pracy L. F. Cavalieri, J. F. Tanker, A. Bendich, J. Am. Chem. Soc., 1949, 71, 533.

Związek (V) można otrzymać tak jak pokazano na następującym schemacie reakcji:

związek (V) można otrzymać w wieloetapowej syntezie z soli sodowej cyjanopirogronianiu etylu znanego z literatury (Borsche i Manteuffel, Liebigs. Ann. Chem. 1934, 512, 97). Jego reakcja z 2-fluorobenzylohydrazyną prowadzona w warunkach ogrzewania w atmosferze gazu obojętnego w obojętnym rozpuszczalniku takim jak dioksan prowadzi do powstania 5-amino-1-(2-fluorobenzylo)pirazolo-3-karboksylanu etylu, który cyklizuje się w reakcji z dimetyloaminoakroleiną w środowisku kwaśnym w atmosferze gazu obojętnego i z ogrzewaniem do odpowiedniej pochodnej pirydyny. Tę pochodną pirydyny, 1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyno-3-karboksylan etylu, przeprowadza się w wieloetapowej syntezie, obejmującej przekształcenie estru w reakcji z amoniakiem w odpowiedni amid, dehydratację amidu środkiem odwadniającym takim jak bezwodnik trifluorooctowy do odpowiedniej pochodnej nitrylu, reakcję pochodnej nitrylu z etanolanem sodu i na koniec reakcję z chlorkiem amonu, w związek (V).

Związki o wzorze (VI) syntetyzuje się metodami znanymi specjaliście z odpowiednich karbaminianów w reakcji z mrówczanem etylu. Karbaminiany otrzymuje się sposobem analogicznym do podanego w pracy Q. Li, D.T. Chu, A. Claiborne, C.S. Cooper, C.M. Lee, J. Med. Chem. 39 (1996) 30703088.

Reakcję związków o wzorach (Ia) i (II) prowadzącą do związków o wzorze (I) prowadzi się stosując reagenty w równomolowych ilościach w rozpuszczalniku organicznym np. dimetyloformamidzie lub tetrahydrofuranie, korzystnie w obecności 1 do 2 równoważników, korzystnie 1,1 do 1,5 równoważnika, zasady takiej jak np. wodorek sodu lub sól sodowa N,N-bistrimetylosililoamid, korzystnie pod ciśnieniem atmosferycznym i mieszając roztwór reakcyjny przez kilka godzin, np. przez 1 godzinę, z oziębianiem, np. w temperaturach od -10°C do temperatury pokojowej, korzystnie w temperaturze 0°C.

Reakcję związków o wzorach (III) i (IV) prowadzącą do związków o wzorze (Ia) prowadzi się stosując reagenty w równomolowych ilościach w rozpuszczalniku organicznym np. w organicznej za8

PL 214 985 B1 sadzie, korzystnie w pirydynie, korzystnie pod ciśnieniem atmosferycznym i mieszając roztwór reakcyjny przez kilka godzin, np. przez 12 godzin, w temperaturach od 0°C do temperatury pokojowej, korzystnie w temperaturze pokojowej.

Reakcję związków o wzorach (V) i (VI) prowadzącą do związków o wzorze (Ib), lub związków o wzorach (V) i (VII) prowadzącą do związków o wzorze (VIII), prowadzi się stosując reagenty w ilościach równomolowych lub biorąc do reakcji związek o wzorze (VI) w nieznacznym nadmiarze, w rozpuszczalniku organicznym takim jak np. węglowodór, taki jak toluen lub ksylen lub w N,N-dimetyloformamidzie, korzystnie w obecności 2-3 równoważników, korzystnie 2 równoważników, zasady takiej jak np. trietyloamina lub metanolan sodu, korzystnie pod ciśnieniem atmosferycznym i mieszając roztwór reakcyjny przez kilka godzin, np. przez 9 godzin, w podwyższonej temperaturze, np. w temperaturze 80-160°C, korzystnie w temperaturze 100-150°C, w szczególności w temperaturze 110°C.

Związki według wynalazku o wzorze (I) wykazują cenny zakres efektów farmakologicznych, których nie można było przewidzieć.

Związki według wynalazku o wzorze (I) obniżają napięcie naczyń i hamują agregację płytek krwi i prowadzą do obniżenia ciśnienia krwi i zwiększają przepływ krwi w naczyniach wieńcowych. W efektach tych pośredniczy bezpośrednia stymulacja rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej oraz zwiększenie poziomu cGMP wewnątrz komórek. Ponadto, związki według wynalazku o wzorze (I) nasilają działanie substancji podwyższających poziom cGMP, takich jak np. EDRF (śródbłonkowy czynnik rozluźniający), donory NO, protoporfiryna DC, kwas arachidonowy lub pochodne fenylohydrazyny.

Można je zatem stosować w lekach do leczenia zaburzeń sercowo-naczyniowych jak np. do leczenia wysokiego ciśnienia krwi i niewydolności krążenia, stabilnej i niestabilnej dusznicy bolesnej, zaburzeń naczyń obwodowych i sercowych, arytmii, do leczenia zaburzeń zakrzepowo-zatorowych i niedokrwiennych, takich jak zawał mięśnia sercowego, udar, przejściowe ataki niedokrwienne, zaburzenia przepływu krwi w naczyniach obwodowych, w celu zapobiegania restenozom, takim jak te po terapiach trombolitycznych, przezskórnych angioplastykach śródnaczyniowych (PTA), przezskórnych śródnaczyniowych angioplastykach naczyń wieńcowych (PTCA), połączeniach omijających (bypass'ach) i w leczeniu stwardnienia tętnic, zaburzeń astmatycznych i chorobach układu moczowo-płciowego, takich jak np. przerost prostaty, zaburzenie erekcji, zaburzenie czynności seksualnych u kobiet, w osteoporozie, jaskrze, nadciśnieniu płucnym, porażeniu żołądka i nietrzymaniu moczu.

Związki według wynalazku o wzorze (I) są także odpowiednie do kontrolowania chorób ośrodkowego układu nerwowego, charakteryzujących się zaburzeniami układu NO/cGMP. Szczególnie są one odpowiednie do polepszania percepcji, koncentracji, uczenia się lub pamięci po upośledzenia poznawczych takich jak te występujące głównie w połączeniu z sytuacjami/chorobami/objawami, takimi jak łagodne upośledzenie poznawcze, związane z wiekiem upośledzenia zdolności uczenia się i pamięci, związana z wiekiem utrata pamięci, otępienie pochodzenia naczyniowego, uraz czaszkowokręgowy, udar, otępienie występujące po udarach (otępienie poudarowe), pourazowy zespół mózgowy, ogólne upośledzenia koncentracji, upośledzenia koncentracji u dzieci z problemami w uczeniu się i pamięci, choroba Alzheimera, otępienie z ciałami Lewy'ego, otępienie z degeneracją płatów czołowych w tym zespół Pick'a, choroba Parkinsona, postępujące porażenie pochodzenia jądrowego, otępienie ze zwyrodnieniem kory i jąder podstawy, stwardnienie zanikowe boczne (ALS), choroba Huntingtona, stwardnienie rozsiane, zwyrodnienie wzgórza, otępienie Creutzfelda-Jakoba, otępienie wywołanie zakażeniem wirusem HIV, schizofrenia z otępieniem lub psychoza Korsakoffa. Są one także odpowiednie w leczeniu zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego, takich jak stany lękowe, napięcie i depresja, zaburzenia czynności seksualnych z podłożem w OUN i zaburzenia snu oraz do kontrolowania patologicznych zaburzeń przyjmowania pokarmu, środków pobudzających i substancji uzależniających.

Związki według wynalazku o wzorze (I) są ponadto odpowiednie również do kontrolowania przepływu krwi w naczyniach mózgowych, a zatem są skutecznymi środkami do leczenia migreny.

Związki według wynalazku o wzorze (I) są także odpowiednie w profilaktyce i leczeniu następstw zawałów mózgowych, takich jak udar, niedokrwienia mózgu i uraz czaszkowokręgowy. Można je podobnie stosować do leczenia stanów bólowych.

Ponadto, związki według wynalazku o wzorze (I) mają działanie przeciwzapalne i można je zatem stosować jako środki przeciwzapalne.

Badania biologiczne

Działanie obniżające napięcia naczyń in vitro

PL 214 985 B1

Króliki oszołomiono uderzeniem w tył karku i skrwawiono. Wyizolowano aortę, usunięto przylegającą tkankę i pocięto na pierścienie o szerokości 1,5 mm, które umieszczono pojedynczo rozciągnięte w 5 ml urządzeniach do badań narządów izolowanych wypełnionych nasyconym gazowym karbogenem roztworem Krebsa-Henseleita w temperaturze 37°C o następującym składzie (mM): NaCl: 119; KCl: 4,8; CaCl2 x 2 H2O: 1; MgSO4 x 7 H2O: 1,4; KH2PO4: 1,2; NaHCO3: 25; glukoza: 10. Siłę skurczu wykrywano stosując przetworniki Statham UC2, wzmacniano i digitalizowano stosując przetwornice AID (DAS-1802 HC, Keithley Instruments, Munich) i rejestrowano równolegle na rejestratorach rysujących wykresy. Skurcz generowano dodając kumulacyjnie do łaźni fenyloefrynę w zwiększającym się stężeniu. Po kilku cyklach kontrolnych, badano daną substancję testową w każdej dalszej serii, w każdym przypadku zwiększając dawkę, a siłę skurczu porównano z siłą skurczu uzyskaną w ostatniej poprzedzającej serii. Korzystając z tego obliczono stężenie konieczne do zmniejszenia wartości kontrolnej siły skurczu o 50% (IC₅₀). Standardowa objętość dawki wynosiła 5 μ|, a zawartość DMSO w roztworze w łaźni była równa 0,1%.

IC50 dla związku według przykładu 1 wynosiło 670 nM, a odpowiednia wartość dla związku z Przykładu 8 wynosiła 500 nM.

Model z wykorzystaniem królika

Dorosłe samce królików rasy chinchi||a o masie ciała 3-5 kg przyzwyczajano do przebywania w samotności przez kilka dni po dostarczeniu. Miały one swobodny dostęp do wody, a pokarm mogły przyjmować przez dwie godziny dziennie. Zwierzęta przetrzymywano w 10/14-godzinnym reżimie światło/ciemność (włączenie światła o godzinie 8:00), w temperaturze pokojowej 22-24°C.

Każda grupa doświadczalna składała się z trzech do sześciu zwierząt, które zważono bezpośrednio przed rozpoczęciem testu. Substancje do podawania dożylnego rozpuszczono w Transcuto|'u (GATTEFOSSE GmbH) i rozcieńczono u stosunku 3/7 stosując 20% roztwór Cremophoru (Cremophor (BASF), woda). Do żyły usznej wstrzyknięto substancję w objętości 0,5 m|/kg. Substancje rozpuszcza|ne w wodzie wstrzykiwano w 0,9% roztworze ch|orku sodu.

Substancje testowe do podawania doustnego rozpuszczono w mieszaninie 6:10:9,69 g|icero|:woda:g|iko| po|ietylenowy i podawano sondą w objętości 1 m|/kg.

W spoczynku, penis królika w rejonie łonowym jest niewidoczny i jest w całości pokryty skórą penisa. Erekcję oszacowano mierząc długość wystającego penisa za pomocą suwmiarki. Pomiar przeprowadzano 5, 10, 15, 30, 45, 60 i 120 minut po podaniu substancji a ponadto 3, 4, 5 i 6 godzin po podaniu doustnym. Do tego celu zwierzęta za każdym razem wyjmowano z k|atki, trzymano mocno za skórę na karku i tylne łapy, odwracano na plecy i dokonywano pomiarów. Przeprowadzano odpowiednie kontro|e rozpuszcza|nikowe. (Porównaj z odpowiednim piśmiennictwem: E. Bischoff, K. Schneider, Int. J. of Impotence Res. 2001, 13, 230-235; E. Bischoff, U. Niewoehner, H. Haning, Μ. Es Sayed, Τ. Schenke, K. H. Sch|emmer, Journa| of Uro|ogy, 2001, 165, 1316-1318; E. Bischoff, Int. J. Impotence Res. 2001, 13, 146-148).

Minimalna skuteczna dawka związku z Przykładu 8 przy podawaniu doustnym wynosiła 0,03 mg/kg (z jednoczesnym dożylnym podawaniem nitroprusydku sodu SNP 0,2 mg/kg).

Określanie parametrów farmakokinetycznych po podaniu dożylnym i doustnym

Środek testowy podawano dożylnie zwierzętom (np. myszom, szczurom, psom) w postaci roztworu i doustnie sondą w postaci roztworu lub zawiesiny. Po podaniu środka, w określonych punktach czasowych pobierano od zwierząt krew, dodawano do niej heparynę po czym przez odwirowanie uzyskiwano z niej osocze. Ilość środka w osoczu określono posługując się analizą LC/MS/MS. Określone w ten sposób przebiegi stężenie w osoczu/czas zastosowano do obliczenia parametrów farmakokinetycznych za pomocą zgodnego z normą programu komputerowego do analizy danych farmakokinetycznych.

Związek z Przykładu 8 po doustnym podaniu szczurom w dawce 0,3 i 1,0 mg/kg (w postaci roztworu w mieszaninie so|uto|:EtOH:woda 1:1:8), wykazuje następujące stężenia w osoczu (AUC):

AUCstand (0,3 mg/kg) = 0,326 [kg*h/|]

AUCstand (1,0 mg/kg) = 0,548 [kg*h/|]

Hamowanie enzymów cytochromu P450

Potencjał hamowania izoenzymów P-450, które są istotne dla metabolizmu, zbadano automatycznie w układzie 96-studzienkowym. Do tego celu zastosowano dwa różne testy.

W teście wykorzystującym powstawanie fluorescencyjnych metabolitów, zastosowano enzymy rekombinowane (np. CYP1A2, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6 lub 3A4) i ogólnie substraty zawierające fragmenty struktur fluoresceiny lub kumaryny. W każdym przypadku zastosowano substrat w jednym stę10

PL 214 985 B1 żeniu i potencjalny inhibitor w 8 stężeniach. Po inkubacji z konkretnym rekombinowanym enzymem CYP, do pomiaru zakresu fluorescencyjnych metabolitów w porównaniu z kontrolą (bez inhibitora), stosowano czytnik fluorescencji i obliczono IC50 [Anal. Biochem. 248, 188 (1997)].

W drugim teście, jako źródło enzymów wykorzystano mikrosomy ludzkiej wątroby oraz substraty selektywne względem izoformy CYP - fenacetyna (CYP1A2), diklofenak (CYP2C9), dekstrometorfan (CYP2D6) i midazolam (CYP3A4). Powstawanie konkretnego metabolitu mierzy się stosując technikę LC-MS/MS. Zakładając, że hamowanie jest konkurencyjne, na podstawie obniżenia powstawania metabolitu w porównaniu z kontrolą obliczono wartości Ki (1 stężenie substratu i 3 stężenia inhibitora).

Indukcja enzymów cytochromu P450 w hodowlach komórek ludzkiej wątroby.

W celu zbadania możliwych działań niepożądanych substancji według wynalazku względem in₅ dukcji enzymów cytochromu Ρ450, pierwotne ludzkie hepatocyty hodowano w gęstości 2,5 x 10⁵ komórek pomiędzy dwiema warstwami kolagenu w 24-studzienkowych płytkach do mikromiareczkowania w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO₂ przez 8 dni. Podłoże do hodowli komórkowej zmieniano każdego dnia.

Po 48 godzinach hodowli, hepatocyty potraktowano substancjami testowymi w różnych stężeniach, porównano z induktorami ryfampicyną (RIF; 50 ąm), omeprazolem (OME; 100 ąm) i fenobarbitalem (PB; 2 mM), w dwóch powtórzeniach przez 5 dni. Końcowe stężenia substancji testowych wynosiły 0,01-10 ąg/ml.

Indukcyjne działanie substancji testowych na enzymy cytochromu P450 (CYP) 1A2, 2B6, 2C19 i 3A4 określono dodając 8 dnia do hodowli komórkowych substraty 7-etoksyresorufinę (CYP1A2), [¹⁴C]-S-mefenytoinę (CYP2B6 i 2C19) i [¹⁴C]-testosteron (CYP3A4). Potencjał indukcyjny substancji testowych określono w oparciu o aktywność zmierzonych w ten sposób enzymów CYP1A2, 2B6, 2C19 i 3A4 w potraktowanych komórkach w porównaniu z komórkami niczym nie traktowanymi. W tabeli 1 poniżej przedstawiono wyniki uzyskane dla związku z Przykładu 8 w porównaniu z induktorami RIF, PB i OME:

T a b e l a 1: Indukcyjny wpływ na aktywności enzymów wątrobowych w hodowlach ludzkich hepatocytów po 8-dniowej inkubacji (znormalizowanych)

	Stężenie	CYP1A2	CYP2B6	CYP2C19	CYP3A4
Kontrola	0	1,0	1,0	1,0	1,0
RIF	50 ąm	n.d.	5,15	15,21	9,15
PB	2000 ąm	n.d.	14,69	4,00	6,70
OME	100 ąm	28,57	1,54	1,61	1,45
Przykład 8	0,01 ąg /ml	0,76	1,92	1,30	1,37
	0,1 ąg/ml	0,70	1,62	1,30	1,60
	1,0 ąg/ml	0,90	1,85	1,12	1,51
	10 ąg/ml	1,38	2,54	1,97	3,47

n.d. = nie określono

Przedmiotem niniejszego wynalazku są ponadto leki zawierające jeden związek według wynalazku wraz z jednym lub większą liczbą farmakologicznie dopuszczalnych rozczynników lub nośników, i ich zastosowanie w realizacji wcześniej wymienionych celów.

Aktywny składnik może działać systemowo i/lub miejscowo. Aby tak zadziałał podaje się go w odpowiedni sposób, np. doustnie, pozajelitowo, do płuc, donosowo, podjęzykowo, na język, podpoliczkowo, doodbytniczo, przezskórnie, do spojówki, miejscowo lub jako implant.

Składnik aktywny podaje się w formach odpowiednich dla danych dróg podawania.

Formami podawania odpowiednimi w przypadku podawania doustnego są znane formy dostarczające składnik aktywny szybko i/lub w zmodyfikowany sposób, takie jak np. tabletki (niepowlekane i powlekane, np. tabletki powleczone warstwą zabezpieczającą przed działaniem soków żołądkowych lub tabletki pokryte filmem), kapsułki, tabletki pokryte cukrem, granulki, peletki, proszki, emulsje, zawiesiny, roztwory i aerozole.

W podawaniu pozajelitowym unika się etapu absorpcji (podawanie dożylne, dotętnicze, dosercowe, dordzeniowe lub dolędźwiowe) lub ma miejsce absorpcja (podawanie domięśniowe,

PL 214 985 B1 podskórne, śródskórne, przezskórne lub dootrzewnowe). Formami podawania odpowiednimi do podawania pozajelitowego są, między innymi, preparaty do iniekcji i wlewów będące roztworami, zawiesiny, emulsje, liofilizaty i sterylne proszki.

Odpowiednimi formami farmaceutycznymi do stosowania w przypadku innych dróg podawania są np. formy farmaceutyczne do inhalacji (między innymi inhalatory do proszków, rozpylacze), krople/roztwory do nosa, spraje; tabletki lub kapsułki do podawania na język, podjęzykowo lub podpoliczkowo, czopki, preparaty do uszu i oczu, kapsułki dopochwowe, zawiesiny wodne (płyny, mieszaniny do wstrząsania), lipofilowe zawiesiny, maście, kremy, mleczka, pasty, rozpylone proszki lub implanty takie jak np. stenty.

Aktywne składniki wprowadza się w znany dobrze sposób w wymienione formy podawania leku. Stosuje się obojętne nietoksyczne, farmaceutycznie odpowiednie rozczynniki. Są nimi, między innymi, nośniki (np. mikrokrystaliczna celuloza), rozpuszczalniki (np. ciekłe glikole polietylenowe), emulgatory (np. dodecylosiarczan sodu), dyspergatory (np. poliwinylopirolidon), syntetyczne i naturale biopolimery (np. albumina), stabilizatory (np. antyutleniacze takie jak kwas askorbinowy), środki barwiące (np. barwniki nieorganiczne takie jak tlenki żelaza) lub środki maskujące smak i/lub zapach. Aktywny składnik, gdy jest to właściwe, może znajdować się w postaci mikrokapsułek w jednym lub większej liczbie wymienionych powyżej nośników.

Zawartość terapeutycznie skutecznego związku o wzorze (I) w wymienionych powyżej preparatach farmaceutycznych powinna wynosić od około 0,1 do 99,5, korzystnie od około 0,5 do 95% wagowych licząc na masę całej mieszaniny.

Wymienione powyżej preparaty farmaceutyczne mogą także zawierać, oprócz związku według wynalazku o wzorze (I), inne aktywne farmaceutycznie składniki.

Generalnie uważa się, że zarówno w medycynie jak i w weterynarii, aby uzyskać pożądane wyniki, korzystne jest podawanie składnika aktywnego według wynalazku w ilościach wynoszących na koniec od około 0,001 do około 50, korzystnie od 0,001 do 10 mg/kg masy ciała co 24 godziny, jeśli jest to właściwe w wielu pojedynczych dawkach. Pojedyncza dawka zawiera korzystnie składnik aktywny według wynalazku w ilościach od około 0,001 do około 30, w szczególności od 0,001 do 3 mg/kg masy ciała.

Niniejszy wynalazek objaśniono poniżej bardziej szczegółowo za pomocą, korzystnych i nie stanowiących ograniczenia wynalazku, przykładów. Jeśli nie wskazano inaczej, wszystkie dane ilościowe wyrażono w procentach wagowych. Stosunki rozpuszczalników, dane dotyczące rozcieńczeń i stężeń dla roztworów ciecz/ciecz wyrażono w każdym przypadku jako objętości.

Skróty:

ACN

BABA stęż.

DCI

DCM

DIEA

DMSO

DMF

EA

EI

ESI

HPLC

LC-MS

LDA

MCPBA temp.topn

MS

NMR

Rf

RP-HPLC temp. pok.

acetonitryl octan n-butylu /n-butanol/lodowaty kwas octowy/ bufor fosforanowy pH 6 (50:9: 25:15; faza organiczna) stężony bezpośrednia jonizacja chemiczn (w widmach masowych MS) dichlorometan

N,N-diizopropyloetyloamina sulfotlenek dimetylu

N,N-dimetyloformamid octan etylu jonizacja w wiązce elektronów (w widmach masowych MS) elektrorozpylanie (w widmach masowych MS) wysokociśnieniowa, wysokosprawna chromatografia cieczowa sprzężona chromatografia cieczowa/ spektroskopia masowa sól litowa diizopropylamidu kwas m-chloronadbenzoesowy temperatura topnienia spektrometria masowa spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego współczynnik retencji (w chromatografii TLC) metoda HPLC na odwróconych fazach temperatura pokojowa

PL 214 985 B1

Rt czas retencji (w HPLC) nas. nasycony

THF tetrahydrofuran

TLC chromatografia cienkowarstwowa

Fazy ruchome w chromatografii cienkowarstwowej:

T1 E1: toluen/octan etylu (1:1)

TI EtOHl: toluen/etanol (1:1)

Cl E1: cykloheksan/octan etylu (1:1)

Cl E2: cykloheksan/octan etylu (1:2)

Metody LCMS i HPLC:

Metoda 1 (LCMS)

Przyrząd: Mikro-mass Platform LCZ, HP1100; kolumna: Symmetry C18, 50 mm x 2,1 mm, 3,5 gm; eluent A: acetonitryl + 0,1% kwasu mrówkowego, eluent B: woda + 0,1% kwasu mrówkowego; gradient: 0,0 minut 10% A > 4,0 minuty 90% A > 6,0 minut 90% A; piec: 40°C; szybkość przepływu: 0,5 ml/min; detekcja UV: 208-400 nm.

Metoda 2 (LCMS)

Przyrząd: Mikromass Quattro LCZ, HP1100; kolumna: Symmetry C18, 50 mm x 2,1 mm, 3,5 gm; eluent A: acetonitryl + 0,1% kwasu mrówkowego, eluent B: woda + 0,1% kwasu mrówkowego; gradient: 0,0 minut 10% A > 4,0 minuty 90% A > 6,0 minut 90% A; piec: 40°C; szybkość przepływu: 0,5 ml/mm; detekcja UV: 208-400 nm.

Metoda 3 (LCMS)

Przyrząd: Waters Alliance 2790 LC; kolumna: Symmetry CIS, 50 mm x 2,1 mm, 3,5 gm; eluent A: woda + 0,1% kwasu mrówkowego, eluent B: acetonitryl + 0,1% kwasu mrówkowego; gradient: 0,0 minut 5% B > 5,0 minut 10% B > 6,0 minut 10% B; temperatura: 50°C; szybkość przepływu: 1,0 ml/min; detekcja UV: 210 nm.

Metoda 4 (HPLC)

Przyrząd: HP 1100 z detekcją DAD; kolumna: Kromasil RP-18, 60 mm x 2 mm, 3,5 gm; eluent: A=5 ml HCIO4/I H2O, B = ACN; gradient: 0 minut 2% B, 0,5 minuty 2% B, 4,5 minuty 90% B, 6,5 minut 90% B; szybkość przepływu: 0,75 ml/min; temp.: 30°C; detekcja UV: 210 nm.

Preparatywna chromatografia RP-HPLC

Kolumna: YMC gel; eluent: acetonitryl/woda (gradient); szybkość przepływu: 50 ml/min; temp.: 25°C; detekcja UV 210 nm.

Związki wyjściowe:

P r z y k ł a d 1A

5-amino-1-(2-fluorobenzylo)pirazolo-3-karboksylan etylu

111,75 g (75 ml, 0,98 mola) kwasu trifluorooctowego dodaje się w atmosferze argonu w temperaturze pokojowej energicznie mieszając do 100 g (0,613 mola) soli sodowej cyjanopirogronianu etylu (wytworzonej sposobem analogicznym do podanego w pracy Borsche i Manteuffel, Liebigs Ann. 1934, 572, 97) w 2,5 I dioksanu i mieszaninę miesza się przez 10 minut; w tym czasie większość prekursora rozpuszcza się. Następnie dodaje się 85,93 g (0,613 mola) 2-fluorobenzylohydrazyny i mieszaninę ogrzewa się w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez

PL 214 985 B1 noc. Po oziębieniu odsącza się wydzielone kryształy trifluorooctanu sodu i przemywa je dioksanem; tak otrzymany roztwór poddaje się dalszej reakcji.

P r z y k ł a d 2A

1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyno-3-karboksylan etylu

Roztwór otrzymany w Przykładzie 1A miesza się z 61,25 ml (60,77 g, 0,613 mola) dimetyloaminoakroleiny i 56,28 ml (83,88 g, 0,736 mola) kwasu trifluorooctowego i ogrzewa w temperaturze wrzenia w atmosferze argonu przez 3 dni. Następnie rozpuszczalnik odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość dodaje się do 2 I wody i ekstrahuje się trzy razy 1 I porcjami octanu etylu. Połączone fazy organiczne suszy się nad siarczanem magnezu i zatęża na wyparce obrotowej. Przeprowadza się chromatografię na 2,5 kg żelu krzemionkowego eluując gradientowo toluen/toluen-octan etylu = 4:1. Wydajność: 91,6 g (49,9% wydajności teoretycznej licząc na dwa etapy).

Temp. topn. 85°C

Rf (SiO2, T1 E1):0,83

P r z y k ł a d 3A

1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyno-3-karboksyamid

10,18 g (34 mmola) estru otrzymanego w Przykładzie 2A wprowadza się do 150 ml metanolu uprzednio nasyconego amoniakiem w temperaturze 0-10°C. Mieszaninę miesza się w temperaturze pokojowej przez dwa dni i następnie zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem. Rf(SiO2, T1 E1): 0,33.

P r z y k ł a d 4A

3-cyjano-1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyna

PL 214 985 B1

36,1 g (133 mmola) 1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyno-3-karboksyamidu z Przykładu 3A rozpuszcza się w 330 ml THF, i dodaje się 27 g (341 mmola) pirydyny. Następnie, w ciągu 10 minut dodaje się 47,76 ml (71,66 g, 341 mmola) bezwodnika trifluorooctowego; w tym czasie temperatura wzrasta do 40°C. Mieszaninę miesza się w temperaturze pokojowej przez noc. Następnie dodaje się ją do 1 I wody i ekstrahuje się trzy razy 0,5 I porcjami octanu etyl. Fazę organiczną przemywa się nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu i 1M roztworem kwasu solnego, suszy się nad siarczanem magnezu i zatęża na wyparce obrotowej. Wydajność: 33,7 g (100% wydajności teoretycznej).

Temp. topn. : 81°C

Rf (SiO2, T1 E1): 0,74.

P r z y k ł a d 5A

1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyno-3-karboksyimidan metylu

30,37 g (562 mmola) metanolanu sodu rozpuszcza się w 1,5 I metanolu i dodaje się 36,45 g (144,5 mmola) 3-cyjano-1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyny (z Przykładu 4A). Mieszaninę miesza się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny i uzyskany roztwór stosuje się bezpośrednio w następnym etapie.

P r z y k ł a d 6A

1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyno-3-karboksyamidyna

Roztwór 1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyno-3-karboksyimidanu metylu w metanolu otrzymany w Przykładzie 5A miesza się z 33,76 g (32,19 ml, 562 mmola) lodowatego kwasu octowego i 9,28 g (173 mmola) chlorku amonu i całość miesza się przez noc w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną. Rozpuszczalnik odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem, pozostałość starannie rozciera się z acetonem i wytrącony osad odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem. Osad dodaje się do 2 I wody, następnie dodaje się mieszając 31,8 g węglanu sodu dodaje się, mieszaninę ekstrahuje się trzy razy w sumie 1 I octanu etylu i fazę organiczną suszy się nad siarczanem magnezu i odparowuje pod zmniejszonym ciśnieniem. Wydajność 27,5 g (76,4% wydajności teoretycznej licząc na dwa etapy) temperatura topnienia: 86°C

Rf (SiO2,T1 EtOH1): 0,08.

PL 214 985 B1

P r z y k ł a d 7A

2-[1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyn-3-ylo]-5-[(E)fenylodiazenylo]-4,6-pirymidynodiamina

3,87 g metanolanu sodu, a później 12,2 g (71,7 mmola) fenyloazomalononitrylu (L. F. Cavalieri, J. F. Tanker, A. Bendich, J. Am. Chem. Soc., 1949, 71, 533) dodaje się do mieszanego roztworu 21,92 g (71,7 mmola) 1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyno-3-karboksyamidyny w N,N-dimetyloformamidzie z Przykładu 6A. Mieszaninę miesza się w temperaturze 110°C przez noc i pozostawia do ochłodzenia. Osad, który się wytrąca odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i przemywa etanolem. Po wysuszeniu otrzymuje się 23 g (73% wydajności teoretycznej) oczekiwanego związku.

P r z y k ł a d 8A trichlorowodorek 2-[1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyn-3-ylo]-4,5,6-pirymidynotriaminy

g (11,38 ramola) 2-[1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyn-3-ylo]-5-[(E)-fenylodiazenylo]-4,6-pirymidynodiaminy z Przykładu 7A uwodornia się wobec 800 mg 50% niklu Raney w wodzie i 60 ml DMF pod ciśnieniem 65 bar wodoru w temperaturze 62°C przez 22 godzin. Katalizator odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem przez ziemię okrzemkową i roztwór odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem i miesza z 5M roztworem kwasu solnego. Żółtawo-brunatny osad, który wytrąca się odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy. Otrzymuje się 3,1 g (59,3% wydajności teoretycznej) oczekiwanego związku. Wolną zasadę otrzymuje się wytrząsając produkt z rozcieńczonym roztworem wodorowęglanu sodu i ekstrahuje się octanem etylu. Osad nierozpuszczalny w obu fazach odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem. Faza z octanem etylu także zawiera niewielką ilość wolnej zasady.

PL 214 985 B1

P r z y k ł a d 9A cyjanomety|o(mety|o)karbaminian mety|u

wytworzono ana|ogicznie jak w pracy: Q. Li, D.T. Chu, A. C|aiborne, C.S. Cooper, C.M. Lee,

J. Med. Chem, 1996, 39, 3070-3088.

P r z y k ł a d 10A (E)-2-cyjano-2-[(metoksykarbony|o)(mety|o)amino]eteno|an sodu

0,46 g (0,01 mmola) metanolanu sodu dodaje się w atmosferze argonu do tetrahydrofuranu (roztwór A). Następnie 1,00 g (0,01 mmola) cyjanometylo(metylo)karbaminianu metylu z Przykładu 9A dodaje się do 1,73 g (0,02 mmola) mrówczanu etylu. Następnie do tej mieszaniny powoli wkrapla się roztwór A. Mieszaninę miesza się w temperaturze pokojowej przez noc. Rozpuszczalnik zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce obrotowej i do pozostałości dodaje się eter dietylowy. Wydzielone kryształy odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy się je pod silnie zmniejszonym ciśnieniem.

Wydajność: 1,05 g (76% wydajności teoretycznej)

HPLC (Metoda 4): Rt = 1,35 min.

¹H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 2,90(d, 1H), 3,35(s, 3H), 3,47(s, 3H).

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1

4-amino-2-[1-(2-f|uorobenzy|o)-1H-pirazo|o[3,4-b]pirydyn-3-y|o]-5-pirymidyny|o(mety|o)karbaminian mety|u

Do 50 ml toluenu dodaje się, w atmosferze argonu, 0,80 g (2,61 mmo|a) 1-(2-f|uorobenzy|o)-1H-pirazo|o[3,4-b]pirydyno-3-karboksyamidyny z Przykładu 6A, 0,51 g (2,86 mmo|a) (E)-2-cyjano-2-[(metoksykarbony|o)(mety|o)amino]eteno|anu sodu z Przykładu 10A i 0,53 g (0,73 m|, 5,23 mmo|a) trietyloaminy. Mieszaninę ogrzewa się w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 9 godzin. Następnie mieszaninę oziębia się do temperatury pokojowej, miesza się i ekstrahuje dichlorometanem

PL 214 985 B1 i wodą. Fazę organiczną suszy się nad siarczanem magnezu, sączy i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce obrotowej. Pozostałość miesza się z 5 ml eteru dietylowego; produkt wykrystalizowuje. Kryształy odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem, suszy i oczyszcza metodą preparatywnej chromatografii RP-HPLC.

Wydajność: 20,2 mg (2% wydajności teoretycznej)

LC/MS (Metoda 2): Rt = 3,01 min

MS (E1): m/z = 408 (M+H)^{+ 1}H-NMR (300 MHz, DMSO-da): δ = 3,09 (s, 3H), 3,29 (s, 3H), 5,83 (s, 2H), 7,09-7,42 (m, 5H),

8,20 (s, 1H), 8,64 (dd, 1H), 8,94 (dd, 1H), 9,27 (br. s, 2H).

P r z y k ł a d 2

4,6-diamino-2-[1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyn-3-ylo]-5-pirymidynylokarbaminian etylu

107,35 mg (0,31 mmola) trichlorowodorku 2-[1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyn-3-ylo]-4,5,6-pirymidynotriaminy z Przykładu 8A dodaje się do 5 ml pirydyny i mieszaninę oziębia się do temperatury 0°C. Dodaje się 33,25 mg (0,31 mmola) chloromrówczanu etylu i reakcję pozostawia się mieszając w temperaturze pokojowej przez noc. Pirydynę odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce obrotowej i pozostałość oczyszcza się metodą preparatywnej chromatografii RP-HPLC.

Wydajność: 56,2 mg (43% wydajności teoretycznej)

LC/MS (Metoda 1): Rt = 2,66 min

MS (EI): m/z = 423 (M+H)^{+ 1}H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ = 1,17-1,33 (m, 3H), 3,97-4,14 (m, 2H), 5,80 (s, 2H), 6,14 (szer. s, 4H), 7,07-7,17 (m, 2H), 7,22 (t, 1H), 7,29-7,40 (m, 2H), 7,97 (szer. s, 1H), 8,60 (d, 1H), 9,07 (d, 1H).

P r z y k ł a d 3

4,6-diamino-2-[1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyn-3-ylo]-5-pirymidynylokarbaminian izopropylu

PL 214 985 B1

Związek wytwarza się analogicznie do metody z Przykładu 2 ze 150 mg (0,43 mmola) trichlorowodorku 2-[1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyn-3-ylo]-4,5,6-pirymidynotriaminy z Przykładu 8A, 7,5 ml pirydyny i 52,47 mg (0,43 mmola) chloromrówczanu izopropylu. Pozostałość zadaje się mieszaniną dichlorometan/metanol, sączy i suszy się.

Wydajność: 165 mg (88% wydajności teoretycznej)

LC/MS (Metoda 1): Rt = 2,84 min

MS (El): m/z = 437 (M+H)^{+ 1}H-NMR (300 MHz, DMSO-da): δ = 1,26 (d, 6H), 4,82 (kwin., 1H), 5,92 (s, 2H), 7,07-7,20 (m, 2H), 7,25 (t, 1H), 7,31-7,43 (m, 2H), 7,47-7,57 (m, 1H), 8,16 (szer. s, 1H), 8,74 (dd, 1H), 8,98 (dd, 1H).

P r z y k ł a d 4

4,6-diamino-2-[1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyn-3-ylo]-5-pirymidynylokarbaminian neopentylu

Związek wytwarza się analogicznie do metody z Przykładu 2 ze 100 mg (0,29 mmola) trichlorowodorku 2-[1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyn-3-ylo]-4,5,6-pirymidynotriaminy z Przykładu 8A, 5 ml pirydyny i 43 mg (0,29 mmola) chloromrówczanu neopentylu.

Wydajność: 54 mg (41% wydajności teoretycznej)

LC/MS (Metoda 1): Rt = 3,10 min MS (EI): m/z = 465 (M+H)^{+ 1}H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 0,95 (szer. s, 9H), 3,74 (s, 2H), 5,79 (s, 2H), 6,10 (szer. s, 4H), 7,08-7,17 (m, 2H), 7,22 (t, 1H), 7,29-7,39 (m, 2H), 8,00 (szer. s, 1H), 8,60 (dd, 1H), 9,06 (dd, 1H).

P r z y k ł a d 5

4,6-diamino-2-[1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyn-3-ylo]-5-pirymidynylokarbaminian metylu

30,5 g (87,0 mmola) trichlorowodorku 2-[1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyn-3-ylo]-4,5,6-pirymidynotriaminy z Przykładu 8A rozpuszcza się w 30 ml pirydyny. Uzyskany roztwór oziębia się do temperatury 0°C. Dodaje się 8,22 g (87,0 mmola) chloromrówczanu metylu i mieszaninę miesza się

PL 214 985 B1 w temperaturze 0°C przez kolejne 2 godziny. Następnie mieszaninę pozostawia się do ogrzania do temperatury pokojowej i miesza się przez dalsze 12 godzin. Po zatężeniu pod zmniejszonym ciśnieniem pozostałość przemywa się wodą i suszy się. Dalsze oczyszczanie prowadzi się mieszając surowy produkt w 300 ml wrzącego eteru dietylowego. Wytrącony produkt sączy się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy pod zmniejszonym ciśnieniem. Wydajność: 32,6 g (92% wydajności teoretycznej)

LC/MS (Metoda 1): = 2,61 min MS (EI): m/z = 409 (M+H)^{+ 1}H-NMR (400 MHz, DMSO-da) : δ = 3,61 (s, 3H), 5,80 (s, 2H), 6,19 (szer. s, 4H), 7,08-7,16 (m, 2H), 7,22 (t, 1H), 7,28-7,39 (m, 2H), 7,99 (szer. s, 1H), 8,60 (dd, 1H), 9,05 (dd, 1H).

P r z y k ł a d 6

4,6-diamino-2-[1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyn-3-ylo]-5-pirymidynylo(metylo)karbaminian etylu

mg (0,13 mmola) 4,6-diamino-2-[1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyn-3-ylo]-5-pirymidynylokarbaminianu etylu z Przykładu 2 dodaje się do 5 ml DMF; mieszaninę oziębia się do temperatury 0°C i dodaje się 7,67 mg (0,19 mmola) wodorku sodu. Następnie wkrapla się 18,14 mg (0,13 mmola) jodometanu i mieszaninę miesza się przez jedną godzinę. Mieszaninę miesza się z wodą i ekstrahuje dichlorometanem. Połączone fazy organiczne suszy się nad siarczanem magnezu i zatęża na wyparce obrotowej. Pozostałość oczyszcza się najpierw metodą chromatografii kolumnowej (faza ruchoma: dichlorometan/metanol = 10:1), a następnie metodą preparatywnej chromatografii RP-HPLC. Wydajność: 32 mg (58% wydajności teoretycznej).

LC/MS (Metoda 2): Rt = 2,91 min

MS (El): m/z = 437 (M+H)^{+ 1}H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 1,08 (t, 3H), 2,99 (s, 3H), 2,93-4,11 (m, 2H), 5,79 (s, 2H), 6,35 (szer. s, 4H), 7,06-7,14 (m, 2H), 7,16-7,28 (m, 1H), 7,28-7,32 (m, 2H), 8,59 (dd, 1H), 9,06 (dd, 1H).

P r z y k ł a d 7

4,6-diamino-2-[1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyn-3-ylo]-5-pirymidynylo(metylo)karbaminian izopropylu

PL 214 985 B1

Związek wytwarza się analogicznie do metody z Przykładu 6 z 75 mg (0,17 mmola) 4,6-diamino-2-[1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyn-3-ylo]-5-pirymidynylokarbaminianu izopropylu z Przykładu 3, 10,31 mg (0,26 mmola) wodorku sodu i 24,4 mg (0,17 mmola) jodometanu. Pozostałość oczyszcza się metodą preparatywnej chromatografii RP-HPLC.

Wydajność: 32 mg (41% wydajności teoretycznej)

LC/MS (Metoda 1): Rt = 2,97 min

MS (EI): m/z = 451 (M+H)^{+ 1}H-NMR (300 MHz, DMSO-da): δ = 1,09 (d, 6H), 2,98 (s, 3H), 4,80 (kwin., 1H), 5,79 (s, 2H), 6,31 (szer. s, 4H), 7,05-7,16 (m, 2H), 7,22 (t, 1H), 7,28-7,40 (m, 2H), 8,59 (dd, 1H), 9,07 (dd, 1H).

P r z y k ł a d 8

4,6-diamino-2-[1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyn-3-ylo]-5-pirymidynyIo(metylo)karbaminian metylu

Związek wytwarza się analogicznie do metody z Przykładu 6 z 310 mg (0,76 mmola) 4,6-diamino-2-[1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyn-3-ylo]-5-pirymidynylokarbaminianu metylu z Przykładu 5, 27,32 mg (1,14 mmola) wodorku sodu i 215,5 mg (1,52 mmola) jodometanu. Mieszaninę przerabia się dodając wodę i 2 molowy roztwór wodorotlenku potasu i ekstrahując dichlorometanem. Połączone fazy organiczne suszy się nad siarczanem magnezu i zatęża na wyparce obrotowej. Pozostałość oczyszcza się metodą preparatywnej chromatografii RP-HPLC. Wydajność: 93 mg (29% wydajności teoretycznej).

Większe ilości związku z Przykładu 8 można otrzymać następującą metodą syntetyczną:

20,0 g (49,0 mmola) 4,6-diamino-2-[1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyn-3-ylo]-5-pirymidynylokarbaminianu metylu z Przykładu 5 rozpuszcza się w 257 ml tetrahydrofuranu i oziębia w temperatury 0°C. W ciągu 15 minut wkrapla się 53,9 ml (49,0 mmola) 1M roztworu soli litowej bis(trimetylosililo)amidu w tetrahydrofuranie. Po mieszaniu w temperaturze 0°C przez 20 minut dodaje się 6,95 g (53,9 mmola) jodometanu. Po upływie 1 godziny mieszaninę pozostawia się do ogrzania do temperatury pokojowej i reakcję przerywa się dodając nasycony wodny roztwór chlorku amonu. Rozdziela się fazy. Fazę wodną ekstrahuje się kilka razy octanem etylu i dichlorometanem. Połączone fazy organiczne zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymaną w ten sposób pozostałość zawiesza się w mieszaninie dichlorometanu i tetrahydrofuranu (1:1). Nierozpuszczone kryształy odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i rozpuszcza w metanolu. Mieszaninę ogrzewa się w temperaturze wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez jedną godzinę. Po oziębieniu wydzielony osad sączy się. Otrzymany w ten sposób czerwony stały osad zawiesza się w 100 ml mieszaniny dioksanu i dichlorometanu (1:1) i, utrzymując mieszaninę we wrzeniu, dodaje się 20 ml metanolu aż do uzyskania klarownego roztworu. Dodaje się węgiel aktywny i mieszaninę krótko ogrzewa się do wrzenia i sączy na gorąco przez ziemię okrzemkową. Otrzymany w ten sposób roztwór odparowuje się do suchej masy. Po zadaniu metanolem zawiesinę miesza się w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Białe kryształy sączy się pod zmniejszonym ciśnieniem.

Wydajność: 14,9 g (72% wydajności teoretycznej)

LC/MS (Metoda 3): Rt = 1,85 min

MS (EI): m/z = 423 (M+H)⁺

PL 214 985 B1 ¹H-NMR (200 MHz, DMS0-d6) δ = 3,01 (s, 3H), 3,57 (s, 3H), 5,92 (s, 2H), 7,05, 7,17 (m, 2H), 7,18-7,46 (m, 3H), 7,47-7,61 (m, 2H), 7,59-7,97 (m, 2H), 8,71-8,81 (m, 1H), 8,97 (dd, 1H).

P r z y k ł a d 9

4,6-diamino-2-[1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyn-3-ylo]-5-pirymidynylo(etylo)karbaminian izopropylu

Związek wytwarza się analogicznie do metody z Przykładu 6 z 60 mg (0,14 mmola) 4,6-diamino-2-[1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyn-3-ylo]-5-pirymidynylokarbaminianu izopropylu z Przykładu 3, 4,95 mg (0,21 mmola) wodorku sodu i 21,4 mg (0,17 mmola) jodoetanu. Aby doprowadzić reakcję do końca ponownie dodaje się jeszcze raz tę samą ilość wodorku sodu i jodoetanu. Pozostałość oczyszcza się metodą preparatywnej chromatografii RP-HPLC.

Wydajność: 43 mg (67% wydajności teoretycznej)

LC/MS (Metoda 1): Rt = 2,97 mm

MS (EI): m/z = 465 (M+H)^{+ 1}H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 0,96-1,06 (m, 3H), 1,09 (d, 6H), 2,79-2,93 (m, 2H), 4,82 (kwin., 1H), 5,80 (s, 2H), 6,25 (szer. s, 4H), 7,01-7,14 (m, 2H), 7,15-7,50 (m, 3H), 8,60 (dd, 1H), 9,09 (dd, 1H).

Claims (11)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Związek o wzorze (I) w którym

   R¹ oznacza -NR³C(=O)OR⁴, ₂

   R² oznacza atom wodoru albo NH2,

   PL 214 985 B1 ₃

   R³ oznacza atom wodoru albo (C1-C4)-alkil,

   R⁴ oznacza (C1-C6)-alkil, i ich sole.
2. 2. Związki według zastrz. 1, znamienne tym, że R¹ oznacza -NR³C(=O)OR⁴, ₂

   R² oznacza atom wodoru albo NH2,

   R³ oznacza C1-C4)-alkil,

   R⁴ oznacza (C1-C4)-alkil, i ich sole.
3. 3. Związki według zastrz. 1, znamienne tym, że

   R¹ oznacza -NR³C(=O)OR⁴, ₂

   R² oznacza NH2, ₃

   R³ oznacza metyl albo etyl,

   R⁴ oznacza metyl, etyl albo izopropyl, i ich sole.
4. 4. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że posiada następującą budowę:

   4,6-diamino-2-[1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyn-3-ylo]-5-pirymidynylo(metylo)karbaminian metylu i jego sole.
5. 5. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że posiada następującą budowę:

   4,6-diamino-2-[1-(2-fluorobenzylo)-1H-pirazolo[3,4-b]pirydyn-3-ylo]-5-pirymidynylokarbaminian metylu ⁱ i jego sole.

   PL 214 985 B1
6. 6. Sposób wytwarzania związków o wzorze (I) według zastrz. 1, znamienny tym, że, a|bo [A] związki o wzorze (Ia) (la) w którym znaczenie R⁴ zdefiniowano w zastrz.

   1, poddaje się reakcji ze związkami o wzorze (II) _R ³ _{- X} ¹ (II), ₃ w którym znaczenie R³ zdefiniowano w zastrz. 1, ⁱ i

   ₁

   X¹ oznacza grupę opuszczającą, a|bo [B] związki o wzorze (III) poddaje się reakcji ze związkami o wzorze (IV)

   Cl

   OR

   PL 214 985 B1 w którym znaczenie R⁴ zdefiniowano w zastrz. 1, albo [C] związki o wzorze (V) poddaje się reakcji ze związkami o wzorze (VI) w którym znaczenia R³ i R⁴ zdefiniowano w zastrz. 1, prowadzącej do otrzymania związków o wzorze (Ib) w którym znaczenia R³ i R⁴ zdefiniowano w zastrz. 1.
7. 7. Lek zawierający związek aktywny oraz co najmniej jeden rozczynnik, znamienny tym, że jako związek aktywny zawiera związek o wzorze (I), określony w zastrz. 1.
8. 8. Zastosowanie związków o wzorze (I), określonych w zastrz. 1, do wytwarzania leków do leczenia zaburzeń sercowo-naczyniowych.
9. 9. Zastosowanie związków o wzorze (I), określonych w zastrz. 1, do wytwarzania leków do leczenia nadciśnienia.
10. 10. Zastosowanie związków o wzorze (I), określonych w zastrz. 1, do wytwarzania leków do leczenia zaburzeń zakrzepowo-zatorowych i niedokrwień.
11. 11. Zastosowanie związków o wzorze (I), określonych w zastrz. 1, do wytwarzania leków do leczenia zaburzeń seksualnych, zwłaszcza zaburzeń erekcji i zaburzeń seksualnych u kobiet.

    Departament Wydawnictw UP RP