PL207160B1 - Pochodne 4-pirymidynylo-N-acylo-L-fenyloalaniny, związki pośrednie, środek farmaceutyczny i ich zastosowanie - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są pochodne 4-pirymidynylo-N-acylo-L-fenyloalaniny, związki pośrednie, środek farmaceutyczny i ich zastosowanie.

Cząsteczka adhezyjna-1 komórek naczyniowych (VCAM-1), należąca do supergenowej rodziny immunoglobulin (Ig), jest prezentowana na uaktywnionym, ale nie na spoczynkowym, śródbłonku. Integryna VLA-4 (α4β1), która jest prezentowana na wielu typach komórek, w tym na limfocytach, granulocytach eozynochłonnych, leukocytach zasadochłonnych i monocytach w układzie krążenia, ale nie na krwinkach białych obojętnochłonnych, jest głównym receptorem dla VCAM-1. Przeciwciała przeciw VCAM-1 lub VLA-4 mogą blokować adhezję tych jednojądrowych leukocytów, a także komórek czerniaka, do uaktywnionego śródbłonka in vitro. Przeciwciała przeciw któremukolwiek z tych białek są skuteczne w hamowaniu nacieczenia leukocytowego i w zapobieganiu uszkodzeniu tkanki w szeregu zwierzęcych modeli zapalenia. Wykazano, że monoklonalne przeciwciała przeciw-VLA-4 blokują wychodzenie komórek T poza naczynia w wywołanym adiuwantem zapaleniu stawów, zapobiegają nagromadzaniu się granulocytów eozynochłonnych i skurczowi oskrzeli w modelach astmy oraz zmniejszają paraliż i hamują nacieczenie monocytami i limfocytami w doświadczalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu (EAE). Wykazano, że monoklonalne przeciwciała przeciw-VCAM-1 wydłużają okres przetrwania aloprzeszczepów sercowych. Ostatnie badania wykazały, że mAb przeciw-VLA-4 mogą zapobiegać zapaleniu wysepek trzustkowych i cukrzycy u nie otyłych diabetycznych myszy i znacząco osłabiają zapalenie u małpy długouszki jako modelu zapalenia okrężnicy. Wykazano ponadto, że VCAM jest prezentowany na komorkach śródbłonka w zapalnej tkance okrężnicy w szczurzym modelu TNB/etanol zapalnej choroby jelit (Gastroenterology 1999, 116, 874-883).

Z tego względu związki, które hamują oddziaływanie pomiędzy integrynami zawierającymi α4 i VCAM-1 będą użyteczne jako środki terapeutyczne w leczeniu przewlekłych chorób zapalnych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów (RA), stwardnienie rozsiane (MS), astma i choroba zapalna jelit (IBD). Związki według wynalazku wykazują takie działanie.

Zatem wynalazek dotyczy pochodnych 4-pirymidynylo-N-acylo-L-fenyloalaniny o ogólnym wzorze I:

w którym R1 oznacza grupę o wzorze Y-1

w którym R22 i R23 niezależnie oznaczają atom wodoru, C1-C6-alkil, C1-C6-alkoksyl, atom chlorowca lub perfluoro-C1-C6-alkil, przy czym co najmniej jeden z R22 i R23 znaczenie inne niż atom wodoru; a R24 oznacza atom wodoru lub C1-C6-alkoksyl; albo

R1 oznacza pirolidynyl; albo

R1 oznacza grupę o wzorze Y-3, którą stanowi 3-7 członowy pierścień o wzorze ^25 ‘jt Y-3

PL 207 160 B1 w którym R25 oznacza grupę o wzorze R26-(CH2)e-, w której R26 oznacza C1-C6-alkoksyl; Q oznacza -(CH2)f-, e oznacza liczbę cał kowitą 0 - 4, a f oznacza liczbę cał kowitą 0-3;

R2 oznacza C1-C6-alkil;

R3 oznacza C1-C6-alkil;

R4 oznacza atom wodoru, C1-C6-alkil lub perfluoro- C1-C6-alkil;

R5 oznacza atom wodoru lub C1-C6-alkil;

R6 oznacza atom wodoru, C1-C6-alkil lub C1-C6-alkilokarbonyloksy-C1-C6-alkil, albo R6 oznacza grupę o wzorze P-3 ρ

ι⁵² ,Λ,

-(CHA-C-iCH^-N

Κ34 w którym R32 oznacza atom wodoru lub C1-C6-alkil; R33 oznacza atom wodoru lub C1-C6-alkil; R34 oznacza atom wodoru lub C1-C6-alkil; h oznacza liczbę całkowitą 0 - 2; g oznacza liczbę całkowitą 0 - 2; a suma h + g wynosi 1-3; albo

R6 oznacza grupę o wzorze P-4 ^32 y-\ —(CHA—C-(CH₂)_g-N <? ^M

H \_/ w którym R32, g i h mają wyż ej podane znaczenie; Q' oznacza O; oraz ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli.

Związki według wynalazku mogą istnieć jako stereoizomery i diastereoizomery, z których wszystkie są objęte zakresem wynalazku. Każdy ze związków wymienionych w różnych postaciach powyżej i poniżej może być także w postaci jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli.

W korzystnej postaci zwią zków o ogólnym wzorze I R1 oznacza grupę o wzorze Y-1, zdefiniowaną powyżej, w której R22 i R23 niezależnie oznaczają C1-C6-alkil lub atom chlorowca; a R24 oznacza atom wodoru.

W innej korzystniej postaci zwią zków o ogólnym wzorze I R1 oznacza grupę o wzorze Y-1, zdefiniowaną powyżej, w której R22 i R23 niezależnie oznaczają atom wodoru lub atom chlorowca; a R24 oznacza C1-C6-alkoksyl, korzystnie metoksyl.

W innej korzystnej postaci związków o ogólnym wzorze I R1 oznacza grupę o wzorze Y-3, którą stanowi 3-7 członowy pierścień o wzorze

w którym R25 oznacza grupę o wzorze R26-(CH2)e-, w którym R26 oznacza C1-C6-alkoksyl, Q oznacza -(CH2)f-, e oznacza liczbę całkowitą 0-4, a f oznacza liczbę całkowitą 0-3, korzystnie 2.

W innej korzystniej postaci związków o ogólnym wzorze I korzystnie R1 oznacza grupę o wzorze Y-1

PL 207 160 B1 w którym R22 i R23 niezależ nie oznaczają perfluoro-C1-C6-alkil, korzystnie triflurometyl; C1-C6-alkil, korzystnie metyl, etyl, propyl lub izopropyl; lub atom chlorowca, korzystnie atom fluoru, chloru lub bromu; a R24 oznacza atom wodoru.

Gdy R1 oznacza korzystną grupę o wzorze Y-1, zdefiniowaną bezpośrednio powyżej, korzystnie

i) R2 i R3 oznaczają C1-C6-alkil; R4 oznacza atom wodoru lub C1-C6-alkil, a R5 i R6 oznaczają atom wodoru, albo ii) R2 i R3 oznaczają C1-C6-alkil; R4 oznacza atom wodoru lub C1-C6-alkil, R5 oznacza atom wodoru, a R6 oznacza atom wodoru, C1-C6-alkil lub C1-C6-alkilokarbonyloksy-C1-C6-alkil, albo R6 oznacza grupę o wzorze P-3

'34

Ρ-3 w którym R32 oznacza atom wodoru lub C1-C6-alkil; R33 oznacza atom wodoru lub C1-C6-alkil; R34 oznacza atom wodoru lub C1-C6-alkil; h oznacza liczbę całkowitą 0-2; g oznacza liczbę całkowitą 0-2; a suma h + g wynosi 1-3; albo

R6 oznacza grupę o wzorze P-4

R

Q' P-4 w którym R32, g i h mają wyżej podane znaczenie; a Q' oznacza O, zwłaszcza gdy R6 oznacza C1-C6-alkil; albo R6 oznacza C1-C6-alkilokarbonyloksy-C1-C6-alkil; albo gdy R6 oznacza grupę o wzorze P-3, w którym R32 oznacza atom wodoru; R33 i R34 oznaczają

C1-C6-alkil; h oznacza 1; oraz g oznacza 0; albo gdy R6 oznacza grupę o wzorze P-4, w którym R32 oznacza atom wodoru; h oznacza 1; g oznacza 0; a Q' oznacza O; albo iii) R2 i R3 oznaczają C1-C6-alkil; R4 oznacza perfluoro-C1-C6-alkil, a R5 i R6 oznaczają atom wodoru, albo iv) R2 i R3 oznaczają C1-C6-alkil; R4 oznacza atom wodoru; R5 oznacza C1-C6-alkil, a R6 oznacza atom wodoru.

Konkretne korzystne związki w nawiązaniu do korzystnej postaci i), wspomnianej bezpośrednio powyżej, są wybrane z grupy obejmującej

N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę;

N-[(2-bromo-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę;

N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę;

N-[(2-etylo-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę;

N-[[2-(2-metyloetylo)-6-metylofenylo]karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę;

N-[(2,6-difluorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę;

N-[[2-fluoro-6-(trifluorometylo)fenylo]karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę;

N-[[2,6-di-(2-metyloetylo)fenylo]karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę;

N-[(2-chloro-6-etylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę;

N-[(2-chloro-6-propylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę;

N-[[2-chloro-6-(2-metyloetylo)fenylo]karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę;

PL 207 160 B1

N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dietylo-6-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę i

N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dietylo-6-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę.

Inne korzystne związki są wybrane z grupy obejmującej N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę;

N-[(2-bromo-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę i

N-[(2-bromo-5-metoksyfenylo)karbonylo]-4-[1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo]-L-fenyloalaninę.

Konkretne korzystne związki w nawiązaniu do powyższej postaci ii), w której R6 oznacza C1-C6-alkil, są wybrane z grupy obejmującej ester etylowy N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo]-L-fenyloalaniny;

ester etylowy N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny i ester etylowy N-[(2,6-difluorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny;

gdy R6 oznacza C1-C6-alkilokarbonyloksy-C1-C6-alkil, korzystne związki są wybrane z grupy obejmującej ester 1-(acetoksy)etylowy N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny;

ester 1-(acetoksy)etylowy N-[(2-chloro-6-metylofenylo)-karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny i ester 1-(acetoksy)etylowy N-[(2,6-difluorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny;

gdy R6 oznacza grupę o wzorze P-3, korzystne związki są wybrane z grupy obejmującej ester 2-[(N,N-dietylo)amino]etylowy N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny;

ester 2-[(N,N-dietylo)amino]etylowy N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo2,4-diokso-5-pirymidynylo]-L-fenyloalaniny i ester 2-[(N,N-dietylo)amino]etylowy N-[(2,6-difluorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo]-L-fenyloalaniny;

gdy R6 oznacza grupę o wzorze P-4, korzystne związki są wybrane z grupy obejmującej ester 2-(4-morfolino)etylowy N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny i ester 2-(4-morfolino)etylowy N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo]-L-fenyloalaniny.

Korzystne związki w nawiązaniu do postaci iii) powyżej są wybrane z grupy obejmującej N-[1-(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę;

N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-[1,3-dimetylo-2,4-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo]-L-fenyloalaninę i

N-[[2-fluoro-6-(trifluorometylo)fenylo]karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę.

Korzystne związki w nawiązaniu do postaci iv) powyżej są wybrane z grupy obejmującej N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaninę;

N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaninę i

N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaninę.

W jeszcze innej korzystnej postaci związków o ogólnym wzorze I R1 oznacza grupę o wzorze Y-3, którą stanowi 3-7 członowy pierścień o wzorze

PL 207 160 B1 *2:

w którym R25 oznacza grupę o wzorze R26-(CH2)e-, którym R26 oznacza C1-C6-alkoksyl, Q oznacza -(CH2)f-, e oznacza liczbę całkowitą 0-4, a f oznacza liczbę całkowitą 0-3. W takich związkach korzystnie R2 i R3 oznaczają C1-C6-alkil, R4 oznacza atom wodoru lub C1-C6-alkil, a R5 i R6 oznaczają atom wodoru.

Do konkretnych korzystnych związków w tym kontekście należą

4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)]-N-[[1-(2-metoksyetylo)cyklopentylo]karbonylo]-L-fenyloalanina;

N-[[1-(2-metoksyetylo)cyklopentylo]karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalanina i

4-(1,3-dietylo-6-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-N-[[1-(2-etoksyetylo)cyklopentylo]karbonylo]-L-fenyloalanina.

W jeszcze innej korzystnej postaci związków o ogólnym wzorze I R1 ma wyżej podane znaczenie, a R2 i R3 oznaczają C1-C6-alkil; a R4, R5 i R6 oznaczają atom wodoru, zwłaszcza gdy R1 oznacza grupę o wzorze Y-1 zdefiniowaną dla wzoru I, korzystnie w której R22 i R23 niezależnie oznaczają C1-C6-alkil lub atom chlorowca; a R24 oznacza atom wodoru, albo w której R22 i R23 niezależnie oznaczają atom wodoru lub atom chlorowca; a R24 oznacza C1-C6-alkoksyl.

W postaci okreś lonej powyż ej, w której R2 i R3 oznaczają C1-C6-alkil; a R4, R5 i R6 oznaczają atom wodoru, korzystne jest również, gdy R1 oznacza pirolidynyl.

W postaci okreś lonej powyż ej, w której R2 i R3 oznaczają C1-C6-alkil; a R4, R5 i R6 oznaczają atom wodoru, korzystnie jest również, gdy R1 oznacza grupę o wzorze Y-3, zdefiniowaną dla wzoru I, korzystnie w której R25 oznacza grupę o wzorze R26-(CH2)e-, którym R26 oznacza C1-C6-alkoksyl,

Q oznacza -(CH2)f-, e oznacza liczbę całkowitą 0-4, a f oznacza liczbę całkowitą 0-3, korzystnie 2.

Wynalazek ponadto dotyczy związków pośrednich o ogólnym wzorze II:

w którym R2-R5 mają znaczenie podane powyż ej dla związków o ogólnym wzorze I, P1 oznacza grupę zabezpieczającą atom azotu, taką jak t-butoksykarbonyl (Boc) lub karbobenzyloksyl, a P2 oznacza grupę zabezpieczającą grupę karboksylową, taką jak C1-C6-alkil lub podstawiony C1-C6-alkil. Związki te są użytecznymi związkami pośrednimi w wytwarzaniu związków o ogólnym wzorze I.

Wynalazek dotyczy także określonego powyżej związku do zastosowania jako lek.

Wynalazek ponadto dotyczy środka farmaceutycznego zawierającego substancję czynną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, którego cechą jest to, że jako substancję czynną zawiera określony powyżej związek lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól.

Wynalazek ponadto dotyczy zastosowania określonego powyżej związku lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli do wytwarzania leku do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów, stwardnienia rozsianego, choroby zapalnej jelit i astmy.

W opisie okreś lenie „atom chlorowca oznacza dowolny z czterech atomów chlorowca, atom bromu, chloru, fluoru lub jodu, o ile nie zaznaczono inaczej. Do korzystnych atomów chlorowca należy atom bromu, fluoru lub chloru.

PL 207 160 B1

Określenie „C1-C6-alkil, samo lub w połączeniu, oznacza alkil o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym, zawierający do co najwyżej 6 atomów węgla, taki jak metyl, etyl, n-propyl, izopropyl, n-butyl, s-butyl, izobutyl, t-butyl, n-pentyl, n-heksyl itp.

Określenie „podstawiony C1-C6-alkil oznacza C1-C6-alkil zdefiniowany powyżej, podstawiony jednym lub większą liczbą podstawników niezależnie wybranych z grupy obejmującej cykloalkil, grupę nitrową, aryloksyl, aryl, hydroksyl, atom chlorowca, grupę cyjanową, C1-C6-alkoksyl, C1-C6-alkanoil, grupę C1-C6-alkilotio, C1-C6-alkilosulfinyl, C1-C6-alkilosulfonyl, grupę aminową oraz mono lub di-C1-C6-alkiloaminową. Do przykładowych podstawionych C1-C6-alkili należą 2-hydroksyetyl, 3-oksobutyl, cyjanometyl i 2-nitropropyl.

Określenie „perfluoro-C1-C6-alkil w odniesieniu do R4, R22 lub R23 oznacza podstawiony C1-C6-alkil zdefiniowany powyżej, np. metyl lub etyl, w którym wszystkie atomy wodoru zostały podstawione atomami fluoru, np. trifluorometyl i pentafluoroetyl.

Określenie „cykloalkil oznacza niepodstawiony lub podstawiony 3-7-członowy pierścień karbocykliczny. Zgodnie z wynalazkiem do przydatnych podstawników należą hydroksyl, atom chlorowca, grupa cyjanowa, C1-C6-alkoksyl, C1-C6-alkanoil, C1-C6-alkil, aroil, grupa C1-C6-alkilotio, C1-C6-alkilosulfinyl, C1-C6-alkilosulfonyl, aryl, heteroaryl i podstawiona grupa aminowa.

Określenie C1-C6-alkoksyl oznacza alkoksyl o łańcuchu prostym lub o rozgałęzionym, zawierający co najwyżej 6 atomów węgla, taki jak metoksyl, etoksyl, n-propoksyl, izopropoksyl, n-butoksyl, t-butoksyl itp.

Określenie „grupa C1-C6-alkilotio oznacza C1-C6-alkil połączony z resztą cząsteczki przez dwuwartościowy atom siarki, np. grupę metylomerkapto lub izopropylomerkapto. Określenie „C1-C6-alkilosulfinyl oznacza C1-C6-alkil zdefiniowany powyżej, połączony z resztą cząsteczki przez atom siarki w grupie sulfinylowej. Określenie „C1-C6-alkilosulfonyl oznacza C1-C6-alkil zdefiniowany powyżej, połączony z resztą cząsteczki przez atom siarki w grupie sulfonylowej.

Określenie „aryl oznacza mono- lub bicykliczną grupę aromatyczną, taką jak fenyl lub naftyl, niepodstawioną lub podstawioną zwykłymi podstawnikami. Do korzystnych podstawników należą C1-C6-alkil, C1-C6-alkoksyl, hydroksy- C1-C6-alkil, hydroksyl, hydroksyalkoksyl, atom chlorowca, grupa C1-C6-alkilotio, C1-C6-alkilosulfinyl, C1-C6-alkilosulfonyl, grupa cyjanowa, grupa nitrowa, perfluoroalkil, alkanoil, aroil, aryloalkinyl, C1-C6-alkinyl i grupa C1-C6-alkanoiloaminowa. Do przykładowych grup arylowych, które można stosować zgodnie z wynalazkiem, należą fenyl, p-tolil, p-metoksyfenyl, p-chlorofenyl, m-hydroksyfenyl, m-metylotiofenyl, 2-metylo-5-nitrofenyl, 2,6-dichlorofenyl, 1-naftyl itp.

Określenie „arylo- C1-C6-alkil oznacza C1-C6-alkil określony powyżej, w którym jeden lub większa liczba atomów wodoru została zastąpiona arylem lub heteroarylem, zdefiniowanymi w opisie. Zgodnie z wynalazkiem można stosować dowolny zwykły aralkil, taki jak benzyl itp.

Określenie „heteroaryl oznacza niepodstawiony lub podstawiony 5- lub 6-członowy monocykliczny pierścień heteroaromatyczny, albo 9- lub 10-członowy bicykliczny pierścień heteroaromatyczny, zawierający 1, 2, 3 lub 4 heteroatomy będące niezależnie atomami N, S lub O. Do przykładowych pierścieni heteroarylowych należy pierścień pirydyny, benzimidazolu, indolu, imidazolu, tiofenu, izochinoliny, chinazoliny itp. Podane powyżej podstawniki dla „arylu są objęte definicją heteroarylu.

Określenie „C1-C6-alkoksykarbonyl oznacza C1-C6-alkoksyl połączony przez grupę karbonylową. Do przykładowych grup alkoksykarbonylowych należy etoksykarbonyl itp.

Określenie „C1-C6--alkilokarbonyloksyl oznacza C1-C6-alkilokarbonyloksyl połączony z resztą cząsteczki przez atom tlenu, np. acetoksyl. Ma ono to samo znaczenie co „acyloksyl.

Określenie „C1-C6-alkanoil oznacza C1-C6-alkil połączony przez grupę karbonylową i obejmuje w swym znaczeniu definicje powyż szych grup; jest to np. acetyl, propionyl itp. Okreś lenie „perfluoro-C1-C6-alkanoil oznacza perfluoro-C1-C6-alkil (podstawiony C1-C6-alkil, w którym wszystkie atomy wodoru są podstawione atomami fluoru, korzystnie trifluorometyl lub pentafluoroetyl), połączony z resztą czą steczki przez grupę karbonylową .

Określenie „aroil oznacza mono- lub bicykliczny aryl lub heteroaryl, połączony z resztą cząsteczki przez grupę karbonylową. Do przykładowych grup aroilowych należy benzoil, 3-cyjanobenzoil, 2-naftoil, nikotynoil itp.

Farmaceutycznie dopuszczalne sole są dobrze znane i można je wytwarzać znanymi sposobami z uwzględnieniem chemicznej natury związku. Do przykładowych farmaceutycznie dopuszczalnych soli w przypadku związków kwasowych należą sole metali alkalicznych lub metali ziem alkalicznych, takich jak sód, potas, wapń, magnez, zasadowych amin lub zasadowych aminokwasów, amonowe lub alkiloamoniowe. Szczególnie korzystnymi solami związków według wynalazku są sole sodowe,

PL 207 160 B1 np. gdy R6 oznacza H. Sól sodową dowolnego kwasu według wynalazku łatwo wytwarza się przez podziałanie na kwas wodorotlenkiem sodu. W przypadku związków zasadowych do przykładowych soli należą sole z kwasami nieorganicznymi lub organicznymi, takimi jak kwas chlorowodorowy, bromowodorowy, siarkowy, azotowy, fosforowy, cytrynowy, mrówkowy, fumarowy, maleinowy, octowy, bursztynowy, winowy, metanosulfonowy i p-toluenosulfonowy.

Związki według wynalazku hamują wiązanie VCAM-1 i fibronektyny z VLA-4 na limfocytach, granulocytach eozynochłonnych, leukocytach zasadochłonnych i monocytach w układzie krążenia („komórkach eksponujących VLA-4). Wiadomo, że wiązanie VCAM-1 i fibronektyny z VLA-4 na tych komórkach odgrywa rolę w pewnych stanach chorobowych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, stwardnienie rozsiane, choroba zapalna jelit, a zwłaszcza w wiązaniu granulocytów eozynochłonnych ze śródbłonkiem dróg oddechowych, co przyczynia się do stanu zapalnego płuc, występującego w przypadku astmy. Z tego względu związki według wynalazku są użyteczne w leczeniu astmy.

Dzięki ich zdolności do hamowania wiązania VCAM-1 i fibronektyny z VLA-4 na limfocytach, granulocytach eozynochłonnych, leukocytach zasadochłonnych i monocytach w układzie krążenia, związki według wynalazku mogą być użyteczne jako leki lub środki farmaceutyczne, zwłaszcza w leczeniu zaburzeń, w przypadku których znane jest powiązanie z takim wiązaniem lub w których takie wiązanie pośredniczy. Do takich zaburzeń należą np. reumatoidalne zapalenie stawów, stwardnienie rozsiane, astma i choroba zapalna jelit. Związki według wynalazku korzystnie stosuje się w leczeniu chorób obejmujących stany zapalne płuc, takie jak astma. Stan zapalny płuc, występujący w astmie, związany jest z uaktywnieniem i nacieczeniem płuc przez granulocyty eozynochłonne, monocyty i limfocyty, które został y uaktywnione przez pewne wywoł ują ce astmę zjawiska lub substancje.

Ponadto związki według wynalazku hamują również wiązanie VCAM-1 i MadCAM z komórkowym receptorem α4-β7, znanym również jako LPAM, eksponowanym na limfocytach, granulocytach eozynochłonnych i komórkach T. Choć dokładna rola oddziaływania α4-β7 z różnymi ligandami w stanach zapalnych, takich jak astma, nie jest w pełni zrozumiała, związki według wynalazku, które hamują wiązanie zarówno receptora α4-β1, jak i α4-β7, są szczególnie skuteczne w zwierzęcych modelach astmy. Dodatkowe badania z użyciem monoklonalnych przeciwciał przeciw α4-β7 wskazują, że związki, które hamują wiązanie α4-β7 z MadCAM lub VCAM, są użyteczne w leczeniu choroby zapalnej jelit. Powinny być one również użyteczne w leczeniu innych chorób, w których takie wiązanie uznaje się za przyczynę uszkodzenia chorobowego lub objawów.

Związki według wynalazku można podawać doustnie, doodbytniczo lub pozajelitowo, np. dożylnie, domięśniowo, podskórnie, domostkowo lub przezskórnie; albo podjęzykowo albo w postaci preparatów do oczu, bądź też jako aerozol w przypadku stanu zapalnego płuc. Kapsułki, tabletki, zawiesiny lub roztwory do podawania doustnie, czopki, roztwory do iniekcji, krople do oczu, balsamy lub roztwory do wytwarzania aerozolu stanowią przykłady postaci leku.

Korzystnymi sposobami stosowania są podawanie dożylne, domięśniowe, doustne lub przez wdychanie. Dawki, w których związki według wynalazku podaje się w skutecznej ilości, zależą od charakteru konkretnej substancji czynnej, wieku i wymagań pacjenta oraz od trybu podawania. Dawki można ustalić zwykłymi sposobami, np. w próbach klinicznych z ograniczonymi dawkami. W związku z tym wynalazek znajduje zastosowanie w sposobie leczenia osobnika cierpią cego na chorobę , w której czynnikiem sprawczym w objawach choroby lub powodowanych przez nią uszkodzeniach jest wiązanie VCAM-1 lub fibronektyny z komórkami eksponującymi VLA-4, przez podawanie związku według wynalazku w ilości wystarczającej do zahamowania wiązania VCAM-1 lub fibronektyny z komórkami eksponującymi VLA-4, tak że te objawy lub to uszkodzenie ulegają zmniejszeniu. Ogólnie dawki wynoszące około 0,1-100 mg/kg masy ciała dziennie są korzystne, przy czym dawki 1-25 mg/kg dziennie są szczególnie korzystne, a dawki 1-10 mg/kg masy ciała dziennie są wyjątkowo korzystne.

Jak podano powyżej, leki oraz środki farmaceutyczne według wynalazku zawierają farmaceutycznie skuteczną ilość związku według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Sposób wytwarzania środka farmaceutycznego polega na połączeniu związku według wynalazku lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli, oraz zgodnego farmaceutycznego nośnika, w galenową postać do podawania. Takie środki można formułować dowolnym odpowiednim sposobem. Tabletki lub granulki mogą zawierać szereg środków wiążących, wypełniaczy, nośników lub rozcieńczalników. Ciekłe środki mogą być np. w postaci jałowych, mieszających się z wodą roztworów. Kapsułki oprócz substancji czynnej mogą zawierać wypełniacz lub zagęstnik. Obecne mogą być ponadto środki poprawiające smak/zapach, a także substancje stosowane zazwyczaj jako środki konserwujące, stabilizujące,

PL 207 160 B1 zatrzymujące wilgoć i emulgujące, a także sole zmieniające ciśnienie osmotyczne, roztwory buforowe i inne dodatki.

Wspomniane powyżej nośniki i rozcieńczalniki mogą stanowić dowolne zwykłe, farmaceutycznie dopuszczalne substancje organiczne lub nieorganiczne, takie jak np. woda, żelatyna, laktoza, skrobia, stearynian magnezu, talk, guma arabska, glikole polialkilenowe itp.

Doustne postacie dawkowane, takie jak tabletki i kapsułki, korzystnie zawierają 25-1000 mg związku według wynalazku.

Związki według wynalazku ogólnie można wytwarzać z odpowiednich pochodnych fenyloalaniny, drogą katalizowanej palladem reakcji z 5-chlorowco-2,4-dioksopirymidonem.

Jak to pokazano na schemacie reakcji 1, pochodną 4-jodo- lub 4-bromofenyloalaniny, taką jak związek 1, przeprowadza się w zabezpieczoną pochodną fenyloalaniny o wzorze 2, w którym R5' oznacza atom wodoru, atom chloru, C1-C6-alkil lub C1-C6-alkoksyl, P1 oznacza typową grupę zabezpieczającą atom azotu, taką jak Boc lub karbobenzyloksyl, a P2 oznacza C1-C6-alkil lub podstawiony C1-C6-alkil, dobrany odpowiednio tak, aby służył jako grupa zabezpieczająca lub część proleku. Grupę P2 można wprowadzić zwykłymi sposobami, znanymi fachowcom w dziedzinie chemii peptydów. Kolejność wprowadzania grup P1 i P2 nie ma decydującego znaczenia i będzie zależeć od konkretnego doboru reagentów. Omówienie stosowania i wprowadzania grup zabezpieczających podano w podręczniku Theodora W. Greene i Peter G.M. Wuts., Protecting Groups in Organie Synthesis, Wiley Interscience, New York, 1991. Alternatywnie związek o wzorze 1 można przeprowadzić w związek o wzorze 4, w którym R1' oznacza część grupy acylowej związku według wynalazku. Dogodnym sposobem jest wprowadzenie najpierw grupy estrowej P2, a następnie przeprowadzenie reakcji sprzęgania wolnej aminy z użyciem zwykłych reagentów sprzęgających stosowanych w syntezie peptydów, np. HBTU w obecności trzeciorzędowej zasady aminowej, takiej jak dietyloizopropyloamina. Również w tym przypadku konkretny dobór reagentów moż e decydować o kolejnoś ci wprowadzania grup R1' i P2. Przemianę związków o wzorze 2 lub 4 w pochodne o wzorze 3 lub 5, gdzie M oznacza podstawiony atom cyny lub boru, można osiągnąć przez podziałanie odpowiednimi związkami, np. heksametylodicyną, heksabutylodicyną lub tetraalkoksydiborem, w obecności źródła Pd(0). Metodologię przedstawiono wraz z odsyłaczami w F. Diederich i P. J. Stang, red.. Metal Catalyzed Cross Coupling Reactions, Wiley-VCH, Weinheim, Niemcy, 1998.

Schemat reakcji 1

PL 207 160 B1

Pirymidyno-2,4-diony (pochodne uracylu) o wzorze 6, w którym R4, oznacza atom wodoru, C1-C6-alkil lub perfluoro-C1-C6-alkil, są dobrze znane z literatury albo można je wytworzyć znanymi sposobami. 1,3-Dipodstawione pirymidyno-2,4-diony o wzorze 7, w którym R2' i R3' oznaczają C1-C6-alkil, arylo-C1-C6-alkil lub aryl, są również znanymi związkami albo można je wytworzyć znanymi sposobami. Do publikacji przedstawiających sposoby syntezy tych związków należą: Shigeo Senda i inni, Chem. Pharm. Bull. 1974, 22, 189-195, Chem Pharm Bull 1972, 20, 1389-1396 oraz Yasuo Morita i inni, Chem Comm. 1997, 359-360. W przypadku gdy R2' i R3' oznaczają C1-C6-alkil lub arylo- C1-C6-alkil, związki o wzorze 7 otrzymuje się drogą alkilowania związków o wzorze 6, przez podziałanie środkami alkilującymi, takimi jak jodometan, bromek benzylu, bromek allilu, w obecności zasady, takiej jak węglan potasu i ewentualnie katalizatora przenoszenia międzyfazowego. W przypadku mniej reaktywnych środków alkilujących, konieczne może być użycie mocniejszej zasady, takiej jak wodorotlenek metalu alkalicznego i ogrzewanie mieszaniny reakcyjnej. Związki o wzorze 6 lub 7, zdefiniowane powyżej, mogą być chlorowcowane w pozycji 5 przez podziałanie zwykłymi środkami chlorowcującymi, takimi jak brom, N-jodosukcynoimid lub N-bromosukcynoimid, w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak lodowaty kwas octowy lub wodny roztwór kwasu octowego, z wytworzeniem chlorowcopirymidyn o wzorze 8, X = Br lub I, R2' i R3' niezależnie oznaczają atom wodoru, C1-C6-alkil, arylo- C1-C6-alkil lub aryl, R4' = atom wodoru, C1-C6-alkil lub perfluoro- C1-C6-alkil.

Jak to pokazano na schemacie reakcji 3, związek o wzorze 8 można stosować w katalizowanej palladem reakcji sprzęgania z pochodną fenyloalaniny o wzorze 3 lub 5. Przykładowo, gdy M oznacza podstawiony atom cyny, przez podziałanie na mieszaninę związku 8 i fenyloalaniny o wzorze 3 lub 5 źródłem Pd(0), takim jak tetrakis(trifenylofosfina)pallad lub dichlorek bis(trifenylofosfina)palladu, w obecnoś ci oboję tnego rozpuszczalnika, takiego jak DMF, w temperaturze od temperatury pokojowej do 100°C, otrzymuje się związek o wzorze 9 lub 10. Związki o wzorze 9 można przeprowadzić w związki o wzorze 10 przez usunięcie grupy zabezpieczającej P1, co można osiągnąć zwykłymi sposobami, w zależności od wybranej grupy P1. Przykładowo, gdy P1 oznacza grupę Boc, można ją usunąć przez podziałanie mocnym kwasem, takim jak kwas trifluorooctowy, ewentualnie w obecności rozpuszczalnika, takiego jak dichlorometan, oraz środka wiążącego. Otrzymaną wolną aminę można następnie zacylować kwasem o wzorze R₁'CO₂H, z użyciem zwykłych metod sprzęgania peptydów.

Przykładowo, przez podziałanie HBTU w obecności trzeciorzędowej zasady aminowej, takiej jak dietyloizopropyloamina, w obecności aprotonowego rozpuszczalnika, takiego jak DMF, otrzymuje się związek o wzorze 10.

Gdy wolny kwas o wzorze 11 stanowi żądany produkt końcowy, grupę estrową P2 można usunąć zwykłymi sposobami. Przykładowo, w przypadku gdy P2 oznacza C1-C6-alkil, np. metyl, można go usunąć przez podziałanie wodorotlenkiem metalu alkalicznego, np. wodorotlenkiem litu, w odpowiednim rozpuszczalniku, np. w wodnym roztworze THF, ewentualnie zawierającym metanol dla ułatwienia rozpuszczania. Gdy P2 oznacza benzyl lub podstawiony benzyl, można go również usunąć drogą katalitycznego uwodorniania w obecności metalu szlachetnego jako katalizatora, np. palladu na węglu.

PL 207 160 B1

Schemat reakcji 3

Alternatywnie, jak to pokazano na schemacie reakcji 4, związek o wzorze 8, w którym X oznacza atom bromu lub jodu, można przeprowadzić w związki o wzorze 12, w którym M' oznacza podstawiony atom cyny, boru lub cynku. W przypadku pochodnych cyny lub boru, w których M' oznacza podstawiony atom cyny lub boru, reakcję można przeprowadzić przez podziałanie odpowiednimi związkami, np. heksametylodicyną, heksabutylodicyną lub tetraalkoksydiborem, w obecności źródła Pd(0). W przypadku wytwarzania pochodnych cynku o wzorze 12, M' = Zn (atom chlorowca), reakcję moż na przeprowadzić przez podziałanie na związek o wzorze 8, X = I, źródłem uaktywnionego metalicznego cynku w odpowiednim obojętnym rozpuszczalniku, np. w dimetyloacetamidzie, w temperaturze od temperatury pokojowej do 100°C, aż do zajścia reakcji do końca, z wytworzeniem związku o wzorze 12, M' = Zn (atom chlorowca). Takie związki o wzorze 12 można poddać reakcji z 4-podstawioną pochodną fenyloalaniny o wzorze 4', w którym X' oznacza atom jodu, atom bromu lub trifluorometylosulfonyloksyl, w obecności źródła Pd(0), z wytworzeniem związku o wzorze 10'. W przypadku gdy grupa estrowa reprezentowana przez P2 nie stanowi części docelowego związku, można ją usunąć sposobami hydrolizy estru, odpowiednimi dla konkretnej grupy P2. Przykładowo, gdy P2 oznacza C1-C6-alkil, np. metyl, można go usunąć drogą zwykłej hydrolizy zasadowej z użyciem wodorotlenku metalu alkalicz12

PL 207 160 B1 nego, np. wodorotlenku litu. W wariancie tego sposobu celowe może być pozostawienie grupy zabezpieczającej podczas reakcji sprzęgania i podstawienie jej w późniejszym etapie. W takim przypadku związek o wzorze 2', w którym P1' oznacza C1-C6-alkoksykarbonyl lub benzyloksykarbonyl, a X' ma wyżej podane znaczenie, może poddać sprzęganiu z pirymidynodionem o wzorze 12, z wytworzeniem związku o wzorze 9', który z kolei można przeprowadzić w związek według wynalazku, z użyciem ogólnych sposobów przedstawionych powyżej na schemacie reakcji 3.

Schemat reakcji 4

Alternatywny sposób prowadzący do związków według wynalazku, pokazany na schemacie reakcji 5, szczególnie przydatny w przypadku związków, w których R5' ma znaczenie inne niż atom wodoru, polega na wytworzeniu aldehydu o wzorze 14. Można to osiągnąć w reakcji związku o wzorze 12 ze związkiem o wzorze 13, w którym R5' oznacza C1-C6-alkil lub C1-C6-alkoksyl, X oznacza jon jodkowy, jon bromkowy lub trifluorometylosulfonyloksyl, a R8 oznacza zabezpieczone ugrupowanie alkoholu lub aldehydu. W przypadku alkoholi do odpowiednich grup zabezpieczających należą ugrupowania eterów sililowych, eterów benzylowych. W razie potrzeby ugrupowania aldehydu mogą być zabezpieczone jako ich pochodne acetalowe. Związek o wzorze 12 można przeprowadzić w aldehyd o wzorze 15 w zwykłych etapach, które w przypadku gdy R8 oznacza ugrupowanie alkoholu, powinny obejmować usuwanie grupy zabezpieczającej, a następnie, w razie potrzeby, utlenianie. Można stosować dowolny ze zwykłych reagentów do utleniania pierwszorzędowych alkoholi benzylowych do aldehydów,

PL 207 160 B1 np. można podziałać uaktywnionym ditlenkiem manganu w obojętnym rozpuszczalniku. W przypadku gdy R8 oznacza zabezpieczone ugrupowanie aldehydu, przemianę w aldehyd o wzorze 15 można osiągnąć przez odpowiednie usunięcie grupy zabezpieczającej, np. drogą hydrolizy acetalu z użyciem rozcieńczonego kwasu. Reakcję związku 15 w celu wytworzenia dehydroaminokwasu o wzorze 16 można prowadzić przez podziałanie odczynnikiem Wittiga o wzorze 17, w którym P1' oznacza C1-C6-alkoksykarbonyl lub benzyloksykarbonyl, a P2 ma wyżej podane znaczenie. Przykładowo podziałanie na związek 15 estrem trimetylowym (±)-N-(benzyloksykarbonylo)-a-fosfonoglicyny w obecności odpowiedniej zasady, np. tetrametyloguanidyny, prowadzi bezpośrednio do dehydroaminokwasu o wzorze 16, P2 = metyl, a P1' = benzyloksykarbonyl. Enancjoselektywną redukcję związku 16 do L-aminokwasu 18 można przeprowadzić z użyciem szeregu przydatnych w tym celu środków redukujących, np. ostatnio opisanego odczynnika rodowego etylo-DuPHOS (Burk M.J., Feaster J.E.; Nugent W.A.; Harlow R.L., J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 10125) postępując zasadniczo zgodnie ze sposobem opisanym w literaturze. Dalszą przemianę związku 18 w związki według wynalazku można przeprowadzić z użyciem ogólnych sposobów opisanych powyżej,

Schemat reakcji 5

W jednej postaci grupę N-acylową, R1' w związku o wzorze 11, otrzymuje się w wyniku użycia 2-podstawionego kwasu benzoesowego. Odpowiednie 2-podstawione kwasy benzoesowe są dostępne w handlu albo można je otrzymać zwykłymi sposobami. Przykładowo o-podstawione jodki lub triflany arylu można poddać karbonylowaniu w obecności tlenku węgla i odpowiedniego katalizatora palladowego. Sposób wytwarzania takich jodkowych lub triflanowych związków pośrednich zależy od kon14

PL 207 160 B1 kretnego wymaganego układu podstawników i związki te można otrzymać przez bezpośrednie jodowanie lub diazowanie aniliny, a następnie podziałanie źródłem jodku, np. jodkiem potasu. Triflany można otrzymać z odpowiednich fenoli w zwykły sposób, taki jak podziałanie bezwodnikiem trifluorometanosulfonowym w obecności zasady, takiej jak trietyloamina lub diizopropyloetyloamina, w obojętnym rozpuszczalniku. Jak to pokazano na schemacie reakcji 6, jeden z innych sposobów wytwarzania o-podstawionych kwasów benzoesowych polega na podziałaniu na pochodną 2-metoksyfenylooksazoliny, taką jak związek 19, Z1 i Z2 = atom wodoru, alkil, atom chloru, perfluoroalkil, C1-C6-alkoksyl, alkilowym odczynnikiem Grignarda, a następnie hydrolizie pierścienia oksazoliny, zgodnie z ogólnym sposobem, który podali Meyers, A.I., Gabel, R., Mihelick, E.D, J. Org. Chem. 1978, 43, 1372-1379, z wytworzeniem kwasu o wzorze 20. 2- lub 2,6-Dipodstawione benzonitryle również służą jako dogodne prekursory dla odpowiednich kwasów benzoesowych. W przypadku nitryli ze znaczną zawadą przestrzenną, np. 2-chloro-6-metylobenzonitrylu, zwykła hydroliza w warunkach kwasowych lub zasadowych przebiega z trudem, tak że lepsze wyniki otrzymuje się drogą redukcji z użyciem DIBAL do odpowiedniego benzaldehydu, a następnie utleniania z użyciem środka utleniającego opartego na chromie. Inne sposoby podano w publikacji Chen i inni, WO 99/10312.

Schemat reakcji 6

Na schemacie reakcji 7, cykliczne kwasy o wzorze 23 są znanymi związkami albo można je wytworzyć zwykłymi sposobami. W celu wytworzenia alkilo- lub cykloalkilo-podstawionych kwasów karboksylowych, można prowadzić reakcje alkilowania z użyciem dianionu metalu alkalicznego w przypadku kwasu lub monoanionu odpowiedniego estru. Przykładowo, na ester kwasu cykloalkilokarboksylowego o wzorze 21 można podziałać mocną zasadą, np. diizopropyloamidkiem litu w obojętnym rozpuszczalniku, np. w THF, a następnie dodać związek R41-Lv, w którym R41 oznacza żądany łańcuch boczny, taki jak podstawiony benzyl, C1-C6-alkil, C1-C6-alkoksy-C1-C6-alkil, azydo-C1-C6-alkil itp., a Lv oznacza grupę odszczepiającą się , taką jak atom bromu, atom jodu, grupa mesylanowa lub podobna grupa uczestnicząca w reakcjach alkilowania enolanu estru. Otrzymany ester o wzorze 22 można zhydrolizować do kwasu o wzorze 23 z użyciem wodorotlenku metalu alkalicznego, w odpowiednim rozpuszczalniku, np. w mieszaninie alkoholu z wodą. W zależności od charakteru grupy R41 i żądanego zwią zku docelowego, zwią zek o wzorze 23 można poddać sprzę ganiu z aminą , taką jak związek o wzorze 1 i przeprowadzić bezpośrednio w związek docelowy, bądź też grupę R41 można poddać dalszym reakcjom w odpowiednim punkcie syntezy. Przykładowo, gdy R41 oznacza azydo-C1-C6-alkil, azydek można zredukować z użyciem np. odczynnika trialkilofosfinowego, po czym otrzymaną aminę można przeprowadzić w pochodną funkcyjną drogą alkilowania, acylowania, sulfonylowania oraz innych odpowiednich reakcji znanych fachowcom. Gdy R41 wprowadza grupę odszczepiającą się, np. końcowy atom bromu, to grupę tę można podstawić odpowiednim związkiem nukleofilowym, np. metylomerkaptydem sodu, z wytworzeniem w tym przypadku tioeteru, który może stanowić żądany produkt, lub który można poddać dalszej reakcji, np. utleniania do sulfotlenku lub sulfonu, w typowych warunkach reakcji. Do innych związków nukleofilowych, które można stosować w celu wytworzenia związków pośrednich prowadzących do związków według wynalazku, należą cyjanek sodu, metanolan sodu, azydek sodu, morfolina i inne związki. Gdy R41 zawiera ugrupowanie ketalu, grupę tę można zhydrolizować w dogodnym punkcie syntezy, z utworzeniem grupy ketonowej. Grupę tę z kolei można poddać dalszym reakcjom, w tym np. redukcji do alkoholu lub przemianie w pochodną, taką jak oksym.

Przykłady stosowania takich sposobów do syntezy związków o wzorze 23 podano w publikacji

Chen i inni, WO 99/10313.

PL 207 160 B1

Schemat reakcji 7

Ogólnie, o-podstawione kwasy aromatyczne, niezbędne do wytwarzania związków, w których R1 = Y-1, można wytworzyć sposobem, którego przykłady podali Chen i inni, WO 99/10312.

Do syntezy kwasów 2-chloro-6-alkilobenzoesowych o wzorze 28, w którym R43 oznacza C1-C6-alkil, szczególnie odpowiednie są sposoby podane na schemacie reakcji 8. Dostępny w handlu aldehyd o wzorze 24 przeprowadza się w iminę o wzorze 25, w którym R42 oznacza C1-C6-alkil, korzystnie butyl, przez podziałanie butyloaminą w obojętnym, hydrofobowym rozpuszczalniku organicznym, np. w heptanie. Na otrzymany związek o wzorze 25 działa się nadmiarem odczynnika Grignarda o wzorze 26 w obojętnym rozpuszczalniku, np. w THF, po czym w wyniku podziałania kwasem podczas obróbki otrzymuje się aldehyd o wzorze 27. Utlenianie związku 27 do kwasu o wzorze 28 można przeprowadzić zwykłymi sposobami, np. przez podziałanie na roztwór związku 27, w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak wodny roztwór acetonitrylu, chlorynem sodu i 30% nadtlenkiem wodoru w temperaturze pokojowej lub niższej.

Schemat reakcji 8

Pożądane może być wytworzenie estrowych proleków związków według wynalazku, w przypadku których dogodniejsze może być wprowadzenie grupy estrowej na końcu syntezy. Można w tym celu stosować wiele znanych metod wytwarzania estrów z kwasów karboksylowych. Do typowych sposobów, które mogą być przydatne, należy sprzęganie alkoholu z kwasem karboksylowym w obecności kwasu, np. kwasu chlorowodorowego, metoda powszechnie znana jako estryfikacja Fishera. Alternatywnie można przeprowadzić sprzęganie kwasu karboksylowego z alkoholem z udziałem diimidu, ewentualnie z użyciem promotora, takiego jak 4,4-dimetyloaminopirydyna. Typowym diimidem jest dicykloheksylokarbodiimid. Inny wariant stanowi podziałanie na kwas karboksylowy reaktywnym halogenkiem alkilu, np. jodkiem alkilu lub chlorkiem acyloksymetylu, w obecności zasady, np. wodorowęglanu sodu i obojętnego rozpuszczalnika, np. DMF. Konkretny dobór sposobu będzie uzależniony od charakteru konkretnego połączenia kwasu karboksylowego i żądanej grupy estrowej, przy czym będzie to oczywiste dla fachowców. Grupy estrowe, które mogą tworzyć proleki, można wprowadzać w dowolnym odpowiednim punkcie syntezy. Przykładowo grupa P2 w związku o wzorze 1 może stanowić żądaną grupę estrową proleku, tak że można ją zachować w produkcie końcowym.

P r z y k ł a d y

Wynalazek ilustrują poniższe przykłady, podane bez zamiaru ograniczania wynalazku w jakikolwiek sposób.

Ogólne sposoby. Temperaturę topnienia mierzono w aparacie Thomas-Hoover i wartości temperatury nie korygowano. Skręcalność optyczną określano w polarymetrze Perkin-Elmer model 241. Widma ¹H-NMR rejestrowano z użyciem spektrometrów Varian XL-200, Mercury 300 i Unityplus 400 MHz, oraz tetrametylosilanu (TMS) jako wzorca wewnętrznego. Widma masowe z jonizacją elektronową (El, 70 eV) i bombardowaniem szybkimi atomami (FAB) rejestrowano z użyciem spektrometrów masowych VG Autospec lub VG 70E-HF. Jako żel krzemionkowy w chromatografii kolumnowej stosowano żel krzemionkowy do chromatografii rzutowej Mallinkrodt SiliCar 230-400 mesh; kolumny pracowały pod ciśnieniem azotu 0-0,03 MPa (0-5 funtów/cal²), wspomagającym przepływ. Chromatogramy

PL 207 160 B1 cienkowarstwowe wykonywano na płytkach szklanych pokrytych cienką warstwą żelu krzemionkowego dostarczanego przez E. Merck (E. Merck nr 1.05719) i wizualizowano je przez naświetlanie promieniowaniem UV o długości fali 254 nm w przeglądarce, przez wystawienie na działanie pary I2 lub przez natryśnięcie kwasu fosfomolibdenowego (PMA) w wodnym roztworze etanolu, albo, po poddaniu działaniu CI2, 4,4'-tetrametylodiaminodifenylometanu, odczynnika przygotowanego zgodnie z E. Von Arx, M. Faupel i M Brugger, J. Chromatography, 1976, 120, 224-228.

Wysokociśnieniową chromatografię cieczową z odwróconymi fazami (RP-HPLC) prowadzono w aparacie Rainin HPLC z użyciem kolumny C-18, 41, 4 x 300 mm, 8 μΜ, Dynamax™ C-18 przy szybkości przepływu 49 ml/minutę, z gradientem acetonitryl:woda (każdy eluent zawierał 0,75% TFA) zazwyczaj od 5 do 95% acetonitrylu w ciągu 35-40 minut. Warunki HPLC zazwyczaj podawano w formacie (5-95-35-214); oznacza to liniowy gradient od 5 do 95% acetonitrylu w wodzie w ciągu 35 minut, z monitorem odcieku za pomocą detektora UV przy długości fali 214 nm.

Jako chlorek metylenu (dichlorometan), 2-propanol, DMF, THF, toluen, heksan, eter i metanol, stosowano odczynniki klasy Fishera lub Bakera, bez dodatkowego oczyszczania, z zaznaczonymi wyjątkami, a acetonitryl stosowano w postaci odczynnika klasy Fishera lub Bakera hplc, bez jakiegokolwiek oczyszczania.

Skróty stosowane w opisie:

THF oznacza tetrahydrofuran,

DMF oznacza N,N-dimetyloformamid,

DMA oznacza N,N-dimetyloacetamid,

HOBT oznacza 1-hydroksybenzotriazol,

BOP oznacza heksafluorofosforan [(benzotriazol-1-il)-oksy]tris-(dimetyloamino)fosfoniowy,

HATU oznacza heksafluorofosforan O-(7-azabenzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametylouroniowy

HBTU oznacza heksafluorofosforan O-benzotriazolo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowy,

DIPEA oznacza diizopropyloetyloaminę,

DMAP oznacza 4-(N,N-dimetyloamino)pirydynę

DPPA oznacza azydek difenylofosforylu

DPPP oznacza 1,3-bis(difenylofosfino)propan

DBU oznacza 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en

NaH oznacza wodorek sodu solanka oznacza nasycony wodny roztwór chlorku sodu

TLC oznacza chromatografię cienkowarstwową

LDA oznacza diizopropyloamidek litu

BOP-Cl oznacza chlorek bis(2-okso-3-oksazolidynylo)fosfinowy

NMP oznacza N-metylopirolidynon odczynnik Lawessona oznacza 2,4-disulfid 2,4-bis(4-metoksyfenylo)-1,3-ditia-2,4-difosfetanu

NIS oznacza N-jodosukcynoimid.

Chromatografia na żelu krzemionkowym w kolumnach Biotage dotyczy zastosowania układu do chromatografii rzutowej, dostarczanego przez Biotage Division Dyax Corporation z wypełnieniem w ilości 40 g (kolumny 40s), 90 g (kolumny 40m) lub 800 g (kolumny 75m). Elucję prowadzono z użyciem mieszanin heksan-octan etylu pod ciśnieniem azotu 0,07-0,1 MPa (10-15 funtów/cal²).

P r z y k ł a d 1

Ester metylowy N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-[(tributylo)stannylo]-L-fenyloalaniny

PL 207 160 B1

Roztwór estru metylowego N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-jodo-L-fenyloalaniny (5,3 g, 13 mmoli) i heksabutylodicyny (27,5 ml, 54 mmole) w toluenie (50 ml) odtleniono przez przemienne zamrażanie mieszaniny na łaźni z ciekłym azotem pod próżnią i odmrażanie w atmosferze argonu (3 x). Dodano tetrakis(trifenylofosfina)palladu (280 mg, 0,22 mmola) i mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez 45 minut, gdy jej zabarwienie zmieniło się z żółtego na czarne. TLC (1:6 octan etylu:heksan) wykazała obecność pewnej ilości wyjściowego jodku, a więc wprowadzono dodatkową porcję (140 mg, 0,11 mmola) katalizatora. Ogrzewanie w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin kontynuowano przez 1 godzinę. Mieszaninę pozostawiono do ochłodzenia się i zatężono. Pozostałość roztworzono w heksanie (200 ml) i trietyloaminie (30 ml), całość mieszano przez 30 minut i przesączono. Przesącz zatężono i poddano chromatografii w kolumnie z suchym żelem krzemionkowym, zawierającej 150 g żelu krzemionkowego z elucją heksanem, a następnie mieszaniną 1:6 octan etylu:heksany, w wyniku czego otrzymano ester metylowy N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-[(tributylo)stannylo]-L-fenyloalaniny (5,7 g, 77%) w postaci przejrzystego oleju. LR(+)LSIMS (C27H47NO4Sn): m/z 1081 (2M-C4H9) 570 (M+H).

P r z y k ł a d 2

N-[(2-Chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalanina

a) Wytwarzanie 5-jodouracylu

Mieszaninę uracylu (28,6 mmola, 3,2 g) i chlorku jodu (49,2 mmola, 7,988 g) w metanolu (120 ml) ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez 40 godzin. Rozpuszczalnik usunięto pod próżnią, a pozostałość poddano krystalizacji z mieszaniny etanol:woda (1:1, 150 ml) i przechowywano w lodówce przez 3 godziny. Uzyskane igły odsączono i przemyto mieszaniną etanol:woda (1:1, 50 ml), wodą (30 ml), heksanem (30 ml), a następnie wysuszono na powietrzu, w wyniku czego otrzymano 5,47 g (80%) 5-jodouracylu w postaci białych igieł (t.t. 278-282°C, lit. 274-276°C, Synthetic communication 1988, 18, 855-867). EI-HRMS m/e obliczono dla C4H3IN2O2 (M⁺) 237,9239, stwierdzono 237,9244.

b) Wytwarzanie 1,3-dimetylo-5-jodouracylu

Mieszaninę 5-jodouracylu (22,2 mmola, 5,28 g) i węglanu potasu w proszku (60 mmoli, 10,3 g) w DMF (188 ml) mieszano przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie dodano jodku metylu (53,5 mmola, 3,33 ml). Mieszaninę reakcyjną następnie mieszano przez kolejne 72 godziny w temperaturze pokojowej, po czym wlano do wody (150 ml) i octanu etylu (150 ml). Warstwy rozdzielono i warstwę wodną wyekstrahowano octanem etylu (2 x 100 ml). Połączone ekstrakty przemyto

PL 207 160 B1 solanką i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i odparowaniu rozpuszczalnika otrzymano surową substancję stałą, którą poddano krystalizacji z mieszaniny etanol/woda (3:1, 150:50 ml) i przechowywano w lodówce przez noc. Substancję stałą odsączono i przemyto mieszaniną etanol:woda (3:1, 120 ml), wodą (30 ml), heksanem (30 ml), po czym wysuszono pod próżnią, w wyniku czego otrzymano 4,61 g (78%) 1,3-dimetylo-5-jodouracylu w postaci białych igieł (t.t. 226-228°C, Lit. 225-227°C, Synthetic communication 1988, 18, 855-867). EI-HRMS m/e obliczono dla C6H7IN2O2 (M⁺) 266,0021, stwierdzono 266,0023.

c) Wytwarzanie estru metylowego N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-[1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)]-L-fenyloalaniny

Do zawiesiny pyłu cynkowego (30 mmoli, 2,0 g) w THF (3,0 ml) dodano 1,2-dibromoetanu (2,0 mmole, 0,174 ml) w temperaturze pokojowej. Otrzymaną zawiesinę ogrzewano do 60-65°C pistoletem grzejnym aż do zaniku wywiązywania się gazowego etylenu (zaobserwowanego). Operację tę powtórzono trzykrotnie. Zawiesinę następnie ochłodzono do temperatury pokojowej, dodano trimetylochlorosilanu (1,0 mmol, 0,15 ml) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 10 minut. Gorący (jodozwiązek nie rozpuszcza się dobrze w żadnym z zastosowanych rozpuszczalników i wytrąca się podczas chłodzenia do temperatury pokojowej) roztwór 5-jodo-1,3-dimetylouracylu (11,0 mmoli, 2,92 g) w THF (3,0 ml) i DMA (10 ml) dodano do zawiesiny cynku. Po zakończeniu dodawania mieszaninę ogrzano do 73°C. Temperatura wewnętrzna mieszaniny reakcyjnej wzrosła do 77-78°C na skutek reakcji egzotermicznej. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze łaźni 73°C przez 1,5 godziny, a następnie ochłodzono do temperatury pokojowej i mieszano przez kolejne 1,5 godziny. ¹H-NMR zhydrolizowanej 0,25 ml próbki mieszaniny wykazało obecność śladów związku wyjściowego, a jodoliza próbki 0,25 ml mieszaniny wykazała obecność jodku. Mieszaninę reakcyjną ogrzano do 70°C i mieszano przez kolejne 30 minut. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono THF (5 ml) po ochłodzeniu do temperatury pokojowej i pozostawiono do opadnięcia nadmiaru cynku przez 30-60 minut.

Otrzymany powyżej związek cynku (5,5 mmola) dodano do zawiesiny Pd(dba)2 (0,07 mmola, 40 mg), trifurylofosfiny (TFP) (0,26 mmola, 66,6 mg) i estru metylowego Boc-4-jodo-L-fenyloalaniny (4,5 mmola, 1,823 g) w THF (10 ml) w temperaturze pokojowej i jasnożółtą mieszaninę mieszano przez 15 godzin. Mieszaninę wlano do nasyconego roztworu chlorku amonu i wyekstrahowano octanem etylu (3 x 50 ml). Połączone ekstrakty przemyto solanką i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu roztworu otrzymano surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej, w wyniku czego otrzymano 0,80 g (43%) estru metylowego N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-[1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)]-L-fenyloalaniny w postaci białej substancji stałej: t.t. 65-69°C. EI-HRMS m/e obliczono dla C21H27N3O6 (M⁺) 418,1978, stwierdzono 418,1965.

d) Wytwarzanie estru metylowego 4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

PL 207 160 B1

Roztwór estru metylowego N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (1,94 mmola, 0,811 g) w dioksanie (5 ml) potraktowano 4,0 N (5 ml, 20 mmoli) kwasu chlorowodorowego w dioksanie w temperaturze pokojowej i roztwór mieszano przez 0,5 godziny. W tym czasie powoli wytrącił się jasnożółty osad. Substancję stałą odsączono i przemyto heksanem, w wyniku czego otrzymano 412 mg (60% wydajności), t.t. 187-193°C. Roztwór macierzysty zatężono pod próżnią, a pozostałość roztarto z dichlorometanem. Połączone substancje stałe, które zawierały pewną ilość związku wyjściowego, połączono i rozpuszczono w metanolu. Główną część metanolu odparowano i dodano dichlorometanu w celu wytrącenia osadu. Substancję stałą zebrano i wysuszono, w wyniku czego otrzymano 330 mg (48%) chlorowodorku estru metylowego 4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (t.t. 187-193°C). EI-HRMS m/e obliczono dla C16H19N3O4 (M+H) 318,1454, stwierdzono 318,1447.

e) Wytwarzanie estru metylowego N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Do zawiesiny chlorowodorku estru metylowego 4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (0,5 mmola, 0,180 g), kwasu 2-chloro-6-metylobenzoesowego (0,55 mmola, 0,084 g) i HBTU (0,6 mmola, 0,227 g) w DMF (4 ml) dodano diizopropyloetyloaminy (3,0 mmole, 0,52 ml) w temperaturze pokojowej. Po 1 minucie całość przeszła do roztworu i przejrzysty ż ółty roztwór mieszano 15 godzin w temperaturze pokojowej. W tym czasie barwa roztworu zmieniła się na brunatną i roztwór rozcień czono octanem etylu (25 ml). Warstwę octanu etylu przemyto kolejno wodą (2 x 20 ml), nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (25 ml) i solanką (25 ml), po czym wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i odparowaniu rozpuszczalnika otrzymano surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, w wyniku czego otrzymano 151,5 mg (72% wydajności) estru metylowego N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci białej substancji stałej: t.t. 155-157°C. EI-HRMS m/e obliczono dla C24H24N3O5CI (M⁺) 470,1483, stwierdzono 470,1484.

PL 207 160 B1

f) Wytwarzanie N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Do zawiesiny estru metylowego N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (0,278 mmola, 131 mg) w etanolu (4 ml) dodano 1,0 N wodnego roztworu wodorotlenku sodu (3 ml) w temperaturze pokojowej. Mieszaninę ogrzano do 40-45°C i otrzymany przejrzysty roztwór mieszano przez 2-3 godziny. Etanol usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozcieńczono wodą (20 ml) i NaOH (3 ml, 1,0 N) w celu rozpuszczenia soli sodowej. Wodny roztwór przemyto eterem (50 ml) w celu usuniecia jakichkolwiek obojętnych zanieczyszczeń. Warstwę wodną zakwaszono 1,0 N HCl i produkt wyekstrahowano octanem etylu (2 x 50 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemyto solanką i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu przesączu otrzymano 107 mg (85%) N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci białej substancji stałej: t.t. 234-236°C. EI-HRMS m/e obliczono dla C23H22N3O5CI (M+H) 456,1326, stwierdzono 456,1326.

P r z y k ł a d 3

Wytwarzanie 4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)]-N-[[1-(2-metoksyetylo)cyklopentylo]karbonylo]-L-fenyloalaniny

4-(1,3-Dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)]-N-[[1-(2-metoksyetylo)cyklopentylo]karbonylo]-L-fenyloalaninę otrzymano z estru metylowego 4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)]-L-fenyloalaniny i kwasu 1-(2-metoksyetylo)cyklopentanokarboksylowego (patrz WO 9910312), z użyciem ogólnych sposobów opisanych w przykładzie 2. EI-HRMS m/e obliczono dla C24H31N3O5 (M+H) 458,2292, stwierdzono 458,2279.

PL 207 160 B1

P r z y k ł a d 4

Wytwarzanie N-[(2-bromo-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

^23^22®^Γ^3θ5 M.cz.: 500,34

N-[(2-Bromo-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę otrzymano z 4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)]-L-fenyloalaniny i kwasu 2-bromo-6-metylobenzoesowego, z użyciem ogólnych sposobów opisanych w przykładzie 2. EI-HRMS m/e obliczono dla C23H22N3O5Br (M+H) 500,0822, stwierdzono 500,0825.

P r z y k ł a d 5

Wytwarzanie N-[(2-bromo-5-metoksyfenylo)karbonylo]-4-[1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo]-L-fenyloalaniny

C₂₃H₂₂BrN₃O₆ M.cz.: 516,34

N-[(2-bromo-5-metoksyfenylo)karbonylo]-4-[1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo]-L-fenyloalaninę otrzymano z estru metylowego 4-[1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo]-L-fenyloalaniny i kwasu 2-bromo-5-metoksybenzoesowego, z użyciem ogólnych sposobów opisanych w przykładzie 2. EI-HRMS m/e obliczono dla C23H22N3O6Br (M+H) 516,0770, stwierdzono 516,0780.

P r z y k ł a d 6

N-[(2,6-Dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalanina

a) Wytwarzanie 5-jodo-1,3,6-trimetylouracylu

PL 207 160 B1

Mieszaninę 5-jodo-6-metylouracylu (22,18 mmola, 5,58 g) i węglanu potasu w proszku (60 mmoli, 8,29 g) w DMF (188 ml) mieszano przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie dodano jodku metylu (90,6 mmola, 3,33 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez kolejne 76 godzin w temperaturze pokojowej, po czym wlano do wody (150 ml) i octanu etylu (150 ml). Warstwy rozdzielono i warstwę wodną wyekstrahowano octanem etylu (2 x 100 ml). Połączone ekstrakty przemyto solanką (150 ml) i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i odparowaniu rozpuszczalnika otrzymano surową substancję stałą, którą poddano krystalizacji z mieszaniny etanol:woda (3:1, 150:50 ml) i przechowywano w lodówce przez noc. Substancję stałą odsączono i przemyto mieszaniną etanol:woda (3:1, 120 ml), wodą (30 ml), heksanami (30 ml) i wysuszono pod wysoką próżnią, w wyniku czego otrzymano 5,8 g (93% wydajności) 5-jodo-1,3,6-trimetylouracylu w postaci białej substancji stałej: t.t. 155-157°C. EI-HRMS m/e obliczono dla C7H9IN2O2 (M⁺) 279,9709, stwierdzono 279,9709.

b) Wytwarzanie estru metylowego N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo]-L-fenyloalaniny

Do zawiesiny pyłu cynkowego (800 mmoli, 52,29 g) w THF (26,0 ml) dodano 1,2-dibromoetanu (53,2 mmola, 4,58 ml) w temperaturze pokojowej. Otrzymaną zawiesinę ogrzewano do 60-65°C pistoletem grzejnym aż do zaniku wywiązywania się gazowego etylenu (zaobserwowanego). Zawiesinę ochłodzono do temperatury pokojowej, dodano trimetylochlorosilanu (26,6 mmola, 3,38 ml) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 15 minut. Zawiesinę 5-jodo-1,3,6-trimetylouracylu (266 mmoli, 74,6 g) w DMA (225 ml) ogrzano, w wyniku czego otrzymano przejrzysty roztwór, który dodano w jednej porcji do mieszaniny reakcyjnej. Po zakończeniu dodawania mieszaninę ogrzano do 70°C. Temperatura wewnętrzna mieszaniny reakcyjnej wzrosła do 80-85°C na skutek reakcji egzotermicznej. Mieszaninę reakcyjną mieszano w 70°C przez 3-4 godziny, gdy TLC próbki zadanej nasyconym roztworem chlorku amonu wykazała brak związku wyjściowego. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono THF (140 ml), ochłodzono do temperatury pokojowej i pozostawiono do opadnięcia nadmiaru pyłu cynkowego na 2-3 godziny.

PL 207 160 B1

Roztwór zawierający związek cynku (266 mmoli) dodano do roztworu Pd(dba)2 (8 mmoli, 4,6 g), tri-o-tolilofosfiny [P(Tol)3] (29,6 mmola, 9,0 g) i estru metylowego N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-jodo-L-fenyloalaniny (186 mmoli, 75,56 g) w THF (280 ml) w temperaturze pokojowej i jasnożółtą mieszaninę mieszano przez 48 godzin w 50-55°C. Mieszaninę reakcyjną wlano do nasyconego roztworu chlorku amonu i wyekstrahowano octanem etylu (3x750 ml). Połączone ekstrakty przemyto solanką (1,5 litra) i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu otrzymano surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym z użyciem kolumny Biotage (75 m), w wyniku czego otrzymano 57,88 g (72% wydajności) estru metylowego N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej białej substancji stałej. EI-HRMS m/e obliczono dla C22H29N3O6 (M⁺) 431,2056, stwierdzono 431,2054.

c) Wytwarzanie chlorowodorku estru metylowego 4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Część stałego estru metylowego N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (17,15 mmola, 7,4 g) otrzymanego powyżej potraktowano 4N kwasem chlorowodorowym w dioksanie (68 mmoli, 17 ml) w temperaturze pokojowej i roztwór mieszano przez 1 godzinę; w tym czasie wytrącił się biały osad. Mieszaninę rozcieńczono eterem dietylowym i supernatant zdekantowano, a pozostałość wysuszono najpierw w wyparce obrotowej, a następnie pod wysoką próżnią, w wyniku czego otrzymano 6,28 g (99% wydajności) chlorowodorku estru metylowego 4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej żółtej substancji stałej. FAB-HRMS m/e obliczono dla C17H21N3O4 (M+H) 332,1610, stwierdzono 332,1617.

d) Wytwarzanie estru metylowego N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

PL 207 160 B1

Do zawiesiny chlorowodorku estru metylowego 4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (3,12 mmola, 1,15 g) i chlorku 2,6-dichlorobenzoilu (3,51 mmola, 0,735 g) w dichlorometanie (40 ml) dodano diizopropyloetyloaminy (9,36 mmola, 1,63 ml) w temperaturze pokojowej. Po 1 minucie całość przeszła do roztworu i przejrzysty żółty roztwór mieszano przez 20 godzin w temperaturze pokojowej. Otrzymany brunatny roztwór rozcień czono dichlorometanem (50 ml). Warstwę dichlorometanu przemyto kolejno 1N kwasem chlorowodorowym (2 x 50 ml), nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (50 ml) i solanką (50 ml), po czym wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i odparowaniu rozpuszczalnika otrzymano surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem kolumny Biotage (40m) i otrzymano 1,46 g (93% wydajności) estru metylowego N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej białej substancji stałej. FAB-HRMS m/e obliczono dla C24H23CI2N3O5 (M+H) 504,1093, stwierdzono 504,1083.

e) Wytwarzanie N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Do zawiesiny estru metylowego N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (2,2 mmola, 1,11 g) w etanolu (12 ml) dodano 1,0 N wodnego roztworu wodorotlenku sodu (8,8 ml) w temperaturze pokojowej. Mieszaninę ogrzano do 45-50°C i otrzymany przejrzysty roztwór mieszano przez około 2 godziny. Etanol usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozcieńczono wodą (50 ml) i NaOH (5 ml, 1,0 N) w celu rozpuszczenia soli sodowej. Wodny roztwór przemyto eterem dietylowym (50 ml) w celu usunięcia jakichkolwiek obojętnych zanieczyszczeń. Warstwę wodną zakwaszono 1,0 N HCl i produkt wyekstrahowano octanem etylu (2 x 75 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemyto solanką (100 ml) i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu przesączu otrzymano 970 mg (90% wydajności) N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci białej substancji stałej: t.t. 225-227°C. FAB-HRMS m/e obliczono dla C23H21CI2N3O5 (M+H) 490,0937, stwierdzono 490,0940.

P r z y k ł a d 7

Wytwarzanie N-[[1-(2-metoksyetylo)cyklopentylo]karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

a) Wytwarzanie estru metylowego N-[[1-(2-metoksyetylo)-cyklopentylo]karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

PL 207 160 B1

Do zawiesiny chlorowodorku estru metylowego 4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (0,4 mmola, 173 mg), HBTU (0,5 mmola, 189 mg) i kwasu 1-(2-metoksyetylo)cyklopentanokarboksylowego (0,5 mmola, 86 mg) w DMF (2 ml) dodano diizopropyloetyloaminy (1,2 mmola, 0,29 ml) w temperaturze pokojowej. Po 5 minutach całość przeszła do roztworu i przejrzysty żółty roztwór mieszano przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Otrzymany ciemnobrunatny roztwór rozcieńczono octanem etylu (30 ml). Warstwę octanu etylu przemyto kolejno 1N kwasem chlorowodorowym (2 x 30 ml), nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (30 ml) i solanką (30 ml), po czym wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i odparowaniu rozpuszczalnika otrzymano surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym z użyciem kolumny Biotage (40m) i otrzymano 139 mg (72% wydajności) estru metylowego N-[[1-(2-metoksyetylo)cyklopentylo]karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej białej substancji stałej. FAB-HRMS m/e obliczono dla C26H35N3O6 (M+H) 486,2604, stwierdzono 486,2602.

b) Wytwarzanie N-[[1-(2-metoksyetylo)cyklopentylo]karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Do zawiesiny estru metylowego N-[[1-(2-metoksyetylo)cyklopentylo]karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (0,273 mmola, 133 mg) w etanolu (3 ml) dodano 1,0 N wodnego roztworu wodorotlenku sodu (1,5 ml) w temperaturze pokojowej. Mieszaninę ogrzano do 40-45°C i otrzymany przejrzysty roztwór mieszano przez 15 godzin. Etanol usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozcieńczono wodą (25 ml) i NaOH (3 ml, 1,0 N) w celu rozpuszczenia soli sodowej. Wodny roztwór przemyto eterem dietylowym (50 ml) w celu usunięcia jakichkolwiek obojętnych zanieczyszczeń. Warstwę wodną zakwaszono 1,0 N HCl i produkt wyekstrahowano octanem etylu (2 x 25 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemyto solanką (50 ml) i wysuszono

PL 207 160 B1 nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu przesączu otrzymano 121 mg (94% wydajności) N-[[1-(2-metoksyetylo)cyklopentylo]karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej białej substancji stałej. FAB-HRMS m/e obliczono dla C25H33N3O6 (M+H) 472,2448, stwierdzono 472,2467.

P r z y k ł a d 8

Wytwarzanie N-[(2-bromo-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

CH, ι ³

C₂₄H₂₄BrN₃O₅ M.cz.: 514,37

N-[(2-Bromo-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę otrzymano z estru metylowego 4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny i kwasu 2-bromo-6-metylobenzoesowego, z uż yciem ogólnych sposobów opisanych w przykładzie 7, w postaci białej substancji stałej: t.t. 240-242°C. FAB-HRMS m/e obliczono dla C24H24BrN3O5 (M+H) 514,0978, stwierdzono 514,0965.

P r z y k ł a d 9

Wytwarzanie N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

CH, i ³

C₂₄H₂₄C1N₃O₅ M.cz.: 469,92

N-[(2-Chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę otrzymano z estru metylowego 4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny i kwasu 2-chloro-6-metylobenzoesowego, z użyciem ogólnych sposobów opisanych w przykładzie 7, w postaci białej substancji stałej: t.t. 238-240°C. FAB-HRMS m/e obliczono dla C24H24CIN3O5 (M+H) 470,1483, stwierdzono 470,1489.

PL 207 160 B1

P r z y k ł a d 10

Wytwarzanie N-[(2-etylo-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

CH, ι ³

C₂₆H₂₉N₃O₅ M.cz.: 463,53

N-[(2-Etylo-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę otrzymano z estru metylowego 4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny i kwasu 2-etylo-6-metylobenzoesowego, z użyciem ogólnych sposobów opisanych w przykładzie 7, w postaci białej substancji stałej: t.t. 127-133°C. ES-HRMS m/e obliczono dla C26H29N3O5 (M+Na) 494,1498, stwierdzono 494,1501.

P r z y k ł a d 11

Wytwarzanie N-[[2-(2-metyloetylo)-6-metylofenylo]karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

CH, i ³

C₂₇H₃₁N₃O₅ M.cz.: 477,55

N-[[2-(2-Metyloetylo)-6-metylofenylo]karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę otrzymano z estru metylowego 4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny i kwasu 2-(2-metyloetylo)-6-metylobenzoesowego, z użyciem ogólnych sposobów opisanych w przykładzie 7, w postaci amorficznej białej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C27H31N3O5 (M+Na) 500,2156, stwierdzono 500,2160.

P r z y k ł a d 12

Wytwarzanie N-[(2,6-difluorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

PL 207 160 B1

N-[(2,6-Difluorofenylo)karbonylo)-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę otrzymano z estru metylowego 4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny i kwasu 2,6-difluorobenzoesowego, z użyciem ogólnych sposobów opisanych w przykładzie 7, w postaci amorficznej białej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C23H21F2N3O5 (M+Na) 480,1483, stwierdzono 480,1489.

P r z y k ł a d 13

Wytwarzanie N-[[2-fluoro-6-(trifluorometylo)fenylo]karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

N-[(2-Fluoro-6-(trifluorometylo)fenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę otrzymano z estru metylowego 4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny i kwasu 2-fluoro-6-(trifluorometylo) benzoesowego, z użyciem ogólnych sposobów opisanych w przykładzie 7, w postaci białej substancji stałej: t.t. 218-220°C. ES-HRMS m/e obliczono dla C25H23F4N3O5 (M+Na) 530,1310, stwierdzono 530,1317.

P r z y k ł a d 14

Wytwarzanie N-[[2,6-di-(2-metyloetylo)fenylo]karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

CH, ι ³

C₂₉H₃₅N₃O₅

M.cz.: 505,61

PL 207 160 B1

N-[[2,6-Di-(2-metyloetylo)fenylo]karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę otrzymano z estru metylowego 4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny i kwasu 2,6-di-(2-metyloetylo)benzoesowego, z użyciem ogólnych sposobów opisanych w przykładzie 7, w postaci amorficznej białej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C29H35N3O5 (M+Na) 530,1310, stwierdzono 530,1317.

P r z y k ł a d 15

Wytwarzanie N-[(2-chloro-6-etylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

a) Wytwarzanie N-(2-chloro-6-fluorobenzylidyno)butyloaminy (Ro 50-5007/000, 30935-229)

Do zawiesiny 2-chloro-6-fluorobenzaldehydu (416 mmoli, 66 g) w mieszaninie heptanów (200 ml) dodano n-butyloaminy (460 mmoli, 45,5 ml) w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu dodawania substancja stała rozpuściła się całkowicie na skutek reakcji egzotermicznej. Roztwór mieszano przez 3 godziny w temperaturze pokojowej, po czym przeniesiono do rozdzielacza, przemyto solanką (200 ml) i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu otrzymano żółty olej, który oczyszczono drogą destylacji pod wysoką próżnią (t.w. 95-98°C/4,5 mm Hg) i otrzymano 86,31 g (97% wydajności) N-(2-chloro-6-fluorobenzylidyno)butyloaminy w postaci ż ó łtego oleju. EI-HRMS m/e obliczono dla C11H13CIFN (M⁺) 213,0720, stwierdzono 213,0714.

b) Wytwarzanie 2-chloro-6-etylobenzaldehydu

Do roztworu N-(2-chloro-6-fluorobenzylidyno)butyloaminy (15 mmoli, 3,21 g) w THF (20 ml) wkroplono roztwór bromku etylomagnezu (30 mmoli, 30 ml, 1M) w THF, utrzymując temperaturę 5-15°C. Po zakończeniu dodawania mieszaninę reakcyjną pozostawiono do ogrzania się do 20°C i mieszano ją przez 5 godzin. Następnie ochłodzono ją do 0°C (na łaźni z lodem) i wkroplono 20% HCl w wodzie (50 ml), utrzymując temperaturę poniżej 15°C przez chłodzenie w łaźni z lodem. Po zakończeniu dodawania mieszaninę pozostawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej i mieszano przez 15 godzin. Z kolei rozcieńczono ją wodą (75 ml) i wyekstrahowano octanem etylu (2 x 50 ml). Połączone ekstrakty przemyto solanką (100 ml) i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu otrzymano 2,27 g (90% wydajności) 2-chloro-6-etylobenzaldehydu w postaci żółtego oleju. EI-HRMS m/e obliczono dla C9H9CIO (M⁺) 167,0264, stwierdzono 167,0263.

c) Wytwarzanie kwasu 2-chloro-6-etylobenzoesowego

PL 207 160 B1

Do utrzymywanej w temperaturze pokojowej zawiesiny 2-chloro-6-etylobenzaldehydu (13,5 mmola, 2,27 g) w acetonitrylu (25 ml) dodano roztwór jednozasadowego fosforanu sodu (3,4 mmola, 0,465 g) w wodzie (7,5 ml), a następnie nadtlenku wodoru (1,8 ml, 30%). Z kolei wkroplono roztwór chlorynu sodu (23,7 mmola, 2,15 g) w wodzie (20 ml) w 0°C, z utrzymywaniem temperatury poniżej 3°C. Po zakończeniu dodawania żółtą zawiesinę mieszano przez 15 godzin w temperaturze od 0°C do temperatury pokojowej. W tym momencie analiza TLC mieszaniny wykazała brak związku wyjściowego. Następnie wkroplono roztwór wodorosiarczynu sodu (20,5 mmola, 2,8 g) w wodzie (10 ml) w 0°C, aż do zaniku ż ó ł tego zabarwienia (dodatnia próba z papierkiem KI). Chł odzenie ma decydujące znaczenie dla kontrolowania reakcji egzotermicznej. Po 1 godzinie rozpuszczalnik usunięto pod próżnią. Obojętne zanieczyszczenia wyekstrahowano eterem dietylowym (200 ml). Następnie zasadowy wodny roztwór zobojętniono 10% HCl do pH około 1. Wytrąconą białą substancję stałą odsączono i wysuszono na powietrzu, w wyniku czego otrzymano 2,415 g (97% wydajności) kwasu 2-chloro-6-etylobenzoesowego w postaci amorficznej białej substancji stałej. EI-HRMS m/e obliczono dla C9H9CIO2 (M⁺) 184,0291, stwierdzono 184,0295.

d) Wytwarzanie estru metylowego N-[(2-chloro-6-etylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Do zawiesiny chlorowodorku estru metylowego 4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (0,5 mmola, 184 mg), HBTU (0,7 mmola, 265 mg) i kwasu 2-chloro-6-etylobenzoesowego (0,7 mmola, 129 mg) w DMF (2 ml) dodano diizopropyloetyloaminy (1,25 mmola, 0,22 ml) w temperaturze pokojowej. Po 5 minutach całość przeszł a do roztworu i przejrzysty żó łty roztwór mieszano przez 15 godzin w temperaturze pokojowej. Otrzymany ciemnobrunatny roztwór rozcieńczono octanem etylu (30 ml). Warstwę octanu etylu przemyto kolejno 1N kwasem chlorowodorowym (2 x 30 ml), nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (30 ml) i solanką (30 ml), po czym wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu rozpuszczalnika otrzymano surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym z użyciem kolumny Biotage (40m) i otrzymano 175 mg (70% wydajności) estru metylowego N-[(2-chloro-6-etylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej białej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C26H28CIN3O5 (M+Na) 520,1611, stwierdzono 520,1613.

e) Wytwarzanie N-[(2-chloro-6-etylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

PL 207 160 B1

Do zawiesiny estru metylowego N-[(2-chloro-6-etylofeny-lo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (0,33 mmola, 164 mg) w etanolu (2 ml) dodano 1,0 N wodnego roztworu wodorotlenku sodu (0,7 ml) w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Etanol usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozcieńczono wodą (30 ml). Wodny roztwór przemyto eterem dietylowym (30 ml) w celu usunięcia jakichkolwiek obojętnych zanieczyszczeń. Warstwę wodną zakwaszono 1,0 N HCl i produkt wyekstrahowano octanem etylu (2 x 35 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemyto solanką (50 ml) i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu przesączu otrzymano 138 mg (87% wydajności) N-[ (2-chloro-6-etylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci białej substancji stałej: t.t. 187-190°C. ES-HRMS m/e obliczono dla C25H26CIN3O5 (M+Na) 506,1459, stwierdzono 506,1455.

P r z y k ł a d 16

Wytwarzanie N-[(2-chloro-6-propylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

a. Wytwarzanie kwasu 2-chloro-6-propylobenzoesowego

Kwas 2-chloro-6-propylobenzoesowy otrzymano z 2-fluoro-6-chlorobenzylidyno)butyloaminy i bromku propylomagnezu, z użyciem ogólnego sposobu opisanego w przykładzie 15.

b. Wytwarzanie N-[(2-chloro-6-propylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

PL 207 160 B1

N-[(2-Chloro-6-propylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę otrzymano z estru metylowego 4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny i kwasu 2-chloro-6-propylobenzoesowego, z użyciem ogólnych sposobów opisanych w przykładzie 15, w postaci białej substancji stałej: t.t. 225-227°C. ES-HRMS m/e obliczono dla C26H28CIN3O5 (M+Na) 520,1611, stwierdzono 520,1615.

P r z y k ł a d 17

Wytwarzanie N-[[2-chloro-6-(2-metyloetylo)fenylo]karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

a. Wytwarzanie kwasu 2-chloro-6-(2-metyloetylo)benzoesowego

Kwas 2-chloro-6-(2-metyloetylo)benzoesowy otrzymano z 2-fluoro-6-chlorobenzylidyno)butyloaminy i bromku izopropylomagnezu, z użyciem ogólnego sposobu opisanego w przykładzie 15.

b. Wytwarzanie N-[[2-chloro-6-(2-metyloetylo)fenylo]karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

CH. ι ³

c₂₆h₂₈cin₃o₅ M.cz.: 497,97

N-[[2-Chloro-6-(2-metyloetylo)fenylo]karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę otrzymano z estru metylowego 4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny i kwasu 2-chloro-6-(2-metyloetylo) benzoesowego, z użyciem ogólnych sposobów opisanych w przykł adzie 15, w postaci biał ej substancji stał ej: t.t. 205-209°C. ES-HRMS m/e obliczono dla C26H28CIN3O5 (M+Na) 520,1611, stwierdzono 520,1617.

P r z y k ł a d 18

N-[(2,6-Dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dietylo-6-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalanina

a) Wytwarzanie 5-jodo-1,3-dietylo-6-metylouracylu

PL 207 160 B1

Do zawiesiny 5-jodo-6-metylouracylu (20,97 mmola, 5,45 g) i węglanu potasu w proszku (60 mmoli, 8,29 g) w DMF (188 ml) dodano jodku etylu (83,88 mmola, 6,7 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 15 godzin w temperaturze pokojowej, po czym wlano do wody (150 ml) i octanu etylu (150 ml). Warstwy rozdzielono i warstwę wodną wyekstrahowano octanem etylu (2 x 100 ml). Połączone ekstrakty przemyto solanką (150 ml) i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu otrzymano surową substancję stałą, którą roztarto z dichlorometanem/eterem dietylowym/mieszaniną heksanów (1:1:1) i otrzymano 3,89 g (60% wydajności) 5-jodo-1,3-dietylo-6-metylouracylu w postaci białej, krystalicznej substancji stałej: t.t. 159-161,5°C. EI-HRMS m/e obliczono dla C9H13IN2O2 (M⁺) 308,0022, stwierdzono 308,0018.

b) Wytwarzanie estru metylowego N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-(1,3-dietylo-6-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Do zawiesiny pyłu cynkowego (33 mmole, 1,96 g) w THF (3 ml) dodano 1,2-dibromoetanu (3 mmole, 0,261 ml) w temperaturze pokojowej. Otrzymaną zawiesinę ogrzewano do 60-65°C pistoletem grzejnym aż do zaniku wywiązywania się gazowego etylenu. Zawiesinę ochłodzono do temperatury pokojowej, dodano trimetylochlorosilanu (1,5 mmola, 0,19 ml) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 15 minut. Zawiesinę 5-jodo-1,3-dietylo-6-metylouracylu (11 mmoli, 3,39 g) w DMA (6 ml) ogrzano, w wyniku czego otrzymano przejrzysty roztwór i dodano go w jednej porcji do mieszaniny reakcyjnej. Po zakończeniu dodawania mieszaninę ogrzano do 70°C. Temperatura wewnętrzna mieszaniny reakcyjnej wzrosła do 75°C na skutek reakcji egzotermicznej. Mieszaninę reakcyjną utrzymywano w 70°C przez 15 godzin, gdy analiza TLC próbki mieszaniny reakcyjnej, któr ą zadano nasyconym roztworem chlorku amonu, wykazała brak związku wyjściowego. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono THF (6 ml) i ochłodzono do temperatury pokojowej. Mieszaninę pozostawiono do opadnięcia nadmiaru pyłu cynkowego.

Roztwór zawierający otrzymany powyżej związek cynku (11 mmoli) dodano do roztworu Pd(dba)2 (0,14 mmola, 80 mg), trifurylofosfiny (TFP) (0,52 mmola, 134 mg) i estru metylowego N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-jodo-L-fenyloalaniny (9 mmoli, 3,65 g) w THF (6 ml) w temperaturze pokojowej i jasnożółtą mieszaninę mieszano przez 72 godziny w 50-55°C. Mieszaninę reakcyjną wlano do nasyconego roztworu chlorku amonu (100 ml) i całość wyekstrahowano octanem etylu (3 x 75 ml). Połączone ekstrakty przemyto solanką (150 ml) i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu uzyskano surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym z użyciem kolumny Biotage (40m) i otrzymano 1,78 g (43% wydajności) estru metylowego N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-(1,3-dietylo-6-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej białej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C24H33N3O6 (M+Na) 482,2262, stwierdzono 482,2262.

c) Wytwarzanie chlorowodorku estru metylowego 4-(1,3-dietylo-6-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

PL 207 160 B1

Do roztworu estru metylowego N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-(1,3-dietylo-6-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (3,87 mmola, 1,78 g) w dioksanie (10 ml) dodano 4N kwasu chlorowodorowego w dioksanie (20 mmoli, 5 ml) w temperaturze pokojowej i roztwór mieszano przez 1 godzinę. Roztwór zatężono i rozcieńczono eterem dietylowym, w wyniku czego wytrąciła się biała substancja stała. Roztwór macierzysty zdekantowano, a pozostałość wysuszono w wyparce obrotowej, a nastę pnie pod wysoką próż nią , w wyniku czego otrzymano 0,72 g (47% wydajnoś ci) chlorowodorku estru metylowego 4-(1,3-dietylo-6-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C19H25N3O4 (M+Na) 382,1737, stwierdzono 382,1736.

d) Wytwarzanie estru metylowego N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dietylo-6-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Do zawiesiny chlorowodorku estru metylowego 4-(1,3-dietylo-6-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (0,76 mmola, 0,3 g) i chlorku 2,6-dichlorobenzoilu (0,84 mmola, 0,175 g) w dichlorometanie (2 ml) dodano diizopropyloetyloaminy (3,03 mmola, 0,53 ml) w temperaturze pokojowej. Po 5 minutach całość przeszła do roztworu i przejrzysty żółty roztwór mieszano przez 15 godzin w temperaturze pokojowej. Otrzymany brunatny roztwór rozcie ń czono dichlorometanem (25 ml). Warstwę dichlorometanu przemyto kolejno 1N kwasem chlorowodorowym (2 x 25 ml), nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (25 ml) i solanką (25 ml), po czym wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu rozpuszczalnika otrzymano surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem kolumny Biotage (40s) i otrzymano 0,40 g (99% wydajności) estru metylowego N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dietylo-6-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej białej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C26H27CI2N3O5 (M+Na) 554,1221, stwierdzono 554,1229.

e) Wytwarzanie N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dietylo-6-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

PL 207 160 B1

Do zawiesiny estru metylowego N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dietylo-6-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (0,77 mmola, 0,41 g) w etanolu (2 ml) dodano 1,0 N wodnego roztworu wodorotlenku sodu (1,5 ml) w temperaturze pokojowej. Mieszaninę ogrzano do 50°C i otrzymany przejrzysty roztwór mieszano przez 2 godziny. Etanol usunięto następnie pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozcieńczono wodą (25 ml) i NaOH (2 ml, 1,0 N) w celu rozpuszczenia soli sodowej. Wodny roztwór przemyto eterem dietylowym (30 ml) w celu usunięcia jakichkolwiek obojętnych zanieczyszczeń. Warstwę wodną zakwaszono 1,0 N HCl i produkt wyekstrahowano octanem etylu (2 x 25 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemyto solanką (50 ml) i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu przesączu otrzymano 320 mg (80% wydajności) N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dietylo-6-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej białej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C25H25CI2N3O5 (M+Na) 541,3921, stwierdzono 541,3925.

P r z y k ł a d 19

Wytwarzanie N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dietylo-6-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

a) Wytwarzanie estru metylowego N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dietylo-6-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Do zawiesiny chlorowodorku estru metylowego 4-(1,3-dietylo-6-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (0,758 mmola, 300 mg), HBTU (0,84 mmola, 318 mg) i kwasu 2-chloro-6-metylobenzoesowego (0,84 mmola, 142 mg) w DMF (2 ml) dodano diizopropyloetyloaminy (1,9 mmola, 0,33 ml) w temperaturze pokojowej. Po 5 minutach cało ść przeszła do roztworu i przejrzysty ż ó łty roztwór mieszano przez 48 godzin w temperaturze pokojowej. Otrzymany ciemnobrunatny roztwór rozcieńczono octanem etylu (30 ml). Warstwę octanu etylu przemyto kolejno 1N kwasem chlorowodorowym (2 x 30 ml), nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (30 ml) i solanką (30 ml), po czym wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu uzyskano surowy

PL 207 160 B1 produkt, który oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem kolumny Biotage (40m) i otrzymano 380 mg (98% wydajności) estru metylowego N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dietylo-6-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej białej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C27H30CIN3O5 (M+Na) 535,1026, stwierdzono 535,1024.

b) Wytwarzanie N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dietylo-6-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Do zawiesiny estru metylowego N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dietylo-6-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (0,82 mmola, 420 mg) w etanolu (2 ml) dodano 1,0 N wodnego roztworu wodorotlenku sodu (1,6 ml) w temperaturze pokojowej. Mieszaninę ogrzano do 50°C i otrzymany przejrzysty roztwór mieszano przez 2 godziny. Etanol usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozcieńczono wodą (25 ml) i NaOH (3 ml, 1,0 N) w celu rozpuszczenia soli sodowej. Wodny roztwór przemyto eterem dietylowym (30 ml) w celu usunięcia jakichkolwiek obojętnych zanieczyszczeń. Warstwę wodną zakwaszono 1,0 N HCl i produkt wyekstrahowano octanem etylu (2 x 25 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemyto solanką (50 ml) i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu przesączu otrzymano 277 mg (68% wydajności) N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dietylo-6-metylo2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej białej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C26H28ClN3O5 (M+Na) 520,1611, stwierdzono 520,1616.

P r z y k ł a d 20

Wytwarzanie 4-(1,3-dietylo-6-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-N-[[1-(2-metoksyetylo)cyklopentylo]karbonylo]-L-fenyloalaniny

PL 207 160 B1

4-(1,3-Dietylo-6-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-N-[[1-(2-metoksyetylo)cyklopentylo]karbonylo]-L-fenyloalaninę otrzymano z estru metylowego 4-(1,3-dietylo-6-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny i kwasu 1-(2-metoksyetylo) cyklopentanokarboksylowego, z użyciem ogólnych sposobów opisanych w przykładzie 19, w postaci amorficznej białej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C27H37N3O6 (M+Na) 522,2575, stwierdzono 522,2581.

P r z y k ł a d 21

N-[1-(2,6-Dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo)-L-fenyloalanina

a) Wytwarzanie 3-metylo-6-(trifluorometylo)uracylu

Do wstępnie wymieszanego roztworu metanolanu sodu (55 mmoli, 2,97 g) i 3-amino-4,4,4-trifluorokrotonianu etylu (55 mmoli, 10,0 g) w DMSO (19 ml, wysuszonym nad sitami molekularnymi) dodano izocyjanianu metylu (55 mmoli, 3,2 g) w DMSO (2,5 ml) w ciągu 15 minut w 20°C. Roztwór mieszano przez 15 minut, a następnie dodano kolejną porcję metanolanu sodu (27,5 mmola, 1,34 g). Po mieszaniu przez 15 minut w 20°C, w tej samej temperaturze dodano izocyjanianu metylu (14 mmoli, 0,8 g). Po kolejnych 15 minutach mieszaninę reakcyjną pozostawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej i mieszano ją przez noc. Otrzymaną żółtą zawiesinę wlano do wody (50 ml), w wyniku czego otrzymano jasnożółty roztwór. Obojętne zanieczyszczenia wyekstrahowano eterem dietylowym (3 x 50 ml). Warstwę wodną zakwaszono stężonym kwasem chlorowodorowym, w wyniku czego otrzymano białą substancję stałą. Substancję stałą odsączono i przemyto wodą. Po wysuszeniu na powietrzu otrzymano 6,79 g (63% wydajności) 3-metylo-6-(trifluorometylo)uracylu w postaci białej substancji stałej: t.t. 235-237°C. EI-HRMS m/e obliczono dla C6H5F3N2O2 (M⁺) 194,0303, stwierdzono 194,0303.

b) Wytwarzanie 1,3-dimetylo-6-(trifluorometylo)uracylu

Do zawiesiny 3-metylo-6-(trifluorometylo)uracylu (20,6 mmola, 4,0 g) i węglanu potasu w proszku (41,2 mmola, 5,7 g) w DME (30 ml) dodano jodku metylu (82,4 mmola, 5,13 ml). Mieszaninę reakcyjną następnie ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez 4 godziny, gdy analiza TLC mieszaniny reakcyjnej wykazała brak związku wyjściowego. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury pokojowej i rozcieńczono wodą (50 ml). Następnie usunięto DME pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymano białą zawiesinę. Substancję stałą odsączono i przemyto wodą. Po wysuszeniu na powietrzu uzyskano 3,55 g (83% wydajności) 1,3-dimetylo-6-(trifluorometylo)uracylu w postaci białej substancji stałej: t.t. 85-87°C. EI-HRMS m/e obliczono dla C7H7F3N2O2 (M⁺) 208,0459, stwierdzono 208,0460.

PL 207 160 B1

c) Wytwarzanie 1,3-dimetylo-5-jodo-6-(trifluorometylo)uracylu

Mieszaninę 1,3-dimetylo-6-(trifluorometylo)uracylu (16,91 mmola, 3,52 g), kwasu trifluorooctowego (20 ml) i bezwodnika trifluorooctowego (5 ml) ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez 5 minut. Następnie dodano NIS (16,91 mmola, 3,8 g) i otrzymaną mieszaninę reakcyjną mieszano przez 15 godzin, gdy analiza TLC mieszaniny reakcyjnej wykazała obecność pewnej ilości związku wyjściowego. Dodano kolejną porcję NIS (8,45 mmola, 1,9 g) i ogrzewanie w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin kontynuowano przez kolejne 5 godzin. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury pokojowej i powoli wlano do nasyconego roztworu węglanu potasu (100 ml). Następnie dodano roztworu tiosiarczynu sodu w celu usunięcia zabarwienia pochodzącego od nadmiaru jodu. Otrzymaną substancję stałą odsączono i przemyto wodą. Po wysuszeniu na powietrzu otrzymano 3,73 g (66% wydajności) 1,3-dimetylo-5-jodo-6-(trifluorometylo)uracylu w postaci białej substancji stałej: t.t. 149-151°C. EI-HRMS m/e obliczono dla C7H6F3IN2O2 (M⁺) 333,9426, stwierdzono 333,9436.

d) Wytwarzanie estru metylowego N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Do zawiesiny pyłu cynkowego (33 mmole, 1,96 g) w THF (3 ml) dodano 1,2-dibromoetanu (3 mmole, 0,261 ml) w temperaturze pokojowej. Otrzymaną zawiesinę ogrzewano do 60-65°C pistoletem grzejnym aż do zaniku wywiązywania się gazowego etylenu. Zawiesinę ochłodzono do temperatury pokojowej, dodano trimetylochlorosilanu (1,5 mmola, 0,19 ml) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 15 minut. Zawiesinę 1,3-dimetylo-5-jodo-6-(trifluorometylo)uracylu (10 mmoli, 3,34 g) w DMA (8 ml) ogrzano, w wyniku czego otrzymano przejrzysty roztwór i dodano go w jednej porcji do mieszaniny reakcyjnej. Po zakończeniu dodawania mieszaninę ogrzano do 70°C. Temperatura wewnętrzna mieszaniny reakcyjnej wzrosła do 75°C na skutek reakcji egzotermicznej. Mieszaninę reakcyjną mieszano w 70°C przez około 3 godziny, gdy TLC próbki, zadanej nasyconym roztworem chlorku amonu, wykazała brak związku wyjściowego. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono THF (5 ml), ochłodzono do temperatury pokojowej i pozostawiono do opadnięcia nadmiaru pyłu cynkowego. Powyższy roztwór związku cynku (10 mmoli) dodano do roztworu Pd(dba)2 (1,0 mmol, 520 mg), trifurylofosfiny (TFP) (4,0 mmole, 0,93 g) i estru metylowego N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-jodo-L-fenyloalaniny (7 mmoli, 2,84 g) w THF

PL 207 160 B1 (10 ml) w temperaturze pokojowej i jasnożółtą mieszaninę mieszano przez 12 godzin w 45°C. Mieszaninę reakcyjną wlano do nasyconego roztworu chlorku amonu (100 ml) i całość wyekstrahowano octanem etylu (3 x 75 ml). Połączone ekstrakty przemyto solanką (150 ml) i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu otrzymano surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem kolumny Biotage (40m) i otrzymano 1,45 g (42% wydajności) estru metylowego N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej białej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C22H26NF3N3O6 (M+Na) 508,1666, stwierdzono 508,1670.

e) Wytwarzanie chlorowodorku estru metylowego 4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Do stałego estru metylowego N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (2,92 mmola, 1,42 g) dodano 4N kwasu chlorowodorowego w dioksanie (28 mmoli, 7 ml) w temperaturze pokojowej i roztwór mieszano przez 2 godziny. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono dichlorometanem (5 ml) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem w wyparce obrotowej. Pozostałość rozcieńczono eterem dietylowym i otrzymano jasnobrunatną substancję stałą. Substancję stałą odsączono i przemyto eterem dietylowym. Po wysuszeniu otrzymano 1,21 g (91% wydajności) chlorowodorku estru metylowego 4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci jasnobrunatnej substancji stałej: t.t. 244-247°C. ES-HRMS m/e obliczono dla C17H18F3N3O4 (M+H) 386,1322, stwierdzono 386,1319.

f) Wytwarzanie estru metylowego N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Do zawiesiny chlorowodorku estru metylowego 4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (1,0 mmol, 421 mg) i chlorku 2,6-dichlorobenzoilu (1,1 mmola, 0,235 g) w dichlorometanie (3 ml) dodano diizopropyloetyloaminy (4,4 mmola, 0,622 ml) w temperaturze poko40

PL 207 160 B1 jowej. Po 1 minucie całość przeszła do roztworu i jasnobrunatny roztwór mieszano przez 72 godziny w temperaturze pokojowej. Otrzymany ciemnobrunatny roztwór rozcieńczono dichlorometanem (25 ml). Warstwę dichlorometanu przemyto kolejno 1N kwasem chlorowodorowym (2 x 25 ml), nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (25 ml) i solanką (25 ml), po czym wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i odparowaniu rozpuszczalnika otrzymano surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem kolumny Biotage (40s) i otrzymano 0,541 g (97% wydajności) estru metylowego N-[1-(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej białej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C24H20CI2F3N3O5 (M+Na) 580,0624, stwierdzono 580,0629.

g) Wytwarzanie N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Do zawiesiny estru metylowego N-[1-(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (0,422 mmola, 0,236 g) w pirydynie (15 ml) dodano jodku litu (4,22 mmola, 0,571 g) w temperaturze pokojowej. Mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez 15 godzin. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury pokojowej, rozcieńczono 1N kwasem chlorowodorowym i wyekstrahowano octanem etylu (2 x 25 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemyto solanką (50 ml) i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu przesączu otrzymano 201 mg (87% wydajności) N-[1-(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci jasnożółtej substancji stałej: t.t. 125-128°C. ES-HRMS m/e obliczono dla C23H18CI2F3N3O5 (M+Na) 566,0469, stwierdzono 566,0468.

P r z y k ł a d 22

Wytwarzanie N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-[1,3-dimetylo-2,4-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo]-L-fenyloalaniny

PL 207 160 B1

Do roztworu kwasu 2-chloro-6-metylobenzoesowego (190 mg, 1,14 mmola) w dichlorometanie (7 ml) zawierającym DMF (4 krople) dodano chlorku oksalilu (0,42 ml, 4,8 mmola) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 godziny. Mieszaninę zatężono, poddano destylacji azeotropowej z toluenem w celu usunię cia śladów chlorku oksalilu, a pozostałość zastosowano bezpośrednio w następnym etapie.

Mieszaninę otrzymanego powyżej chlorku kwasowego i chlorowodorku estru metylowego 4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (423 mg, 1,003 mmola) w dichlorometanie (5 ml) potraktowano DIPEA (0,625 ml, 4,46 mmola) i otrzymany jasnobrunatny roztwór mieszano przez 3 dni. Mieszaninę zatężono, rozcieńczono octanem etylu, przemyto 1N HCl i solanką, po czym wysuszono nad siarczanem magnezu. Po przesączeniu i odparowaniu otrzymano pozostałość, którą oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem kolumny Biotage (40s) i otrzymano ester metylowy N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-[1,3-dimetylo-2,4-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo]-L-fenyloalaniny w postaci białej piany (179 mg, 33%). ES-HRMS m/e obliczono dla C25H23CIN3O5 (M+Na) 560,1171, stwierdzono 560,1172.

Roztwór estru metylowego N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (260 mg, 0,48 mmola), otrzymanego w powyższym doświadczeniu, oraz jodku litu (6534 mg, 4,8 mmola) w pirydynie (14 ml) ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez noc. Mieszaninę rozcieńczono 1N HCl i wyekstrahowano octanem etylu. Połączone ekstrakty przemyto solanką i wysuszono nad siarczanem magnezu, przesączono i odparowano. Pozostałość roztarto z eterem, heksanem i dichlorometanem, w wyniku czego otrzymano N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-[1,3-dimetylo-2,4-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo]-L-fenyloalaninę (205 mg, 81%) w postaci białej substancji stałej: t.t. 243-247°C. ES-HRMS m/e obliczono dla C24H21CIF3N3O5 (M+Na) 546,1014, stwierdzono 5 546,1013.

P r z y k ł a d 23

Wytwarzanie N-[[2-fluoro-6-(trifluorometylo)fenylo]karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo]-L-fenyloalaniny

Do roztworu kwasu 2-fluoro-6-trifluorometylobenzoesowego (125 mg, 0,60 mmola) (Aldrich 33080-9) w dichlorometanie (3 ml) zawierają cym DMF (2 krople) dodano chlorku oksalilu (0,21 ml, 2,4 mmola) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 godziny. Mieszanin ę zatężono, poddano destylacji azeotropowej z toluenem w celu usunięcia śladów chlorku oksalilu, a pozostałość zastosowano bezpośrednio w nastę pnym etapie.

Do mieszaniny otrzymanego powyżej chlorku kwasowego i chlorowodorku estru metylowego 4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (210 mg, 0,50 mmola) w dichlorometanie (3 ml) dodano DIPEA (0,336 ml, 2,4 mmola) i otrzymany jasnobrunatny roztwór mieszano przez 3 dni. Mieszaninę zatężono, rozcieńczono octanem etylu, przemyto 1N HCl i solanką, po czym wysuszono nad siarczanem magnezu. Po przesączeniu i odparowaniu otrzymano pozostałość, którą oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem kolumny Biotage (40s) i otrzymano ester metylowy N-[[2-fluoro-6-(trifluorometylo)fenylo]karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,442

PL 207 160 B1

-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci białej piany (179 mg, 62%). ES-HRMS m/e obliczono dla C25H20F7N3O5 (M+Na) 598,1183, stwierdzono 598,1186.

Roztwór estru metylowego N-[[2-fluoro-6-(trifluorometylo)fenylo]karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (266 mg, 0,46 mmola), otrzymanego w powyższym doświadczeniu i jodku litu (624 mg, 4,6 mmola) w pirydynie (14 ml) ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez noc. Mieszaninę rozcieńczono 1N HCl i wyekstrahowano octanem etylu. Połączone ekstrakty przemyto solanką i wysuszono nad siarczanem magnezu, przesączono i odparowano. Pozostałość roztarto z eterem i dichlorometanem, w wyniku czego otrzymano N-[[2-fluoro-6-(trifluorometylo)fenylo]karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę (167 mg, 64%) w postaci białej substancji stałej: t.t. 122-125°C. ES-HRMS m/e obliczono dla C24H18F7N3O5 (M+Na) 584,1027, stwierdzono 584,1028.

P r z y k ł a d 24

N-[(2-Chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalanina

a) Wytwarzanie alkoholu 4-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]amino-3-metylobenzylowego

Mieszaninę alkoholu 4-nitro-3-metylobenzylowego (56,53 mmola, 9,45 g), diwęglanu di-t-butylu (63 mmole, 13,74 g) i palladu na węglu drzewnym, (450 mg) w octanie etylu (240 ml) uwodorniano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną następnie przesączono przez wkład z celitu, z przemywaniem octanem etylu (50 ml). Przesą cz zatężono pod próż nią i otrzymano 10,18 g (76% wydajności) alkoholu 4-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]amino-3-metylobenzylowego w postaci jasnożółtej substancji stałej. EI-HRMS m/e obliczono dla C13H19NO3 (M⁺) 237,0126, stwierdzono 237,0129.

b) Wytwarzanie 4-[[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]amino]-3-metylobenzaldehydu

Do roztworu alkoholu 4-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]amino-3-metylobenzylowego (42,9 mmola,

10,18 g) w dichlorometanie (85 ml) dodano ditlenku manganu (138 mmoli, 12 g) i sit molekularnych 4A (6 g) w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 76 godzin w temperaturze pokojowej, po czym przesączono przez wkład z celitu, z przemywaniem dichlorometanem. Przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem kolumny Biotage (40m) i otrzymano 7,82 g (77% wydajności) 4-[[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]amino]-3-metylobenzaldehydu w postaci białej substancji stałej: t.t. 109-111°C EI-HRMS m/e obliczono dla C13H17NO3 (M⁺) 235,1208, stwierdzono 235,1207.

c) Wytwarzanie estru metylowego N-(benzyloksykarbonylo)-4-[[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]amino]-3-metylodehydrofenyloalaniny

PL 207 160 B1

Do roztworu estru trimetylowego N-(benzyloksykarbonylo)-a-fosfonoglicyny (18 mmoli, 5,96 g) (Aldrich Chemical Company) w dichlorometanie (30 ml) dodano tetrametyloguanidyny (18 mmoli, 2,07 g) w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i ochłodzono ją do -30°C. Następnie dodano w jednej porcji 4-[[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]amino]-3-metylobenzaldehydu (15 mmoli, 3,52 g) w dichlorometanie (12,5 ml). Po 30 minutach w tej temperaturze mieszaninę reakcyjną pozostawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej i mieszano ją przez 15 godzin. Mieszaninę reakcyjną następnie rozcieńczono eterem dietylowym (100 ml) i przemyto kolejno 0,5N kwasem chlorowodorowym (2 x 50 ml), nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (100 ml) i solanką (100 ml), po czym wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu otrzymano surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem kolumny Biotage (40m) i otrzymano 3,87 g (58% wydajności) estru metylowego N-(benzyloksykarbonylo)-4-[[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]amino]-3-metylodehydrofenyloalaniny w postaci białej substancji stałej. EI-HRMS m/e obliczono dla C24H28N2O6 (M⁺) 440,1527, stwierdzono 440,1524.

d) Wytwarzanie estru metylowego N-(benzyloksykarbonylo)-4-[[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]amino]-3-metylo-L-fenyloalaniny

Strumień argonu przepuszczano przez noc przez roztwór N-(benzyloksykarbonylo)-4[[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]amino]-3-metylodehydrofenyloalaniny (8,08 mmola, 3,56 g) w metanolu (25 ml) w ciśnieniowej kolbie Parra. Następnie w strumieniu argonu dodano katalizatora, trifluorometanosulfonianu(+)-1,2-bis((2S,5S)-2,5-dimetylofosfolano)benzeno(cyklooktadieno)roduI [[Rh(COD)(S,S)-(me)DuPHOS]-+TfO-] (około 40 mg), w komorze rękawicowej. Roztwór mieszano pod ciśnieniem wodoru (0,41 MPa, tj. 60 funtów/cal²) w temperaturze pokojowej przez 22 godziny. Otrzymany roztwór zatężono i surowy produkt oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem kolumny Biotage (40m), w wyniku czego otrzymano 2 g (55% wydajności) estru metylowego N-(benzyloksykarbonylo)-4-[[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]amino]-3-metylo-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej białej substancji stałej. EI-HRMS m/e obliczono dla C24H30N2O6 (M⁺) 442,1627, stwierdzono 442,1629.

e) Wytwarzanie chlorowodorku estru metylowego N-(benzyloksykarbonylo)-4-amino-3-metylo-L-fenyloalaniny

PL 207 160 B1

c₁₉h₂₃cin₂o₄

M.cz.: 378,85

Do roztworu estru metylowego N-(benzyloksykarbonylo)-4-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]amino-3-metylo-L-fenyloalaniny (4,52 mmola, 2 g) w dioksanie (12 ml) dodano 4N kwasu chlorowodorowego w dioksanie (48 mmoli, 2 ml) w temperaturze pokojowej i roztwór mieszano przez około 2 godziny, przy czym wytrącił się biały osad. Substancję stałą rozcieńczono eterem dietylowym, roztwór macierzysty zdekantowano, a pozostałość wysuszono najpierw w wyparce obrotowej, a następnie pod wysoką próżnią, w wyniku czego otrzymano 1,487 g (87% wydajności) chlorowodorku estru metylowego N-(benzyloksykarbonylo)-4-amino-3-metylo-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej żółtej substancji stałej. FAB-HRMS m/e obliczono dla C19H22N2O4 (M+H) 343,0142, stwierdzono 343,0144.

f) Wytwarzanie estru metylowego N-(benzyloksykarbonylo)-4-jodo-3-metylo-L-fenyloalaniny

Zawiesinę kwasu siarkowego (0,3 ml), wody (36 ml) i chlorowodorku estru metylowego N-(benzyloksykarbonylo)-4-amino-3-metylo-L-fenyloalaniny (2,9 mmola, 1,1 g) ogrzano, w wyniku czego otrzymano przejrzysty roztwór. Następnie ochłodzono ją do -1°C (w łaźni z lodem) i wkroplono roztwór azotynu sodu (5,8 mmola, 400 mg) w wodzie (8 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 30 minut i dodano roztworu jodku potasu (8,7 mmola, 1,5 g) w wodzie (6 ml), w wyniku czego otrzymano brunatną zawiesinę. Po mieszaniu przez 30 minut mieszaninę reakcyjną pozostawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej i mieszano ją przez 1 godzinę. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono następnie wodą (100 ml) i wyekstrahowano octanem etylu (3x50 ml). Połączone ekstrakty przemyto nasyconym roztworem wodorosiarczynu sodu (100 ml) i solanką (100 ml), po czym wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu uzyskano surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem kolumny Biotage (40m) i otrzymano 0,84 g (64% wydajności) estru metylowego N-(benzyloksykarbonylo)-4-jodo-3-metylo-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej białej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C19H20INO4 (M+Na) 476,0329, stwierdzono 476,0336.

g) Wytwarzanie estru metylowego N-(benzyloksykarbonylo)-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaniny

PL 207 160 B1

CHa hk

HjC

W₃O₆ M.cz.: 465,50

Do zawiesiny pyłu cynkowego (15 mmoli, 0,98 g) w THF (1,5 ml) dodano 1,2-dibromoetanu (1 mmol, 0,13 ml) w temperaturze pokojowej. Otrzymaną zawiesinę ogrzano do 60-65°C pistoletem grzejnym aż do zaniku wywiązywania się gazowego etylenu. Zawiesinę następnie ochłodzono do temperatury pokojowej, dodano trimetylochlorosilanu (0,5 mmola, 70 μΐ) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 15 minut. Zawiesinę 5-jodo-1,3-dimetylouracylu (2,5 mmola, 665 mg) w DMA (2 ml) ogrzano, w wyniku czego otrzymano przejrzysty roztwór i dodano go w jednej porcji do mieszaniny reakcyjnej. Po zakończeniu dodawania mieszaninę ogrzano do 70°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano w 70°C przez około 3 godziny, gdy TLC próbki, zadano nasyconym roztworem chlorku amonu, wykazała brak związku wyjściowego. Mieszaninę rozcieńczono THF (2 ml), pozostawiono do ochłodzenia się do temperatury pokojowej i odstawiono w celu umożliwienia opadnięcia nadmiaru pyłu cynkowego.

Otrzymany powyżej roztwór związku cynku (2,5 mmola) dodano do roztworu Pd(dba)2 (0,05 mmola, 27 mg), trifurylofosfiny (TFP) (0,2 mmola, 50 mg) i estru metylowego N-(benzyloksykarbonylo)-4-jodo-3-metylo-L-fenyloalaniny (0,5 mmola, 227 mg) w THF (2 ml) w temperaturze pokojowej, i otrzymaną jasnożółtą mieszaninę reakcyjną mieszano przez 15 godzin w 45°C. Mieszaninę reakcyjną następnie wlano do nasyconego roztworu chlorku amonu i całość wyekstrahowano octanem etylu (3 x 30 ml). Połączone ekstrakty przemyto solanką (50 ml) i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu uzyskano surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem kolumny Biotage (40m) i otrzymano 161 mg (69% wydajności) estru metylowego N-(benzyloksykarbonylo)-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej białej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C25H27N3O6 (M+Na) 488,1792, stwierdzono 488,1801.

h) Wytwarzanie estru metylowego 4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaniny

CH, i ^{3 XT χτ}

O c₁₇h₂₁n₃o₄

M.cz.: 331,37

Mieszaninę estru metylowego N-(benzyloksykarbonylo)-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaniny (0,34 mmola, 159 mg), cykloheksenu (1 ml) i 10% palladu na węglu (100 mg) w etanolu (3 ml) ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez 20 minut.

PL 207 160 B1

Przesączono ją następnie przez wkład z celitu i wkład przemyto etanolem (10 ml). Połączone przesącze zatężono, a pozostałość wysuszono pod wysoką próżnią i otrzymano 96 mg (85% wydajności) estru metylowego 4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaniny w postaci lepiącej się żółtej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C17H21N3O4 (M+Na) 354,1424, stwierdzono 354,1424.

i) Wytwarzanie estru metylowego N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaniny

c^ci^o, M.cz.: 483,94

Do zawiesiny estru metylowego 4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaniny (0,125 mmola, 46 mg), HBTU (0,125 mmola, 47,5 mg) i kwasu 2-chloro-6-metylobenzoesowego (0,137 mmola, 25 mg) w DMF (2 ml) dodano diizopropyloetyloaminy (0,312 mmola, 44 w temperaturze pokojowej. Po 5 minutach całość przeszła do roztworu i przejrzysty żółty roztwór mieszano przez 72 godziny w temperaturze pokojowej. Otrzymany ciemnobrunatny roztwór rozcieńczono octanem etylu (30 ml). Warstwę octanu etylu przemyto kolejno 1N kwasem chlorowodorowym (2 x 30 ml), nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (30 ml) i solanką (30 ml), po czym wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu rozpuszczalnika otrzymano surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem kolumny Biotage (40s) i otrzymano 42 mg (70% wydajności) estru metylowego N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaniny jako oleistą pozostałość. ES-HRMS m/e obliczono dla C25H26CIN3O5 (M+Na) 506,1454, stwierdzono 506,1459.

j) Wytwarzanie N-[{2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaniny

CH, i ³

C₂₄H₂₄C1N₃O₅ M.cz.: 469,92

Do zawiesiny N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-5-metylo-L-fenyloalaniny (0,083 mmola, 40 mg) w etanolu (1 ml) dodano 1,0 N wodnego roztworu wodorotlenku sodu (0,2 ml) w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 godziny

PL 207 160 B1 w temperaturze pokojowej. Następnie usunięto etanol pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozcieńczono wodą (5 ml). Wodny roztwór przemyto eterem dietylowym (20 ml) w celu usunięcia obojętnych zanieczyszczeń. Warstwę wodną zakwaszono 1,0 N HCl i produkt wyekstrahowano octanem etylu (2 x 25 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemyto solanką (50 ml) i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu przesączu otrzymano 34 mg (87% wydajności) N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej białej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C24H24CIN3O5 (M+Na) 492,1295, stwierdzono 492,1301.

P r z y k ł a d 25

Wytwarzanie N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaniny

a) Wytwarzanie estru metylowego N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaniny

Do zawiesiny estru metylowego 4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaniny (0,128 mmola, 47 mg) i chlorku 2,6-dichlorobenzoilu (0,153 mmola, 32 mg) w dichlorometanie (1 ml) dodano diizopropyloetyloaminy (0,45) mmola, 77 μθ w temperaturze pokojowej. Po 5 minutach całość przeszła do roztworu i przejrzysty żółty roztwór mieszano przez 15 godzin w temperaturze pokojowej. Otrzymany brunatny roztwór rozcieńczono dichlorometanem (25 ml). Warstwę dichlorometanu przemyto kolejno 1N kwasem chlorowodorowym (2 x 25 ml), nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (25 ml) i solanką (25 ml), po czym wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu otrzymano surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem kolumny Biotage (40m) i otrzymano 52 mg (81% wydajności) estru metylowego N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej białej substancji stałej, ES-HRMS m/e obliczono dla C24H23CI2N3O5 (M+Na) 526,0907, stwierdzono 526,0912.

b) Wytwarzanie N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaniny

PL 207 160 B1

Do zawiesiny estru metylowego N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaniny (0,1 mmola, 59 mg) w etanolu (1 ml) dodano 1,0 N wodnego roztworu wodorotlenku sodu (0,2 ml) w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Etanol usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozcieńczono wodą (10 ml). Wodny roztwór przemyto eterem dietylowym (20 ml) w celu usunięcia jakichkolwiek obojętnych zanieczyszczeń. Warstwę wodną zakwaszono 1,0 N HCl i produkt wyekstrahowano octanem etylu (2 x 15 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemyto solanką (50 ml) i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu przesączu otrzymano 20 mg (41% wydajności) N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej białej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C23H21CI2N3O5 (M+Na) 512,0752, stwierdzono 512,0754.

P r z y k ł a d 26

N-[(2,6-Dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalanina

a) Wytwarzanie estru metylowego N-(benzyloksykarbonylo)-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo]-3-metylo-L-fenyloalaniny

CH. ι ³

Do zawiesiny pyłu cynkowego (15 mmoli, 0,98 g) w THF (1,5 ml) dodano 1,2-dibromoetanu (1 mmol, 0,13 ml) w temperaturze pokojowej. Otrzymaną zawiesinę ogrzewano do 60-65°C pistoletem grzejnym aż do zaniku wywiązywania się gazowego etylenu. Zawiesinę następnie ochłodzono do temperatury pokojowej, dodano trimetylochlorosilanu (0,5 mmola, 70 μΐ) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 15 minut. Zawiesinę 5-jodo-1,3,6-trimetylouracylu (2,5 mmola, 700 mg) w DMA (2 ml) ogrzano, w wyniku czego otrzymano przejrzysty roztwór, który dodano w jednej porcji do mieszaniny reakcyjnej. Mieszaninę reakcyjną mieszano w 70°C przez 3-4 godziny, gdy TLC próbki zadanej nasyconym roztworem chlorku amonu wykazała brak związku wyjściowego. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono następnie THF (3 ml) i pozostawiono do opadnięcia nadmiaru pyłu cynkowego.

Wyżej otrzymany roztwór zawierający związek cynku (2,5 mmola) dodano do roztworu Pd(dba)2 (0,05 mmola, 27 mg), trifurylofosfiny (TFP) (0,2 mmola, 50 mg) i estru metylowego N-(benzyloksykarbonylo)-4-jodo-3-metylo-L-fenyloalaniny (0,5 mmola, 227 mg) w THF (2 ml) w temperaturze pokojowej i jasnożółtą mieszaninę mieszano przez 15 godzin w 45°C. Mieszaninę reakcyjną następnie wlano do nasyconego roztworu chlorku amonu i całość wyekstrahowano octanem etylu (3 x 30 ml). Połączone ekstrakty przemyto solanką (50 ml) i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu otrzymano surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem kolumny Biotage (40m) i otrzymano 71 mg (30% wydajności) estru metylowego N-(benzyloksykarbonylo)-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaniny w postaci żółtego oleju. ES-HRMS m/e obliczono dla C26H29N3O6 (M+Na) 502,2173, stwierdzono 502,2174.

PL 207 160 B1

b) Wytwarzanie estru metylowego 4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaniny

Mieszaninę estru metylowego N-(benzyloksykarbonylo)-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaniny (0,145 mmola, 70 mg), cykloheksenu (1 ml) i 10% palladu na węglu (100 mg) w etanolu (2 ml) ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez 15 godzin. Przesączono ją następnie przez wkład z celitu i wkład przemyto etanolem (10 ml). Połączone przesącze zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość wysuszono pod wysoką próżnią i otrzymano 36 mg (72% wydajności) estru metylowego 4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaniny w postaci jasnożółtej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C18H23N3O4 (M+Na) 368,1327, stwierdzono 368,1321.

c) Wytwarzanie estru metylowego N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaniny

CH, ι ³

^25^25^^2^3θ5

M.cz.: 518,39

Do zawiesiny estru metylowego 4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaniny (0,089 mmola, 34 mg) i chlorku 2,6-dichlorobenzoilu (0,1 mmola, 21 mg) w dichlorometanie (2 ml) dodano diizopropyloetyloaminy (0,4 mmola, 70 μΙ) w temperaturze pokojowej. Po 5 minutach całość przeszła do roztworu i przejrzysty żółty roztwór mieszano i przez 15 godzin w temperaturze pokojowej. Otrzymany brunatny roztwór rozcieńczono dichlorometanem (25 ml). Warstwę dichlorometanu przemyto kolejno 1N kwasem chlorowodorowym (2 x 25 ml), nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (25 ml) i solanką (25 ml), po czym wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu rozpuszczalnika otrzymano surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem kolumny Biotage (40 m) i otrzymano 22 mg (48% wydajności) estru metylowego N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-dioksopirymidyny50

PL 207 160 B1 lo)-3-metylo-L-fenyloalaniny w postaci lepkiego oleju. ES-HRMS m/e obliczono dla C25H25CI2N3O5 (M+Na) 541,1065, stwierdzono 541,1063.

d) Wytwarzanie N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaniny

Do zawiesiny estru metylowego N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaniny (0,04 mmola, 22 mg) w etanolu (2 ml) dodano 1,0 N wodnego roztworu wodorotlenku sodu (0,5 ml) w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Etanol usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozcieńczono wodą (10 ml). Wodny roztwór przemyto eterem dietylowym (20 ml) w celu usunięcia jakichkolwiek obojętnych zanieczyszczeń. Warstwę wodną zakwaszono 1,0 N HCl i produkt wyekstrahowano octanem etylu (2 x 15 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemyto solanką (50 ml) i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu przesączu otrzymano 20 mg (93% wydajności) N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej białej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C23H21CI2N3O5 [(M-H)+2Na] 548,0725, stwierdzono 548,0733.

P r z y k ł a d 27

Ester etylowy N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

CH, ι ³

C₂₅H₂₅C1₂N₃O₅ M.cz.: 518,39

Do zawiesiny N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (0,6 mmola, 300 mg) i wodorowęglanu sodu (3,6 mmola, 302 mg) w DMF (4 ml) dodano jodoetanu (3,6 mmola, 0,29 ml) w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 72 godziny w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną następnie wlano do wody (50 ml) i całość wyekstrahowano octanem etylu (3 x 20 ml). Połączone ekstrakty przemyto solanką (60 ml) i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu przesączu otrzymano surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkoPL 207 160 B1 wym z użyciem kolumny Biotage (40m) i otrzymano 155 mg (50% wydajności) estru etylowego N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci krystalicznej białej substancji stałej: t.t. 262-265°C. ES-HRMS m/e obliczono dla C25H25CI2N3O5 (M+Na) 540,1062, stwierdzono 540,1049.

P r z y k ł a d 28

Wytwarzanie estru 2-[(N,N-dietylo)amino]etylowego N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Mieszaninę N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (320 mg, 0,65 mmola), chlorowodorku chlorku 2-[(N,N-dietylo)amino]etylu (579 mg, 3,26 mmola) i węglanu potasu (451 mg, 3,27 mmola) w octanie etylu (5 ml) i wody (5 ml) mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Warstwy rozdzielono i warstwę wodną wyekstrahowano octanem etylu. Połączone ekstrakty przemyto solanką, wysuszono nad siarczanem magnezu i zatężono, w wyniku czego otrzymano ester 2-[(N,N-dietylo)amino]etylowy N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (190 mg, 49%) w postaci amorficznej białej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C29H34CI2N4O5 (M+H) 589,1978, stwierdzono 589,1980.

Po zakwaszeniu warstwy wodnej otrzymano odzyskaną N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę (167 mg).

P r z y k ł a d 29

Wytwarzanie estru 2-[(N,N-dietylo)amino]etylowego N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Ester 2-[(N,N-dietylo)amino]etylowy N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny otrzymano z N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,652

PL 207 160 B1

-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny i chlorowodorku chlorku 2-[(N,N-dietylo)aminoetylu, z użyciem ogólnego sposobu opisanego w przykładzie 28, w postaci amorficznej białej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C30H37CIN4O5 (M+H) 569,2525, stwierdzono 569,2530.

P r z y k ł a d 30

Wytwarzanie estru etylowego N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo)-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Ester etylowy N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo)-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny otrzymano z N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny i jodoetanu, z użyciem ogólnego sposobu opisanego w przykładzie 27, w postaci amorficznej białej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C26H28ClN3O5 (M+Na) 520,1610, stwierdzono 520,1591.

P r z y k ł a d 31

Ester 2-(4-morfolino)etylowy N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

a) Wytwarzanie N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Do zawiesiny estru metylowego N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (8,8 mmola, 3,79 g) w etanolu (20 ml) dodano 1,0 N wodnego roztworu wodorotlenku sodu (17,57 ml) w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Mieszaninę rozcieńczono następnie wodą (50 ml) i etanol usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Wodny roztwór przemyto eterem dietylowym (100 ml) w celu usunięcia jakichkolwiek obojętnych zanieczyszczeń. Warstwę wodną zakwaszono 1,0 N HCl i produkt wyekstrahowano octanem etylu (2 x 100 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemyto solanką (200 ml) i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu przesączu otrzymano 3,44 g (94% wydajności) N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4PL 207 160 B1

-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci jasnobrunatnej spienionej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C21H27N3O6 (M+Na) 440,1792, stwierdzono 440,1792.

b) Wytwarzanie estru 2-(4-morfolino)etylowego N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Do roztworu N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (1,21 mmola, 505 mg) i 2-(4-morfolino)etanolu (2,42 mmola, 318 mg) w THF (8 ml) dodano diizopropylokarbodiimidu (DIC) (1,82 mmola, 0,287 ml) i 4-dimetyloaminopirydyny (0,6 mmola, 74 mg) w temperaturze pokojowej. Otrzymany roztwór mieszano przez 72 godziny. Mieszaninę reakcyjną następnie wlano do wody (50 ml) i całość wyekstrahowano octanem etylu (3 x 50 ml). Połączone ekstrakty przemyto wodą (2 x 50 ml) i solanką (100 ml), po czym wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu przesączu otrzymano surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem kolumny Biotage (40m) i otrzymano 428 mg (67% wydajności) estru 2-(4-morfolino)etylowego N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej białej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C27H38N4O7 (M+Na) 553,2633, stwierdzono 553,2636.

c) Wytwarzanie chlorowodorku estru 2 -(4-morfolino)etylowego 4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Do stałego estru 2-(4-morfolino)etylowego N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-(1,3,6-tri-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (1,6 mmola, 0,85 g) dodano 4N kwasu chlorowodorowego w dioksanie (16,02 mmola, 4 ml) w temperaturze pokojowej i roztwór mieszano przez 3 godziny, przy czym wytworzył się biały osad. Substancję stałą rozcieńczono eterem dietylowym, roztwór macierzysty zdekantowano, a pozostałość wysuszono najpierw w wyparce obrotowej, a następnie pod wysoką próżnią, w wyniku czego otrzymano 0,75 g (99% wydajności) chlorowodorku estru 2-(4-morfolino)etylowego 4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej żółtej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C22H30N4O5 (M+H) 431,2289, stwierdzono 431,2292.

d) Wytwarzanie estru 2-(4-morfolino)etylowego N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

PL 207 160 B1

Do zawiesiny chlorowodorku estru 2-(4-morfolino)etylowego 4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (0,85 mmola, 399 mg) i chlorku 2,6-dichlorobenzoilu (0,95 mmola, 0,201 g) w dichlorometanie (4 ml) dodano diizopropyloetyloaminy (4,75 mmola, 0,66 ml) w temperaturze pokojowej. Po 5 minutach całość przeszła do roztworu i przejrzysty żółty roztwór mieszano przez 48 godzin w temperaturze pokojowej. Otrzymany jasnobrunatny roztwór rozcieńczono dichlorometanem (50 ml). Warstwę dichlorometanu przemyto kolejno 1N kwasem chlorowodorowym (2 x 50 ml), nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (50 ml) i solanką (50 ml), po czym wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu otrzymano surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem 1 kolumny Biotage (40m) i otrzymano 0,427 g (75% wydajności) estru 2-(4-morfolino)etylowego N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci białej substancji stałej: t.t. 90-94°C. ES-HRMS m/e obliczono dla C29H32Cl2N4O6 (M+H) 603,1772, stwierdzono 603,1782.

P r z y k ł a d 32

Wytwarzanie estru 2-(4-morfolino)etylowego N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Ester 2-(4-morfolino)etylowy N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny otrzymano z estru 2-(4-morfolino)etylowego 4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny i chlorku 2-chloro-6-metylobenzoilu, z użyciem ogólnych sposobów opisanych w przykładzie 31, w postaci amorficznej białej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C30H35CIN4O6 (M+H) 583,2318, stwierdzono 583,2326.

PL 207 160 B1

P r z y k ł a d 33

Wytwarzanie estru 1-(acetoksy)etylowego N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

a) Wytwarzanie estru 1-(acetoksy)etylowego N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Do zawiesiny N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (1,006 mmola, 420 mg) i wodorowęglanu sodu (5,03 mmola, 422 mg) w DMF (8 ml) dodano octanu 1-chloroetylu (5,03 mmola, 616 mg) w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 48 godzin. Następnie wlano ją do wody (50 ml) i całość wyekstrahowano octanem etylu (3 x 50 ml). Połączone ekstrakty przemyto wodą (2 x 50 ml) i solanką (100 ml), po czym wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu przesączu otrzymano surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem kolumny Biotage (40s) i otrzymano 390 mg (77% wydajności) estru 1-(acetoksy)etylowego N-[(1,1-dimetyloetoksy) karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej białej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C25H33N3O8 (M+Na) 526,2160, stwierdzono 526,2143.

b) Wytwarzanie chlorowodorku estru 1-(acetoksy)etylowego 4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Do stałego estru 1-(acetoksy)etylowego N-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (1,4 mmola, 0,705 g) dodano 4N kwasu chlorowodorowego w dioksanie (20 mmoli, 5 ml) w temperaturze pokojowej i roztwór mieszano przez 2 godziny; w tym czasie wytrącił się biały osad. Mieszaninę rozcieńczono eterem dietylowym i dichlorometanem, po czym substancję stałą odsączono, z przemywaniem eterem dietylowym. Po wysuszeniu na powietrzu otrzymano 0,63 g (99% wydajności) chlorowodorku estru 1-(acetoksy)etylowego 4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej szarej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C20H26N3O6 (M+H) 404,1816, stwierdzono 404,1818.

c) Wytwarzanie estru 1-(acetoksy)etylowego N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

PL 207 160 B1

Do zawiesiny chlorowodorku estru 1-(acetoksy)etylowego 4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (0,723 mmola, 399 mg) i chlorku 2,6-dichlorobenzoilu (0,8 mmola, 0,17 g) w dichlorometanie (5 ml) dodano diizopropyloetyloaminy (3,2 mmola, 0,45 ml) w temperaturze pokojowej. Po 5 minutach całość przeszła do roztworu i przejrzysty żółty roztwór mieszano przez 48 godzin w temperaturze pokojowej. Otrzymany jasnobrunatny roztwór rozcień czono dichlorometanem (50 ml). Warstwę dichlorometanu przemyto kolejno 1N kwasem chlorowodorowym (2 x 50 ml), nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (50 ml) i solanką (50 ml), po czym wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu rozpuszczalnika otrzymano surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem kolumny Biotage (40s) i otrzymano 0,312 g (67% wydajności) estru 1-(acetoksy)etylowego N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci białej substancji stałej: t.t. 168-5 170°C. ES-HRMS m/e obliczono dla C27H27CI2N3O7 (M+Na) 598,1118, stwierdzono 598,1122.

P r z y k ł a d 34

Wytwarzanie estru 1-(acetoksy)etylowego N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Ester 1-(acetoksy)etylowy N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny otrzymano z estru 1-(acetoksy)etylowego 4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny i chlorku 2-chloro-6-metylobenzoilu, z użyciem ogólnych sposobów opisanych w przykładzie 33, w postaci białej substancji stałej: t.t. 84-88°C. ES-HRMS m/e obliczono dla C28H30CIN3O7 (M+Na) 578,1664, stwierdzono 578,1665.

P r z y k ł a d 35

Wytwarzanie L-prolilo-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalanina a) Wytwarzanie estru metylowego L-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]prolilo-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

PL 207 160 B1

Do zawiesiny chlorowodorku estru metylowego 4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (7 mmoli, 2,57 g), HBTU (8,75 mmola, 3,32 g) i L-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]proliny (8,75 mmola, 1,88 g) w DMF (28 ml) dodano diizopropyloetyloaminy (21 mmoli, 3,65 ml) w temperaturze pokojowej. Po 2 minutach całość przeszła do roztworu i żółty przejrzysty roztwór mieszano przez 48 godzin w temperaturze pokojowej. Otrzymany ciemnobrunatny roztwór rozcieńczono octanem etylu (100 ml). Warstwę octanu etylu przemyto kolejno 1N kwasem chlorowodorowym (2 x 50 ml), nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (100 ml) i solanką (100 ml), po czym wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu rozpuszczalnika otrzymano surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym z użyciem kolumny Biotage (40m) i otrzymano 2,5 g (67% wydajności) estru metylowego L-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]prolilo-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej białej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C27H36N4O7 (M+Na) 551,2476, stwierdzono 551,2476.

b) Wytwarzanie L-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]prolilo-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Do zawiesiny estru metylowego L-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]prolilo-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (1,51 mmola, 800 mg) w etanolu (8 ml) dodano 1,0 N wodnego roztworu wodorotlenku sodu (5 ml) w temperaturze pokojowej. Mieszaninę ogrzano do 45-50°C i otrzymany przejrzysty roztwór mieszano przez 3 godziny. Etanol usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozcieńczono wodą (25 ml). Wodny roztwór przemyto eterem dietylowym (50 ml) w celu usunięcia jakichkolwiek obojętnych zanieczyszczeń. Warstwę wodną zakwaszono 1,0 N HCl i produkt wyekstrahowano octanem etylu (2 x 50 ml). Połączone ekstrakty organiczne przemyto solanką (50 ml) i wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu przesączu otrzymano 640 mg (83% wydajności) L-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]prolilo-458

PL 207 160 B1

-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej białej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C26H34N4O7 (M+Na) 537,2320, stwierdzono 537,2321.

c) Wytwarzanie L-prolilo-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Do Stałej L-[(1,1-dimetyloetoksy)karbonylo]prolilo-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (0,89 mmola, 462 mg) dodano 4N kwasu chlorowodorowego w dioksanie (16 mmoli, 4 ml) w temperaturze pokojowej i roztwór mieszano przez 3 godziny. Rozpuszczalnik następnie usunięto pod próżnią, a pozostałość wysuszono pod wysoką próżnią i uzyskano surową pozostałość, którą roztarto z dichlorometanem, eterem dietylowym i acetonitrylem i otrzymano 395 mg (99% wydajności) chlorowodorku L-prolilo-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej jasnożółtej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C21H26N4O5 (M+H) 415,1976, stwierdzono 415,1976.

P r z y k ł a d 36

Ester etylowy N-[(2,6-difluorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Do zawiesiny N-[(2,6-difluorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (0,743 mmola, 340 mg) i wodorowęglanu sodu (5,94 mmola, 499 mg) w DMF (3,8 ml) dodano jodoetanu (5,94 mmola, 0,475 ml) w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 48 godzin w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną następnie wlano do wody (100 ml) i całość wyekstrahowano octanem etylu (3 x 25 ml). Połączone ekstrakty przemyto solanką (80 ml) i wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu przesączu otrzymano surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem kolumny Biotage (40s) i otrzymano 335 mg (93% wydajności) estru etylowego N-[(2,6-difluorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci krystalicznej białej substancji stałej: t.t. 218-219°C. ES-HRMS m/e obliczono dla C25H25F2N3O5 (M+Na) 508,1654, stwierdzono 508,1660.

PL 207 160 B1

P r z y k ł a d 37

Wytwarzanie estru 2-[(N,N-dietylo)amino]etylowego N-[(2,6-difluorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

Mieszaninę N-[(2,6-difluorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (1,0 mmol, 460 mg), chlorowodorku chlorku 2-[(N,N-dietylo)amino]etylu (8,05 mmola, 1,43 g) i wę glanu potasu (8,05 mmola, 1,11 g) w octanie etylu (5 ml) i wodzie (5 ml) mieszano w temperaturze pokojowej przez noc. Warstwy rozdzielono i warstwę wodną wyekstrahowano octanem etylu (2 x 40 ml). Połączone ekstrakty przemyto solanką (50 ml) i wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu. Po odsączeniu środka osuszającego i zatężeniu przesączu otrzymano surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem kolumny Biotage (40m) i otrzymano 426 mg (76% wydajności) estru 2-[(N,N-dietylo)amino]etylowego N-[(2,6-difluorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej białej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C29H34F2N4O5 (M+H) 557,2570, stwierdzono 557,2575.

P r z y k ł a d 38

Ester 1-(acetoksy)etylowy N-[(2,6-difluorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny

CH, ι ³

^27^27^2^3θ7

M.cz.: 543,53

Do zawiesiny N-[(2,6-difluorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny (0,743 mmola, 340 mg) i wodorowęglanu sodu (5,94 mmola, 499 mg) w DMF (3,0 ml) dodano octanu 1-chloroetylu (5,94 mmola, 0,73 g) w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 48 godzin w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną następnie wlano do wody (50 ml) i całość wyekstrahowano octanem etylu (3 x 25 ml). Połączone ekstrakty przemyto solanką (80 ml)

PL 207 160 B1 i wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu. Po odsączeniu środka osuszają cego i zatężeniu przesączu otrzymano surowy produkt, który oczyszczono metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem kolumny Biotage (40m) i otrzymano 265 mg (66% wydajności) estru 1-(acetoksy)etylowego N-[(2,6-difluorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny w postaci amorficznej białej substancji stałej. ES-HRMS m/e obliczono dla C27H27F2N3O7 (M+Na) 566,1709, stwierdzono 566,1710.

Przykłady testów biologicznych

P r z y k ł a d A

Test przesiewowy VLA-4/VCAM-1

Działanie antagonizujące VLA-4, określane jako zdolność do konkurowania z wiązaniem z unieruchomionym VCAM-1, określono z użyciem metody ELISA w fazie stałej, z podwójnymi przeciwciałami. VLA-4 (integryna α4β1) związane z VCAM-1 wykrywano kompleksem przeciwciało przeciwintegrynie β1: skoniugowana z HRP przeciwmysia IgG: chromogeniczny substrat (K-Blue). Na początku 96-studzienkowe płytki (Nunc Maxisorp) powleczono zrekombinowanym ludzkim VCAM-1 (0,4 μg w 100 gl PBS), uszczelniono każdą płytkę i płytki odstawiono w 4°C na około 18 godzin. Płytki powleczone VCAM następnie zablokowano 250 μl 1% BSA/0,02% NaN₃ w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania. W dniu wykonywania testu wszystkie płytki przemyto dwukrotnie buforem testowym VCAM (200 gl/studzienkę 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM MnCl₂, 0,05% Tween 20; pH 7,4). Badane związki rozpuszczono w 100% DMSO i rozcieńczono 1:20 buforem testowym VCAM uzupełnionym 1 mg/ml BSA (czyli ostateczne stężenie DMSO = 5%). Wykonano seryjne rozcieńczenia 1:4 w celu uzyskania zakresu stężeń 0,005 nM - 1,563 μM w przypadku każdego badanego związku. Porcję 100 gl roztworu w każdym rozcieńczeniu dodano na płytki powleczone VCAM, a następnie 10 μl VLA-4 pochodzącego z komórek Ramos. Płytki wymieszano następnie na wytrząsarce stolikowej przez 1 minutę, inkubowano przez 2 godziny w 37°C, po czym przemyto czterokrotnie 200 gl/studzienkę buforu testowego VCAM. Do każdej studzienki dodano 100 μl mysiego przeciwciała przeciwludzkiej integryny β1 (0,6 μg/ml w buforze testowym VCAM + 1 mg/ml BSA) i umożliwiono zachodzenie inkubacji przez 1 godzinę w 37°C. Po zakończeniu tego okresu inkubacji wszystkie płytki przemyto czterokrotnie buforem testowym VCAM (200 μl/studzienkę). Odpowiednie drugie przeciwciało, skoniugiowaną z HRP kozią przeciwmysia IgG (100 μl/studzienkę, rozcieńczenie około 1:800 w buforze testowym VCAM + 1 mg/ml BSA) dodano następnie do każdej studzienki, po czym prowadzono inkubację przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i na zakończenie przemyto trzykrotnie (200 gl/studzienkę) buforem testowym VCAM. Wywoływanie barwy zainicjowano przez dodanie 100 gl K-Blue na studzienkę (15 minutowa inkubacja, temperatura pokojowa), a zakończono je przez dodanie 100 gl/studzienkę buforu Red Stop Buffer. Wszystkie płytki następnie odczytywano w spektrofotometrze UV/Vis przy 650 nm. Wyniki obliczano jako % hamowanie całkowitego wiązania (czyli VLA-4 + VCAM-1 bez badanego związku). Wyniki podano w poniższej tabeli I (A = IC50 < 1 nM, B = IC50 < 10 nM):

T a b e l a I

Związek z przykładu	Aktywność w teście ELISA z VCAMA/VLA-4
2	A
3	B
4	A
5	A

P r z y k ł a d B

Procedura testu przesiewowego opartego na komórkach Ramos z (VLA-4)/VCAM-1

Materiały

Rozpuszczalną ludzką rekombinowaną VCAM-1 (mieszanina domeny 5- i 7-Ig) oczyszczono z ośrodka hodowli komórek CHO metodą chromatografii powinowactwa i utrzymywano w roztworze zawierającym 0,1 M Tris-glicynę (pH 7,5), 0,1 M NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,02% 0,02% NaN3 i 10 gg/ml leupeptyny. Kalceinę-AM zakupiono z Molecular Probes Inc.

Metody

Działanie antagonizujące VLA-4 (integryny α4β1), określane jako zdolność konkurowania z VLA-4 na powierzchni komórki w wiązaniu z unieruchomionym VCAM-1, określano ilościowo w teście adhezji z komórkami Ramos-VCAM-1. Komórki Ramos zawierające VLA-4 na powierzchni komórki wyznakoPL 207 160 B1 wano barwnikiem fluorescencyjnym (Kalceiną-AM) i umożliwiono ich wiązanie się z VCAM-1 w obecności lub bez badanych związków.

Zmniejszenie natężenia fluorescencji związanej z przyczepionymi komórkami (% hamowanie) odzwierciedla konkurencyjne hamowanie przez badany związek adhezji komórek pośredniczonej przez VLA-4.

Na początku 96 studzienkowe płytki (Nunc Maxisorp) powleczono zrekombinowanym ludzkim VCAM-1 (100 ng w 100 μΐ PBS), każdą płytkę uszczelniono i płytki odstawiono w 4°C na około 18 godzin. Płytki powleczone VCAM następnie przemyto dwukrotnie 0,05% Tween-20 w PBS, po czym zablokowano przez 1 godzinę (w temperaturze pokojowej) 200 μl buforu blokującego (1% BSA/0,02% tymerosal) w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania. Po inkubacji z buforem blokującym płytki odwrócono, wytarto, a resztę buforu odessano. Każdą płytkę przemyto następnie 300 μl PBS, odwrócono i resztki PBS odessano.

Badane związki rozpuszczono w 100% DMSO, a następnie rozcieńczono w stosunku 1:25 buforem do testu adhezji komórek VCAM (4 mM CaCl2, 4 mM MgCl2 w 50 mM TRIS-HCl, pH 7,5) (ostateczne stężenie DMSO = 4%). W przypadku każdego związku wykonano serię 8 rozcieńczeń 1:4 (ogólne stężenie 1 nM - 12500 nM). Do płytek powleczonych VCAM dodano 100 μl/studzienkę każdego rozcieńczonego roztworu, a następnie 100 μl komórek Ramos (200000 komórek/studzienkę w 1% BSA/PBS). Płytki zawierające badane związki i komórki Ramos inkubowano przez 45 minut w temperaturze pokojowej, po czym dodano PBS w ilości 165 μl/studzienkę. Płytki odwrócono w celu usunięcia nie przyczepionych komórek, wytarto i dodano PBS w ilości 300 μl/studzienkę. Płytki ponownie odwrócono, wytarto i resztki buforu łagodnie odessano. Do każdej studzienki dodano 100 μl buforu lizy (0,1% SDS w 50 mM TRIS-HCl, pH 8,5) i płytki mieszano przez 2 minuty na obrotowym stoliku do wytrząsania. Następnie zmierzono natężenie fluorescencji na płytkach w układzie do pomiaru fluorescencji Cytofluor 2300 (Millipore) (wzbudzanie = 485 nm, emisja = 530 nm). Wyniki podano w poniższej tabeli:

W tabeli II wyniki podano w następującej postaci (A = IC50 < 100 nM, B = IC50 < 10000 nM):

T a b e l a II

Związek z przykładu	Aktywność w teście ELISA z komórkami Ramos VCAM/VLA-4
1	2
2	A
3	A
4	A
5	B
6	A
7	A
8	A
9	A
10	A
11	A
12	A
13	A
14	B
15	A
16	A
17	A
18	A
19	A
20	A

PL 207 160 B1 cd. tabeli II

1	2
21	A
22	A
23	A
24	B
25	A
26	B
27	B
28	A
29	A
30	B
31	B
32	B
33	B
34	B
35	A

Przykład C

Procedura testu z α4-β7

Na 2 tygodnie - 1 dzień przed wykonywaniem testu płytki immunologiczne F96 Maxisorp silnie wiążące Nunc, #442404 lub #439454, pokryto 25 ng/studzienkę (0,25 μg/ml) MadCAM w objętości 100 μl/studzienkę. Płytki przykryto uszczelką i opakowano w folię opakowaniową z saranu, a następnie inkubowano w lodówce przez co najmniej 24 godziny. Jako bufor do powlekania zastosowano: 10 mM bufor węglanowy/wodorowęglanowy przygotowany z: 0,8 g/litr węglanu sodu i 1,55 g/litr wodorowęglanu sodu, doprowadzony do pH 9,6 za pomocą 1N HCl.

Skład buforów testowych był następujący:

Bufor przemywania: Bufor blokujący: Bufor znakowania: Bufor komórkowy: Bufor wiązania:

Bufor rozcieńczania:

0,05% Tween 20 w PBS 1% odtłuszczone mleko w proszku w PBS

PBS pożywka RPMI 1640 (bez dodatków)

1,5 mM CaCl2 0,5 mM MnCl2 mM TRIS-HCl; wkroplić NaOH do pH 7,5

Uzupełnić H2O do określonej objętości Doprowadzić do pH 7,5 4% DMSO w buforze wiązania

Płytki przemyto 2 x buforem przemywania, a następnie zablokowano w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę buforem blokującym. Uszczelnione płytki czasami blokowano przez noc w lodówce. Płytki następnie przemyto PBS i wytarto ręcznie do sucha. Resztki cieczy odessano ze studzienek.

Wystarczającą ilość komórek RPMI 8866 pobrano do testów z hodowli podstawowej (2 x 10⁶ komórek/ml x 10 ml/płytkę x liczba płytek) i umieszczono w probówce do wirowania. Probówki dopełniono do wymaganej objętości z użyciem PBS i odwirowano przy 200 x g przez 8 minut. Bufor zlano i komórki ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny do stężenia 10 x 10⁶/ml w PBS, po czym dodano roztworu bazowego kalceiny w DMSO (5 mg/ml) w ilości 5 nl/ml zawiesiny komórek. Zawiesinę inkubowano przez 30 minut w 37°C w ciemności. Komórki przemyto następnie PBS. PBS zlano i komórki ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w buforze komórkowym w stężeniu 2 x 10⁶ komórek/ml do zastosowania w teście.

PL 207 160 B1

Przygotowano podstawowy roztwór badanych związków w 100% DMSO, w stężeniu odpowiadającym 25 krotności wymaganego pierwszego rozcieńczenia. Pierwsze rozcieńczanie w przypadku wzorca oraz w przypadku badanych związków, wykonano w stosunku 1:25 bezpośrednim buforem wiązania, natomiast pozostałe seryjne rozcieńczenia wykonywano buforem rozcieńczania (bufor wiązania/4% DMSO). Stężenia podstawowe i w rozcieńczeniu związków do testów przesiewowych oznaczano na podstawie przewidywanej aktywności.

W celu wykonania testu 129 μl buforu wiązania umieszczono w pierwszym rzędzie studzienek, a 100 μl buforu rozcieńczania umieszczono w pozostałych studzienkach. Porcję 5,4 μl każdego związku odpipetowano do odpowiednich, oznaczonych studzienek, z trzema powtórkami. Następnie związki rozcieńczono na płytce (34 μl + 100 μl => 4-krotne rozcieńczenie). W celach kontrolnych 100 μl buforu rozcieńczania + 100 μl buforu komórkowego umieszczono w niespecyficznych studzienkach tła (bez komórek, bez związku) oraz 100 μl buforu rozcieńczania + 100 μl komórek umieszczono w studzienkach całkowitego wiązania (bez związku = 100% wiązanie). Znakowane komórki w ilości 2 x 10⁶ komórek/ml, 100 μl/studzienkę ( = 2 x 10⁵ komórek/studzienkę) dodano do każdej studzienki zawierającej związek. Płytki uszczelniono i inkubowano w ciemności przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji niezwiązane komórki usunięto przez dodanie 150 μl PBS/studzienkę. Płytki odwrócono, osuszono na papierowych ręcznikach i przemyto przez łagodne dodanie do studzienek 200 μl PBS i ponowne osuszenie. Resztki buforu ostrożnie odessano ze studzienek. Na koniec do każdej studzienki dodano 100 μl PBS.

Następnie zmierzono natężenie fluorescencji na płytkach z użyciem układu do pomiaru fluorescencji Cytofluor 2300 (Millipore) (wzbudzanie = 485 nm, emisja = 530 nm). Wartości IC50 dla każdego związku wyznaczono na podstawie analizy metodą regresji liniowej. Wyniki podano w poniższej tabeli III.

T a b e l a III

Związek z przykładu	Aktywność w teście MadCAM/komórki RPMI (A = IC50 < 100 nM, B = IC50 <10000 nM, C = IC50 < 5000 nM)
6	A
7	A
8	A
9	A
10	B
11	C
12	A
13	B
14	C
15	B
16	B
17	B
18	A
19	B
20	B
21	B
22	B
23	B
24	B
25	B
26	B
27	B

PL 207 160 B1

Claims (35)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Pochodne 4-pirymidynylo-N-acylo-L-fenyloalaniny o ogólnym wzorze I:

   w którym R1 oznacza grupę o wzorze Y-1 w którym R22 i R23 niezależnie oznaczają atom wodoru, C1-C6-alkil, C1-C6-alkoksyl, atom chlorowca lub perfluoro-C1-C6-alkil, przy czym co najmniej jeden z R22 i R23 znaczenie inne niż atom wodoru; a R24 oznacza atom wodoru lub C1-C6-alkoksyl; albo

   R1 oznacza pirolidynyl; albo

   R1 oznacza grupę o wzorze Y-3, którą stanowi 3-7 członowy pierścień o wzorze w którym R25 oznacza grupę o wzorze R26-(CH2)e-, w której R26 oznacza C1-C6-alkoksyl; Q oznacza -(CH2)f^-, e oznacza liczbę całkowitą 0 - 4, a f oznacza liczbę całkowitą 0-3;

   R2 oznacza C1-C6-alkil;

   R3 oznacza C1-C6-alkil;

   R4 oznacza atom wodoru, C1-C6-alkil lub perfluoro-C1-C6-alkil;

   R5 oznacza atom wodoru lub C1-C6-alkil;

   R6 oznacza atom wodoru, C1-C6-alkil lub C1-C6-alkilokarbonyloksy-C1-C6-alkil, albo R6 oznacza grupę o wzorze P-3 w którym R32 oznacza atom wodoru lub C1-C6-alkil; R33 oznacza atom wodoru lub C1-C6-alkil; R34 oznacza atom wodoru lub C1-C6-alkil; h oznacza liczbę całkowitą 0 - 2; g oznacza liczbę całkowitą 0 - 2; a suma h + g wynosi 1-3; albo

   R6 oznacza grupę o wzorze P-4

   PL 207 160 B1

   -(01^-0-(0^)-/)0 Ρ-4

   Η \_/ w którym R32, g i h mają wyżej podane znaczenie; Q' oznacza O; oraz ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.
2. 2. Związek według zastrz. 1, w którym R1 oznacza grupę o wzorze Y-1, w którym R22 i R23 niezależnie oznaczają C1-C6-alkil lub atom chlorowca; a R24 oznacza atom wodoru.
3. 3. Związek według zastrz. 1, w którym R1 oznacza grupę o wzorze Y-1, w którym R22 i R23 niezależnie oznaczają atom wodoru lub atom chlorowca; a R24 oznacza C1-C6-alkoksyl.
4. 4. Związek według zastrz. 1, w którym R1 oznacza grupę o wzorze Y-3, którą stanowi 3-7 członowy pierścień o wzorze ^25 w którym R25 oznacza grupę o wzorze R26-(CH2)e-, w którym R26 oznacza C1-C6-alkoksyl, Q oznacza -(CH2)f-, e oznacza liczbę całkowitą 0-4, a f oznacza liczbę całkowitą 0-3.
5. 5. Związek według zastrz. 1, w którym R1 oznacza grupę o wzorze Y-1 w którym R22 i R23 niezależnie oznaczają perfluoro-C1-C6-alkil, C1-C6-alkil lub atom chlorowca; a R24 oznacza atom wodoru.
6. 6. Związek według zastrz. 5, w którym R2 i R3 oznaczają C1-C6-alkil; R4 oznacza atom wodoru lub C1-C6-alkil, a R5 i R6 oznaczają atom wodoru.
7. 7. Związek według zastrz. 6, wybrany z grupy obejmującej

   N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę;

   N-[(2-bromo-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę;

   N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę;

   N-[(2-etylo-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalanin ę ;

   N-[[2-(2-metyloetylo)-6-metylofenylo]karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę;

   N-[(2,6-difluorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę;

   N-[[2-fluoro-6-(trifluorometylo)fenylo]karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę;

   N-[[2,6-di-(2-metyloetylo)fenylo]karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo]-L-fenyloalaninę;

   N-[(2-chloro-6-etylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę;

   N-[(2-chloro-6-propylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę;

   N-[[2-chloro-6-(2-metyloetylo)fenylo]karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę;

   N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dietylo-6-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę i

   PL 207 160 B1

   N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dietylo-6-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę.
8. 8. Zwią zek wedł ug zastrz. 6, wybrany z grupy obejmują cej

   N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę;

   N-[(2-bromo-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaninę i

   N-[(2-bromo-5-metoksyfenylo)karbonylo]-4-[1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo]-L-fenyloalaninę.
9. 9. Związek według zastrz. 5, w którym R2 i R3 oznaczają C1-C6-alkil; R4 oznacza atom wodoru lub C1-C6-alkil, R5 oznacza atom wodoru, a R6 oznacza atom wodoru, C1-C6-alkilokarbonyloksy-C1-C6alkil lub C1-C6-alkil albo R6 oznacza grupę o wzorze P-3 η

   ι³² /Rja

   -(CHA-C-iCH^-N

   K-34 w którym R32 oznacza atom wodoru lub C1-C6-alkil; R33 oznacza atom wodoru lub C1-C6-alkil; R34 oznacza atom wodoru lub C1-C6-alkil; h oznacza liczbę całkowitą 0 - 2; g oznacza liczbę całkowitą 0 - 2; a suma h + g wynosi 1-3; albo

   R6 oznacza grupę o wzorze P-4

   R₃₂ —(CHj)—C-(CHĄ-N Q' P-4

   H \_f w którym R32, g i h mają wyżej podane znaczenie; a Q' oznacza O.
10. 10. Związek według zastrz. 9, w którym R6 oznacza C1-C6-alkil.
11. 11. Związek według zastrz. 10, który stanowi ester etylowy N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny;

    ester etylowy N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny lub ester etylowy N-[(2,6-difluorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny.
12. 12. Związek według zastrz. 9, w którym R6 oznacza C1-C6-alkilokarbonyloksy- C1-C6-alkil.
13. 13. Związek według zastrz. 12, który stanowi ester 1-(acetoksy)etylowy N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny;

    ester 1-(acetoksy)etylowy N-[(2-chloro-6-metylofenylo)-karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo]-L-fenyloalaniny lub ester 1-(acetoksy)etylowy N-[(2,6-difluorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny.
14. 14. Związek według zastrz. 9, w którym R6 oznacza grupę o wzorze P-3, w którym R32 oznacza atom wodoru; R33 i R34 oznaczają C1-C6-alkil; h oznacza 1; a g oznacza 0.
15. 15. Związek według zastrz. 14, który stanowi ester 2-[(N,N-dietylo)amino]etylowy N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny;

    ester 2-[(N,N-dietylo)amino]etylowy N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny lub ester 2-[(N,N-dietylo)amino]etylowy N-[(2,6-difluorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny.
16. 16. Związek według zastrz. 9, w którym R6 oznacza grupę o wzorze P-4, w którym R32 oznacza atom wodoru; h oznacza 1; g oznacza 0; a Q' oznacza O.
17. 17. Związek według zastrz. 16, który stanowi

    PL 207 160 B1 ester 2-(4-morfolino)etylowy N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny lub ester 2-(4-morfolino)etylowy N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalaniny.
18. 18. Związek według zastrz. 5, w którym R2 i R3 oznaczają C1-C6alkil; R4 oznacza perfluoro-C1-C6-alkil, a R5 i R6 oznaczają atom wodoru.
19. 19. Związek według zastrz. 18, który stanowi

    N-[1-(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo)-L-fenyloalanina;

    N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo)-4-[1,3-dimetylo-2,4-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo]-L-fenyloalani-5 na lub

    N-[[2-fluoro-6-(trifluorometylo)fenylo]karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-6-(trifluorometylo)-5-pirymidynylo)-L-fenyloalanina.
20. 20. Związek według zastrz. 5, w którym R2 i R3 oznaczają C1-C6-alkil; R4 oznacza atom wodoru; R5 oznacza C1-C6-alkil, a R6 oznacza atom wodoru.
21. 21. Związek według zastrz. 20, który stanowi

    N-[(2-chloro-6-metylofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalanina;

    N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalanina; lub

    N-[(2,6-dichlorofenylo)karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-3-metylo-L-fenyloalanina.
22. 22. Związek według zastrz. 1, w którym R1 oznacza grupę o wzorze Y-3, którą stanowi 3-7 członowy pierścień o wzorze ^25

    Υ-3 w którym R25 oznacza grupę o wzorze R26-(CH2)e-, w którym R26 oznacza C1-C6-alkoksyl, Q oznacza -(CH2)f-, e oznacza liczbę całkowitą 0-4, a f oznacza liczbę całkowitą 0-3.
23. 23. Związek według zastrz. 22, w którym R2 i R3 oznaczają C1-C6-alkil, R4 oznacza atom wodoru lub C1-C6-alkil; a R5 i R6 oznaczają atom wodoru.
24. 24. Związek według zastrz. 23, który stanowi

    4-(1,3-dimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)]-N-[[1-(2-metoksyetylo)cyklopentylo]karbonylo]-L-fenyloalanina;

    N-[[1-(2-metoksyetylo)cyklopentylo]karbonylo]-4-(1,3,6-trimetylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-L-fenyloalanina lub

    4-(1,3-dietylo-6-metylo-2,4-diokso-5-pirymidynylo)-N-[[1-(2-metoksyetylo)cyklopentylo]karbonylo]-L-fenyloalanina.
25. 25. Związek według zastrz. 1, w którym R2 i R3 oznaczają C1-C6-alkil; R4 oznacza atom wodoru, a R5 i R6 oznaczają atom wodoru.
26. 26. Związek według zastrz. 25, w którym R1 oznacza grupę o wzorze Y-1.
27. 27. Związek według zastrz. 25, w którym R1 oznacza grupę o wzorze Y-1, w którym R22 i R23 niezależnie oznaczają C1-C6-alkil lub atom chlorowca; a R24 oznacza atom wodoru.
28. 28. Związek według zastrz. 26, w którym R1 oznacza grupę o wzorze Y-1, w którym R22 i R23 niezależnie oznaczają atom wodoru lub atom chlorowca; a R24 oznacza C1-C6-alkoksyl.
29. 29. Związek według zastrz. 25, w którym R1 oznacza pirolidynyl.
30. 30. Związek według zastrz. 25, w którym R1 oznacza grupę o wzorze Y-3.
31. 31. Związek według zastrz. 30, w którym R1 oznacza grupę o wzorze Y-3, w którym R25 oznacza grupę o wzorze R26-(CH2)e-, w którym R26 oznacza C1-C6-alkoksyl, Q oznacza -(CH2)f-, e oznacza liczbę całkowitą 0-4, a f oznacza liczbę całkowitą 0-3.

    PL 207 160 B1
32. 32. Związki pośrednie o ogólnym wzorze II:

    w którym R2-R5 mają znaczenie podane w zastrz. 1, P1 oznacza grupę zabezpieczającą atom azotu, taką jak t-butoksykarbonyl (Boc) lub karbobenzyloksyl, a P2 oznacza grupę zabezpieczającą grupę karboksylową, taką jak C1-C6-alkil lub podstawiony C1-C6-alkil.
33. 33. Związek określony w zastrz. 1-31, do zastosowania jako lek.
34. 34. Środek farmaceutyczny zawierający substancję czynną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera związek określony w zastrz. 1-31 lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól.
35. 35. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1-31 lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli do wytwarzania leku do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów, stwardnienia rozsianego, choroby zapalnej jelit i astmy.