PL196419B1 - Zastosowanie emamektyny albo jej soli do wytwarzania leczniczej karmy dla ryb, lecznicza karma dla ryb oraz premiks do wytwarzania leczniczej karmy dla ryb - Google Patents

Abstract

1. Zastosowanie emamektyny albo jej soli do wytwarzania leczniczej karmy dla ryb do usuwa- nia, ograniczania lub zapobiegania pasozytom w populacji ryb. 7. Lecznicza karma dla ryb do usuwania, ograniczania lub zapobiegania pasozytom w populacji ryb, znamienna tym, ze obok typowych skladników karmy zawiera benzoesan emamektyny w ilosci od 0,01 do 1% wagowych. 8. Premiks do wytwarzania leczniczej karmy dla ryb do usuwania, ograniczania lub zapobiega- nia pasozytom w populacji ryb, znamienny tym, ze zawiera: 0,01% do 1% wagowych benzoesanu emamektyny; 0,001 do 0,2% wagowych srodka konserwujacego; 1 do 4% wagowych glikolu propylenowego lub glikolu polietylenowego; a uzupelnienie stanowi rozcienczalnik. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie emamektyny albo jej soli do wytwarzania leczniczej karmy dla ryb, lecznicza rama dla ryb oraz premiks do wytwarzania leczniczej karmy dla ryb. Przedmioty wynalazku są użyteczne w usuwaniu, ograniczaniu lub zapobieganiu pasożytom w populacji ryb.

Dotychczas kontrola inwazji wszy morskich (Lepeophteirus salmonis i Caligus elongatus) w handlowych gospodarstwach rybnych zależy od stosowania terapii chemicznych (Roth M., Richards R i Sommerville C. (1993) „Current Practices in the Chemotherapeutic Control of Sea Lice Infestations: A review Journal of Fish Diseases (16(1); 1-26). Obecnie ogniska pasożytów zewnętrznych leczy się metodami kąpieli zawierających fosforany organiczne - dichlorwos (Aquagard®, Novartis) i azametiofos (Salmosan®, Novartis), albo nadtlenek wodoru (Salartec®, Brenntag, Paramove® Solvay-Interox), albo syntetyczne pyretroidy, cypermetrynę (Excis®, Vericore) i deltametrynę (Alphamax®, Alpharma). Procedury kąpieli są bardzo pracochłonne, kosztowne i powodują silne stresy u ryb. Ponadto, taka terapia może być niewykonalna w miejscach odkrytych i podczas niesprzyjających warunków atmosferycznych.

Z wyjątkiem cypermetryny (Jakobsen P. J. i Holm J.C. (1990) „Promising Test with New Compound against Salmon Lice Norsk Fiskeoppdrett. styczeń, 16-18), kąpiele lecznicze są skuteczne jedynie wobec wszy w stadium młodzieńczym i dojrzałym rozwoju wszy morskiej, umożliwiając stadiom nimfy (larwa owada o przeobrażeniu niezupełnym) przetrwanie i kontynuację cyklu inwazyjnego. Zatem terapia jest wskazana tylko w przypadku osiągnięcia przez populację fazy młodzieńczej i dojrzałej, , przy czym dla osiągnięcia skutecznej kontroli powinna być często powtarzana. U niektórych populacji wszy morskiej stwierdzono odporność na fosforan organiczny dichlorwos (Jones M.W., Sommerville C.S. i Wootten R. (1992) „Reduced ensitivity of the Salmon Louse, Lepeophtheirus salmonis, to the Organophosphate Dichlorvos Journal of Fish Diseases 15: 197-202). Nadtlenek wodoru może powodować uszkodzenie skrzeli, zaś jego stosowanie ze względu na toksyczność przy wyższych temperaturach wody jest ograniczone do okresu letniego (Thomassen J.M. (1993) „Hydrogen peroxide as a Delousing Agent for Atlantic Salmon w: Pathogens of Wild and Farmed Salmon: Sea Lice (wyd. przez G.Boxshall i D.Defaye) Ellis Horwood Ltd. London).

W przemysłowych hodowlach łososi korzystna byłaby terapia skuteczna wobec wszystkich stadiów rozwoju wszy morskiej i innych pasożytów, odpowiednia do podawania w karmie w celu uniknięcia niedogodności związanych ze stosowaniem kąpieli. Podawanie leku w karmie umożliwia terapię podczas niesprzyjających warunków atmosferycznych i w miejscach odsłoniętych, we wszystkich klatkach danego obszaru oraz wszystkich miejscach systemu zatok lub pojedynczej zatoki, uniemożliwiając w ten sposób inwazję krzyżową, która może nastąpić w czasie kilku dni niezbędnych do przeprowadzenia kąpieli leczniczych we wszystkich klatkach obszaru. Aktualnie dostępne preparaty pokarmowe stanowią regulatory wzrostu owadów, diflubenzuron (Lepsidon®, Ewos) i teflubenzuron (Calcide®, Nutreco) (Erdal J.I. (1997) „New Drug Treatment Hits Sea Lice when They are Most Vulnerable. Fish Farming International t. 24, nr 2). Mechanizm ich działania polega na hamowaniu syntezy chityny (Horst M.N. i Walker A.N. (1996) „Biochemical Effects of Diflubenzuron on Chitin Synthesis in the Post-molt blue crab (Callinectes sapidus) Journal of Crustacean Biology, 15: 401-408) a zatem aktywność ta jest ograniczona do stadiów linienia wszy morskiej.

Awermektyny, wytwarzane przez kulturę Streptomyces avermilitis, posiadają bardzo silne właściwości przeciwrobacze i owadobójcze. Chemicznie modyfikowana pochodna, iwermektyna (22,23dihydroksy-awermektyna B1), została opracowana jako środek o szerokim spektrum działania przeciwpasożytniczego dla bydła, owiec, koni i świń (Sutherland I.H. (1990) „Vetrinary Use of Ivermectin Acta Leidensia 59: 211-216) i jest w sprzedaży na wszystkich rynkach świata od 1981 roku. Iwermektyna jest także szeroko stosowana w leczeniu szeregu zakażeń pasożytniczych u ludzi (Ottesen E.A. i Campbell W.C. (1994) „Ivermecti in Human Medicine Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 34(2): 195-203). Po stwierdzeniu u wszy morskiej oporności na fosforany organiczne (Jones M.W., Sommerville C. S. i Wootten R. (1992) „Reduced Sensitivity of the Salmon Louse, Lepeophtheirus Salmonis, to the Organophosphate Dichlorvos Journal of Fish Diseases 15: 197-202), iwermektynę zaczęto uznawać za terapię alternatywną. Poza nowym mechanizmem działania, jej zaletą jest możliwość stosowania jako leku podawanego w karmie. Jakkolwiek awermektyna nie uzyskała urzędowego zatwierdzenia do stosowania u łososi, to może być przepisywana w Wielkiej Brytanii przez weterynarzy zgodnie z procedurą kaskadową (Anonymous (1998) Amelia nr 8, Veterinary Medicines Directorate, Woodham Lane, Newhaw, Addlestone, Surrey KT153NB), gdy produkty autoryzowane nie zapewniają

PL 196 419B1 skutecznej kontroli inwazji wszy morskiej. Stosowanie awermektyny od szeregu lat wskazuje, że zapewnia ona pewną kontrolę w zazwyczaj stosowanej dawce 25 mg.kg^-1 biomasy dwa razy na tydzień (Rae G.H. (1996) „Guidelines for the Use of Ivermectin Pre-Mix for Pigs to Treat Farmed Salmon For Sea Lice Scottish Salmon Growers Association pamphlet). Jednak stwierdzono, że iwermektyna podawana w ilościach wyższych niż 25 mg.kg^-1 biomasy dwa razy na tydzień jest toksyczna (S.C. Johnson i wsp. „Toxicity and Pathological Effects of Orally Administered Ivermectin In Atlantic, Chinook and Coho Salmon and Steelhead Trout Diseases of Aguatic Organisms, t. 17: 107-112 (1993).

Emamektyna (4-deoksy-4-epimetyloaminoawermektyna B1) została ostatnio zastosowana do traktowania jadalnych płodów roślin (Leibee, G.L., Jansson, R.K., Nuessly, G. i Taylor J. L. (1995) „Efficacy of Emamectin Benzoate and Bacillus thuringensis at Controlling Diamondback Moth (Lepidoptera; Plutellidae) Populations On Cabbage in Florida Florida Entomologist. 78(1); 82-96).

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie emamektyny albo jej soli do wytwarzania leczniczej karmy dla ryb do usuwania, ograniczania lub zapobiegania pasożytom w populacji ryb.

Korzystnie stosuje się 0,5 do 100 mg emamektyny albo jej soli na kilogram leczniczej karmy dla ryb.

Korzystnie pasożyt jest pasożytem wewnętrznym, i wtedy korzystnie stosuje się benzoesan emamektyny.

W innym wykonaniu korzystnie pasożyt jest pasożytem zewnętrznym, i wtedy korzystnie stosuje się benzoesan emamektyny.

Przedmiotem wynalazku jest także lecznicza karma dla ryb do usuwania, ograniczania lub zapobiegania pasożytom w populacji ryb, charakteryzująca się tym, że obok typowych składników karmy zawiera benzoesan emamektyny w ilości od 0,01 do 1% wagowych.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest premiks do wytwarzania leczniczej karmy dla ryb do usuwania, ograniczania lub zapobiegania pasożytom w populacji ryb, zawierający: 0,01% do1% wagowych benzoesanu emamektyny; 0,001 do 0,2% wagowych środka konserwującego; 1 do 4% wagowych glikolu propylenowego lub glikolu polietylenowego;

a uzupełnienie stanowi rozcieńczalnik.

Korzystnie taki premiks zawiera:

0,2% wagowych benzoesanu emamektyny;

0,01% wagowych butylowanego hydroksanizolu;

2,5% wagowych glikolu propylenowego;

49,8% wagowych skrobii kukurydzianej i a uzupełnienie stanowi maltodekstryna M-100.

Przedmioty wynalazku są odpowiednie dla sposobu usuwania, ograniczania lub zapobiegania pasożytom w populacji ryb, obejmującego karmienie populacji ryb emamektyną lub jej soląw dawce dziennej 25 mg do 400 mg na kg biomasy ryb dziennie przez okres 3-14 dni.

Produkty według wynalazku są pakowane w zestaw do przygotowywania karmy leczniczej do usuwania, ograniczania lub zapobiegania pasożytom w populacji ryb, obejmujący emamektynę lub jej sól oraz drukowane instrukcje karmienia emamektyną lub jej solą w dawce dziennej 25 mg do 400 mg na kg biomasy ryb dziennie przez okres 3-14 dni.

Figura 1 przedstawia wykres porównujący średnią ilość osobników nimf (stadia I, II, III i IV) przypadających na rybę w grupie kontrolnej, w porównaniu z grupą otrzymującą dawkę 50 mg/kg w 7 dniu w eksperymencie ustalenia dawki (przykład 1).

Figura 2 stanowi wykres przedstawiający to samo porównanie jak na fig. 1, ale w 14 dniu.

Figura 3 stanowi wykres porównujący średnią ilość osobników nimf (stadia I, II, III i IV) przypadających na rybę w grupie kontrolnej, w porównaniu z grupą otrzymującą dawkę 50 mg/kg w 7 dniu w eksperymencie potwierdzenia dawki (przykład 3).

Figura 4 stanowi wykres przedstawiający to samo porównanie jak na fig. 3, ale w 14 dniu.

Szczegółowy opis wynalazku

Emamektyna (4-deoksy-4-epimetyloaminoawermektyna B₁), którą można wytworzyć tak jak opisano w patentach USA o numerach US-5288710 lub US-5399717, stanowi mieszaninę dwu homologów, 4-deoksy-4-epimetyloaminoawermektyny B1a i 4-deoksy-4-epimetyloaminoawermektyny B1b. Korzystnie stosuje się sól awermektyny. Nieograniczające przykłady soli emamektyny, które mogą być zastosowane w wynalazku obejmują sole opisane w US-5288710, na przykład sole wywodzące się z kwasu benzoesowego, podstawionego kwasu benzoesowego, kwasu benzenosulfenowego, cytrynowego, fosforowego, winowego, maleinowego i podobnych. Najbardziej korzystnie, sól emamektyny stosowaną w wynalazku stanowi benzoesan emamektyny.

PL 196 419B1

Nieoczekiwanie stwierdzono, że emamektyna, stosowana w dawkach i według schematu dawkowania tutaj opisanego, nie jest toksyczna dla populacji ryb. Jest to szczególnie zaskakujące odkrycie, biorąc pod uwagę fakt stwierdzonej toksyczności iwermektyny w stosunkowo niskich dawkach. Ponieważ iwermektyny nie można podawać w kolejnych dniach ze względu na obawę o toksyczność, to istnieje zasadnicze ryzyko, że ze względu na bardziej żarłoczne osobniki nie wszystkie ryby w danej populacji otrzymają odpowiednią dawkę. Możliwość karmienia emamektyna przez kilka kolejnych dni stanowi znaczącą przewagę nad iwermektyną, ponieważ karmienie przez kilka kolejnych dni zwiększa prawdopodobieństwo spożycia jej przez większą liczbę ryb danej populacji.

Emamektynę i jej sole można stosować zgodnie z wynalazkiem dla usunięcia lub ograniczenia wszystkich typów pasożytów rybich, w tym pasożytów zewnętrznych i pasożytów wewnętrznych. Przykłady pasożytów wewnętrznych, które można usunąć lub ograniczyć obejmują, bez ograniczeń, należące do typu Phylum Platyhelminthes (klasy Monogenea, Digenea i Cestoda); Phylum Aschelminthes (klasa niecienie) i pierwotniaki (np. infekcje śluzowe (Phylum Myxozoa), infekcje mikrozarodnikowe (Phylum Microspora), kokcydiozy (Phylum Apicomplexa) oraz Phylum Ciliophora). Przykłady pasożytów zewnętrznych, które można usunąć lub ograniczyć obejmują, bez ograniczeń: monogeneans, pasożyty z typu Phylum Arthropoda (klasa Crustacea, podklasa Branchiura i podklasa Copeptoda (np. obejmująca rzędy Cyclopidea, Caligidea i Lernaeopodidea) oraz pasożyty z rzędu Argulus i Phylum Isopoda.

Stwierdzono, że terapia emamektyną zgodna z wynalazkiem jest szczególnie skuteczna wobec wszy morskich, to jest pasożytów należących do podklasy Copepoda, rząd Caligidea, zwłaszcza należących do rodzaju Lepeophtheirus i Caligus.

Emamektynę można stosować w celu usunięcia lub ograniczenia pasożytów dla każdego gatunku ryb, z odmianami słodkowodnymi i morskimi włącznie. Przykładowe ryby to, bez ograniczeń, łosoś, pstrąg, tuńczyk, jesiotr, turbot, flądra, sola, karp, okoń prążkowany, węgorz, leszcz morski i inne.

Dawka emamektyny skutecznie ograniczająca, usuwająca lub zapobiegająca pasożytom może być rutynowo określona przez weterynarza, jakkolwiek może być różna w zależności od gatunku leczonej ryby, konkretnego pasożyta oraz stopnia inwazji. Korzystnie, emamektynę lub jej sól podaje się w dawce 25 mg do 400 mg na kg biomasy ryb dziennie, bardziej korzystnie, 25 mg do 100 mg na kg biomasy ryb dziennie, najkorzystniej 50 fig do 75 mg na kg biomasy ryb dziennie.

Terapię emamektyną stosuje się codziennie, przez okres 3 do 14 dni, korzystnie przez 7-14 dni, a najkorzystniej przez 1 tydzień. Nieoczekiwanie stwierdzono, że skuteczność emamektyny utrzymuje się przez 8 do 10 tygodni po zakończeniu terapii. Zatem emamektynę można podawać w ilościach profilaktycznych dla zapobiegania pojawieniu się pasożytów.

Zestaw zawierający produkty według wynalazku może mieć dowolną postać odpowiednią do dostarczania emamektyny przez co najmniej 7 dni, łącznie z pisemnymi instrukcjami podawania jej w dawkach i schemacie dawkowania opisanym powyżej. Przykłady obejmują, bez ograniczeń, różnorodne pojemniki (np. butelki, kartony, opakowania blistrowe i ampułki) zaopatrzone we wkładkę opisującą instrukcje dawkowania cyklicznego, przy czym instrukcje dawkowania są nadrukowane lub przymocowane do pojemnika. Emamektyna lub sól emamektyny w zestawie może występować w postaci premiksu, zawierającego jeden lub więcej rozcieńczalników i 0,01 do 1% wagowych emamektyny lub soli emamektyny.

Karmę leczniczą dla ryb można przygotować wprowadzając odpowiednią ilość emamektyny lub jej soli do dostępnego na rynku pokarmu dla ryb do uzyskania pożądanych poziomów dawkowania. Ilość emamektyny wprowadzona do pokarmu dla ryb będzie zależna od dawki, w jakiej karmione są ryby. W przypadku podawania pokarmu w proporcji 0,2% do 4% biomasy/dzień, karma lecznicza korzystnie zawiera od 0,5 do 100 mg emamektyny lub jej soli na kg karmy, bardziej korzystnie od 1 do 50 mg na kg karmy, najkorzystniej od 5 do 15 mg na kg karmy leczniczej.

Chociaż emamektynę można wprowadzić do mieszanki pokarmowej przed poddaniem jej peletyzacji, to karmę leczniczą korzystnie wytwarza się przez powlekanie peletek karmy emamektyną. Do powlekania peletek karmy korzystnie stosuje się premiks zawierający:

(a) 0,01% do 1% wagowych emamektyny lub jej soli;

(b) 0,001 do 0,2% wagowych środka konserwującego;

(c) 1do 4% wagowych glikolu propylenowego lub glikolu polietylenowego; oraz (d) wystarczającą ilość rozcieńczalnika.

PL 196 419B1

Środek konserwujący korzystnie stanowi butylohydroksyanizol (BHA). Korzystnie stosuje się glikol propylenowy. Rozcieńczalnik może stanowić dowolny powszechnie stosowany rozcieńczalnik, np. laktoza, maltodekstryna, skrobia kukurydziana, węglan wapnia, celuloza mikrokrystaliczna, łuska ryżowa, kolba kukurydzy. Korzystnie, rozcieńczalnik stanowi maltodekstryna, skrobia kukurydziana lub ich mieszanina. Szczególnie korzystnie premiks zawiera 0,2% wagowych benzoesanu emamektyny, 0,01% wagowych butylohydroksyanizolu, 2,5% wagowych glikolu propylenowego, 49,8% wagowych skrobi kukurydzianej i wystarczającą ilość maltodekstryny M-100. Premiks korzystnie wytwarza się stosując mieszalnik/granulator o wysokiej sile ścinania, stosując następującą procedurę: rozpuścić BHA, mieszając, w glikolu propylenowym. Załadować skrobię do mieszalnika/granulatora o wysokiej sile ścinania. Kontynuować mieszanie przez 20-40 minut (docelowo 30 minut) dla umożliwienia wchłonięcia roztworu przez skrobię. Wyskrobać wewnętrzną ścianę czaszy mieszalnika w celu usunięcia przywartych substancji. Załadować lek do czaszy mieszalnika przez sito o rozmiarze 20 mesh. Mieszać i przerywać (włączony przerywacz) przez 10 minut. Załadować do czaszy mieszalnika maltodekstrynę i mieszać/przerywać przez dodatkowe 10 minut. Rozładować do pakowania.

Alternatywnie można stosować proces w mieszarce taśmowej: rozpuścić BHA, mieszając, w glikolu propylenowym. Załadować skrobię do mniejszej mieszarki taśmowej (około połowa wielkości wsadu). Uruchomić mieszarkę taśmową i powoli dodawać roztwór BHA do skrobi. Mieszać do ujednorodnienia. Zatrzymać mieszalnik i pozostawić mieszankę w mieszarce na około 30-60 minut. Pobrać niewielką próbkę mieszanki (1-5% objętości wsadu) do niewielkiego mieszalnika planetarnego. Załadować lek do mieszalnika planetarnego i mieszać przez 5 minut. Przenieść mieszankę wstępną z powrotem do mieszarki i przepuścić przez młyn rozdrabniający (Fitzmill) dla rozkruszenia brył. Przenieść zmielony surowiec na kolejny mieszalnik taśmowy. Załadować maltodekstrynę do mieszarki i mieszać przez 10-30 minut. Rozładować do pakowania.

Peletki karmy można powlekać premiksem metodą powlekania na sucho lub powlekania olejowego. W metodzie powlekania na sucho premiks miesza się z peletkami, tak że zostaje jednorodnie rozmieszczony na peletkach, i do mieszaniny dodaje się podgrzany olej rybny lub roślinny do całkowitego pokrycia peletek. W metodzie powlekania olejowego najpierw premiks miesza się z niewielką objętością podgrzanego oleju rybnego lub roślinnego, a następnie miesza się z peletkami jednorodnie rozmieszczając go na nich, do powleczonych peletek dodaje się dodatkowy ogrzany olej rybny lub roślinny i miesza do czasu dokładnego powleczenia peletek.

Poniższe przykłady ilustrują wynalazek, jakkolwiek nie powinny być interpretowane jako ograniczające jego zakres.

P r z y k ł a d y

Trzy eksperymenty przeprowadzono w Institute of Aquaculture Marine Ennnvironmental Research Laboratory w Machrihanish, Szkocja. Narybek łososia atlantyckiego, Salmo salar L., pozyskano ze zdrowej hodowli i aklimatyzowano w oddziale badawczym.

Ryby utrzymywano w powtarzalnych grupach w zbiornikach z tworzywa sztucznego, o objętości 0,54 m³ każdy. Do każdego zbiornika dostarczano naturalną wodę morską o temperaturze oto-1 czenia (7-14°C) i zasoleniu (30-35 ppt), z szybkością około 18 l.min^-1. Zbiorniki były zaopatrzone w sita z oczkami nad odpływem wody dla zatrzymania niezjedzonych przez ryby peletek. Ryby obserwowano codziennie pod kątem ich zachowania i działań niepożądanych leku. Odnotowywano śmiertelność ryb i zniszczenie wszy morskich.

Inwazyjność wszy morskich

Wszy morskie zebrano podczas połowów na handlowych fermach łososi na zachodnim wybrzeżu Szkocji. Jaja zebrane od ciężarnych wszy samic inkubowano w wodzie morskiej w temperaturze otoczenia i zasoleniu w zakresie 32-35 ppt. Po osiągnięciu przez wylęgnięte larwy stadium copepodite, osobniki w ilości 38-170 na rybę wpuszczano do każdego z powtarzalnych zbiorników z rybami i zatrzymywano dopływ wody do każdego zbiornika na około 3 godziny, umożliwiając zaatakowanie ryby przez copepodite. Czynność tę powtarzano 4-5 razy w odstępach 3-5 dni aż do pojawienia się stadiów nimfy I, II, III i IV. Ilość nimf określano w dniach 1 lub 2 przed terapią, na podgrupach ryb (N= 6-9 ryb w zbiorniku). W tym czasie ryby zarażano wszami w stadium młodzieńczym i dorosłym, dodając 5-10 wszy na rybę do każdego zbiornika. Zamykano dopływ wody do każdego zbiornika na około godzinę do czasu zaatakowania ryb przez wszy. Ilość wszy przed terapią szacowano na podstawie podgrupy populacji całkowitej i przedstawiano jako średnią ilość nimf przypadających na rybę. Wtedy ryby przenoszono losowo z czterech zbiorników pierwotnych do zbiorników kontrolnych lub

PL 196 419B1 terapeutycznych, zgodnie z planem eksperymentu dla każdego badania, ani w trakcie ani po terapii nie dokonywano żadnych inwazji.

Lecznicza karma

Podstawę karmy stanowił Fulmar® (BOCM Pauls Ltd.) w postaci peletek do karmienia łososia 3,5 lub 5 mm. Benzoesan emamektyny rozpuszczano w glikolu propylenowym i mieszano z olejem rybnym przed powleczeniem peletek karmy. Karmę kontroIną przygotowywano w ten sam sposób z glikolem propylenowym i olejem rybnym. Lek podawano wnominalnej proporcji dawkowania 0, 25, 50 i 100 mg.kg^-1 masy ryb dziennie, w proporcji 0,5% biomasy, przez okres siedmiu kolejnych dni (dni 0-6). Aktualne spożycie karmy mierzono w każdym zbiorniku zbierając niezjedzone peletki karmy po około 30 minutach od podania i odejmując ilość peletek od dziennej racji pokarmowej. Średnią dawkę spożytą obliczano dla każdej z grup następująco:

Suma dziennego % spożycia karmy

----—--- = średnie spożycie karmy (%)

7dni

-1 -1 średnie spożycie karmy(%) x nominalna dawka (mg.kg^-1)= średnia dawka spożyta (mg.kg^-1)

Ocena wszy morskich

Oceny wszy morskich dokonywano w dniach 7, 14 i 21 od początku terapii. Ryby poddawano znieczuleniu za pomocą p-aminobenzoesanu etylu (benzokainy) i każdą rybę badano pod mikroskopem elektronowym niskiej mocy. Wszy identyfikowano jako nimfa I-IV, stadium młodzieńcze I lub II albo dojrzałe. Wszy w stadium młodzieńczym i dojrzałym dodatkowo identyfikowano jako samce lub samice. Notowano liczbę każdego stadium rozwoju. W tej liczbie była uwzględniona każda wesz wyodrębniona z roztworu znieczulającego, którą przypisywano danej rybie przed przeniesieniem jej do świeżej wody morskiej. Ryby zawracano do zbiorników magazynowych po pobraniu próbki i tę samą rybę poddawano ocenie w dniach 7, 14 i 21.

P r z y k ł a d 1

Badanie zwiększenia dawki

Temperatura wody wynosiła 7-10°C, zasolenie 33-34 ppt . Średnia masa ryby przed terapią wynosiła 192 g (+30 g S.D.). Benzoesan emamektyny podawano w dawkach nominalnych 0, 25, 50 i 100 mg.kg^-1 biomasy ryb. Uwzględniano dwa powtórzenia zbiorników o wielkości próbki 19 albo20 ryb w zbiorniku.

Rezultaty powyższego badania przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1. Badanie zwiększenia dawki: skuteczność benzoesanu emamektyny wobec indukowanej inwazji wszy morskich, Lepeophtheirus salmonis, na łososia atlantyckiego, Salmo salar. Rybom podawano karmę leczniczą w proporcji 0,5% biomasy dziennie przez 7 kolejnych dni (dzień 0-dzień 6). Średnią liczbę wszy morskich określano dnia 7, 14 i 21. Średnią i odchylenie standardowe obliczano z połączonych danych dwu powtórzeń zbiorników (wielkość próbki N=19 lub 20 ryb w zbiorniku).

Czas	Dawka nominalna w mg.kg-1	Średnia dawka* spożyta mg.kg'1	Średnia liczba wszy ogółem (±S.D.)	Średnia liczba nimf (±S.D.)	Średnia liczba stadiów ruchliwych (+S.D.)	% zmniejszenie w stosunku do grupy kontrolnej (wszy ogółem)
	0	0	51,1±15,1	24,3±8,8	26,7±7,8	/
Dzień 7	25	21,5	32,6±10,7	20,9±8,6	11,7±6,0	36,2%
50	45,0	31,9±11,4	24,8±10,3	7,1+4,1	37,5%
	100	91,0	33,0±10,7	29,0±9,8	4,0±3,6	35,4%
	0	44,9±11,1	3,2+2,0	41,7±10,5	41,7±10,5	/
Dzień 14	25	13,1±6,9	9,7±3,9	3,4±6,4	3,4±6,4	70,8%
50	13,4±5,9	12,4±3,5	1,0±1,2	1,0±1,2	70,3%
	100	15,1±5,8	14,1±5,5	1,0±3,2	1,0±3,2	66,4%
	0		34,5±9,3	0,03±0,2	34,5±9,3	/
Dzień 21	25		3,5±2,7	2,4±1,9	1,1±2,2	89,8%
50		1,7±1,3	1,6±1,5	0,1±0,3	95,2%
	100		1,5±1,6	1,2±1,2	0,3±1,0	95,8%

* średnia dawka spożyta jest rzeczywistą dawką obliczoną na podstawie procentowego spożycia karmy w okresie terapii.

PL 196 419B1

P r z y k ł a d 2

Badanie potwierdzenia dawki I

Temperatura wody wynosiła 12-14°C, zasolenie 33-35 ppt. Średnia masa ryby przed terapią wynosiła 224 g (±43 g S.D.). Benzoesan emamektyny podawano w nominalnych dawkach dziennych 0,25 i 50 mg.kg^-1 biomasy ryb. Uwzględniano trzy powtórzenia zbiorników do terapii o wielkości próbki 15 ryb w każdym. Jednakże w tym eksperymencie w wyniku śmiertelności zmniejszyła się liczba ryb umożliwiających ocenę pasożytów pod koniec badań do 9, 10 i 14 w grupach 25 mg.kg^-1, 10, 12 i 13 w grupach 50 m g.kg^-1 i zaledwie 2,5 i 5 w grupach kontrolnych. Z tego powodu przeprowadzono kolejne badanie potwierdzenia dawki II (przykład 3 poniżej). Rezultaty tego badania przedstawiono w tabeli 2.

T a b e l a 2. Badanie potwierdzenia dawki I: skuteczność benzoesanu emamektyny wobec indukowanej inwazji wszy morskich, Lepeophtheirus salmonis, na łososia atlantyckiego, Salmo salar. Rybom podawano karmę leczniczą w proporcji 0,5% biomasy dziennie przez 7 kolejnych dni (dzień 0 - dzień 6). Średnią liczbę wszy morskich określano dnia 7, 14 i 21. Średnia i odchylenie standardowe obliczano z połączonych danych dwu powtórzeń zbiorników (wielkość próbki N= 2-15 ryb w zbiorniku).

Czas	Dawka nominalna mg.kg'1	Średnia dawka* spożyta mg.kg-1	Średnia liczba wszy ogółem (±S.D.)	Średnia liczba nimf (±S.D.)	Średnia liczba stadiów ruchliwych (±S.D.)	% zmniejszenie w stosunku do grupy kontrolnej (wszy ogółem)
	0	0	60,9±15,1	1,9±1,6	59,0±14,9	/
Dzień 7	25	20,2	34,2±15,8	1,8±1,7	32,4±15,4	43,8%
	50	44,3	28,1±13,1	3,2±2,2	24,9±13,2	53,8%
	0		40,9±14,4	0	40,9±14,4	/
Dzień 14	25		9,8±4,4	0,30	9,5±4,4	76,0%
	50		4,9±2,7	0,6	4,3±2,6	88,0%
	0		27,3±9,7	0	27,3±9,7	/
Dzień 21	25		4,9±3,1	0	4,913,1	81,9%
	50		1,6±1,3	0	1,6±1,4	94,3%

* średnia dawka spożyta jest rzeczywistą dawką obliczoną na podstawie procentowego spożycia karmy w okresie terapii.

P r z y k ł a d 3

Badanie potwierdzenia dawki II

Temperatura wody wynosiła 9-12°C, zasolenie 30-34 ppt. Średnia masa ryby przed terapią wynosiła 418,2g (±49 g S.D.). Benzoesan emamektyny podawano w nominalnych dawkach dziennych 0 i 50 mg.kg^-1 biomasy ryb. Stosowano trzy powtórzenia w zbiornikach do terapii o wielkości próbek 15-16 ryb w zbiorniku. Rezultaty tego badania przedstawiono w tabeli 3.

T a b e l a 3. Badanie potwierdzenia dawki II: skuteczność benzoesanu emamektyny wobec indukowanej inwazji wszy morskich, Lepeophtheirus salmonis, na łososia atlantyckiego, Salmo salar. Rybom podawano karmę leczniczą w proporcji 0,5% biomasy dziennie przez 7 kolejnych dni (dzień 0 - dzień 6). Średnią liczbę wszy morskich określano dnia 7, 14 i 21. Średnią i odchylenie standardowe obliczano z połączonych danych z dwu powtórzeń (wielkość próbki N=15-16 ryb w zbiorniku).

Czas	Dawka nominalna mg-kg-1	Średnia dawka* spożyta mg.kg'1	Średnia liczba wszy ogółem (±S.D.)	Średnia liczba nimf (±S.D.)	Średnia liczba stadiów ruchliwych (±S.D.)	% zmniejszenie w stosunku do grupy kontrolnej (wszy ogółem)
Dzień 7	0	0	74,9±17,1	22,7±8,8	52,2±13,4	/
	50	45,7	40,5±12,2	30,0±11,8	10,5+8,1	45,9
Dzień 14	0		50,2±10,3	0,6±0,8	49,5+10,3	/
	50		14,7±5,9	12,7±5,7	2,0±3,2	70,7
Dzień 21	0		38,1±8,6	0,110,3	38,1±8,7	/
	50		2,1±2,1	1,5+1,7	0,6±1,1	97,6

* średnia dawka spożyta jest rzeczywistą dawką obliczoną na podstawie procentowego spożycia karmy w okresie terapii.

PL 196 419B1

Obróbka danych

Rezultaty przedstawiono jako stadia nimfy (stadia I-IV), stadia wszy ruchliwych (stadia młodzieńcze i dojrzale) oraz wszy ogółem (stadia nimfy i ruchliwe razem). Dane dotyczące liczby wszy przypadających na rybę poddano testom F na jednorodność wariancji i testowi korelacji w celu określenia normalności rozkładu. Masy ryb i liczbę wszy przed terapią poddano jednokierunkowemu testowi ANOVA. Ponieważ wariancje nie wykazały heterogeniczności ani rozkładu normalnego, liczbę wszy po terapii analizowano stosując test nieparametryczny Dunn'a (Zar 1984).

We wszystkich trzech badaniach nie stwierdzono znaczących różnic (P>0,05) w ilości nimf i wszy ruchliwych pomiędzy żadnym z powtórzeń w żadnej z prób kontrolnych, 25, 50 lub 100 m g.kg^-1, w żadnym punkcie czasu. Umożliwiło to połączenie w tabelach 1, 2 i 3 danych średnich z każdego zestawu powtórzeń zbiorników. Jednakże dane analizowano także oddzielnie dla powtórzeń każdego zbiornika.

Procentowe zmniejszenie średniej liczby wszy morskich w stosunku do grup kontrolnych obliczano dla każdej dawki następująco:

% zmniejszenia = 100 - (średnia z powtórzeń w grupie terapii) średnia z powtórzeń kontrolnych

Podsumowanie rezultatów dla każdego z trzech badań przedstawiono w tabeli 4.

Tabel a 4. Zebrane dane z badania zwiększenia dawki, badania potwierdzenia dawki I i badania potwierdzenia dawki II w dniu 21: skuteczność benzoesanu emamektyny wobec indukowanej inwazji wszy morskich, Lepeophtheirus salmonis, na łososia atlantyckiego, Salmo salar. Rybom podawano karmę leczniczą w proporcji 0,5% biomasy dziennie przez 7 kolejnych dni (dzień 0-dzień 6).

Badanie	Dawka nominalna mg.kg'1	Średnia dawka spożyta mg.kg-1	Procentowe zmniejszenie (wszy ogółem)	Procent ryb pozbawionych wszy (nimf i ruchliwych)	Procent ryb posiadających wszy ruchliwe (±S.D.)	Procent śmiertelności*
Badanie zwiększenia dawki	0	0	/	0%	0%	5%
25	21,5	89,8%	13,8%	55,0%	0%
50	45,0	95,2%	22,5%	87,5%	0%
100	91,0	95,8%	28,2%	87,0%	2,5%
Badanie	0	0	/	0%	0%	75%
potwierdze-	25	20,2	81,9%	3,0%	6,1%	31%
nia dawki I	50	44,3	94,3%	28,6%	28,6%	27%
Badanie	0	0	/	0%	0%	6%
potwierdzenia dawki II	50	45,7%	94,6%	27%	66,3%	0%

Procentowe zmniejszenie ilości wszy morskich w stosunku do grupy kontrolnej, obliczone ze średnich połączonych powtórzeń dla każdej grupy kontrolnej.

* Oznacza śmiertelność przypisywaną uszkodzeniu wszy morskiej, z wyjątkiem badania potwierdzenia dawki II, gdzie 2% przypadków śmiertelnych w grupie kontrolnej nie przypisano wszom morskim. Wykresy śmiertelności obejmują ryby poddane selekcji.

Analiza i dyskusja rysunków

Spożycie karmy w grupach leczonych mieściło się w przedziale 81-92%. Aktualnie spożyte dawki średnie obliczone dla każdej z grup przedstawiono w tabelach 1, 2 i 3 razem z dawkami nominalnymi. Spożycie karmy mieściło się w zakresie 77-90% w grupach kontrolnych. W okresie badań obserwowano spadek chęci spożycia i aktywności w niektórych grupach kontrolnych. Miało ono związek z wyższą ilością wszy na rybach z grup kontrolnych i było najsilniej zauważalne w okresie wzrostu aktywności wszy morskich, kiedy stadia nimf dojrzewały przekształcając się w bardziej agresywne stadia ruchliwe. Pod koniec badania nie obserwowano znaczących różnic (P>0,05) średnich mas ryb pomiędzy żadną z grup poddawanych terapii i kontrolnych.

Żadnego z działań niepożądanych ani śmiertelności ryb nie przypisano terapii za pomocą benzoesanu emamektyny w żadnej z testowanych dawek. Wystąpiło kilka przypadków śmiertelnych w eksperymencie zwiększenia dawki oraz badaniu potwierdzenia dawki II, ale, ze względu na dużą liczbę wszy, szereg przypadków śmiertelnych lub selekcji wystąpił w badaniu potwierdzenia dawki I (tabela 4).

PL 196 419B1

Badanie zwiększenia dawki

Na początku badania, średnia całkowita liczba nimf przypadających na rybę przed terapią, oparta na podgrupie 10 ryb w zbiorniku wynosiła 58,1 (±21,9). Nie obserwowano znaczących różnic (F3,36 = 1,70, P>0, 05) w poziomie inwazji pomiędzy zbiornikami przed rozdzieleniem i terapią. Liczba wszy, w tym ruchliwych, przed terapią wynosiła 63-68 na rybę.

Rezultaty badania zwiększenia dawki przedstawiono w tabeli 1. Już w dniu 7, całkowita liczba wszy przypadających na rybę zmniejszyła się o 35,4-37,5% we wszystkich grupach leczonych, w porównaniu z grupami kontrolnymi. W dniu 21 średnia liczba wszy przypadających na rybę uległa zmniejszeniu odpowiednio o 89,8, 95,2 i 95,8% w grupach 25, 50 i 100 mg.kg^-1. Wgrupach kontrolnych średnia wynosiła 34,5 wszy na rybę, podczas gdy przy dawce 50 mg.kg^-1 zaledwie 1,7. Liczby wszy w stosunku do grup kontrolnych uległy znaczącemu zmniejszeniu zarówno przy dawkach 50 jak i 100 mg.kg^-1 w dniach 7, 14 (P<0,05) i 21 (P<0,001) od rozpoczęcia leczenia. Jednakże nie obserwowano znaczącej różnicy pomiędzy dawkami 50 i 100 mg.kg^-1.

Dane analizowano także niezależnie, pod kątem występowania stadiów nimfy i ruchliwego. Wykazały one, że od dnia 7 do 21 średnia liczba wszy ruchliwych wzrosła w grupach kontrolnych średnio z 26,7 do 34,5 na rybę w związku z dojrzewaniem nimf (tabela 1). Przeciwnie, średnia liczba wszy ruchliwych w grupach poddawanych terapii zmniejszyła się aż do 0,1-1,1 na rybę w dniu 21.

Średnie liczby nimf zmniejszyły się również w grupach kontrolnych z powodu ich dojrzewania, wskutek czego zwiększyła się liczba wszy ruchliwych (tabela 1). Jednakże, we wszystkich trzech grupach poddawanych terapii, średnia liczba nimf zmniejszała się wolniej i nie obserwowano odpowiedniego wzrostu liczby wszy w stadium ruchliwym. W dniach 14 i 21, liczba nimf była większa we wszystkich trzech grupach poddawanych terapii niż w grupach kontrolnych. Jednakże wiele spośród nimf występujących na rybach leczonych miało wygląd nienormalny i zostało uznanych za martwe lub niezdolne do życia. W dniu 7 więcej nimf w stadiach I i II było na rybach poddawanych terapii niż na rybach kontrolnych, które miały większy udział nimf w stadiach III i IV, jak to przedstawia wykres fig. 1. W dniu 14 (fig. 2) na rybach poddawanych terapii wciąż występowały nimfy w stadiach I i II, podczas gdy w grupach kontrolnych nimf w stadiach I i II nie obserwowano, tylko nieliczne nimfy w stadiach III i IV. W dniu 21 u wielu z ryb leczonych nie występowały wszy ruchliwe, podczas gdy niektóre ryby były całkowicie pozbawione zarówno nimf jak i wszy ruchliwych. W przeciwieństwie do tego żadna z ryb z grupy kontrolnej nie była całkowicie pozbawiona wszy ruchliwych (tabela 4).

Badanie potwierdzenia dawki I

Na początku badania całkowita średnia liczba nimf przypadających na rybę przed terapią, na podstawie podgrupy dziewięciu ryb w zbiorniku, wynosiła 82,3 (±36,6). Nie obserwowano znaczących różnic (F3/32 = 0,55, P>0,05) w poziomie inwazji pomiędzy zbiornikami przed ponownym rozdzieleniem i terapią. Całkowita średnia liczba wszy, w tym ruchliwych, wynosiła 87-92 na rybę.

W badaniu tym obserwowano pewną liczbę ryb martwych lub wyselekcjonowanych w wyniku wysokiego poziomu inwazji. W grupach kontrolnych, gdzie liczba wszy pozostała wysoka, 75% ryb zmarło lub zostało poddanych selekcji, podczas gdy zmarło lub zostało poddane selekcji tylko 27% ryb leczonych dawką 50 mg.kg^-1 (tabela 4). Badanie martwych ryb w grupach kontrolnych ujawniło bardzo wysoką liczbą wszy ruchliwych i, jak można przypuszczać, ryby kontrolne, które przeżyły do dnia 21 były tymi, które miały mniejszą liczbę wszy. Zatem, średnia liczbą wszy przypadających na rybę w dniu 21 mogła być znacznie wyższa gdyby wszystkie ryby z grup kontrolnych przeżyły. Wszystkie przypadki śmiertelne i poddane selekcji przypisano uszkodzeniom wywołanym działaniem wszy. Uszkodzenia powodowane przez wszy zarówno w grupach kontrolnej jak i leczonej objawiały się powierzchniami erozji naskórka okolic czaszkowej i grzbietowej, którym towarzyszyła zmniejszona chęć spożywania karmy u tych osobników. W dniu 21, ogólny wygląd i chęć spożywania przez ryby karmy w grupach poddawanych terapii uległa znaczącej poprawie. Przeciwnie, kilka cierpiących ryb w grupach kontrolnych posiadało uszkodzenia spowodowane przez wszy i w dalszym ciągu nie wykazywało chęci do jedzenia.

Rezultaty badania potwierdzenia dawki I przedstawiono w tabeli 2. W grupach leczonych całkowita średnia liczba wszy uległa zmniejszeniu o 44-45% już w dniu 7 w porównaniu z grupami kontrolnymi, a pod koniec badań w dniu 21, średnia liczba wszy uległa zmniejszeniu o 82% w grupach 25 mg.kg^-1 i o94% w grupach 50 mg.kg^-1. Przy najwyższej dawce 50 mq.kq^-1 liczba wszy morskich uległa znaczącemu zmniejszeniu w porównaniu z dwoma z trzech grup kontrolnych w dniach 14 i 21 (P<0,05). W trzeciej równoległej grupie kontrolnej wielkość próby pod koniec badań wynosiła zaledwie dwie ryby, w związku z czym nie została uwzględniona w analizie. Jakkolwiek

PL 196 419B1 nie wystąpiły znaczące różnice pomiędzy poszczególnymi równoległymi grupami kontrolnymi a gru-1 pą 25 mg.kg^-1, kiedy dane połączono dla uzyskania próby o większej wielkości, nie zaobserwowano znaczącej różnicy (P<0,0010) pomiędzy tymi dwoma terapiami. Nie występowała także znacząca -1 -1 różnica 0* pomiędzy równoległymi grupami 25 mg.kg^-1 i dwoma spośród powtórzeń 50 mg.kg^-1, ale znowu, kiedy dane dla tych grup połączono, dwie dawki okazały się znacząco różne (P<0,001). W dniu 21 połączone średnie liczby wszy wyniosły 27,3 na rybę w grupie kontrolnej, 4,9 w grupie 25 mg.kg^-1 i 1,6 w grupie 50 mg.kg^-1, odpowiednio.

Mimo, iż na początku badania było obecnych stosunkowo niewiele wszy w stadium ruchliwym młodzieńczym i dojrzałym, ilość ich wzrosła we wszystkich grupach w dniu 7 w związku z dojrzewaniem (tabela 2). Wzrost liczby wszy ruchliwych na rybach w dwu grupach poddawanych terapii był słabszy niż obserwowano w grupach kontrolnych. Pomiędzy dniami 7 i 21, średnia liczba wszy zmniejszyła się w grupach kontrolnych z powodu naturalnej śmiertelności i, w tym badaniu, ze względu na śmierć lub selekcję najciężej zaatakowanych ryb. W grupach leczonych spadek średniej liczby wszy był nawet wyższy przez cały czas i w dniu 21, całkowita liczba wszy była o 82-94 niższa niż w grupach kontrolnych.

Tabela 2 pokazuje, że średnia liczba nimf w grupach kontrolnej i 25 mg.kg^-1 zmniejszyła się od początku badań do dnia 14. W dniach 7 i 14 liczba nimf była nieznacznie wyższa w grupie 50 mg.kg^-1, ale znowu stwierdzono, że nimfy występujące na rybach są niezdolne do życia, tak że w dniu 21 na żadnej z badanych ryb nie pozostawała żadna nimfa.

W dniu 21, 28,6% ryb z grup 50 m g.kg^-1 było całkowicie pozbawionych zarówno nimf jak i wszy ruchliwych (tabela 4). Przeciwnie, jedynie 3% ryb w grupie 25 mg.kg^-1 i żadna w grupie kontrolnej nie była całkowicie pozbawiona wszy.

Badanie potwierdzenia dawki II

Nie obserwowano znaczących różnic (F₃,₃2 =0,428, P>0,05) w poziomie inwazji nimf pomiędzy zbiornikami przed ponownym rozdzieleniem ryb i terapią. Liczba wszy w okresie przed terapią, w tym wszy ruchliwych, wynosiła 79-84 na rybę.

Rezultaty przedstawione w tabeli 3 pokazują, że już w dniu 7 średnią całkowita liczba wszy w grupach 50 mg.kg^-1 była mniejsza w stosunku do grup kontrolnych o 46%, a w dniu 21 o 95%. W dniu 21 w grupach kontrolnych średnia całkowita wynosiła 38,1 wszy przypadających na rybę, podczas gdy w grupach 50 mg.kg^-1 średnio jedynie 2,1 wszy na rybę.Liczby wszy były znacząco mniejsze (P<0,001) we wszystkich grupach leczonych 50 mg.kg^-1, w porównaniu z trzema grupami kontrolnymi, w dniach 7, 14 i 21.

Przeciętna liczba wszy ruchliwych w grupach kontrolnych wykazała spadek od 52,2 na rybę w dniu 7 do 38,1 na rybę w dniu 21 (tabela 3). W tym samym okresie średnia liczba wszy ruchliwych w grupach 50 mg.kg^-1 zmniejszała się znacznie szybciej i w dniu 21 wynosiła średnio 0,6 wszy na rybę. Średnie liczby nimf zmniejszały się w grupach kontrolnych wraz z ich dojrzewaniem, tak że w rzeczywistości w dniu 14 nie odnotowano żadnej nimfy (tabela 3). Wkażdej próbce, więcej nimf pozostawało na rybie poddawanej terapii niż na rybie z grupy kontrolnej i w dniu 14 różnica ta była statystycznie znacząca (P<0,001). W dniu 21 stwierdzono, że wiele spośród nimf przetrwałych na rybach poddawanych terapii stanowią postaci zdegenerowane i uznano je za zatrzymane w rozwoju i niezdolne do życia. Figury 3 i 4 przedstawiają proporcje poszczególnych stadiów nimf w grupach kontrolnych i poddawanych terapii w dniach 7 i 14. W dniu 7 obserwowano większy udział nimf I i II na rybach poddawanych terapii, podczas gdy ryby z grupy kontrolnej posiadały więcej nimf w stadiach III i IV oraz niewiele w stadiach I i II, podczasgdy u ryb z grupy kontrolnej w dalszym ciągu średnia wynosiła tylko 0,4 nimfy IV na rybę (figura 4).

Na zakończenie badań, u 27% ryb poddawanych terapii nie obserwowano nimf ani wszy ruchliwych, a u 65% wszy ruchliwych. W przeciwieństwie do tego żadna z ryb z grup kontrolnych nie była całkowicie pozbawiona nimf ani wszy ruchliwych w dowolnym stadium (tabela 4). W dniu 21, 21% ryb z grup kontrolnych miało w wyniku aktywności wszy miejsca chorobowo zmienione na czaszce. Nie odnotowano występowania żadnych miejsc chorobowo zmienionych u ryb z grup 50 mg.kg^-1, ani śmiertelności ryb w żadnej z grup poddawanych leczeniu, podczas gdy 4% ryb z grup kontrolnych zostało poddane selekcji z badań z powodu uszkodzeń wywołanych przez wszy morskie.

Doustna terapia łososia atlantyckiego za pomocą benzoesanu emamektyny wykazała we wszystkich trzech badaniach jego bardzo wysoką skuteczność wobec stadiów ruchliwego i nimfy L. Salmonis. Benzoesan emamektyny w dawce 50 mg.kg^-1 okazał się równie skuteczny jak w dawce 100 mg.kg^-1. W badaniu potwierdzenia dawki I, średnia całkowita liczba wszy występująPL 196 419B1 cych na rybach poddawanych terapii dawką 25 mg.kg^-1 nie różniła się w sposób znaczący od liczb wgrupach kontrolnych, podczas gdy ryby poddawane terapii dawką 50 mg.kg^-1 miały znacznie mniej -1 -1 wszy niż ryby leczone dawką 25 mg.kg^-1. W badaniu tym, grupy poddawane terapii dawką 25 mg.kg^-1 otrzymywały dawkę aktualną obliczoną w oparciu o spożycie karmy tylko 18,7-22,0 mg.kg^-1. Zgodnie z oczekiwaniami osobniki silnie zaatakowane na początku badań wykazały mniejsze spożycie karmy, a więc i spożycie leku, w związku z czym nie mogły w pełni skorzystać z terapii. To skutkowało stosunkowo wysoką śmiertelnością i częstotliwością selekcji w tej grupie i we wszystkich przypadkach zostało przypisane uszkodzeniu wszy. Jakkolwiek liczba nimf pozostawała wyższa na rybach poddawanych terapii niż na rybach z grup kontrolnych, brak jakiegokolwiek odpowiedniego wzrostu liczby wszy ruchliwych i opóźniony rozwój różnych stadiów nimf wyraźnie wskazują, że leczenie za pomocą benzoesanu emamektyny jest wysoce skuteczne przeciw dojrzałym stadiom nimf.

W wyniku leczenia dawką 50 mg.kg^-1 benzoesanu emamektyny, udział procentowy ryb pozbawionych wszy ruchliwych był wysoki i wynosił 87%. Jakkolwiek udział procentowy ryb pozbawionych wszy w jakimkolwiek stadium rozwoju wynosił jedynie 20-30%, większość ryb z wszami posiadała jedynie wszy w stadiach nimfy. Mimo iż wiele nimf na rybach poddawanych leczeniu nie miała normalnego wyglądu iuważana byłą za martwe lub niezdolne do życia, przetrwały one na rybach, ponieważ zaatakowanie struktury włókna czołowego zajmuje nieco czasu do pojawienia się uszkodzenia i odklejenia. Podczas gdy skuteczność leku wobec stadiów nimfy jest korzystna w powstrzymywaniu ich rozwoju w bardziej szkodliwe stadia ruchliwe, gwałtowne zmniejszenie liczby wszy ruchliwych jest również ważne, jako że uszkadzają one żywiciela znacznie silniej. Już w dniu 7 od zapoczątkowania terapii liczba wszy ruchliwych na rybach leczonych dawką 50 mg.kg^-1 uległa zmniejszeniu aż o 58-80%.

Usunięcie wszy w następstwie terapii benzoesanememamektyny wykazało w rezultacie ograniczenie ilości miejsc chorobowo zmienionych naskórka spowodowanych obecnością pasożyta. W badaniu potwierdzenia dawki I uszkodzenia powodowane przez wszy spowodowały pewną liczbę przypadków śmierci i selekcji ryb, które wpłynęły na ocenę wartościową badań. Z tego powodu badanie powtórzono, ale jego rezultaty wskazują na korzystne działanie ochronne emamektyny.

Większość licencjonowanych preparatów dostępnych do kontroli inwazji wszy morskich nie jest jednocześnie skuteczna wobec niedojrzałych nimf i dojrzałych stadiów ruchliwych (Roth, Richards i Sommerville 1993) i leczenie musi być dokładnie określone w czasie dla uzyskania pewności, że większość wszy zostanie potraktowana we wrażliwym stadium cyklu życiowego. Larwy wszy mogą następnie osiągnąć zdolne do rozrodu stadia dorosłe, tak, że populacja ulega ciągłemu odtwarzaniu. Zaletę terapii skutecznej wobec wszystkich stadiów rozwoju pasożyta stanowi możliwość kontroli wszy w dowolnym momencie ich cyklu życiowego i zapobieganie w ten sposób reprodukcji. Leczenie pokarmowe pozwala jednocześnie kontrolować wszystkie klatki, tak, że możliwa jest kontrola wszystkich miejsc i obszarów, co pociąga za sobą zmniejszenie częstotliwości leczenia.

Podczas gdy obecny wynalazek został opisany w związku ze szczególnymi przykładami jego realizacji, dla przeciętnego fachowca będzie z nich wynikać wiele alternatyw, modyfikacji i odmian. Intencją wynalazku jest objęcie duchem i zakresem wynalazku wszystkich tych alternatyw, modyfikacji i odmian.

Claims (9)

1. Zastosowanie emamektyny albo jej soli do wytwarzania leczniczej karmy dla ryb do usuwania, ograniczania lub zapobiegania pasożytom w populacji ryb.

2. Zastosowanie według zastrz.1, znamienne tym, że stosuje się 0,5 do 100 mg emamektyny albo jej soli na kilogram leczniczej karmy dla ryb.

3. Zastosowanie według zastrz.1, znamienne tym, że pasożyt jest pasożytem wewnętrznym.

4. Zastosowanie według zastrz.3, znamienne tym,że stosuje się benzoesan emamektyny.

5. Zastosowanie według zastrz.1, znamienne tym, że pasożyt jest pasożytem zewnętrznym.

6. Zastosowanie według zastrz.5, znamienne tym, że stosuje się benzoesan emamektyny.

7. Lecznicza karma dla ryb do usuwania, ograniczania lub zapobiegania pasożytom w populacji ryb, znamienna tym, że obok typowych składników karmy zawiera benzoesan emamektyny w ilości od 0,01 do 1% wagowych.

PL 196 419B1

8. Premiks do wytwarzania leczniczej karmy dla ryb do usuwania, ograniczania lub zapobiegania pasożytom w populacji ryb, znamienny tym, że zawiera:

0,01% do 1% wagowych benzoesanu emamektyny;

0,001 do 0,2% wagowych środka konserwującego;

1 do 4% wagowych glikolu propylenowego lub glikolu polietylenowego; a uzupełnienie stanowi rozcieńczalnik.

9. Premiks według zastrz. 7, znamienny tym, że zawiera:

0,2% wagowych benzoesanu emamektyny;

0,01% wagowych butylowanego hydroksanizolu;

2,5% wagowych glikolu propylenowego;

49,8% wagowych skrobii kukurydzianej i a uzupełnienie stanowi maltodekstryna M-100.