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KR20000075748A - 알츠하이머 병의 치료 또는 예방에 유효한 약물을 선별하기 위한 유전자 변형동물 및 세포계 - Google Patents

알츠하이머 병의 치료 또는 예방에 유효한 약물을 선별하기 위한 유전자 변형동물 및 세포계 Download PDF

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KR20000075748A
KR20000075748A KR1019997007818A KR19997007818A KR20000075748A KR 20000075748 A KR20000075748 A KR 20000075748A KR 1019997007818 A KR1019997007818 A KR 1019997007818A KR 19997007818 A KR19997007818 A KR 19997007818A KR 20000075748 A KR20000075748 A KR 20000075748A
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ad7c
seq
dna
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KR1019997007818A
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델라몬테수잔
원즈잭알
Original Assignee
마빈 씨. 구트리
더 제너럴 호스피탈 코포레이션
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Publication date
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Abstract

본 발명은 알츠하이머 병, 신경외배엽의 종양, 악성 성상세포종 및 신경교아세포종과 관계된 단백질을 발현하는, 유전자 변형동물 및 형질 감염된 세포계를 개시하고 있다. 또한, 본 발명은 알츠하이머 병, 신경외배엽의 종양, 악성 성상세포종 및 신경교아세포종을 치료 또는 예방하는 데 사용될 가능성이 있는 약물 후보를 선별하기 위해 이들 유전자 변형동물 및 형질 감염된 세포계를 사용하는 것을 개시하고 있다. 또한, 본 발명은 알츠하이머 병, 신경외배엽의 종양, 악성 성상세포종 및 신경교아세포종을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 3중 형성 DNA 및 외부 가이드 서열에 관한 것이다.

Description

알츠하이머 병의 치료 또는 예방에 유효한 약물을 선별하기 위한 유전자 변형동물 및 세포계{TRANSGENIC ANIMALS AND CELL LINES FOR SCREENING DRUGS EFFECTIVE FOR THE TREATMENT OR PREVENTION OF ALZHEIMER'S DISEASE}
알츠하이머 병(AD)[Khachaturian,Z.s.,"Diagnosis of Alzheimer's Disease," Arch. Neurol. 421:1097-1105 (1985)]은 가장 흔한 신경퇴행성 질환이고, 서부 반구에서 치매(dementia)의 가장 보편적인 원인이다. AD 신경퇴행은 뇌에서의 뉴론 손실, 신경원섬유의 엉킴 형성, 신경돌기의 이상 증식, 노인성 플라크(senile plaque) 및 βA4-아밀로이드 침착과 함께 피질변연계(corticolimbic) 구조의 현저한 위축을 특징으로 한다(Khachaturian, Z.S.). AD의 약 90%는 산발성으로 일어난다. 그 원인은 알려지지 않았으나, 가장 중요한 포괄적인 위험 인자는 노화이다[Takman, A., "Epidemiology of Alzheimer's Disease. Issues of Etiology and Validity."Acta Neurol. Scand. Suppl. 145:1-70 (1993)]. ε4 유전자형[Corder, E.H. et al., "Gene Does of Apolipoproein E Type 4 Allele and the Risk of Alzheimer's Disease in Late Onset Families, Science 261:921-923 (1993)] 및 트리소미 21 다운 신드롬(Trisomy 21 Down syndrome)의 가족력[Lai, F. and Williams, R.S.,"A Prospective Study of Alzheimer Disease in Down Syndrome," Arch. Neurol. 46:849-853 (1989)]은 산발성 AD의 위험을 증가시키거나 또는 그 진행을 가속화한다. 그 환자의 5 내지 10%에 해당하는 가족형 AD는 21번 염색체[Robakis, N.K. et al., Chromosome 21q21 Sublocalization of Gene Encoding Beta-Amyloid Peptide in Cerebral Vessels and Neuritic (Senile) Plaques of People with Alzheimer Disease and Down Syndrome," Lancet 1:384-385 (1987)]에 위치하는 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 유전자[Kennedy, A.M. et al., "Familial Alzheimer's Disease. A Pedigree With a Mis-Sense Mutation in the Amyloid Precursor Protein Gene (Amyloid Precursor Protein 717 Valine--〉 Gylcine,"Brain 309-324 (1993); Peacock, M.L. et al., "Novel Amyloid Precursor Protein Gene Mutation (Codon 665 Asp) in a Patient with Late-Onset Alzheimer's Disease," Ann. Neurol. 35:432-438 (1994); Tanzi, R.E et al., "Assessment of Amyloid Beta-Protein Precursor Gene Mutations in a Large Set of Familial and Spradic Alzheimer's Disease Cases, "Am. J. Hum. Genet. 51:273-282 (1992)] 또는 1번과 14번 염색체 [Levy-Lahad, E. et al., "Candidate Gene for thd Chromosome 1 familial Alzheimer's disease Locus, "Sxience 18:973-977 (1995); Sorbi, S. et al., Missense Mutation of S182 Gene in Italian Families With Early Onset Alzheimer's Disease," Lancet 346:439-440 (1995); Sherrington, R. et al., "Cloning of a Gene Bearing Missense Mutations in Early-Onset Familial Alzheimer's Disease, Nature 375:754-760 (1995); Rogaev, E.I, et al., "Familial Alzheimer's Disease in Kindreds With Missense Mutations in a Gene on Chromosome 1 Related to Akzheimer's Disease Type 3 Gene," Nature 376:775-778 (1995); Barinaga, M. et al., "Candidate Gene for the Chromosome 1 familial Alzheimer's Disease Locus," Science 269:973-977 (1995)]에 존재하는 조로(presenilin) 유전자의 돌연변이와 관계가 있다. APP의 과다 발현 및 비정상적인 분열(cleaving)은 AD 신경퇴행성을 촉진할 수 있다. 왜냐하면, 트리소미 21 다운 증후군을 가지고 40년이상 생존하는 개체는 βA4-아밀로이드의 광범위한 중추 신경계(CNS) 축적을 가진 AD를 발병하고[Lai, F. and Williams, R.S., "A Prospective Study of Alzheimer Disease in Down Syndrome," Arch. Neurol. 46:849-853 (1989)], 실험적으로 βA4-아밀로이드는 신경독성을 나타내고 아포토제닉(apotogenic)하다[LaFeral, F.M. et al., "The Alzheimer's A Beta Peptide Induces Neurodegeneration and Apoptotic Cell Death in Transgenic Mice," Nat. Genet. 9:21-30 (1995)]. 또한, 자연발생적인 제1형 조로의 미스센스 돌연변이는 맥관병, 및 뇌내에서 펩티드의 광범위한 축적을 유발한다[Lemere, C.A. et al., "The E280A Presenilin 1 Alzheimer Muatation Produces Increased Aβ42 Deposition and Severe Cerebellar Pathology," Nature Med. 2:1146-1150 (1996); Mann. D.m. et al., "Amyloid Beta Protein (Abeta) Deposition in Chromosome 14-Linked Alzheimer's Disease: Predominance of Abeta42(43),"Ann Neurol. 40:149-156 (1996)].
AD에서 확인된 중추 신경계의 생화학적 및 분자적 이상은 다음을 포함한다: (1) 뉴론에서 tau 및 다른 세포골격 단백질의 인산화 증가[Grundke-Iqbal, I. et al., "Abnormal Phosphorylation of the Microtubule-Associated Protein τ(tau) in Alzheimer Cytoskeletal Pathology," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:4913-4917 (1986)]; (2) 성장에 관계된 단백질, GAP-43[de la Monte, S.M. et al., "Aberrant GAP-43 Gene Expression in Alzheimer's disease," Am. J. Pathol. 147:934-946 (1995)], 구성 내피의 산화 질소 신타아제[de la Monte, S.M. and Bloch, K.D. "Aberrant Expression of the Constitutive Endothelial Nitric Oxide Synthase Gene in Alzheimer's disease," Molecular and Chemical Neuropathy 29: (in press)], 형질 전환 성장 인자 β[Peress, N.S and Perillo, E., "Differential Expression of TGF-β1, 2, and 3 Isotypes in Alzheimer's Disease: a comparative Immunohistochemical Study With Cerebral Infarction, Aged Human and Mouse Control Brains, "J. Neuropathol. Exp. Neurol. 54:802-811 (1995)], 및 메탈로티오닌-3[Aschner, M."The Functional signigicance of Brain Metallothioneins, "Faseb. J.10:1129-1136 (1996)]; (3) 신경교 원섬유의 산성 단백질[Goodison, K.L. et al., "Neuronal and Glial Gene Expression in Neocortex of Down's Syndrome," J. Neuropathol. Exp. Neurol. 52:192-198 (1993)] 및 알파-1 항키모트립신[Pasternack, J.M. et al., "Astrocytes in Alzheimer's Disease Gray Matter Express Alpha 1-Antichymotrypsin mRNA, "Am. J. Path. 135:827-834 (1989)]과 같은 신경교 세포 활성화에 관계된 유전자 발현의 증가; 및 (4) 당단백질-2의 황산염[May, P.C. et al., "Dynamics of Gene Expression for a Hippocampal Glycoprotein Elevated in Alzheimer's Disease and in Response to Experimental Lesions in Rat," Neuron 5:831-839 (1990)], 카텝신 D[Cataldo, A.M. et al., "Gene Expression and Cellular Content of Cathepsin D in Alzheimer's Disease Brain: Evidence for Early Up-Regulation of the Endosomal-Lysosomal System," Neuron 14:671-680 (1995)], 수퍼옥사이드 디뮤타아제 1[Somerville, M.J. et al., "Localization and Quantitation of 68 kDA Neurofilament and Superoxide Dimutase-1 mRNA in Alzheimer Brains, Brain Res. Mol. Brain Res. 9:1-8 (1991)], 미토콘드리아 시토크롬 산화효소[Chandrasekaran, K. et al., "Impairment in Mitochondrial Cytochrome Oxidase Gene Expression In Alzheimer Disease," Brain Res. Mol. Brain. Res. 24:336-340 (1994)], 보체의 C1q 성분[Fischer, B. et al., "Complement C1q and C3 mRNA Expression in the Frontal Cortex of Alzheimer's Patient," J. Mol. Med. 73:465-471 (1995)], 칼빈딘 D28k[Yamagishi, M. et al., "Ontogenetic Expression of Spot 35 Protein(Calbindin-D28k) in Human Olfactory Receptor Neurons and its Decrease in Alzheimer's Disease Patients," Ann. Ontol. Rhinol. Laryngol. 105:132-139(1996)], 및 bcl-2[O'Barr, S. et al., "Expression of the Protooncogene bcl-2 in Alzheimer's Disease Brain," Neurobiol. Aging 17:131-136 (1996)]를 포함하여, 세포 독성 또는 예정된 세포 괴사(programmed cell death)로부터 뉴론을 보호하는 유전자 발현의 변화.
이전의 연구에서, 본 발명자들은 췌장 단백질에 대해 제조된 폴리클로날 항혈청을 사용하여 AD 뇌에서 면역반응성이 증가된다는 것을 입증하였다[Ozturk, M. et al., " Elevated Levels of an Exocrine Pancreatic Secretary Protein in Alzheimer's Disease Brain," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.86:419-423 (1989)]; de la Monte, S.M. et al., " Enhanced Expression of an Exocrine pancreatic Protein in Alzheimer's Disease and thd developing Human Brain," J. Clin. Invest. 86:1004-1013 (1990); WO90/06993]. 이런 폴리클로날 항체를 사용하여, 우리는 AD 뇌 발현 라이브러리로부터 AD7c-NTP cDNA를 분리하였다(WO94/23756). WO94/23756에서, 이 클론은 또한 AD10-7로 언급되는데, 이는 수탁 번호 제 69262호로 ATCC에 DH1 세포내에 기탁되었다. 이 cDNA의 뉴클레오티드 서열은 WO94/23756의 도 16R에 도시되어 있다. 그러나, 이 서열은 다수의 오류를 포함하고 있다. 또한, WO96/15272(서열 번호 120, 168-170쪽)을 참조할 수 있으나, 이것 또한 다수의 오류를 포함하고 있다. 결과로서, 예상 아미노산 서열(서열 번호 121; WO96/15272)은 또한 잘못된 것이다.
연방 정부의 지원을 받은 연구 및 개발하에서 이루어진 발명의 권리에 대한 선언
본 발명은 미국 국립 보건원에 의해 부여된 허가 번호 CA-35711, AA-00026 및 AA-002169 하에서 미국 정부의 지원을 받아 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 있어서 특정한 권리를 가진다.
본 발명은 유전 공학 및 분자 생물학 분야에 속한다. 특히, 본 발명은 알츠하이머 병, 신경외배엽의 종양, 악성 성상세포종 및 신경교아세포종에 관계된 단백질을 발현하는 유전자 변형동물(transgenic animal) 및 형질 감염된 세포계에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이런 유전자 변형동물과 형질 감염된 세포계를 사용하여 알츠하이머 병을 치료 또는 예방하는 데 사용될 가능성이 있는 약물 후보를 선별하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 알츠하이머 병을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있는 신규의 안티센스(antisense) 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 트리플렉스를 형성하는 DNA 및 외부 가이드 서열에 관한 것이다.
도1은 AD7c-NTP cDNA의 뉴클레오티드 및 번역된 아미노산 서열(서열 번호 1과 2)을 도시한 것이다. 어두운 부위는 mRNA의 RT-PCR 분석에 의해 6개의 AD 뇌에서 검출된 핵산 서열에 상응한다. cDNA는 Alu 유전자와 현저한 상동성을 나타내고, 헌팅톤 부위, 염색체 4q16.3(밑줄친 부분)에서 알려지지 않은 유전자를 나타낸다. 개방된 리딩(leading) 프레임은 최초의 메티오닌 코돈에서 개시된다. 번역된 아미노산 서열은 소수성 선도 서열(이탤릭)을 함유한 41.3 kD 단백질을 암호화한 후, 미리스토일화 모티브(굵은 이탤릭)와 가능성 있는 AI 분열 위치가 그 뒤를 따른다. 동일한 부위(밑줄친 이탤릭)는 인슐린/IGF-1 키메라 수용체와 현저한 상동성을 나타낸다. 17개의 가능성 있는 글루카곤 신타아제 키나아제-3, 프로테인 키나아제 C, 또는 cAMP 또는 Ca-의존성 키나아제 Ⅱ 인산화 모티브 및 하나의 형질 전환 성장 인자(tgf) 모티브(이중 밑줄)가 있다. 수록된 아미노산 서열은 NF2, 인테그린의 β서브유니트, 및 사람의 사망을 촉진하는 인자 2 전구체의 A4 대안적으로 스플라이싱된 돌연변이형과 상당한 동일성을 나타낸다. 박스내 아미노산 서열은 사람의 중요한 막 단백질 및 마이엘린(myelin) 올리고당단백질-16과 현저한 동일성을 나타낸다.
도2A-2D는 시험관내 및 생체내의 AD7c-NTP 발현을 나타낸다. (2A): 센스 가닥 cRNA 전사를 사용하여 시험관내 전사에 의해 검출된 재조합 단백질. (2B): 비관련성 FB50 모노클로날 항체를 제외한, Tag 및 N3I4 AD7c-NTP 모노클로날 항체와의 특이 면역반응성을 입증하는 정제된 재조합 단백질의 웨스턴 블롯 분석. (2C): pcDNA3-AD7c-NTP 또는 pcDNA3(비어있는 벡터)로 안정하게 형질 감염된 BOSC 세포의 웨스턴 블롯 분석. (2D): 노화에 관계된 대조 전두엽 조직에 비해 AD 전두엽 중 41-45 kD AD7c-NTP 단백질 레벨의 현저한 상승. (2E): 초기의 더 적은 증후성 (E) AD에 비해 나중의 말기(L) AD내 41-45 kD 및 19-21 kD AD7c-NTP 단백질 레벨의 상승, 모든 조직 샘플을 전두엽에서 제거했다. 다른 인산화 정도에 상응할 가능성이 있는 ∼41 내지 ∼45 kD의 3 또는 4개의 밴드의 집단을 주시해야 한다. (2F): N314 항체를 사용하여, 노화 대조군 샘플에 비해 AD에서 ∼41 kD AD7c-NTP 분자의 높은 레벨을 입증하는 사후의 뇌실 유액의 웨스턴 블롯 분석. ∼38-30 kD 밴드는 생성물의 분해를 나타낼 수 있다. 또한, AD중 ∼19-21 kD N314-면역반응성 분자의 검출을 주시해야 한다.
도3A-3F는 AD 및 노화 대조군 뇌중의 AD7c-NTP mRNA 발현을 도시하고 있다. AD 및 노화 대조군 전두엽 RNA의 노던 블롯 분석 결과, AD＆c-NTP cDNA의 크기에 상응하는 ∼1.4 kB 전사가 검출되었다. 게다가, 다른 cDNA에 상응하는 ∼0.9 kB 전사는 다른 조직을 제외한 모든 뇌에서 검출되었다. 오토라디오그램의 덴시토메트리 분석 결과, AD 군에서 다양한 레벨의 AD7c-NTP mRNA가 발현되었으나(도3A), 1.4 kB AD7c-NTP 전사의 평균 레벨은 노화 대조군(N=11)(P〈0.01)에 비해 AD(N=17)에서 현저히 높았다. (도3C 및 도3D): 안티센스(3C) 또는 센스(3D; 음성 대조군) 디곡시게닌-표지된 cDNA 탐침을 사용하여 정위치 혼성화한 결과의 현미경사진에서 밝은 부분. 화살표는 뉴론의 예를 나타내고, 어두운 조직은 양성 혼성화 시그날을 나타낸다. (도3E 및 도3F): 노화 대조군(3F)의 전두엽내 피질 뉴론(화살표)에 비해 AD(3E)내에서 더 강하게 표지된다는 것(백색 조직)을 입증하는 정위치 혼성화 결과의 현미경사진에서 어두운 부분.
도4A-도4H는 N2T8와의 면역조직화학 염색에 의해, 노화 대조군(4B) 피질 뉴론에 비해 AD(4A)내 AD7c-NTP의 면역반응성이 증가되었다는 것을 도시한다(4A 및 4B). AD 뇌의 N2J1 면역반응성(도4C, 4E-4H)은 세포학적으로 완전한 뉴론 핵주위부(4E) 및 퇴행성 뉴론(4F)에서 높은 레벨의 AD7c-NTP를 발현 및 축적한다는 것을 입증한다. 또한, N2J1 항체는 백질(4G)내에 분산되고 불규칙한 구슬 모양의 축삭(4H)에 상응하는, 집합물(돌기)에서 생성되는 비정상적인 이영양성 신경 돌기와 면역반응하였다. 도4D는 비관련성 항체로 면역염색된 AD 대뇌 피질을 도시하고 있다. 도4A 및 4B에 도시된 부분은 대조 백그라운드를 제공하는 헤마톡실린에 의해 역으로 염색되었다.
도5A 및 도5B는 pcDNA3-AD7c-NTP로 형질 감염된 SH-Sy5y 세포중 세포 괴사의 증가를 나타내는 그래프를 도시한다. 동조화된 세포에게 15% 태아 소의 혈청을 함유하는 배지를 공급하고, DNA내로3H-티미딘을 혼입시켜 DNA 합성을 평가했다(5A). 생존가능한 세포의 농도는 각각의 시간에서 측정되었다(5A). 높은 레벨의 DNA 합성에도 불구하고, 세포의 농도는 대조 (pcDNA3-형질 감염된) 세포에 비해 4개의 복제 AD7c-NTP에 의해 형질 감염된 배양물내에서 현저히 감소되었다. 또한, AD7c-NTP-형질 감염된 세포는 눈금을 새긴 DNA(TUNEL)에 대한 정위치 분석에 의해 핵의 p53 면역반응성의 증가와 핵의 DNA 분획의 증가를 나타내었는데, 이는 뉴론 세포내 AD7c-NTP의 과다 발현이 세포 소멸을 야기한다는 것을 암시한다.
도6A-6G는 형질 감염된 뉴론 세포내 AD7c-NTP의 과다 발현이 신경염의 발생을 증가시킨다는 것을 도시한다. (6A): pc-DNA3(비어있는 벡터)로 안정하게 형질 감염된 SH-Sy5y 세포. (6B-6D): pcDNA3-AD7c-NTP로 안정하게 형질 감염된 SH-Sy5y 세포. 도6B-6D에 있는 대부분의 세포상의 미세한 신경염의 돌기(화살표)를 주목하여야 한다. 또한, 도6A에 비해 도6D에서 낮은 세포 밀도 및 다수의 둥근 굴절된(refractile) 죽은 세포(화살표의 위부분)에 주목하여야 한다. (도6E-6G): pcDNA3(6E) 또는 pcDNA3-AD7c-NTP(6F, 6G)로 안정하게 형질 감염된 SH-Sy5y 세포의 N3I4 모노클로날 항체를 사용한 면역세포화학적 염색. 6F에 있는 핵주위부 및 세포 돌기(화살표)의 강한 표지, 및 6E에서 표지의 부재에 주목하여야 한다.
도7A-7C는 AD7c-NTP 발현의 IPTG 유도에 따른 유전자 발현의 조절을 도시하고 있다. AD7c-NTP가 결핍된 LacA-대조 세포(도7A); LacB-B6 세포(도7B) 및 LacF-B6 세포(도7C)는 다른 레벨의 AD7c-NTP 유도를 지닌 2개의 다른 클론이다, 유도 후 24시간이 경과되었을 때, 발현 레벨의 변화를 AD에 관계된 유전자, 신경 돌기 및 세포 소멸에 대해 나타낸다.
도8A-8D는 NTP(도A), Tau(도B), 시냅토피신(도C) 및 p53(도D) 단백질 레벨이 IPTG 용량에 따라 증가된다는 것을 도시하고 있다. 각 단백질의 양의 변화 백분율을 IPTG 농도(mM)의 함수로서 나타낸다.
도9A 및 9B는 대사(MTT) 활성 및 세포 생존력에 대한 CYZ 뉴론 세포내 AD7c-NTP 발현의 효과를 도시하고 있다. LacA-LacF는 6개의 다른 클론을 나타내고, B6은 AD7c-NTP 발현을 나타낸다. MTT 활성(도9A) 및 세포 생존력(도9B)의 변화 백분율을 대조군(LacA-대조군) 및 AD7c-NTP를 발현하는 세포계에 대해 나타낸다.
도10A 및 도10는 세포 생존력에 대한 AD7c-NTP 발현의 효과를 도시하고 있다. 비발현성 LacA 대조군 및 다양한 레벨의 AD7c-NTP, LacB-B6 및 LacF-F6를 발현하는 세포계는, 단백질 유도제(IPTG) 및 다양한 산화적 스트레스 독소에 대한 노출시간을 변화시킨 후 생존력에 대해 분석되었다.
도11은 AD7c-NTP 발현의 IPTG 유도 후 DNA 단편을 도시함으로써 세포 소멸을 정량적으로 평가할 수 있다. 유도 후 다양한 네벨의 AD7c-NTP를 발현하고, 안정하게 형직 감염된 CYZ 뉴론 세포계, LacA, LacB, 및 LacF는32dCTP 표지의 존재하에 배양되었다. 대조군(미유도된) 및 IPTG 유도 조건하에 각각의 세포계 DNA로 혼입된 방사성 동위원소의 양이 제시되어 있다.
도12는 산화적 스트레스를 증가시키고 감소시키거나 차단시키는 조건하에서 AD7c-NTP로 안정하게 형질 감염되어 이를 발현하는 세포에 의한 생존력의 변화 백분율을 도시하고 있다. 산화적 스트레스를 증가시키는 약제로 과산화수소(H2O2) 및 디에틸디티오카르바민산(DDC), S-니트로-N-아세틸-페니실라민(SNAP) 및 N-아세틸 시스테인을 들 수 있고, 산화적 스트레스를 차단하거나 또는 감소시키기 위해 사용하는 약제는 피로글루타메이트(PG)이다.
발명의 개요
본 발명은 AD7c-NTP를 과다하게 발현하는 유전자 변형동물과 세포계, 및 알츠하이머 병, 신경외배엽의 종양, 악성 성상세포종 및 신경교아세포종을 치료 또는 예방하는 데 사용되는 후보 약물을 선별하기 위해 이들을 사용하는 것에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 DNA 구조체에 관한 것으로서, 상기 DNA 구조체는 서열 번호 1 또는 그와 40% 이상 상동성을 갖는 DNA 서열을 함유하는 DNA 분자, 또는 이들의 단편을 포함한다. DNA 분자가 이종의(heterologous), 신경 특이성 프로모터의 조절하에 있는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 본 발명의 DNA 구조체를 함유하는 세포계에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNA 구조체를 포함하는, 유전자 변형동물(사람을 제외한 동물)에 관한 것이다. 유전자 변형동물이 AD7c-NTP를 과다 발현하는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 알츠하이머 병, 신경외배엽의 종양, 악성 성상세포종 및 신경교아세포종을 치료 또는 예방하는 데 사용될 가능성이 있는 후보 약물을 선별하기 위한 시험관내(in-vitro) 방법에 관한 것으로서, 다음의 단계를 포함한다:
(a) 후보 약물을 DNA 구조체로 형질 감염된 숙주에 접촉시키는 단계로서, 상기 DNA 구조체는 서열 번호 1의 DNA 분자 또는 그것과 40% 이상 상동성을 갖는 DNA 분자, 또는 이들의 단편을 포함하며, 상기 숙주는 상기 DNA 분자에 의해 암호화된 단백질을 과다 발현하는 단계, 및
(b) 후보 약물을 투여받지 않은 대조 숙주에 비해 후보 약물에 기인하는 다음 중 하나 이상을 검출하는 단계: (ⅰ) 단백질의 발현의 억제 또는 방지, (ⅱ) 단백질 분해의 증가, 또는 (ⅲ) 신경염의 발생, 신경 세포 괴사, 퇴행성 뉴론, 신경원섬유의 엉킴, 또는 숙주내 불규칙한 팽창된 신경돌기 및 축삭 중 하나 이상의 빈도의 감소.
바람직한 구체예에서, 숙주는 유전자 이식 동물이다. 다른 바람직한 구체예에서, 숙주는 시험관내 세포이다.
또한, 본 발명은 PTP 핵산 서열과 일치하지 않고 NTP 핵산 서열에 상보적이고, 과거에 부정확하게 서열화된 부위에 상응하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 이들 올리고뉴클레오티드와 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 NTP 서열에 상보적이고 PTP 핵산 서열에 일치하지 않는 표적 서열을 포함하는 리보자임, 과거에 부정확하게 서열화된 부위에 상응하는 이런 리보자임과 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 AD7c-NTP 유전자를 가진 3중 가닥 부위를 형성하는 올리고데옥시뉴클레오티드, 및 이런 올리고데옥시뉴클레오티드와 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로서, 상기 올리고데옥시뉴클레오티드는 PTP 핵산 서열과 불일치하고 과거의 부정확하게 서열화된 부위에 상응한다.
또한, 본 발명은 허용 담체 또는 발현 벡터를 통해 뇌로 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임 및 3중 나선 올리고뉴클레오티드를 약학적으로 전달시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임 및 3중 나선 올리고뉴클레오티드를 치료적으로 사용하여 알츠하이머 형의 뉴론 퇴행성 치매를 개질 또는 개선시키고; 신경외배엽의 종양, 악성 성상세포종 및 신경교아세포종을 치료 또는 예방하는 것에 관한 것이다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
정의
다음의 설명 중에서, 재조합 DNA 기법에 사용되는 수많은 용어들이 광범위하게 사용된다. 이런 용어의 범위를 포함하여, 명세서 및 청구 범위의 명확하고 일관된 이해를 위해 다음의 정의를 제공한다.
클로닝 벡터
플라스미드 또는 파지 DNA, 또는 숙주 세포중에서 자발적으로 복제할 수 있고, DNA 서열이 벡터의 필수적인 생물학적 기능의 손실없이 측정가능한 방식으로 절단될 수 있고 그것의 복제 및 클로닝을 나타내기 위해 DNA 단편이 스플라이싱(splicing)될 수 있는 소수의 제한 엔도뉴클레아제 인지 부위를 특징으로 하는 다른 DNA 서열. 클로닝 벡터는 클로닝 벡터로 형질 전환 세포의 확인에 사용하기에 적당한 마커(marker)를 추가로 함유할 수 있다. 마커는 예를 들어 테트라사이클린 내성 또는 암피실린 내성을 제공한다.
발현 벡터
클로닝 벡터와 유사하나, 숙주내로 형질 전환된 후, 그 벡터내로 클론된 유전자의 발현을 증진시킬 수 있는 벡터. 클론된 유전자는 일반적으로 프로모터 서열과 같이 특정한 대조 서열의 조절하에(즉 작동적으로 연결되어) 위치한다. 프로모터 서열은 구조적 또는 유도적일 수 있다.
거의 순수한
본원에 사용된 용어는 소정의 정제된 단백질에 세포 성분의 오염이 본질적으로 없다는 것을 의미하고, 상기 성분은 존재하는 소정의 단백질과 관련되며, 상기 정의는 폴리아크릴아미드-나트륨 도데실 설페이트 겔 전기영동에 따른 단일 밴드에 의해 확인된다. 세포 성분의 오염 물질로 단백질 화합물, 탄수화물, 또는 지질 불순물이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
"거의 순수한"이라는 용어는 또한, 당업자가 사용하는 하나 이상의 순도 또는 동종성 특징에 의해 동종의 분자를 나타내는 의미이다. 예를 들어, 거의 순수한 NTP는 다음과 같은 파라메타(예: 분자량, 크로마토그래피 이동, 아미노산 조성, 아미노산 서열, 차단된 또는 비차단된 N-말단, HPLC 용출 프로파일, 생물학적 활성 등)에 대한 실험적 표준 편차내에서 일정하고 감소될 수 있는 특징을 나타낼 것이다. 그러나, 이 용어는 다른 화합물을 가진 인자의 인공적 또는 합성 혼합물을 제외하는 의미는 아니다. 게다가, 이 용어는 재조합 숙주에서 분리된 NTP 융합 단백질을 제외하는 의미는 아니다.
재조합 숙주
본 발명에 따라, 재조합 숙주는 발현 벡터 또는 클로닝 벡터상이 있는 소정의 클론된 유전자를 함유하는 임의의 원핵 또는 진핵 숙주 세포일 수 있다. 또한, 이 용어는 그 개체의 염색체 또는 게놈 중에 소정의 유전자를 함유하도록 유전자적으로 조작된 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함하는 의미이다. 이러한 숙주의 예로서, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)]을 참조한다. 바람직한 재조합 숙주는 본 발명의 DNA 구조체에 의해 형질 전환된 뉴론 세포이다. 이러한 뉴론 세포는 동물의 뇌 또는 다른 이용가능한 뉴론 세포계의 기계적 분해 후 분리된 뇌세포를 포함한다.
재조합 벡터
소정의 클론된 유전자(들)를 함유하는 임의의 클로닝 벡터 또는 발현 벡터.
숙주 동물
생식 세포 및 체세포 모두가 본 발명의 DNA 구조체를 함유하는 유전자 변형동물. 이러한 유전자 변형동물은 일반적으로 척추동물이다. 바람직한 숙주 동물은 사람을 제외한 영장류, 마우스, 양, 돼지, 소, 염소, 기니아 피그, 설치류(예: 래트) 등과 같은 포유동물이다. 숙주 동물이라는 용어는 배아기 및 태아기를 포함하는 모든 발달 단계에 있는 동물을 또한 포함한다.
프로모터
개시 코돈에 근접한 위치에 있는, 유전자의 5′부위로서 일반적으로 나타내는 DNA 서열. 인접한 유전자(들)의 전사는 프로모터 부위에서 개시된다. 프로모터가 유도 가능한 프로모터라면, 전사율은 유도제에 대한 응답으로 증가된다. 반대로, 프로모터가 구조 프로모터인 경우, 전사율은 유도제에 의해 조절되지 않는다. 본 발명에 따르면, 바람직한 프로모터는 AD7c-NTP 유전자와 이종의, 즉 사람에서 유전자를 발현시키지 않는 프로모터이다. 이런 프로모터는 CMV 프로모터(캘리포니아주 샌 디에고에 소재하는 인비트로젠), SV40, MMTV 및 hMTIIa 프로모터(미국 특허 번호 제 5,457,034호), HSV-1 4/5 프로모터(미국 특허 번호 제 5,501,979호), 및 초기 중간체 HCMV 프로모터(WO92/17581)를 포함한다. 또한, 프로모터가 신경 특이성인 것이 바람직한데, 즉 뉴론 조직에서 선택적으로 유도되는 것이다. 또한, 신경 특이성을 증진시키는 요소를 사용할 수 있다. 신경 특이성 프로모터의 예로서 신경미세섬유 유전자를 조절하는 프로모터[WO91/02788; Byrne and Ruddle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477(1989)], 사람의 신경미세섬유 라이트 유전자(neutofilament light gene; NFL)의 뉴론 특이성 프로모터(미국 특허 번호 제 5,569,827호);뉴론의 니코틴성 아세틸콜린 수용체 β2-서브유니트의 프로모터(유럽 특허 제 0 171 105호; 미국 특허 출원 번호 제 08/358,627호), hThy-1 프로모터[WO95/03397; 미국 특허 출원 번호 제 08/096,944호; gordon, J. et al., Cell 50:445-452 (1987)], Tα1 α-튜불린 프로모터[WO95/25795; 미국 특허 출원 번호 제 08/215,083호; Gloster et al., J. Neurosci. 14:7319-7330 (1994)], APP 프로모터, 래트 신경 특이성 프로모터, 사람 β 액틴 유전자 프로모터, 사람 혈소판에서 유래된 성장 인자 B(PDGF-B) 계통의 유전자 프로모터, 래트의 나트륨 채널 유전자 프로모터, 마우스 마이엘린 염기성 단백질 유전자 프로모터, 사람의 구리-아연 수퍼옥사이드 디뮤타아제 유전자 프로모터, 포유동물 POU-도메인 조절 유전자 프로모터[WO93/14200; 미국 특허 출원 번호 제 07/817,584호 및 07/915,469호]; 사람의 혈소판에서 유래된 성장 인자 B(PDGF-B) 계통의 유전자 프로모터[WO96/40895; 미국 특허 출원 번호 제 08/486,018호 및 08/486,538호; Sasahara et al., Cell 64:217-227 (1991)]; 및 신경 특이성 에놀라아제 프로모터[McConlogue et al., Aging 15:S12 (1994); Higgins et al., Ann Neurol. 35:598-607 (1995); Mucke et al., Brain Res. 666:151-167 (1994); Higgins et al., Proc Natl. Acad. Sci USA 92:4402-4406 (1995); WO96/40896; 미국 특허 출원 번호 제 08/480,653호; 및 미국 특허 제 5,387,742호]; 및 JC 바이러스의 희돌기교세포 특이성 발현, 프로테오리피드 단백질의 신경교 특이성 발현 및 신경교 원섬유의 산성 단백질 유전자(미국 특허 번호 제 5,082,670호)를 조절하는 서열이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 신경 특이성 프로모터는 당업자에게 명백할 것이다. 단백질 인산화가 뉴론 조절에 중요하므로[Kennedy, "Second Messengers and Neuronal Function," in An Introduction to Molecular Neurobiligy, Hall, Ed., Sinauer Associates, Inc. (1992)], 프로테인 키나아제 프로모터 서열을 사용하여 충분한 레벨의 NTP 유전자를 발현시킬 수 있다.
유전자
폴리펩티드 또는 단백질을 발현시키는 데 필요한 정보를 함유하는 DNA 서열.
구조 유전자
메신저 RNA(mRNA)내로 전사되어 특정 폴리펩티드의 특징적인 아미노산 서열로 번역되는 DNA 서열.
안티센스 RNA 유전자/안티센스 RNA
진핵 세포에서, mRNA는 RNA 폴리머라이제 Ⅱ에 의해 전사된다. 그러나, RNA 폴리머라아제 Ⅱ 주형을 함유하는 유전자를 구성하는 mRNA가 또한 알려져 있는데, 여기에서 RNA가 정상적으로 번역되지 않는 것을 제외하고는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 서열을 가진 RNA 서열로 전사된다. 본원에서는 이런 유전자 구조체를 "안티센스 RNA 유전자"라고 하고, 이러한 RNA 전사는 "안티센스 RNA"라고 한다. 안티센스 RNA 서열내에 있는 번역 종결 코돈이 존재하므로, 안티센스 RNA는 정상적으로 번역되지 않는다.
안티센스 올리고뉴클레오티드
특정 mRNA의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 또는 RNA 분자 또는 그 유도체. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 특정 mRNA내의 상보적 서열에 결합하고 mRNA의 번역을 저해한다. 이런 DNA 및 RNA 분자의 다수의 유도체기 일려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제 5,602,240호, 5,596,091호, 5,506,212호, 5,521,302호, 5,541,307호, 5,510,476호, 5,514,787호, 5,543,507호, 5,512,438호, 5,510,239호, 5,514,577호, 5,519,134호, 5,554,746호 5,276,019, 5,286,717호, 5,264,423호, 및 WO96/35706, WO96/32474, WO96/29337 (티아노 트리에스테르로 개질된 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드 포스포로시오에이트), WO94/17093 (올리고뉴클레오티드 알킬포스포네이트 및 알킬포스포티오에이트), WO94/08004 [올리고뉴클레오티드 포스포티오에이트, 메틸 포스페이트, 포스포라미데이트, 디티오에이트, 가교 포스포로티오에이트, 가교 포스포라미데이트, 설폰, 설페이트, 케토, 포스페이트 에스테르 및 포스포로부틸아민(vna der Krol et al., Biotech. 6: 958-976 (1988); Uhlamann et al. Chem. Rev. 90:542-585 (1990)], WO94/02499 (올리고뉴클레오티드 알킬포스포노티오에이트 및 아릴포스포노티오에이트), 및 WO92/209679 (3′-말단에 캡이 부가된 올리고뉴클레오티드)를 참고한다. 본 발명의 특정 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드는 S-올리고뉴클레오티드[포스포로티오에이트 유도체 또는 S-올리고[참고 문헌: Jack Cohen, Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press (1989)]와 같은 유도체를 포함한다. S-올리고(뉴클레오시드 포스포로티오에이트)는 포스페이트기의 비가교성(nonbridging) 산소 원자가 황 원자로 치환된 올리고뉴클레오티드(O-올리고)의 등전자(isoelectronic) 유사체이다. 본 발명의 S-올리고는 상응하는 O-올리고를 황 전이 시약인 3H-1,2-벤조디티올-3-온-1,1-디옥사이드로 처리함으로써 제조될 수 있다[참고 문헌; Iyer et al., J. Org. Chem. 55:4693-4698 (1990); and Iyer et al., J.Am. Chem. SoC. 112:1253-1254 (1990)].
안티센스 치료법
안티센스 올리고뉴클레오티드를 환자에게 투여하여 상응하는 단백질의 발현을 저해하는 치료 방법.
상보적 DNA(cDNA)
"상보적 DNA", 또는 "cDNA" 유전자는 mRNA 역전사에 의해 합성되고, 사이에 있는 서열(인트론)을 제거한 mRNA로부터 합성된 재조합 유전자를 포함한다.
발현
발현은 구조 유전자로부터 생성된 폴리펩티드에 의한 과정이다. 이 과정은 mRNA내로 유전자를 전사하는 단계 및 폴리펩티드내로 이런 mRNA를 번역하는 단계를 수반한다.
상동성/비상동성
2개의 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열이 HASH-코딩 알고리즘에 의해 측정되었을 때 40% 이상의 유사성을 공유하는 경우, 2개의 핵산 분자는 "상동성"이 있는 것으로 취급한다[Wilber, W.J. and Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad. Sci. 80:726-730 (1983)]. 2개의 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열이 40% 미만의 유사성을 공유하는 경우, 2개의 핵산 분자는 "비상동성인" 것으로 취급한다.
리보자임
리보자임은 촉매 작용의 중심을 함유하는 RNA 분자이다. 이 용어는 RNA 효소, 자가-스플라이싱 RNA 및 자가 분열 RNA를 함유하는 RNA 분자이다.
리보자임 치료법
리보자임을 환자에게 투여하여 표적 mRNA의 번역을 저해하는 치료 방법.
단편
NTP와 같은 분자의 "단편"은 그 분자의 임의의 폴리펩티드 하위 분류를 의미한다.
작용성 유도체(functional derivative)
"작용성 유도체"라는 용어는 "분자의 변종", "유사종" 또는 "화학적 유도체"를 포함하는 의미이다. NTP와 같은 분자의 "변종"은 전체 분자 또는 그것의 단편과 거의 유사한, 자연 발생적인 분자를 의미한다. NTP와 같은 분자의 "유사종"은 전체 분자 또는 그것의 단편과 거의 유사한, 비자연 발생적인 분자를 의미한다.
2개의 분자의 아미노산 서열이 거의 동일하고 2개의 분자가 유사한 생물학적 활성을 가지는 경우, 하나의 분자는 다른 분자에 대해 "거의 유사한" 것으로 생각된다. 그러므로, 2개의 분자가 유사한 활성을 가지는 경우, 분자 중 하나가 다른 분자에서는 발견되지 않는 아미노산 잔기를 추가로 함유하고 있거나 또는 아미노산 잔기의 서열이 동일하지 않더라도, 이들 분자는 본원에서 사용된 용어인 변종으로 생각된다.
분자가 정상적으로는 그 분자의 일부가 아닌 추가의 화학적 부분(moiety)을 함유하는 경우, 본원에서는 이 분자를 다른 분자의 "화학적 유도체"로 간주한다. 이런 부분은 분자의 용해도, 흡수, 생물학적 반감기 등을 향상시킬 수 있다. 이 부분은 대안적으로 분자의 독성을 감소시키거나, 분자의 임의의 바람직하지 않은 부작용 등을 제거 또는 약화시킬 수 있다. 이런 효과를 매개할 수 있는 부분의 예는 문헌[Remington's pharmaceutical Sciences (1980)]에 개시되어 있으며, 이는 당업자에게 분명할 것이다.
AD7c-NTP
"AD7c-NTP"라는 용어는 서열 번호 2 및 그것의 대립 유전자(allelic) 변종을 가진 단백질을 의미한다.
본 발명자들은 cDNA에 의해 지령되는 AD7c-NTP를 분리하였다. AD7c-NTP는 뉴론에서 발현되고 AD가 있는 뇌에서 과다 발현된다. 1442-뉴클레오티드 AD7c-NTP cDNA는 아미노 말단 근처의 소수성 선도(leader) 서열 및 미리스틸화(myristylation) 모티브를 가진, ∼41 kD 막을 연결하는 단백질을 암호화한다. AD7c-NTP cDNA는 NF2, 인테그린(integrin)의 β1 서브유니트, 사람의 필수적인 막단백질, 마이엘린 올리고당단백질-16 전구체 및 사람의 사망을 촉진하는 인자 2 전구체의 대안적으로 스플라이싱된 A4 형태와 상당 부분 상동성을 갖는 3개의 부위, 및 염색체 4p16.3 상에 있는 헌팅톤 질병 부위내의 서열과 상당 부분 상동성을 갖는 2개의 부위를 가진 Alu 서열을 함유한 유전자이다. AD7c-NTP의 발현은 뇌로부터 분리한 RT-PCR 생성물의 핵산 서열화에 의해 확인되었다. 노던 블롯 분석에 의해 1.4 kB와 0.9 kB mRNA 전사로 혼성화한 AD7c-NTP cDNA 탐침, 및 재조합 단백질로 생성한 모노클로날 항체를 사람 뇌의 웨스턴 블롯 분석에 의해 ∼39-45 kD 및 ∼19-21 kD 분자와 면역반응시켰다. 17개의 AD 및 11개의 노화와 관계된 대조군의 뇌로부터터 얻은 데이터의 정량 결과, AD에서 상당히 높은 레벨의 AD7c-NTP를 발현한다는 것이 입증되었다. 정위치(in-situ) 혼성화 및 면역염색 연구는 뉴론에서의 AD7c-NTP 유전자 발현에 집중되었고, AD 신경퇴행과 관계된 과다 발현이 입증되었다. AD7c-NTP 단백질 레벨의 증가는 또한 웨스턴 블롯 분석에 의해 뇌척수액 중에서 검출가능할 수 있었다. 그 결과는 비정상적인 AD7c-NTP 유전자 발현이 AD 신경퇴행과 관계가 있다는 것을 암시한다. 그러므로, AD7c-NTP의 비정상적인 발현은 알츠하이머 병과 관계된 표현형이다.
AD7c-NTP 발현이 알츠하이머 병을 유발한다는 사실을 확인함으로써, AD7c-NTP를 과다 발현하는 유전자 변형동물 및 세포계를 사용하여 알츠하이머 병, 신경외배엽의 종양, 악성 성상세포종 및 신경교아세포종의 치료 또는 예방에 사용하는 약물을 선별할 수 있다는 기대를 갖게 되었다.
본 발명은 DNA 구조체에 관한 것으로서, 상기 DNA 구조체는 서열 번호 1 또는 그것의 단편, 또는 그것과 40% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상 상동성을 갖는 DNA 분자를 포함한다. DNA 구조체가 서열 번호 2를 가진 AD7c-NTP를 암호화하는 것이 바람직하다. 또한, DNA 서열이 이종 구조의 신경 특이성 프로모터의 조절하에 있는 것이 바람직하다. 숙주 세포에서 AD7c-NTP를 발현시키는 데 사용될 수 있는 프로모터의 예는 앞서 기술한 바 있다. 프로모터를 제어할 수 있는 경우, 프로모터를 서열 번호 1의 DNA 분자에 쉽게 연결할 수 있다. DNA 단편을 연결시키는 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다. 서열 번호 1을 가진 DNA 분자는, 프로모터를 함유하여 AD7c-NTP DNA 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 생성하는 플라스미드에 연결된다.
본 발명의 DNA 분자의 단편은 AD7c-NTP의 활성을 가진 단백질을 암호화한다. 즉, DNA 단편은 이것을 발현하는 숙주내 신경염의 발생, 신경 세포 괴사, 신경 세포 분해, 신경원섬유 엉킴 및/또는 불규칙한 팽창된 신경돌기를 유도한다.
서열 번호 1과 40%, 85% 또는 90% 이상 상동성을 갖는 DNA 분자는 당업자에게 알려진 방법에 따라 서열 번호 1의 DNA 분자의 엄중한 조건(stringent condition)하에서 혼성화함으로써 사람 및 동물의 cDNA 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 서열 번호 1과 40%, 85% 및 90% 이상 상동성을 갖는 DNA 분자를 선택하기 위해 사용되는 엄중한 혼성화 조건은 참고 문헌[Sambrook et al., In: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); and Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1985]에 개시되어 있다. 이 혼성화는 65℃의 6 x SSC/5 x 덴하르트 용액/0.1% SDS 중에서 수행될 수 있다. 엄중한 정도는 세척단계에서 결정된다. 그러므로, 적당한 조건은 0.2 x SSC/0.01% SDS/65℃ 및 0.1 x SSC/0.01% SDS/65℃를 포함한다.
또한, 본 발명은 본발명의 DNA 구조체를 함유하는 세포에 관한 것이다. 본 발명의 DNA구조체를 함유할 수 있는 적당한 세포의 예는 진핵 세포와 원핵 세포를 포함한다. 사람의 세포, 사람을 제외한 영장류의 세포, 돼지의 세포, 양의 세포 등을 포함하는 척추동물 진핵 세포로부터 유래된 진핵 세포와 같은 진핵 세포가 바람직하다. 또한, 세포계가 이들 척추동물 중 하나의 뉴론 세포계인 것이 고안될 수 있다. 이러한 세포계의 예는 SH-Sy5y, pNET-1, pNET-2, hNTS(스트라타젠 인코포레이티드), 및 A172(ATCC) 뉴론 세포를 포함한다. 참고 문헌[O'Barr, S. et al., Neurobiol. Aging 17:131-136 (1996); Ozturk, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:419-423 (1989); Bieldler et al., Cancer Res. 33:2643-2652 (1973); and The et al., Nature Genet. 3:2643-2652 (1993)].
시험관내에서, 생체내에서 및 생체외에서 세포내로 DNA 구조체를 도입하는 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제 5,595,899호, 5,521,291호, 5,166,320호, 5,547,932호, 5,354,844호, 5,399,346호, WO94/10569 및 문헌[Citron et al., Nature 360:622-674 (1995)]을 참고할 수 있다..
또한, 본 발명은 또한 생식 세포와 체세포 각각에 본 발명의 DNA 구조체를 포함하고 AD7c-NTP를 과다 발현하는 유전자 변형된, 사람을 제외한 동물에 관한 것이다. 이런 유전자 변형동물은 예를 들어, 성숙한 동물로 성장할 수정된 난자에 본 발명의 DNA 구조체를 주사함으로써 얻어질 수 있다. 유전자 변형동물을 제조하기 위해서, 수백개의 DNA 분자를 수정된 하나의 세포 난자의 전핵(pro-nucleus)내에 주사할 수 있다. 이어서, 마이크로 주사된 난자들을 가임신의 대리모의 난관내로 옮겨서 성장시킨다. 문헌[Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442 (1985)]에는 성장하는 마우스의 약 25%가 마이크로 주사된 DNA의 하나 이상의 복사(copy)를 유전시키는 것에 대해 기재되어 있다. 또 다르게는, 참고 문헌[Gossler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9065-9069 (1989)]에 기재된 것과 같이, 유전자 변형동물은 변형 유전자(transgene)를 생성시키기 위해 재조합 ES 세포를 사용함으로써 얻을 수 있다. 꼬리 조직으로부터 게놈 DNA, 및 통상의 DNA 활성화 기법에 의해 확인된 AD7c-NTP를 암호화하는 단편을 분리함으로써 변형 유전자의 삽입에 대해 자손(offsping)을 분석할 수 있다[Southern,J. Mol. Biol. 98:503-517 (1975)]. AD7c-NTP 마우스의 콜로니를 확장시키기 위해 AD7c-NTP 유전자에 대해 양성인 동물을 더 성장시킨다. 유전자 변형동물을 제조하는 방법의 일반적인 예 및 특수한 예는 미국 특허 번호 제 5,602,299호, 5,366,894호, 5,464,758호, 5,569,827호, WO96/40896(미국 특허 출원 번호 제 08/480,693호); WO96/40895 (미국 특허 출원 번호 제 08/486,018호 및 08/486,536호); WO93/14200 (미국 특허 출원 번호 제 07/817,584호 및 07/915,469호); WO95/03397(미국 특허 출원 번호 제 08/096,944호); WO95/25792(미국 특허 출원 번호 제 08/215,083호); EP 0 717 105(미국 특허 출원 번호 제 08/358,627호); 및 문헌[Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1986); Hammer et al., Cell 63:1099-1112 (1990)]에 개시되어 있다.
AD7c-NTP를 함유하는 유전자 변형동물을 얻은 후, AD7c-NTP 발현, 및 알츠하이머 병, 신경외배엽의 종양, 악성 성상세포종과 신경교아세포종과 관계된 뉴론 또는 신경돌기의 이상을 확인하기 위해 면역조직학에 의해 상기 유전자 변형동물을 분석할 수 있다. 뇌의 일부는 모노클로날 또는 폴리클로날 AD7c-NTP에 대해 특이적인 항체로 염색될 수 있다.
또한, 본 발명은 또한 알츠하이머 병, 신경외배엽의 종양, 악성 성상세포종 및 신경교아세포종을 치료 또는 예방하는 데 사용될 가능성이 있는 후보 약물을 선별하기 위한 시험관내 방법에 관한 것으로서, 다음의 단계를 포함한다.
(a) 후보 약물을 DNA 구조체로 형질 감염된 숙주에 접촉시키는 단계로서, 상기 DNA 구조체는 서열 번호 1의 DNA 분자 또는 이것과 40% 이상 상동성을 갖는 DNA 분자를 포함하며, 상기 숙주는 상기 DNA 분자에 의해 암호화된 단백질을 과다 발현하는 단계, 및
(b) 후보 약물에 기인하는 다음 중 하나 이상을 검출하는 단계: (ⅰ) 단백질 발현의 억제 또는 예방 (ⅱ) 단백질 분해의 증가 (ⅲ) 숙주내 신경염의 발생, 신경 세포 괴사, 퇴행성 뉴론, 신경원섬유의 엉킴 또는 불규칙한 팽창된 신경돌기 및 축삭 중 하나 이상의 빈도의 감소
바람직한 구체예에서, 숙주는 유전자 변형동물이다. 다른 바람직한 구체예에서, 숙주는 시험관내 세포이다. AD7c-NTP와 같은 단백질 발현의 억제 또는 예방, 및 분해의 증가는 AD7c-NTP에 특이성이 항체를 사용하여 검출될 수 있다. AD7c-NTP에 특이적인 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 및 AD7c-NTP의 정성적 및 정량적 검출은 본원뿐 아니라 WO94/23756 및 미국 특허 출원 번호 제 08/340,426호에 기재되어 있다. 이런 시험은 유전자 변형동물의 CSF상에서 또는 동물의 뇌조직 단편의 면역조직화학적 염색에 의해 수행될 수 있다. 게다가, 이런 시험은 웨스턴 블롯 분석, ELISA 또는 RIA에 의해 수행될 수 있다.
또한, 면역조직화학적 염색은, 동물에서 신경염의 발생, 신경 세포 괴사, 퇴행성 뉴론, 신경원섬유의 엉킴, 또는 불규칙한 팽창된 신경돌기 및 축삭 중 하나 이상의 빈도를 측정하기 위해 수행될 수 있다. 일반적으로 동물을 치사시켜야 할 것이므로, 시험군 및 대조군 유전자 변형동물의 푸울(pool)을 시험하여야 한다. 치사시킨 후, 신경염의 발생, 신경 세포 괴사, 퇴행성 뉴론, 신경원섬유의 엉킴, 또는 불규칙적으로 팽창된 신경돌기 및 축삭의 상대적 빈도를 양쪽 집단에 대해 측정한다. 시험군이 신경염의 발생, 신경 세포 괴사, 퇴행성 뉴론, 신경원섬유의 엉킴, 또는 불규칙한 팽창된 신경돌기 및 축삭의 빈도의 감소를 나타내는 경우, 약물은 알츠하이머 병, 신경외배엽의 종양, 성상세포종, 또는 신경교아세포종의 치료 또는 예방이 기대되는 것으로 생각될 수 있다.
숙주가 유전자 변형동물인 경우, 후보 약물의 효과는 학습 및 기억 결손을 평가하기 위해 고안된 행동 시험에 의해 또한 시험될 수 있다. 이런 시험의 예는 문헌[Morris, Learn Motivet. 12:239-260 (1981) 및 WO96/40895]에 개시된 모리스 워터 미로(Morris Water maze)이다.
본 발명의 방법을 수행함에 있어서, 후보 약물을 유전자 변형동물에 투여하거나, 또는 본 발명의 DNA 구조체를 가진 형질 감염된 동물 또는 세포로부터 유래된 세포의 배양 배지내로 도입시키는 것이다. 후보 약물을 일정 기간동안 다양한 용량으로 투여하고, 동물 또는 동물의 세포를 AD7c-NTP 발현, 신경 세포 분해 또는 조직병리학에 있어서의 변화에 대해 시험했다. 유전자 변형동물의 경우, 행동 시험에서의 향상에 대해 이들 동물을 또한 시험할 수 있다.
후보 약물의 효과에 대해 세포를 시험관내에서 시험하는 경우, 이들을 성장 수행 배지 및 후보 약물을 함유하는 배지로 대체된 배지내에서 성장시킨다. 실제 임의의 세포 유형의 성장을 촉진시키는 광범위한 배지가 시판되는데, 예를 들어 라이프 테크놀로지 인코포레이티드(매릴랜드주 가이테스버그에 소재)로부터 시판된다. 후보 약물이 배지에 단지 약간 용해되는 경우, 저장 용액은 디메틸 설폭시드(DMSO) 중에 제조될 수 있다. 이어서, DMSO 용액은 배지와 혼합된다. 배지중의 DMSO의 농도는 0.5%, 바람직하게는 0.1%를 초과하지 않는다. 이어서, 세포를 예정된 시간동안(예: 2 내지 10시간) 예정된 온도(예: 약 37℃)에서 약물을 함유하는 배지의 존재하에 배양시킨다. 이 기간의 종반부에, 배지를 다시 제거하고 후보 약물을 함유하는 신선한 배지를 첨가한다. 이어서, 세포를 제2의 예정된 시간동안(예: 2 내지 16시간) 배양시킨다. 이 과정은 유의성 있는 결과를 얻는데 필요한 만큼 반복될 수 있다.
처리 기간이 경과한 후, 세포를 NTP 발현 레벨에 대해 시험하고 및/또는 세포가 뉴론 세포인 경우, 신경염의 발생, 신경 세포 괴사, 퇴행성 뉴론, 신경원섬유의 엉킴, 또는 불규칙적으로 팽창한 신경돌기 및 축삭의 존재 및/또는 빈도를 검사한다. NTP 발현 레벨을 시험하기 위해서, 실시예에 기재된 것과 같이 면역조직화학적 염색을 수행할 수 있다. 또 다르게는, 세포를 함유하는 플레이트를 원심분리하여 배지로부터의 세포 파편을 펠렛으로 옮기고, 배지의 샘플을 NTP 농도에 대해 시험했다. NTP의 농도는 NTP에 특이적인 항체를 사용하는 ELISA에 의해 측정될 수 있다. 이런 분석을 수행하는 방법은 WO94/10569에 개시되어 있고, 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이어서, 시험 세포/배지 중 NTP의 농도를, 배지가 후보 약물을 함유하지 않는 것(그러나, 동일한 레벨의 DMSO를 함유)을 제외하고는 동일한 방법으로 처리된 대조군의 농도와 비교한다. ELISA의 결과는 표준 곡선에 적합하고, ng/ml NTP로서 나타낸다. [참고: WO96/40895]
바람직한 시험관내 모델 시스템에서, AD7c-NTP는 Lac-스위치(Lac-Switch) 유도 시스템내로 클론되고 안정하게 뉴론 세포[예: PNET2(CYZ), SH-Sy5y 및 hNT2]내로 형질 감염된다. AD7c-NTP는 완전한 길이의 cDNA 또는 CAT 수용체 유전자 구조체일 수 있다. 단백질 발현은 1-5 mM IPTG로 유도될 수 있다. 배양물은 세포 괴사, 신경염의 발생, 및 이들 또는 다른 AD에 관계된 현상과 관련된 유전자 발현의 상응하는 변화에 대해 검사될 수 있다. 분석에 이용 가능한 분석 방법은 유전자 발현 연구를 위한 생존력(크리스탈 바이올렛) 및 대사(MTT) 분석, 웨스턴 블롯 및 면역세포화학적 염색, 마이크로타이터 면역세포화학적 ELISA(MICE) 분석, 세포 소멸(apoptosis) DNA 분단 분석(래더, 말단-표지, 획스트 염색 및 TUNEL 분석) 및 CAT 분석을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 뉴론 세포에 대한 NTP의 독성에 미치는 후보 약물의 효과는 WO96/40895에 따라 1차 래트 피질 세포 배양물 내에서 측정되거나, 또는 태아의 뇌조직 또는 분화된 뉴론 세포계(예: hNT2 및 SH-Sy5y 세포계)를 사용하여 측정될 수 있다. 또 다르게는, 본원에 기재된 AD7c-NTP로 형질 전환되고, AD7c-NTP를 암호화하는 유전자를 발현하는 뉴론 세포가 사용될 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 원핵 세포[Mizuno et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1966-1970 (1984)] 및 진핵 세포[Heywood, Nucleic Acids Res. 14:6771-6772 (1986)]내 자연 발생적인 유전자 발현의 생물학적 저해제로서 기재되어 있고, 이들 서열은 아마 상보적인 mRNA 서열로 혼성화함으로써 작용하여 번역의 혼성화 정지를 유발할 것이다[Paterson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:4370-4374 (1987)].
안티센스 올리고뉴클레오티드는 특정 유전자 또는 RNA 신호(masseage)에 상보적으로 제조되는 짧은 합성 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드 분자이다. 이들 올리고머를 표적 DNA 또는 mRNA 서열에 결합시킬 수 있지만, 유전자의 전사 또는 번역은 선택적으로 차단될 수 있고 유전자에 의해 발생된 질병의 진행은 중단될 수 있다. 예로서 문헌[Jack Cohen, Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press (1989)]을 참고할 수 있다. mRNA의 세포질의 위치는 세포로 들어가는 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드에 쉽게 접근할 수 있을 것으로 생각되는 표적을 제공한다. 따라서, 이 분야의 많은 연구는 표적으로서 RNA에 집중되었다. 현재, 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드의 사용은 시험관내 및 조직 배양에서 유전자 발현의 조절을 연구하기 위한 도구로서 유용하다[Rotherberg, et al., J. Natl. Cancer Inst. 81:1359-1544 (1989)].
안티센스 치료법은 세포내에 위치하는 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하는 외인성 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것이다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 항암 치료를 위해 전신적으로 투여될 수 있다(WO 90/09180). AD7c-NTP는 신경외배엽의 종양 세포, 악성 성상세포종, 신경교아세포종 세포에 의해 생성되며, AD 환자의 뇌 조직에서 비교적 고농도(즉, 대조군에 비해)로 생성된다. 그러므로, 본 발명의 AD7c-NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드는 AD뿐만 아니라 신경외배엽의 종양, 악성 성상세포종 및 신경교아세포종에 대한 치료에서 활성일 수 있다.
전술한 것과 같이, 본 발명은 또한 NTP에 대한 올바른 아미노산 및 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 그러므로, 본 발명은 또한 서열 번호 1로부터 전사될 수 있는 mRNA에 상보적인 안티센스 뉴클레오티드에 관한 것이다. 서열 번호 1에서 상기 뉴클레오티드는 WO94/23756 및 WO96/15272에서 부정확하게 서열된 NTP 유전자의 위치, 예를 들어 뉴클레오티드 150-1139(공개된 출원의 도16R의 뉴클레오티드 1-148; 본 발명의 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1-149는 부정확하게 서열화되었음)에 상응한다. 이 부정확한 서열은 서열 번호 3과 4에서 존재한다. 그러므로, 본 발명은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 150-1139에 상응하는 NTP mRNA 서열과 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 올리고뉴클레오티드가 서열 번호 1의 뉴클레오티드 150, 194-195, 240-241, 243, 244, 255-256, 266-267, 269-271, 276, 279-280, 293-295, 338-340, 411, 459, 523-533, 591, 633-644, 795-797, 828, 853-854, 876-877, 883, 884-885, 898, 976, 979-980, 999, 1037, 1043-1044, 1092-1096, 1099 및 1116-1119으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드를 포함하는 부위에 상응하는 것이 바람직하다. 본 발명은 다음으로 구성된 군에서 선택된 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열에 관한 것이다:
5′TTC ATC CTG GGT AAG AGT GGG ACA CCT GTG (서열 번호 9)
5′TGG TGC ATG TCT TTG GTC CCA GCT AC (서열 번호 10); 및
5′ATC AAC CTG GCG AAC ATG GTG AAC CCC ATC (서열 번호 11).
또한, 서열이 15 내지 40량체인 것이 바람직하고, 15 내지 30량체인 것이 더 바람직하다. 또한, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 또는 전술한 다른 올리고뉴클레오티드 유도체 중 하나인 것이 바람직하다. 또한, NTP 핵산 서열에 상보적이고, PTP 핵산 서열과 일치하지 않고, 과거에 부정확하게 서열화되었던 부위에 상응하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 그 올리고뉴클레오티드와 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물이 바람직하다.
약학적 허용 담체와 함께, 본 발명의 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상을 유효한 양으로 포함하는 약학 조성물 또한 본 발명에 포함된다. 하나의 구체예에서, 하나의 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드가 사용된다. 또 다른 구체예에서, NTP DNA의 인접한 부위에 상보적인 2개의 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드가 사용된다. DNA 또는 상응하는 mRNA의 인접한 부위에 상보적인 2개의 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하여 NTP 게놈 전사 또는 mRNA 번역을 더 유효하게 저해함으로써, NTP 생성을 더 유효하게 저해할 수 있다.
NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드가 세포에 의한 안티센스 분자의 섭취(untake)를 증진시키는 약제와 함께 투여되는 것이 바람직하다. 예를 들어, NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드는 리포좀(liposome)의 형태일 수 있는 지질친화성 양이온성 화합물과 결합될 수 있다. 세포내로 뉴클레오티드를 도입하기 위해 리포좀을 사용하는 것은 예를 들어, 미국 특허 번호 제 4,897,355호 및 제 4,394,448호 및 제4,394,488호에 교시되어 있다. 생물학적 물질을 포함하는 리포좀의 일반적인 제조방법에 대해 미국 특허 번호 제 4,235,871호, 4,231,877호, 4,224,179호, 4,753,788호, 4,677,567호, 4,247,411호, 4,814,270호를 또한 참고할 수 있다.
또 다르게는 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드는 지질친화성 담체, 예를 들어 콜레스테롤, 콜레이트, 데옥시콜린산을 포함하는 다수의 스테롤 중 임의의 하나와 결합될 수 있다. 바람직한 스테롤은 콜레스테롤이다.
또한, NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포에 의해 섭취된 펩티드에 접합될 수 있다. 유용한 펩티드의 예로서 펩티드 호르몬, 항원 또는 항체, 및 펩티드 독소가 포함된다. 종양 세포에 의해 선택적으로 섭취되는 펩티드를 선택함으로써, 안티센스 약제의 특이적 전달이 영향을 받을 수 있다. NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드는 활성화된 아미노알킬 유도체를 형성함으로써 5′OH 기를 통해 공유적으로 결합될 수 있다. 이어서, 선택된 펩티드는 아미노 및 설파히드릴 반응성 헤테로 양쪽기능성 시약을 통해 활성화된 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드에 공유적으로 부착될 수 있다. 후자는 펩티드 중에 존재하는 시스테인 잔기에 결합된다. 세포를 펩티드에 결합된 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드에 노출시키면, 펩티딜 안티센스 약제는 엔도사이토시스되고 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 NTP mRNA에 결합하여 번역을 저해한다[Haralambid et al., WO 8903849; Lebleu et al., EP 0263740].
본 발명의 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 약학 조성물은 이들의 의도된 목적을 달성하기 위한 임의의 방법으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 투여는 비경구적, 피하, 정맥, 근육내, 복강내, 경피, 난포막내 또는 두개내 경로에 의할 수 있다. 투여되는 용량은 투여될 개체의 연령, 건강 상태, 체중, 병용요법의 종류, 병용하는 치료가 존재하는 경우 그 치료의 빈도 및 소정의 효과의 특성에 좌우되어 달라질 수 있다.
본 발명의 범위내에 있는 조성물은 피검체의 종양 세포의 증식을 저해하고/저해하거나 분화를 자극하거나, 또는 AD를 경감시키기에 유효한 양의 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드를 함유하는 모든 조성물을 포함한다. 개체는 변화를 필요로 하는 반면, 각각 성분의 유효량에 대한 최적의 범위는 당해 기술에 의해 정해진다. 통상적으로, NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드는 포유동물, 예를 들어 사람에게 0.005 내지 1 mg/kg/일의 용량으로, 또는 치료되는 포유 동물의 체중의 1일당 동일한 양의 그것의 약학적 허용염으로 투여될 수 있다.
이중 DNA의 전사된 부위(인트론, 엑손 또는 모두를 포함) 및 3중 나선을 형성하는 부위(미국 특허 번호 제 5,594,121호, 미국 특허 번호 제 5,591,607호, WO96/35706, WO96/32474, WO94/17091, WO94/01550, WO91/06626, WO92/10590)에 결합함으로써 NTP 유전자의 전사를 방해하도록 고안된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제조할 수 있다. 3중 나선을 형성하기 위해 바람직한 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드(Id.)의 2 이상의 부위에 대해 역으로 된 극성을 가지는 올리고뉴클레오티드이다. 이런 올리고뉴클레오티드는 3′---5′-L-5′---3′, 또는 5′---3′-L-3′---5′와 같이 반대 극성을 가진 평행한 서열을 포함하고 있으며, 상기 L은 올리고뉴클레오티드들 사이에 0 내지 10개의 염기 올리고뉴클레오티드 연결을 나타낸다. 역으로 된 극성 형태는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 엑소뉴클레아제 분해에 대해 안정화시킨다[Feoehler et al., supra). 바람직한 올리고뉴클레오티드는 PTP 핵산과 일치하지 않고 과거의 부정확하게 서열화된 부위에 상응한다. 또한, 본 발명은 이런 올리고데옥시뉴클레오티드 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
치료적 적용에서, 3중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드를 전술한 것과 같은 전신 또는 국소 투여를 포함하여, 다양한 방식의 투여를 위한 약학적 제제로 제제화될 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 3중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드는 고상(solid phase) 합성법, 및 본원에 인용된 공보, 특허 및 특허 출원에 개시된 다른 방법을 포함하여 당업자에게 널리 알려진 임의의 방법에 따라 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열 번호 1의 NTP 서열에 상보적이고 PTP 핵산과 일치하지 않고 과거에 부정확하게 서열화되었던 부위에 상응하는 표적 서열을 포함하는 리보자임, 및 이런 리보자임과 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
리보자임은 mRNA 기능을 저해하는 대안적인 방법을 제공한다. 리보자임은 RNA 효소, 자가-스플라이싱 RNA 및 자가 분열 RNA일 수 있다[Cech et al., Journal of Biological Chemistry 267:17479-17482 (1992)]. 특정 표적 서열에 대해 트랜스(trans) 방향으로 엔도뉴클레아제 활성을 가진 데 노보(de novo) 리보자임을 구성하는 것이 가능하다. 이들 리보자임은 다양한 서열상에서 작용할 수 있으므로, 리보자임은 거의 모든 RNA 기질에 대해 고안될 수 있다. 그러므로, 리보자임은 특이성 유전자의 발현을 저해하는 데 매우 유연한 도구이고, 안티센스 구조에 대해 대안적이다.
클로람페니콜 아세틸트랜스페라아제 mRNA에 대한 리보자임이 성공적으로 구성되었다[Haseloff et al., Nature 334:585-591 (1988); Uhlenbeck et al., Nature 328:596-600 (1987)]. 리보자임은 3개의 구조 도메인을 함유한다: (1) 5′방향에 있는 분열 위치의 측면에 위치하는 뉴클레오티드의 고도로 보존된 서열; (2) 염기쌍으로 된 가닥을 형성하는, 리보자임의 자연발생적 분열 도메인 내에 함유된 고도로 보존된 서열; 및 (3) 양 쪽의 분열 위치의 측면에 위치하고, 분열 위치 및 기질과 효소의 접착에 관계하는 리보자임의 정확한 배열을 확인하는 위치. 이 모델에 따라 구성된 RNA 효소는 RNA 서열의 특이한 분열에 시험관내에서 적합한 것으로 이미 입증되었다[Haseloff et al., supra]. 이런 부위의 예는 전술한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
또 다르게는, 헤어핀(hairpin) 리보자임이 담배 고리 스폿 바이러스(tabacco ring spot virus)의 부수체 RNA의 마이너스 가닥으로부터 유래된 활성 위치에 사용될 수 있다[Hampel et al., Biochemistry 28:4929-4933 (1989)]. 최근, 사람의 면역결핍성 바이러스 제1형 RNA를 분해시키는 헤어핀 리보자임이 고안되었다[Ojwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10802-10806 (1992)]. 다른 자가 분열 RNA 활성은 간염 델타 바이러스에 관계된다[Kuo et al., J. Virol. 62:4429-4444 (1988)]. 리보자임의 사용방법 및 제조방법에 대해 미국 특허 번호 제 5,574,143호를 참고할 수 있다. 본 발명의 NTP 리보자임 분자가 전술한 클로람페니콜 아세틸트랜스페라아제 리보자임 또는 헤어핀 리보자임을 기초로 고안되는 것이 바람직하다. 또 다르게는, 화학적 및 효소적 분해에 대한 안정성을 증가시킨 촉매적 활성 리보자임 구조를 개시하는 엑스타인 등(국제 공개 번호 제 WO 92/07065)에 의해 기재된 것과 같이, NTP 리보자임 분자가 고안되었으며, 이는 치료제로서 유용하다.
대안적인 접근법으로, 외부 가이드 서열(EGS)은 내인성 리보자임, RNase P, 세포내부의 NTP mRNA를 지향하도록 구성될 수 있는데, 이는 세포성 리보자임에 의해 차후에 분열된다[Altman et al., U.S. Patent No. 5,168,053호]. NTP EGS가 AD7c-NTP mRNA(잘못 서열화된 부위에 상응함) 및 3′-NCCA 뉴클레오티드 서열(여기에서, N은 퓨린(Id.)인 것이 바람직함)에 상보적인 10 내지 15개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 아래에 기술된 것과 같이, NTP EGS 분자가 세포로 전달된 후, 분자는 NTP mRNA와 상보적인 NTP EGS 서열 사이에 염기쌍을 형성함으로써 표적 NTP mRNA 종류에 결합하여 염기쌍 부위(Id.)의 5′방향에 있는 뉴클레오티드의 RNase P에 의해 NTP mRNA의 분열은 촉진한다.
이런 외부 가이드 서열의 예는 다음과 같다:
CAC TGC ACT TNC CA(서열 번호 12)
CCA GGT GTA GNC CA(서열 번호 13)
CAA GGT CCA GNC CA(서열 번호 14)
약학적 허용 담체와 함께 하나 이상의 본 발명의 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드, 상중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드, NTP 리보자임 또는 NTP EGS의 유효량을 포함하는 약학 조성물은 또한 본 발명에 포함된다. NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드, 3중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드, NTP 리보자임 또는 NTP EGS는 세포에 의한 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드, 3중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드, 리보자임 또는 NTP EGS의 섭취를 향상시키는 약제와 병용투여되는 것이 바람직하다. 예를 들어, NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드, 3중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드, NTP 리보자임 또는 NTP EGS는 전술한 것과 같은 리포좀의 형태일 수 있는 지질친화성 양이온성 화합물과 결합될 수 있다. 또 다르게는, NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드, 3중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드, NTP 리보자임 또는 NTP EGS는 지질친화성 담체, 예를 들어 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜린산을 포함하는 다수의 스테롤 중 임의의 하나와 결합될 수 있다. 바람직한 스테롤은 클레스테롤이다.
NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드, NTP 3중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드, NTP 리보자임 또는 NTP EGS, 및 본 발명의 약학 조성물은 이들의 의도된 목적을 달성하기 위한 임의의 방법으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 투여는 비경구적, 피하, 정백, 근육내, 복강내, 경피, 난포막 또는 두개내 경로에 의할 수 있다. 투량은 투여될 개체의 연령, 건강 상태, 체중, 병용요법의 종류, 병용하는 치료가 존재하는 경우 치료의 빈도 및 소정의 효과의 특성에 좌우되어 달라질 수 있다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드 700 mg을 독성의 징후없이 10일동안(즉, 0.05 mg/kg/시) 환자에게 정맥으로 투여하였다[Sterling, "Systemic Antisense Treatment Reported,"Genetic Engineering News 12(12): 1,28 (1992)].
본 발명의 범위내에 있는 조성물은 피검체의 종양 세포의 증식을 저해하고/저해하거나 분화를 자극하거나, 또는 AD를 경감시키는 데 유효한 양의 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드, NTP 3중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드, NTP 리보자임 또는 NTP EGS를 함유하는 모든 조성물을 포함한다. 개개의 필요성은 다른 반면, 각각의 성분의 유효량에 대한 최적의 범위는 당해 기술에 의해 정해진다.
용액 중에 생 화학물질로서 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드, 3중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드, 리보자임 또는 NTP EGS를 투여하는 것 이외에, 치료적 분자는 약학적으로 사용되는 제제내에 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드, 3중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드, 리보자임 또는 NTP EGS의 가공을 촉진하는 부형제 및 보조제를 포함하는 적당한 약학적 허용 담체를 함유하는 약학 제제의 일부로서 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위한 적당한 제제는 NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드, NTP 3중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드, NTP 리보자임 또는 NTP EGS의 수용성 형태(예: 수용성염)의 수용액을 포함한다. 또한, 적절한 유성 주사 현탁액으로서 활성 화합물의 현탁액을 투여할 수 있다. 적당한 지질친화성 용매 또는 비이클은 지방유(예: 참기름) 또는 합성 지방산 에스테르(예: 에틸 올레이트 또는 트리글리세라이드)가 포함된다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예를 들어, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 및/또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 안정화제를 함유할 수 있다.
또 다르게는, NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드, NTP 3중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드, NTP 리보자임 또는 NTP EGS는 비리온의 형태로 투여되는 DNA 구조체에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 생체내에서 복제할 수 없는 것이 바람직하다(예로서 참조; Taylor, WO 92/06693). 예를 들어, 이런 DNA 구조체는 헤르페스계 바이러스를 사용하여 투여될 수 있다[Gage et al., U.S. Patent No. 5,082,670]. 또 다르게는, NTP 안티센스 올리고뉴클레오티드, NTP 3중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드, NTP 리보자임 또는 NTP EGS는 비리온(virion), 예를 들어 레트로바이러스의 형태로 투여된 RNA 구조체에 의해 암호화될 수 있다. 레트로바이러스 벡터의 제조는 당해 기술 분야에 널리 알려져 있다[예로서 참조; Brown et al., "Retroviral Vectors,"in DNA Cloning; A Practical Approach, Volume 3, IRL Press, Washington, D. C. (1987)].
본 발명에 따르면, 유전자 치료는 NTP의 특정 형태의 부적절한 발현을 저해함으로써 AD를 경감시키는 데 사용될 수 있다. 또한, 유전자 치료는 특정 형태의 NTP를 적절한 레벨로 발현시켜 AD을 경감시키는 데 사용될 수 있다. 이 경우에, 특정 NTP 핵산 서열은 전술한 것과 같이 바이러스의 형태로 투여되는 DNA 또는 RNA 구조체에 의해 암호화될 수 있다. 또 다르게는, "공여체 세포(donor cell)"는 NTP 서열을 함유하는 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 사용하거나, 또는 세포내로 외부 DNA를 도입하는 널리 알려진 기법을 사용하여 시험관내에서 개질될 수 있다[예로서 참조; Sambrook et al., supra]. 이런 공여체 세포는 섬유아세포, 뉴론 세포, 신경교 세포 및 조직간 세포(connective tissue cell)(Gage et al., supra)를 포함한다. 유전자 조작 이후, 공여체 세포는 중추 신경계내로 이식되어 유전자적으로 개질된 세포는 NTP의 치료적 형태(Id.)를 제공한다.
게다가, 이런 비리온은 뇌로의 전달을 위해 혈류내로 도입될 수 있다. 이것은 비리온을 투여하기 전에, 혈액 뇌 관문(blood brain barrier)의 삼투성 피괴를 통해 수행된다[예로서 참조; 뉴벨트, 미국 특허 번호 제 4,866,042호). 혈액 뇌 관문은 약학적으로 유효한 비독성 고장액, 예를 들어 만니톨, 아라비노오스 또는 글리세롤(Id.)을 투여함으로써 파괴될 수 있다.
지금까지 본 발명을 일반적으로 상술하였으나, 예시의 목적으로 제공된 하기의 실시예를 참고로 하여 본 발명을 더 잘 이해할 수 있을 것이다. 하기의 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
실시예 1
AD7c-NTP cDNA의 분리
cDNA 라이브러리는 말기 AD를 가진 개체의 측두엽으로부터 추출한 RNA를 사용하여 상업적으로 제조되었다(캘리포니아주 샌 디에고에 소재하는 인비트로젠 코포레이티드). 라이브러리를 pcDNA2 벡터(인비트로겐)내로 연결했다. AD7c-NTP 유전자를 분리하기 위해, 약 5 x105개의 형질 전환되고 IPTG 유도된[Sambrook, J. et al.'Molecular Cloning. A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. N.Y.] 이 콜리(E. coli) 콜로니는 사람의 PTP에 대한 폴리클로날 항체를 사용하여 스크리닝되었고[Gross, J. et al., "Isolation, Characterization, and Distribution of an Unusual Pancreatic Human Sectory Protein," J. Clin Invest. 76:2115-2126 (1985)], 이어서 항-사람의 IgG(일리노이주 알링톤 하이트에 소재하는 아메리샴)로 방사선표지되었다[Sambrook, J. et al.(1989); and Ausubel, F.M. et al., "Current Protocols in Molecular Biology," New York, NY, John Wiley ＆ Sons (1988)]. AD7c-NTP의 제한 엔도뉴클레아제 단편(XhoI-PstI; PstI-pvuⅡ; pvuⅡ-HindⅢ)은 pGem7(위스콘신주 메디슨에 소재하는 프로메가 코포레이션)내로 서브클론되고, 양쪽 가닥의 뉴클레오티드 서열은 T7 DNA 폴리머라아제[Ausubel, F.M. et al. (1988)]를 사용하는 디데옥시 연쇄 종결 방법에 의해 측정되었다. 추가 유전자에 특이성 있는 프라이머가 생성되어 단편을 중복시키는 서열을 생성했다. DNA 서열은 맥 벡터 스프트웨어 버전 4.5로 정리되었고, 마이크로 백스 Ⅱ 컴퓨터에 장착된 제네틱 컴퓨터 그룹 버전 7.3의 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 국립 생명공학 정보센터의 BLAST 네트워크 서비스를 이용하여 데이터베이스 조사를 수행했다.
AD 뇌 라이브러리로부터 분리된 AD7c-NTP cDNA의 특성
AD7c-NTP cDNA는 1442개의 뉴클레오티드를 함유하고, 올리고-dT 트랙으로 개시된다. 뉴클레오티드 서열은 제1 AUG 코돈으로 시작하는 1125-뉴클레오티드의 개방된 해독 구조, 및 AATAAA 폴리아데닐화 시그날을 가진 번역되지 않는 서열 302-뉴클레오티드를 함유하고 있다(도1). 베스트핏(Bestfit) 및 GAP 분석 결과, 개방된 해독 구조(뉴클레오티드 1-170, 423-593, 595-765 및 898-1068)내에 포매된 4개의 Alu-형 서열, 및 뉴클레오티드 898에서 개시되는 최초의 450 뉴클레오티드의 실질적인 복제물(85% 동일)의 존재를 발견했다. BLAST 데이터베이스 비교 결과, 헌팅톤 질병이 있는 개체에서 반복되는 정상적인 (CAG)n보다 긴 것을 함유하는 1T15 헌팅톤 cDNA의 배열이 없는 것을 제외하고, 헌팅톤 질병 부위, 즉 염색체 4p16.3[Gusella, J.F. et al.,"A Polymorphic DNA Marker Genetically Linked to Huntington's Disease," Nature 306:24-238(1983)](도1)과 상당 부분(67-89%) 상동성을 갖는 3개의 부위가 나타났다[The Huntington's Disease Collaborative Research Group, "A Novel Gene Containing a Trinucleotide Repeat that is expanded and Unstable on Huntington's Disease Chromosomes," Cell 72:971-983(1993)].
번역된 375 아미노산 서열은 예상 분자량 41,718 및 pI 측정치 9.89를 가지며, Ser(11.7%) 및 Pro(8.8%) 잔기가 풍부하다. 카이트-둘리틀(kyte-Doolittle) 및 슈-파스만(Chou-Fasman) 친수성 및 호프-우즈(Hopp-Woods) 표면 가능성 프로파일은 15개의 아미노산 소수성 선도 서열 및 7개의 막을 연결하는 부위를 예상한다. cDNA의 구성에 상응하여, 단백질의 연속된 분석 결과 9 내지 23 아미노산 길이의, 4개의 83% 내지 91% 동일한 중복된(1회 또는 2회) 항원성 도메인이 나타났다(도1). 단백질의 연속된 분석 결과, 21 cAMP, 칼모둘린-의존성 프로테인 키나아제 Ⅱ, 프로테인 키니아제 C, 또는 글리코겐 신타아제 키나아제 3 인산화 위치, 및 하나의 미리스틸화 위치가 입증되었다. 게다가, 하나의 tgf 모티브(잔기 #44-#53)가 검출되었다. AD7c-NTP 아미노산 서열과 유전자 은행의 데이터베이스의 비교 결과, 인테그린의 β-서브유니트(72-80%), 신경섬유종증 2 유전자의 대안적으로 스플라이싱된 A4 형(72-81%), 마이엘린 희돌기교세포 당단백질-16 전구체 단백질(70-76%), 사람의 중요한 막 단백질(55-85%), 및 사람의 사망을 촉진하는 인자 2 전구체(62-68%)와 상당 부분 상동성을 갖는 4개 부위, 및 c-rel 원시종양유전자(protooncogene)를 형질 전환시키는 단백질과 상당 부분 상동성을 갖는 2개 부위(잔기 56-84:65%; 잔기 287-295; 88%) (도1)가 나타났다. 잔기 5-24는 IGF1/인슐린 수용체 혼성 부위와 75% 동일하며, 잔기 4-24, 47-79, 109-132, 227-261 및 227-360은 사람의 형질 전환에 관계된 단백질과 57% 내지 76% 동일성을 나타낸다. 또한, 2개의 세린/트레오닌 키나아제 단백질 도메인(잔기 6-48 및 272-294)은 동일했다.
금속 킬레이트 크로마토그래피로 정제되고 융합 파트너로부터 분열된 시험관내에서 번역된 단백질 및 pTrcHis-AD7c-NTP 재조합 단백질은 SDS-PAGE 또는 웨스턴 블롯 분석에 의해 ∼39-42 kD의 분자 질량을 가졌다(도2). 또한, pcDNA 3 벡터(캘리포니아주 샌 디에고에 소재하는 인비트로젠)내로 연결된 AD7c-NTP cDNA로 형질 감염된 보스크(Bosc) 세포내에서, 하나의 ∼39-42 kD 단백질은 N3I4 모노클로날 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출되었다. 2개-부위의 면역방사법 분석 및 면역 블롯팅 연구에서, AD7c-NTP 재조합 단백질은 정제된 pTrcHis-AD7c-NTP 재조합 단백질에 의해 생성된 폴리클로날 및 모노클로날 항체 모두에 특이적인 면역반응성 결합을 나타내었다. 예비-면역 토끼 혈청, GAP-43에 대한 비-관련성 토끼 폴리클로날 항체, 또는 뎅그 바이러스 또는 FB 50에 대한 비-관련성 모노클로날 항체를 사용하였을 때, AD7c-NTP와의 면역반응성은 검출되지 않았다(도2).
실시예 2
AD7c-NTP의 시험관내 발현
안티센스 및 센스 cRNA는 KpnI 및 XhoI를 각각 함유하는 AD7c-NTP cDNA 플라스미드로부터 전사되었다. cRNA 전사는 [35S]메티오닌(메사츠세츠주 보스톤에 소재하는 듀폰-뉴잉글랜드 뉴클리어)의 존재하에 토끼 망상적혈구 용해질 시스템(캘리포니아주 라 졸라에 소재하는 스트라타젠) 중에서 번역되었고, 시험관내 번역 결과 생성물은 SDS-PAGE 및 오토라디오그래피(autoradiography)에 의해 분석되었다. AD7c-NTP cDNA는, 금속 킬레이트 크로마토그래피에 의해 융합 단백질을 분리하는 데 사용되는 5N 6-His Tag 서열을 암호화하는 pTrcHis 발현 벡터(캘리포니아주 샌 디에고에 소재하는 인비트로젠 코포레이션)내에 연결되었다. 로그 상으로 성장하는 동안 1 mM IPTG를 첨가하여 형질 전환된 이 콜리중 재조합 융합 단백질 유도를 달성했다. 융합 단백질은 ProBOND 수지(캘리포니아주 샌 디에고에 소재하는 인비트로젠 코포레이션)을 사용하여 친화성(affinity) 정제되었고[Ausubel, F.M. et al., (1988)], T7-표지 융합 파트너(노보젠) 역할을 하는 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석[Harlow, E. and Lane, D., "Antibodies: a Laboratory Manual,"cold Spring Harbor Laboratory, Cold spring Harbor, N.Y. (1988)]에 의해 검출되었다. 이어서, 이 표지를 엔트로키니아제를 사용하여 분해시켜 AD7c-NTP 단백질을 생성했다[Ausubel, R.M. et al. (eds) in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, Inc., New York, N.Y.,1994].
실시예 3
재조합 AD7c-NTP에 대한 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 생성
폴리클로날 항체는 친화성 정제된 재조합 AD7c-NTP 단백질로 면역화한 토끼에서 생성되었다. 모노클로날 항체는, 프로인트 완전 보조제 중에 유화시킨 정제된 재조합 AD7c-NTP 단백질 50 ㎍을 복강내 면역화한 Balb/c 마우스내에서 생성되었다[Harlow, E. and Lane, D. (1988); and Wands, J.R. and Zurawski, V.R., Jr., "High Affinity Monoclonal Antibodies to Hepatitis B surface Antigen (HBsAg) produced by Somatic Cell hybrids," Gastroeneology 80I:225-232 (1981)]. 6-10주 후 마우스에게 AD7c-NTP 10 ㎍을 꼬리 정맥 주사하여 추가면역화하였다.
비장세포는 SP-0 골수종 세포로 융합되었다[Harlow, E. and Lane, D.(1988) and Wands, J.R. and Zurawski, V.R., jr(1981)]. 세포는 HAT 배지에서 성장되고, 항-AD7c-NTP 항체를 생성하는 하이브리도마는 고상 면역분석에 의해 확인되었다[Bellet, D.H. et al., "Sensitive and Specific Assay for Human Chorionic Gonadotropin Based on Anti-Peptide and Anto-Glycoprotein Monoclonal Antibodies; Construction and Clinical Implication,"J. Clin. Endocrinol. Metabol. 63;1319-1327(1988)]. 폴리클로날 면역 혈청의 면역글로불린 단편 및 하이브리도마 상청액의 결합 특이성은 재조합 AD7c-NTP를 사용하는 방사면역분석(RIA) 및 웨스턴 블롯 분석, 및 AD와 노화 대조군 뇌의 웨스턴 블롯 분석과 면역조직화학적 염색에 의해 확인되었다. 25개의 하이브리도마의 판넬중에서, 3개의 MoAb는 정제된 천연 PTP 및 재조합 AD7c-NTP에 의해 유사한 레벨의 면역반응성을 나타내었고, 따라서 추가로 특성화되었다(표 1).
AD7c-NTP 모노클로날 항체에 의해 나타낸 면역반응성 프로파일
항체 웨스턴 블롯 ICC* AD 특이성** AD 뇌에서 표지의 분포
N2B10 Y: 감소 음성 N/A 무
N2I5 Y: 감소 음성 N/A 무
N2J1 유 ++ 유 신경망 섬유, 불규칙적인 신경돌기, 축삭
N2R1 무 음성 N/A 무
N2S6 Y: 감소 ++++ 유 뉴론
N2T8 Y: 감소 ++++ 유 퇴행성 뉴론, NFT, 불규칙한 신경돌기
N2U6 유 +++ 유 신경망 섬유, NFT
N3A13 무 + 무 무
N3C11 무 ++ 무 무
N3D12 무 + 무 무
N3I4 Y: 감소없음 음성 N/A 무
N2-36 무 + 유 NFT, 팽창된 신경돌기
N2-22-11 무 음성 N/A 무
폴리클로날 유 ++++ 유† 퇴행성 뉴론, 불규칙한 신경돌기
ICC*=면역세포화학; NFT= 신경원섬유의 엄킴**AD-특이성: 조직학적으로 정상인 뉴론 및 AD 조직 분획(N2S6)중 섬유, 또는 퇴행성 뉴론 세포체에서만 검출되는 면역반응성 및 AD에서 검출되는 과정†= 포름산만으로 처리한 후
MoAb로 밝혀진 AD7c-NTP 면역반응성의 프로파일(표 1):
다음에 제시된 발견은 6 개체의 말기 AD 및 5 개체의 노화 대조군 뇌의 관찰을 나타낸 것이다. 25개의 AD7c-NTP MoAb는 면역세포화학적 염색에 의해 특성화되었다. 표 1은 13개의 AD7c-NTP MoAb의 특징을 상세히 나타낸다. 다른 12개의 MoAb는 상기 표로부터 제외되었는데, 그 이유는 이들이 낮은 결합 레벨 때문에 면역세포화학적 염색에 적합하지 않거나(N=9), 또는 췌장의 가느다란 단백질과 교차-면역반응성을 나타내기(N=3) 때문이다. 추가로 특성화된 13개의 AD7c-NTP MoAb 중에서, 단지 8개만이 뉴론 핵주위부(perikarya), 신경망 섬유, 백질 섬유(축삭) 또는 AD 신경퇴행성 병변에서 면역반응성을 나타내었다. 다른 5개는 조직학적 단편에서 비면역반응성이었다.
표 1에서, AD-특이성 결합은 퇴행성 뉴론, 뉴론섬유의 엉킴, 불규칙한 팽창된 신경돌기 및 축삭의 검출, 또는 대조군의 뇌를 제외한 AD 중 조직학적으로 완전한 뉴론내의 면역반응성을 의미한다. 4개의 AD7c-NTP MoAb(N2-36, N3-C11, N2S6, N2-T8)는 피질 뉴론, 특히 층 3과 5에 있는 추체세포 중 면역세포화학적 염색의 강도를 나타내었다. 2개의 MoAb(N2-U6, N2-S6)는 신경망과 백질 섬유(축삭)를 눈에 띄게 표지했고, 5개의 MoAb(N2-U6, N3-C11, M2-S6, M2-T8, N2-J1)는 대뇌 피질 또는 백질내에 있는 A2B5+ 및 GFAP+ 원형질(제2형) 신경교성상세포를 검출했다. 2개의 AD7c-NTP MoAb(N2-U6 및 N2-T8)는 AD에서 피질 뉴론 및 팽창된 불규칙한(이영양성) 신경망 신경돌기를 강하게 표지했다. N2-36, N2-T8, N2-U6 MoAb를 사용한 경우, AD와 관계된 신경퇴행성 병변내에서 관찰된 면역반응성이 가장 현저했다. N2-T8은 세포내 신경원섬유의 엉킴뿐 아니라, 신경섬유의 엉킴이 없는 퇴행된 뉴론을 검출했고; N3-D12, N2-T8 및 N2-J1은 특히 대뇌 피질의 외층에 있는 팽창된 이영양성 축삭 및 미세한 신경염의 돌기를 표지했으며; N2-U6 및 N2-J1은 AD 뇌에서만 검출된 불안정하고 불규칙적인 실과 같은 구조를 표지했다. N2J1은 불규칙한 실과 같은 구조, 이영양성 신경돌기 및 팽창된 축삭을 매우 눈에 띄게 표지하였지만, 뉴론 핵주위부 또는 신경교 세포를 최소한으로 표지하였다. B형 간염 바이러스에 대한 음성 대조군 5C3 MoAb는 동일한 뇌의 인접한 부분과 면역반응하지 않았다.
다음의 실시예에서, 폴리클로날 및 N3I4, N2J1 및 N2U6 모노클로날 AD7c-NTP 항체가 사용되었다.
실시예 4
사람의 뇌조직
메사추세츠 제네랄 병원(MGH-ADRC)에 위치한 알츠하이머 병 연구 센터 뇌 은행으로부터 사람의 뇌조직을 입수했다. 모든 뇌는 사망 후 12시간내에 얻었으며, CERAD 기준[Mirra, S.S. et al., "the Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease(CERAD). Ⅱ. Standardization of the Neuropathological assessment of Alzheimer's disease, "Neurology 41:479-486 (1991)]]을 사용하여 AD의 조직병리학적 진단을 내렸다. AD 군(N=17)의 평균 연령은 76.3 ±8.8 세이고, 평균 뇌 중량은 1117 ±101 g이고, 평균 사후 간격은 7.3 ±3.9 시간이었다. 대조 군(N=11)은 평균 연령이 78.0 ±6.2세이고, 평균 뇌 중량은 1274 ±115 g이고, 평균 사후 간격은 8.3 ±3.6 시간이었다. 또한, 인식력의 감소와 완화한 AD 조직병리학적 병변을 가진, 초기 AD의 가능성이 있는 4개의 개체 및 확산 루이체 질병[Kosaka. K. "dementia and Neuropathology in Lewy Body Disease, "Adv. Neurol. 60:456-463 (1993)](DLBD: AD에 관계된 CNS 신경퇴행성 질병)을 가진 2개 개체를 연구했다. 신선한 전두엽 및 측두엽 조직을 사용하여 노던 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 사후의 뇌척수액(CSF) 샘플(8개의 AD; 7개의 대조군; 2 DLBD)을 사용하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 AD7c-NTP를 검출했다. 파라핀에 포매된 조직학적 단편을 사용하여 정위치 혼성화 및 면역조직화학적 염색에 의한 AD7c-NTP 유전자 발현을 국소화했다.
실시예 5
AD7c-NTP mRNA 발현의 노던 분석
AD 및 노화 대조군의 전두엽 조직(브로드만 영역 11), 정상 성인의 신장, 간, 비장, 위장관, 난소, 팔로피오 난관, 자궁, 갑상선, 폐, 골격근 및 췌장으로부터 분리된 전체 RNA 샘플(15㎍)[Ausubel F.M. et al.(1988)]을 임의의 헥사머(hexamer) 방법[Ausubel F.M. et al.(1988)]에 의해 생성된, [α32P]dCTP로 표지된 AD7c-NTP cDNA 탐침(특이적 활성 ∼108dpm/㎍ DNA) 2 x 106dpm/ml를 사용하여 노던 혼성 분석하였다. 이 블롯은 차후에 0.5% SDS[Sambrook, J. et al.(1989); Ausubel, F.M. et al.(1988)]을 함유하는 5 x SSC(1 x SSC는 0.15 M NaCl과 0.015 M 나트륨 사이트레이트를 합한 것)의 희석액, 및 65℃의 0.1 x SSC/0.5% SDS 내에서 차례로 세척되었다. RNA 부하(loading)를 평가하기 위해, 이 블롯에서 탐침을 제거하고, 18s 리보솜 RNA에 상응하는, 10 배 몰 과량의 [γ32P]ATP-표지된 합성 30량체로 혼성화시켰다[de la Monte, S.M. and Bloch, K.D. (1996)]. 그 결과는 오토라디오그래피 및 덴시토메트리(ImageQuant, Molecular Dynamics, Inc)에 의해 분석되었다.
결과: AD 및 노화 대조군 뇌에서 AD7c-NTP mRNA의 발현
노던 블롯 혼성화 연구에서, AD7c-NTP cDNA 탐침은 성인의 전두엽 및 측두엽 조직에서 1.4 kB 및 0.9 kB mRNA 전사를 검출했으나, 췌장, 신장, 간, 비장, 위장관(다양한 부위), 난소, 팔라피오 난관, 자궁, 갑상선, 폐, 골격근, 고환 및 흉선에서는 음성이었다. 1.4 kB 및 0.9 kB AD7c-NTP mRNA 전사 모두가 AD 및 노화 대조군의 뇌에서 검출되었으나, 발현 레벨은 AD에서 증가되었다. 부하 및 비-특이적 분해에서의 차이를 수정하기 위해 18S RNA 시그날에 대해 표준화된 수치를 가지고 불포화된 오토라디오그램의 덴시토메트리 분석 결과, 정상적인 노화 대조군 뇌에 비해 AD의 1.4 kB(P〈0.01) 및 0.9 kB(P〈0.05) AD7c-NTP 전사 모두는 현저히 높은 평균 레벨을 나타내었다.
실시예 6
역전사 효소-폴리머라아제 연쇄 반응 증폭(RT-PCR) 연구
사람의 뇌, PNET1 및 PNET2 사람 CNS 뉴론 세포계[The, I. et al., "Nertufibromatosis type 1 Gene Mutation in Neuroblastoma," Nature Genet. 3:62-66 (1993)](양성 대조군), SH-Sy5y 사람의 신경아세포종 세포[Biedler, J.L et al.,"Morphorology and Growth, Tumorigenicity, and Cytogenetics of Human Neuroblastoma Cells in Continuous Culture," Cancer Res. 33:2543-2652 (1973)], 및 사람의 췌장과 간(음성 대조군)으로부터 분리된 전체 RNA(2 ㎍)의 샘플은 임의의 헥사머 프라이머[Ausubel, F.M. (1988)] 및 수퍼스크립트TM역전사효소(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재하는 깁코-BRL)를 사용하여 역전사되었다. cDNA 생성물(10%)은 프라이머[(459-480) 5′TGTCCCACTCTTACCCAGGATG (서열 번호 5) 및 (849-826) 5′AAGCAGGCAGATCACAAGGTCCAG (서열 번호 6)]를 사용하여 AD7c-NTP 서열을 검출하기 위해 PCR 증폭되었다. β-액틴 대조군 프라이머[Dallman, M.J. and Porter, A.C.G., "Semi-Quantitative PCR for the Anylysis of Gene Expression," In; PCR A Practical Approach, M.J. McPherson et al. (eds.), IRL Oxford University Press, Oxford, pp. 215-224 (1991)] [5′AATGGATGACGATATCGCTG (서열 번호 7); 5′-ATGAGGTAGTCTGTCAGGT (서열 번호 8)]는 모든 연구에 포함되었다. PCR 증폭 순환(cycle) 각각은 95℃에서 30초간 변성, 60℃에서 30초간 가열 냉각 및 72℃에서 1분간 확장으로 구성되었다. 30회의 순환 및 72℃에서의 10분간 최종 확장 후, PCR 생성물의 10%는 아가로오스 겔 전기영동, 및 AD7c-NTP cDNA의 뉴클레오티드 702-720에 상응하는 [γ32P]dATP-표지된 올리고뉴클레오티드 탐침을 사용하는 서던 혼성화에 의해 분석되었다. 잔존하는 PCR 생성물은 전기영동적으로 단편화되어 PCRⅡ TA 클로닝 벡터(캘리포니아주의 샌 디에고에 소재하는 인비트로젠)내로 연결되었다. 6개의 뇌 샘플로부터 분리된 클론의 뉴클레오티드 서열은 디데옥시 연쇄 종결 방법[Sambrook, J. et al., (1989); Ausubel, F.M. (1988)]에 의해 측정되었다.
사람 뇌에서 AD7c-NTP mRNA의 발현은 6개의 AD 및 5개의 노화 대조군의 뇌(전두엽)로부터 분리된 RNA의 RT-PCR 증폭에 의해 증명되었다. 예상 390 뉴클레오티드 PCR 생성물을 모든 샘플에서 얻었다. PCR 생성물에 대한 특이성은 내부 서열에 상응하는 [32P]-표지된 올리고뉴클레오티드 탐침을 사용하는 서던 블롯 분석, 및 5개의 AD의 뇌로부터 클론된 390-뉴클레오티드 PCR 생성물의 핵산 서열이 도1의 밑줄친 서열과 동일하다는 것을 측정함으로써 입증되었다. RT-PCR 증폭 연구에서, AD7c-NTP PCR 생성물은 사람의 췌장 또는 간을 제외한 PNET1, PNET2 및 SH-Sy5y 뉴론 세포로부터 분리된 RNA를 사용하여 또한 검출되었다.
실시예 7
정위치(in-siru) 혼성화
AD 및 대조군의 뇌의 파라핀 단편(10 ㎛ 두께)은 KpnI 또는 XhoI로 직선화된 cDNA 주형으로부터 생성된 안티센스 및 센스 (음성 대조군) AD7c-NTP cRNA 탐침[de la Monte S.M. et al (1995); de la Monte, S.M. and Bloch, K.D. (1996)]으로 혼성화되고, T7 DNA 의존성 RNA 폴리머라아제에 대해 SP6을 사용하는 [11-디곡시게닌]UTP로 표지되었다[Melton, D.A. et al."Efficient in Vitro Synthesis of Biologically Active RNA and RNA Hybridization Probe from Plasmids Containing a Bacteriophage SP6 Promoter," Nucl. Acids Res. 12:7035-7056 (1984)]. 특이적으로 결합된 탐침은 알카리성 포스파타아제가 접합된 양(sheep)의 F(ab′)2항-디곡신게닌(베링거-만하임 인코포레이티드) 및 X-포스페이트/5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트/니트로-블루-테트라졸리움-클로라이드으로 검출되었다(de la Monte, S.M. and Bloch, K.D. (1996)]. 탐침 특이성은 [α32P]UPT로 표지된 동일한 cRNA 탐침을 사용하는 뇌의 노던 블롯 분석에 의해 확인되었다.
결과; 사람의 뇌에서 AD7c-NTP mRNA의 세포의 국소화
[11-디곡시게닌]UTP-표지된 안티센스 cRNA 탐침을 사용하는 정위치 혼성화 연구 결과, AD(N=6) 및 노화 대조군(N=4) 뇌 양자에 있는 전두엽(브로드만 영역 11) 및 측두엽(브로드만 영역 21) 피질 뉴론에서 AD7c-NTP와 관계된 mRNA가 입증되었다(도3). 그러나, 암시야 조명법 현미경 관찰 결과, 노던 블롯 분석 결과에 상응하여, 노화 대조군 뇌에 비해 AD내 측두엽 및 전두엽 양자에서 AD7c-NTP mRNA 발현 레벨의 현저한 상승이 나타났다. 낮은 레벨의 AD7c-NTP mRNA 전사도 AD의 피질 및 백질 신경교 세포에서 또한 검출되었다. AD7c-NTP mRNA 전사는 뇌혈관 내에서 검출되지 않았고, 특이적인 혼성화 시그날은 디곡시게닌-표지된 센스 가닥 cRNA 탐침으로 혼성화된 임의의 표본에서 관찰되지 않았다.
실시예 8
AD7c-NTP 발현의 면역검출
웨스턴 면역 블롯팅 연구[Harlow, E. and Lane, D. (1988)]는 RIPA 완충액 중에 균질화시킨 사후의 전두엽 및 측두엽 조직, 및 다양한 비-CNS 조직에서 생성된 단백질 추출물(60 ㎍ 샘플)을 사용하여 수행되었다[Ausubel, F.M. et al (1988)]. 게다가, 사후의 또는 생전의 뇌척수액 샘플 40㎕는 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가되었다. 이 블롯은 토끼 폴리클로날(1:800) 또는 N2I3, N2U6 또는 N2J1 마우스 모노클로날(5 ㎍/ml) 항-AD7c-NTP으로 탐침되었다. 항체 결합은 1:25,000으로 희석된, 호오스래디시 퍼옥시다아제-접합된 2차 항체(피어스) 및 수퍼시그날 강화 화학형광시약(피어스)으로 검출되었다. AD7c-NTP 발현 레벨은 오토라디오그램(ImageQuant; Molecular Dynamics Inc., Sunnyvale, CA)의 용량 덴시토메트리 주사(走査)에 의해 정성되었다. AD7c-NTP 면역반응성의 세포의 국소화는 AD 및 노화와 관계된 대조군의 뇌로부터 얻은 전두엽(브로드만 영역 11) 및 측두엽(브로드만 영역 21)의 파라핀이 포매된 조직학적 단편내에서 입증되었다. 이 단편은 N2J1 및 N2U6 AD7c-NTP 모노클로날 항체를 사용하는 아비딘-바이오틴 호오스래디시 퍼옥시다아제 복합체 방법[de la Monte, S.M. et al. (1995); and de la Monte, S.M. and Bloch, K.D. (1996)]에 의해 면역염색되었다. 인접한 단편은 양성 대조군으로서 신경교 섬유의 산성 단백질에 대한 모노클로날 항체, 및 음성 대조군으로서 뎅그(Dengue) 바이러스에 대한 모노클로날 항체로 면역염색되었다.
결과: 웨스턴 블롯에 의한 AD7c-NTP 항체 결합의 특징
사람의 전두엽 및 측두엽으로부터 추출된 단백질의 웨스턴 블롯팅 연구에서, 15개의 모노클로날 항체중 11개 및 폴리클로날에 의해 AD7c-NTP 면역반응성의 광범위한 ∼39-45 kD 밴드가 검출되었다. 단백질이 15% 래믈리 겔에서 전기영동적으로 분획되고 N3I4, N2U6 또는 N2J1 모노클로날 항체로 탐침되었을 때, ∼39-45 kD AD7c-NTP-면역반응성 분자는 분해되어 다른 AD7c-NTP 인산화도를 나타낼 수 있는, 3 또는 4개의 밀집된 집단의 밴드를 이룬다(도 2E). 또한, 폴리클로날 및 4개의 모노클로날 항체는 뇌에 있는 18-21 kD AD7c-NTP-면역반응성 단백질을 검출했다(도2E). 비-CNS 조직을 웨스턴 블롯 분석한 결과, AD7c-NTP 항체와 특이성 있는 결합을 나타내지 않았다.
실시예 9
시험관내 발현 연구
AD7c-NTP cDNA는 CMV 프로모터를 함유하는, pcDNA3 포유동물의 발현 벡터(캘리포니주 샌 디에고에 소재하는 인비트로젠)내에 연결되었다. SH-Sy5y 세포를 pcDNA3-AD7c-NTP 또는 pcDNA3(비어있는 벡터, 음성 대조군)으로 형질 감염시키고, G418로 선별했다. 안정하게 형질 감염된 세포계로 성장 특성, 형태, 및 AD7c-NTP의 발현에 대해서 검사한다. DNA내 [3H]티미딘 혼입을 측정하고 배양물에서 생존가능한 세포의 농도를 측정함으로써 세포의 성장을 평가했다. 챔버슬라이드 내에서 성장한 세포는 N3I4 모노클로날 항체를 사용하여 면역염색되었다. 또한, AD7c-NTP 발현은 N3I4 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가되었다.
결과: 뉴론 세포내 AD7c-NTP의 과다-발현은 알츠하이머 병의 특징인 세포 소멸, 신경염의 발생을 야기한다
pcDNA3-AD7c-NTP로 안정하게 형질 감염된 SH-Sy5y 뉴론 세포내 AD7c-NTP의 과다-발현 결과, DNA 합성 레벨은 정상 또는 상승되었으나, 배양물내에 있는 생존가능한 세포의 밀도는 현저히 감소되었다(도5). 이 결과는 다른 뉴론 세포 및 다른 발현 벡터를 사용해서 재생산가능했다. 배양물내 세포 밀도의 감소는 세포 괴사의 증가에 기인했다. 부수적으로 증가된, AD7c-NTP 형질 감염된 세포내 핵의 p53 발현은 세포 괴사(cell death)가 세포 소멸(apoptosis)에 의해 매개될 수 있다는 것을 암시한다. pcDNA3으로 형질 감염된 SH-Sy5y 세포의 집합 배양물은 돌기가 없거나 또는 거의 없는 둥근 또는 가늘고 긴 형태의 세포를 함유하고 있었다(도6A). 대조적으로, pcDNA3-AD7c-NTP로 형질 감염된 SH-Sy5y 세포는 대부분의 세포에서 검출되는 미세한 상호연결된 돌기를 가진 광범위한 신경돌기의 성장을 나타내었다(도6B-6D). 또한, pcDNA3-AD7c-NTP로 형질 감염된 배양물은 타이판 블루 염료를 함유하는, 다수의 둥근, 굴절된 부유 세포(죽은 세포)를 항상 함유하고 있었다. N3I4 모노클로날 항체를 사용하는 정지된 배양물을 면역세포화학적 염색을 한 결과, pcDNA3-AD7c-NTP로 형질 감염된 SH-Sy5y 세포의 세포체 및 세포돌기가 강하게 표지되었고(도6F 및 6G), pcDNA3(비어있는 벡터)로 형질 감염된 SH-Sy5y 세포에서는 면역반응성이 없었다(도6E). 이들 연구 결과, 형질 감염된 뉴론 세포내 AD7c-NTP의 과다 발현은 알츠하이머 병 신경퇴행의 2가지 주된 특징인 신경염의 발생 및 세포 괴사를 증가시킨다는 것이 입증되었다. 그러므로, AD7c-NTP를 과다 발현하는 형질 감염된 세포계 및 유전자 변형동물은 AD7c-NTP 발현을 감소시키는 데 유효할 가능성이 있는 약물을 선별함으로써 알츠하이머 병의 발병을 치료 또는 예방하는 데 사용될 것이다.
실시예 10
AD 및 노화 대조군의 뇌내 AD7c-NTP 단백질의 발현
AD 및 노화 대조군 뇌의 웨스턴 블롯 분석 및 면역조직화학적 염색은 N3I4, N2U6 및 N2J1 모노클로날 AD7c-NTP 항체를 사용하여 수행되었다. AD 및 노화 대조군의 뇌에서, ∼39-45 kD 단백질은 3개의 모노클로날 항체 모두에서 검출되었다. 또한, ∼18-21 kD 단백질은 N2U6 및 N2J1 항체에서 검출되었다. 오토라디오그램의 덴시토메트리 분석 결과, 노화 대조군의 전두엽 조직에 비해 AD내의 ∼39-45 kD AD7c-NTP의 레벨이 현저히 상승되었다는 것이 입증되었다(도2D). 또한, ∼18-21 kD AD7c-NTP-면역반응성 단백질의 발현도 AD에서 증가되었으나, 연구는 이들 분자가 ∼39-45 kD AD7c-NTP의 분해 생성물을 나타내는지, 또는 다른 cDNA에 의해 암호화되는 특이한 단백질을 나타내는지의 여부를 아직 결정하지 못했다. 소집단에서, 초기와 말기의 AD를 비교하면, 말기 질환을 가진 뇌에서 AD7c-NTP 면역반응성의 레벨이 높았다(도2E). N3I4 항체를 사용하는 경우, 웨스턴 블롯 분석으로 사후의 CSF에서 ∼39-45 kD AD7c-NTP 분자의 출현이 검출되고, 노화 대조군 샘플에 비해 AD중 레벨이 높았다(도2F). 폴리클로날 및 7개의 특이적인 모노클로날 항체에 의한 면역조직화학적 염색 연구는 AD 및 대조군 뇌에 있는 뉴론, 신경망 섬유 및 백질 섬유내에 AD7c-NTP 면역반응성을 국소화했다. 면역조직화학적 염색 연구에서 N2U6 및 N2J1 항제는 완전한 뉴론뿐 아니라 AD 뇌에 있는 퇴행성 피질 뉴론 및 이영양성 신경돌기에서 강한 면역반응성을 나타내었으나, 노화 대조군 뇌에서는 면역반응성이 낮은 레벨이거나 또는 없었다(도4). 재조합 AD7c-NTP 단백질을 가진 1차 항체의 탈락 또는 예비흡착, 또는 비관련성 1차 항체를 적용하는 경우(음성 대조군), 음성 면역염색 결과가 또한 도출되었다. 모든 뇌의 단편은 신경교 섬유의 산성 단백질에 대한 모노클로날 항체과 양성 면역반응성을 나타내었다(양성 대조군).
이들 연구 결과, 노화 대조군 뇌에 비해 AD에서 AD7c-NTP 발현 레벨의 상승, 및 정위치 혼성화 및 면역조직화학적 염색에 의해 AD 뇌의 뉴론내에 국소화된 비정상적인 AD7c-NTP 유전자 발현이 입증되었다. 2가지의 개별적인 mRNA 전사, 및 2개 이상의 별개 종류의 단백질이 뇌에서 검출되었고, AD7c-NTP에 상응하는 mRNA 및 단백질 레벨은 AD에서 증가되었다. 본 발명자들은 아직 더 작은 전사 및 단백질의 종류가 별개인지 또는 하나의 유전자의 교호적으로 스플라이싱된 형태를 나타내는지의 여부를 아직 결정하지 못했다. cDNA가 하나의 AD 뇌에서 분리된 RNA로 제조한 라이브러리로부터 분리되었으나, RT-PCR 연구로 6개의 다른 AD 뇌에서 동일한 서열이 존재한다는 것을 확인했다. AD7c-NTP cDNA는 사람 췌장 단백질과 유의성 있는 초기 서열 상동성을 나타내지 않기 때문에[Watenabe, T. et al., "Complete Nucleotide Repeat that is expanded and Unstable on Huntington's Disease Chromosomes." Cell 72:971-983 (1993)], AD7c-NTP 분자와 폴리클로날 항체의 교차-반응성은 배좌 에피토프(conformational epitope)를 통해서 일어난다. 조직학적으로 완전한 뉴론과 퇴행성 뉴론, 및 세포 돌기 모두에서 AD7c-NTP의 발현 증가가 관찰되었고, 최근의 연구결과는 AD7c-NTP 단백질 발현이 AD 신경퇴행의 초기에 일어난다는 것을 제안하고 있다.
실시예 11
시험관내 약물 선별 시스템
AD7c-NTP를 Lac-스위치 발현 벡터(스트라타젠)내로 클론하고, CYZ 뉴론 세포를 안정하게 그 구조체를 사용하여 형질 전환시켰다. IPTG로 단백질 발현을 유도한 후, 소수의 세포계를 선별하여 다양한 레벨, LacA-LacF로 AD7c-NTP를 발현시켰다. 뉴론 세포에 대한 AD7c-NTP 발현의 효과(예: 형태, 유전자 발현, 생존력의 변화)를 측정하기 위해 실험을 수행하였고, 그로 인해 AD의 치료에 사용될 가능성이 있는 약제를 시험관내에서 선별하는 데 유용한 마커를 생성하였다.
마이크로타이터 면역세포화학적 ELISA 분석(Microtiter Immunocytochemical Elisa Assay; MICE)에 의해 발현 레벨을 측정하였다. 간단히, 104개/웰의 세포가 96-웰 플레이트내에 식종되고, 6-18시간동안 AD7c-NTP를 발현시키기 위해 유도되었다; 또한 어떤 실험에서, 세포는 비슷한 시간동안 독소 또는 보호 약제에 노출되었다. 처리 기간의 종반부에, 세포는 ABS 과정에 따라 고정, 투과 및 적절한 항체로 면역염색되었다. 가용성 색소(chromagen)를 사용하여 세포를 배양하고, 2M H2SO4를 사용하여 반응을 중단하고, 자동 ELISA 판독 기계내에서 색소 흡착을 측정함으로써 정량을 수행했다. 쿠마지(Coommassie) 블루로 염색한 후, 면역반응성(예: 결합된 색소) 대 쿠마지 블루 흡착의 비율을 측정하고(MICE 단위), 그 결과를 그래프화했다. 또 다르게는, 면역반응성은 침전 색소(예: DAB, TruBlue 또는 AEC)를 사용하여 또한 측정될 수 있다.
MICE 분석을 위한 배양 및 처리 후에 세포 생존력 측정 실험을 위해 배양 배지를 크리스탈 바이올렛/PBS/포르말린 용액으로 대체했다. 염색 후, 세포를 철저히 세척하고, PBS/1% SDS 용액으로 용해시키고, 자동 ELISA 판독기를 사용하여 흡착을 측정하였다. 결과는 생존력 백분율로서 그래프화되었다.
결과: 뉴론 세포내 AD7c-NTP의 과다 발현이 유전자 발현, 세포 생존력 및 독소 과민증의 변화를 야기한다
AD7c-NTP의 발현은 AD에 관계된 유전자 발현의 변화(Tau, bA4 아밀로이드), 신경염의 발생 (시냅토피신) 및 세포 소멸(p53, SC95-Fas, NO-Tyr, NOS3)을 야기한다(도7A-7C 및 도8A-8D). 도7A-7C에서는, AD7c-NTP 유도 후 24시간이 경과하였을 때, 발현된 변화의 백분율을 표시된 유전자에 대해 나타낸다. AD7c-NTP 발현이 없는 경우(도7A), LacA-대조군, 비발현 세포내에서 유전자 발현의 변화는 없거나 거의 관찰되지 않는다; 반면, 다른 레벨의 AD7c-NTP(B6)를 발현하도록 유도된 LacB(도7B) 및 LacF(도7C) 세포를 사용하여 수행한 유사한 실험 결과, 유전자 발현의 현저한 변화가 입증되었다. 예를 들어, NOS3은 LacA-대조군 세포(도7A)에 비해 LacB-B6 실험(도7B)에서 정상레벨의 거의 2배로 발현된다.
도8A-8D는 유전자 발현의 변화가 AD7c-NTP 유도 레벨에 따라 좌우된다는 것을 입증한다. NTP(도8A), 시냅토피신(도8B), Tau(도8C) 및 p53(도8D) 유전자에 대한 결과는 안정하게 형질 감염된 CYZ 뉴론 세포내에 AD7c-NTP 발현의 IPTG 유도 작용으로 발현의 변화 백분율로서 제시되어 있다. LacB(충전된 정사각형) 및 LacF(개방된 원형) 세포를 24시간동안 표시된 양의 IPTG(1-5 mM)에 노출시켰다. 이들 데이터는, 증가된 IPTG 농도가 모든 검사된 유전자의 상승 조절(up-regulation)을 유발한다는 것을 나타낸다.
2가지의 분석을 사용하여 CYZ 뉴론 세포내 AD7c-NTP 발현의 효과를 측정했다: MTT 분석에 의해 대사 활성을 측정했고(도9A), CV 생존력 분석에 의해 세포 괴사를 측정했다(도9B). 결과는 미처리된 대응하는 대조군 배양에 대해 IPTG 유도후 24시간 경과시의 MTT 활성 또는 세포 생존력 변화의 백분율로서 나타낸다. IPTG 유도 후 6개의 다른 클론, 즉 LacA-LacF를 분석하고(B6), AD7c-NTP가 결핍된 LacA 대조 세포와 비교했다. 검사된 6개의 클론 모두에 대해서, AD7c-NTP 발현을 자극한 결과 대조군 세포에 비해 실질적으로 감소된 대사 활성을 얻는다(도9A). LacB-B6 및 LacF 세포에서 세포 괴사가 유도되었고, LacA-B6 및 LacE-B6 클론에서 세포 생존력의 감소가 관찰되었다.
AD7c-NTP를 발현하는 세포의 세포 생존력 감소는 산화적 스트레스에 의해 악화된다. LacB 및 LacF 세포를 3 mM IPTG(B6)로 24시간 또는 48시간동안 유도시키고, 6시간 또는 24시간동안 산화적 스트레스를 증가시키는 독소에 노출시켰을 때(도10A 및 도10B 각각), 세포 생존력은 LacA-대조군인 비발현 세포에 비해 현저히 감소되었다. 도10A 및 도10B에 도시된 결과로부터, 더 장시간의 AD7c-NTP에 의해 유도된 발현, 및 과산화수소(H2O2) 및 디에틸디티오카르바민산(DDC)에 대한 더 장시간의 노출이 각각 세포 생존력을 감소시키고 과민증을 증가시키는 것이 입증되었다.
세포 생존력을 감소시키는 원인을 결정하기 위해, 안정하게 형질 감염된, AD7c-NTP를 발현하는 CYZ 뉴론 세포내의 세포 소멸을 정량적으로 측정하였다; 결과는 도11에 도시되어 있다. 세포 괴사의 세포 소멸적 메커니즘의 특징인, 단편화된 DNA내로 표지의 주형-의존성 혼입을 측정하기 위해,32dCTP의 존재하에 세포를 배양함으로써 세포 소멸의 정도를 측정하였다. 3 mM 유도된(B6에 나타냄) LacA, LacB 및 LacF 세포와 대조군(미유도된, 형질 감염된 세포)을 비교하면, AD7c-NTP의 발현이 세포성 DNA내로32dCTP 표지의 혼입을 증가시키다는 것(세포 소멸의 증가)이 명확히 나타난다. IPTG 유도된 세포계 사이의 표지의 혼입에 있어서 편차는 AD7c-NTP 발현 레벨에 있어서의 차이에 기인한다.
확립된 시험관내 시스템은 AD7c-NTP 발현 및, 표면상 AD 진행에 의해 영향을 받는 변화를 조절하거나 중화시키는 약제를 선별하기 위한 수단을 제공한다. AD7c-NTP 발현은 소수의 뉴론세포에서 산소 자유 라디칼을 형성시키는 산화 질소 신타아제의 상승 조절을 유발한다. 도12에서 도시된 실험은 AD7c-NTP에 의해 유도된 산화적 스트레스가 약제에 의해 중화될 수 있다는 것을 입증한다. 결과는 대조군, 즉 비유도된 세포에 대해 실험군(AD7c-NTP 유도된 것)의 생존력 변화의 백분율의 비로서 표현된다. 도12에서, AD7c-NTP로 안정하기 형질 감염된 CYZ 세포는 유도되어 AD7c-NTP를 발현하도록 유도되고, 다양한 약제에 노출된다. 과산화수소(H2O2) 및 디에틸디티오카르바민산(DDC)은 세포 괴사를 악화시키는 반면, 피로글루타메이트(PG)(및 L-NAME 및 L-아르기닌)과 같은 약제는 AD7c-NTP 발현에 따른 산화 질소 신타아제 독성을 억제하거나 또는 감소시킨다.
전술한 것으로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특징을 쉽게 확인할 수 있고, 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않는다면 부적당한 실험 없이 다양한 용도 및 조건에 적합하도록 본 발명을 다양하게 변화 및 개질시킬 수 있다. 본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 공보는 그 자체로 참고로 포함된 것이다.
서열 목록
(1) 일반 정보:
(ⅰ) 출원인: 미국 메사추세츠주 02114 보스톤 프루트 스트리트 더 제너럴 호스피탈 코포레이션
출원인/발명자: 디 라 몬테, 수잔 및 원즈, 잭 알
(ⅱ) 발명의 명칭: 알츠하이머 병의 치료 또는 예방에 유효한 약물을 선별하기 위한 유전자 변형동물 및 세포계
(ⅲ) 서열의 수: 14
(ⅳ) 통신 주소:
(A) 수신인: 스테른, 케슬러, 골드슈타인 ＆ 폭스 P.L.L.C.
(B) 스트리트: 1100 뉴욕 애비뉴, 슈트 600
(C) 도시: 워싱턴
(D) 주: 콜럼비아주
(E) 국가: 미국
(F) 우편 번호: 20005-3934
(ⅴ) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 작동 체계: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release # 1.0, Version # 1.30
(ⅵ) 현 출원 데이터:
(A) 출원 번호: PCT/US98/03685
(B) 출원일: 1998. 2. 26
(C) 분류: C07H 21/02
(ⅶ) 우선권 데이터:
(A) 출원 번호: US 60/038,908
(B) 출원일: 1997. 2. 26
(ⅷ) 대리인 정보:
(A) 성명: 에스몬드, 로버트 더블유
(B) 등록 번호: 32,893
(C) 참조/사건 번호: 0609.537PC01
(ⅸ) 원격 정보:
(A) 전화: 202-371-2600
(B) 팩스: 202-371-2540
(2) 서열 번호 1에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 1442 염기쌍
(B) 서열 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 형태: 양형태(both)
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅸ) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: CDS
(B) 존재위치: 15..1139
(ⅹⅰ) 서열 표현: 서열 번호 1:
[서열 1A]
[서열 1B]
(2) 서열 번호 2에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 375 아미노산
(B) 서열 유형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅹⅰ) 서열 표현: 서열 번호 2:
[서열 2A]
[서열 2B]
(2) 서열 번호 3에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 1381 염기쌍
(B) 서열 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 형태: 양형태
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅹⅰ) 서열 표현: 서열 번호 3:
[서열 3A]
[서열 3B]
(2) 서열 번호 4에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 1418 염기쌍
(B) 서열 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 형태: 양형태
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅹⅰ) 서열 표현: 서열 번호 4:
[서열 4]
(2) 서열 번호 5에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 22 염기쌍
(B) 서열 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅹⅰ) 서열 표현: 서열 번호 5:
[서열 5]
(2) 서열 번호 6에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 서열 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅹⅰ) 서열 표현: 서열 번호 6:
[서열 6]
(2) 서열 번호 7에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 서열 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅹⅰ) 서열 표현: 서열 번호 7:
[서열 7]
(2) 서열 번호 8에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 19 염기쌍
(B) 서열 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅹⅰ) 서열 표현: 서열 번호 8:
[서열 8]
(2) 서열 번호 9에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 서열 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅹⅰ) 서열 표현: 서열 번호 9:
[서열 9]
(2) 서열 번호 10에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 서열 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅹⅰ) 서열 표현: 서열 번호 10:
[서열 10]
(2) 서열 번호 11에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 서열 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅹⅰ) 서열 표현: 서열 번호 11:
[서열 11]
(2) 서열 번호 12에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 14 염기쌍
(B) 서열 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅹⅰ) 서열 표현: 서열 번호 12:
[서열 12]
(2) 서열 번호 13에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 14 염기쌍
(B) 서열 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅹⅰ) 서열 표현: 서열 번호 13:
[서열 13]
(2) 서열 번호 14에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특성:
(A) 길이: 14 염기쌍
(B) 서열 유형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: cDNA
(ⅹⅰ) 서열 표현: 서열 번호 14:
[서열 14]
출원인의 대리인의 파일 참조 번호 0609.437PC01 국제 출원 번호: PCT/US98/03685TBA
미생물 기탁 증명서(PCT Rule 13bis)
A. 다음에 작성된 증명서는 명세서 5 페이지의 11째줄에 언급된 미생물에 관한 것이다
B. 기탁의 증명 추가 기탁물은 첨부한 시트에서 증명된다
기탁 기관의 명칭: AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION
기탁 기관의 주소(우편 번호와 국가명 포함): 미국 매릴랜드주 20852 록빌 파크로운 드라이브 12301
기탁일: 1993. 3. 16 수탁 번호: 69262
C. 추가 증명(불필요한 경우 공백으로 하시오) 이 정보는 첨부한 시트에 계속된다
Escherichia coli: AD10-7-DH1
D. 증명을 필요로 하는 국가의 지정(이 증명이 모든 지정국에 대한 것이 아닌 경우)
E. 증명서의 다른 제공(불필요한 경우 공백으로 하시오)
아래에 제시된 증명서은 이후 국제 기관에 제출될 것이다(증명서의 일반적인 종류를 구체화하시오, 예를 들어 "기탁의 수탁 번호")
수리 관청용 국제 사무국용
이 시트는 국제 출원과 함께 수리되었습니다 이 시트는 국제 수리 관청에 의해 수리되었습니다
권한을 가진 자 권한을 가진 자
Form PCT/RO/134 (1992년 7월)

Claims (34)

  1. 서열 번호 1의 DNA 분자 또는 그와 40% 이상 상동성을 갖는 DNA 분자, 또는 그 단편을 포함하는 DNA 구조체로서, 상기 DNA 분자가 이종(heterologous) 신경 특이성 프로모터의 조절하에 있는 DNA 구조체.
  2. 제1항에 있어서,
    벡터내에 함유된 DNA 구조체.
  3. 제1항에 있어서,
    비리온에 함유된 DNA 구조체.
  4. 제1항에 있어서,
    DNA 분자가 서열 번호 1을 가진 DNA 구조체.
  5. 제1항의 DNA 구조체로 형질 전환된 숙주 세포.
  6. 제5항에 있어서,
    뉴론 세포인 숙주 세포계.
  7. 생식 세포 및 체세포 모두 서열 번호 1의 DNA 분자 또는 그것과 40% 이상 상동성을 갖는 DNA 분자를 포함하는 유전자 변형된(transgenic), 사람을 제외한 동물.
  8. 제7항에 있어서,
    각각의 생식 세포 및 체세포에 함유된 DNA 분자가 서열 번호 1을 가지는 유전자 변형된, 사람을 제외한 동물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 DNA 분자에 의해 암호화된 단백질이 동물의 뇌에서 과다 발현되는, 유전자 변형된, 사람을 제외한 동물.
  10. 알츠하이머 병, 신경외배엽의 종양, 악성 성상세포종 및 신경교아세포종을 치료 또는 예방하는 데 사용될 가능성이 있는 후보 약물을 선별하기 위한 시험관내 방법으로서, 다음을 포함하는 방법:
    (a) 후보 약물을 제5항의 숙주 세포계에 접촉시키는 단계, 및
    (b) 후보 약물을 접촉시키지 않은 대조 세포계에 비해 후보 약물에 기인하는 다음 중 하나 이상을 검출하는 단계:
    (ⅰ) DNA 구조체에 의해 암호화되는 단백질 발현의 억제 또는 예방;
    (ⅱ) DNA 구조체에 의해 암호화되는 단백질의 분해의 증가; 또는
    (ⅲ) 숙주내 신경염의 발생, 신경 세포 괴사, 퇴행성 뉴론, 신경원섬유의 엉킴 또는 불규칙한 팽창된 신경돌기와 축삭 중 하나 이상의 빈도의 감소.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 단백질이 서열 번호 2를 가지는 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 단백질이 상기 숙주 세포에 의해 과다 발현되는 방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 세포가 뉴론 세포인 방법.
  14. 알츠하이머 병, 신경외배엽의 종양, 악성 성상세포종 및 신경교아세포종을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 가능성이 있는 후보 약물을 선별하기 위한 시험관내 방법으로서, 다음을 포함하는 방법:
    (a) 제7항의 유전자 변형동물에게 후보 약물을 투여하는 단계, 및
    (b) 후보 약물을 투여받지 않은 대조 동물에 비해 후보 약물에 기인하는 다음 중 하나 이상을 검출하는 단계:
    (ⅰ) 상기 동물에 함유된 DNA 구조체에 의해 암호화되는 단백질 발현의 억제 또는 예방;
    (ⅱ) 상기 동물에 함유된 DNA 구조체에 의해 암호화되는 단백질의 분해의 증가; 또는
    (ⅲ) 숙주내 신경염의 발생, 신경 세포 괴사, 퇴행성 뉴론, 신경원섬유의 엉킴 또는 불규칙한 팽창된 신경돌기와 축삭 중 하나 이상의 빈도의 감소.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 동물에 함유된 DNA 구조체가 서열 번호 1인 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 동물에 함유된 DNA 구조체에 의해 암호화되는 단백질이 상기 동물의 뇌에서 과다 발현되는 방법.
  17. 서열 번호 1의 뉴클레오티드 150-1139에 상응하는 NTP mRNA 서열에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  18. 제17항에 있어서,
    15-40량체인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  19. 제17항에 있어서,
    서열 번호 9 내지 11로 구성된 군에서 선택되는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  20. 제17항에 있어서,
    데옥시리보핵산인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  21. 제17항에 있어서,
    데옥시리보핵산 포스포로티오에이트인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  22. 제17항에 있어서.
    데옥시리보핵산 또는 데옥시리보핵산 포스포로티오에이트의 유도체인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  23. 제17항의 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물.
  24. 서열 번호 1의 뉴클레오티드 150-1139에 상응하는 NTP mRNA 서열에 상보적인 표적 서열을 포함하는 리보자임.
  25. 제24항의 리보자임 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물.
  26. 서열 3′X5′-L-5′X3′를 가지며 AD7c-NTP 암호화 핵산의 부위와 3중 가닥 부위를 형성하는 올리고데옥시뉴클레오티드로서, X는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 150-1139에 상응하는 AD7c-NTP 핵산 서열을 포함하고, L은 올리고뉴클레오티드 링커(linker) 또는 결합을 나타내는 올리고데옥시뉴클레오티드.
  27. 제26항의 올리고데옥시뉴클레오티드 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물.
  28. 서열 5′X3′-L-3′X5′를 가지며 AD7c-NTP 암호화 핵산의 부위와 3중 가닥 부위를 형성하는 올리고데옥시뉴클레오티드로서, X는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 150-1139에 상응하는 AD7c-NTP 핵산 서열을 포함하고, L은 올리고뉴클레오티드 링커(linker) 또는 결합을 나타내는 올리고데옥시뉴클레오티드.
  29. 제28항의 올리고데옥시뉴클레오티드 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물.
  30. 리보뉴클레오티드 외부 가이드 핵산 분자로서, 3′NCCA 뉴클레오티드 서열에 융합된 서열 번호 1의 뉴클레오티드 150-1139에 상응하는 10량체 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 N이 퓨린인 리보뉴클레오티드 외부 가이드 핵산 분자.
  31. 제30항에 있어서,
    서열 번호 12 내지 14 중 임의의 하나로 구성된 군에서 선택되는 리보뉴클레오티드 외부 가이드 핵산 분자.
  32. 제30항의 리보뉴클레오티드 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물.
  33. 알츠하이머 형의 뉴론뉴론 치매를 치료 또는 예방하거나; 또는 신경외배엽의 종양, 악성 성상세포종 또는 신경교아세포종을 치료 또는 예방하기 위한 방법으로서, 이를 필요로 하는 동물에게 제17항, 제24항, 제26항, 제28항 또는 제30항 중 임의의 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 3중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 외부 가이드 서열을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 3중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 외부 가이드 서열을 상기 환자에게 약학적 허용 담체의 일부로서 투여하는 방법.
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