PL207591B1

PL207591B1 - Peptyd NTP i środek zawierający ten peptyd

Info

Publication number: PL207591B1
Application number: PL370891A
Authority: PL
Inventors: Paul Averback; Jack Gemmell
Original assignee: Nymox Corp
Priority date: 2001-11-16
Filing date: 2002-11-18
Publication date: 2011-01-31
Also published as: NZ532721A; AU2002342463B2; JP2011135876A; JP4717349B2; BRPI0213786B8; US20030166569A1; US7745572B2; US20090022743A1; US20050032704A1; EA200400632A1; NO332842B1; NO20041844L; CY1107578T1; BRPI0213786B1; WO2003044053A3; US7408021B2; JP5357196B2; AU2002342463A1; DE60213274T2; PL370891A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest peptyd NTP i środek zawierający ten peptyd.

Wynalazek należy do dziedziny związanej z leczeniem stanów wymagających usunięcia lub zniszczenia elementów komórkowych, takich jak łagodne lub złośliwe nowotwory u ludzi, za pomocą związków opartych na peptydach zawierających sekwencje aminokwasowe odpowiadające, podobne lub homologiczne do części sekwencji aminokwasowej białek włókienek neuronalnych.

Istota wielu terapii i procedur medycznych obejmuje usuwanie lub niszczenie szkodliwej lub niepożądanej tkanki. Przykłady takich istotnych terapii obejmują chirurgiczne usuwanie rozrostów nowotworowych, niszczenie nowotworów przerzutowych drogą chemioterapii oraz zmniejszanie rozrostu gruczołów (np. prostaty). Inne przykłady obejmują usuwanie niepożądanych włosów z twarzy, brodawek i tkanki tłuszczowej.

Istniało oczywiste zapotrzebowanie na skuteczny środek, który niszczyłby i w ten sposób ułatwiał usuwanie lub hamował dalszy wzrost szkodliwych lub niepożądanych komórek i tkanki, ale który miałby głównie działanie miejscowe i minimalną toksyczność ogólnoustrojową lub jej brak.

Białka włókienek neuronalnych i ich pokrewne cząsteczki stanowią jedną grupę takich środków ujawnionych w publikacji US 20030054990. Pewne fragmenty białek włókienek neuronalnych i pokrewnych cząsteczek są ujawnione jako użyteczne do leczenia nowotworów i innych stanów chorobowych wymagających usuwania lub niszczenia komórek, w publikacji US 20030096350 oraz opisach patentowych US 7192929 i US 7241738.

W opisie ujawniono pewne inne fragmenty białek włókienek neuronalnych, które są także użyteczne do leczenia nowotworów i innych stanów chorobowych wymagających usuwania lub niszczenia komórek.

Rak jest spowodowany nieprawidłowością wewnętrznych mechanizmów regulatorowych komórki, co powoduje niekontrolowany wzrost i namnażanie komórki. Prawidłowe komórki tworzą tkanki i gdy te komórki tracą swoją zdolność do zachowywania się jako wyspecjalizowana, kontrolowana i skoordynowana jednostka (odróż nicowanie) zaburzenie to prowadzi do nieł adu w populacji komórek. Gdy to nastąpi powstaje nowotwór.

Łagodne rozrosty tkanki są nieprawidłowościami, w przypadku których pożądane jest usuwanie komórek z organizmu. Łagodne nowotwory są proliferacjami komórek, które nie dają przerzutów w organizmie, a jednak wywołują objawy chorobowe. Takie nowotwory mogą być śmiertelne, gdy są umiejscowione w niedostępnych obszarach w narządach, takich jak mózg. Istnieją łagodne nowotwory narządów, takich jak płuca, mózg, skóra, przysadka, tarczyca, kora i rdzeń nadnerczy, jajniki, macica, jądra, tkanka łączna, mięśnie, jelita, ucho, nos, gardło, migdałki, usta, wątroba, pęcherzyk żółciowy, trzustka, prostata, serce i inne narządy.

Operacja chirurgiczna jest często pierwszym etapem w leczeniu raka. Cel operacji chirurgicznej różni się. Czasami jest ona stosowana do usunięcia w jak największym stopniu widocznego nowotworu lub co najmniej do „odbarczenia go (usunięcia większości masy(mas) nowotworu tak, żeby mniejsza jego ilość mogła być leczona w inny sposób). Zależnie od typu nowotworu oraz jego umiejscowienia operacja chirurgiczna może przynieść także pacjentowi pewną ulgę w objawach. Przykładowo, gdy lekarz może usunąć dużą część powiększającego się nowotworu mózgu, zmniejszy się ciśnienie w czaszce, co doprowadzi do polepszenia objawów u pacjenta.

Nie wszystkie nowotwory nadają się do operacji chirurgicznej. Niektóre z nich mogą być umiejscowione w częściach ciała, w których całkowite ich usunięcie jest niemożliwe. Przykładami takich nowotworów są nowotwory pnia mózgu (części mózgu kontrolującej oddychanie) lub nowotwór, który rozrósł się w lub wokół głównego naczynia krwionośnego. W tych przypadkach rola operacji chirurgicznej jest ograniczona ze względu na wysokie ryzyko związane z usunięciem nowotworu.

W niektórych przypadkach operacja chirurgiczna nie jest stosowana do odbarczenia nowotworu, ponieważ po prostu nie jest ona potrzebna. Przykładem jest chłoniak Hodgkina, nowotwór węzłów chłonnych, który odpowiada bardzo dobrze na połączenie chemioterapii i radioterapii. W przypadku chłoniaka Hodgkina operacja chirurgiczna jest rzadko potrzebna do osiągnięcia wyleczenia, ale prawie zawsze jest stosowana do postawienia diagnozy.

Chemioterapia jest inną powszechną postacią terapii nowotworowej. Zasadniczo obejmuje ona stosowanie leków (zazwyczaj podawanych doustnie lub drogą iniekcji), które specyficznie atakują szybko dzielące się komórki (takie jak te występujące w nowotworze) w organizmie. Czyni to chemioterapię użyteczną w leczeniu nowotworów, które już dały przerzuty, a także nowotworów, w przypadku

PL 207 591 B1 których istnieje duże ryzyko rozprzestrzenienia przez układ krwionośny i limfatyczny, ale nie są wykrywalne poza pierwotnym nowotworem. Chemioterapia może być także stosowana do wzmocnienia odpowiedzi umiejscowionych nowotworów na operację chirurgiczną i radioterapię. Ma to miejsce np. w przypadku niektórych nowotworów głowy i szyi.

Niestety chemioterapia wpływa na inne komórki w organizmie człowieka, które prawidłowo także szybko się dzielą (takie jak wyściółka żołądka i włosy). Z tego powodu wiele środków chemioterapeutycznych wywołuje niepożądane skutki uboczne, takie jak mdłości, wymioty, niedokrwistość, wypadanie włosów lub inne objawy. Te skutki uboczne są przejściowe i istnieją leki, które mogą pomóc złagodzić wiele z tych skutków ubocznych. Wraz z postępem wiedzy badacze wynaleźli nowsze środki chemioterapeutyczne, które nie tylko skuteczniej zabijają komórki nowotworowe, ale także powodują mniej skutków ubocznych u pacjenta.

Chemioterapię podaje się pacjentom na wiele różnych sposobów. W niektórych przypadkach podaje się pigułki, a w innych stosuje się iniekcję dożylną lub inną. W przypadku chemioterapii drogą iniekcji pacjent udaje się na leczenie do gabinetu lekarza lub do szpitala. Inne środki chemioterapeutyczne wymagają ciągłego wlewu do krwioobiegu, 24 godziny na dobę. W przypadku tych typów chemioterapii przeprowadza się niewielki zabieg chirurgiczny w celu wszczepienia niewielkiej pompy noszonej przez pacjenta. Wówczas pompa powoli podaje lek. W wielu przypadkach umieszcza się stałe miejsce dostępu w żyle pacjenta, aby wyeliminować konieczność powtarzalnych ukłuć igłą.

Radioterapia jest inną powszechnie stosowaną bronią w walce z rakiem. Promieniowanie zabija komórki nowotworowe uszkadzając DNA w komórkach nowotworowych. Promieniowanie stosuje się w róż ny sposób. Najczę stszy sposób obejmuje skierowanie wią zki promieniowania na pacjenta w wysoce precyzyjny sposób i zogniskowanie jej na nowotworze. Aby to przeprowadzić pacjent leż y na stole, wiązka porusza się wokół niego/niej. Procedura trwa przez minuty, ale może być powtarzana codziennie przez kilka tygodni (zależnie od typu nowotworu), aby osiągnąć konkretną całkowitą przepisaną dawkę.

Czasami stosowana inna metoda napromieniania, nazywana brachyterapią, obejmuje wszczepienie radioaktywnych peletek (ziaren) lub drutów do organizmu w obszar nowotworu. Implanty mogą być tymczasowe lub stałe. W przypadku implantów stałych promieniowanie w ziarnach zanika w ciągu dni lub tygodni, tak że pacjent nie staje się radioaktywny. W przypadku implantów tymczasowych całkowita dawka promieniowania jest zazwyczaj dostarczana przez kilka dni i pacjent musi pozostać w tym czasie w szpitalu. W przypadku obu typów brachyterapii promieniowanie zazwyczaj dostarcza się do bardzo ściśle określonego obszaru, aby osiągnąć miejscowe zwalczenie nowotworu (w przeciwieństwie do działania na cały organizm jak w przypadku chemioterapii).

Niektórzy dokładnie wybrani pacjenci mogą być kierowani na przeszczepy szpiku kostnego. Procedurę tę zazwyczaj przeprowadza się gdy pacjent ma nowotwór, który jest szczególnie agresywny, albo gdy ma nowotwór, który nawrócił po leczeniu standardową terapią. Przeszczep szpiku kostnego jest skomplikowaną procedurą. Jest wiele jego typów i różnią się one pod względem wywoływanych skutków ubocznych oraz leczenia. Większość przeszczepów wykonuje się w specjalnych ośrodkach i w wielu przypadkach ich zastosowanie uważa się za eksperymentalne.

Istnieje wiele innych terapii, ale większość z nich jest wciąż badana w próbach klinicznych i nie należą jeszcze do standardowego postępowania. Przykłady obejmują stosowanie immunoterapii, przeciwciał monoklonalnych, czynników przeciw angiogenezie i terapii genowej.

Immunoterapia: Istnieją różne techniki zaprojektowane aby pomóc własnemu układowi immunologicznemu pacjenta w zwalczaniu nowotworu, zupełnie niezależnie od radioterapii i chemioterapii. Często aby osiągnąć ten cel, badacze wstrzykują pacjentowi specjalnie opracowaną szczepionkę.

Przeciwciała monoklonalne: Są to przeciwciała zaprojektowane do przyłączenia do komórek rakowych (ale nie do prawidłowych komórek) przez wykorzystanie różnic pomiędzy komórkami rakowymi i nierakowymi pod względem ich antygenowości i/lub innych cech. Pacjentowi mogą być podawane przeciwciała same lub sprzężone z różnymi związkami cytotoksycznymi albo w postaci radioaktywnej, tak że przeciwciało selektywnie dociera do komórek rakowatych, tym samym dostarczając środek toksyczny lub radioaktywność do pożądanych komórek.

Czynniki przeciw angiogenezie: Z uwagi na to, że komórki rakowe szybko się dzielą i nowotwory rosną, może to szybko spowodować niedobór dostarczanej krwi. Aby to zrekompensować niektóre nowotwory wydzielają substancje uważane za pomagające w wywołaniu wzrostu naczyń krwionośnych w ich pobliżu, tym samym dostarczając komórkom rakowym naczyniowe źródło substancji od4

PL 207 591 B1 żywczych. Zaprojektowano terapie doświadczalne, które hamują wzrost naczyń krwionośnych w nowotworach.

Terapia genowa: Rak jest produktem serii mutacji, które ostatecznie prowadzą do powstania komórki rakowej i jej nadmiernej proliferacji. Raki można leczyć wprowadzając geny do komórek rakowych, które będą działać tak, żeby sprawdzać lub hamować proliferację raka, uruchamiać zaprogramowane w komórce mechanizmy niszczenia komórki, wzmacniać immunologiczne rozpoznawanie komórki lub eksprymować prolek, który ulega przemianie w toksyczny metabolit albo cytokinę, która hamuje wzrost nowotworu.

Łagodne nowotwory i wady rozwojowe można także leczyć różnymi sposobami obejmującymi operacje chirurgiczne, radioterapię, terapię lekami, ablację cieplną lub elektryczną, krioterapię i inne. Pomimo tego, że łagodne nowotwory nie dają przerzutów, mogą one osiągać duże rozmiary i mogą nawracać. Chirurgiczna ekstyrpacja łagodnych nowotworów wiąże się ze wszystkimi trudnościami i skutkami ubocznymi operacji chirurgicznej w znaczeniu ogólnym i czę sto musi być wykonywana powtórnie w przypadku niektórych łagodnych nowotworów, takich jak gruczolaki przysadki mózgowej, oponiaki mózgu, rozrost prostaty i inne.

Istnieją inne stany, w których występują niepożądane elementy komórkowe, i selektywne usunięcie komórek jest pożądane. Przykładowo choroby serca i udary są często spowodowane miażdżycą tętnic, która jest proliferacyjną zmianą chorobową obejmującą elementy włóknisto-tłuszczowe i zmodyfikowane komórki mięśni gładkich, które zniekształcają ścianę naczynia krwionośnego, zwężają światło naczynia, ograniczają przepływ krwi, predysponują do powstawania ogniskowych skrzepów krwi i ostatecznie prowadzą do zablokowania naczynia i zawału. Istnieją różne terapie miażdżycy tętnic, takie jak przeszczepy omijające; sztuczne przeszczepy; angioplastyka z rekanalizacją, łyżeczkowanie, napromienianie, terapia laserowa lub usunięcie zmian w inny sposób; farmakoterapia w celu zahamowania miażdżycy tętnic przez obniżanie poziomu lipidów; terapie przeciwzakrzepowe oraz ogólne postępowanie obejmujące dietę, wysiłek fizyczny i styl życia. Potrzebny jest sposób usuwania uszkodzeń miażdżycowych bez ryzyka i skutków ubocznych zabiegów chirurgicznych.

Inne przykłady niepożądanych elementów komórkowych, w przypadku których pożądane jest selektywne usunięcie komórek, obejmują rozrosty wywoływane wirusem, takie jak brodawki. Innym przykładem są przerostowe masy zapalne występujące w stanach zapalnych oraz przerostowe blizny lub bliznowce. Można wymienić jeszcze kolejne przykłady w kontekście kosmetyki, tak jak usuwanie niepożądanego owłosienia, np. włosów na twarzy lub obkurczanie niepożądanych obszarów tkanek w celach kosmetycznych, takich jak skóra właściwa i tkanki łączne twarzy oraz skóra właściwa i tkanka łączna kończyn.

Inne przykłady niepożądanych elementów komórkowych, w przypadku których pożądane jest selektywne usunięcie komórek lub zahamowanie proliferacji komórek, obejmują stenozę i restenozę jakiejkolwiek tętnicy, zastawki lub kanału w układzie krążenia, obejmujących, ale nie wyłącznie, zastawki (np. stenozę aorty, która obejmuje zwężenie ujścia zastawki aortalnej), tętnic wieńcowych (np. stwardnienie ujścia tętnic wieńcowych, które obejmuje zwężenie ujścia tętnic wieńcowych), tętnic szyjnych i tętnic nerkowych. Inne przykłady obejmują zahamowanie lub usunięcie niepożądanych rozrostów lub mas komórkowych powodujących częściowe lub całkowite zatkanie urządzeń medycznych, takich jak stenty umieszczone lub wszczepione w naczyniu krwionośnym w celu leczenia stenoz, zwężeń lub tętniaków, albo w drogach moczowych i drogach żółciowych.

Jeszcze inne przykłady będą oczywiste dla fachowców. We wszystkich lub większości z tych przypadków istnieje potrzeba znalezienia terapii, które mogą usunąć lub zniszczyć niepożądane elementy komórkowe bez ryzyka i skutków ubocznych związanych ze zwykłymi terapiami, lub usunąć niepożądane elementy komórkowe bardziej precyzyjnie.

Białka włókienek neuronalnych (NTP) stanowią rodzinę ostatnio scharakteryzowanych białek mózgowych. Jeden członek tej rodziny, AD7c-NTP, jest fosfoproteiną o masie ~41 kD związaną z błoną, która działa w związku z powstawaniem wypustek neurytów (de la Monte i in., J Clin. Invest., 100: 3093-3104 (1997); de la Monte i in., Alz., Rep., 2: 327-332 (1999); de la Monte SM i Wands JR, Journal of Alzheimer's Disease, 3: 345-353 (2001)). Gen kodują cy AD7c-NTP i przewidywaną sekwencję białkową AD7c-NTP zidentyfikowano i opisano (de la Monte i in., J. Clin. Invest., 100 : 3093-3104 (1997)). Oprócz składników o masie ~41 kD, zidentyfikowano inne rodzaje białek włókienek neuronalnych (o masie ~26 kD, ~21 kD, ~17 kD i ~15 kD) i powiązano je z nowotworami neuroektodermalnymi, gwiaź dziakami i glejakami oraz z uszkodzeniami w wyniku niedotlenienia, niedokrwienia i zawału mózgu (Xu i in., Cancer Research, 53: 3823-3829 (1993);

PL 207 591 B1 de la Monte i in., J Neuropathol. Exp. Neurol., 55 (10):1038-50 (1996), de la Monte i in., J. Neurol. Sci., 138 (1-2):26-35 (1996); de la Monte i in., J Neurol. Sci., 135 (2):118-25 (1996); de la Monte i in., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997) oraz de la Monte i in., Alz. Rep., 2: 327-332 (1999)).

Rodzaje białka włókienek neuronalnych opisano i zastrzeżono w opisach patentowych US nr 5948634, 5948888 i 5830670, wszystkie dotyczące „Neural Thread Protein Gene Expression and Detection of Alzheimer's Disease”, oraz w opisie patentowym US 6071705, „Method of Detecting Neurological Disease or Dysfunction”. Jak podano w tych opisach patentowych, NTP ulega nadekspresji i jest wytwarzane podczas śmierci komórki.

Zatem martwe i umierające komórki nerwowe są opisywane jako nadprodukujące NTP, a tym samym jego obecność oznacza śmierć komórek nerwowych i początek choroby Alzheimera (AD).

Inne rodzaje białka włókienek neuronalnych zidentyfikowano jako inne produkty genu AD7c-NTP (np. białko o długości 112 aminokwasów opisane w bazie danych NCBI Entrez-Protein database pod nr dostępu XP_032307 PID g15928971) lub jako podobne do białek włókienek neuronalnych (np. białko o długości 106 aminokwasów opisane w bazie danych NCBI Entrez-Protein database pod nr dostępu AAH14951 PID g15928971.

Białko włókienek neuronalnych jest związane z AD, a NTP ulega nadekspresji w związku ze śmiercią komórek w AD. AD7c-NTP mRNA jest nadeksprymowany w mózgu z AD w porównaniu z kontrolą ; poziomy biał ka AD7c-NTP w mózgu i CSF są wyż sze przy AD niż w przypadku kontroli; oraz immunoreaktywność AD7C-NTP jest wykrywana w płytkach starczych, w kłąbach neurofibrylarnych (NFT), degenerujących neuronach, włóknach neuropilowych oraz w dystroficznych wyrostach neurotycznych w mózgach osób z AD i zespołem Downa (Ozturk i in.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:419-423 (1989); de la Monte i in., J Clin. Invest., 86 (3):1004-13 (1990); de la Monte i in., J Neurol. Sci., 113 (2):152-64 (1992); de la Monte i in., Ann. Neurol., 32 (6):733-42 (1992); de la Monte i in., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55 (10):1038-50 (1996), de la Monte i in., J.Neurol. Sci., 138 (1-2): 26-35 (1996); de la Monte i in., J. Neurol. Sci., 135 (2): 118-25 (1996); de la Monte i in., J Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997) oraz de la Monte i in., Alz., Rep., 2:327-332 (1999)). NTP jest umiejscowione w komórkach, w drobnych wyrostkach w neuropilu lub występuje zewnątrzkomórkowo zarówno w mózgach osób z AD i zespołem Downa, de la Monte i in., Ann. Neurol., 32 (6):733-42 (1992).

Podwyższone poziomy białka AD7c-NTP wykryto zarówno w CSF, jak i w moczu pacjentów z AD (de la Monte i Wands, Front Biosci 7:989-96 (2002); de la Monte i Wands, Journal of Alzheimer' s Disease 3:345-353 (2001); Munzar i in., Alzheimer's Reports 4:61-65 (2001); Kahle i in., Neurology 54:1498-1504 (2000); Munzar i in., Alzheimer Reports 3:155-159 (2000); de la Monte i in., Alzheimer's Reports 2:327-332 (1999); oraz de la Monte i in., J Clin Invest 100:3093-3104 (1997).

Nadekspresję NTP powiązano także z procesem śmierci komórek w chorobie Alzheimera (de la Monte i Wands, J. Neuropathol. Exp. Neurol., 60:195-207 (2001); de la Monte i Wands, Cell Mol Life Sci 58:844-49 (2001). AD7c-NTP zidentyfikowano w tkance mózgowej osób z zespołem Downa (Wands i in., międzynarodowa publikacja patentowa WO 90/06993; de la Monte i in., J Neurol Sci 135:118-25 (1996); de la Monte i in., Alz., Rep., 2: 327-332 (1999)). Istnieją także pewne dowody, że nadekspresja NTP może być także związana z jaskrą z normalnym ciśnieniem (Golubnitschaja-Labudova i in. , Curr Eye Res 21:867-76 (2000)).

Udowodniono, że NTP jest skutecznym środkiem do wywoływania śmierci komórek zarówno w hodowlach in vitro komórek glejaka i komórek nerwiaka niedojrzał ego, jak i in vivo w prawidł owej tkance mięśniowej, podskórnej tkance łącznej i skórze właściwej gryzoni oraz w różnych nowotworach pochodzących i niepochodzących od ludzi, w tym w raku sutka, raku i brodawczaku skóry, raku jelita, glejaku mózgu, oraz w innych modelach gryzoni. Patrz, publikacja US 22030054990.

Udowodniono także, że pewne sekwencje peptydowe i fragmenty AD7C-NTP oraz innych rodzajów NTP są skutecznymi środkami wywołującymi śmierć komórek zarówno in vitro w hodowlach komórek glejaka i nerwiaka niedojrzałego i/lub in vivo w tkance mięśniowej, podskórnej tkance łącznej i skórze wła ściwej oraz innych tkankach normalnych gryzoni. Patrz publikacja US 20030096350 oraz opisy patentowe US 7192929 i US 7241738.

Nadal istnieje potrzeba opracowania nowych, mniej toksycznych terapii do leczenia niepożądanych elementów komórkowych. Wynalazek spełnia tę potrzebę.

Wynalazek jest oparty częściowo na ustaleniu, że peptydy zawierające sekwencje aminokwasowe odpowiadające części sekwencji aminokwasowych białek włókienek neuronalnych innych gatunków, innych niż AD7c-NTP, są zdolne do leczenia i/lub niszczenia niepożądanych proliferacji komórek. Niepożądane proliferacje komórek obejmują, między innymi, łagodne i złośliwe nowotwory,

PL 207 591 B1 rozrost gruczołów (np. prostaty), niepożądane owłosienie twarzy, brodawki i niepożądaną tkankę tłuszczową.

Wynalazek dotyczy peptydu NTP o sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy obejmującej:

SEQ ID NO. 9 (Met-Met-Val-Cys-Trp-Asn-Arg-Phe-Gly-Lys-Trp-Val-Tyr-Phe-Ile);

SEQ ID NO. 10 (Ser-Ala-Ile-Phe-Asn-Phe-Gly-Pro-Arg-Tyr-Leu-Tyr-His-Gly-Val);

SEQ ID NO. 11 (Pro-Phe-Tyr-Phe-Leu-Ile-Leu-Val-Arg-Ile-Ile-Ser-Phe-Leu-Ile);

SEQ ID NO. 12 (Gly-Asp-Met-Glu-Asp-Val-Leu-Leu-Asn-Cys-Thr-Leu-Leu-Lys-Arg);

SEQ ID NO. 13 (Ser-Ser-Arg-Phe-Arg-Phe-Trp-Gly-Ala-Leu-Val-Cys-Ser-Met-Asp);

SEQ ID NO. 14 (Ser-Cys-Arg-Phe-Ser-Arg-Val-Ala-Val-Thr-Tyr-Arg-Phe-Ile-Thr); oraz

SEQ ID NO. 15 (Leu-Leu-Asn-Ile-Pro-Ser-Pro-Ala-Val-Trp-Met-Ala-Arg-Asn-Thr).

Wynalazek dotyczy również peptydu NTP określonego powyżej do stosowania jako lek.

Wynalazek dotyczy ponadto środka zawierającego substancję czynną oraz nośnik, charakteryzującego się tym, że jako substancję czynną zawiera peptyd określony powyżej.

Wynalazek umożliwia leczenie niepożądanych proliferacji komórek (łagodne i złośliwe nowotwory, rozrost gruczołów, np. prostaty, niepożądane owłosienie twarzy, brodawki i niepożądana tkanka tłuszczowa) przez podawanie ssakowi, potrzebującemu takiego leczenia, terapeutycznie skutecznej ilości peptydu zawierającego sekwencję aminokwasową (lub więcej niż jedną sekwencję) odpowiadającą części sekwencji aminokwasowej rodzajów białka włókienek neuronalnych (NTP) innych niż AD7c-NTP.

Taki peptyd („peptyd NTP) można podawać sam lub w postaci sprzężonej z nośnikiem lub przeciwciałem. Peptyd NTP można podawać domięśniowo, doustnie, dożylnie, śródotrzewnowo, śródmózgowo (śródmiąższowo), do komór mózgowych, donowotworowo, do uszkodzenia, śródskórnie, doodbytniczo, donosowo, doocznie, dotętniczo, domiejscowo, przezskórnie, w aerozolu, we wlewach, w zastrzykach uderzeniowych, we wszczepianym urządzeniu, w układzie o przedłużonym uwalnianiu itd., samodzielnie lub w postaci sprzężonej z nośnikiem. Alternatywnie peptyd NTP można eksprymować in vivo przez podawanie genu eksprymującego peptyd, przez podawanie szczepionki wywołującej takie wytwarzanie lub przez wprowadzanie komórek, bakterii lub wirusów eksprymujących peptyd in vivo, w wyniku modyfikacji genetycznej, albo w inny sposób.

Ponadto peptyd NTP można stosować w połączeniu z innymi terapiami do leczenia łagodnych lub złośliwych nowotworów oraz innych niepożądanych lub szkodliwych rozrostów komórkowych.

Zarówno powyższy ogólny opis, jak i poniższy opis szczegółowy są przykładowe i wyjaśniające, i mają na celu dalsze wyjaśnienie wynalazku. Inne przedmioty, korzyści i cechy będ ą wyraźnie wynikać z poniższego szczegółowego opisu wynalazku.

Należy wziąć pod uwagę, że chociaż poniżej opisano konkretne metodologie, protokoły, linie komórkowe, wektory i odczynniki, mogą się one różnić. Poza tym stosowana terminologia ma na celu tylko opisanie konkretnych postaci i nie ma charakteru ograniczającego wynalazek.

Określenia i wyrażenia stosowane w opisie mają znaczenie podane poniżej, o ile nie wskazano inaczej.

W opisie określenia wyrażone w liczbie pojedynczej obejmują takż e odniesienia do liczby mnogiej, chyba że kontekst wyraźnie wskazuje inaczej. Tak więc np. odniesienie do „komórki gospodarza obejmuje wiele takich komórek gospodarzy, a odniesienie do „przeciwciała jest odniesieniem, do jednego lub większej liczby przeciwciał lub ich odpowiedników znanych fachowcom itd.

Określenie „AD7c-NTP dotyczy białka o masie ~41 kD oraz genu i sekwencji kwasu nukleinowego kodujących to białko, opisanych w de la Monte i in., J. Clin. Invest., 100:3093-104 (1997), w sekwencjach 120 i 121 w opisach patentowych US nr 5948634, 5948888 i 5830670.

Określenie „NTP dotyczy białek włókienek neuronalnych i pokrewnych cząsteczek (w tym białek włókienek trzustki) innych niż AD7C-NTP, jak opisano w opisach patentowych US nr 5948634, 5948888, 5830670 i 6071705 oraz w de la Monte i in., J. Neuropathol. Exp. Neurol, 55(10):1038-50 (1996), de la Monte i in., J. Neurol. Sci., 138 (1-2): 26-35 (1996); de la Monte i in., J. Neurol. Sci., 135(2)118-25 (1996), de la Monte i in., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997) oraz de la Monte i in., Alz. Rep., 2:327-332 (1999). Określenie „NTP obejmuje, ale nie wyłącznie:

(a) rodzaje białka włókienek neuronalnych o masie ~42, ~26, ~21, ~17, ~14 i ~8 kD, jak opisano w opisach patentowych US nr 5948634, 5948888, 5830670 i 6071705 oraz w de la Monte i in., J. Neuropathol. Exp. Neural, 55 (10):1038-50 (1996), de la Monte i in., J. Neurol. Sci., 138 (1-2): 26-35 (1996); de la Monte i in., J. Neurol. Sci., 135 (2):118-25 (1996), de la Monte i in., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997) oraz de la Monte i in., Alz. Rep., 2:327-332 (1999);

PL 207 591 B1 (b) białka specyficznie rozpoznawane przez przeciwciało monoklonalne nr 2 z depozytu American Type Culture Collection, Manassas, Va., pod nr dostępu HB-12546 lub przeciwciało monoklonalne nr 5 z depozytu American Type Culture Collection, Manassas, Va., pod numerem dostępu HB-12545;

(c) białka kodowane przez gen AD7c-NTP, włącznie z wariantami składania;

(d) 122-aminokwasowe białko włókienek neuronalnych opisane w sekwencji 40 z opisów patentowych US nr 5830670, 5948634 i 5948888 oraz wymienione w NCBI Entrez-Protein pod nr dostępu AAE25447, PID g10048540, którego sekwencję aminokwasową zilustrowano na fig. 1 („NTP-122);

(e) 112-aminokwasowe białko włókienek neuronalnych wymienione w NCBI Entrez-Protein pod nr dostępu XP_032307, PID g14725132, którego sekwencję aminokwasową zilustrowano na fig. 2 („NTP-112);

(f) 106-aminokwasowe białko włókienek neuronalnych wymienione w NCBI Entrez-Protein pod nr dostępu AAH14951 PID g15928971, którego sekwencję aminokwasową zilustrowano na fig. 3 („NTP-106);

(g) 98-aminokwasowe białko włókienek neuronalnych opisane w sekwencji 30 z opisów patentowych US nr 5830670, 5948634 i 5948888 oraz wymienione w NCBI Entrez-Protein pod nr dostępu AAE25445, PID g10048538, którego sekwencję aminokwasową zilustrowano na fig. 4 („NTP-98);

(h) 75-aminokwasowe białko włókienek neuronalnych opisane w sekwencji 48 z opisów patentowych US nr 5830670, 5948634 i 5948888 oraz wymienione w NCBI Entrez-Protein pod nr dostępu AAE25448, PID g10048541, którego sekwencję aminokwasową zilustrowano na fig. 5 („NTP-75);

(i) 68-aminokwasowe białko włókienek neuronalnych opisane w sekwencji 36 z opisów patentowych US nr 5830670, 5948634 i 5948888 oraz wymienione w NCBI Entrez-Protein pod nr dostępu AAE25446, PID g10048539, którego sekwencję aminokwasową zilustrowano na fig. 6 („NTP-68);

(j) 61-aminokwasowe białko podobne do białka włókienek neuronalnych wymienione w NCBI Entrez-Protein pod nr dostępu AAH02534, PID g12803421, którego sekwencję aminokwasową zilustrowano na fig. 7 („NTP-61);

(k) białko włókienek trzustki;

(l) białko włókienek neuronalnych trzustki (nPTP) opisane w opisie patentowym US nr 6071705;

oraz (m) białka specyficznie rozpoznawane przez przeciwciała wytwarzane przez hybrydomę z grupy obejmującej HB 9934, HB 9935 i HB 9936 zdeponowanych w American Type Culture Collection.

Określenie „NTP obejmuje homologi, fragmenty, pochodne, warianty, białka fuzyjne i peptydowe mimetyki białek NTP, chyba, że kontekst wskazuje inaczej.

Określenie „peptyd NTP dotyczy peptydów zawierających sekwencje aminokwasowe odpowiadające co najmniej części sekwencji aminokwasowej NTP, rodzajów NTP lub fragmentów rodzajów NTP i obejmuje homologi, pochodne, warianty, białka fuzyjne i peptydowe mimetyki takich peptydów, o ile kontekst nie wskazuje inaczej.

Określenie „fragment dotyczy białka lub polipeptydu zawierającego ciągłą podsekwencję sekwencji aminokwasowej białka NTP lub peptydu NTP i obejmuje naturalnie występujące fragmenty, takie jak warianty składania i fragmenty powstałe w wyniku naturalnie występującej in vivo aktywności proteazowej. Taki fragment może być skrócony na N-końcu, C-końcu i/lub wewnętrznie (np. w wyniku naturalnego składania). Można wytworzyć takie fragmenty z N-końcową metioniną lub bez niej. Określenie „fragment obejmuje fragmenty, identyczne lub różne, z tego samego białka NTP lub peptydu NTP, ze wspólną sekwencją sąsiadujących aminokwasów lub bez niej, połączonych razem, bezpośrednio albo przez łącznik.

Określenie „wariant dotyczy białka lub polipeptydu, w którym, obecne jest jedno lub większa liczba podstawień, delecji i/lub insercji aminokwasów w porównaniu z sekwencją aminokwasową białka NTP lub peptydu NTP i obejmuje naturalnie występujące alleliczne warianty lub warianty alternatywnego składania białka NTP lub peptydu NTP. Określenie „wariant obejmuje zastąpienie jednego lub większej liczby aminokwasów w sekwencji peptydu podobnymi lub homologicznymi aminokwasami lub niepodobnymi aminokwasami. Istnieje wiele skal według których aminokwasy można uszeregować jako podobne lub homologiczne. (Gunnar von Heijne, Sequence Analysis in Molecular Biology, str. 123-39 (Academic Press, New York, NY 1987). Korzystne warianty obejmują podstawienia alaniny w jednej lub wię kszej liczbie pozycji aminokwasowych. Inne korzystne podstawienia obejmują podstawienia konserwatywne, które wywierają niewielki wpływ lub nie wywierają wpływu na ogólny ładunek netto, polarność lub hydrofobowość białka. Konserwatywne podstawienia podano w tabeli 1 poniżej.

PL 207 591 B1

Tabela 1

Konserwatywne podstawienia aminokwasów

Zasadowe: arginina lizyna histydyna

Kwasowe: kwas glutaminowy kwas asparaginowy

Nienaładowane polarne: glutamina asparagina seryna treonina tyrozyna

Niepolarne: fenyloalanina tryptofan cysteina glicyna alanina walina prolina metionina leucyna izoleucyna

Tabela 2 przedstawia inny schemat podstawień aminokwasów. Tabela 2

Pierwotna reszta

Ala

Arg

Asn

Asp

Cys

Gln

Glu

Gly

His

Ile

Leu

Lys

Met

Phe

Ser

Thr

Trp

Tyr

Val

Podstawienia gly; ser lys gln; his glu ser asn asp ala; pro asn; gln leu; val ile; val arg; gln; glu leu; tyr; ile met; leu; tyr thr ser tyr trp; phe ile; leu

Inne warianty mogą zawierać mniej konserwatywne podstawienia aminokwasowe, tak jak przez wybranie reszt różniących się bardziej znacząco ich wpływem na utrzymanie (a) struktury szkieletu polipeptydu w obszarze podstawienia, np. w konformacji kartki lub helikalnej, (b) ładunku lub hydrofobowości cząsteczki w docelowym miejscu, albo (c) objętości łańcucha bocznego. Podstawieniami, w przypadku których ogólnie przewiduje się , ż e wywierają bardziej znaczą cy wpł yw na dzia łanie, są takie, w których (a) glicyna i/lub prolina jest podstawiona inną resztą aminokwasową lub jest wydeletowana albo wstawiona; (b) reszta hydrofilowa, np. serylowa lub treonylowa, jest podstawiona (lub zastąpiona) resztą hydrofobową, np. leucylową, izoleucylową, fenyloanlaninową, walilową lub alanilową; (c) reszta cysteinowa jest podstawiona (lub zastąpiona) dowolną inną resztą; (d) reszta mająca elektrododatni łańcuch boczny, np. lizylowa, arginylowa lub histydylowa jest podstawiona (lub zastąpiona) resztą mającą ładunek elektroujemny, np. glutamylem lub aspartylem; albo (e) reszta mająca duży łańcuch boczny, np. fenyloalanina, jest podstawiona (lub zastąpiona) resztą nie mającą takiego

PL 207 591 B1 łańcucha, np. glicyną. Inne warianty obejmują te zaprojektowane tak, aby wytworzyć nowe miejsce(-a) glikozylacji i/lub fosforylacji, albo te zaprojektowane tak, aby usunąć istniejące miejsce(-a) glikozylacji i/lub fosforylacji. Warianty obejmują podstawienie co najmniej jednego aminokwasu w miejscu glikozylacji, miejscu rozszczepienia proteolitycznego i/lub reszty cysteiny. Warianty także obejmują białka NTP i peptydy NTP z dodatkowymi resztami aminokwasowymi przed i po sekwencji aminokwasowej białka NTP lub peptydu NTP w peptydach łącznikowych. Przykładowo resztę cysteiny można dodać zarówno na N-, jak i na C-końcu peptydu NTP w celu umożliwienia cyklizacji peptydu NTP przez utworzenie wiązania disiarczkowego. Określenie „wariant obejmuje także polipeptydy mające sekwencję peptydu NTP zawierającą od co najmniej jednej do 25 lub większej liczby dodatkowych reszt aminokwasowych flankujących na końcu 3' albo 5' peptydu NTP.

Określenie „pochodna dotyczy chemicznie modyfikowanego białka lub polipeptydu, które zostały zmodyfikowane chemicznie lub w wyniku naturalnych procesów, takich jak obróbka i inne modyfikacje posttranslacyjne, ale także metodami modyfikacji chemicznej, jak np. przez dodanie jednej lub większej liczby cząsteczek glikolu polietylenowego, cukrów, fosforanów i/lub innych podobnych cząsteczek, przy czym cząsteczka lub cząsteczki nie są naturalnie dołączone do białek NTP lub peptydów NTP typu dzikiego. Pochodne obejmują sole. Takie modyfikacje chemiczne są dokładnie opisane w podstawowych tekstach oraz w bardziej szczegółowych monografiach, a także w obszernej literaturze badawczej i są one dobrze znane fachowcom. Należy wziąć pod uwagę, że taki sam typ modyfikacji może być obecny w takim samym lub zmiennym stopniu w kilku miejscach w danym białku lub polipeptydzie. Dane białko lub polipeptyd może także zawierać wiele typów modyfikacji. Modyfikacje mogą wystąpić gdziekolwiek w białku lub polipeptydzie, w tym w szkielecie polipeptydu, łańcuchach bocznych aminokwasów; oraz na N- i C-końcach. Modyfikacje obejmują np. acetylowanie, acylowanie, ADP-rybozylowanie, amidowanie, kowalencyjne przyłączenie flawiny, kowalencyjne przyłączenie ugrupowania hemowego, kowalencyjne przyłączenie nukleotydu lub pochodnej nukleotydu, kowalencyjne przyłączenie lipidu lub pochodnej lipidu, kowalencyjne przyłączenie fosfatydyloinozytolu, sieciowanie, cyklizację, tworzenie wiązań disiarczkowych, odmetylowanie, tworzenie kowalencyjnych wiązań poprzecznych, tworzenie cysteiny, tworzenie piroglutaminianu, formylowanie, γ-karboksylowanie, glikozylację, tworzenie kotwicy GPI, hydroksylowanie, jodowanie, metylowanie, mirystoilowanie, utlenianie, obróbkę proteolityczną, fosforylowanie, prenylowanie, racemizację, glikozylację, przyłączenie lipidu, siarczanowanie, γ-karboksylację reszt kwasu glutaminowego, hydroksylowanie i ADP-rybozylowanie, selenoilowanie, siarczanowanie, pośredniczone przez tRNA dodanie aminokwasów do białek, takie jak arginylowanie i ubikwitynowanie. Patrz, np. Proteins-Structure And Molecular Properties, wyd. 2, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993) and Wold, F., „Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, str. 1-12 w Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, red., Academic Press, New York (1983); Seifter i in., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990) oraz Rattan i in., „Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62 (1992). Określenie „pochodne obejmuje modyfikacje chemiczne powodujące rozgałęzienie i/lub cyklizację białka lub peptydu. Cykliczne, rozgałęzione i rozgałęzione koliste białka lub polipeptydy mogą powstać w wyniku naturalnych procesów posttranslacyjnych i mogą być także wytwarzane całkowicie syntetycznymi metodami.

Określenie „homolog dotyczy białka, które jest co najmniej w 60% identyczne pod względem sekwencji aminokwasowej z białkiem NTP lub peptydem NTP zależnie od okoliczności, co określa się znanymi metodami, które powszechnie stosuje się do porównywania podobieństwa w pozycjach aminokwasów dwóch polipeptydów. Stopień podobieństwa lub identyczności pomiędzy dwoma białkami można łatwo obliczyć znanymi metodami, w tym, ale nie wyłącznie, opisanymi w Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., red., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith D. W., red., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, część I, Griffin A. M., i Griffin H. G., red., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov M. i Devereux J., red., M Stockton Press, New York, 1991 oraz Carillo H. i Lipman D., SIAM, J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Korzystne metody określania identyczności zaprojektowano w celu uzyskania największego dopasowania pomiędzy badanymi sekwencjami. Metody określania identyczności i podobieństwa są skodyfikowane w publicznie dostępnych programach komputerowych.

Korzystne programy komputerowe użyteczne do określania identyczności i podobieństwa pomiędzy dwiema sekwencjami obejmują, ale nie wyłącznie, pakiet programów GCG (Devereux, J., i in., Nucleic Acids Research, 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN i FASTA, Atschul S. F. i in.,

PL 207 591 B1

J. Molec. Biol, 215: 403-410 (1990). Program BLASTX jest publicznie dostępny z NCBI i innych źródeł (BLAST Manual, Altschul S. i in., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul S. i in., J. Mol. Biol, 215: 403-410 (1990)). Przykładowo, stosując algorytm komputerowy, taki jak GAP (Genetic Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), dwa białka lub polipeptydy, dla których ma być określony procent identyczności sekwencji, porównuje się w celu optymalnego dopasowania ich odpowiadających aminokwasów („zakres dopasowania, co wyznacza algorytm).

W połączeniu z algorytmem stosuje się karę za otwarcie przerwy (którą oblicza się jako 3 x (razy) średni diagonal; „średni diagonal oznacza średnią diagonalną zastosowanej macierzy porównującej; „diagonal oznacza punktację lub liczbę przypisaną każdemu perfekcyjnemu aminokwasowi przez konkretną macierz porównującą) oraz karę za wydłużenie przerwy (która zazwyczaj wynosi 1/10 razy kara za otwarcie przerwy), a także macierz porównującą, taka jak PAM 250 lub BLOSUM 62. Standardowa macierz porównująca (patrz, Dayhoff i in. w: Atlas of Protein Sequence and Structure, tom 5, suplement 3 [1978] macierz porównująca PAM250; patrz Henikoff i in., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 [1992] macierz porównująca BLOSUM 62) także może być stosowana przez algorytm. Następnie algorytm oblicza procent identyczności. Homologi zazwyczaj mają jedno lub większą liczbę aminokwasowych podstawień, delecji i/lub insercji w stosunku do porównywanego białka NTP lub peptydu NTP, zależnie od okoliczności.

Określenie „białko fuzyjne dotyczy białka, w którym jeden lub większa liczba peptydów NTP jest sfuzowana rekombinacyjnie lub sprzężona chemicznie (w tym sprzężona kowalencyjnie i niekowalencyjnie) z białkiem, takim jak (ale nie wyłącznie) przeciwciało lub fragment przeciwciała, jak fragment Fab lub krótki łańcuch Fv. Określenie „białko fuzyjne dotyczy także multimerów (tj. dimerów, trimerów, tetramerów i wyższych multimerów) peptydów NTP. Takie multimery obejmują homomeryczne multimery zawierające jeden peptyd NTP, heteromeryczne multimery zawierające więcej niż jeden peptyd NTP oraz heteromeryczne multimery zawierające co najmniej jeden peptyd NTP i co najmniej jedno inne białko. Takie multimery mogą być wynikiem hydrofobowych, hydrofilowych, jonowych i/lub kowalencyjnych asocjacji, wiązań lub połączeń, mogą być wytworzone przez sieciowanie za pomocą cząsteczek łącznikowych lub mogą być połączone pośrednio, np. przez wytworzenie liposomu.

Określenie „mimetyk peptydu lub „mimetyk oznacza biologicznie aktywne związki, które naśladują aktywność biologiczną peptydu lub białka, ale nie mają już natury chemicznej peptydu, czyli nie zawierają jakichkolwiek wiązań peptydowych (czyli wiązań amidowych pomiędzy aminokwasami). W niniejszym opisie okre ś lenie mimetyk peptydu stosuje się w szerszym znaczeniu jako obejmują ce cząsteczki, które nie mają wcale natury peptydowej, takie jak pseudopeptydy, semipeptydy i peptoidy. Przykłady mimetyków peptydów w szerszym znaczeniu (gdzie część peptydu jest zastąpiona strukturą, w której brak jest wiązań peptydowych) opisano poniżej. Jakkolwiek całkowicie lub częściowo niepeptydowe, mimetyki peptydów według wynalazku wykazują przestrzenne rozmieszczenie ugrupowań chemicznych, które blisko przypominają trójwymiarowe rozmieszczenie grup aktywnych w peptydzie NTP, na którym oparty jest mimetyk peptydu. Wskutek tej podobnej geometrii miejsca aktywnego, mimetyk peptydu wywiera wpływ na układy biologiczne, podobny do aktywności biologicznej peptydu NTP.

Mimetyki peptydów według wynalazku korzystnie są zasadniczo podobne zarówno pod względem trójwymiarowego kształtu, jak i aktywności biologicznej do opisanych tutaj peptydów NTP. Przykłady znanych w dziedzinie wynalazku metod strukturalnego modyfikowania peptydu z wytworzeniem mimetyku peptydu obejmują inwersję centrów chiralnych szkieletu prowadzącą do struktur reszt D-aminokwasów, które mogą, szczególnie na N-końcu prowadzić do zwiększenia odporności na rozkład proteolityczny bez niekorzystnego wpływu na aktywność. Przykład podano w publikacji „Tritriated D-ala¹-Peptide T Binding, Smith C. S. i in., Drug Development Res., 15, str. 371-379 (1988). Drugą metodą jest zmiana struktury cyklicznej w celu stabilizacji, tak jak N na C w międzyłańcuchowych imidach i laktamach (Ede i in., w Smith i Rivier (red.) „Peptides: Chemistry and Biology, Escom, Leiden (1991), str. 268-270). Przykładem tego są konformacyjnie ograniczone związki tymopentyno-podobne, takie jak ujawnione w opisie patentowym US 4457489 (1985) (Goldstein G. i in.). Trzecią metodą jest zastępowanie wiązań peptydowych w peptydzie NTP przez wiązania pseudopeptydowe, które nadają odporność na proteolizę.

Opisano szereg wiązań pseudopeptydowych, które ogólnie nie wpływają na strukturę i aktywność biologiczną peptydu. Jednym z przykładów tego podejścia jest podstawienie wiązaniami retro-inverso pseudopeptydowymi („Biologically active retroinverso analogues of thymopentin, Sisto A. i in., w Rivier, J. E. i Marshall, G. R. (red.) „Peptides, Chemistry, Structure and Biology, Escom, Leiden (1990), str. 722-773) oraz Dalpozzo i in., (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41:561-566). ZgodPL 207 591 B1 nie z tą modyfikacją sekwencje aminokwasowe peptydów mogą być identyczne z opisanymi tutaj sekwencjami peptydu NTP, z wyjątkiem tego, że jedno lub większa liczba wiązań peptydowych są zastąpione wiązaniem retro-inverso pseudopeptydowym. Korzystnie najbliższe N-końca wiązanie peptydowe jest podstawione, gdyż takie podstawienie nadaje odporność na proteolizę przez egzopeptydazy działające na N-koniec. Kolejne modyfikacje można także wprowadzić przez zastąpienie grup chemicznych aminokwasów innymi grupami chemicznymi o podobnej strukturze. Innym odpowiednim wiązaniem, pseudopeptydowym, odnośnie którego wiadomo, że wzmacnia stabilność względem rozszczepiania enzymatycznego przy braku lub niewielkiej utracie aktywności biologicznej jest zredukowane izosteryczne wiązanie pseudopeptydowe (Couder i in., (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41:181-184).

Zatem sekwencje aminokwasowe tych peptydów mogą być identyczne z sekwencjami peptydu NTP z wyjątkiem tego, że jedno lub większa liczba wiązań peptydowych jest zastąpiona izosterycznym wiązaniem pseudopeptydowym. Korzystnie najbliższe N-końca wiązanie peptydowe jest podstawione, gdyż takie podstawienie nadaje odporność na proteolizę przez egzopeptydazy działające na N-koniec. Synteza peptydów z jednym lub większą liczbą zredukowanych izosterycznych wiązań pseudopeptydowych jest znana (Couder i in., (1993), patrz powyżej). Inne przykłady obejmują wprowadzenie wiązań ketometylenowych lub metylosiarczkowych w celu zastąpienia wiązań peptydowych,

Peptoidowe pochodne peptydów NTP stanowią inną klasę mimetyków peptydów, które zachowują determinanty strukturalne ważne dla aktywności biologicznej, ale bez wiązań peptydowych, co nadaje odporność na proteolizę (Simon i in., Proc. Natl. Acad Sci USA, 8 9:9367-9371). Peptoidy są oligomerami N-podstawionych glicyn. Opisano kilka grup N-alkilowych, z których każda odpowiada łańcuchowi bocznemu naturalnego aminokwasu (Simon i in., (1992), patrz powyżej). Kilka lub wszystkie aminokwasy peptydów NTP można zastąpić N-podstawioną glicyną odpowiadającą zastępowanemu aminokwasowi.

Określenie „mimetyk peptydu lub „mimetyk obejmuje także odwrotne D peptydy i enancjomery, jak zdefiniowano poniżej.

Określenie „odwrotny D peptyd oznacza biologicznie aktywne białko lub peptyd składające się z D-aminokwasów uszeregowanych w odwrotnej kolejności w porównaniu z sekwencją L-aminokwasów peptydu NTP. Zatem C-końcowa reszta L-aminokwasowego peptydu NTP staje się N-końcową D-aminokwasowego peptydu itd. Przykładowo peptyd NTP, ETESH, staje się HdSdEdTdEd, gdzie Ed, Hd, Sd i Td są D-aminokwasami odpowiadającymi L-aminokwasom odpowiednio E, H, S i T.

Określenie „enancjomer oznacza biologicznie aktywne białko lub peptyd, w którym jedna lub większa liczba reszt L-aminokwasów w sekwencji aminokwasowej peptydu NTP jest zastąpiona odpowiednią(-mi) resztą (-ami) D-aminokwasów.

„Środek w użytym tutaj szerokim znaczeniu dotyczy środka zawierającego wymieniony peptyd lub sekwencję aminokwasową. Środek może stanowić suchy preparat, roztwór wodny lub środek jałowy. Środki zawierające peptydy NTP można stosować jako sondy do hybrydyzacji. Sondy można przechowywać w postaci liofilizowanej oraz mogą być one połączone ze środkiem stabilizującym, takim jak węglowodan. Przy hybrydyzacji sondę można umieścić w wodnym roztworze zawierającym sole, np. NaCl, detergenty np. dodecylosiarczan sodu (SDS) i inne składniki np. roztwór Denhardta, mleko w proszku, DNA z nasienia łososia itd.

Opisane aminokwasy i reszty aminokwasowe można określać według przyjętego jedno- lub trój-literowego kodu podanego w tabeli 3 poniżej. O ile nie zaznaczono inaczej, aminokwasy lub reszty są w naturalnie wystę pują cej postaci stereoizomeru L.

Tabela 3

Aminokwas Symbol jednoliterowy Symbol trójliterowy

Alanina A Ala

Arginina R Arg

Asparagina N Asn

Kwas asparaginowy D Asp

Cysteina C Cys

Glutamina Q Gln

Kwas glutaminowy E Glu

Glicyna G Gly

Histydyna H His

Izoleucyna I Ile

PL 207 591 B1

Leucyna L Leu

Lizyna K Lys

Metionina M Met

Fenyloalanina F Phe

Prolina P Pro

Seryna S Ser

Treonina T Thr

Tryptofan W Trp

Tyrozyna Y Tyr

Walina V Val

Jak już opisano powyżej, wynalazek dotyczy środka zawierającego określone peptydy NTP.

Korzystny peptyd NTP pochodzi z sekwencji aminokwasowej 122-aminokwasowej sekwencji NTP przedstawionej na fig. 1 (NTP[122]) lub 112-aminokwasowej sekwencji NTP przedstawionej na fig. 2 (NTP[112]).

Jednakże zastosowanie innych peptydów NTP opartych na częściach lub fragmentach innych cząsteczek z tej samej rodziny co NTP[122] i NTP[112], takich jak inne białka włókienek neuronalnych lub takich jak te przedstawione na fig. 3-7 oraz białka włókienek trzustki, jest także możliwe. Ponadto mogą być użyteczne inne białka zawierające całość lub część peptydu NTP, przy czym białka korzystnie mają taką samą, podobną lub zwiększoną aktywność biologiczną w porównaniu z peptydem NTP.

Sekwencje i fragmenty peptydowe AD7c-NTP oraz innych rodzajów NTP i podobnych wariantów oraz homologów także występują w różnych białkach pochodzących od ludzi i niepochodzących od ludzi („białkach pokrewnych). W szczególności gen AD7C-NTP zawiera sekwencje typu Alu, które są bardzo podobne do tych występujących także w innych genach w genomach ludzi i innych naczelnych.

Zatem uzasadnione jest założenie, że pewne, jeżeli nie wszystkie, peptydy NTP także okażą się skutecznymi środkami do wywoływania śmierci komórek, gdyż zawierają one sekwencje peptydowe identyczne, homologiczne lub bardzo podobne do sekwencji peptydowych występujących w AD7c-NTP i innych rodzajach NTP. W oparciu o podane tu wskazówki fachowiec moż e zsyntetyzować specyficzne pokrewne peptydy na podstawie sekwencji aminokwasowej dowolnego peptydu NTP, odnośnie którego stwierdzono, że jest skutecznym środkiem do wywoływania śmierci komórek, oraz może je zbadać pod względem skuteczności jako środków do wywoływania śmierci komórek.

Inne sekwencje peptydowe pochodzące z peptydu NTP, które uznano za skuteczny środek do wywoływania śmierci komórek, także mogą być skutecznymi środkami do wywoływania śmierci komórek. Fachowiec, w oparciu o podane tu wskazówki, może zsyntetyzować bez zbędnych doświadczeń fragmenty skutecznego peptydu NTP pokrywające całą sekwencję aminokwasową tego białka w celu zidentyfikowania innych skutecznych sekwencji peptydowych.

Peptydy NTP zawierające sekwencje aminokwasowe odpowiadające części sekwencji aminokwasowej NTP[122] obejmują, ale nie wyłącznie, następujące peptydy.

Peptyd NTP[122] nr 1 [SEQ ID NO. 8], NTP[122] p106-122 IDQQVLSRIKLEIKRCL

Ile-Asp-Gln-GLn-Val-Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Arg-Cys-Leu

Peptyd NTP[122] nr 2 [SEQ ID NO. 9], NTP[122] p1-15 MMVCWNRFGKWVYFI

Met-Met-Val-Cys-Trp-Asn-Arg-Phe-Gly-Lys-Trp-Val-Tyr-Phe-Ile

Peptyd NTP[122] nr 3 [SEQ ID NO. 10], NTP[122] p16-30 SAIFNFGPRYLYHGV

Ser-Ala-Ile-Phe-Asn-Phe-Gly-Pro-Arg-Tyr-Leu-Tyr-His-Gly-ValPeptyd NTP[122] nr 4 [SEQ ID NO. 11], NTP[122] p31-45 PFYFLILVRIISFLI

Pro-Phe-Tyr-Phe-Leu-Ile-Leu-Val-Arg-Ile-Ile-Ser-Phe-Leu-Ile

Peptyd NTP[122] nr 5 [SEQ ID NO. 12], NTP[122] p46-60 GDMEDVLLNCTLLKR

Gly-Asp-Met-Glu-Asp-Val-Leu-Leu-Asn-Cys-Thr-Leu-Leu-Lys-Arg

Peptyd NTP[122] nr 6 [SEQ ID NO. 13], NTP[122] p60-75 SSRFRFWGALVCSMD

Ser-Ser-Arg-Phe-Arg-Phe-Trp-Gly-Ala-Leu-Val-Cys-Ser-Met-Asp

Peptyd NTP[122] nr 7 [SEQ ID NO. 14], NTP[122] p76-90 SCRFSRVAVTYRFIT

Ser-Cys-Arg-Phe-Ser-Arg-Val-Ala-Val-Thr-Tyr-Arg-Phe-Ile-Thr

Peptyd NTP[122] nr 8 [SEQ ID NO. 15], NTP[122] p91-105 LLNIPSPAVWMARNT

Leu-Leu-Asn-Ile-Pro-Ser-Pro-Ala-Val-Trp-Met-Ala-Arg-Asn-Thr

Peptydy NTP według wynalazku zawierające sekwencje aminokwasowe odpowiadające części sekwencji aminokwasowej NTP[112] obejmują, ale nie wyłącznie, następujące peptydy.

PL 207 591 B1

Peptyd NTP[112] nr 1 [SEQ ID NO. 16], NTP[112] p1-15 MAQSRLTATSASRVQ

Met-Ala-Gln-Ser-Arg-Leu-Thr-Ala-The-Ser-Ala-Ser-Arg-Val-Gln

Peptyd NTP[112] nr 2 [SEQ ID NO. 17], NTP[112] p16-30 AILLSQPPKQLGLRA

Ala-Ile-Leu-Leu-Ser-Gln-Pro-Pro-Lys-Gln-Leu-Gly-Leu-Arg-Ala

Peptyd NTP[112] nr 3 [SEQ ID NO. 18], NTP[112] p31-45 PANTPLIFVFSLEAG

Pro-Ala-Asn-Thr-Pro-Leu-Ile-Phe-Val-Phe-Ser-Leu-Glu-Ala-Gly

Peptyd NTP[112] nr 4 [SEQ ID NO. 19], NTP[112] p46-60 FHHICQAGLKLLTSG

Phe-His-His-Ile-Cys-Gln-Ala-Gly-Leu-Lys-Leu-Leu-Thr-Ser Gly

Peptyd NTP[112] nr 5 [SEQ ID NO. 20], NTP[112] p61-75 DPPASAFQSAGITGV

Asp-Pro-Pro-Ala-Ser-Ala-Phe-Gln-Ser-Ala-Gly-Ile-Thr-Gly-Val

Peptyd NTP[112] nr 6 [SEQ ID NO. 21], NTP[112] p76-90 SHLTQPANLDKKICS

Ser-His-Leu-Thr-Gln-Pro-Ala-Asn-Leu-Asp-Lys-Lys-Ile-Cys-Ser

Peptyd NTP[112] nr 7 [SEQ ID NO. 22], NTP[112] p91-112 NGGSCYVAQAGLKLLASCNPSK

Asn-Gly-Gly-Ser-Cys-Tyr-Val-Ala-Gln-Ala-Gly-Leu-Lys-Leu-Leu-Ala-Ser-Cys-Asn-Pro-Ser-Lys

Peptydy NTP zawierające sekwencje aminokwasowe odpowiadające części sekwencji aminokwasowej 106-aminokwasowego NTP opisanego na fig. 3 (NTP[106]) obejmują, ale nie wyłącznie, następujące peptydy.

Peptyd NTP[106] nr 1 [SEQ ID NO. 23], NTP[106] p1-15 MWTLKSSLVLLLCLT

Met-Trp-Thr-Leu-Lys-Ser-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Leu-Cys-Leu-Thr

Peptyd NTP[106] nr 2 [SEQ ID NO. 24], NTP[106] p16-30 CSYAFMFSSLRQKTS

Cys-Ser-Tyr-Ala-Phe-Met-Phe-Ser-Ser-Leu-Arg-Gln-Lys-Thr-Ser

Peptyd NTP[106] nr 3 [SEQ ID NO. 25], NTP[106] p31-45 EPQGKVPCGEHFRIR

Glu-Pro-Gln-Gly-Lys-Val-Pro-Cys-Gly-Glu-His-Phe-Arg-Ile-Arg

Peptyd NTP[106] nr 4 [SEQ ID NO. 26], NTP[106] p46-60 QNLPEHTQGWLGSKW

Gln-Asn-Leu-Pro-Glu-His-Thr-Gln-Gly-Trp-Leu-Gly-Ser-Lys-Trp

Peptyd NTP[106] nr 5 [SEQ ID NO. 27], NTP[106] p61-75 LWLLFAVVPFVILKC

Leu-Trp-Leu-Leu-Phe-Ala-Val-Val-Pro-Phe-Val-Ile-Leu-Lys-Cys

Peptyd NTP[106] nr 6 [SEQ ID NO. 28], NTP[106] p76-90 QRDSEKNKVRMAPFF

Gln-Arg-Asp-Ser-Glu-Lys-Asn-Lys-Val-Arg-Met-Ala-Pro-Phe-Phe

Peptyd NTP[106] nr 7 [SEQ ID NO. 29], NTP[106] p90-106 LHHIDSISGVSGKRMF

Leu-His-His-Ile-Asp-Ser-Ile-Ser-Gly-Val-Ser-Gly-Lys-Arg-Met-Phe

Peptydy NTP zawierające sekwencje aminokwasowe odpowiadające części sekwencji aminokwasowej 98-aminokwasowego NTP opisanego na fig. 4 (NTP[98]) obejmują, ale nie wyłącznie, następujące sekwencje.

Peptyd NTP[98] nr 1 [SEQ ID NO. 30], NTP[98] p1-15 EAYYTMLHLPTTNRP

Glu-Ala-Tyr-Tyr-Thr-Met-Leu-His-Leu-Pro-Thr-Thr-Asn-Arg-Pro

Peptyd NTP[98] nr 2 [SEQ ID NO. 31], NTP[98] p16-30 KIAHCILFNQPHSPR

Lys-Ile-Ala-His-Cys-Ile-Leu-Phe-Asn-Gln-Pro-His-Ser-Pro-Arg

Peptyd NTP[98] nr 3 [SEQ ID NO. 32], NTP[98] p31-45 SNSHSHPNPLKLHRR

Ser-Asn-Ser-His-Ser-His-Pro-Asn-Pro-Leu-Lys-Leu-His-Arg-Arg

Peptyd NTP[98] nr 4 [SEQ ID NO. 33], NTP[98] p46-60 SHSHNRPRAYILTTI

Ser-His-Ser-His-Asn-Arg-Pro-Arg-Ala-Tyr-Ile-Leu-Ile-Thr-Ile

Peptyd NTP[98] nr 5 [SEQ ID NO. 34], NTP[98] p61-75 LPSKLKLRTHSQSHH

Leu-Pro-Ser-Lys-Leu-Lys-Leu-Arg-Thr-His-Ser-Gln-Ser-His-His

Peptyd NTP[98] nr 6 [SEQ ID NO. 35], NTP[98] p76-98 NPLSRTSNSTPTNSFLMTSSKPR

Asn-Pro-Leu-Ser-Arg-Thr-Ser-Asn-Ser-Thr-Pro-Thr-Asn-Ser-Phe-Leu-Met-Thr-Ser-Ser-Lys-Pro-Arg

Peptydy NTP zawierające sekwencje aminokwasowe odpowiadające części sekwencji aminokwasowej 75-aminokwasowego NTP opisanego na fig. 5 (NTP[75]) obejmują, ale nie wyłącznie, następujące peptydy.

Peptyd NTP[75] nr 1 [SEQ ID NO. 36], NTP[75] p1-15 SSSLGLPKCWDYRHE

Ser-Ser-Ser-Leu-Gly-Leu-Pro-Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-His-Glu

Peptyd NTP[75] nr 2 [SEQ ID NO. 37], NTP[75] p16-30 LLSLALMINFRVMAC

Leu-Leu-Ser-Leu-Ala-Leu-Met-Ile-Asn-Phe-Arg-Val-Met-Ala-Cys

Peptyd NTP[75] nr 3 [SEQ ID NO. 38], NTP[75] p31-45 TFKQHIELRQKISIV

Thr-Phe-Lys-Gln-His-Ile-Glu-Leu-Arg-Gln-Lys-Ile-Ser-Ile-Val

Peptyd NTP[75] nr 4 [SEQ ID NO. 39], NTP[75] p46-60 PRKLCCMGPVCPVKI

PL 207 591 B1

Pro-Arg-Lys-Leu-Cys-Cys-Met-Gly-Pro-Val-Cys-Pro-Val-Lys-Ile

Peptyd NTP[75] nr 5 [SEQ ID NO. 40], NTP[75] p61-75 ALLTINGHCTWLPAS

Ala-Leu-Leu-Thr-Ile-Asn-Gly-His-Cys-Thr-Trp-Leu-Pro-Ala-Ser

Peptydy NTP zawierające sekwencje aminokwasowe odpowiadające części sekwencji aminokwasowej 68-aminokwasowego NTP opisanego na fig. 6 (NTP[68]) obejmują, ale nie wyłącznie następujące peptydy.

Peptyd NTP[68] nr 1 [SEQ ID NO. 41], NTP[68] p1-15 MFVFCLILNREKIKG

Met-Phe-Val-Phe-Cys-Leu-Ile-Leu-Asn-Arg-Glu-Lys-Ile-Lys-Gly

Peptyd NTP[68] nr 2 [SEQ ID NO. 42], NTP[68] p16-30 GNSSFFLLSFFFSFQ

Gly-Asn-Ser-Ser-Phe-Phe-Leu-Leu-Ser-Phe-Phe-Phe-Ser-Phe-Gln

Peptyd NTP[68] nr 3 [SEQ ID NO. 43], NTP[68] p31-45 NCCQCFQCRTTEGYA

Asn-Cys-Cys-Gln-Cys-Phe-Gln-Cys-Arg-Thr-Thr-Glu-Gly-Tyr-Ala

Peptyd NTP[68] nr 4 [SEQ ID NO. 44], NTP[68] p46-68 VECFYCLVDKAAFECWWFYSFDT

Val-Glu-Cys-Phe-Tyr-Cys-Leu-Val-Asp-Lys-Ala-Ala-Phe-Glu-Cys-Trp-Trp-Phe-Tyr-Ser-Phe-Asp-Thr

Peptydy NTP zawierające sekwencje aminokwasowe odpowiadające części sekwencji aminokwasowej 61-aminokwasowego NTP opisanego na fig. 7 (NTP[61]) obejmują, ale nie wyłącznie następujące peptydy.

Peptyd NTP[61] nr 1 [SEQ ID NO. 45], NTP[61] p1-15 MEPHTVAQAGVPQHD

Met-Glu-Pro-His-Thr-Val-Ala-Gln-Ala-Gly-Val-Pro-Gln-His-Asp

Peptyd NTP[61] nr 2 [SEQ ID NO. 46], NTP[61] p16-30 LGSLQSLLPRFKRFS

Leu-Gly-Ser-Leu-Gln-Ser-Leu-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Arg-Phe-Ser

Peptyd NTP[61] nr 3 [SEQ ID NO. 47], NTP[61] p31-45 CLILPKIWDYRNMNT

Cys-Leu-Ile-Leu-Pro-Lys-Ile-Trp-Asp-Tyr-Arg-Asn-Met-Asn-Thr

Peptyd NTP[61] nr 4 [SEQ ID NO. 48], NTP[61] p46-61 ALIKRNRYTPETGRKS

Ala-Leu-Ile-Lys-Arg-Asn-Arg-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Gly-Arg-Lys-Ser

Dla fachowca będzie oczywiste, że inne mniejsze fragmenty powyższych peptydów NTP można wybrać tak, aby te peptydy miały taką samą lub podobną aktywność biologiczną. Inne fragmenty NTP może wybrać fachowiec tak, aby te peptydy miały taką samą lub podobną aktywność biologiczną. Peptydy NTP według wynalazku mogą obejmować te inne fragmenty. Ogólnie peptydy według wynalazku mają długość co najmniej 6 aminokwasów, korzystnie co najmniej 5 aminokwasów, a najkorzystniej co najmniej 4 aminokwasów.

Użyteczne mogą być również peptydy zawierające dwa lub większą liczbę peptydów NTP połączonych ze sobą, nawet jeżeli sekwencje tych dwóch peptydów NTP nie sąsiadują w sekwencji tego rodzaju(-ów) NTP, z którego(-ych) pochodzą te peptydy NTP. Z uwagi na to, że peptyd NTP ma wymaganą aktywność biologiczną, dwa takie peptydy powinny również mieć wymaganą aktywność biologiczną, nawet jeżeli te segmenty nie sąsiadują w sekwencji aminokwasowej tego rodzaju(-ów) NTP, z którego(-ych) pochodzą peptydy NTP.

Peptydy NTP oraz ich fragmenty, warianty, pochodne, homologi, białka fuzyjne i mimetyki można wytwarzać sposobami znanymi fachowcom, takimi jak technika rekombinacji DNA, synteza białek i izolacja naturalnie występujących peptydów NTP, białek NTP, białka AD7c-NTP oraz ich fragmentów, wariantów, pochodnych i homologów.

Peptydy NTP oraz ich fragmenty, warianty, pochodne, homologi, białka fuzyjne i mimetyki można wytwarzać z innych peptydów NTP, białek NTP, białek AD7c-NTP oraz ich fragmentów, wariantów, pochodnych i homologów stosując metody znane fachowcom. Takie metody obejmują (ale nie wyłącznie) zastosowanie proteaz do rozszczepiania peptydu NTP, białka NTP lub białka AD7c-NTP do wymaganego peptydu NTP.

Peptyd NTP lub białko NTP można wytwarzać stosując dobrze znane techniki rekombinacji DNA, takie jak opisane w Sambrook i in., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. [1989]) i/lub Ausubel i in., red., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, N.Y. [1994].

Gen lub cDNA kodujący peptyd NTP lub białko NTP można uzyskać np. przez przeszukanie biblioteki genomowej lub cDNA lub amplifikację PCR. Sondy lub startery użyteczne do przeszukania biblioteki można wytwarzać w oparciu o informację o sekwencji innych znanych genów lub fragmentów genów z tej samej lub pokrewnej rodziny genów, takich jak np. konserwowane motywy występujące w innych peptydach NTP lub biał kach NTP. Ponadto, gdy gen kodują cy peptyd NTP lub biał ko NTP został zidentyfikowany w jednym gatunku, cały taki gen lub jego część można zastosować jako sondę

PL 207 591 B1 do identyfikacji homologicznych genów u innych gatunków. Sondy lub startery można stosować do przeszukania bibliotek cDNA pochodzących z różnych tkanek, które uważa się za eksprymujące gen peptydu NTP lub białka NTP. Zazwyczaj przeszukiwanie prowadzi się w ostrych warunkach, aby zminimalizować liczbę fałszywych pozytywnych peptydów uzyskiwanych w wyniku takiego przeszukania.

Innym sposobem wytwarzania genu kodującego peptyd NTP lub białko NTP jest zastosowanie syntezy chemicznej zgodnie z metodami dobrze znanymi fachowcom, takimi jak opisane w Engels i in., [Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734 [1989]). Metody te obejmują, między innymi, fosfotriestrową, fosforoamidytową i H-fosfonianową metodę syntezy kwasów nukleinowych. Korzystną metodą takiej syntezy chemicznej jest synteza na nośniku polimerowym zgodnie ze standardową metodą fosforoamidytową. Zazwyczaj DNA kodujący peptyd NTP lub białko lub NTP będzie miał długość kilkuset nukleotydów. Kwasy nukleinowe dłuższe niż 100 nukleotydów można syntetyzować w kilku fragmentach stosując te metody. Następnie fragmenty można ligować ze sobą z wytworzeniem pełnej długości peptydu NTP lub białka NTP. Zazwyczaj fragment DNA kodujący N-koniec białka będzie zawierał ATG, kodujący resztę metioniny. Ta metionina może, ale nie musi być obecna w dojrzałej postaci białka NTP lub peptydu NTP, zależnie od tego czy białko wytwarzane w komórce gospodarzu jest przeznaczone do wydzielania z tej komórki.

Gen, cDNA lub jego fragment kodujący białko NTP lub peptyd NTP można wstawić do odpowiedniego wektora ekspresyjnego lub amplifikującego z zastosowaniem standardowych metod ligacji. Wektor zazwyczaj wybiera się tak, aby był funkcjonalny w konkretnej stosowanej komórce gospodarzu (tj. wektor jest zgodny z maszynerią komórki gospodarza, tak że zachodzi amplifikacja genu i/lub ekspresja genu). Gen, cDNA lub jego fragment kodujący białko NTP lub peptyd NTP można amplifikować/eksprymować w prokariotycznych, drożdżowych, owadzich (układy bakulowirusowe) i/lub eukariotycznych komórkach gospodarzach. Wybór komórki gospodarza będzie zależeć częściowo od tego, czy białko NTP lub peptyd NTP ma być glikozylowany i/lub fosforylowany. Jeżeli tak, korzystne są drożdżowe, owadzie lub ssacze komórki gospodarze.

Zazwyczaj wektory stosowane w jakichkolwiek komórkach gospodarzach będą zawierać co najmniej sekwencję 5'-flankującą (określaną również jako promotor) oraz także inne elementy regulatorowe, takie jak wzmacniacz(-e), element miejsca startu replikacji, element zakończenia transkrypcji, kompletną sekwencję intronową zawierającą donorowe i akceptorowe miejsca składania, sekwencję peptydu sygnałowego, element miejsca wiązania rybosomu, sekwencję poliadenylacji, region polilinkerowy do wstawienia kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd, który ma być eksprymowany oraz element markera selekcji. Każdy z tych elementów omówiono poniżej. Ewentualnie wektor może zawierać sekwencję znacznikową, tj. cząsteczkę oligonukleotydu umiejscowioną na końcu 5' lub 3' sekwencji kodującej białko NTP lub peptyd NTP; która to cząsteczka oligonukleotydowa koduje poliHis (taki jak heksaHis) lub inny znacznik, taki jak FLAG, HA (hemaglutynina wirusa grypy) lub myc, dla których istnieją dostępne w handlu przeciwciała. Ten znacznik zazwyczaj łączy się drogą fuzji z polipeptydem podczas ekspresji polipeptydu i może służyć jako narzędzie do oczyszczania na drodze powinowactwa do białka NTP lub peptydu NTP z komórki gospodarza. Oczyszczanie na drodze powinowactwa można przeprowadzić np. metodą chromatografii kolumnowej z użyciem przeciwciał przeciw znacznikowi jako matrycy powinowactwa. Ewentualnie znacznik można następnie usuwać różnymi sposobami z oczyszczonego białka NTP lub peptydu NTP, np. z użyciem pewnych peptydaz.

Regiony zawiasowy i Fc ludzkiej immunoglobuliny mogą być sfuzowane z N-końcem albo z C-końcem białka NTP lub peptydu NTP przez fachowca. Następnie białko fuzyjne z Fc można oczyścić z użyciem kolumny powinowactwa z białkiem A. Wiadomo, że Fc wykazuje długi farmakokinetyczny okres półtrwania in vivo i stwierdzono, że białka sfuzowane z Fc wykazują zasadniczo dłuższy okres półtrwania in vivo niż ich niesfuzowane odpowiedniki. Fuzja z regionem Fc umożliwia również dimeryzację/multimeryzację cząsteczki, co może być użyteczne dla bioaktywności niektórych cząsteczek.

Sekwencja 5' flankująca może być homologiczna (tj. z tego samego gatunku i/lub szczepu co komórka gospodarz), heterologiczna (tj. z innego gatunku lub szczepu niż komórka gospodarz), hybrydowa (tj. może stanowić połączenie sekwencji 5' flankujących z większej niż jeden liczby gatunków), syntetyczna lub może być natywną sekwencją 5' flankującą genu białka NTP lub peptydu NTP. Źródłem sekwencji 5' flankującej może być jednokomórkowy organizm prokariotyczny lub eukariotyczny, jakikolwiek organizm kręgowca lub bezkręgowca albo jakakolwiek roślina, pod warunkiem, że sekwencja 5' flankująca działa w i może być aktywowana przez maszynerię komórki gospodarza.

PL 207 591 B1

Sekwencje 5' flankujące użyteczne w odpowiednich wektorach można otrzymywać kilkoma metodami dobrze znanymi w dziedzinie wynalazku. Zazwyczaj użyteczne tutaj sekwencje 5' flankujące inne niż sekwencja flankująca genu białka NTP lub peptydu NTP powinny być wcześniej zidentyfikowane przez mapowanie i/lub trawienie endonukleazą restrykcyjną, a zatem, mogą być wyizolowane z odpowiedniego ź ródł a tkankowego za pomocą odpowiednich endonukleaz restrykcyjnych. W niektórych przypadkach może być znana pełna sekwencja nukleotydowa sekwencji 5' flankującej. Tutaj sekwencję 5' flankującą można syntetyzować standardowymi metodami opisanymi powyżej dla syntezy i klonowania kwasów nukleinowych.

Gdy znana jest cała sekwencja 5' flankująca lub tylko jej część, można ją uzyskać drogą PCR i/lub przeszukania biblioteki genomowej odpowiednim oligonukleotydem i/lub fragmentami sekwencji 5' flankującej z tego samego lub innego gatunku.

Gdy nie jest znana sekwencja 5' flankująca, fragment DNA zawierający sekwencję 5' flankującą można wyizolować z większego fragmentu DNA zawierającego, np. sekwencję kodującą lub nawet inny gen lub geny. Izolację można przeprowadzić przez trawienie endonukleazami restrykcyjnymi z uż yciem jednego lub wię kszej liczby starannie wybranych enzymów do izolacji odpowiedniego fragmentu DNA. Po strawieniu dany fragment można wyizolować przez oczyszczanie w żelu agarozowym, w kolumnie Qiagen® lub innymi metodami znanymi fachowcom. Wybór odpowiednich enzymów dla osiągnięcia tego celu będzie oczywisty dla fachowca.

Element miejsca startu replikacji zazwyczaj jest częścią prokariotycznych wektorów ekspresyjnych dostępnych w handlu i ułatwia amplifikację wektora w komórce gospodarzu. Amplifikacja wektora do pewnej liczby kopii może być, w niektórych przypadkach, istotna dla optymalnej ekspresji białka NTP lub peptydu NTP. Gdy wybrany wektor nie zawiera miejsca startu replikacji, może być ono zsyntetyzowane chemicznie w oparciu o znaną sekwencję i wligowane do wektora. Element zakończenia transkrypcji zazwyczaj jest umiejscowiony na 3' końcu sekwencji kodującej białka NTP lub peptydu NTP i służy do zakończenia transkrypcji białka NTP lub peptydu NTP. Zazwyczaj element zakończenia transkrypcji w komórkach prokariotycznych jest fragmentem bogatym w G-C, po którym następuje sekwencja poli-T. Podczas gdy element ten może być sklonowany z biblioteki lub zakupiony w handlu jako część wektora, może on być również łatwo zsyntetyzowany metodami syntezy kwasów nukleinowych, takimi jak te opisane powyżej.

Element genu markera selekcyjnego koduje białko potrzebne do przeżycia i wzrostu komórki gospodarza hodowanej w pożywce hodowlanej. Typowe geny markera selekcyjnego kodują białka, które (a) nadają oporność na antybiotyki lub inne toksyny, np. ampicylinę, tetracyklinę lub kanamycynę w przypadku prokariotycznych komórek gospodarzy, (b) uzupeł niają niedobory auksotroficzne komórki; albo (c) dostarczają kluczowych składników odżywczych niedostępnych ze złożonych pożywek. Korzystnymi markerami selekcyjnymi są gen oporności na kanamycynę, gen oporności na ampicylinę i gen oporności na tetracyklinę.

Element wiążący rybosom, powszechnie nazywany sekwencją Shine-Dalgarno (prokarioty) lub sekwencją Kozak (eukarioty), jest zazwyczaj potrzebny do inicjacji translacji mRNA. Element ten jest zazwyczaj umiejscowiony 3' względem promotora i 5' względem sekwencji kodującej syntetyzowanego białka NTP lub peptydu NTP. Sekwencja Shine-Dalgarno jest zmienna, ale zazwyczaj jest to polipuryna (tj. ma dużą zawartość A-G). Zidentyfikowano wiele sekwencji Shine-Dalgarno i każdą z nich można łatwo zsyntetyzować stosując metody przedstawione powyżej i zastosować w wektorze prokariotycznym.

W przypadkach gdy korzystne jest aby biał ko NTP lub peptyd NTP był y wydzielane z komórki gospodarza, można zastosować sekwencję sygnałową, aby skierować białko NTP lub peptyd NTP na zewnątrz komórki gospodarza, w której jest syntetyzowany i C-końcowa część białka może zostać wydeletowana w celu przeciwdziałania zakotwiczeniu w błonie. Zazwyczaj sekwencja sygnałowa jest umiejscowiona w regionie kodującym genu lub cDNA białka NTP/peptydu NTP lub bezpośrednio na 5' końcu regionu kodującego genu białka NTP/peptydu NTP. Zidentyfikowano wiele sekwencji sygnałowych i dowolna z nich, która jest funkcjonalna w wybranej komórce gospodarzu może być zastosowana w połączeniu z genem lub cDNA białka NTP/peptydu NTP. Zatem sekwencja sygnałowa może być homologiczna lub heterologiczna względem genu lub cDNA białka NTP/peptydu NTP i może być homologiczna lub heterologiczna względem genu lub cDNA białka NTP/peptydu NTP. Ponadto sekwencję sygnałową można zsyntetyzować chemicznie metodami przedstawionymi powyżej. W większości przypadków wydzielanie polipeptydu z komórki gospodarza dzięki obecności peptydu sygnałowego powoduje usunięcie N-końcowej metioniny z polipeptydu.

PL 207 591 B1

W wielu przypadkach transkrypcja genu lub cDNA białka NTP/peptydu NTP jest zwiększona dzięki obecności w wektorze jednego lub większej liczby intronów; jest to szczególnie prawdą, gdy białko NTP lub peptyd NTP są wytwarzane w eukariotycznych komórkach gospodarzach, szczególnie ssaczych komórkach gospodarzach. Stosowane introny mogą być naturalnie występującymi w genie białka NTP/peptydu NTP, szczególnie gdy stosowany gen stanowi sekwencja genomowa długości lub jej fragment. Gdy intron nie występuje naturalnie w genie (tak jak w przypadku większości cDNA), intron(y) można uzyskać z innego źródła. Pozycja intronu względem sekwencji flankującej i genu białka NTP/peptydu NTP jest ogólnie ważna, gdyż intron musi być transkrybowany aby działać. Zatem gdy gen białka NTP/peptydu NTP wstawiony do wektora ekspresyjnego jest cząsteczką cDNA, korzystną pozycją dla intronu jest 3' względem miejsca startu transkrypcji oraz 5' względem sekwencji poliA zakończenia transkrypcji. Korzystnie w przypadku cDNA białka NTP/peptydu NTP, intron lub introny będą umiejscowione po jednej lub drugiej stronie (tj. 5' lub 3') cDNA, tak że nie przerywa on sekwencji kodującej. W realizacji wynalazku można zastosować jakikolwiek intron z dowolnego źródła, włącznie z dowolnym organizmem wirusowym, prokariotycznym i eukariotycznym (roślinnym lub zwierzęcym), pod warunkiem, że jest on zgodny z komórką(-ami), do której(-ych) jest wstawiany. Obejmuje to również syntetyczne introny. Ewentualnie w wektorze można zastosować więcej niż jeden intron.

Gdy jeden lub większa liczba z wymienionych powyżej elementów nie jest obecna w stosowanym wektorze, można je pojedynczo uzyskać i wligować do wektora. Metody uzyskiwania każdego z tych elementów są dobrze znane fachowcom i porównywalne z metodami przedstawionymi powyżej (tj. synteza DNA, przeszukiwanie bibliotek itp.).

Ostateczne wektory stosowane w realizacji wynalazku można konstruować z wyjściowych wektorów, takich jak wektor dostępny w handlu. Takie wektory mogą, ale nie muszą, zawierać niektóre elementy występujące w całkowitym wektorze. Gdy żaden z wymaganych elementów nie jest obecny w wyjściowym wektorze, każdy element może być indywidualnie wligowany do wektora przez przecięcie wektora odpowiednią(-mi) endonukleazą(-ami) restrykcyjną(-ymi), tak że końce elementu do wligowania i końce wektora są zgodne dla ligacji. W niektórych przypadkach konieczne może być utworzenie tępych końców do zligowania ze sobą dla uzyskania zadowalającej ligacji. Tępe końce tworzy się najpierw przez wypełnienie „lepkich końców za pomocą polimerazy DNA Klenowa lub polimerazy DNA T4 w obecności wszystkich czterech nukleotydów. Ta procedura jest dobrze znana w dziedzinie wynalazku i opisana, np. w Sambrook i in., jak wyżej. Alternatywnie, dwa lub większą liczbę elementów do wstawienia do wektora można najpierw zligować ze sobą (gdy mają one być umiejscowione obok siebie), a następnie wligować do wektora.

Dodatkową metodą konstruowania wektora jest przeprowadzenie wszystkich ligacji różnych elementów równocześnie w jednej mieszaninie reakcyjnej. W tym przypadku zostanie wytworzonych wiele nonsensownych lub niefunkcjonalnych wektorów ze względu na nieprawidłową ligację lub insercję elementów, jednakże funkcjonalny wektor może być zidentyfikowany i wybrany przez trawienie endonukleazami restrykcyjnymi.

Korzystnymi wektorami w realizacji wynalazku są te, które są zgodne z komórkami gospodarzami bakteryjnymi, owadzimi i ssaczymi. Takie wektory obejmują, między innymi, pCRII, pCR3, i pcDNA3.1 (Invitrogen Company, San Diego, Calif.), pB-SII (Stratagene Company, La Jolla, Calif.), pET15b (Novagen, Madison, Wis.), PGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ.), PEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, Calif.), pETL (BlueBacII; Invitrogen) i pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, N.Y.).

Po skonstruowaniu wektora i wstawieniu kwasu nukleinowego kodującego pełnej długości lub skrócone białko NTP lub peptyd NTP w odpowiednie miejsce wektora, kompletny wektor może zostać wstawiony do odpowiedniej komórki gospodarza w celu amplifikacji i/lub ekspresji polipeptydu. Komórkami gospodarzami mogą być komórki prokariotyczne (takie jak E. coli) lub eukariotyczne komórki gospodarze (takie jak komórka drożdżowa, komórka owadzia lub komórka kręgowca). Komórka gospodarz, przy hodowaniu w odpowiednich warunkach, może syntetyzować białko NTP lub peptyd NTP, które mogą być następnie zebrane z pożywki hodowlanej (gdy komórka gospodarz wydziela je do pożywki) lub bezpośrednio z wytwarzającej je komórki gospodarza (gdy nie są wydzielane).

Po zebraniu białko NTP lub peptyd NTP można oczyścić takimi metodami, jak chromatografia na sitach molekularnych, chromatografia powinowactwa itp. Wybór komórki gospodarza do wytwarzania białka NTP lub peptydu NTP będzie zależeć częściowo od tego, czy białko NTP lub peptyd NTP ma być glikozylowany lub fosforylowany (w tym przypadku korzystne są eukariotyczne komórki gospodarze) oraz od sposobu w jaki komórka gospodarz jest w stanie zwinąć białko do jego natywnej struktury trzeciorzędowej (np. odpowiedniej orientacji mostków disiarczkowych itd.) tak, aby biologicz18

PL 207 591 B1 nie aktywne białko zostało wytworzone przez białko NTP lub peptyd NTP wykazujące aktywność biologiczną. Białko NTP lub peptyd NTP mogą zostać zwinięte po syntezie w odpowiednich warunkach chemicznych, jak omówiono poniżej. Odpowiednimi użytecznymi komórkami lub liniami komórkowymi mogą być komórki ssacze, komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), ludzkie embrionalne komórki nerki (HEK) 293 lub 293T lub komórki 3T3. Wybór odpowiednich ssaczych komórek gospodarzy oraz sposobu ich transformacji, hodowli, namnażania, przeszukiwania oraz wytwarzania i oczyszczania są znane w dziedzinie. Inne odpowiednie ssacze linie komórkowe są liniami komórek małpy COS-1 i COS-7 oraz liniami komórek CV-1. Kolejne przykł adowe ssacze komórki gospodarze obejmują linie komórek naczelnych i linie komórek gryzoni, włącznie z transformowanymi liniami komórkowymi. Prawidłowe komórki diploidalne, szczepy komórek pochodzące z hodowli in vitro tkanki pierwotnej, a także pierwotne eksplanty są także odpowiednie. Komórki kandydaci mogą być genotypicznie różne pod względem genu selekcyjnego lub mogą zawierać dominująco działający gen selekcyjny. Inne odpowiednie ssacze linie komórkowe obejmują, ale nie wyłącznie, mysie komórki nerwiaka niedojrzałego N2A, HeLa, mysie komórki L-929, linie 3T3 pochodzące od myszy Swiss, Balb-c lub NIH, chomicze linie komórkowe BHK lub HaK.

Podobnie użytecznymi komórkami gospodarzami są komórki bakteryjne. Przykładowo, różne szczepy E. coli (np. HB101, DH5a, DH10 i MC1061) są dobrze znane jako komórki gospodarze w dziedzinie biotechnologii. Różne szczepy B. subtilis, Pseudomonas spp., innych Bacillus spp., Streptomyces spp. itp. można także zastosować w tej metodzie. Wiele szczepów komórek drożdżowych znanych fachowcom jest także dostępnych jako komórki gospodarze do eksprymowania polipeptydów według wynalazku.

Ponadto, gdy jest to wymagane, zgodnie z wynalazkiem można stosować układy komórek owadzich. Takie układy opisano np. w Kitts i in. (Biotechniques, 14:810-817 [1993]), Lucklow (Curr. Opin. Biotechnol, 4:564-572 [1993]) oraz Lucklow i in. (J. Virol 67:4566-4579 [1993]). Korzystnymi komórkami owadzimi są Sf-9 i Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.).

Wstawienie (nazywane także transformacją lub transfekcją) wektora do wybranej komórki gospodarza można przeprowadzić stosując takie metody, jak metoda z chlorkiem wapnia, elektroporacja, mikroiniekcja, lipofekcja lub DEAE-dekstranowa. Wybrana metoda będzie częściowo zależeć od typu stosowanej komórki gospodarza. Metody te oraz inne odpowiednie metody są dobrze znane fachowcom, jak przedstawiono np. w Sambrook i in., jak wyżej.

Komórki gospodarze zawierające wektor (tj. transformowane lub transfekowane) można hodować stosując standardowe pożywki znane fachowcom. Pożywki zazwyczaj będą zawierać wszystkie składniki odżywcze potrzebne do wzrostu i przeżycia komórek. Odpowiednimi pożywkami do hodowli komórek E. coli są np. Luria Broth (LB) i/lub Terrific Broth (TB). Odpowiednimi pożywkami do hodowli komórek eukariotycznych są RPMI1640, MEM, DMEM, z których wszystkie mogą być uzupełnione surowicą i/lub czynnikami wzrostowymi, jak jest to wymagane przez konkretną hodowaną linię komórkową. Odpowiednią pożywką dla hodowli owadzich jest pożywka Grace's wzbogacona ekstraktem drożdżowym, hydrolizatem laktalbuminowym i/lub płodową surowica cielęcą, gdy jest to potrzebne. Zazwyczaj antybiotyk lub inny związek użyteczny do selektywnego wzrostu tylko transformowanych komórek dodaje się jako dodatek do pożywki. Stosowany związek będzie zależny od elementu markera selekcyjnego obecnego na plazmidzie, którym została stransformowana komórka gospodarz. Przykładowo, gdy elementem markera selekcyjnego jest oporność na kanamycynę, związkiem dodanym do pożywki hodowlanej będzie kanamycyna.

Ilość białka NTP lub peptydu NTP wytwarzana w komórce gospodarzu można oznaczyć stosując znane metody. Takie metody obejmują, bez ograniczeń, analizę Western blot, elektroforezę w żelu poliakrylamidowym z SDS, elektroforezę żelową w warunkach nie denaturujących, rozdział HPLC, spektrometrię masową, immunoprecypitację i/lub testy aktywności, takie jak testy zmiany migracji w żelu po związaniu DNA.

PL 207 591 B1

Gdy białko NTP lub peptyd NTP zostały zaprojektowane tak, aby były wydzielane z komórki gospodarza, większość białka NTP lub peptydu NTP można znaleźć w komórkowej pożywce hodowlanej. Białka wytworzone w ten sposób nie będą zazwyczaj zawierać N-końcowej metioniny, gdyż jest ona usuwana podczas wydzielania z komórki. Jednak gdy białko NTP lub peptyd NTP nie są wydzielane z komórek gospodarzy, będą one obecne w cytoplazmie i/lub jądrze (w przypadku komórek eukariotycznych) lub w cytozolu (w przypadku komórek gospodarzy będących bakteriami Gram-ujemnymi) i będą zawierać N-końcową metioninę.

W przypadku biał ka NTP lub peptydu NTP znajdują cego się w cytoplazmie i/lub j ą drze komórki gospodarza, komórki gospodarze zazwyczaj najpierw rozbija się mechanicznie lub za pomocą detergentu w celu uwolnienia zawartości wewnątrzkomórkowej do buforowanego roztworu. Następnie białko NTP lub peptyd NTP można wyizolować z tego roztworu.

Oczyszczanie białka NTP lub peptydu NTP z roztworu można prowadzić stosując różne metody. Gdy białko zostało zsyntetyzowane tak, że zawiera znacznik, taki jak heksaHistidyna (np. peptyd NTP/hexaHis) lub inny niewielki peptyd, taki jak FLAG (Sigma-Aldritch, St. Louis, MI) lub peptyd wiążący kalmodulinę (Stratagene, La Jolla, CA) na jego C-końcu lub N-końcu, może być ono zasadniczo oczyszczane w jednoetapowym procesie przez przepuszczanie roztworu przez kolumnę powinowactwa, gdzie matryca kolumny wykazuje powinowactwo do znacznika lub bezpośrednio do białka (czyli stanowi przeciwciało monoklonalne specyficznie rozpoznające peptyd NTP). Przykładowo, polihistydyna wiąże się z większym powinowactwem lub specyficznością z niklem, cynkiem i kobaltem, a zatem do oczyszczania peptydu NTP/poliHis moż na zastosować chromatografię powinowactwa do unieruchomionych jonów metalu z użyciem żywicy powinowactwa opartej na niklu (jak stosuje się w ukł adzie QIAexpress Qiagen lub Xpress System Invitrogen) lub ż ywicy powinowactwa opartej na kobalcie (jak stosuje się w układzie Talon BD Biosciences-CLONTECH). (patrz, np. Ausubel i in., red. Current Protocols in Molecular Biology, część 10.11.8, John Wiley & Sons, New York [1993]).

Gdy białko NTP lub peptyd NTP wytwarza się bez dołączonego znacznika i nie są dostępne przeciwciała można zastosować inne dobrze znane procedury oczyszczania. Takie procedury obejmują, ale nie wyłącznie, chromatografię jonowymienną, chromatografię na hydroksyapatycie, chromatografię z oddziaływaniami hydrofobowymi, chromatografię na sitach molekularnych, HPLC, natywną elektroforezę żelową w połączeniu z elucją z żelu oraz preparatywne ogniskowanie izoelektryczne (urządzenie/technika Isoprime, Hoefer Scientific). W niektórych przypadkach dwie lub większą liczbę z tych technik moż na połączyć w celu osią gnię cia zwię kszonej czystoś ci.

Gdy przewiduje się, że białko NTP lub peptyd NTP będzie występować głównie wewnątrzkomórkowo, materiał wewnątrzkomórkowy (w tym ciałka inkluzyjne bakterii Gram-ujemnych) można wyekstrahować z komórki gospodarza stosując standardowe techniki znane fachowcom. Przykładowo, komórka gospodarz może zostać zlizowana z uwolnieniem składników peryplazmy/cytoplazmy przez prasę French press, homogenizazję i/lub sonifikację, a następnie odwirowanie. Gdy białko NTP lub peptyd NTP wytworzyły ciałka inkluzyjne w cytozolu, ciałka inkluzyjne często mogą wiązać się z wewnętrznymi i/lub zewnętrznymi błonami komórkowymi, a zatem mogą występować głównie w materiale osadu po odwirowaniu. Następnie materiał osadu można poddać obróbce przy ekstremalnym pH lub środkiem chaotropowym, takim jak detergent, guanidyna, pochodne guanidyny, mocznik lub pochodne mocznika, w obecności środka redukującego, takiego jak ditiotreitol przy alkalicznym pH lub triskarboksyetylofosfina przy kwaśnym pH, w celu uwolnienia, rozerwania i rozpuszczenia ciałek inkluzyjnych. Białko NTP lub peptyd NTP w jego teraz rozpuszczalnej postaci można analizować metodą elektroforezy żelowej, immunoprecypitacji itp. Gdy wymagane jest wyizolowanie białka NTP lub peptydu NTP, izolację można przeprowadzić stosując znane metody, takie jak te podane poniżej oraz w Marston i in. (Meth Enz., 182:264-275 [1990]).

W niektórych przypadkach białko NTP lub peptyd NTP mogą nie być biologicznie aktywne po wyizolowaniu. Aby przywrócić aktywność biologiczną można zastosować różne metody ponownego zwijania lub przekształcania polipeptydu w jego strukturę trzeciorzędową i tworzenia wiązań disiarczkowych. Takie metody obejmują wystawienie rozpuszczonego polipeptydu na pH zazwyczaj powyżej 7 i w obecności okreś lonego stężenia chaotropu. Wybrany chaotrop jest bardzo podobny do wybranego do stosowania w rozpuszczaniu ciałek inkluzyjnych, ale zazwyczaj w niższym stężeniu i nie jest to koniecznie taki sam chaotrop, co stosowany w rozpuszczaniu. W większości przypadków roztwór do powtórnego zwijania/utleniania będzie także zawierać środek redukujący lub środek redukujący wraz z jego utlenioną postacią w określonym stosunku, w celu wytworzenia konkretnego potencjału redox umożliwiającego tasowanie disiarczków z wystąpieniem tworzenia mostka(-ów) pomiędzy cysteinami

PL 207 591 B1 białka. Kilka z powszechnie stosowanych par redoks obejmuje cysteinę/cystaminę, glutation (GSH)/ditiobisGSH, chlorek miedziowy, ditiotreitol (DTT)/ditianoDTT, 2-merkaptoetanol(bME)/ditio(bME). W wielu przypadkach potrzebny jest współrozpuszczalnik, aby zwiększyć wydajność ponownego zwijania i najczęstsze odczynniki stosowane w tym celu obejmują glicerol, glikol polietylenowy o róż nych masach czą steczkowych i argininę .

Gdy ciałka inkluzyjne białka NTP lub peptydu NTP nie tworzą się w znaczącym stopniu w komórce gospodarzu, białko NTP lub peptyd NTP mogą głównie występować w supernatancie po odwirowaniu homogenatu komórkowego, i białko NTP lub peptyd NTP można wyizolować z supernatantu stosując metody takie jak przedstawione poniżej.

W tych sytuacjach gdy korzystna jest częściowa lub całkowita izolacja białka NTP lub peptydu NTP, oczyszczanie można przeprowadzić stosując standardowe metody dobrze znane fachowcom. Takie metody obejmują, ale nie wyłącznie, rozdział elektroforetyczny, a następnie elektroelucję, różne typy chromatografii (immunopowinowactwa, na sitach molekularnych i/lub jonowymienną) i/lub wysokociśnieniową chromatografię cieczową. W niektórych przypadkach korzystne może być zastosowanie większej niż jedna liczby tych metod w celu całkowitego oczyszczenia.

Ponadto oprócz wytwarzania i oczyszczania białek NTP lub peptydów NTP technikami rekombinacji DNA, białka NTP lub peptydy NTP oraz ich fragmenty, warianty, homologi, białka fuzyjne, mimetyki peptydów i pochodne można wytwarzać metodami syntezy chemicznej (takimi jak synteza peptydów na fazie stałej) stosując techniki znane w dziedzinie wynalazku oraz przedstawione w Merrifield i in. (J. Am. Chem. Soc, 85:2149 [1963]), Houghten i in. (Proc Natl Acad. Sci. USA, 82:5132 [1985]) oraz Stewart i Young (Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, Ill [1984]). Takie polipeptydy można syntetyzować z metioniną lub bez metioniny na N-końcu. Chemicznie syntetyzowane białka NTP lub peptydy NTP można utleniać stosując metody przedstawione w tych pozycjach literaturowych, z utworzeniem mostków disiarczkowych. Oczekuje się, że te białka NTP lub peptydy NTP będą mieć aktywność biologiczną porównywalną z białkami NTP lub peptydami NTP wytwarzanymi drogą rekombinacji lub oczyszczonymi ze źródeł naturalnych, a zatem można je stosować wymiennie z rekombinowanymi lub naturalnymi białkami NTP lub peptydami NTP.

Preparaty chemicznie modyfikowanego peptydu NTP, w których peptyd NTP jest sprzężony z polimerem są objęte zakresem, wynalazku. Wybrany polimer jest najczęściej rozpuszczalny w wodzie, tak że białko, do którego jest dołączony, nie wytrąca się w środowisku wodnym, takim jak środowisko fizjologiczne. Wybrany polimer jest zazwyczaj zmodyfikowany tak, aby zawierał pojedynczą grupę reaktywną, taką jak ugrupowanie aktywnego estru do acylowania lub ugrupowanie aldehydu do alkilowania, tak że stopień polimeryzacji może być regulowany, jak przedstawiono w opisanych metodach. Polimer może mieć jakąkolwiek masę cząsteczkową i może być rozgałęziony lub nierozgałęziony. Zakresem polimerów peptydu NTP objęta jest mieszanina polimerów.

W niektórych przypadkach wymagane może być wytworzenie wariantów kwasu nukleinowego i/lub aminokwasowych wariantów naturalnie występujących białek NTP lub peptydów NTP. Warianty kwasu nukleinowego można wytwarzać przez ukierunkowaną mutagenezę, amplifikację PCR lub innymi odpowiednimi metodami, przy czym starter(y) ma(-ją) wymaganą(-e) mutację(-e) punktową (-e) (patrz Sambrook i in., jak wyżej, oraz Ausubel i in., jak wyżej, opisy technik mutagenezy). Syntezę chemiczną z zastosowaniem metod opisanych przez Engels i in., jak wyżej, także można zastosować do wytwarzania takich wariantów. Można również stosować inne metody znane fachowcom.

Korzystnymi wariantami kwasu nukleinowego są kwasy zawierające podstawienia nukleotydowe uwzględniające preferencję kodonów w komórce gospodarzu, która ma być stosowana do wytworzenia białka NTP lub peptydu NTP. Taką optymalizację kodonów można określić za pomocą algorytmów komputerowych z tabelami częstotliwości kodonów, takie jak Ecohigh.Cod dla preferencji kodonów wysoko eksprymowanych genów bakteryjnych z University of Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group, Madison, Wis. Inne użyteczne tabele częstotliwości kodonów obejmują Celegans_high.cod, Celegans_low.cod, Drosophila_high.cod, Human_high.cod, Maize_high.cod i Yeast_high.cod. Innymi korzystnymi wariantami są kodujące konserwatywne zmiany aminokwasowe opisane powyżej (np. w których ładunek lub polarność naturalnie występującego bocznego łańcucha aminokwasowego nie jest zasadniczo zmieniona przez podstawienie innym aminokwasem) w porównaniu z typem dzikim i/lub takie zaprojektowane w celu wytworzenia nowego(-ych) miejsca(miejsc) glikozylacji i/lub fosforylacji lub zaprojektowane w celu usunięcia istniejącego nowego miejsca (miejsc) glikozylacji i/lub fosforylacji.

PL 207 591 B1

Białka NTP, peptydy NTP oraz ich fragmenty, homologi, warianty, białka fuzyjne, mimetyki peptydów, pochodne i sole również można wytwarzać stosując typowe techniki syntezy peptydów znane fachowcom. Techniki te obejmują metody sprzęgania chemicznego (porównaj, Wunsch, E: „Methoden der organischen Chemie, tom 15, rozdział 1+2, Synthese von Peptiden, thime Verlag, Stuttgart (1974) oraz Barrany G.; Marrifield, R. B.: „The Peptides, red E. Gross, J. Meienhofer, tom 2, rozdział 1, str. 1-284, Academic Press (1980)), metody sprzęgania enzymatycznego (patrz, Widmer F., Johansen J.T., Carlsberg Res. Commun., tom 44, str. 37-46.(1979) i Kullmann, W.: „Enzymatic Peptide Synthesis, CRC Press Inc. Boca Raton, Fla. (1987) oraz Widmer, F., Johansen, J. T. w „Synthetic Peptides in Biology and Medicines:, red. Alitalo, K., Partanen, P., Vatieri, A., str. 79-86, Elsevier, Amsterdam (1985)), albo połączenie metod chemicznych i enzymatycznych, gdy jest to korzystne ze względu na projektowanie i ekonomikę procesu. Stosując wskazówki tutaj zamieszczone fachowcy są w stanie zmienić sekwencję peptydową białka NTP lub peptydu NTP z wytworzeniem homologu mającego taką samą lub podobną aktywność biologiczną (bioaktywność) co pierwotne lub natywne białko NTP lub peptyd NTP.

Korzystne może być stosowanie raczej mimetyku danego peptydu NTP niż samego peptydu. Ogólnie mimetyki peptydów są bardziej biodostępne, dłużej działają i mogą być tańsze w produkcji niż natywne białka i peptydy.

Zatem peptydy NTP opisane powyżej znajdują zastosowanie w opracowaniu takich małych związków chemicznych o podobnej aktywności biologicznej, a tym samym o podobnej użyteczności terapeutycznej. Peptydowe mimetyki peptydów NTP można opracować stosując techniki chemii kombinatoryjnej oraz inne techniki znane w dziedzinie (patrz np. Proceedings of the 20th European Peptide Symposium, red. G. Jung, E. Bayer, str. 289-336 oraz pozycje literaturowe tam przytoczone).

Przykłady znanych metod strukturalnego modyfikowania peptydu, w celu wytworzenia mimetyku peptydu, obejmujące inwersję centrów chiralnych szkieletu prowadzącą do struktur reszt D-aminokwasów, w szczególności na N-końcu, prowadzą do zwiększenia stabilności pod względem rozkładu proteolitycznego bez niekorzystnego wpływu na aktywność. Przykład podano w artykule „Tritriated D-ala¹-Peptide T Binding, Smith C. S. i in., Drug Development Res. 15, str. 371-379 (1988).

Drugą metodą jest zmiana struktury cyklicznej w celu stabilizacji, taka jak tworzenie międzyłańcuchowych imidów i laktamów pomiędzy N i C (Ede i in., w Smith i Rivier (red.) „Peptides: Chemistry and Biology, Escom, Leiden (1991), str. 268-270). Przykładem tego są konformacyjnie ograniczone związki tymopentyno-podobne, takie jak to podano w opisie patentowym US 4457489 (1985), Goldstein G. i in.

Trzecią metodą jest podstawienie wiązań peptydowych w peptydzie NTP przez wiązania pseudopeptydowe, które nadają odporność na proteolizę. Opisano kilka wiązań pseudopeptydowych, które ogólnie nie wpływają na strukturę i aktywność biologiczną peptydu. Jednym z przykładów tego podejścia jest podstawienie wiązaniami retro-inverso pseudopeptydowymi („Biologically active retroinverso analogues of thymopentin, Sisto A. i in., w Rivier, J. E. i Marshall, G. R. (red.) „Peptides, Chemistry, Structure and Biology, Escom, Leiden (1990), str. 722-773) oraz Dalpozzo i in., (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41:561-566). Zgodnie z tą modyfikacją, sekwencje aminokwasowe peptydów mogą być identyczne z opisanymi tutaj sekwencjami peptydów NTP, z wyjątkiem tego, że jedno lub większa liczba wiązań peptydowych jest zastąpiona wiązaniem retro-inverso pseudopeptydowym. Korzystnie najbliższe N-końca wiązanie peptydowe jest podstawione, gdyż takie podstawienie nadaje odporność na proteolizę przez egzopeptydazy działające na N-koniec.

Synteza peptydów z jednym lub większą liczbą zredukowanych wiązań retro-inverso pseudopeptydowych jest znana (Sisto (1990) oraz Dalpozzo i in. (1993), jak wyżej). Zatem wiązania peptydowe mogą być zastąpione wiązaniami niepeptydowymi, które umożliwiają przyjęcie przez mimetyk peptydu struktury, a tym samym aktywności biologicznej, podobnej do pierwotnego peptydu. Dalsze modyfikacje także można wprowadzić przez zastąpienie grup chemicznych aminokwasów innymi grupami chemicznymi o podobnej strukturze. Innym odpowiednim, wiązaniem pseudopeptydowym, odnośnie którego wiadomo, że wzmacnia stabilność względem rozszczepiania enzymatycznego przy braku lub niewielkiej utracie aktywności biologicznej jest zredukowane izosteryczne wiązanie pseudopeptydowe (Couder i in., (1993),

Int. J. Peptide Protein Res., 41:181-184). Zatem sekwencje aminokwasowe tych peptydów mogą być identyczne z sekwencjami peptydu NTP, z wyjątkiem tego, że jedno lub większa liczba wiązań peptydowych jest zastąpiona izosterycznym wiązaniem pseudopeptydowym. Korzystnie najbliższe N-końca wiązanie peptydowe jest podstawione, gdyż takie podstawienie nadaje odporność na proteo22

PL 207 591 B1 lizę przez egzopeptydazy działające na N-końcu. Synteza peptydów z jednym lub większą liczbą zredukowanych izosterycznych wiązań pseudopeptydowych jest znana w dziedzinie wynalazku (Couder i in., (1993), patrz powyżej). Inne przykłady obejmują wprowadzanie wiązań ketometylenowych lub metylosiarczkowych w celu zastąpienia wiązań peptydowych.

Peptoidowe pochodne peptydów NTP stanowią inną klasę mimetyków peptydów, które zachowują determinanty strukturalne ważne dla aktywności biologicznej, ale bez wiązań peptydowych, co nadaje odporność na proteolizę (Simon i in., Proc. Natl. Acad Sci USA, 89:9367-9371). Peptoidy są oligomerami N-podstawionych glicyn. Opisano kilka grup N-alkilowych, z których każda odpowiada łańcuchowi bocznemu naturalnego aminokwasu (Simon i in., (1992), jak wyżej). Kilka lub wszystkie aminokwasy peptydu NTP są zastąpione N-podstawioną glicyną odpowiadającą zastępowanemu aminokwasowi.

W opracowaniu mimetyków peptydów może pomóc określenie struktury trzeciorzędowej peptydu NTP metodami spektroskopii NMR, krystalografii i/lub komputerowego modelowania molekularnego. Metody te ułatwiają opracowanie nowych środków o większej sile i/lub większej biodostępności i/lub większej stabilności niż pierwotny peptyd (Dean (1994), BioEssays, 16: 683-687; Cohen i Shatzmiller (1993), J. Mol Graph., 11: 166-173; Wiley i Rich (1993), Med. Res. Rev., 13: 327-384; Moore (1994), Trends Pharmacol Sci., 15: 124-129; Hruby (1993), Biopolymers, 33: 1073-1082; Bugg i in., (1993), Sci. Am., 269: 92-98).

Gdy zostanie zidentyfikowany nowy związek, mimetyk peptydu, może on zostać zsyntetyzowany i zbadany metodami przedstawionymi w poniższych przykładach w celu określenia aktywności. Związki będące mimetykami peptydów otrzymane powyższymi metodami, mające aktywność biologiczną peptydów NTP oraz podobną strukturę trójwymiarową znajdują zastosowanie. Dla fachowca będzie zrozumiałe, że mimetyk peptydu można wytworzyć z dowolnych peptydów NTP mających jedną lub większą liczbę modyfikacji tutaj opisanych. Dalej będzie zrozumiałe, że mimetyki peptydów według wynalazku można dalej stosować do opracowania nawet jeszcze silniejszych związków niepeptydowych, dodatkowo poza ich użytecznością jako środków terapeutycznych.

Obecnie istnieje wiele organizacji mogących przeprowadzić syntezę peptydów NTP tutaj opisanych. Przykładowo, biorąc pod uwagę sekwencję peptydu NTP, organizacja może zsyntetyzować peptyd i przesłać zsyntetyzowany peptyd z dołączoną dokumentacją dowodu tożsamości peptydu.

Ponadto możliwe jest zastosowanie peptydów NTP i odpowiadających im cząsteczek kwasów nukleinowych w testach w celu oznaczania, jakościowo lub ilościowo, obecności peptydów NTP, białek NTP, AD7c-NTP, DNA peptydu NTP, DNA białka NTP, DNA AD7C-NTP lub odpowiadającego im RNA w próbkach tkanek lub płynów ustrojowych ssaka. Peptydy NTP oraz odpowiadające im cząsteczki kwasów nukleinowych mogą znaleźć zastosowanie w przygotowywaniu takich testów, bez względu na to, czy peptyd NTP lub DNA kodujący peptyd NTP wykazuje, czy nie wykazuje aktywności biologicznej. Sekwencje kwasu nukleinowego peptydu NTP można zastosować jako źródło sond do hybrydyzacji w oznaczaniu, jakościowo lub ilościowo, obecności peptydów NTP, białek NTP, AD7c-NTP, DNA peptydu NTP, DNA białka NTP, DNA ADTc-NTP lub odpowiadającego mu RNA w próbkach tkanek lub płynów ustrojowych ssaka. Peptyd NTP, który sam nie jest biologicznie aktywny, można stosować do wytwarzania przeciwciał rozpoznających i/lub wiążących peptydy NTP, białka NTP lub białko AD7C-NTP. Takie przeciwciała można wytwarzać znanymi sposobami. Zatem przeciwciała reagujące z peptydami NTP, a także krótkołańcuchowe fragmenty przeciwciał i inne reaktywne fragmenty takich przeciwciał także są użyteczne. Przeciwciała mogą być poliklonalne, monoklonalne, rekombinowane, chimeryczne, jednołańcuchowe i/lub bispecyficzne. Zazwyczaj przeciwciało lub jego fragment będzie pochodzić od człowieka lub będzie humanizowane, czyli wytworzone tak, żeby przeciwdziałać lub zminimalizować odpowiedź immunologiczną na przeciwciało przy podaniu go pacjentowi. Korzystnymi przeciwciałami są ludzkie przeciwciała, poliklonalne lub monoklonalne. Fragmentem przeciwciała może być jakikolwiek fragment, który jest reaktywny z peptydami NTP według wynalazku, taki jak Fab' Fab' itd. Możliwe są także hybrydomy wytworzone przez prezentację dowolnego peptydu NTP jako antygenu wybranemu ssakowi, a następnie sfuzowanie komórek ssaka (np. komórek śledziony) z pewnym typem komórek nowotworowych w celu wytworzenia nieśmiertelnych linii komórkowych za pomocą znanych technik. Te metody stosowane do wytwarzania takich linii komórkowych oraz przeciwciał skierowanych przeciw całości lub częściom peptydu NTP są opisane.

Przeciwciała można także stosować do celów diagnostycznych i badawczych in vivo i in vitro, np. w postaci znakowanej do wykrywania obecności peptydu NTP, białka NTP lub AD7c-NTP w próbce płynu ustrojowego lub komórek.

PL 207 591 B1

Możliwe jest również zastosowanie jednego lub większej liczby peptydów NTP jako wzorców do kalibracji w testach do oznaczania, jakościowo lub ilościowo, obecności peptydów NTP, białek NTP, AD7c-NTP, DNA peptydu NTP, DNA białka NTP, DNA AD7c-NTP lub odpowiadającego im RNA w próbkach tkanek lub pł ynów ustrojowych ssaka.

Wynalazek umożliwia realizację sposobów leczenia stanów wymagających usunięcia komórek, takich jak łagodne i złośliwe nowotwory, rozrost gruczołów (np. prostaty), niepożądane włosy na twarzy, brodawki, niepożądana tkanka tłuszczowa, albo hamowania lub zapobiegania niepożądanej proliferacji komórkowej, takiej jak zwężenie stentu. Taki sposób polega na podawaniu ssakowi, potrzebującemu takiego leczenia lub dostarczenia takiego urządzenia jak stent, terapeutycznie skutecznej ilości peptydu NTP.

Stanem tym może być np. nowotwór płuc, sutka, żołądka, trzustki, prostaty, pęcherza, kości, jajników, skóry, nerki, zatoki, okrężnicy, jelita, żołądka, odbytnicy, przełyku, krwi, mózgu i jego opon, rdzenia kręgowego i jego opon, mięśni, tkanki łącznej, nadnerczy, przytarczyc, tarczycy, macicy, jądra, przysadki, narządów rozrodczych, wątroby, pęcherzyka żółciowego, oka, ucha, nosa, gardła, migdałków, jamy ustnej, węzłów chłonnych i układu limfatycznego oraz innych narządów.

Stosowane tu określenie „nowotwór złośliwy obejmuje wszystkie postacie ludzkich raków, mięsaków i czerniaków występujących w postaci słabo zróżnicowanej, średnio zróżnicowanej i dobrze zróżnicowanej.

Dzięki wynalazkowi zostało spełnione istniejące w dziedzinie wynalazku zapotrzebowanie na sposoby leczenia, które mogą usuwać łagodne nowotwory z mniejszym ryzykiem i mniejszymi niepożądanymi skutkami ubocznymi niż operacja chirurgiczna. Szczególnie potrzebna jest metoda usuwania łagodnych nowotworów w obszarach chirurgicznie ryzykownych, takich jak umiejscowione głęboko w organizmie (np. mózgu, sercu, p ł ucach i innych).

Sposób leczenia stanów, w których komórki muszą być usuwane, można stosować w połączeniu ze zwykłymi metodami leczenia takich stanów, takimi jak wycięcie chirurgiczne, chemioterapia i radioterapia. Peptydy NTP można podawać przed, podczas lub po takim zwykłym leczeniu.

Leczonym stanem może być także rozrost lub przerost tkanki wybranej z grupy obejmującej tkankę płuca, sutka, żołądka, trzustki, prostaty, pęcherza, kości, jajnika, skóry, nerki, zatoki, okrężnicy, jelita, żołądka, odbytnicy, przełyku, krwi, mózgu i jego opon, rdzenia kręgowego i jego opon, mięśni, tkankę łączną, nadnerczy, przytarczyc, tarczycy, macicy, jądra, przysadki, narządów rozrodczych, wątroby, pęcherzyka żółciowego, oka, ucha, nosa, gardła, migdałków, jamy ustnej, węzłów chłonnych i ukł adu limfatycznego.

Inne stany, które mogą być leczone obejmują wirusowe, bakteryjnie lub pasożytniczo zmienioną tkankę wybraną z grupy obejmującej tkankę płuc, sutka, żołądka, trzustki, prostaty, pęcherza, kości, jajnika, skóry, nerki, zatoki, okrężnicy, jelita, żołądka, odbytnicy, przełyku, krwi, mózgu i jego opon, rdzenia kręgowego i jego opon, mięśni, tkankę łączną, nadnerczy, przytarczyc, tarczycy, macicy, jądra, przysadki, narządów rozrodczych, wątroby, pęcherzyka żółciowego, oka, ucha, nosa, gardła, migdałków, jamy ustnej, węzłów chłonnych i układu limfatycznego.

Leczonym stanem może być także wada rozwojowa lub zaburzenie tkanki wybranej z grupy obejmującej tkankę płuc, sutka, żołądka, trzustki, prostaty, pęcherza, kości, jajnika, skóry, nerki, zatoki, okrężnicy, jelita, żołądka, odbytnicy, przełyku, krwi, mózgu i jego opon, rdzenia kręgowego i jego opon, mięśni, tkankę łączną, nadnerczy, przytarczyc, tarczycy, macicy, jądra, przysadki, narządów rozrodczych, wątroby, pęcherzyka żółciowego, oka, ucha, nosa, gardła, migdałków, jamy ustnej, węzłów chłonnych i układu limfatycznego.

W szczególności leczonym stanem moż e być przerost migdałków, rozrost prostaty, łuszczyca, wyprysk, choroby skóry lub żylaki odbytu. Leczonym stanem może być choroba naczyniowa, taka jak miażdżyca tętnic lub stwardnienie tętnic lub zaburzenie naczyniowe, takie jak żylaki kończyn, stenoza lub restenoza tętnicy lub stentu. Leczonym stanem może być także kosmetyczna modyfikacja tkanki, takiej jak tkanka skóry, oka, ucha, nosa, gardła, ust, mięśni, tkanka łączna, włosów lub tkanka sutka.

Środki terapeutyczne zawierające peptydy NTP są objęte zakresem wynalazku. Takie środki mogą zawierać terapeutycznie skuteczną ilość peptydu NTP w mieszaninie z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Materiałem nośnikowym może być woda do zastrzyków, korzystnie uzupełniona innymi materiałami powszechnie stosowanymi w roztworach do podawania ssakom. Zazwyczaj peptyd NTP do stosowania terapeutycznego będzie podawany w postaci środka zawierającego peptyd NTP w połączeniu z jednym lub większą liczbą fizjologicznie dopuszczalnych nośników, zaróbek lub rozcieńczalników. Przykładami odpowiednich nośników jest obojętna buforowana sól fizjologiczna

PL 207 591 B1 lub sól fizjologiczna zmieszana albuminy surowiczej. Korzystnie produkt formułuje się jako liofilizat z użyciem odpowiednich zaróbek (np. sacharozy). Można dodawać inne znane nośniki, rozcieńczalniki i zaróbki, gdy jest to potrzebne. Środki według wynalazku mogą również zawierać znane fachowcom bufory o odpowiednim zakresie wartości pH, w tym bufor Tris o pH około 7,0 - 8,5 lub bufor octanowy o pH około 4,0 - 5,5, które ponadto mogą zawierać sorbitol lub jego odpowiedni zamiennik.

Możliwe jest także zastosowanie peptydów NTP sprzężonych lub połączonych lub związanych z przeciwciałem, fragmentem przeciwciała, cząsteczką podobną do przeciwciała lub cząsteczką o dużym powinowactwie do specyficznego markera nowotworowego, takiego jak receptor komórkowy, peptyd sygnałowy lub nadeksprymowany enzym, w celu skierowania do niepożądanych elementów komórkowych. Przeciwciało, fragment przeciwciała, cząsteczkę podobną do przeciwciała lub cząsteczkę o dużym powinowactwie do specyficznego markera nowotworowego stosuje się w celu skierowania koniugatu peptydu NTP do specyficznej docelowej komórki lub tkanki. Przykładowo, do nowotworu z charakterystycznym antygenem powierzchniowym lub eksprymującym ten antygen, może być skierowana wiążąca cząsteczka przeciwciała, fragmentu przeciwciała lub cząsteczka podobna do przeciwciała i komórki nowotworowe mogą być uśmiercone przez peptyd NTP. Takie podejście z zastosowaniem ukierunkowanych przeciwciał ma przewidywalne zalety obejmujące obniżenie dawki, zwiększenie prawdopodobieństwa wiązania i wchłaniania przez komórki docelowe oraz zwiększenie przydatności do lokalizowania i leczenia nowotworów przerzutowych i nowotworów o mikroskopowych rozmiarach.

Ponadto istotne jest zastosowanie peptydów NTP sprzężonych lub połączonych lub związanych z białkiem lub inną cząsteczką do wytwarzania środka, który po rozszczepieniu w miejscu lub w pobliżu miejsca (miejsc) nowotworu lub niepożądanych komórek, przez enzym lub proteazę specyficzne dla nowotworu lub przez koniugat przeciwciała, który jest kierowany do nowotworu lub innych niepożądanych komórek, uwalnia peptyd NTP w miejscu lub w pobliżu miejsca (miejsc) nowotworu lub niepożądanych komórek.

Istotne jest zastosowanie peptydów NTP sprzężonych lub połączonych lub związanych z białkiem lub inną cząsteczką do wytwarzania środka uwalniającego peptyd NTP lub pewien biologicznie aktywny fragment peptydu NTP po wystawieniu leczonej tkanki na światło (tak jak w terapii laserowej lub innej terapii fotodynamicznej lub fotoaktywowanej), inne postacie promieniowania elektromagnetycznego, takie jak promieniowanie podczerwone, ultrafioletowe, promieniowanie rentgenowskie lub promieniowanie γ, umiejscowione doprowadzenie ciepła, promieniowanie α lub β, emisję ultradźwięków lub inne źródła zlokalizowanej energii.

Peptydy NTP można stosować same, razem lub w połączeniu z innymi środkami farmaceutycznymi, takimi jak cytokiny, czynniki wzrostowe, antybiotyki, środki wywołujące apoptozę, środki przeciwzapalne i/lub środki chemioterapeutyczne, jak zależnie od wymagań dla leczonego wskazania.

Można wytwarzać środki terapeutyczne zawierające peptydy NTP stosując dendrymery, fulereny i inne syntetyczne cząsteczki, polimery i makrocząsteczki, przy czym peptyd NTP i/lub odpowiadająca mu cząsteczka DNA jest sprzężona z, dołączona do lub zamknięta w cząsteczce, polimerze lub makrocząsteczce, indywidualnie albo razem z innymi rodzajami cząsteczek, takimi jak marker specyficzny dla nowotworu. Przykładowo, w opisie patentowym US 5714166, Bioactive and/or Targeted Dendimer Conjugates, opisano sposoby wytwarzania i stosowania, między innymi, dendrytycznych polimerów koniugatów składających się z co najmniej jednego ukierunkowanego dendrymeru i co najmniej jednego sprzężonego z nim środka bioaktywnego.

Użyteczne są środki terapeutyczne zawierające peptydy NTP i/lub geny oraz nośniki dostarczające leki, takie jak emulsje lipidowe, micele polimerów, mikrosfery polimerowe, polimery elektroaktywne, hydrożele i liposomy.

Możliwe jest również przeniesienie pokrewnych genów lub odpowiedników genów peptydów NTP do niepożądanych komórek. Nadekspresję peptydu NTP w nowotworze można wykorzystać do indukcji śmierci komórek w nowotworze, a zatem i zmniejszenia populacji komórek nowotworowych. Przewiduje się, że przeniesienie genu lub odpowiednika genu peptydu NTP do leczenia niepożądanych elementów komórkowych ma zalety polegające na stosowaniu mniejszej dawki i przekazywaniu do komórek potomnych leczonych elementów komórkowych, co wywołuje rzadszą potrzebę stosowania terapii i ogólnie potrzebę stosowania mniejszej liczby terapii. Możliwe jest także przeniesienie genów kodujących białko fuzyjne zawierające peptyd NTP do niepożądanych komórek lub komórek sąsiednich, w których po ekspresji genu i wytworzeniu i/lub wydzieleniu białka fuzyjnego, białko fuzyjne

PL 207 591 B1 jest rozszczepiane przez natywne enzymy lub proteazy lub przez prolek z uwolnieniem peptydu NTP w niepożądanych komórkach, na nich lub w ich pobliż u.

Możliwe jest również zastosowanie sklonowanych koniugatów peptyd NTP-przeciwciało; sklonowanych zrekombinowanych koniugatów peptyd NTP-fragment przeciwciała; oraz sklonowanych zrekombinowanych koniugatów peptyd NTP-białko podobne do przeciwciała. Zaletami stosowania koniugatu sklonowanego peptydu NTP połączonego z ukierunkowaną cząsteczką (taką jak przeciwciało, fragment przeciwciała, cząsteczka podobna do przeciwciała lub cząsteczka o dużym powinowactwie do nowotworowo-specyficznego receptora lub markera nowotworowego) jest to, że taka cząsteczka ma opisane powyżej zalety ukierunkowania w połączeniu z zaletami związanymi z wytwarzaniem i standaryzacją produkcji sklonowanej sprzężonej cząsteczki.

Stałe postacie dawkowane do podawania doustnego obejmują, ale nie wyłącznie, kapsułki, tabletki, pigułki, proszki i granulki. W takich stałych postaciach dawkowanych związek czynny jest zmieszany z co najmniej jedną z poniższych substancji: (a) jedną lub większą liczbą obojętnych zaróbek (lub nośników), takich jak cytrynian sodu lub fosforan dwuwapniowy; (b) wypełniaczami lub rozcieńczalnikami, takimi jak skrobie, laktoza, sacharoza, glukoza, mannitol i kwas krzemowy; (c) środkami wiążącymi, takimi jak karboksymetyloceluloza, alginiany, żelatyna, poliwinylopirolidon, sacharoza i guma arabska; (d) środkami utrzymującymi wilgoć, takimi jak gliceryna; (e) środkami rozsadzającymi, takimi jak agar, węglan wapnia, skrobia ziemniaczana lub tapiokowa, kwas alginowy, pewne złożone krzemiany i węglan sodu; (f) środkami opóźniającymi rozpuszczanie, takimi jak parafina; (g) środkami przyspieszającymi wchłanianie, takimi jak czwartorzędowe związki amoniowe; (h) środkami zwilżającymi, takimi jak alkohol acetylowy i monostearynian glicerolu; (i) środkami adsorbującymi, takimi jak kaolin i bentonit; oraz (j) środkami poślizgowymi, takimi jak talk, stearynian wapnia, stearynian magnezu, stałe glikole polietylenowe, laurylosiarczan sodu lub ich mieszaninami. W przypadku kapsułek, tabletek i pigułek postaci dawkowane mogą także zawierać środki buforujące.

Ciekłe postacie dawkowane do podawania doustnego obejmują farmaceutycznie dopuszczalne emulsje, roztwory, zawiesiny, syropy i eliksiry. Oprócz związków czynnych, ciekłe postacie dawkowane mogą zawierać powszechnie stosowane obojętne rozcieńczalniki, takie jak woda lub inne rozpuszczalniki, środki rozpuszczające i emulgujące. Przykładowymi środkami emulgującymi są alkohol etylowy, alkohol izopropylowy, węglan etylu, octan etylu, alkohol benzylowy, benzoesan benzylu, glikol propylenowy, glikol 1,3-butylenowy, dimetyloformamid, oleje, takie jak olej bawełniany, olej arachidowy, olej kukurydziany, olej oliwkowy, olej rycynowy i olej sezamowy, gliceryna, alkohol tetrahydrofurfurylowy, glikol polietylenowy, estry kwasów tłuszczowych sorbitanu lub mieszaniny tych substancji itp.

Oprócz takich obojętnych rozcieńczalników, środek może także zawierać środki pomocnicze, takie jak środki zwilżające, środki emulgujące i suspendujące, słodzące, smakowo-zapachowe i aromatyzujące.

Rzeczywiste poziomy dawkowania substancji czynnych w środkach według wynalazku mogą się różnić aby uzyskać ilość peptydu NTP, która jest skuteczna do osiągnięcia wymaganej odpowiedzi terapeutycznej na konkretny środek i sposób podawania. Zatem wybrany poziom dawki zależy od wymaganego efektu terapeutycznego, drogi podawania, wymaganego czasu trwania leczenia i innych czynników.

W przypadku ssaków, w tym ludzi, skuteczną ilość można podawać w odniesieniu do powierzchni ciała. Wzajemną zależność dawek dla zwierząt różnej wielkości, gatunków oraz ludzi (w mg/m² powierzchni ciała) opisano w E. J. Freireich i in., Cancer Chemother. Rep., 50(4):219 (1966). Powierzchnię ciała można w przybliżeniu określić na podstawie wzrostu i masy osobnika (patrz np. Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardsley, NY. str. 537-538 (1970)).

Całkowita dzienna dawka peptydu NTP podawana gospodarzowi może być dawką pojedynczą lub podzieloną. Środki w postaci jednostek dawkowanych mogą zawierać takie ilości takich ich podwielokrotności, które mogą być stosowane do pokrycia dziennej dawki. Należy jednak rozumieć, że konkretny poziom dawki dla danego konkretnego pacjenta będzie zależeć od wielu czynników, w tym masy ciała, ogólnego stanu zdrowia, płci, diety, czasu i drogi podawania, działania podawanego leku, szybkości wchłaniania i wydalania, połączenia z innymi lekami oraz ciężkości konkretnej leczonej choroby.

Sposób podawania zawierającego peptyd NTP środka według wynalazku obejmuje, ale nie wyłącznie, podawanie związków domięśniowo, doustnie, dożylnie, śródotrzewnowo, śródmózgowo (śródmiąższowo), do komór mózgowych, donowotworowo, do miejsca objętego chorobą, śródskórnie, doodbytniczo, donosowo, doocznie, dotętniczo, domiejscowo, przezskórnie, w aerozolu, we wlewie, w zastrzyku uderzeniowym, we wszczepianym urządzeniu, układzie do przedłużonego uwalniania itd.

PL 207 591 B1

Innym sposobem podawania peptydu NTP według wynalazku jest podawanie przezskórne. W szczególności można wytworzyć plaster z jednorodną zawiesiną peptydu NTP, np. w dimetylosulfotlenku (DMSO) lub mieszaninie DMSO z olejem bawełnianym i doprowadzić do kontaktu ze skórą ssaków z nowotworem, z dala od miejsca umiejscowienia nowotworu wewnątrz uchyłka skórnego. Inne podłoża i ich mieszaniny z innymi rozpuszczalnikami i stałymi nośnikami będą nadawały się równie dobrze. Plaster może zawierać peptyd NTP w postaci roztworu lub zawiesiny. Następnie plaster można nałożyć na skórę pacjenta, np. przez umieszczenie go w uchyłku skórnym pacjenta utworzonym przez zagięcie i utrzymywanie skóry ze sobą za pomocą lepkich substancji, klipsów i urządzeń przytrzymujących. Ten uchyłek powinien być utworzony w taki sposób, aby zapewnić ciągły kontakt ze skórą bez wpływu na ssaka. Poza wykorzystaniem uchyłka skórnego można zastosować dowolne urządzenie, które umożliwia mocne umieszczenie plastra w kontakcie ze skórą. Przykładowo, aby utrzymać plaster w miejscu na skórze można zastosować bandaż przylepny.

Peptyd NTP można podawać w preparacie lub środku o przedłużonym uwalnianiu. Odpowiednie przykłady preparatów o przedłużonym uwalnianiu obejmują półprzepuszczalne matryce w postaci ukształtowanych produktów, np. błon lub mikrokapsułek. Matryce o przedłużonym uwalnianiu obejmują poliestry, hydrożele, polilaktydy (US 3773919, EP 58481), kopolimery kwasu L-glutaminowego i etylo-L-glutaminianu (Sidman i in., Biopolymers, 22: 547-556 [1983]), poli(2-hydroksyetylometakrylan) (Longer i in., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 [1981] oraz Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 [1982]), octan etylenowinylu (Langer i in., jak wyżej) lub kwas poli-D(-)-3-hydroksymasłowy (EP 133988). Środki o przedłużonym uwalnianiu mogą także zawierać liposomy, które można wytworzyć dowolną z szeregu metod znanych w dziedzinie wynalazku (np. Eppstein i in., Proc. Natl Acad. Sci USA, 82: 3688-3692 [1985]; EP 36676; EP 88046 oraz EP 143949).

Innym sposobem podawania peptydu NTP według wynalazku jest bezpośredni lub pośredni wlew peptydu NTP do guza lub innej leczonej tkanki. Jednym przykładem tego rozwiązania jest bezpośrednie wstrzyknięcie peptydu NTP do guza lub innej leczonej tkanki. Leczenie może obejmować podanie pojedynczego zastrzyku, kilku zastrzyków wykonanych w jednym czasie lub serię zastrzyków wykonywanych w ciągu godzin, dni lub miesięcy z cofaniem się lub zniszczeniem nowotworu lub leczonej tkanki, co monitoruje się za pomocą biopsji, obrazowania i innymi metodami monitorującymi wzrost tkanki. Wstrzyknięcie do guza lub innej leczonej tkanki można wykonać za pomocą urządzenia umieszczonego w otworze, takim jak nos, jama ustna, ucho, pochwa, odbyt lub cewka moczowa lub przez nacięcie w celu dotarcia do guza lub tkanki in vivo i można je wykonywać w połączeniu z układem obrazowania lub optycznym, takim jak wskaźnik ultradźwiękowy lub z włókna optycznego, w celu zidentyfikowania odpowiedniego miejsca (miejsc) do wstrzyknięcia. Innym przykładem takiej postaci jest zastosowanie urządzenia, które może zapewnić stały wlew peptydu NTP do tkanki przez pewien czas.

Innym sposobem podawania peptydu NTP według wynalazku jest połączenie z chirurgiczną lub podobną procedurą stosowaną do fizycznego wycięcia, usunięcia lub uśmiercenia albo zniszczenia w inny sposób nowotworu lub innej tkanki lub elementów komórkowych, które są wymagane lub pożądane do usunięcia lub zniszczenia, przy czym peptyd NTP według wynalazku podaje się do najbliższego obszaru(-ów) otaczającego(-ych) obszar(-y), z którego nowotwór lub inna tkanka zostały usunięte w celu zniszczenia lub zahamowania wzrostu jakichkolwiek komórek nowotworowych lub innych elementów komórkowych nieusuniętych lub niezniszczonych w wyniku tej procedury.

Innym sposobem podawania peptydu NTP według wynalazku jest wszczepienie urządzenia do guza lub innej leczonej tkanki. Jednym przykładem tego rozwiązania jest wszczepienie płatka zawierającego peptyd NTP do guza lub innej leczonej tkanki. Płatek uwalnia terapeutyczną dawkę peptydu NTP do tkanki przez pewien czas. Alternatywnie lub dodatkowo, preparat można podawać domiejscowo przez wszczepienie do dotkniętego obszaru błony, gąbki lub innego odpowiedniego materiału na którym został zaadsorbowany peptyd NTP. Gdy stosuje się wszczepiane urządzenie, urządzenie to można wszczepiać do jakiejkolwiek odpowiedniej tkanki lub narządu i podawanie peptydu NTP może być bezpośrednie przez urządzenie w porcjach lub przy podawaniu ciągłym lub przez cewnik z zastosowaniem ciągłego wlewu.

Alternatywnym sposobem podawania jest wprowadzenie jednej lub większej liczby kopii genu kodującego peptyd NTP do docelowej komórki oraz, gdy jest to potrzebne, zaindukowanie kopii genu do rozpoczęcia wytwarzania peptydu NTP wewnątrzkomórkowo. Jednym ze sposobów zastosowania terapii genowej jest zastosowanie genu kodującego peptyd NTP (albo genomowego DNA, cDNA i/lub syntetycznego DNA kodującego peptyd NTP lub jego fragment, wariant, homolog lub pochodną), który

PL 207 591 B1 może być funkcjonalnie sprzężony z konstytutywnym lub indukowalnym promotorem z wytworzeniem konstruktu DNA do terapii genowej. Promotor może być homologiczny lub heterologiczny względem endogennego genu kodującego peptyd NTP, pod warunkiem, że jest on aktywny w komórce lub typie tkanki do którego konstrukt będzie wstawiony. Inne składniki konstruktu DNA do terapii genowej mogą dodatkowo zawierać, gdy jest to wymagane, cząsteczki DNA zaprojektowane do miejscowo specyficznej integracji (np. endogenne sekwencje flankujące użyteczne do homologicznej rekombinacji), tkankowo specyficzny promotor, wzmacniacz(-e) lub wyciszacz(-e), cząsteczki DNA zdolne do zapewnienia korzyści selektywności względem komórki wyjściowej, cząsteczki DNA użyteczne jako znaczniki do identyfikacji transformowanych komórek, układy negatywnej selekcji, komórkowo specyficzne środki wiążące (takie jak np. do ukierunkowania na komórkę, komórkowo specyficzne czynniki internalizujące oraz czynniki transkrypcyjne do wzmocnienia ekspresji przez wektor, a także czynniki do umożliwienia wytwarzania wektora.

Sposoby dostarczania genu do komórki lub tkanki in vivo lub ex vivo obejmują (ale nie wyłącznie) bezpośrednie wstrzyknięcie nagiego DNA, metody balistyczne, transfer za pośrednictwem liposomów, transfer za pośrednictwem receptorów (kompleks ligand-DNA), elektroporację, wytrącanie fosforanem wapnia, jak ujawniono np. w opisie patentowym US 4970154, WO 96/40958, opisach patentowych US nr 5679559, 5676954 i 5593875. Obejmują one także zastosowanie wektora wirusowego, takiego jak retrowirus, adenowirus, wirus adenosatelitarny, wirus ospy, lentiwirus, wirus brodawczaka lub wirus opryszczki pospolitej, zastosowanie koniugatu DNA-białko oraz zastosowanie liposomu. Zastosowanie wektorów do terapii genowej opisano np. w opisach patentowych US nr 5672344, 5399346, 5631236 i 5635399.

Gen kodujący peptyd NTP można dostarczać przez wszczepienie do pewnych komórek pacjenta, które poddano procedurom inżynierii genetycznej ex vivo, z zastosowaniem opisanych metod, aby eksprymowały i wydzielały peptyd NTP lub jego fragmenty, warianty, homologi lub pochodne. Takie komórki mogą być komórkami zwierzęcymi lub ludzkimi i mogą pochodzić z własnej tkanki pacjenta lub z innego źródła, pochodzącego lub niepochodzącego od człowieka. Ewentualnie komórki mogą być nieśmiertelne lub mogą być komórkami macierzystymi. Jednakże, aby zmniejszyć szansę odpowiedzi immunologicznej, korzystne jest aby komórki były kapsułkowane, aby zapobiec naciekaniu sąsiadujących tkanek. Zazwyczaj materiały kapsułkujące są biozgodnymi, półprzepuszczalnymi polimerycznymi otoczkami lub błonami, które umożliwiają uwalnianie produktu(-ów) białkowego (-ych), ale przeciwdziałają zniszczeniu komórek przez układ immunologiczny gospodarza lub przez inne czynniki szkodliwe z sąsiednich tkanek. Metody stosowane do membranowego kapsułkowania komórek są znane fachowcom i wytwarzanie kapsułkowanych komórek oraz wszczepienie ich pacjentom można przeprowadzić bez nadmiernych doświadczeń. Patrz np. opisy patentowe US nr 4892538, 5011472 i 5106627. Układ do kapsułkowania żywych komórek opisano w publikacji PCT WO 91/10425. Metody formułowania różnych innych materiałów do przedłużonego lub kontrolowanego podawania, takich jak nośniki liposomowe, biorozkładalne cząstki lub kulki, są także znane fachowcom i opisane w, np. opisie patentowym US 5653975. Komórki, z kapsułkowaniem lub bez kapsułkowania, można wszczepić do odpowiednich tkanek i narządów ciała pacjenta.

Poniżej opisano figury rysunku powołane w niniejszym opisie.

Fig. 1: Przedstawia kompletne sekwencje aminokwasowe 122-aminokwasowego białka włókienek neuronalnych (sekwencja 40 z opisów patentowych US nr 5830670, 5948634 i 5948888; nr dostępu NCBI Entrez-Protein AAE25447 PID g10048540) [SEQ ID NO. 1].

Fig. 2: Przedstawia kompletne sekwencje aminokwasowe 122-aminokwasowego białka włókienek neuronalnych (nr dostępu NCBI Entrez-Protein XP_032307 PID g15928971) [SEQ ID NO. 2].

Fig. 3: Przedstawia kompletne sekwencje aminokwasowe 106-aminokwasowego białka podobnego do białka włókienek neuronalnych (nr dostępu NCBI Entrez-Protein AAH14951 PID g15928971) [SEQ ID NO. 3].

Fig. 4: Przedstawia kompletne sekwencje aminokwasowe 98-aminokwasowego białka włókienek neuronalnych (sekwencja 30 z opisów patentowych US nr 5830670, 5948634 i 5948888; nr dostępu NCBI Entrez-Protein AAE25445, PID g10048538) [SEQ ID NO. 4].

Fig. 5: Przedstawia kompletne sekwencje aminokwasowe 75-aminokwasowego białka włókienek neuronalnych (sekwencja 48 z opisów patentowych US nr 5830670, 5948634 i 5948888; nr dostępu NCBI Entrez-Protein AAE25448, PID g10048541) [SEQ ID NO. 5].

PL 207 591 B1

Fig. 6: Przedstawia kompletne sekwencje aminokwasowe 68-aminokwasowego białka włókienek neuronalnych (sekwencja 36 z opisów patentowych US nr 5830670, 5948634 i 5948888; nr dostępu NCBI Entrez-Protein AAE25446, PID g10048539) [SEQ ID NO. 6].

Fig. 7: Przedstawia kompletne sekwencje aminokwasowe 61-aminokwasowego białka podobnego do białka włókienek neuronalnych (nr dostępu NCBI Entrez-Protein AAH02534, PID g12803421) [SEQ ID NO. 7].

W odniesieniu do wynalazku można specjalnie powołać przykłady podane w publikacji US 20030054990, gdzie ujawniono, że całe białko AD7c-NTP jest skutecznym środkiem do wywoływania śmierci komórek zarówno in vitro w hodowlach komórek glejaka i nerwiaka niedojrzałego, jak i in vivo w prawidłowej tkance mięśniowej, podskórnej tkance łącznej oraz skórze właściwej gryzoni oraz w wielu różnych nowotworach pochodzących i niepochodzących od ludzi, włącznie z rakiem sutka, rakiem i brodawczakiem skóry, rakiem jelita, glejakiem mózgu oraz w innych modelach gryzoni. Można tu wymienić przykłady podane w publikacji US 20030096350 oraz opisach patentowych US nr 7192929 i 7241738, gdzie ujawniono, że fragmenty AD7c-NTP, białek homologicznych do AD7c-NTP i białek NTP oraz białka NTP są skutecznymi środkami do wywoływania śmierci komórek in vivo w prawidłowej tkance mięśniowej, podskórnej tkance łącznej, skórze właściwej oraz innych tkankach gryzoni.

W celu zilustrowania wynalazku podano poniż sze przykł ady.

P r z y k ł a d 1

Celem tego przykładu było określenie wpływu peptydu NTP[122] nr 1 na tkankę w miejscach wstrzyknięcia.

Samce szczura Sprague-Dawley (o masie 300 g) uśpiono eterem i podano peptyd NTP[122] nr 1 we wlewie śródprostatowym po chirurgicznym uwidocznieniu prostaty. Zastrzyki zawierały 300 μΐ peptydu NTP[122] nr 1, 1 mg/ml w PBS pH 7,4 (1,0 mg/kg) (n = 8), kontrolne zastrzyki zawierały samą PBS (n = 6) oraz przeprowadzono próby kontrolne bez wstrzykiwania (n = 2). Szczury bezboleśnie uśmiercono po 72 godzinach. Gruczoły prostaty wypreparowano, utrwalono w 10% buforowanej formalinie przez 24 godziny, zatopiono w parafinie, pocięto i wybarwiono H & E. W przypadku każdego zwierzęcia cały gruczoł prostaty zatopiono i pocięto. Wszystkie wybarwione przekroje zbadano histologicznie i zmierzono. Dla każdej prostaty badano co najmniej 4 przekroje histologiczne i dla każdego przekroju histologicznego zmierzono dwie średnice (D) przekroju poprzecznego pod kątem 90° względem siebie (całkowita liczba > 8 pomiarów na prostatę). Średnią średnicę z tych pomiarów dla każdej prostaty zastosowano do obliczenia objętości według wzoru:

Wyniki

Zmniejszenie objętości prostaty przez peptyd NTP[122] nr 1 wstrzyknięty szczurom określono jako średnio 45% w porównaniu z próbami kontrolnymi (brak było zauważalnej różnicy pomiędzy próbą kontrolną z wstrzykiwaniem samej PBS, a próbami kontrolnymi bez wstrzykiwania). Traktowana prostata szczurza wykazywała rozległy zanik nabłonka gruczołu, spłaszczenie i atrofię. Otwarte wlewy 1,0 mg/kg peptydu NTP [122] nr 1 w PBS pH 7,4 do szczurzej prostaty spowodowały oszacowane zmniejszenie objętości prostaty > 40% w porównaniu z kontrolnymi zwierzętami nietraktowanymi i traktowanymi PBS, po 72 godzinach.

P r z y k ł a d 2

Celem tego przykładu było określenie wpływu peptydu NTP[112] nr 1 na tkankę w miejscu wstrzyknięcia.

Samce szczura Sprague-Dawley (o masie w zakresie 300 g) uśpiono eterem i podano im peptyd NTP[122] nr 1 we wlewie śródprostatowym po chirurgicznym uwidocznieniu prostaty. Zastrzyki zawierały 300 μI peptydu NTP [122] nr 1, 1 mg/ml, w PBS pH 7,4, (1,0 mg/kg) (n = 4), kontrolne zastrzyki zawierały samą PBS (n = 3) oraz przeprowadzono próbę kontrolną bez wstrzykiwania (n = 1). Szczury bezboleśnie uśmiercono po 72 godzinach. Gruczoły prostaty wypreparowano, utrwalono w 10% buforowanej formalinie przez 24 godziny, zatopiono w parafinie, pocięto i wybarwiono H & E. W przypadku każdego zwierzęcia cały gruczoł prostaty zatopiono i pocięto. Wszystkie wybarwione przekroje zbadano histologicznie i zmierzono. Dla każdej prostaty badano co najmniej 4 przekroje histologiczne, a dla każdego przekroju histologicznego zmierzono dwie średnice (D) przekroju poPL 207 591 B1 przecznego pod kątem 90° względem siebie (całkowita liczba > 8 pomiarów na prostatę). Średnią średnicę z tych pomiarów dla każdej prostaty zastosowano do obliczenia objętości według wzoru:

Próby kontrolne były takie same jak w przykładzie 1

Wyniki

Tak jak w powyższym przykładzie 1, wstrzyknięcie peptydu NTP[112] nr 1 spowodowało znaczącą utratę komórek i atrofię prostaty po 72 godzinach. W przypadku zwierząt kontrolnych zaobserwowano minimalne zmiany, lub ich brak, które obejmowały łagodne zapalenie miejscowe wynikające z ukł ucia ig łą.

P r z y k ł a d 3

Celem tego przykładu było określenie wpływu opisanych powyżej peptydów NTP na tkankę w miejscach wstrzyknię cia.

Ośmiu normalnym szczurom wstrzyknięto do skóry i podskórnie, za każdym razem do czterech różnych ognisk oraz do mięśnia szkieletowego kończyny, za każdym razem do dwóch różnych ognisk, opisane powyżej peptydy NTP[122] 1-8, peptydy NTP[112] 1-7, peptydy NTP[106] 1-7, peptydy NTP[98] 1-6, peptydy NTP[75] 1-5, peptydy NTP[68] 1-4 oraz peptydy NTP[61] 1-4 w roztworze soli fizjologicznej w ilościach 100 - 400 ml w stężeniach 0,1-1 mg/ml za pomocą strzykawki z tworzywa sztucznego, z igłami ze stali nierdzewnej o rozmiarze 26.

Zwierzęta obserwowano przez 24 godziny i bezboleśnie uśmiercono po 24 godzinach. Poszczególne ogniska nacieku wycięto, utrwalono w 10% formalinie, zatopiono w parafinie i wybarwiono oraz zbadano standardowymi metodami histopatologicznymi.

Podobnym grupom szczurów kontrolnych wstrzyknięto (1) 0,1% surowiczą albuminę bydlęcą w soli fizjologicznej, (2) normalną ludzką surowicę , (3) sól fizjologiczną , (4) nie infekcyjne białka bakteryjne, oraz (5) peptydy kontrolne, a następnie szczury spreparowano, zbadano i uśmiercono jak powyżej, traktując wycięte ogniska po zastrzykach w sposób opisany powyżej.

Wyniki

Wstrzyknięcie peptydów NTP[122] 1-8, peptydów NTP[112] 1-7, peptydów NTP[106] 1-7, peptydów NTP[98] 1-6, peptydów NTP[75] 1-5, peptydów NTP[68] 1-4 i peptydów NTP[61] 1-4 we wszystkich przykładach spowodowało rozległą ostrą nekrozę tkanki w miejscach wstrzyknięcia. Nekroza była widoczna w tkance mięśniowej, podskórnej tkance łącznej oraz skórze właściwej w miejscach, w które wstrzyknięto peptyd NTP. Po 24 godzinach komórki stały się blade, pomarszczone, nekrotyczne i wystę pował o naciekanie komórek zapalnych. Nekroza korelował a z obszarem wstrzyknię cia i nie wydawała się rozprzestrzeniać dalej niż miejsce iniekcji.

Poza łagodnymi obszarami zapalnymi, zwierzęta kontrolne wykazywały brak widocznej nekrozy lub utraty komórek. W odróżnieniu od zwierząt, którym wstrzykiwano peptyd NTP, u których całe pola warstw włókien mięśniowych były nekrotyczne, zwierzęta kontrolne wykazywały brak lub minimalne zmiany mięśni. Kontrolne zastrzyki wywoływały łagodne do minimalnie ostrego zapalenia w miejscach iniekcji i ogniskowy krwotok wywołany igłą.

PL 207 591 B1

Wykaz sekwencji <110> ΝΥΜΟΧ CORPORATION AVERBACK, PAUL GEMMEL, JACK <120> Peptyd NTP i środek zawierający ten peptyd <130» 10107-52 <140» PCT/CA02/01757 <141> 2002-11-18 <150> US 60/331,447 <151> 2001-11-16 <160» 49 <170» Patentln wersja 3,2 <210> 1 <211> 122 <212» PRT .

<213» Homo sapiens <400» 1

Met 1

Met

Val

Cys

Trp 5

Asn

Arg

Phe

Gly

Lys 10

Trp

Val

Tyr

Phe

Ile 15

Ser

Ala

Ile

Phe

Asn 20

Phe

Gly

Pro

Arg

Tyr 25

Leu

Tyr

His

Gly

Val 30

Pro

Phe

Tyr

Phe

Leu 35

Ile

Leu

Val

Arg

Ile 40

Ile

Ser

Phe

Leu

Ile 45

Gly

Asp

Met

Glu

Asp 50

Val

Leu

Asn

Cys 55

Thr

Leu

Lys

Arg 60

Ser

Arg

Phe

Arg 65

Phe

Trp

Gly

Ala

Leu 70

Val

Cys

Ser

Met

Asp 75

Ser

Cys

Arg

Phe

Ser 80

Arg

Val

Ala

Vał

Thr 85

Tyr

Arg

Phe

Ile

Thr 90

Leu

Asn

Ile

Pro 95

Ser

Pro

Ala

Val

Trp 100

Met

Ala

Arg

Asn

Thr 105

Ile

Asp

Gin

Val 110

Leu

Ser

Arg

Ile

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Cys

Leu

115 120 <210» 2 <211» 112

PL 207 591 B1 <212» PRT <213> Homo sapiens <400» 2

Met Ala Gin Ser Arg Leu Thr Ala Thr Ser Ala Ser Arg Val Gin Ala

1

5

10

15

Ile

Leu

Ser 20

Gin

Pro

Lys

Gin 25

Leu

Gly

Leu

Arg

Ala 30

Pro

Ala

Asn

Thr

Pro 35

Leu

Ile

Phe

Val

Phe 40

Ser

Leu

Glu

Ala

Gly 45

Phe

His

Ile

Cys 50

Gin

Ala

Gly

Leu

Lys 55

Leu

Thr

Ser

Gly 60

Asp

Pro

Ala

Ser 65

Ala

Phe

Gin

Ser

Ala 70

Gly

Ile

Thr

Gly

Val 75

Ser

His

Leu

Thr

Gin 80

Pro

Jll a

Asn

Leu

Asp 85

Lys

Ile

Cys

Ser 90

Asn

Gly

Ser

Cys 95

Tyr

Yal

Ala

Gin

Ala

Gly

Leu

Lys

Leu

Ala

Ser

Cys

Asn

Pro

Ser

Lys

100 105 110 <210> 3 <211> 106 <212» PRT <213» Homo sapiens

<400» 3 Met Trp 1

Thr

Leu

Lys 5

Ser

Leu

Val

Leu 10

Leu

Cys

Leu

Thr 15

Cys

Ser

Tyr

Ala

Phe 20

Met

Phe

Ser

Leu 25

Arg

Gin

Lys

Thr

Ser 30

Glu

Pro

Gin

Gly

Lys 35

Val

Pro

Cys

Gly

Glu 40

His

Phe

Arg

Ile

Arg 45

Gin

Asn

Leu

Pro

Glu 50

His

Thr

Gin

Gly

Trp 55

Leu

Gly

Ser

Lys

Trp 60

Leu

Trp

Leu

Phe 65

Ala

Val

Pro

Phe 70

Val

Ile

Leu

Lys

Cys 75

Gin

Arg

Asp

Ser

Glu 80

Lys

Asn

Lys

Val

Arg 85

Met

Ala

Pro

Phe

Phe 90

Leu

His

Ile

Asp 95

Ser

Ile

Ser

Gly

Yal

Ser

Gly

Lys

Arg

Met

Phe

100 105

PL 207 591 B1 <210> 4 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Glu 1

Ala

Tyr

Thr 5

Met

Leu

His

Leu

Pro 10

Thr

Asn

Arg

Pro 15

Lys

Ile

Ala

His

Cys 20

Ile

Leu

Phe

Asn

Gln 25

Pro

His

Ser

Pro

Arg 30

Ser

Asn

Ser

His

Ser 35

His

Pro

Asn

Pro

Leu 40

Lys

Leu

His

Arg

Arg 45

Ser

His

Ser

His

Asn 50

Arg

Pro

Arg

Ala

Tyr 55

Ile

Leu

Ile

Thr

Ile 60

Leu

Pro

Ser

Lys

Leu 65

Lys

Leu

Arg

Thr

His 70

Ser

Gln

Ser

His

His 75

Asn

Pro

Leu

Ser

Arg 80

Thr

Ser

Asn

Ser

Thr

Pro

Thr

Asn

Ser

Phe

Leu

Met

Thr

Ser

Lys

90 95

Pro Arg <210> 5 <211> 75 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 5

Ser Leu

Gly 5

Leu

Pro Lys

Cys Trp Asp Tyr Arg His Glu Leu

Ser 1

Ser

10

15

Leu

Ser

Leu

Ala 20

Leu

Met

Ile

Asn

Phe 25

Arg

Val

Met

Ala

Cys 30

Thr

Phe

Lys

Gln

His 35

Ile

Glu

Leu

Arg

Gln 40

Lys

Ile

Ser

Ile

Val 45

Pro

Arg

Lys

Leu

Cys 50

Cys

Met

Gly

Pro

Val 55

Cys

Pro

Val

Lys

Ile 60

Ala

Leu

Thr

Ile

Asn

Gly

His

Cys

Thr

Trp

Leu

Pro

Ala

Ser

70 75 <210> 6 <211> 68 <212> PRT <213> Homo sapiens

PL 207 591 B1 <400> 6

Met 1

Phe

Val

Phe

Cys 5

Leu

Ile

Leu

Asn

Arg 10

Glu

Lys

Ile

Lys

Gly 15

Gly

Asn

Ser

Phe 20

Phe

Leu

Ser

Phe 25

Phe

Ser

Phe

Gin 30

Asn

Cys

Gin

Cys 35

Phe

Gin

Cys

Arg

Thr 40

Thr

Glu

Gly

Tyr

Ala 45

Val

Glu

Cys

Phe

Tyr

Cys

Leu

Val

Asp

Lys

Ala

Phe

Glu

Cys

Trp

Phe

Tyr

55 60

Ser Phe Asp Thr 65 <210> 7 <211> 61 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7

Met Glu Pro His Thr Val Ala Gin Ala Gly Val Pro Gin His Asp Leu 15 10 15

Gly Ser Leu Gin Ser Leu Leu Pro Arg Phe Lys Arg Phe Ser Cys Leu 20 25 30

Ile Leu Pro Lys Ile Trp Asp Tyr Arg Asn Met Asn Thr Ala Leu Ile 35 40 45

Lys Arg Asn Arg Tyr Thr Pro Glu Thr Gly Arg Lys Ser 50 55 60 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8

Ile Asp Gin Gin Val Leu Ser Arg Ile Lys Leu Glu Ile Lys Arg Cys 15 10 15

Leu <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens

PL 207 591 B1 <400> 9

Met Met Val Cys Trp Asn Arg Phe Gly Lys Trp Val Tyr Phe Ile 15 10 15 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10

Ser Ala Ile Phe Asn Phe Gly Pro Arg Tyr Leu Tyr His Gly Val 15 10 15 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11

Pro Phe Tyr Phe Leu Ile Leu Val Arg Ile Ile Ser Phe Leu Ile 15 10 15 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12

Gly Asp Met Glu Asp Val Leu Leu Asn Cys Thr Leu Leu Lys Arg 15 10 15 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13

Ser Ser Arg Phe Arg Phe Trp Gly Ala Leu Val Cys Ser Met Asp 15 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14

Ser Cys Arg Phe Ser Arg Val Ala Val Thr Tyr Arg Phe Ile Thr 15 10 15

PL 207 591 B1 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15

Leu Leu Asn Ile Pro Ser Pro Ala Val Trp Met Ala Arg Asn Thr 15 10 15 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16

Met Ala Gin Ser Arg Leu Thr Ala Thr Ser Ala Ser Arg Val Gin 15 10 15 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17

Ala Ile Leu Leu Ser Gin Pro Pro Lys Gin Leu Gly Leu Arg Ala 15 10 15 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18

Pro Ala Asn Thr Pro Leu Ile Phe Val Phe Ser Leu Glu Ala Gly 15 10 15 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19

Phe His His Ile Cys Gin Ala Gly Leu Lys Leu Leu Thr Ser Gly 15 10 15 <210> 20 <211> 15 <212> PRT

PL 207 591 B1 <213> Homo sapiens <400> 20

Asp Pro Pro Ala Ser Ala Phe Gin Ser Ala Gly Ile Thr Gly Val 15 10 15 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21

Ser His Leu Thr Gin Pro Ala Asn Leu Asp Lys Lys Ile Cys Ser 15 10 15 <210> 22 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22

Asn Gly Gly Ser Cys Tyr Val Ala Gin Ala Gly Leu Lys Leu Leu Ala 15 10 15

Ser Cys Asn Pro Ser Lys 20 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23

Met Trp Thr Leu Lys Ser Ser Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Thr 15 10 15 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24

Cys Ser Tyr Ala Phe Met Phe Ser Ser Leu Arg Gin Lys Thr Ser 15 10 15 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens

PL 207 591 B1 <400» 25

Glu Pro Gin Gly Lys Val Pro Cys Gly Glu His Phe Arg He Arg 15 10 15 <210» 26 <211» 15 <212> PRT <213» Homo sapiens <400» 26

Gin Asn Leu Pro Glu His Thr Gin Gly Trp Leu Gly Ser Lys Trp 15 10 15 <210» 27 <211» 15 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 27

Leu Trp Leu Leu Phe Ala Val Val Pro Phe Val Ile Leu Lys Cys 15 10 15 <210» 28 <211» 15 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 28

Gin Arg Asp Ser Glu Lys Asn Lys Val Arg Met Ala Pro Phe Phe 15 10 15 <210» 29 <211» 16 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 29

Leu His His Ile Asp Ser Ile Ser Gly Val Ser Gly Lys Arg Met Phe 15 10 15 <210» 30 <211» 15 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 30

Glu Ala Tyr Tyr Thr Met Leu His Leu Pro Thr Thr Asn Arg Pro 15 10 15

PL 207 591 B1 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31

Lys Ile Ala His Cys Ile Leu Phe Asn Gin Pro His Ser Pro Arg 15 10 15 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32

Ser Asn Ser His Ser His Pro Asn Pro Leu Lys Leu His Arg Arg 15 10 15 <210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33

Ser His Ser His Asn Arg Pro Arg Ala Tyr Ile Leu Ile Thr Ile 15 10 15 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34

Leu Pro Ser Lys Leu Lys Leu Arg Thr His Ser Gin Ser His His 15 10 15 <210> 35 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35

Asn Pro Leu Ser Arg Thr Ser Asn Ser Thr Pro Thr Asn Ser Phe Leu 15 10 15

Met Thr Ser Ser Lys Pro Arg 20

PL 207 591 B1 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36

Ser Ser Ser Leu Gly Leu Pro Lys Cys Trp Asp Tyr Arg His Glu 15 10 15 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37

Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Ile Asn Phe Arg Val Met Ala Cys 15 10 15 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38

Thr Phe Lys Gin His Ile Glu Leu Arg Gin Lys Ile Ser Ile Val 15 10 15 <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39

Pro Arg Lys Leu Cys Cys Met Gly Pro Val Cys Pro Val Lys Ile 15 10 15 <210> 40 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40

Ala Leu Leu Thr Ile Asn Gly His Cys Thr Trp Leu Pro Ala Ser 15 10 15 <210> 41 <211> 15 <212> PRT

PL 207 591 B1 <213> Homo sapiens <400> 41

Met Phe Val Phe Cys Leu Ile Leu Asn Arg Glu Lys Ile Lys Gly 15 10 15 <210> 42 <211» 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42

Gly Asn Ser Ser Phe Phe Leu Leu Ser Phe Phe Phe Ser Phe Gin 15 10 15 <210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43

Asn Cys Cys Gin Cys Phe Gin Cys Arg Thr Thr Glu Gly Tyr Ala 15 10 15 <210> 44 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44

Vał Glu Cys Phe Tyr Cys Leu Val Asp Lys Ala Ala Phe Glu Cys Trp 15 10 15

Trp Phe Tyr Ser Phe Asp Thr 20 <210> 45 <211» 15 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 45

Met Glu Pro His Thr Val Ala Gin Ala Gly Val Pro Gin His Asp 15 10 15 <210> 46 <211» 15 <212» PRT <213> Homo sapiens

PL 207 591 B1 <400> 46

Leu Gly Ser Leu Gin Ser Leu Leu Pro Arg Phe Lys Arg Phe Ser 15 10 15 <210> 47 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47

Cys Leu Ile Leu Pro Lys Ile Trp Asp Tyr Arg Asn Met Asn Thr 15 10 15 <210> 48 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48

Ala Leu Ile Lys Arg Asn Arg Tyr Thr Pro Glu Thr Gly Arg Lys Ser 1 S 10 15 <210> 49 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49

Glu Thr Glu Ser His

Claims

1. Peptyd NTP o sekwencji aminokwasowej wybranej z grupy obejmującej:

SEQ ID NO. 9 (Met-Met-Val-Cys-Trp-Asn-Arg-Phe-Gly-Lys-Trp-Val-Tyr-Phe-Ile);

SEQ ID NO. 10 (Ser-Ala-Ile-Phe-Asn-Phe-Gly-Pro-Arg-Tyr-Leu-Tyr-His-Gly-Val);

SEQ ID NO. 11 (Pro-Phe-Tyr-Phe-Leu-Ile-Leu-Val-Arg-Ile-Ile-Ser-Phe-Leu-Ile);

SEQ ID NO. 12 (Gly-Asp-Met-Glu-Asp-Val-Leu-Leu-Asn-Cys-Thr-Leu-Leu-Lys-Arg);

SEQ ID NO. 13 (Ser-Ser-Arg-Phe-Arg-Phe-Trp-Gly-Ala-Leu-Val-Cys-Ser-Met-Asp);

SEQ ID NO. 14 (Ser-Cys-Arg-Phe-Ser-Arg-Val-Ala-Val-Thr-Tyr-Arg-Phe-Ile-Thr); oraz SEQ ID NO. 15 (Leu-Leu-Asn-Ile-Pro-Ser-Pro-Ala-Val-Trp-Met-Ala-Arg-Asn-Thr).

2. Peptyd NTP określony w zastrz. 1 do stosowania jako lek.

3. Środek zawierający substancję czynną oraz nośnik, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera peptyd określony w zastrz. 1.

PL 207 591 B1

Rysunki

Fig. 1

NTP[122] [SEQIDNO. 1]

I Met-Met-Val-Cys-Trp-Asn-Arg-Phe-Gly-LysMMVCWNRFGK

II Trp-Va 1 - Tyr- Phe-I1e-Ser-Ala-Ile- Phe - AsnWVYFISAIFN

21 Phe-Gly-Pro-Arg-Tyr-Łeu-Tyr-His-Gly-ValFGPRYLYHGV

31 Pro-Phe-Tyr-Phe-Leu-Ile-Leu-Val-Arg-IlePFYFLILVRI

41 Ile-Ser-Phe-Leu-Ile-Gly-Asp-Met-Glu-AspISFLIGDMED

51 Val-Leu~Leu-Asn-Cys-Thr-Leu-Leu-Lys-ArgVLLNCTLLKR

61 Ser-Ser-Arg-Phe-Arg-Phe-Trp-Gly-Ala-LeuS SRFRFWGAL

71 Val-Cys-Ser-Met-Asp-Ser-Cys-Arg-Phe-Ser VCSMDSCRFS

81 Arg-Val-Ala-Val-Thr-Tyr-Arg-Phe-Ile-ThrRVAVTYRFI T

91 Leu-Leu-Asn-Ile-Pro-Ser-Pro-Ala-Val-Trp· LLNIPSPAVW

101 Met-Ala-Arg-Asn-Thr-Ile-Asp-Gln-Gln-Val· MARNTIDQQV

111 Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Arg LSRIKLEIKR

121 Cys-Leu C L

PL 207 591 B1

Fig. 2

NTP[112] [SEQIDNO. 2]

I Met-Ala-Gln-Ser-Arg-Leu-Thr-Ala-The-Ser

MAQSRLTATS

II Ala- Ser-Arg-Val -Gin-Ala-Ile-Leu-Leu-Ser

ASRVQAILLS

21 Gln-Pro-Pro-Lys-Gln-Leu-Gly-Leu-Arg-Ala Q PPKQLGLRA

31 Pro-Ala~Asn-Thr-Pro-Leu-Ile-Phe-Val-Phe PANTPLIFVF

41 Ser-Leu-Glu-Ala-Gly-Phe-His-His-Ile-Cys S LEAGFHHIC

51 Gln-Ala-Gly-Leu-Łys-Leu-Leu-Thr-Ser-Gly QAGLKLLTSG

61 Asp-Pro-Pro-Ala-Ser-Ala-Phe-Gln-Ser-Ala dppasafqsa

71 Gly-Ile-Thr-Gly-Val-Ser-His-Leu-Thr-Gln G I TGVSH LTQ

81 Pro-Ala-Asn-Leu-Asp-Lys-Lys-Ile-Cys-Ser PANLDKKICS

91 Asn-Gly-Gly-Ser-Cys-Tyr-Val-Ala-Gln-Ala nggscy vaqa

101 Gly-Leu-Lys-Leu-Leu-Ala-Ser-Cys-Asn-Pro glkll ascnp

III Ser-Lys

S K

PL 207 591 B1

Fig. 3

NTP[106] [SEQIDNO. 3]

I Met-Trp-Thr-Leu-Lys-Ser“Ser-Leu-Val-LeuMWTLKSSLVL

II Leu-Leu-Cys-Leu-Thr-Cys-Ser-Tyr-Ala-PheLLCLTCSYAF

21 Met-Phe-Ser-Ser-Leu-Arg-Gln-Lys-Thr-Ser· MFSSLRQKTS

31 Glu-Pro-Gln-Gly-Lys-Yal-Pro-Cys-Gly-Glu E PQGKVPCGE

41 His-Phe-Arg-Ile-Arg-Gln-Asn-Leu-Pro-Glu HFRIRQNLPE

51 His-Thr-Gln-Gly-Trp-Leu-Gly-Ser-Lys-Trp HTQGWLGSKW

61 Leu-Trp-Leu-Leu-Phe-Ala-Val-Val-Pro-Phe LWLLFAVVPF

71 Val-Ile-Leu-Lys-Cys-Gln-Arg-Asp-Ser-*Glu VILKCQRDSE

81 LyS“Asn-Lys-Val-Arg-Met-Ala-Pro-Phe-Phe K N K V R M A P F F

91 Leu-His-His-Ile“Asp-Ser-Ile-Ser-Gly-Val LHHIDSISGV

101 Ser-Gly-Lys-Arg-Met-Phe S G K R M F

PL 207 591 B1

Fig. 4

NTP[98] [SEQEDNO. 4]

I Glu-Ala-Tyr-Tyr-Thr-Met-Leu-His-Leu-ProEAYYTMLHLP

II Thr-Thr-Asn-Arg-Pro-Lys-Ile-Ala-His-Cys

TTNRPKIAHC

21 Ile-Leu-Phe-Asn-Gln-Pro-His-Ser-Pro-ArgILFNQPHSPR

31 S er-Asn- S er-Hi s - S er- Hi s - Pro -Asn-Pro-Leu·

SNSHSHPNPL

41 Lys-Leu-His-Arg-Arg-Ser-His-Ser-His-AsńKLHRRSHSHN

51 Arg-Pro-Arg-Ala-Tyr-Ile-Leu-Ile-Thr-Ile· RPRAYILITI

61 Leu-Pro-Ser-Lys-Leu-Lys-Leu-Arg-Thr-HisLPSKLKLRTH

71 Ser-Gln-Ser-His-His-Asn-Pro-Leu-Ser-Arg· SQSHHNPLSR

81 Thr-Ser-Asn-Ser-Thr-Pro-Thr-Asn-Ser-Phe TSNSTPTNSF

91 Leu-Met-Thr-Ser-Ser-Lys-Pro-Arg LMTSSKPR

PL 207 591 B1

Fig. 5

NTP[75] [SEQDDNO. 5]

I Ser-Ser-Ser-Leu-Gly-Leu-Pro-Lys-Cys-TrpS SSLGLPKCW

II Asp-Tyr-Arg-His-Glu-Leu-Leu-Ser-Leu-AlaDYRHELLSLA

21 Leu”Met“Ile-Asn-Phe-Arg-Val-Met-Ala-Cys LMINFRVMAC

31 Thr-Phe-Lys-Gln-His-Ile-Glu-Leu-Arg-GlnTFKQHIELRQ

41 Lys-Ile-Ser-Ile-Val-Pro-Arg-Lys~Leu-Cys· KISIVPRKLC

51 Cyś-Met-Gly-Pro-Val-Cys-Pro-Val-Lys-Ile' C MG P VC P V K I

61 Ala-Leu-Leu-Thr-Ile-Asn-Gly-His-Cys-Thr ALLTINGHCT

71 Trp-Leu-Pro-Ala-Ser W L P A S

PL 207 591 B1

Fig. 6

NTP[68] [SEQIDNO. 6]

I Met-Phe-yał-Phe-Cys-Leu-Ile-Leu-Asn-Arg·

MFVFCLILNR

II Glu-Lys-Ile-Lys-Gly-Gly-Asn-Ser-Ser-PheEKIKGGNSSF

21 Phe-Leu-Leu-Ser-Phe-Phe-Phe-Ser-Phe-Gln· FLLS FFFSFQ

31 Asn-Cys-Cys-Gln-Cys-Phe-Gln-Cys-Arg-Thr NCCQCFQCRT

41 Thr-Glu-Gly-Tyr-Ala-Val-Glu-Cys-Phe-Tyr TEGYAVE CFY

51 Cys-Leu-Val-Asp-Lys-Ala-Ala~Phe-Glu-Cys CLVDKAAFEC

61 Trp-Trp-Phe-Tyr-Ser-Phe-Asp-Thr WWFYSFDT

PL 207 591 B1

Fig. 7

NTP[61] [SEQIDNO. 7] 1 Met-Glu-Pro-His-Thr-Val-Ala-Gln-Ala-Gly- Μ E P Η Τ V A Q A G 11 Val-ProV P -Gln-His- Asp-LeuQ H D L -Gly—Ser—Leu—Gin— G S L Q 21 Ser-LeuS L -Leu-Pro-Arg-PheL P R F - Lys-Arg-Phe-SerK R F S 31 Cys-Leu C L -Ile-Leu-Pro-LysI L P K -Ile-Trp-Asp-TyrI W D Y 41 Arg-AsnR N -Met-Asn-Thr-AlaM N T A -Leu-Ile-Lys-ArgL I K R 51 Asn-ArgN R -Tyr-Thr-Pro-GluY Τ P E -Thr-Gly-Arg-LysT G R K 61 Ser S

Departament Wydawnictw UP RP