PL194221B1 - Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFalfa, dimery, oligomery lub multimery zmodyfikowanej cząsteczki ludzkiego TNFalfa, wyizolowana cząsteczka DNA, wektor, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, sposób wytwarzania zmodyfikowanej cząsteczki ludzkiego TNFalfa, szczepionki przeciwko TNFalfa oraz zastosowanie przynajmniej jednej zmodyfikowanej cząsteczki ludzkiego TNFalfa - Google Patents

Abstract

1. Zmodyfikowana czasteczka ludzkiego TNFa zdolna do indukowania przeciwcial neutralizuja- cych przeciwko ludzkiemu TNFa typu dzikiego po podaniu tej zmodyfikowanej czasteczki TNFa ludz- kiemu gospodarzowi, przy czym przynajmniej jeden segment czasteczki ludzkiego TNFa zostal zasta- piony przynajmniej jednym peptydem zawierajacy immunodominujacy epitop komórek T lub skrócona postacia takiej czasteczki zawierajaca immunodominujacy epitop komórek T, i jeden lub obydwa re- giony flankujace czasteczke ludzkiego TNFa z przynajmniej jednym epitopem TNFa dla komórek B, przy czym substytucja jest wprowadzana w dowolnej z nici nalezacej do przedniej harmonijki ß, w dowolnej z petli laczacych i/lub w dowolnej z nici B', l lub D nalezacych do tylnej harmonijki ß, przy czym substytucja zostala dokonana w regionach czasteczki TNFa tak, zeby zachowac strukture har- monijki ß nici B i G, i przy czym substytucja prowadzi do inaktywacji aktywnosci biologicznej ludzkie- go TNFa testowanej w oznaczeniu biologicznym L929. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFa, dimery, oligomery lub multimery zmodyfikowanej cząsteczki ludzkiego TNFα, wyizolowana cząsteczka DNA kodująca zmodyfikowaną cząsteczkę ludzkiego TNFα, wektor zawierający wyizolowaną cząsteczkę DNA, wektor ekspresyjny zawierający wyizolowaną cząsteczkę DNA, komórka gospodarza transformowana wektorem ekspresyjnym, sposób wytwarzania zmodyfikowanej cząsteczki ludzkiego TNFα, szczepionki przeciwko TNFα oraz zastosowanie przynajmniej jednej zmodyfikowanej cząsteczki ludzkiego TNFα.

Fizjologiczną funkcją układu immunologicznego kręgowców jest zapewnienie mechanizmem obronnym przeciwko inwazji na organizm obiektów zakaźnych, takich jak mikroorganizmy. Obce białka są sprawnie usuwane przez układ siateczkowo-śródbłonkowy zaopatrzony w wysoce specyficzne i krążące przeciwciała, a wirusy i bakterie są atakowane przez złożone systemy komórkowych i humoralnych mechanizmów, włącznie z przeciwciałami, cytotoksyną T, limfocytami (CTL), komórkami naturalnych zabójców (NK), dopełniaczem, itd. Najistotniejszym z nich jest limfocyt pomocniczy (TH), który we współpracy z komórkami prezentującymi antygeny (APC) reguluje obronę immunologiczną przez złożoną sieć cytokin.

Limfocyty TH rozpoznają antygeny białkowe obecne na powierzchni APC. Jednakże nie rozpoznają one natywnych antygenów jako takich. Zamiast tego, wydaje się że rozpoznają kompleksowy ligand złożony z dwóch części, przetworzonego (podzielonego) białkowego antygenu (tak zwany epitop komórki T) oraz cząsteczki kompleksu zgodności tkankowej klasy II (O. Werdelin i wsp., Imm. Rev. 106, 181 (1988)). Tego rodzaju rozpoznanie ostatecznie umożliwia limfocytom TH specyficzną pomoc limfocytom B w produkowaniu przeciwciała przeciwko nienaruszonym antygenom białkowym (Werdelin i wsp., supra). Dana komórka T rozpoznaje tylko pewne połączenie antygen-MHC, lecz nie rozpozna tego samego lub innego antygenu w obecności produktu genu z innego allelu MHC. To zjawisko zostało nazwane restrykcją MHC.

Fragmenty własnych białek są także prezentowane przez APC, lecz normalnie takie fragmenty są ignorowane lub nie rozpoznawane przez limfocyt TH. Jest to główną przyczyną dla której osobniki nie posiadają w surowicy autoprzeciwciał, które ostatecznie prowadziłyby atak na własne białka osobnicze (tak zwane białka własne lub autoproteiny). Jakkolwiek w pewnych przypadkach proces ten jest upośledzony i układ immunologiczny obraca się przeciwko własnym składnikom osobniczym co może prowadzić do choroby autoimmunologicznej.

Obecność pewnych białek własnych jest w pewnych przypadkach niewskazana, zwłaszcza na podniesionym poziomie, ponieważ indukuje wystąpienie objawów chorobowych. Czynnik martwicy nowotworu α (TNFα) jest znany z tego, że może powodować wyniszczenie u pacjentów z nowotworem lub u cierpiących na inne przewlekłe choroby. (H.N. Langstein i wsp. Cancer Res. 51, 2302-2306, 1991). TNFα odgrywa także ważną rolę w procesach zapalnych (W.P. Arend i wsp. Arthritis Rheum. 33, 305-315, 1990), a zneutralizowanie TNFα przy użyciu przeciwciał monoklonalnych okazało się wywierać korzystne efekty u pacjentów z przewlekłymi chorobami zapalnymi, takimi jak reumatoidalne zapalenie stawów, Elliott i wsp., Lancet 1994, 344:1105-10 i „Choroba crohna”, van Dullemen i wsp., Gastroenterology 109 (1):129-135 (1995). Istnieje więc zapotrzebowanie na sposób indukcji przeciwciał neutralizujących i szczepionkę, która posiada tą własność.

Czynnik martwicy nowotworu (TNF) jest białkiem regulacyjnym należącym do rodziny cytokin (zobacz Walsh, G. i Headon, D.E., Protein Biotechnology, 1994, John Wiley & Sons Ltd. England, p. 257-267), do której należą również interferony i interleukiny. Obecnie są rozpoznane dwie formy TNF: TNFα i TNFβ. Chociaż oba białka wiążą się z tymi samymi receptorami i wywołują zasadniczo podobne biologiczne reakcje to są różnymi cząsteczkami wykazującymi co najwyżej 30% homologii. Oryginalny termin czynnik martwicy nowotworu, w skrócie TNF, właściwiej nazwany TNFα jest także znany jako kachektyna. TNFβjest nazywany limfotoksyną.

TNFα jest produkowany przez bardzo wiele typów komórek, do najbardziej znaczących należą makrofagi, monocyty, pewne limfocyty T i komórki NK, oprócz tego komórki mózgu i wątroby. Najbardziej znanym czynnikiem wywołującym syntezę TNFα jest biocząsteczka kompleksowa zwana lipopolisacharydem (LPS). Zbudowany jest on z części tłuszczowej i polisacharydowej i jest także zaliczany do endotoksyn. Lipopolisacharyd jest pozbawiony jakichkolwiek właściwości antynowotworowych. W surowicy zwierząt zaszczepianych lipopolisacharydem stwierdzono obecność czynnika toksycznego wobec komórek nowotworowych, czynnik ten produkowany przez specyficzne komórki w odpowiedzi na obecność lipopolisacharydu został nazwany czynnikiem martwicy nowotworu. Różne inne czynniki

PL 194 221 B1 takie jak wirusy, grzyby, pasożyty również stymulują syntezę i uwolnienie tej cytokiny. Co więcej, TNFa może działać w sposób autokrynny, stymulując swą własną produkcję.

Natywny ludzki TNFα jest homotrimerem, złożonym z trzech identycznych podjednostek polipeptydowych, ściśle zasocjowanych wokół potrójnej osi symetrii co zostanie poniżej wytłumaczone. Takim ułożeniem przypomina zespoły podjednostek kapsydowych białek wirusowych. Pojedyncza podjednostka polipeptydowa ludzkiego TNFα jest nieglikozylowana i zawiera 157 aminokwasów. Cząsteczka ma masę cząsteczkową 17300 Da, i zawiera pojedyncze międzyłańcuchowe wiązanie disiarczkowe. Ludzki TNFα jest syntetyzowany początkowo jako 233 aminokwasowa cząsteczka prekursorowa. Proteolityczne cięcie sekwencji od -76 do -1 w tym sekwencji sygnałowej uwalnia natywny TNFα. TNFα może także występować w postaci cząsteczki 2600 Da związanej z błoną. Trzy monomeryczne podjednostki TNFα asocjują niekowalencyjnie do trimeru co zostanie wytłumaczone poniżej.

TNFα indukuje swe skutki biologiczne przez wiązanie ze specyficznymi receptorami obecnymi na powierzchni podatnych komórek. Zidentyfikowano dwa odrębne receptory TNFα. Jeden (TNF-R55) ma masę cząsteczkową 55000 Da, a drugi (TNF-R75) około 75000 Da. Te dwa odrębne receptory wykazują nie więcej niż 25% homologii sekwencji. TNF-R55 jest obecny na bardzo wielu komórkach, podczas gdy występowanie TNF-R75 jest bardziej ograniczone. Oba są przezbłonowymi glikoproteinami z pozakomórkową domeną wiążącą, przezbłonową domeną hydrofobową i wewnątrzkomórkową domeną efektorową.

Dokładny cząsteczkowy mechanizm dzięki któremu TNFα wywołuje swe skutki biologiczne nie został jeszcze poznany. Wydaje się, że wiązanie TNFα z receptorem wzbudza oprócz aktywacji cyklazy adenylowej, fosfolipazy A2 i kinaz białkowych różnorodne skutki zależne od białek G. Dokładne biologiczne skutki wywołane przez TNFα mogą różnić się w zależności od typu komórki. Inne czynniki, takie jak obecność dodatkowych cytokin, dodatkowo przekształcają skutki molekularne przypisywane działaniu TNFα na wrażliwe komórki.

Gen TNFα został sklonowany i insertowany w wiele układów ekspresji rekombinacyjnej, zarówno bakteryjnych jak i eukariotycznych. Dzięki temu osiągnięto dużą dostępność do oczyszczonych, biologicznie czynnych TNFα, które ułatwiły kliniczną ocenę wielu chorób, zwłaszcza nowotworów. Wiele prób z użyciem TNFα, zarówno samym jak i w kombinacji z interferonami, dało jednakże bardzo rozczarowujące efekty. Większość TNFα nie może być podawana pacjentom posiadającym własne toksyny, które jeśli nie są letalne to wywołują efekty uboczne.

Jak wspomniano powyżej wydłużona produkcja na niewłaściwym podwyższonym poziomie TNFα została także zaliczona do przyczyn rozwoju kacheksji, zespołu wyniszczającego często powiązanego z przewlekłymi zarażeniami pasożytniczymi lub innymi, a także z rakiem. TNFα jest także zaangażowany w przerzutowanie i wzrost nowotworu, a także w indukcję niedokrwistości. Co więcej TNFα jest bezpośrednio odpowiedzialny za rozwój pewnych przewlekłych stanów zapalnych u ludzi, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów i choroba Crohna, w których wykazano, że podanie przeciwciała monoklonalnego anty-TNFα jest dobroczynne. TNFα zaangażowany jest także w osteoporozę i łuszczycę. Dodatkowo na modelu zwierzęcym wykazano, że podanie przeciwciała anty-TNFα może zmniejszyć lub zapobiec odrzutom szczepionych lub przeszczepionych tkanek.

Struktura TNFα

Poznano strukturę trójwymiarową ludzkiego czynnika martwicy nowotworu (TNFα) (zobacz „Tumor Necrosis Factors, Structure, Function and Mechanism of Action” pod redakcją Bharat B. Aggarwal i Jan Vilcek, 1992 Marcel Dekker, Ind., New York, Chapter 5 „Crystal structure of TNFα”, Jones, E.Y. Stuart, D.I. i Walker N.P.C.). Biologiczne działanie TNFα zależy od jego współdziałania z jego receptorami. Te wzajemne oddziaływania są determinowane przez dokładne ułożenie odpowiednio złożonej trzeciorzędowej struktury. Tak więc aby zrozumieć jak cząsteczki TNFα wykonują swoje biologiczne funkcje na poziomie oddziaływań aminokwasowych trzeba znać nie tylko sekwencje aminokwasową ale także strukturę trzeciorzędową.

Struktura trzeciorzędowa

Konformacja trimeru biologicznie czynnego TNFα w roztworze została poznana za pomocą ultrawirowania analitycznego, spektroskopii rentgenowskiej z małym kątem rozrzutu oraz elektroforezy żelowej, a badania metodą wiązań krzyżowych („cross-linking”) wskazały że jest to aktywna forma tego białka (Smith i Baglioni, 1987, J. Biol. Chemistry 252, 6951-6954). Testy wiązania pokazały, że trimer był co najmniej 8-krotnie bardziej aktywny niż monomer. Eksperymentalne dowody wykazały, że zarówno naturalne jak i zrekombinowane TNFα występują w warunkach fizjologicznych w przeważającej mierze jako trimer. Analiza dichroizmu kołowego umiejscowiła TNFα we wszystkich klasach białek

PL 194 221 B1 (Davis et al., Biochemistry 1987, 26, 1322-1326 - wyniki badań strukturalnych oczyszczonych rekombinantów TNFα przy użyciu miareczkowania kwasem siarkowym, filtracji żelowej i dichroizmu kołowego). Doniesiono o kilku różnych formach krystalicznych ludzkich rekombinantów TNFα. Wszystkie formy krystaliczne wykazują trzykrotną krystalograficzną i/lub niekrystalograficzną symetrię specyficzną dla krystalicznego trimeru TNFα, co wykazuje, że TNFα występuje w krysztale w formie trimeru. Trimery TNFα leżą w luźno upakowanych tablicach perforowanych kanalikami rozpuszczalnika o średnicy 10 nm. Tylko niewielka część powierzchni cząsteczki jest zaangażowana w kontaktowanie w upakowaniu krystalicznu. Taki rodzaj kontaktowania może nieco zaburzać preferowaną konformację przyjmowaną w roztworze kilku bocznych łańcuchów i być może nawet krótkich części elastycznego głównego łańcucha.

Zwinięcie głównego łańcucha monomeru TNFα

Kształt ogólny pojedynczej 157 aminokwasowej podjednostki trimeru TNFα jest podobny do klinu o średniej wysokości 5,5 nm i maksymalnej szerokości 3,5 nm przy podstawie. Topologia głównego łańcucha jest przedstawiona na figurach 1a-c; jej istotą jest struktura β-kanapki stworzonej przez dwie antyrównoległe harmonijki β. Konformacja głównego łańcucha przypomina klasyczny motyw „jellyroll” (rys 1c) (częsty w wirusowych białkach kapsydowych). Nomenklatura przyjęta na figurze 1 dla określeń drugorzędowej struktury jest typowa dla konwencji przyjętej dla wirusów. Istnieje osiem podstawowych nici β (od B do I), pomiędzy B i C znajduje się insercja, która dodaje krótki łańcuch na krańcu obydwu harmonijek β i odcina N-końcowo połowę C tak, że każda harmonijka β zawiera w efekcie pięć antyrównoległych nici β, tj.: tylna harmonijka β zawiera nici β: B', B, I, D i G, a przednia harmonijka β zawiera nici β: C', C, H, E i F.

N-koniec jest wysoce elastyczny. Region ten aż do reszty 10 (zobacz fig. 1b) jest raczej niezależny od reszty cząsteczki, a kilka pierwszych reszt może przybierać dowolne konformacje w roztworze. W przeciwieństwie do tego, C-koniec jest zakorzeniony w podstawie końca harmonijki β i tworzy integralną część tej stosunkowo płaskiej drugorzędowej struktury. Gradacja długości nici β i insercja pomiędzy nićmi β B i C powoduje że przednia powierzchnia jest uformowana prawie w całości z pętli, jest to „zamaskowana” strona β-kanapki, która w trimerze jest wystawiona w stronę roztworu. Krystalograficzne dane informują o stopniu elastyczności różnych części struktury. Nici β tworzą nieelastyczne rusztowanie, w szczególności, tylna część harmonijki β usytuowana w jądrze trimeru i w konsekwencji jest szczególnie sztywna. Jak można było się spodziewać zewnętrzną część cząsteczki mającą dostęp do roztworu tworzą pętle, które wykazują wysoki stopień elastyczności/mobilności. Ogólnie biorąc sztywność cząsteczki maleje wraz z luźniejszym upakowaniem jądra w górnej połowie cząsteczki.

Ogólna topologia trimeru TNFα

Trzy monomeryczne podjednostki TNFα asocjują niekowalencyjnie do posiadających małe rozmiary, stożkowych trimerów, mających długość około 5,5 nm i maksymalną szerokość 5 nm. Nici β z trzech osobnych β-kanapek leżą równolegle (skręcenie wynosi około 30°) do trzykrotnej osi trimeru. Oddziaływanie pomiędzy podjednostkami zachodzi poprzez potrójną oś dzięki prostemu krawędziowo-czołowemu upakowaniu β-kanapki, krawędź β-kanapki, złożonej z nici B i G jednej podjednostki, leży w poprzek końca harmonijki β [GDIBB'] z trzyczęściowej podjednostki (zobacz fig. 2). Koniec karboksylowy leży blisko trzykrotnej osi. Sposób czołowo-krawędziowego upakowania powoduje bardzo ścisłe powiązanie pomiędzy podjednostkami. Tak więc jądro trimeru jest zupełnie niedostępne dla roztworu.

Sposób rozmieszczenia aminokwasów

Całościowe rozmieszczenie różnych grup zewnętrznych w trzeciorzędowej strukturze TNFα warunkuje ogólne właściwości białek: dokładniej, końcowe hydrofobowe grupy układają się w jądrze cząsteczki, podczas gdy naładowane występują na powierzchni. Tak więc jądro kanapki TNFα jest wypełnione ciasno upakowanymi, apolarnymi grupami.

Energetyka układu nie faworyzuje obecności TNFα w postaci monomerycznej. Dla dużego obszaru wzajemnego oddziaływania utworzonego przez komplementarne grupy (na przykład grupy polarne naprzeciwko polarnym) utrata powierzchni dostępu roztworu powoduje, że z energetycznego punktu widzenia bardziej dogodną jest konformacja oligomeryczna (tutaj trimer). Potraktowanie roztworem dużej grupy wysoce hydrofobowych reszt, które są zwykle ukryte w wewnętrznych warstwach trimeru, może także doprowadzić do destabilizacji monomeru TNFα

Badanie funkcji strukturalnych

Współdziałanie TNFo/przeciwciała

Zaobserwowano, że przeciwciała tworzone przeciwko TNFα z jednego gatunku (np. człowiek) nie reagują krzyżowo z TNFα z innego gatunku (np. mysz), pomimo co najmniej 80% identyczności

PL 194 221 B1 sekwencji i zdolności TNFa do wiązania receptorów TNFa innych gatunków. Jeżeli stopień zróżnicowania sekwencji jest odwzorowany w strukturze trzeciorzędowej, to od razu widać, że najbardziej zmienne sekwencyjnie regiony cząsteczki odpowiadają powierzchniowym pętlom kontaktującym się z przeciwciałem. Regiony z wysoce konserwowanymi resztami aminokwasowymi w środku kanapki lub w polu wzajemnego oddziaływania w trimerze są niewidoczne dla przeciwciał. Tak więc epitop dla przeciwciała przeciwko TNFα będzie zawsze zawierał jakieś grupy aminokwasowe, które różnią się pomiędzy gatunkami, a więc będą znosić wiązanie przeciwciała. Wynika z tego, że charakter oddziaływania pomiędzy TNFα, a jego receptorem musi się jakoś różnić od oddziaływania wymaganego do przyłączenia przeciwciała do TNFα.

Mutageneza ukierunkowana

Rola różnych specyficznych grup aminokwasowych i regionów cząsteczki TNFα w odniesieniu do jej biologicznego (cytotoksycznego) działania i wiązania receptorów została zbadana przez zamianę tych grup aminokwasowych przez różne aminokwasy lub poprzez delecję części sekwencji przy użyciu mutagenezy ukierunkowanej (Jones et al, op.cit. p. 113-119).

Delecja obejmująca do ośmiu grup aminokwasowych z N-końca nie wywierająca żadnych szkodliwych skutków na aktywność biologiczną, podkreśliła nieistotny charakter tego regionu dla całkowitej stabilności cząsteczki. Grupy aminokwasowe N-końca zdają się wywierać pośrednią, drugorzędną rolę w biologicznej skuteczności trimeru TNFα.

Niekonserwatywna substytucja dotycząca wysoce konserwowanych reszt aminokwasowych, które tworzą ściśle upakowane jądro β-kanapki powoduje wypaczenie struktury i silne upośledzenie aktywności biologicznej TNFα (Yamagishi et al., Protein Engineering, Vol. 3, No. 8, p. 713-719 (1989)). Wiele tak zmutowanych białek (mutein) nie tworzy stabilnej, odpowiednio ukształtowanej cząsteczki. Pewne konserwatywne substytucje są dopuszczalne w hydrofobowych regionach w pobliżu trzykrotnej osi, jednakże wydają się mieć o wiele większą swobodę w bardziej luźno upakowanych regionach bliżej warstwy zewnętrznej trimeru. W szczególności Cys 69 i Cys 101, które tworzą mostki disiarczkowe pomiędzy dwiema łączącymi się pętlami na szczycie luźno upakowanej cząsteczki są stosunkowo niewrażliwe na zmiany (zobacz fig. 1a). Jednakże ogólnie, w pobliżu osi TNFα mutacje muszą być wysoce konserwatywne aby zachować aktywność biologiczną i ogólny kształt TNFα. Reszty aminokwasowe na powierzchni cząsteczki mają znacząco większą swobodę mutacji bez niszczącego wpływu na strukturę, czego dowodem jest rozprzestrzenienie różnych reszt aminokwasowych tej kategorii pomiędzy gatunkami. Tak więc drastyczna redukcja aktywności biologicznej TNFα jest powodowana substytucjami dotyczącymi reszt aminokwasowych, które są bezpośrednio zaangażowane w oddziaływanie pomiędzy trimerem TNFα i jego receptorem. Reszty aminokwasowe zawierające Arg 31, Arg 32 i Ala 33 usytuowane w pętli łączącej pomiędzy nićmi B i B' tylnej harmonijki β, Ser 86 i Tyr 87 usytuowane w pętli łączącej pomiędzy nićmi E i F przedniej harmonijki β, i Glu 146 usytuowana w pętli łączącej pomiędzy nicią H z przedniej harmonijki β i nicią I z tylnej harmonijki β wydają się być takimi grupami aminokwasowymi. Wydaje się, że występują w dwóch różnych „miejscach zapalnych” z przodu i z tyłu monomeru TNFα. Rozkład wszystkich delecyjnych mutacji bez względu na kategorię strukturalną jeszcze bardziej wzmacnia ten obraz. Obecność tych miejsc zapalnych i wrażliwość funkcji biologicznych na mutacje została przedstawiona przez Yamagishi et al., op.cit., i Goh et al. Protein Engineering, Vol. 4, No. 4, p. 385-389 (1991).

Prace dotyczące mutacji ludzkiego polipeptydu TNFα zostały przedstawione w wielu zgłoszeniach patentowych. Tak więc Yamagishi et al. (EP 251 037) ujawnił wiele miejscowo specyficznych mutantów cząsteczek TNFα, które są rozpuszczalne i wykazują cytotoksyczne i antyrakowe działanie charakterystyczne dla ludzkiego TNFα in vitro i/lub in vivo.

Inne muteiny posiadające aktywność TNFα zostały opisane w publikacji WO 90/07579. Muteiny z wyższym powinowactwem do łączenia się z ludzkim receptorem p75-TNF, niż z ludzkim receptorem p55-TNF są opisane w zgłoszeniu EP-A-619 372.

Żadne z tych cytowań, włączanych poprzez odsyłacze, nie ujawnia takiej modyfikacji cząsteczki TNFα, która znosi aktywność biologiczną TNFα i doprowadza do otrzymywania przeciwciał przeciwko ludzkiemu TNFαtypu dzikiego.

Jednakże wniosły one przydatne informacje o TNFα i jego właściwościach biologicznych oraz ujawniły także produkcję i ekspresję analogów TNFα i jego preparaty, a także testy wiązania się do receptorów.

Wiele różnych danych może obecnie wywrzeć wpływ na zrozumienie specyficznych oddziaływań pomiędzy strukturą, a funkcją TNFα. Wszelkie dostępne dowody wskazują na istotność trimeru jako stabilnej naturalnej jednostki. Jest oczywiste, że dwa „miejsca zapalne”usytuowane po dwóch różnych

PL 194 221 B1 stronach monomeru TNFa są zbliżone do siebie, gdyż znajdują się na sąsiadujących ze sobą podjednostkach w trimerze. Tak więc ważny funkcjonalnie region składa się z grup aminokwasowych od 31 do 35, od 84 do 87, od 143 do 148 i wydaje się być zlokalizowany na powierzchni między dwiema podjednostkarni, w dolnej połowie trimeru. Yamagishi et al. op.cit opisali utratę zdolności wiązania z receptorem i cytotoksyczności w przypadku mutacji Asp 143 na Tyr, a Tsujimoto et al., J. Biochem. 101, p. 919-925 (1987) donosi o podobnych efektach wymiany Arg 31 i Arg 32 na Asn i Thr. Tak więc miejsce to może być kojarzone bezpośrednio z wiązaniem z receptorem jak i z cytotoksycznością. Interesujące jest to, że region wiązania z receptorem TNFa wydaje się leżeć na powierzchni pomiędzy dwiema jednostkami.

Podsumowując, dokładna trzeciorzędowa struktura TNFa służy wyjaśnieniu wielorakich obserwacji dotyczących wiązania z przeciwciałami, oligomeryzacji oraz ukierunkowanych mutacji. Jeśli rozpatruje się strukturę w połączeniu ze wspomnianymi mutacjami punktowymi to regionem ważnym biologicznie dla wiązania receptora są podjednostki z dolnej połowy trimeru.

W publikacji WO 95/05849, kilku z twórców niniejszego wynalazku opisało metody modyfikacji białek własnych w celu wywołania odpowiedzi przeciwciałowej przeciwko niezmodyfikowanym białkom własnym, gdzie analog białka własnego dostarczono z użyciem metod biologii molekularnej. Bardziej szczegółowo jeden lub więcej fragmentów białek własnych zastępowano przez jeden lub więcej fragmentów zawierających immunodominujące obce epitopy komórki T.

Przed wynalazkiem, który pozwolił na opracowanie publikacji WO 95/05849 znane było tworzenie koniugatów białkowych lub peptydowych, zawierających białka własne, z białkami nośnikowymi zawierającymi epitopy komórek T. Publikacja WO 92/19746 ujawniła polipeptydy rekombinacyjne zawierające sekwencje LHRH, jeden lub więcej epitopów komórek T i miejsca do oczyszczania, co jest przydatne w szczepionkach do immunokastracji zwierząt.

W publikacji WO 95/05849 uznano za sprzyjający aby immunodominujący epitop komórek T był insertowany w taki sposób by regiony flankujące z pierwotnego białka, zawierające co najmniej 4 aminokwasy, były zachowane po obu stronach insertowanego epitopu. Innymi słowy epitop nie powinien być sprzęgany z białkami własnymi jako białko fuzyjne. Dogodnie, substytucja powinna być zrobiona tak, żeby zachować trzeciorzędową strukturę oryginalnego białka. Oprócz tego nie ujawniono żadnej innej wskazówki dotyczącej optymalnej wewnątrzcząsteczkowej pozycji insertowanego epitopu, która mogłaby zapewnić stworzenie najsilniejszej odpowiedzi przeciwciałowej przeciwko niezmodyfikowanemu białku własnemu. Prawdopodobnie będzie się to różnić w zależności od białka własnego, ale bazując na ogólnych wskazówkach z tego opisu najbardziej odpowiednia pozycja(e) może być określona bez zbędnych doświadczeń, przy pomocy selekcji peptydów zawierających odpowiednie imunodominujące epitopy, wymiany sekwencji peptydowych zasadniczo mających tę samą długość w różnych częściach cząsteczki białka własnego i określając powstały w ten sposób wzrost odpowiedzi przeciwciałowej z użyciem odpowiednich technik oznaczania.

Prawdopodobnie jest bardzo trudno, przy użyciu dostępnych narzędzi modelujących, przewidzieć czy substytucja jednego lub więcej fragmentów białka będzie miała wpływ na trzeciorzędową strukturę pierwotnego białka. Tak więc w farmaceutycznych programach poszukujących związków wiodących w początkowej fazie powinna zostać uwzględniona standardowa procedura skriningowa mająca ocenić, które zmodyfikowane białka własne zachowują trzeciorzędową strukturę pierwotnego białka. Może być to dokonane przy użyciu kilku technik doświadczalnych, które zostały opisane w wielu książkach na temat poznawania charakterystyki białek, np. spektroskopia fluoroscencyjna, dichroizm kołowy w bliskim UV, spektroskopia w podczerwieni z transformacją furierowską, wielowymiarowe techniki NMR („Physical Methods to Characterize Pharmaceutical Proteins”, Pharmaceutical Biotechnology Vol. 7. Eds. J.N. Herron, W. Jiskoot & D.J.A. Crommelin, Plenum Press, New York (1995)). Najlepiej jeśli w procesach skriningowych związków wiodących, powiąże się dwie lub więcej techniki wspomniane powyżej w celu określenia zmian mogących się ewentualnie pojawić lub nie w strukturze trzeciorzędowej.

Przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFα zdolna do indukowania przeciwciał neutralizujących przeciwko ludzkiemu TNFα typu dzikiego po podaniu tej zmodyfikowanej cząsteczki TNFα ludzkiemu gospodarzowi, przy czym przynajmniej jeden segment cząsteczki ludzkiego TNFα został zastąpiony przynajmniej jednym peptydem zawierający immunodominujący epitop komórek T lub skróconą postacią takiej cząsteczki zawierającą immunodominujący epitop komórek T, i jeden lub obydwa regiony flankujące cząsteczkę ludzkiego TNFα z przynajmniej jednym epitopem TNFα dla komórek B, przy czym substytucja jest wprowadzana w dowolnej z nici należącej do przedniej harmonijki β, w dowolnej z pętli łączących i/lub w dowolnej z nici B', Ilub D należących do

PL 194 221 B1 tylnej harmonijki β, przy czym substytucja została dokonana w regionach cząsteczki TNFa tak, żeby zachować strukturę harmonijki β nici B i G, i przy czym substytucja prowadzi do inaktywacji aktywności biologicznej ludzkiego TNFα testowanej w oznaczeniu biologicznym L929.

Korzystnie substytucja nie obejmuje dowolnej całkowitej nici tylnej harmonijki β.

Korzystniej substytucja obejmuje przynajmniej segment nici H należącej do przedniej harmonijki β i pętli łączącej z nicią I należącą do tylnej harmonijki β, segment nici H i Ii całą pętlę łączącą, segment nici D należącej do tylnej harmonijki β, i przynajmniej segment nici E należącej do przedniej harmonijki β i całą pętlę łączącą, całe nici C' i C należące do przedniej harmonijki β oraz segment nici D należącej do tylnej harmonijki β, albo przynajmniej segment nici E należącej do przedniej harmonijki β i jedną lub obie pętle łączące.

Korzystnie substytucja jest dokonana w regionach cząsteczki TNFα które obejmują nici należące do przednich harmonijek β i/lub pętli łączących żeby zasadniczo zachować strukturę harmonijki β dowolnej z nici należącej do tylnej harmonijki β.

Korzystniej substytucja jest dokonana w regionach cząsteczki TNFα, które obejmują segment z nici D należącej do tylnej harmonijki β.

Korzystniej substytucja obejmuje przynajmniej segment nici H należącej do przedniej harmonijki β i pętli łączącej z nicią I, korzystnie aminokwasy 132 do 146.

Korzystniej substytucja obejmuje segmenty nici H i l oraz całą pętlę łączącą, korzystnie aminokwasy 132 do 152.

Korzystniej substytucja obejmuje segment nici D, przynajmniej segment nici E oraz całą pętlę łączącą, korzystnie aminokwasy 65 do 79 lub 64 do 84.

Korzystniej substytucja obejmuje całą nić C' i C oraz segment nici D, korzystnie aminokwasy 40 do 60.

Korzystniej substytucja obejmuje przynajmniej segment nici E należącej do przedniej harmonijki β i jedną lub obie pętle łączące, korzystnie aminokwasy 76 do 90.

Korzystnie przeciwciała neutralizujące wzbudzone przeciwko tej zmodyfikowanej cząsteczce w odpowiednim gospodarzu są zdolne do zasadniczego hamowania aktywności natywnego TNFα w oznaczeniu biologicznym L929, i/lub przy czym przeciwciała te znacząco hamują wiązanie ludzkiego TNFα dzikiego typu z receptorem 1 TNFα o masie cząsteczkowej 55 kDa (TNFα-55 kDa) lub receptorem 2 TNFα o masie cząsteczkowej 75 kDa (TNFα-75 kDa).

Korzystnie wstawiony epitop komórki T jest słabo specyficzny i immunogenny dla większości typów ludzkich HLA klasy II.

Korzystniej epitop pochodzi z anatoksyny tężcowej, korzystnie epitopu P2 i/lub P30.

Korzystniej cząsteczka ta posiada sekwencję aminokwasową pokazaną na SEQ ID NR:8.

Korzystniej cząsteczka ta posiada sekwencję aminokwasową pokazaną na SEQ ID NR:10.

Korzystniej cząsteczka ta posiada sekwencję aminokwasową pokazaną na SEQ ID NR:4 lub SEQ ID NR:16.

Korzystniej cząsteczka ta posiada sekwencję aminokwasową pokazaną na SEQ ID NR:20.

Korzystniej cząsteczka ta posiada sekwencję aminokwasową pokazaną na SEQ ID NR:14.

Korzystnie cząsteczka ta ma postać białka fuzyjnego z cząsteczką adiuwanta.

Korzystniej cząsteczkę adiuwanta stanowi adiutant immunologicznie aktywny.

Jeszcze korzystniej cząsteczkę adiuwanta stanowi GMCSF, HSP70 lub interleukina.

Przedmiotem wynalazku są też dimery, oligomery lub multimery zmodyfikowanej cząsteczki ludzkiego TNFα opisanej powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także wyizolowana cząsteczka DNA, charakteryzująca się tym, że koduje zmodyfikowaną cząsteczkę TNFα opisaną powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest też wektor charakteryzujący się tym, że zawiera wyizolowaną cząsteczkę DNA określoną powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także wektor ekspresyjny charakteryzujący się tym, że zawiera wyizolowaną cząsteczkę DNA określoną powyżej operacyjnie związaną z sekwencją kontrolującą ekspresję.

Przedmiotem wynalazku jest również komórka gospodarza charakteryzująca się tym, że jest transformowana wektorem ekspresyjnym opisanym powyżej.

Korzystnie komórka wybrana jest ze szczepów bakterii, drożdży lub innych grzybów i linii komórkowych owadzich, ssaczych lub ptasich.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania zmodyfikowanej cząsteczki ludzkiego TNFα opisanej powyżej, polegający na tym, że hoduje się komórki gospodarza opisane powyżej

PL 194 221 B1 w odpowiednich warunkach pozwalających na produkcję zmodyfikowanego TNFα i odzyskuje się tak wyprodukowany zmodyfikowany TNFα.

Przedmiotem wynalazku jest także szczepionka przeciwko TNFα, charakteryzująca się tym, że zawiera jedną lub więcej zmodyfikowanych cząsteczek ludzkiego TNFα opisanych powyżej i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny adiuwant.

Korzystnie farmaceutycznie dopuszczalny adiuwant stanowi fosforan glinu, wodorotlenek glinu, fosforan wapnia, dipeptyd muramylowy lub iscom.

Korzystnie szczepionka przeznaczona jest do profilaktyki lub leczenia chorób promowanych przez uwalnianie lub działanie TNFα, takich jak przewlekłe choroby zapalne.

Korzystniej przewlekłe choroby zapalne stanowią reumatoidalne zapalenie stawów i choroby zapalne jelit.

Jeszcze korzystniej choroby zapalne jelit stanowią choroba Crohna i wrzodziejące zapalenie jelita grubego.

Korzystnie szczepionka przeznaczona jest do podawania pozajelitowego.

Korzystniej przeznaczona jest do podawania podskórnego, domięśniowego lub śródskórnego.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto szczepionka przeciwko TNFα, charakteryzująca się tym, że zawiera kodującą zmodyfikowaną cząsteczkę ludzkiego TNFα opisaną powyżej wyizolowany DNA zawarty w odpowiednim wektorze ekspresyjnym.

Korzystnie zawiera ona konstrukt zawierający niezakaźną, nieintegrującą sekwencję DNA kodującą zmodyfikowaną cząsteczkę TNFα jak określono w zastrz. 1 operacyjnie związaną z sekwencją promotorową, która może kontrolować ekspresję tej sekwencji DNA u ludzi, w ilości wystarczającej aby nastąpiło pobranie wspomnianego konstruktu i nastąpiła ekspresja wystarczająca do wygenerowania przeciwciał neutralizujących przeciwko TNFα.

Korzystnie zawiera wirusowy wektor ekspresyjny.

Korzystniej jako wirusowy wektor ekspresyjny zawiera retrowirusowy wektor ekspresyjny.

Korzystnie szczepionka przeznaczona jest do podawania pozajelitowego.

Korzystniej przeznaczona jest do podawania podskórnego, domięśniowego lub śródskórnego.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie przynajmniej jednej zmodyfikowanej cząsteczki ludzkiego TNFα opisanej powyżej, ewentualnie w kombinacji z odpowiednim adiuwantem lub cząsteczką nośnika, do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki przewlekłego zapalenia, nowotworu, kacheksji, stwardnienia rozsianego, cukrzycy, łuszczycy, osteoporozy lub astmy.

Figura 1 ilustruje krystaliczną strukturę natywnego monomeru TNFα. Ta figura jest szkicem podjednostki, nici β są przedstawione jako cienkie strzałki w kierunku od grupy aminowej do karboksylowej, a łączące pętle są pokazane jako grube strzałki. Mostek disiarczkowy jest ukazany przez rozjaśnienie a region wysokiej elastyczności jest zakreskowany. Dla tej orientacji potrójna oś trimeru będzie pionowa.

Figura 1 (b) przedstawia nić C α monomerycznego kryształu TNFα. Ten szczegółowy rysunek powinien być pokazywany wraz z fig. 1(a) aby dać dokładne dopasowanie sekwencji aminokwasowej z czytelniejszym ale stylizowanym obrazem ufałdowania podjednostki.

Figura 1(c) pokazuje strukturę TNFα mającej kształt rolady. Insercja pomiędzy β-łańcuchami B i C jest zaznaczona przez zakreskowanie, połączenie pomiędzy B i C biegnie prosto przez górę cząsteczki.

Figura 2 pokazuje upakowanie krawędziowo-czołowe β-kanapek w trimerze TNFα. Obraz, wzdłuż trzykrotnej osi, pokazuje wąski wycinek trimeru z nićmi β ukazanymi jako wstążki wbiegające i wybiegające z rysunku.

Figura 3(a) ilustruje sekwencję DNA kodującą czynnik martwicy nowotworu (TNFα) o sekwencji aminokwasowej pokazanej na fig. 3(b).

Sekwencja DNA jest dostępna w bazie Gen Bank pod numerem dostępu M10988, SEQ LD NO:339737.

Sekwencja została opisana przez Wang et al., Science 228, 149-154 (1985). Sekwencja zawiera kodony kodujące -76-1 sekwencję poprzedzającą ludzkiego TNFα.

Kompletna sekwencja genu zawierająca introny została opisana przez Nedwin et al., Nucleic Acids, Res. 13 (17) 6361-6373 (1985), Shirai et al., Nature 313 (6005), 803-806 (1985) i Dennica et al., Nature312 (5996), 724-729 (1984).

Figura 3(b) pokazuje sekwencję aminokwasową ludzkiego TNFα zawierającą sekwencję poprzedzającą -76-1.

Figura 4(a) ilustruje schematycznie substytucje immunodominujących epitopów P2 i P30 w dzikim typie TNFα (WT) z utworzeniem analogów TNFα TNF2-1 do 2-7 i TNF30-1 do 30-5.

PL 194 221 B1

Figura4(b) pokazuje dokładne położenie substytucji w sekwencji WT dla poszczególnych analogów TNFα.

Figury5(a) i 5(b) pokazują strukturę analogów w oparciu o fig. 1(a), poszczególne substytucje P2 i P30 w łańcuchach harmonijek β i połączenia pętli są odpowiednio zaczernione.

Figura 6 pokazuje biologiczną aktywność analogów TNFα w oznaczeniach L929 (Meager, A., Leung, H., & Woolley, J. Testy czynnika martwicy nowotworu i pokrewnych cytokin, J. Immunol. Meth. 116, 1-17 (1989)) w porównaniu z rekombinantem TNFα.

Figura 7 pokazuje odpowiedź przeciwciał przeciwko ludzkiemu TNFα u królika, które to przeciwciała uzyskano w odpowiedzi na szczepienie zmodyfikowanymi cząsteczkami TNFα.

Figura 8 pokazuje zdolność zmodyfikowanych P2/P30 cząsteczek ludzkiego TNFα do indukowania przeciwciał neutralizujących co pokazano w oznaczeniu komórkowym L929.

Figura 9 pokazuje zdolność - podczas podawania królikom modyfikowanych P2/P30 cząsteczek ludzkiego TNFa do indukowania przeciwciał neutralizujących, którą mierzono w teście receptorowym.

Figura 10 pokazuje odpowiedź jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) pochodzących od trzech dawców uzyskaną w stosunku do peptydów TT, P22 i P30.

Figura11 pokazuje poliklonalną odpowiedź proliferacyjną uzyskaną u dwóch dawców za pomocą różnych zmodyfikowanych P2 i P30 cząsteczek TNFa.

Figura 12 pokazuje indeksy proliferacyjne (PI) policzone z 34 doświadczeń dla zmodyfikowanych P2 i P30 cząsteczek TNFa.

Figura 13 pokazuje odpowiedź PBMS przeciwko zmodyfikowanym P2 i P30 białkom TNFaw odpowiednio P2 i P30 specyficznych odpowiedziach.

Figura14 pokazuje podobną odpowiedź PBMC u dwóch innych dawców.

Figura 15 pokazuje wpływ aminokwasów flankujących na rozpoznawanie P2 i P30 przez komórkę T.

Figura16 pokazuje strategię mutacyjną używaną dla przygotowania zmodyfikowanych cząsteczek TNFa.

W niniejszym opisie przedstawiono wskazówki, w jaki sposób szczególne białko własne, wchodzące w zakres wyżej wspomnianej publikacji WO 95/05849, a mianowicie ludzki TNFa, powinno być zmodyfikowana aby było biologicznie nieaktywne, jak również wywoływało silną neutralizującą odpowiedź przeciwciałową przeciwko dzikiemu typowi biologicznie aktywnego TNFa. W tym kontekście „biologicznie nieaktywny”odnosi się do aktywności dzikiego typu TNFa, głównie jego aktywności cytotoksycznej.

Z dyskusji o trzeciorzędowej strukturze TNFa przedstawionej powyżej wynika, że biologicznie aktywny TNFa jest trimer złożony z trzech podjednostek. Z powodu czołowo-krawędziowego upakowania tylnej harmonijki β, prezentuje on „ukrytą”powierzchnię dla kontaktu pomiędzy podjednostkami, która jest w pełni niedostępna dla roztworu. Znamienne jest to, że substytucja w tym obszarze doprowadzi niemal nieuchronnie do utraty całej biologicznej aktywności. Z drugiej strony „przednia harmonijka β” i powiązane regiony przedstawiają przestrzeń dostępną, która zawiera obszary współdziałające z receptorami TNFa. Przeciwciała do tych obszarów będą więc prawdopodobnie w stanie przeszkodzić receptorom wiążącym i w związku z tym będą posiadać właściwości neutralizujące TNFa.

Specjaliści w dziedzinie, którzy chcą skonstruować nietoksyczną ale immunogenną cząsteczkę TNFa zgodnie z publikacją WO 95/05849 po pierwsze insertowałyby immunodominujący epitop komórki T w tylną harmonijkę β monomeru TNFa. Modyfikacje w tym obszarze będą zatem prawdopodobnie przeszkadzać w biologicznej aktywności TNFa i pozostawią przedni receptorowo-dostępną harmonijką β wolną dla oddziaływań z przeciwciałami. Jest to także spójne z dyskusją przedstawioną powyżej nad miejscową mutagenezą w ściśle upakowanym jądrze β-kanapki.

Jednakże niespodziewanie jest inaczej. Na podstawie rezultatów przedstawionych poniżej, wykazano, że skutek był odwrotny, ponieważ substytucje dotyczące nici B i G tylnej harmonijki β niespodziewanie dostarczyły analogi TNFa, które nie mogły indukować przeciwciał neutralizujących przeciwko TNFa. Zgodnie z wynalazkiem dostarczono zmodyfikowane cząsteczki ludzkiego TNFa zdolne do indukowania przeciwciał neutralizujących przeciwko dzikiemu typowi ludzkiego TNFa poprzez podanie wspomnianej zmodyfikowanych cząsteczek TNFa ludzkiemu gospodarzowi, w których co najmniej jeden fragment peptydu cząsteczki ludzkiego TNFa został zastąpiony przez co najmniej jeden peptyd znany z posiadania immunodominującego epitopu lub jego skróconej postaci zawierającej immunodominujący epitop i jeden lub dwa regionów flankujące cząsteczki ludzkiego TNFaz co najmniej jednym immunodominującym epitopem TNFakomórek B, przy czym substytucja wprowadza zasadniczą zmianę w sekwencji aminokwasowej przedniej harmonijki β, w jakiejkolwiek z pętli łączących i/lub

PL 194 221 B1 w dowolnej z nici B', I lub D tylnej harmonijki β. Ponadto, należy unikać substytucji w nici B i G tylnej harmonijki β.

W tym kontekście jako „zasadniczą zmianę” należy rozumieć jako zmianę, która wychodzi poza zwykłe konserwatywne substytucje poszczególnych aminokwasów i poza mutacje punktowe które nie zmieniają drugorzędowej i/lub trzeciorzędowej struktury dzikiego typu TNFα. Innymi słowy epitop komórki T wprowadzony do sekwencji TNFα powinien dogodnie wprowadzać sekwencję o bardzo niskiej homologii do sekwencji dzikiego typu TNFα.

Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFα według wynalazku jest zdolna do indukowania przeciwciał neutralizujących przeciwko dzikiemu typowi ludzkiego TNFα po podaniu tej zmodyfikowanej cząsteczki TNFα ludzkiemu gospodarzowi, przy czym co najmniej jeden fragment peptydu cząsteczki ludzkiego TNFα został zastąpiony przez co najmniej jeden peptyd znany z posiadania immunodominującego epitopu komórek T lub skróconej formy wspomnianej cząsteczki zawierającej immunodominujący epitop i jeden lub oba regiony flankujące cząsteczki ludzkiego TNFα zawierające co najmniej jeden epitop TNFα komórek B, przy czym zmodyfikowana cząsteczka TNFα jest zasadniczo wolna od aktywności TNFα.

Termin „zasadniczo wolna od aktywności TNFα” w tym kontekście znaczy, że podanie istocie ludzkiej tak zmodyfikowanej cząsteczki TNFα nie spowoduje znaczących niekorzystnych skutków, które powodowane są przez wpływy cytokine natywnego TNFα. Innymi słowy zmodyfikowane cząsteczki TNFα według wynalazku są substancjami farmaceutycznie dopuszczalnymi.

W celu przetestowania zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFα według wynalazku jest zasadniczo wolna od aktywności TNFα, można zastosować oznaczenie biologiczne L929. Co więcej w celu potwierdzenia immunogennego charakteru zmodyfikowanych cząsteczek TNFα, przeciwciała wytworzone przeciwko zmodyfikowanej cząsteczce TNFα u odpowiedniego gospodarza znacząco obniżą aktywność dzikiego typu TNFα w oznaczeniu biologicznym L929, i/lub przeciwciała te znacząco obniżą wiązanie się dzikiego typu TNFα do receptora 1 TNFα o masie cząsteczkowej 55 kDa (TNFα-R55) lub do receptora 2 TNFα o masie cząsteczkowej 75 kDa (TNFα-R75).

Odpowiedni gospodarze to np. naczelne, jak małpy Rhesuslub Cynomolgus, gryzonie takie jak szczur lub mysz lub świnka morska albo zajęczaki, takie jak króliki.

Testy odpowiednie do oceny potencjału zmodyfikowanych cząsteczek według wynalazku są przeprowadzane przy użyciu przeciwciała lub antysurowicy w stężeniu, odpowiednio względem składu próby i powinny odzwierciedlać warunki fizjologiczne biorąc pod uwagę zaangażowane reagenty, lub powinny uwzględniać możliwość ekstrapolowania fizjologicznych warunków z wyników uzyskanych w trakcie testu. Innymi słowy, wyniki testu muszą wskazywać czy fizjologiczne stężenie przeciwciał przeciwko TNFα in vivo jest w stanie zredukować aktywność TNFα do rozmiaru co najmniej 10%, 15%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% lub 100%. Specjaliściw dziedzinie z łatwością będą wiedziałyjak stworzyć takie warunki.

Należy rozumieć, że „znaczące hamowanie dzikiego typu TNFα” może być odpowiednie gdy skutkuje redukcją lub eliminacją niekorzystnych skutków dzikiego typu TNFα. Takie hamowanie może być odpowiednie na poziomie co najmniej 10%, co najmniej 15%, co najmniej 25%, co najmniej 30%, co najmniej 35%, co najmniej 40%, co najmniej 45%, co najmniej 50%, co najmniej 55%, co najmniej 60%, co najmniej 65%, co najmniej 70%, co najmniej 75%, co najmniej 80%, co najmniej 85%, co najmniej 90%, co najmniej 95% lub nawet 100%.

W świetle powyższego zmodyfikowane cząsteczki ludzkiego TNFα według wynalazku mogą obejmować substytucję dokonaną w tych regionach cząsteczki TNFα, które dotyczą nici z przedniej harmonijki β i/lub pętli łączących co zasadniczo zachowuje strukturę harmonijki β w jakichkolwiek niciach tylnej harmonijki β.

Chociaż nie zostało to jeszcze w pełni zweryfikowane doświadczalnie, należy wziąć pod uwagę, że ta własność jest wspólna dla nici budujących tylną harmionijkę β, tak więc zalecanymi substytucjami powinny być substytucje w takich regionach cząsteczki TNFα, które nie zawierają żadnej całkowitej nici z tylnej harmonijki β. Z powyższej dyskusji dotyczącej istotności reszt aminokwasowych 31-35 wynika, że nie należy także zmieniać pętli łączących leżących pomiędzy odrębnymi nićmi tylnej harmonijki β.

Jednakże jest dopuszczalne, aby substytucja była dokonywana także w regionach cząsteczki TNFα, które dotyczą tylko segmentu nici D tylnej harmonijki β. W zalecanym wykonaniu substytucja może obejmować wymianę co najmniej segmentu nici H przedniej harmonijki β i części pętli łączącej do nici I tylnej harmonijki β, preferowane aminokwasy to do 132 do 146. Inne wykonanie substytucji może dotyczyć segmentu nici H i I oraz całej pętli łączącej, preferowane aminokwasy to od 132 do 152.

PL 194 221 B1

W jeszcze innym wykonaniu substytucja może obejmować segment nici D tylnej harmonijki β, co najmniej segment nici E przedniej harmonijki β i całą pętle łączącą, preferowane aminokwasy to od 65 do 79 lub od 64 do 84.

Kolejne wykonanie może obejmować substytucję całej nici C' i C przedniej harmonijki β i segment nici D tylnej harmonijki β, preferowane aminokwasy to od 40 do 60.

Jeszcze inne wykonanie substytucji może obejmować co najmniej segment nici E przedniej harmonijki β i jedną lub dwie pętle łączące, preferowane aminokwasy to od 76 do 90.

Wstawiany epitop komórek T powinien być słabo specyficzny ale immunogenny wobec większości ludzkich klas HLA typu II. Odpowiednie epitopy wywodzą się np. z anatoksyny tężcowej, preferowane epitopy to P2 i/lub P30, Panina-Bordignon et al., Eur. J. Immunol. 19:2237-42, 1989. Użyte mogą być także epitopy uzyskane z anatoksyny błoniczej.

Preferowane zmodyfikowane cząsteczki ludzkiego TNFα (analogi TNFα) takie jak wspomniane powyżej z nawiązaniem do umiejscowienia substytucji, są pokazane w załączonej liście sekwencji jako SEQ ID:8 i SEQ ID NO:16

Inne stosowane analogi TNFα są ukazane jako SEQ ID 15 NO:4, 10, 14 i 16.

Zmodyfikowane analogi TNFα według wynalazku mogą obejmować także skrócone analogi. Skrócone analogi cząsteczek TNFα zawierających słabo specyficzne i imunodominujące epitopy komórek T i jeden lub dwa regiony flankujące zawierające co najmniej jeden epitop TNFα komórek B, z co najmniej pięcioma aminokwasami, mogą być wykorzystane jako aktywne składniki szczepionki przeciwko TNFα według wynalazku. Epitop komórki T indukuje proliferację komórek T po prezentacji przez APC cząsteczkom MHC klasy II, podczas gdy epitop komórki B będzie rozpoznawany przez receptory immunoglobulinowe na komórkach B, a następnie będzie prezentowany na tych cząsteczkach cząsteczkom MHC klasy I. Stanowi to podstawę wzbudzania odpowiedzi immunologicznej przeciwko dzikiemu typowi TNFα, który posiada epitop komórek B, zgodnie z publikacją WO 95/05849 i niniejszym wynalazkiem.

Epitop komórki B może być zidentyfikowany w TNFα zarówno teoretycznie jak i doświadczalnie. Algorytm na identyfikacje potencjalnych liniowych epitopów komórek Bzostałopublikowany,a totworzy podstawy eksperymentalnych badańnadnaturąpotencjalnychepitopów.Przeciwciała uzyskiwane w układzie heterologicznym (np. poprzez króliki) w odpowiedzi na zakażenie taką skróconą cząsteczką TNFα zawierającą epitopy komórki T mogą być analizowane in vitro pod kątem zdolności wiązania natywnego ludzkiego TNFα, dogodnie w sposób neutralizujący. Zbiory monoklonalnych przeciwciał neutralizujących mogą być skriningowane in vitro na zdolność wiązania potencjalnego epitopu komórek B z TNFα. Obie strategie polegają na zidentyfikowaniu możliwych i najlepszych epitopów komórek B.

Uważa się, że powyżej wspomniane analogi TNFα występują w formie monomerycznej, ponieważ modyfikacja prawdopodobnie niszczy tendencję do trimeryzacji dzikiego typu TNFα.

Dimerów, oligomery,a zwłaszczatrimery,lubwielomerywspomnianych zmodyfikowanych cząsteczek TNFα według wynalazku wykazują brak aktywności TNFα. Zmodyfikowane cząsteczki TNFα według wynalazku mogą być kodowane przez wyizolowane DNA.

Wyizolowane cząsteczki DNA kodujące preferowane analogi TNFα mają sekwencje wskazane jako SEQ ID NO:7 i 15, a cząsteczki DNA kodujące inne dostępne analogi są wskazane w SEQ ID NO:3, 9, 13 i 15.

Wektory ekspresyjne według wynalazku mogą być stosowane do transformacji gospodarza.

Gospodarzem może jakikolwiek z najczęściej używanych do ekspresji gospodarzy, np. szczep bakterii, drożdże lub inne grzyby albo owadzie, ssacze lub ptasie linie komórkowe.

Sposoby wytwarzania analogów TNFα obejmują transformację komórki gospodarza wektorem ekspresyjnym analogu i hodowlę w odpowiednich warunkach pozwalających na produkcję analogu, oraz odzyskiwanie z wytworzonych analogów.

Jeżeli jest to wskazane, zmodyfikowane cząsteczki TNFα według wynalazku mogą być ekspresjonowane w postaci białek fuzyjnych z odpowiednim środkiem wspomagającym, najlepiej z immunologicznie aktywnym środkiem wspomagającym, takim jak GM-CSF, HSP70 lub interleukiny, np. interleukina 2.

Dokładniej, zmodyfikowane cząsteczki TNFα są wytwarzane przez substytucję odpowiednich segmentów genów kodujących imunodominujący epitop komórki T do genu kodującego natywną cząsteczkę TNFα. Następnie zmodyfikowany gen TNFα jest ekspresjonowany w odpowiednim eukariotycznym lub prokariotycznym wektorze ekspresyjnym. Zekspresjonowane i zmodyfikowane cząsteczki TNFα są oczyszczane i zwijane jak opisano poniżej.

PL 194 221 B1

Pomimo, że może być preferowane insertowanie całego epitopu komórek T, w pewnych przypadkach dogodniej będzie insertować sekwencję peptydu zawierającą zarówno epitop jak i regiony flankujące wywodzące się z białek, z których pochodzi epitop.

Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFα może być użyta w szczepionkach przeciwko TNFα. Strategie opracowywania szczepionek bazujących na oczyszczonych białkach takich jak przekształcone białka własne, generalnie odpowiadają innym strategiom opracowywania lekarstw bazujących na białkach.Potencjalne problemy i rady jak je ominąć- jak np. zachowanie trzeciorzędowej struktury - są wyjaśnione w wielu opracowaniach np. „Therapeutic Peptides and Protein Formulation. Processing and Delivery Systems” Ed. A.K. Banga; Technomic Publishing AG, Basel 1995. Użycie adiuwantów takich jak np. wodorotlenek glinu, fosforan glinu (Adju-Phos), fosforan wapnia, analog dipeptydu muramylowego lub inne częściej stosowane w szczepionkach adiuwanty, takie jak biodegradowalne mikrofragmenty i iscomy są środkami podobnymi do tych, z którymi stykają się specjaliści w dziedznie.

Wytwarzanie szczepionki według wynalazku, którazawiera jako aktywne składniki sekwencje białkowe jest dobrze znane wśród specjalistów, co przykładowo opisano w opisach patentowych US: 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792; i 4,578,770, załączanych tutaj jako odsyłacze. Typowe szczepionki są przygotowywane jako zastrzyki, zarówno w postaci ciekłych roztworów jak i zawiesin; w postaci stałej odpowiedniej do rozpuszczenia lub stworzenia zawiesiny, w postaci ciekłej, która może być również przygotowana przed samym szczepieniem. Preparat może być również zemulgowany. Aktywne immunogennie składniki są często mieszane z zaróbkami, które są farmaceutycznie dopuszczalne i do przyjęcia z aktywnymi składnikami. Odpowiednimi zaróbkami są np. woda, fizjologiczny roztwór soli, dekstroza, glicerol, etanol itp. i kombinacje powyższych. Dodatkowo, w razie potrzeby szczepionka może zawierać mniejszą ilość pomocniczych substancji, takich jak emulgatory, środki nawilżające, buforujące lub inne środki wspomagające zwiększające efektywność szczepionki.

Szczepionkę konwencjonalnie podaje się pozajelitowo, jako zastrzyk, przykładowo podskórnie albo domięśniowo. Dodatkowe sposoby odpowiednie do podawania szczepionki to czopki, a w pewnych przypadkach także preparaty doustne. W przypadku czopków tradycyjnymi łącznikami i nośnikami to triglicerydy, polialkilo-glikol, takie czopki mogą być formowane z mieszanin zawierających składniki aktywne w stężeniach od 0,5% do 10%, najlepiej 1-2%. Preparaty doustne mogą zawierać takie zaróbki jak farmaceutyczne klasy mannitolu, laktozy, skrobi, stearynianu magnezu, sacharynianu sodu, celulozy, węglanu magnezu, i tym podobne. Takie kompozycje mogą mieć postać roztworu, zawiesin, tabletek, pigułek, kapsułek, preparatów o przedłużonym uwalnianiu lub pudrów o zawartości 10-95% składników aktywnych, najlepiej 25-70%.

Polipeptydy mogą być formowane w szczepionkę w postaci neutralnej lub jako sól. Farmaceutycznie dopuszczalnymi solami są kwaśne sole addycyjne (utworzone z wolnymi grupami aminowymi peptydu) i z kwasów nieorganicznych takich, jak np. solny, fosforowy lub z kwasów organicznych np. szczawiowy, winowy, migdałowy i tym podobne. Sól utworzona z wolnej grupy karboksylowej może także wywodzić się z zasad nieorganicznych takich jak sodowa, potasowa, amoniak, wapniowa, lub wodorotlenek żelaza i z zasad organicznych takich jak izopropyloamina, trimetyloamina, 2-etyloaminoetanol, histydyna, prokaina, i tym podobne.

Szczepionki podaje się w sposób kompatybilny z dozowanym preparatem, w takiej ilości, która będzie terapeutycznie efektywna i immunogenna. Ilość, którą należy podać zależy od pacjenta który będzie nią traktowany, mając na uwadze np. zdolność jednostkową systemu immunologicznego do przeprowadzenia odpowiedzi immunologicznej, i wymaganego stopnia ochrony, który z kolei zależy od poziomu TNFa u pacjenta. Odpowiednia dawka to około kilkaset mikrogramów składników aktywnych na szczepionkę, a dogodniej w zakresie od około 0,1 μg do około 1000 μg, jak również w zakresie od około 1 do około 300 μg a zwłaszcza w zakresie od około 10 do około 50 μg. Odpowiednie schematy dawkowania dla pierwszego podania jak i zastrzyku przypominającego są również różne, ale zależne od pierwszej podanej dawki, po której następują późniejsze zastrzyki lub podania. Sposób aplikowania może być bardzo różny. Jakakolwiek, dowolna z konwencjonalnych metod podawania szczepionki jest dopuszczalna. Bierze się pod uwagę aplikację doustną na stałej fizjologicznie dopuszczalnej bazie, pozajelitową, przez szczepionkę lub podobne. Dawka szczepionki będzie zależeć od drogi podania, i będzie różna w zależności od wieku osoby, a w mniejszym stopniu będzie zależeć od jej rozmiarów.

Niektóre ze zmodyfikowanych cząsteczek według wynalazku są wystarczająco immunogenne w szczepionce, ale w przypadku innych z nich odpowiedź immunologiczna wzrośnie gdy szczepionka będzie zawierać adiuwant.

PL 194 221 B1

Różne metody uzyskiwania wpływu adiuwantowego obejmują użycie środków takich jak wodorotlenek glinu, fosforanglinu, powszechnie używanych w stężeniu procentowym od 0,05 do 0,1w roztworze soli fizjologicznej buforowanym solami fosforanowymi, zmieszany z syntetycznymi polimerami cukrów używanych w postaci roztworu o stężeniu 0,25%, agregację białek w szczepionce za pomocą podgrzewania w temperaturze pomiędzy 70-101°C przez 30 sekund do 2 minut odpowiednio. Agregacja przez potraktowanie pepsynami (Fab) przeciwciał do albumin, zmieszanie z komórkami bakteryjnymi takimi jak C.parvum lubendotoksynami lub lipolisacharydami z gramujemnych bakterii, emulgowanie w fizjologicznie dopuszczalnym podłożu olejowym takim jak mannidomonooleinian (Aracel A) lub emulsja w 20% roztworze nadfluorku węgla (Fluosol-DA) użytych jako blokujący substytut. DDA (bromek dimetylodioktadecyloamonowy) jest ciekawym kandydatem na adiuwant, ale także QuilA i RIBIsą ciekawymi możliwościami. Następnymi możliwościami są monofosforan lipidu A(MPL), dipeptyd muramylowy (MDP). Innymi odpowiednimi adiuwantami są wodorotlenek glinu, fosforan glinu (Adju-Phos), fosforan wapnia, analogi dipeptydu muramylowego. Mogą być również użyte inne bardziej nowoczesne środki wspomagające takie jak biodegradowalne mikrokawałki i Iscomy.

Następną wysoce interesującą (a więc preferowaną) możliwością otrzymania środków wspomagających są techniki opisane w Gosselin et al., 1992 (zawarte tutaj przez odsyłacz). Krótko mówiąc prezentacja danego antygenu takiego jak zmodyfikowana cząsteczka TNFα według wynalazku może być poprawiona przez sprzęganie tego antygenu z przeciwciałami (lub fragmentami przeciwciał wiążącymi antygen) przeciwko receptorom Fcy na monocytach/makrofagach. Zwłaszcza w przypadku koniougatów pomiędzy antygenem a anty FcyRI wykazano zwiększoną imunogenność dla celów szczepienia.

Inne możliwości obejmują użycie immunomodulujących substancji takich jak limfokiny (np. IFN-γ, IL-2 i IL-12) lub syntetycznych induktorów IFN-γ, takich jak poli I:C w kombinacji z wyżej wspomnianymi adiuwantami.

W wielu przypadkach może być konieczne wielokrotne podawanie szczepionki, zwykle nie więcej niż 6, częściej nie więcej niż 4 i dogodniej jedną lub więcej, zazwyczaj przynajmniej około 3. Szczepienia prowadzi się w 2 do 12 miesięcznych odstępach, częściej w 3 do 5 tygodniowych odstępach. Okresowe zastrzyki przypominające w odstępach od 1roku do 5 lat, zwykle w odstępach trzyletnich, są wystarczające do utrzymania odpowiedniego poziomu odporności immunologicznej.

Jednym z powodów dla wykonywania przedmieszki polipeptydów według wynalazku z adiuwantami jest poprawienie efektywności komórkowej odpowiedzi immunologicznej. Jednakże ten efekt może być także osiągnięty innymi sposobami np. przez ekspresję skutecznych w szczepionce antygenów w organizmach niepatogennych. Dobrze znanym takim organizmem jest Mycobacterium bovis BCG.

Preferowanymi niepatogennymi mikroorganizmami są bakterie, np. wybrane z grup obejmujących głównie rodzaje Mycobacterium, Salmonella, Pseudomonas i Escherichia. Szczególnie preferowanym mikroorganizmem niepatogennym jest Mycobacterium bovis.

Włączenie jednej lub więcej kopii sekwencji nukleotydowej kodującej cząsteczkę według wynalazku do mykobakterii ze szczepu M.bovis BCG zwiększy efekt immunogenny szczepu BCG. Włączenie więcej niż jednej kopii sekwencji nukleotydowej kodującej cząsteczkę według wynalazku zwiększy odpowiedź immunologiczną jeszcze bardziej, a w konsekwencji tego, w szczepionce według wynalazku mogą być włączone do genomu mikroorganizmu co najmniej dwie cząsteczki sekwencji DNA, jak również co najmniej 5 kopii. Kopie sekwencji DNA mogą być zarówno identyczne kodujące identyczne cząsteczki jak i mogą być odmianami tej samej sekwencji DNA kodującej identyczne lub homologiczne polipeptydy, lub w innych realizacjach różne sekwencje DNA kodujące różne polipeptydy gdzie co najmniej jeden z polipeptydów stanowi cząsteczkę według wynalazku.

Żywa szczepionka według wynalazku może być wytworzona przez przygotowanie transformowanych niepatogennych komórek zgodnych z wynalazkiem, i przeniesienie tych komórek do podłoża szczepionki, i ewentualne dodanie nośnika, zaróbki i/lub adiuwanta.

Poza ich stosowaniem jako punkty startowe do syntezy cząsteczek według wynalazku i sond hybrydyzacyjnych (użytecznych w bezpośrednich testach hybrydyzacyjnych lub jako startery w np. PCR lub innych molekularnych metodach amplifikacyjnych) cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku mogą być użyte do wywołania ekspresji in vivoantygenów, tj. fragmenty kwasu nukleinowego mogą zostać użyte w tak zwanych szczepionkach DNA. Zgodnie z ostatnimi badaniami fragment DNA wklonowany do wektora, który nie jest zdolny do replikacji w komórkach eukariotycznych może być wprowadzany do zwierzęcia (włączając w to człowieka) poprzez np. wstrzyknięcie domięśniowe lub podawanie doskórne (tak zwana „strzelba genowa”, an. gene gun). DNA jest wyłapywane przez np. komórki mięśniowe i pożądany gen jest ekspresjonowany dzięki promotorowi funkcjonującemu

PL 194 221 B1 u eukariota, np. promotorowi wirusowemu, a następnie produkt genu stymuluje układ immunologiczny. Te nowo poznane metody zostały opisane przez Ulmer et al., 1993, która to praca została włączona do niniejszego zgłoszenia poprzez odsyłacz.

Skuteczność takiej „szczepionki DNA” może być wzmocniona poprzez podawanie genu kodującego ekspresjonowany produkt wraz z fragmentem DNA kodującym polipeptyd, który ma zdolność modulowania odpowiedzi immunologicznej. Przykładowo, gen kodujący prekursory limfokin lub limfokiny (np. IFN-γ, IL-2, lub IL-12) może być podawany wraz z genem kodującym białko immunogenne, zarówno poprzez podawanie dwóch oddzielnych fragmentów DNA jak i poprzez podawanie dwóch fragmentów zawartych w tym samym wektorze.

Szczepionki mogą być użyte do profilaktyki/leczenia dowolnych chorób opisanych powyżej, których patofizjologia charakteryzuje się uwalnianiem TNFα, w szczególności przewlekłych chorób zapalnych. Jako przykład można wymienić reumatoidalne zapalenie stawów lub choroby zapalne jelit (IBD), które obejmują wrzodziejące zapalenie okrężnicy i chorobę Crohna, a w szczególności zapalenie okrężnicy Crohna. Innymi przykładami są rak, kacheksja, często związana z nowotworami, stwardnienie rozsiane, cukrzyca, łuszczyca, osteoporoza i astma. Raki, które można dogodnie leczyć lub im zapobiegać zgodnie z wynalazkiem mogą zostać histogenetycznie sklasyfikowane jako złośliwe guzy nabłonkowe, obejmując raki i gruczolakoraki, i jako złośliwe guzy nienabłonkowe, obejmując tłuszczomięsaki, włókniaki mięsakowe, chrzęśniakomięsaki, kostniakomięsaki, mięsaki gładkie, mięśniakomięsaki prążkowe, glejaki, nerwiaki niedojrzałe,rdzeniaki, czerniaki złośliwe, oponiaki złośliwe, różne białaczki, różne zaburzenia mieloproliferacyjne, różne chłoniaki (chłoniak Hodgkin-a i chłoniak nieziarniczy), naczyniomięsaki krwionośne, mięsaki Kaposiego, mięsakonaczyniaki chłonne, potworniaki złośliwe, rozrodczaki, nasieniaki, i złośliwe nabłoniaki kosmówkowe.

Raki i gruczolakoraki są najczęściej spotykane (szacuje się, że są przyczyną 90% śmiertelnych przypadków nowotworowych) i z tego powodu stanowią one choroby będące celem szczególnego zainteresowania w leczeniu/profilaktyce. Bardzo ważnymi rakami i gruczolakorakami są powodujące choroby dróg oddechowych (szczególnie wywodzące się z oskrzeli), piersi, okrężnicy i odbytnicy oraz żołądka. Jednakże, także raki i gruczolakoraki prostaty, jajnika,tkanki limfoidalnej i szpiku kostnego, macicy, trzustki, przełyku, pęcherza moczowego i nerki są przyczyną znaczącej ilości zgonów i z tego powodu są godne zainteresowania.

Szczepionkę dogodnie podaje się w celach profilaktycznych, lecz ze względu na przewlekły charakter tych chorób oraz ich tendencję do remisji i nawrotów, może być ona także podawana pacjentom, u których stwierdzono jedną lub więcej z powyżej wspomnianych chorób oraz może być podawana w celu utrzymania stanu remisji.

W oparciu o wcześniejsze badania na myszach, uważa się, że modyfikowane analogi TNFα według wynalazku mogą być także podawane jako element terapii leczniczej w powyżej wspomnianych chorobach w stanie ostrym lub przynajmniej z nadzieją zapewnienia pacjentowi remisji i utrzymania jej na stałym poziomie.

Obecnie nie można ustalić specyficznego efektywnego przedziału dawek, ponieważ szczepionki nie były jeszcze testowane na ludziach wrażliwych na jedną z tych chorób. Ocena co do wielkości dawki powinna być dokonana przez odpowiedzialnego lekarza.

W jednym wykonaniu szczepionka może zawierać mieszaninę dwóch różnie zmodyfikowanych cząsteczek TNFα zawierających dwa różne epitopy komórki T, np. P2 i P30, które wywodzą się z anatoksyny tężcowej. Ta mieszanina może zawierać ewentualnie odpowiednią ilość farmaceutycznie dopuszczalnego adiuwanta.

W innym wykonaniu szczepionka może nie zawierać zmodyfikowanej cząsteczki ludzkiego TNFα jako takiej, lecz raczej konstrukt zawierający niezakaźną nieintegrującą sekwencję DNA kodującą taką cząsteczkę, operacyjnie związaną z sekwencją promotora, który może kontrolować ekspresję takiej sekwencji DNA u człowieka, w ilości wystarczającej aby następowało pobranie takiego konstruktu, i następowała ekspresja wystarczająca do indukowania neutralizującej odpowiedzi przeciwciałowej przeciwko TNFα. Użyteczność tego typu szczepionek, tak zwanych szczepionek DNA, jest zilustrowana np. w patentach USA o numerach 5.589.466 i 5.580.859, obydwa włączane do niniejszego opisu przez odesłanie, w szczególności w odniesieniu do sposobów podawania.

Szczepionki DNA mogą zawierać wirusowy wektor ekspresyjny, taki jak retrowirusowy wektor ekspresyjny.

Ogólnie, szczepionki według wynalazku mogą być przystosowane do podawania doustnego lub pozajelitowego, w szczególności podskórnego, domięśniowego lub śródskórnego.

PL 194 221 B1

Przeciwciała indukowane podaniem szczepionki według wynalazku, dogodnie przeciwciała monoklonalne, mogą być zastosowane w szczególności do celów diagnostycznych.

Sposób testowania ludzkich płynów ustrojowych na obecność TNFα, może obejmować kontaktowanie kompozycji zawierającej zmodyfikowany TNFα według wynalazku z próbką ludzkiego płynu ustrojowego i określanie, czy wspomniane przeciwciała wiążą się z TNFα we wspomnianej próbce.

Sposób diagnozowania chorób związanych z TNFα może obejmować test immunologiczny in vitro do wykrywania TNFα w ludzkich płynach ustrojowych.

Wspomniane sposoby mogą obejmować zastosowanie warstrowego (kanapkowego) tesu ELISA lub równoważnych testów, które mogą obejmować amplifikację lub być jej pozbawione, np. stosowanie techniki awidyna/biotyna.

Szczepionki/białka rekombinowane mogą zostać scharakteryzowane przy pomocy technik znanych specjaliście w tej dziedzinie techniki:

chromatografia żelowa w obecności SDS (SDS-Page) połączona z wybarwianiem coomassie lub srebrem (informacja o wielkości i czystości),

IEF - ogniskowanie izoelektryczne (informacja o punkcie izoelektrycznym) próba z endotoksyną LAL (informacja o czystości), białko komórek żywiciela (informacja o czystości), spektroskopia masowa (informacja o masie cząsteczkowej),

SE-HPLC z profilem detekcji w UV (informacja o rozkładzie mas cząsteczkowych) sekwencja N-końcowa (informacja o tożsamości), dichroizm kołowy (informacja o strukturze trzeciorzędowej),

SE-HPLC z wykrywaniem rozpraszania (informacja o strukturze trzeciorzędowej poprzez rozpraszanie światła), skład aminokwasowy (informacja o tożsamości), immunogenność u gatunków heterologicznych (mysz, szczur lub królik), reaktywność z przeciwciałami w teście Western Blot, spektroskopia NMR, struktura krystalograficzna, określenie całkowitej sekwencji aminokwasowej.

Część eksperymentalna z opisem zalecanych realizacji

W publikacji WO 95/05849 wykazano, że epitopy cząsteczek zmodyfikowanego mysiego TNF komórek T α mogą indukować wysoki poziom reakcji krzyżowych z natywnym (typu dzikiego) mysim TNα. Te przeciwciała są zdolne do oddziaływania z TNFα i jego receptorem zarówno in vitro jak i in vivo. Odpowiednie efekty immunizacji przeciwko TNFα wykazano w wielu modelach zwierzęcych chorób indukowanych przez TNFα, takich jak doświadczalna kacheksja, indukowane kolagenem zapalenie stawów i doświadczalne alergiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE). Wyniki doświadczeń na zwierzętach uzyskano pomimo faktu, że obydwie użyte zmodyfikowane cząsteczki mysiego TNFα (nazwane MR 103 i MR 106) nie były optymalizowane pod względem immunogenności w haplotypach MHC klasy II DBA/1 i SJL myszy. Te szczepy myszy odpowiednio użyto w doświadczeniach z zapaleniem stawów i EAE. W innym doświadczeniu dyferencyjnie zmodyfikowana cząsteczka mysiego TNFα (MR 150) pozwalała uzyskać silniejszą odpowiedź immunologiczną niż uzyskiwana za pomocą rekombinowanego mysiego TNFα sprzężonego z białkami E.coli z zastosowaniem formaldehydu.

MR 103, MR 105 i MR 106 są mysimi cząsteczkami i w oparciu o wcześniejszą publikację WO 95/05849 nie można poczynić żadnych przypuszczeń odpowiednio co do immunogenności komórek T w przypadku zastąpienia zmodyfikowanymi cząsteczkami ludzkiego TNFα ani o ich potencjalnej zdolności do indukowania przeciwciał neutralizujących TNFα, ponieważ wszystkie te cząsteczki były aktywne.

Otrzymywanie konstruktów ludzkiego TNFα

Ogólnie, w przypadku szczepionki TNFα do stosowania u ludzi cząsteczki TNFα powinny spełniać następujące wymagania:

powinny być one immunogenne w odniesieniu do dużej części populacji powinny być zdolne do optymalnego indukowania przeciwciał neutralizujących TNFα nie powinny one posiadać pozostałości aktywności biologicznej TNFα.

Ponadto, podczas procesu selekcji powinny być rozważone inne praktyczne parametry takie jak poziom ekspresji rekombinantów, łatwość oczyszczania, rozpuszczalność itp.

Immunologiczna niespecyficzność modyfikowanych cząsteczek TNFα

PL 194 221 B1

Podczas otrzymywania ludzkiej szczepionki TNFa celem było wyprodukowanie zmodyfikowanych cząsteczek ludzkiego TNFa, które ewentualnie byłyby immunogenne w możliwie największej grupie ludzkiej populacji prezentującej w oczywisty sposób dużą liczbę typów różnorodnych HLA klasy II. Dlatego zamiast specyficznych epitopów MHC zastosowanych we wcześniejszych doświadczeniach na zwierzętach użyto słabo specyficzne epitopy komórek T. Nie było wiadomo z poprzedniej publikacji WO 95/05849 w jaki sposób takie epitopy mogą wpłynąć na zdolność takich cząsteczek do indukowania przeciwciał neutralizujących.

Wybrano dwa epitopy komórek T pochodzące z anatoksyny tężcowej (TT), P2 i P30, które zostały dobrze scharakteryzowane w literaturze naukowej. Wiadomo o tych epitopach, że są one immunodominujące w TT i są zdolne do wiązania się z co najmniej 80% cząsteczek HLA klasy IIw populacji ludzkiej.

Ponadto dzięki zastosowaniu tych epitopów TT spodziewano się umożliwienia testowania immunogenności konstruktów TNFain vitro w jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej (PBMC) i w liniach komórek T generowanych z krwi odpornych dawców na TT.

Sekwencja aminokwasowa epitopu P2 to QYIKANSKFIGITEL i odpowiada aminokwasom 830-844 w TT, a sekwencja epitopu P30 to FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE i odpowiada ona aminokwasom 947-967 w TT. Podstawienie P2 i P3 do dwóch różnych cząsteczek ludzkiego TNFa zmieniało natywną sekwencję TNFa odpowiednio w 10% i 15%. W przypadku gdy obydwa epitopy były podstawiane w jednej cząsteczce TNFa, jej sekwencja ulegała zmianie w ok. 25%, i można było obawiać się, że może to zbytnio wpływać na pozostałe natywne części cząsteczki TNFa. Dlatego zdecydowano się na otrzymanie dwóch cząsteczek TNFa, z których każda zawierała P2 albo P30. Oczekiwano, że takie dwie cząsteczki łącznie byłyby immunogenne dla 60% populacji ludzkiej. W dodatku, jest bardzo prawdopodobne, że skrócone cząsteczki złożone częściowo z epitopu P2 lub P30 i częściowo z regionów flankujących TNFamogą również przyczyniać się do uzyskania konstruktów o immunogenności dla prawie 100% populacji.

Mimo, że możliwe było otrzymywanie przeciwciał indukowanych przez wszystkie konstrukty mysiej dobrze przetestowanych szczepów mysich, por. powyższe omówienie MR 103, 105 i 106, można było oczekiwać a priori, że insercja obcego epitopu komórki T będzie bardziej korzystna w pewnych pozycjach niż w innych pozycjach TNFa ze względu na prezentowanie epitopu komórkom T przez cząsteczki MHC klasy II. Dlatego zdecydowano się na otrzymanie biblioteki różnorako zmodyfikowanych ludzkich cząsteczek TNFa ze wstawionym w różnych pozycjach cząsteczki epitopem P2 i P30, patrz fig. 4. Następnie, wszystkie cząsteczki były testowane in vitrotestem z komórkami T, w oparciu o linie komórkowe jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) lub linie komórek T specyficzne dla P2/P30 izolowane od licznych zdrowych dawców krwi odpornych na TT.

Niezgodnie z tymco oczekiwano, okazało się, że mimo obserwowanych niewielkich ilościowych różnic, wewnątrz cząsteczkowa pozycja epitopów P2 i P30 nie była istotna dla podatności na obróbkę przez komórki prezentujące antygen i następnie prezentowanie TT specyficznym komórkom T. Tak więc, P2 wstawiony w pozycjach od 132 do 146, 65 do 79 oraz 76 do 90 oraz P30 wstawiany w pozycjach 40 do 60 i 132 do 152 (TNF2-5, 2-3, 2-7, 30-2, 30-5) były wszystkie poddawane obróbce i prezentowane komórkom T. W związku z dyskusją powyżej zdaje się być bardzo prawdopodobne, że te cząsteczki mogą być ewentualnie uniwersalnie immunogenne w populacji ludzkiej.

Zdolność modyfikowanych ludzkich cząsteczek TNFado indukowania przeciwciał neutralizujących

Jak już wspomniano powyżej, nie było możliwe na podstawie poprzednio prowadzonych badań na myszach opisanych w publikacji WO 95/05849 ustalenie, która pozycja może być najbardziej odpowiednia do indukowania przeciwciał neutralizujących TNFa, ponieważ trzy analogi MR 103, MR 105 i MR 106 były zdolne do indukowania przeciwciał pomimo posiadania substytucji w różnych obszarach. Z tego powodu wyprodukowano bibliotekę różnych cząsteczek ludzkiego TNFa posiadających w różnych pozycjach insercje P2 i P30. Substytucje były losowo rozmieszczane w całych cząsteczkach użytych. Przeciwciała indukowane u królika w wyniku szczepień tymi cząsteczkami były następnie testowane zarówno w biochemicznych jak i biologicznych testach in vitro pod względem ich zdolności do oddziaływania na aktywność biologiczną TNFa.

W niepublikowanych obserwacjach twórców niniejszego wynalazku wykazano, że zależnie od wewnątrzkomórkowych pozycji insercji epitopu obserwowany był różny zakres specyficzności indukowanych przeciwciał. Całkiem niezgodnie z tym czego można było się spodziewać w oparciu o dane strukturalne dotyczące cząsteczki TNFa zaobserwowano, że substytucje zlokalizowane w przedniej harmonijce β zarówno w przypadku P2 jak i P30 całkowicie znosiły aktywność biologiczną cząsteczek

PL 194 221 B1

TNFa, ale jednocześnie zachowywały zdolność modyfikowanych cząsteczek do indukowania przeciwciał neutralizujących TNFa.

Cząsteczki zawierające P2 lub P30, w pozycjach wspomnianych powyżej, okazały się szczególnie efektywne w indukowaniu przeciwciał neutralizujących. Stąd też dowolne z tych cząsteczek są potencjalnymi kandydatami do zastosowania w ludzkich szczepionkach TNFa.

Aktywność biologiczna różnych konstruktów TNFa

Z oczywistych względów nie było wykonalne stosowanie w szczepionkach toksycznych cząsteczek TNFa. Modyfikowane cząsteczki TNFa powinny być z tych powodów nietoksyczne tj. być pozbawione pozostałości aktywności TNFa.

Wszystkie zmutowane białka TNFa były z tych powodów testowane in vitro w zależnym od TNFa teście biologicznym oraz w teście wiązania do receptora w celu stwierdzenia czy są one nietoksyczne. Wykazano jasno, że wszystkie zmodyfikowane cząsteczki ludzkiego TNFa (TNF2-5, 2-3, 2-7, 30-2, i 30-5) były pozbawione aktywności biologicznej. Dzięki temu spełnione zostały wszystkie wymagania stawiane tym cząsteczkom aby mogły być częścią uniwersalnej, nietoksycznej szczepionki zdolnej do indukowania przeciwciał skierowanych przeciwko ludzkiemu TNFa.

Przykład 1

Opracowanie konstruktów genetycznych.

Zdecydowano się na wyprodukowanie 10 różnych zmodyfikowanych cząsteczek ludzkiego TNFa

- pięć zawierających epitop P2 i pięć zawierających P30. Epitopy były rozmieszczone w różnych pozycjach wewnątrz cząsteczki. Konstrukty genetyczne zostały uzyskane za pomocą różnych standardowych enzymów restrykcyjnych i technik mutagenezy bazujących na PCR. Konstrukty genetyczne zostały schematycznie zaprezentowane na figurze 4a i 4b. Sekwencje DNA kodujące modyfikowane cząsteczki TNFai odpowiadające im sekwencje aminokwasowe zostały włączone jako SEQ ID NR:1- SEQ ID NR:20. Poniżej na zasadzie przykładu opisano konstrukcję zmutowanego genu ludzkiego TNFa, strategia klonowania i mutagenezy, i następnie ekspresji, izolacji i oczyszczania analogu TNF2-5 zostały wyjaśnione.

Konstruowanie i otrzymywanie TNF2-5

Genetyczne konstruowanie zmutowanego genu ludzkiego TNF2-5, klonowanie i strategiamutagenezy.

Genetyczne konstruowanie genu kodującego zmutowany analog ludzkiego TNF2-5 było oparte na tradycyjnych technikach mutagenezy opartej na PCR, oraz innych genetycznych konstrukcjach.

Natywna sekwencja DNA ludzkiego TNFa kodująca rozpuszczalną część tej cząsteczki została uzyskana tradycyjnym klonowaniem PCR z zastosowaniem syntetycznie syntetyzowanych starterów I oraz II (tabela 1 oraz SEQ ID NR:21 i 22) na bazie ludzkiej biblioteki cDNA dostępnej komercyjnie, CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA, USA (fig. 16,1). Natywny gen został wstawiony do wektora ekspresyjnego E.colikomercyjnie oferowanego przez Novagen, Madison, WI53711, USA, w taki sposób, że gen mógł być poddawany ekspresji w ramce zgodnej z promotorem indukowanym IPTG.

Konstrukcję genetyczną zmutowanego analogu TNFa TNF2-5 przeprowadzono techniką mutagenezy PCR w oparciu o natywną sekwencję DNA. Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca epitop komórek T została włączona do syntetyzowanego sztucznie 75-cio nukleotydowego oligomeru (starter „mut2-5”, tabela 1i SEQ ID NR: 27) pomiędzy dwie 3'- i 5'- hybrydyzujące nici DNA homologicznego do TNF DNA, „mut” starter był dzięki temu zdolny do hybrydyzacji z natywną sekwencją genu ludzkiego TNFa w określonym miejscu wybranym dla TNF2-5 (patrz fig. 16,2a). W oligonukleotydzie „mut” liczba kodonów kodujących epitop komórek T odpowiadała dokładnie liczbie kodonów TNF pominiętych między dwiema hybrydyzującymi nićmi 3'- i 5' DNA DNA homologicznego do TNF. Startery mutagenezy zostały zastosowane w celu uzyskania produktu PCR zawierającego DNA kodujący epitop komórek T i sekwencję TNFaznajdującą się poniżej (lub 3') w stosunku do wstawionego epitopu, (fig. 16,2a).Odcinek DNA TNFa znajdujący się powyżej (lub 5') w stosunku do punktu insercji epitopu był dostarczany poprzez drugi produkt PCR z zastosowaniem starterów I oraz III (tabela 1, SEQ ID NR:23) (fig. 16,2b). Dwa produkty PCR były następnie łączone razem w końcowej reakcji PCR, (fig. 16,3) z zastosowaniem dwóch najbardziej skrajnych starterów (I,II) z obydwu reakcji. Całkowita sekwencja DNA mutanta TNF2-5 była następnie wprowadzana do komercyjnego wektora ekspresyjnego E.coli analogicznie do klonowaniaekspresyjnego natywnego genu w ten sposób, że gen mógł ulegać transkrypcji w transformowanych komórkach pod kontrolą promotora indukowanego przez IPTG.

Startery „mut” zastosowane do konstruowania innych analogów (TNF2-1, 2-3, 2-4, 2-7, 30-1, 30-2, 30-3, 30-4 i 30-5) zostały oznaczone odpowiednio jako SEQ ID NR:23-26 oraz 28-33.

PL 194 221 B1

T a b el a I

Starter I ludzki TNF-alfa FW. 24'-mer.

miejsce NcoI

5'-GAC AAG CCC ATG GTC AGA TCA TCT-3'

Starter II ludzki TNF-alfa Rev 30'-mer.

miejsce XbaI.

5'-TCT CTA GAG GGC AAT GAT CCC AAA GTA GAC-3'

Starter „mut2-5” Mutant oligo P2-5 (tt830-44), 75'-mer.

5'-G AAG GGT GAC CGA CAG TAC ATT AAG GCC AAT TCG AAG TTC ATT GGC ATC ACT

GAG CTG TCT GGG CAG GTC TAC TT-3'

Starter III ludzki TNF-alfa Rev 2'nd. 21'-mer.

5'-CCC AAA GTA GAC CTG CCC AGA-3'

Hodowanierekombinowanych bakterii, zbieranie i rozpuszczanie ciał inkluzyjnych.

Oczyszczanie białka analogu TNF2-5.

Otrzymywanie białka TNF2-5 było analogiczne do otrzymywania innych rekombinowanych cząsteczek TNF.

1. Zaszczepiano 20 ml pożywki LB zawierającej 50 μg/ml karbenicyliny transformowanym szczepem E.coli posiadającym indukowany IPTG wektor plazmidowy zawierający gen kodujący rekombinowane białko, hodowano E.coli przez noc w 37°C wytrząsając.

2. Rozcieńczano całonocne hodowle 1:25 w 250 ml pożywki TB zawierającej 50 μg/ml karbenicyliny, i hodowano do uzyskania wartości OD450 wynoszącej 1. Indukowano ekspresję rekombinowanych białek poprzez dodawanie IPTG do uzyskania stężenia 1 mM. Hodowano przez noc intensywnie wytrząsając w 37°C.

3. Zbierano rekombinowane komórki z medium poprzez odwirowywanie przy 3500 x g. Przemywano osad jednorazowo buforem BSB. Stosowano 150 ml BSB na 50 g mokrej masy bakterii.

4. Sonifikowano 4-krotnie przez 30 sekund przy maksymalnej amplitudzie aż do uzyskania całkowicie homogennej zawiesiny. Sonifikację prowadzono stosując sonifikator MSE Soniprep 150 ustalony dla 9,5 mm próbie standardowej (Soniprep 05 38 121-1154).

5. Dodawano 8 μl PMSF (50 mM) oraz 80 μl roztworu lizozymu (10 mg/ml) na gram osadu komórek. Inkubowano przez 30 min w temperaturze pokojowej.

6. Dodawano 4 mg kwasu dezoksycholowego na gram osadu, mieszano i pozostawiano w 37°C.

7. Gdy roztwór stawał się lepki dodawano 20 μl DNAzy (1 mg/ml) na gram osadu i MgCl₂ do końcowego stężenia 5 mM, mieszano i pozostawiano w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

8. Sonifikowano na lodzie 5-cio krotnie przez 30 sekund z 30-to sekundowymi przerwami przy maksymalnej amplitudzie, aż do uzyskania ciekłego, nielepkiego roztworu.

9. Odwirowywano przy 20.000 x g przez jedną godzinę, zachowywano supernatant do późniejszej kontroli procedury przemywania aby stwierdzić czy wszystkie ciała inkluzyjne zostały wytrącone.

10. Ponownie zawieszano osad w wodzie MiliQ (1 ml H2O na gram E.coli), wytrząsano przez 1 godzinę.

11. Odwirowywano przy 20.000 x g przez jedną godzinę, zachowywano supernatant do późniejszej kontroli aby stwierdzić czy wszystkie ciała inkluzyjne zostały wytrącone.

12. Zawieszano ponownie osad w 1 M roztworze mocznika w ilości 1 ml na gram E.coli, wytrząsano 1godzinę.

13. Odwirowywano przy 20.000 x g przez jedną godzinę, zachowywano supernatant do późniejszej kontroli aby stwierdzić czy wszystkie ciała inkluzyjne zostały wytrącone.

14. Zawieszano ponownie osad w 1 M roztworze guanidyny w ilości 1 ml na gram E.coli, wytrząsano 1 godzinę.

15. Odwirowywano przy 20.000 x g przez jedną godzinę, zachowywano supernatant do późniejszej kontroli aby stwierdzić czy wszystkie ciała inkluzyjne zostały wytrącone.

16. Zawieszano ponownie osad w 25 ml 6 M roztworu guanidyny + 20 mM Tris pH 8,0, mieszano przez noc.

PL 194 221 B1

17. Odwirowywano przy 20.000x g przez jedną godzinę, zbierano supernatant zawierający rekombinowane białka z ciał inkluzyjnych, zachowywano do późniejszej kontroli osad aby stwierdzić czy wszystkie ciała inkluzyjnezostały rozpuszczone.

18. Roztwór białkowy poddawano intensywnej dializie w wodzie MiliQ, następnie roztwór był suszony przez wymrażanie.

19. Wysuszony przez wymrażanie materiał rozpuszczano w 20 mM Tris, 6 M guanidynie, 30% 2-propanolu (pH 8,0) do stężenia 20 mg/ml. Pozostawiono do rozpuszczania przez noc połączonego z delikatnym wytrząsaniem. Obecność monomerów stwierdzano na kolumnie superdex 200 (XK 16, Pharmacia, średnica: 1.6 cm, wysokość: 750 cm). Przepływ buforu rozdzielającego 1 ml/min. Porównywano ze standardem w tym samym buforze.

20. Oczyszczanie białka prowadzono techniką filtracji żelowej na kolumnie superdex 200 (XK2 16, Pharmacia, wysokość: 100 cm, średnica: 2.,6 cm), którą równoważono buforem do równoważenia. Nanoszono w buforze do równoważenia. Stosowano objętość próby równą ok. 1% całkowitej objętości kolumny.

21. Ponowne zwijanie się rekombinowanych białek prowadzono stosując dializę. Białko rozcieńczano do 0,1 mg/ml w buforze do równoważenia, roztwór był umieszczany w wygotowanej torebce do dializy i prowadzono dializę w: 20 mM Tris, 4 M mocznik (pH 8,5) z trzykrotnymi zmianami, przez noc w temperaturze pokojowej. Torebkę dializacyjną przenoszono do buforu Tris (20 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 8,0)). Zmieniano trzykrotnie, pierwszy raz w temperaturze pokojowej. Przez noc w zimnym pokoju. Stopień ponownego zwinięcia oceniano na kolumnie Superose 12 zrównoważonej buforem Tris (20 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 8,0)). Porównywano ze standardami.

Przechowywanie.

Białko rekombinowane przechowywano w postaci wysuszone przez wymrażanie.

Produkcja cząsteczek modyfikowanej TNFα na dużą skalę może być prowadzona zgodnie z poniższą procedurą:

Materiały startowe:

Hodowano 500 litrową kulturę E.coli, dializowano do wody to ok. 50 litrów.

1) Przemywanie komórek

A) Rozmrażano mrożony osad komórkowy

B) Odwirowywano komórki przez 10 minut przy 4000 xg

C) Zawieszano osad w 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0.

Powtarzano etap B) i C) trzykrotnie

2) homogenizowanie komórek

A) Homogenizowano komórki w homogenizerze Rannie, 5 cykli przy 700 bar

B) Odwirowywano ciała inkluzyjne przez 30 minut przy 16.500*g

C) Przemywano ciała inkluzyjne trzykrotnie w 3M guanidynie, 1 M NaCl, 5 mM EDTA, 20% sacharozie, 50 mM Tris, pH 8. Odwirowywano ciała inkluzyjne przez 30 minut przy 16.500*g.

3) Rozpuszczanie ciał inkluzyjnych

Ponownie zawieszano osad w 6 M guanidynie, 10 mM DTT, 150 mM NaCl, 5% etanolu, 50 mM Tris, pH 8. Stosowano ok. 1 ml buforu/100 mg osadu.

4) Ultrafiltracja ciał inkluzyjnych

Usuwano większe zanieczyszczenia na filtrze 0,45 μm. Usuwano wysokocząsteczkowe składniki na filtrze 30 kDa

Zatężano ciała inkluzyjne na filtrze 5 kDa.

5) Zmiana buforu

Przygotowywano próbę do chromatografii jonowymiennej. Zmieniano bufor na 6 M mocznik, 1mM DTT w 50 mM Tris, pH 8 poprzez diafiltrację.

6) Oczyszczanie na SP-Sepharose

Nanoszono białko na kolumnę SP-Sepharose. Przemywano kolumnę czterema objętościami buforu A i eluowano białka 100% buforem B i zbierano wszystkie frakcje zawierające TNFa

Bufor A: 6 M mocznik, 1mM DTT, 50 mM Tris/Cl, pH 8.

Bufor B: 6 M mocznik, 1M NaCl, 1mM DTT, 50 mM Tris/Cl, pH 8.

7) Ponowne zwijanie ludzkiego TNFa

PL 194 221 B1

Rozpuszczano zebrane białka do ok. 0,1 mg TNFo/ml w 6 M mocznik, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 5% EtOH w 20 mM Tris/Cl pH 8,8 i usuwano stopniowo mocznik poprzez dializowanie do następujących buforów:

A) 2 M mocznik, 1mM DTT, 150 mM NaCl w 20 mM Tris/Cl, pH 8,8 -przez noc w 5°C

B) 1 M mocznik, 1mM DTT,150 mM NaCl w 20 mM Tris/Cl pH 8,8-osiem godzin w 5°C

C) 1 mM DTT, 150 mM NaCl w 20 mM Tris/Cl pH 8,8 -przez noc w 5°C

D) 150 mM NaCl w 20 mM Tris/Cl pH 8,8 -przez noc w 5°C

8) Przechowywanie analogów ludzkiej TNFα

Zatężano białka do 1,0 mg/ml i przechowywano próby w -20°C.

Pożywka TB

Rozpuszczano Terrific Broth (GIBCO BRL 22711-22) w wodzie MiliQ zgodnie zinstrukcją producenta. Autoklawowano w 121°C przez 20 min.

Wyjściowy roztwór stężony x100 (50 mg/ml) karbenicyliny

Sól disodową karbenicyliny (Sigma C1389) rozpuszczano w wodzie MiliQ do stężenia 50 mg/ml. Roztwór sterylizowano filtrując na filtrze 0,2 μm (Sterifix 0409 9206)

Wyjściowy roztwór stężony x100 (100 mM) IPTG

Izopropylo-beta-D-tiogalaktopyranozyd (IPTG, USB 17884) 1,19 g IPTG rozpuszczano w 50 ml wody MiliQ. Roztwór sterylizowano filtrując na filtrze 0,2 μm (Sterifix 0409 9206)

Bufor BSB

Roztwór do zawieszania bakterii (BSB) mM TRIS (zasady Trisma, SigmaT1503)

0,5 M NaCl (Ridel-de.Haen 31434) mM DTT (DL-ditiotreitol, Sigma D-0632) pH 8,0

PMSF mM, fenylometylosulfonylofluorek, SIGMA # P-7626, rozpuszczano w 2-propanolu

Roztwór lizozymu mg/ml lizozymu Grade III z białek jaj kurzych, (EC 3.2.1.17) SIGMA # L-7001

Kwas dezoksycholowy (Kwas 7-dezoksycholowy) Sigma # D-6750

DNAza mg/ml Dnazy I, Dezoksyrybonukleazy I, (EC.3.1.21.1) Boehringer Cat # 1284932

Mocznik

Mocznik (GibcoBRL 15716-020)

Guanidyna

Chlorowodorek guanidyny (Sigma G4505)

2-Propanol

Bufor do elucji mM TRIS, (zasada Trisma, SigmaT1503)

M mocznik, (GibcoBRL 15716-020)

0,1% β-merkaptoetanol pH 8,0

Bufor do równoważenia mM TRIS, (zasada Trisma, SigmaT1503)

M mocznik, (GibcoBRL 15716-020)

0,1% β-merkaptoetanol

Przykład 2

Ekspresja, oczyszczanie i ponowne zwijanie modyfikowanych P2 i P30 cząsteczek TNFa

Powszechnie wiadomo, że białka rekombinowane zachowują się różnie podczas ekspresji, oczyszczania i zwijania. Wszystkie białka ekspresjonowano w E.coli i uzyskano poziom ekspresji mieszczący się w zakresie 2-20%. Wszystkie te białka były rozpoznawane w doświadczeniach typu Western blotting stosujących komercyjnie dostępne poliklonalne królicze przeciwciała specyficzne wobec ludzkiego TNFa.

Konstrukty TNFa były następnie ekspresjonowane kolejno w 250 ml hodowlach w szarżach wielkości 3-4 litry. Wszystkie modyfikowane białka TNFa były ekspresjonowane jako ciała inkluzyjne a zwinięte białko o czystości większej niż 85% było otrzymywane metodą opisaną powyżej.

PL 194 221 B1

Zawartość białka była określana za pomocą standardowej analizy BCA. Wszystkie oczyszczania białek były prowadzone w co najmniej trzech oddzielnych cyklach dla każdego białka, i we wszystkich przypadkach oddzielone porcje białka były testowane i okazywały się być podobne. Białka były przechowywane w stężeniu od 0,2-1,0mg/ml w PBS w -20°C aż do użycia.

Standardowa kontrola jakości obejmowała elektroforezę żelową SDS z wybarwianiem Coomassie blue oraz wybarwianiem srebrem poszczególnych preparatów białkowych. We wszystkich przypadkach białka miały oczekiwaną wielkość i czystość większą niż 85%.

Cząsteczki ze wstawionymi w pozycji 4 epitopami (TNF2-4 i TNF30-4) były ekspresjonowane jedynie na niskim poziomie (ok. 2%).Ponadto było bardzo trudno oczyścić te cząsteczki, a ich ponowne zwijanie było szczególnie utrudnione. Obydwie cząsteczki, szczególnie TNF30-4, nie rozpuszczały się szczególnie dobrze w PBS i miały tendencję do wytrącania się podczas przechowywania.

Przykład 3

Aktywność biologiczna różnych konstruktów TNFα

Bezpośrednia aktywność biologiczna oczyszczonych cząsteczek TNFα była testowana w oznaczeniu biologicznym L929, które stanowi standardowy test in vitrookreślający aktywność biologiczną TNFα. Jak pokazano na figurze 6 żadna z cząsteczek TNFα modyfikowanych P2 i P30 nie powodowała obumierania komórek L929 w zakresie testowanych stężeń (do 60 mg/ml). Komercyjnie dostępne cząsteczki rekombinowanych TNFα były w pełni aktywne przy ok. 0,6 mg/ml. Preparaty TNFα typu dzikiego były także w pełniaktywne w całym testowanym zakresie stężeń.

Przykład 4

Zdolność modyfikowanych cząsteczek TNFα do indukowania neutralizujących przeciwciał

Immunizowano króliki każdym z dziesięciu konstruktów w celu stwierdzenia, czy są one zdolne do indukowania przeciwciał mogących neutralizować biologiczną aktywność ludzkiego TNFα in vitro. Stosowano grupy trzech królików i każdy królik otrzymywał 100 mg TNFα s.c. w kompletnym adiuwancie Freunda i następnie 100 mg w przybliżeniu co trzeci tydzień w niekompletnym adiuwancie Freunda.

Podczas całego 18 tygodniowego okresu immunizacji zbierano próbki krwi w regularnych odstępach i testowano surowice na aktywność anty- TNFα stosując konwencjonalną technikę ELISA w której jako antygen używano oczyszczony, komercyjnie dostępny niemodyfikowany ludzki TNFα.

U wszystkich królików powstały przeciwciała anty- TNFα podczas okresu immunizacji a maksymalny poziom bądź miano przeciwciał zmieniało się w zakresie dekady w obrębie każdej grupy. Średnie miana przeciwciałowe zostały pokazane na fig.7. TNF2-5, TNF2-7, TNF2-3, TNF2-1 i WT- TNFα indukowały miana na poziomie stu w trakcie 2-4 tygodni natomiast TNF2-4 dawał znacznie wolniejszą odpowiedź. Podobna kinetyka była obserwowana dla białek TNF30 dla których również w przypadku TNF30-4 otrzymywana była wolniejsza odpowiedź.

Zdolność tych surowic do oddziaływania z ludzkim TNFα i jego receptorem była testowana w oznaczeniu L929 oraz w teście wiązania receptora fazy stałej.

W oznaczeniu L929 rozcieńczenia surowic odpornościowych oraz kontrolnej surowicy nieodpornościowej były dodawane do komercyjnie dostępnego ludzkiego TNFα przed dodaniem mieszaniny do komórek L929. Surowice ze wszystkich trzech królików z każdej grupy były testowane w dwóch powtórzeniach i obliczana była przeciętna wartość. Ponieważ normalna surowica wykazuje tendencję do zwiększania wartości tła w systemach detekcji kolorów, były one odejmowane od wszystkich wartości i wyliczano względne procentowe hamowanie. Wyniki dotyczące zdolności do hamowania w 14 tygodniuschematu szczepień immunizacyjnych wszystkich królików zostały pokazane na fig. 8.

TNF2-5 nie posiadający substytucji w żadnym segmencie nici harmonijki β jest oczywiście najlepszy w porównaniu z innymi konstruktami i ta cząsteczka była porównywalna z posiadającą pełną toksyczność cząsteczką WT-TNFα w odniesieniu do zdolności do indukowania przeciwciał neutralizujących (dane nie pokazane). TNF2-3 posiadający małą substytucję w nici D harmonijki β i TNF2-7 nie posiadający żadnej substytucji w niciach tworzących tylną harmonijkę β, są także zdolne do indukowania przeciwciał hamujących, a miano przeciwciał neutralizujących w przypadku TNF2-7 wzrastało znacząco w trakcie kolejnych trzech tygodni (dane nie pokazane). TNF2-4 i TNF2-1, które posiadają odpowiednio nici G i B harmonijki β, należące do tylnej harmonijki β nie posiadały zdolności do indukowania przeciwciał neutralizujących w oznaczeniu L929.

Wyniki odnoszące się do białek TNF30były bardziej zróżnicowane, mimo że TNF30-3 zdawała się być lepsze w 14 tygodniu. TNF30-1 i TNF30-4 posiadające odpowiednio substytucję w niciach G i B należących do tylnej harmonijki β, nie indukowały przeciwciał neutralizujących w teście L929.

PL 194 221 B1

W teście wiązania receptora w fazie stałej immobilizowano na mikropłytce testowej rekombinowany ludzki receptor 1 TNFα o masie 55 kDa (TNF-R55) a komercyjnie dostępny biotynylowany ludzki TNFα była podawany w odpowiednim rozcieńczeniu. Następnie wykrywano specyficzne wiązanie do receptora stosując streptawidynę znaczoną peroksydazą chrzanową oraz substrat luminescencyjny. Podczas testowania surowic pochodzących z immunizowanych królików były one podawane najpierw do roztworu biotynylowanego ludzkiego TNFα, a następnie mieszaninę dodawano do mikropłytek pokrytych TNF-R55. Surowice ze wszystkich trzech królików z każdej grupy były poddawane testom, a następnie wyliczano średnie wartości. Surowica z nieimmunizowanych królików była użyta jako kontrola. Poziom tła był bardzo niski i test był bardzo czuły. Wyniki zaprezentowano na fig. 9.

Można także stwierdzić, że wyniki uzyskane w oznaczeniu L929 i teście wiązania receptora w fazie stałej, były odpowiednio wzajemnie prawie identyczne w odniesieniu do konstruktów TNFα 2. Różnice między TNF30-2, 30-3 i 30-5 nie były tak wyraźne w teście z fazą stałą jak obserwowano w oznaczeniu L929. Jednakże test ze stałą fazą jest bardziej powtarzalny ze względu na jego bardziej biochemiczny niż komórkowy charakter, i wartości dla normalnej surowicy nie były odejmowane w tym teście.

Względne ilości surowicy (w procentach) dla których uzyskano połowę maksymalnego hamowania wiązania TNFα (wartości IC₅₀) były wyliczane dla TNF2-3, TNF2-5, TNF2-7, TNF30-2, TNF30-3, TNF30-5 i WT-TNFα dla każdej z odpowiednich surowic odpornościowych. Stwierdzając, że podobne krzywe mogły być otrzymane dla surowic odpornościowych otrzymanych przeciwko TNF2-1, TNF2-1, TNF30-1 i TNF30-4 przeprowadzono ekstrapolacje i wyliczono wartości IC50 również dla tych surowic. Wyniki zostały przedstawione w tabeli II.

Tabel a II

Wartości IC50 króliczych surowic odpornościowych przeciwko ludzkiemu TNFci w teście fazy stałej

2-1	2-3	2-4	2-5	2-7	WT	30-1	30-2	30-3	30-4	30-5
>	2,02%	>	0,53%	1,38%	0,43%	>	0,82%	0,88%	>	1,69%
100%		100%				100%			74%

Można także stwierdzić, że TNF2-5 stanowi ekwiwalent dla mysiego TNFc typu dzikiego (WT) w odniesieniu do zdolności indukowania anty-mysich przeciwciał neutralizujących TNFc w króliku. TNF2-1, TNF2-4, TNF30-1 i TNF30-4, wszystkie posiadające substytucje w niciach B lub G tylniej harmonijki β dawały bardzo słabą bądź żadną odpowiedź przeciwciałową. Sugeruje to nieoczekiwanie, że pomimo tego, że nici B i G tylnej harmonijki β nie są zaangażowane w wiązanie receptora, mutacje występujące w tych regionach prowadzą w jakiś sposób do zaburzenia struktury regionów ludzkiego TNFc zaangażowanych w wiązanie receptora. TNF30-2 i TNF30-3 okazały się zdolne do porównywalnie dobrego indukowania przeciwciał neutralizujących.

P r z y k ła d 5

Zdolność modyfikowanych cząsteczek TNFc do stymulowania komórek T pochodzących od zdrowych dawców odpornych na P2 i P30.

Ze względu na to, że oczekiwano, że lokalizacja epitopów P2 i P30 w zmodyfikowanych cząsteczkach TNFc może także przyczyniać się do obróbki antygenu i prezentacji wstawionych epitopów - a stąd do ich immunogenności - wszystkie 10 cząsteczek testowano w różnych testach komórek T. Zastosowano test molekularny poliklonalnych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC), i ustalono szereg linii komórek T specyficznych wobec P2 i P30 z użyciem konwencjonalnych metod immunologicznych do testowania peptydów i rekombinowanych białek TNFc posiadających wstawione epitopy P2 i P30.

Początkowo 28 zdrowych ochotników (dawców) testowano konwencjonalnym testem proliferacji PBMC na ich zdolność do odpowiedzi na peptydy TT i P2 oraz P30. Na podstawie tych wyników 19 osobników zdolnych do generowania znaczącej odpowiedzi na peptydy TT, P2 oraz P30 zostało wybranych do dalszych doświadczeń. Pomimo znacznego zróżnicowania poziomów odpowiedzi, potwierdzało to wyraźnie, że P2 i P30 są niespecyficznymi oraz immunodominującymi epitopami dla komórek T.

Dodatkowo do 28 dawców, wybrano także siedmiu kolejnych. Z powodów wyjaśnionych poniżej pewni z nich zostali wybrani ze względu na ich zdolność do generowania odpowiedzi na P30 albo na P2. Kilku z nich dodatkowo szczepiono TT w celu uzyskania silnej odpowiedzi komórek T. NiektóPL 194 221 B1 rzy z drugiej grupy dawców zostali także użyci do uzyskiwania linii komórek T specyficznych wobec P2 lub P30 w celu zbadania prezentowania antygenu P2 i P30 z modyfikowanych syntetycznych peptydów TNF oraz modyfikowanych cząsteczek. Na fig. 10 przedstawiono przykłady odpowiedzi proliferacyjnej poliklonalnych PBMC u trzech dawców wobec TT oraz peptydów P2 i P30.

Wszystkie 10 rekombinowanych białek testowano trzykrotnie dla przynajmniej 6 różnych stężeń począwszy od ok. 100 mg/ml, a wszystkie doświadczenia z PBMC były powtarzane 2-3 razy dla każdego osobnika. Wewnątrzkomórkowe wbudowywanie tymidyny znaczonej ³H zostało zastosowane do stwierdzenia proliferacji komórek T, a doświadczenia były zbierane i zliczane w formatach 96-studzienkowych. Indeksy maksymalnej proliferacji (PI) były wyliczane dla każdej krzywej miana jako stosunek przeciętnej liczby CPM w studzienkach doświadczalnychdzielonej przez przeciętną liczbę CPM uzyskanych w studzienkach nie zawierających antygenu (tylko PBS). Dane dotyczące proliferacji komórek T zbierano trzykrotnie, a Con A oraz P2 i P30 były stosowane odpowiednio jako kontrole negatywne oraz pozytywne. Na fig. 11 pokazano trzy przykłady wyników doświadczeń uzyskanych dla dwóch różnych dawców krwi z zastosowaniem różnych cząsteczek TNFa modyfikowanych P2 i P30.

JH odpowiadał tylko na P2, natomiast SR odpowiadał zarówno na P2 jak i P30. Odbijało się to takżena odpowiedzi proliferacyjnej na zmodyfikowane P2 i P30 białka TNFa, z których wszystkie były zdolne do stymulowania PBMC w różnym zakresie.

Na fig. 12 pokazano indeksy proliferacyjne (PI) wyliczone na podstawie 34 doświadczeń. Pomimo tego, że jest bardzo trudno porównać ilościowo PIpomiędzy różnymi doświadczeniami z powodu zmiennego poziomu tła PBS, wydaje się jasne, że wszystkie konstrukty są zdolne do lepszego lub słabszego wywoływania odpowiedzi proliferacyjnej.

W obrębie drugiej grupy dawców pewne osobniki zaszczepiano przeciwko TT na 1-2 miesiące przed doświadczeniami. PIuzyskane dla tych osób (HB, MR, KG i MW) były dużo wyższe dla wszystkich modyfikowanych konstruktów TNFa i dane były łatwe do oceny. Trzy osoby (DL, ID i LS) zaszczepiano dawniej niż przed 5-ciu laty, i wszyscy oni wykazywali wartości Pl poniżej przeciętnej. Wzmacnia to przypuszczenia, że obserwowane PI były specyficzne dla antygenów. Dane odnoszące się do ostatniego szczepienia TT w pierwszej grupie dawców nie były dostępne, ale ich poziom immunizacji był w sposób ewidentny bardzo zmienny.

Nie jest możliwe wybranie zalecanego białka TNFa2 lub TNFa30 jedynie w oparciu o przeciętną wielkość wartości PI. Przyczyną tego może być zróżnicowany status szczepień u testowanych osób i zmienny charakter wyników testu PBMC uzyskiwanych dla osób o zróżnicowanym statusie odpowiedzi. Jednakże było zaskakujące, że P2 i P30we wszystkich pozycjach insercji w TNFa okazały się być zdolne do ulegania obróbce i prezentacji komórkom T. Aby wykluczyć możliwość, że pomimo powtarzanej chromatografii powinowactwa, filtracji żelowej i dializy, preparaty antygenowe mogą ciągle jeszcze zawierać znaczące stężenie niespecyficznych mitogenów, przeprowadzono pewne dodatkowe doświadczenia.

Dawcy z drugiej grupy o których wiedziano, że nie wykazują odpowiedzi na P2 i generują odpowiedź na P30oraz dawcy o odwrotnym układzie odpowiedzi zostali poddani testom PBMC. Na fig. 13 odpowiedź na białka P2, P30 oraz TNFa2 i TNFa30 została zaprezentowana dla DL i ID.

Można stwierdzić, że specyficzna odpowiedź jest otrzymywana dla odpowiednich epitopów T komórkowych i odpowiednich zmodyfikowanych cząsteczek TNFa. Jednakże nie zaobserwowano znaczącej odpowiedzi u DL na białka TNFa 30 (górna część) i nie zaobserwowano znaczącej odpowiedzi proliferacyjnej u ID na białka TNFa2 (dolna część) potwierdzając, że nie było niespecyficznych mitogenów w oczyszczanych preparatach TNFa.

Możliwość ta była dodatkowo kontrolowana przy użyciu specyficznych wobec P2 i P30 linii komórek T izolowanych z drugiej grupy dawców, które były hodowane przynajmniej przez sześć tygodni w co najmniej trzech rundach stymulacji odpowiednimi syntetycznymi peptydami P2 i P30. Na fig. 14 pokazano wyniki dwóch takich doświadczeń.

Można zauważyć, że linie komórek T specyficznych wobec P2 i P30 były stymulowane jedynie przez odpowiednie białka P2 i P30. Ponadto, można także zauważyć, że wszystkie konstrukty TNFa są zdolne do indukowania wzmocnionej proliferacji komórek T, co podkreśla, że chociaż obróbka antygenu może to być ilościowo istotna dla prezentacji P2 i P30, ale nie wydaje się jednak być znaczącym czynnikiem jakościowym ograniczającym prezentację antygenu.

Wiadomo z literatury, że regiony flankujące epitopy komórek T mogą wpływać na wiązanie się peptydów antygenowych do cząsteczek MHC klasy II. Ponieważ żadna z pozycji w TNFa, która została wybrana dla insercji P2 i P30, nie okazała się być wyróżniona dla prezentacji antygenu, rozważano

PL 194 221 B1 czy różne sekwencje flankujące TNFa wstawianych epitopów mogą wpływać na odpowiedź komórek T na epitopy P2 i P30 jako efekt różnego wiązania do cząsteczek ludzkiego HLA klasy II. Dlatego zsyntetyzowano peptydy pokazane w tabeli III, reprezentujące wstawione epitopy oraz flankujące je aminokwasy z ludzkiego TNFa. Oznaczono je jakoPP2-5, PP30-3, itp. Sekwencje aminokwasowe zostały pokazane w wykazie sekwencji jako SEQ ID NR: 34 do SEQ ID NR:42 określając Pep2-1do Pep30-5

Tabel a III

Syntetyczne peptydy reprezentujące P2 i P30 i ich regiony flankujące z TNFa
2-1	SRTPSQYIKANSKFIGITELQLQWL
2-3	SQVLFQYIKANSKFIGITELISRIA
2-4	AEAKPQYIKANSKFIGITELGDRLS
2-5	EKGDRQYIKANSKFIGITELSGQVY
2-7	ND
30-1	SRTPSFNNFTVSFWLRVPKVSASHLERRANA
30-2	ALLANFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEQVLFK
30-3	YSQVLFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEVSYQT
30-4	ORETPFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEKGDRL
30-5	EKGDRFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEGIIAL

Peptydy te zostały użyte do stymulowania linii komórek T specyficznych wobec P2 i P30. Wyniki stymulacji linii P30 zostały pokazane na fig. 15. Można zauważyć, że linie komórek T specyficzne wobec P2 i P30 pochodzące od MR i KG wykazują podobny układ stymulacyjny gdy są stymulowane zarówno peptydem jak i odpowiednim białkiem TNFa. Staje się jasne, że TNF2-5 jest dobrym potencjalnym antygenem i dane te stanowią dodatkowe poparcie dla obserwacji, że proliferacje komórek T są specyficzne dla antygenu. Nie było ogólnie jakościowych różnic w wynikach stymulacji w przypadku gdy stymulowano peptydami i białkami linie komórek T specyficznych wobec P30 otrzymywane z MR i KG (dane nie pokazane). Specyficzne wobec P30 linie komórek T pochodzące od HC rozpoznawały preferencyjnie TNF30-3 i reagowały w mniejszym stopniu z TNF30-2.

Wnioski

Dyferencyjnie zmodyfikowane białka ludzkiego TNFa zostały otrzymane i scharakteryzowane. Zostały one skonstruowane w taki sposób aby zawierały dwa dobrze znane niespecyficzne epitopy komórek T P2 i P30 w celu zwiększenia ich potencjalnej immunogenności u conajmniej 85% populacji.

Wszystkie białka mogą być ekspresjonowane i oczyszczane, chociaż TNF2-4 i TNF30-4 uzyskiwano na niskim poziomie. Mutacje w tej pozycji w TNFazdają się także wpływać na zwijanie się białka co skutkuje słabą rozpuszczalnością białek. Nie wykryto aktywności biologicznej TNFaw żadnej z modyfikowanych cząsteczek TNFa.

Immunizowano króliki za pomocą wszystkich białek oraz natywnego TNFa. Po 2-3 miesiącach immunizacji możliwe było wykrycie we wszystkich surowicach wysokiego miana przeciwciał wysoce reaktywnych w stosunku do ludzkiego, nie modyfikowanego TNFa.

Zdolność tych przeciwciał do wpływania na biologiczną aktywność natywnego TNFa była testowana w dwóch różnych testach - oznaczeniu biologicznym L929 i teście wiązania receptora w fazie stałej. Obydwa testy wykazały, że zasadniczo takie same TNF2-1, TNF2-4, TNF30-1 i TNF30-4 nie były zdolne do znaczącego indukowania przeciwciał neutralizujących, natomiast TNF2-5 był najsilniejszy w porównaniu z innymi konstruktami. TNF30-2 i TNF30-3 były porównywalnie zdolne do indukowania przeciwciał neutralizujących i były dwukrotnie lepsze od TNF30-5, który był wystarczająco dobry.

PL 194 221 B1

Nieco zaskakująca była niemożność określenia istotnych różnic między zdolnością cząsteczek do stymulowania proliferacji PBMC. Można było wykazać, że nie było to przyczyną obecności mitogenów w preparatach antygenowych i w oparciu o te dane stwierdzono, że wszystkie pozycje wybrane dla P2 i P30 umożliwiają prezentowanie tych epitopów. Specyficzność odpowiedzi została udokumentowana ponadto za pomocą testowania zmodyfikowanych białek TNFa za pomocą specyficznych wobec epitopów linii komórek T oraz syntetycznych peptydów reprezentujących wstawione epitopy oraz sekwencje flankujące z TNFa. Doświadczenia te jasno wykazały, że TNF2-5, TNF30-2 i TNF30-3 (wśród innych konstruktów) były najsilniejszymi potencjalnymi immunogenami.

PL 194 221 B1

Lista sekwencji ilJ Informacje ogólne:

(i) Zgłaszający:

(A) Nazwa: PHARMEXA Α/Ξ (B) Ulica: Kogle Alle 6 (C) Miasto: Harsholm (E) Państwo: Dania (F) Kod pocztowy (ZIP): DK-2970 (ii) Tytuł wynalazku: Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFa, dimery, oligomery lub multimery zmodyfikowanej cząsteczki ludzkiego TNFa, wyizolowana cząsteczka DNA, wektor, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, sposób wytwarzania zmodyfikowanej cząsteczki ludzkiego TNFa, szczepionki przeciwko TNFa oraz zastosowanie przynajmniej jednej zmodyfikowanej cząsteczki TNFa (iii) Liczba sekwencji: 42 (iv) Postać do odczytu komputerowego:

(A) Typ Nośnika: dyskietka (3) Komputer: IBM PC kompatybilny (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reiease #1.0, Version #1.30 (EPO) (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR:1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 477 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LINIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSONNA: NIE (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo sapiens (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) UMIEJSCOWIENIE:1..477 (C) METODA IDENTYFIKACJI: eksperymentalna (D) INNE INFORMACJE:/kodon_startu= 1 /funkcja= Antygen /produkt= Analog TNF-alfa /dowód- Eksperymentalny /gen= tnfP2-l /nazwa_standardowa= TNF2-1

(xi)

OPI

S SEKWENCJI:

: SEQ ID

NR:

1:

ATG

GTC

AGA

TCA

TCT

TCT

CGA

ACC

CCG

AGT

CAG

TAC

ATT

AAA

GCC

AAT

48 Met 1 u.

Val

Arg

Ser

Ser 5

Ser

Arg

Thr

Pro

Ser 10

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala 15

Asn

TCT

AAA

TTC

ATC

GGT

ATA

ACT

GAG

CTG

CAG

CTC

CAG

TGG

CTG

AAC

CGC

96 Ser

Lys

Phe

Ile 20

Gly

Ile

Thr

Glu

Leu 25

Gin

Leu

Gin

Trp

Leu 30

Asn

Arg

CGG

GCC

AAT

GCC

CTC

CTG

GCC

AAT

GGC

GTG

GAG

CTG

AGA

GAT

AAC

CAG

144 Arg

Ala

Asn 35

Ala

Leu

Leu

Ala

Asn 40

Gly

Val

Glu

Leu

Arg 45

Asp

Asn

Gin

PL 194 221 B1

CTG 192

GTG

GTG

CCA

TCA

GAG

GGC

CTG

TAC

CTC

ATC

TAC

TCC

CAG

GTC

CTC

Leu.

Val 50

Val

Pro

Ser

Glu

Gly 55

Leu

Tyr

Leu

He

Tyr 60

Ser

Gin

val

Leu

TTC 240

AAG

GGC

CAA

GGC

TGC

CCC

TCC

ACC

CAT

GTG

CTC

CTC

ACC

CAC

ACC

Phe 65

Lys

Gly

Gin

Gly

Cys 70

Pro

Ser

Thr

His

Val 75

Leu

Leu

Thr

His

Thr 80

ATC 288

AGC

CGC

ATC

GCC

GTC

TCC

TAC

CAG

ACC

AAG

GTC

AAC

CTC

CTC

TCT

Ile

Ser

Arg

Ile

Ala 85

Val

Ser

Tyr

Gin

Thr 90

Lys

Val

Asn

Leu

Leu 95

Ser

GCC 336

ATC

AAG

AGC

CCC

TGC

CAG

AGG

GAG

ACC

CCA

GAG

GGG

GCT

GAG

GCC

Ala

Ile

Lys

Ser 100

Pro

Cys·

Gin

Arg

Glu 105

Thr

Pro

Glu

Gly

Ala 110

Glu

Ala

AAG 384

CCC

TGG

TAT

GAG

CCC

ATC

TAT

CTG

GGA

GGG

GTC

TTC

CAG

CTG

GAG

Lys

Pro

Trp 115

Tyr

Glu

Pro

Ile

Tyr 120

Leu

Gly

Gly

Val

Phe 125

Gin

Leu

Glu

AAG 432

GGT

GAC

CGA

CTC

AGC

GCT

GAG

ATC

AAT

CGG

CCC

GAC

TAT

CTC

GAC

Lys

Gly 130

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala 135

Glu

Ile

Asn

Arg

Pro 140

Asp

Tyr

Leu

Asp

TTT 477

GCC

GAG

TCT

GGG

CAG

GTC

TAC

TTT

GGG

ATC

ATT

GCC

CTC

TAG

Phe 145

Ala

Glu

Ser

Gly

Gin 150

Val

Tyr

Phe

Gly

Ile 155

Ile

Ala

Leu

Ar

(2)	INFORMACJE DOTYCZĄCE	; SEQ	ID NR:2:
	(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
	(A) DŁUGOŚĆ: 1	59 aminokwasów
	(B) TYP: aminokwas
	(D) TOPOLOGIA:	liniowa
	(ii) TYP CZĄSTECZKI:	białko
	(xi) OPIS SEKWENCJI:	SEQ	ID NR: 2:
Met	Val Arg Ser Ser Ser	Arg	Thr Pro Ser Gin Tyr Ile Lys Ala Asn
1	5		10 15
Ser	Lys Phe Ile Gly Ile	Thr	Glu Leu Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg
	20		25 30
Arg	Ala Asn Ala Leu Leu	Ala	Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin
	35		40 45
Leu	Val Val Pro Ser Glu	Gly	Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Val Leu
	50	55	60
Phe	Lys Gly Gin Gly Cys	Pro	Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr
65	70		75 80

PL 194 221 B1

Ile

Ser

Arg

Ile

Ala 85

Val

Ser

Tyr

Gin

Thr 90

Lys

Val

Asn

Leu

Leu 95

Ser

Ala

Ile

Lys

Ser 100

Pro

Cys

Gin

Arg

Glu 105

Thr

Pro

Glu

Gly

Ala 110

Glu

Ala

Lys

Pro

Trp 115

Tyr

Glu

Pro

Ile

Tyr 120

Leu

Gly

Gly

Val

Phe 125

Gin

Leu

Glu

Lys

Gly 130

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala 135

Glu

Ile

Asn

Arg

Pro 140

Asp

Tyr

Leu

Asp

Phe

Ala

Glu

Ser

Gly

Gin

Val

Tyr

Phe

Gly

Ile

Ile

Ala

Leu

k

145 150 155 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR:3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 477 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LINIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo sapiens (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) UMIEJSCOWIENIE:I..477 (D) INNE INFORMACJE:/kodon_startu= 1 /funkcja= Antygen . /produkt= Analog TNF-alfa /gen= tnfP2-3 /nazwa standardowa= TNF2-3

	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	SEC	> ID	NR:	3:
ATG	GTC	AGA TCA TCT TCT	CGA	ACC	CCG	AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT
48
Met	Val	Arg Ser Ser Ser	Arg	Thr	Pro	Ser Asp Lys Pro Val Ala His
160		165				170 175
GTT	GTA	GCA AAC CCT CAA	GCT	GAG	GGG	CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC
96
Val	Val	Ala Asn Pro Gin	Ala	Glu	Gly	Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg
		180				185 190
CGG	GCC	AAT GCC CTC CTG	GCC	AAT	GGC	GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG
144
Arg	Ala	Asn Ala Leu Leu	Ala	Asn	Gly	Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin
		195			200	205

PL 194 221 B1

CTG 192

GTG

GTG

CCA

TCA

GAG

GGC

CTG

TAC

CTC

ATC

TAC

TCC

CAG

GTC

CTC

Leu

Val

Val 210

Pro

Ser

Glu

Gly

Leu 215

Tyr

Leu

Ile

Tyr

Ser 220

Gin

Val

Leu

TTC 240

CAG

TAC

ATA

AAG

GCC

AAC

TCC

AAG

TTT

ATC

GGC

ATC

ACC

GAG

CTC

Phe

Gin 225

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn 230

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly 235

Ile

Thr

Glu

Leu

ATC 288

AGC

CGC

ATC

GCC

GTC

TCC

TAC

CAG

ACC

AAG

GTC

AAC

CTC

CTC

TCT

lie 240

Ser

Arg

Ile

Ala

Val 245

Ser

Tyr

Gin

Thr

Lys 250

Val

Asn

Leu

Leu

Ser 255

GCC 336

ATC

AAG

AGC

CCC

TGC

CAG

AGG

GAG

ACC

CCA

GAG

GGG

GCT

GAG

GCC

Ala

Ile

Lys

Ser

Pro 260

Cys

Gin

Arg

Glu

Thr 265

Pro

Glu

Gly

Ala

Glu 270

Ala

AAG 384

CCC

TGG

TAT

GAG

CCC

ATC

TAT

CTG

GGA

GGG

GTC

TTC

CAG

CTG

GAG

Lys

Pro

Trp

Tyr 275

Glu

Pro

Ile

Tyr

Leu 280

Gly

Gly

Val

Phe

Gin 285

Leu

Glu

AAG 432

GGT

GAC

CGA

CTC

AGC

GCT

GAG

ATC

AAT

CGG

CCC

GAC

TAT

CTC

GAC

Lys

Gly

Asp 290

Arg

Leu

Ser

Ala

Glu 295

Ile

Asn

Arg

Pro

Asp 300

Tyr

Leu

Aso

TTT 477

GCC

GAG

TCT

GGG

CAG

GTC

TAC

TTT

GGG

ATC

ATT

GCC

CTC

TAG

Phe

Ala 305

Glu

Ser

Gly

Gin

Vai 310

Tyr

Phe

C-ly

Ile

Ile 315

Ala

Leu

7t

(2)	INFORMACJE 1	DOTYCZĄCE SEQ	ID NR: 4 :
(xi)	(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 159 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR: 4:
Met 1	Val Arg Ser	Ser Ser Arg 5	Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His 10 15
Val	Val Ala Asn 20	Pro Gin Ala	Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg 25 30
Arg	Ala Asn Ala 35	Leu Leu Ala	Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin 40 4 5
Leu	Val Val Pro 50	Ser Glu Gly 55	Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Val Leu 60
Phe 65	Gin Tyr Ile	Lys Ala Asn 70	Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 75 80

PL 194 221 B1

Ile

Ser

Arg

Ile

Ala 85

Val

Ser

Tyr

Gin

Thr 90

Lys

Val

Asn

Leu

Leu 95

Ser

Ala

Ile

Lys

Ser

Pro

Cys

Gin

Arg

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly

Ala

Glu

Ala

100

105

110

Lys

Pro

Trp

Tyr

Glu

Pro

Ile

Tyr

Leu

Gly

Gly

Val

Phe

Gin

Leu

Glu

115

120

125

Lys

Gly

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala

Glu

Ile

Asn

Arg

Pro

Asp

Tyr

Leu

Asp

130

135

140

Phe

Ala

Glu

Ser

Gly

Gin

Val

Tyr

Phe

Gly

Ile

Ile

Ala

Leu

-A-

145

150

155

(2)

INFORMACJE

DOTY!

OZĄCE SEQ ID

NR:

5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI

	(A) DŁUGOŚĆ: (B) TYP: kwas CC) LINIOWOŚĆ (D) TOPOLOGIA	477 par zasad nukleinowy : podwójna : liniowa
(ii)	TYP CZĄSTECZKI	: DNA (genomowe)
iii)	HIPOTETYCZNA:	NIE
(iv)	ANTY-SENSOWNA:	NIE
(vi)	ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo sapiens (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) UMIEJSCOWIENIE:1..477 (D) INNE INFORMACJE:/kodon_startu= 1 . /funkcja= Antygen /produkt^ Analog TNF-alfa /gen= tnfP2-4 /nazwa standardowo- TNF2-4

	(xi)	OPIS SEKWENCJI;	; SEC	> ID	NR:	5:
ATG	GTC	AGA TCA TCT TCT	CGA	ACC	CCG	AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT
48
Met	Val	Arg Ser Ser Ser	Arg	Thr	Pro	Ser Asp Lys Pro Val Ala His
160		165				170 175
GTT	GTA	GCA AAC CCT CAA	GCT	GAG	GGG	CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC
96
Val	Val	Ala Asn Pro Gin	Ala	Glu	Gly	Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg
		180				185 190
CGG	GCC	AAT GCC CTC CTG	GCC	AAT	GGC	GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG
144
Arg	Ala	Asn Ala Leu Leu	Ala	Asn	Gly	Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin
		195			200	205

PL 194 221 B1

CTG 192

GTG

GTG

CCA

TCA

GAG

GGC

CTG

TAC

CTC

ATC

TAC

TCC

CAG

GTC

CTC

Leu

Val

Val 210

Pro

Ser

Glu

Gly

Leu 215

Tyr

Leu

Ile

Tyr

Ser 220

Gin

Val

Leu

TTC 240

AAG

GGC

CAA

GGC

TGC

CCC

TCC

ACC

CAT

GTG

CTC

CTC

ACC

CAC

AC u

Phe

Lys 225

Gly

Gin

Gly

Cys

Pro 230

Ser

Thr

His

Val

Leu 235

Leu

Thr

His

Thr

ATC 288

AGC

CGC

ATC

GCC

GTC

TCC

TAC

CAG

ACC

AAG

GTC

AAC

CTC

CTC

TCT

Ile 240

Ser

Arg

Ile

Ala

Val 245

Ser

Tyr

Gin

Thr

Lys 250

Vai

Asn

Leu

Leu

Ser 255

GCC 336

ATC

AAG

AGC

CCC

TGC

CAG

AGG

GAG

ACC

CCA

GAG

GGG

GCT

GAG

GCC

Ala

Ile

Lys

Ser

Pro 260

Cys

Gin

Arg

Glu

Thr 265

Pro

Glu

Gly

Ala

Glu 270

Ala

AAG 384

CCC

CAG

TAT

ATC

AAG

GCC

AAT

TCG

AAA

TTC

ATC

GGC

ATC

ACG

GAG

Lys

Pro

Gin

Tyr 275

Ile

Lys

Ala

Asn

Ser 280

Lys

Phe

Ile

Gly

Ile 285

Thr

Glu

CTC 432

GGT

GAC

CGA

CTC

AGC

GCT

GAG

ATC

AAT

CGG

CCC

GAC

TAT

CTC

GAC

Leu

Gly

Asp 290

Arg

Leu

Ser

Ala

Glu 295

Ile

Asn

Arg

Pro

Asp 300

Tyr

Leu

Asp

TTT 477

GCC

GAG

TCT

GGG

CAG

GTC

TAC

TTT

GGG

ATC

ATT

GCC

CTC

TAG

Phe

Al a 305

Glu

Ser

Gly

Gin

Val 310

Tyr

Phe

Gly

Ile

Tle 315

Ala

Leu

•k

(2)	INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR:	6 :
	(i)	CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
		(A) DŁUGOŚĆ: 159 aminokwasów
		(B) TYP: aminokwas
		(D) TOPOLOGIA: liniowa
	(ii)	TYP CZĄSTECZKI: białko
	(xi)	OPIS SEKWENCJI; SEQ ID	NR:	6:
Met	Val	Arg Ser Ser Ser Arg Thr	Pro	Ser	Asp	Lys	Pro	Val	Ala	His
1		5		10					15
Val	Val	Ala Asn Pro Gin Ala Glu	Gly	Gin	Leu	Gin	Trp	Leu	Asn	Arg
		20	25					30
Arg	Ala	Asn Ala Leu Leu Aia Asn	Gly	Val	Glu	Leu	Arg	Asp	Asn	Gin
		35 40					45
Leu	Val	Val Pro Ser Glu Gly Leu	Tyr	Leu	Ile	Tyr	Ser	Gin	Val	Leu
	50	55				60
Phe	Lys	Gly Gin Gly Cys Pro Ser	Thr	His	Val	Leu	Leu	Thr	His	Thr
65		70			7 5					80

PL 194 221 B1

Ile

Ser

Arg

Ile

Ala 85

Val

Ser

Tyr

Gin

Thr 90

Lys

Val

Asn

Leu

Leu 95

Ser

Ala

Ile

Lys

Ser 100

Pro

Cys

Gin

Arg

Glu 105

Thr

Pro

Glu

Gly

Ala lic

Glu

Ala

Lys

Pro

Gin 115

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn 120

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly 125

ile

Thr

Glu

Leu

Gly 130

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala 135

Glu

Ile

Asn

Arg

Pro 140

Asp

Tyr

Leu

Asp

Phe

Ala

Glu

Ser

Gly

Gin

Val

Tyr

Phe

Gly

Ile

Ile

Ala

Leu

k

145 150 155 (2J INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR:7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

JA) DŁUGOŚĆ: 477 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy

CC) LINIOWOŚĆ: podwójna

CD) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo sapiens (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) UMIEJSCOWIENIE;1..477 (D) INNE INFORMACJE:/funkcja= Antygen /produkt= Analog TNF-alfa /gen= tnfP2-5 /nazwa startdardowa= TNF2-5”

	(xi)	OPIS SEKWENCJI;	; SEt	2 ID	NR;	7 :
ATG	GTC	AGA TCA TCT TCT	CGA	ACC	CCG	AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT
48
Met	Val	Arg Ser Ser Ser	Arg	Thr	Pro	Ser Asp Lys Pro Val Ala His
ISO		165				170 175
GTT	GTA	GCA AAC CCT CAA	GCT	GAG	GGG	CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC
96
Val	Val	Ala Asn Pro Gin	Ala	Glu	Gly	Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg
		180				185 190
CGG	GCC	AAT GCC CTC CTG	GCC	AAT	GGC	GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG
144
Arg	Ala	Asn Ala Leu Leu	Ala	Asn	Gly	Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin
		195			200	205
CTG	GTG	GTG CCA TCA GAG	GGC	CTG	TAC	CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC
192
Leu	Val	Val Pro Ser Glu	Gly	Leu	Tyr	Leu Ile Tyr Ser Gin Val Leu

PL 194 221 B1

210

215

220

TTC

AAG

GGC

CAA

GGC

TGC

CCC

TCC

ACC

CAT

GTG

CTC

CTC

ACC

CAC

ACC

240

Phe

Lys

Gly

Gin

Gly

Cys

Pro

Ser

Thr

His

Val

Leu

Leu

Thr

His

Thr

225

230

235

ATC

AGC

CGC

ATC

GCC

GTC

TCC

TAC

CAG

ACC

AAG

GTC

AAC

CTC

CTC

TCT

288

Ile

Ser

Arg

Ile

Ala

Val

Ser

Tyr

Gin

Thr

Lys

Val

Asn

Leu

Leu

Ser

240

245

250

255

GCC

ATC

AAG

AGC

CCC

TGC

CAG

AGG

GAG

ACC

CCA

GAG

GGG

GCT

GAG

GCC

336

Ala

Ile

Lys

Ser

Pro

Cys

Gin

Arg

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly

Ala

Glu

Ala

260

265

270

AAG

CCC

TGG

TAT

GAG

CCC

ATC

TAT

CTG

GGA

GGG

GTC

TTC

CAG

CTG

GAG

384

Lys

Pro

Trp

Tyr

Glu

Pro

Ile

Tyr

Leu

Gly

Gly

Val

Phe

Gin

Leu

Glu

275

230

285

AAG

GGT

GAC

CGA

CAG

TAC

ATT

AAG

GCC

AAT

TCG

AAG

TTC

ATT

GGC

ATC

4 32

Lys

Gly

Asp

Arg

Gin

Tyr

Ile

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile

Gly

Ile

290

295

300

ACT

GAG

CTG

TCT

GGG

CAG

GTC

TAC

TTT

GGG

ATC

ATT

GCC

CTC

TAG

477

Thr

Glu.

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Tyr

Phe

Gly

Ile

Ile

Ala

Leu

★

305

310

315

(2)	INFORMACJE DOTYCZĄCE SEC	> ID	NR: 3	i :
	(i!	l CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
		(A) DŁUGOŚĆ: 159 aminokwasów
		(B) TYP: aminokwas
		(D) TOPOLOGIA: liniowa
	(ii)	i TYP CZĄSTECZKI: białko
(xi)	1 OPIS SEKWENCJI: SEQ ID	NR:	8:
Met	Val	Arg Ser Ser Ser Arg	Thr	Pro	Ser	Asp	Lys	Pro	Val	Ala	His
1		5			10					15
Val	Val	Ala Asn Pro Gin Ala	Glu	Gly	Gin	Leu	Gin	Trp	Leu	Asn	Arg
		20		25					30
Arg	Ala	Asn Ala Leu Leu Ala	Asn	Gly	Val	Glu	Leu	Arg	Asp	Asn	Gin
		35	4 0					45
Leu	Val	Val Pro Ser Glu Gly	Leu	Tyr	Leu	Ile	Tyr	Ser	Gin	Val	Leu
	50	55					60
Phe	Lys	Gly Gin Gly Cys Pro	Ser	Thr	His	Val	Leu	Leu	Thr	His	Thr
65		70				75					80
Ile	Ser	Arg Ile Ala Val Ser	Tyr	Gin	Thr	Lys	Val	Asn	Leu	Leu	Ser
		85			90					95

PL 194 221 B1

Alą Lys Lys Thr 145

Ile Pro Gly 130 Glu

Lys Trp 115 Asp Leu

Ser 100 Tyr Arg Ser

Pro Glu Gin Gly

Cys Pro Tyr Gin 150

Gin Arg

Glu 105 Leu Ala Phe

Thr Gly Asn Gly

Pro Gly Ser Ile 155

Glu Val Lys 140 Ile

Gly Ala

Glu Ala

Phe 125 Phe Ala

110 Gin Ile Leu

Ile Ile 135 Val

Tyr 120 Lys Tyr

Leu Gly

Glu Ile

(2)

INFORMACJE DOTYCZĄCE SBC

1 ID

NR: 9

(i)

CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 477 par zasad

(E

i) TYP: :

kwas

nukleinowy

(C) LINIOWOŚĆ

: podwójna

(D) TOPOLOGIA

: liniowa

(ii)

TYP

! CZĄSTECZKI

: DNA

. igenomowe)

1

! iii}

HIPOTETYCZNA: NIE

(iv)

ANTY-SENSOWNA:

NIE

<vi)

ŹRÓDŁO

POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM:

Home

' sapiens

(ix)

CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS

(B) UMIEJSCOWIENIE

Ol. .

477

(D) INNE

INFORMACJE:/kodon

i startu:

= 1

/funkcja=

Antygen

/produkt^ ”

Analog TNF-alfa

II

/9'

tnfP2-7

/nazwa

standardowa=

= TNF2-

7

(xi)

OPIS SEKWENCJI

: SEC

! ID

NR:

9:

ATG

GTC

AGA

TCA

TCT

TCT

CGA

ACC

CCG

AGT

GAC

AAG

CCT

GTA

GCC

CAT

48

Met

Val

Arg

Ser

Ser

Ser

Arg

Thr

Pro

Ser

Asp

Lys

Pro

Val

Ala

His

160

165

170

175

GTT

GTA

GCA

AAC

CCT

CAA

GCT

GAG

GGG

CAG

CTC

CAG

TGG

CTG

AAC

CGC

96

Val

Val

Ala

Asn

Pro

Gin

Ala

Glu

Gly

Gin

Leu

Gin

Trp

Leu

Asn

Arg

180

185

190

CGG

GCC

AAT

GCC

CTC

CTG

GCC

AAT

GGC

GTG

GAG

CTG

AGA

GAT

AAC

CAG

144

Arg

Ala

Asn

Ala

Leu

Leu

Ala

Asn

Gly

Val

Glu

Leu

Arg

ASp

Asn

Gin

195

200

2 05

CTG

GTG

GTG

CCA

TCA

GAG

GGC

CTG

TAC

CTC

ATC

TAC

TCC

CAG

GTC

CTC

192

Leu

Val

Val

Pro

Ser

Glu

Gly

Leu

Tyr

Leu

Ile

Tyr

Ser

Gin

Val

Leu

210

215

220

PL 194 221 B1

TTC 240

AAG

GGC

CAA

GGC

TGC

CCC

TCC

ACC

CAT

GTG

CTC

CAG

TAC

ATC

AAA

Phe

Lys 225

Gly

Gin

Gly

Cys

Pro 230

Ser

Thr

His

Val

Leu 235

Gin

Tyr

Ile

Lys

GCT 289

AAC

TCC

AAA

TTC

ATC

GGC

ATC

ACC

GAA

CTG

GTT

AAC

CTC

CTC

TCT

Ala 240

Asn

Ser

Lys

Phe

Ile 245

Gly

Ile

Thr

Glu

Leu 250

Val

Asn

Leu

Leu

Ser 255

GCC 336

ATC

AAG

AGC

CCC

TGC

CAG

AGG

GAG

ACC

CCA

GAG

GGG

GCT

GAG

GCC

Ala

Ile

Lys

Ser

Pro 260

Cys

Gin

Arg

Glu

Thr 265

Pro

Glu

Gly

Ala

Glu 270

Ala

AAG 394

CCC

TGG

TAT

GAG

CCC

ATC

TAT

CTG

GGA

GGG

GTC

TTC

CAG

CTG

GAG

Lys

Pro

Trp

Tyr 275

Glu

Pro

Ile

Tyr

Leu 280

Gly

Gly

Val

Phe

Gin 285

Leu

Glu

AAG 432

GGT

GAC

CGA

CTC

AGC

GCT

GAG

ATC

AAT

CGG

CCC

GAC

TAT

CTC

GAC

Lys

Gly

Asp 290

Arg

Leu

Ser

Ala

Glu 295

Ile

Asn

Arg

Pro

Asp 300

Tyr

Leu

Asp

TTT 477

GCC

GAG

TCT

GGG

CAG

GTC

TAC

TTT

GGG

ATC

ATT

GCC

CTC

TAG

Phe

Ala 305

Glu

Ser

Gly

Gin

Val 310

Tyr

Phe

Gly

Ile

Ile 315

Ala

Leu

A

(2)	INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR:10:
		(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI
		(A) DŁUGOŚĆ: .	159 aminokwasów
		(3) TYP: aminokwas
		(D) TOPOLOGIA	: liniowa
	(ii!	TYP CZĄSTECZKI	: białko
	<xi I	1 OPIS SEKWENCJI	: SEQ ID	NR:	10:
Met	Val	Arg Ser Ser Ser	Arg Thr	Pro	Ser	Asp	Lys	Pro	Val	Ala	His
1		5			10					15
Val	Val	Ala Asn Pro Gin	Ala Glu	Gly	Gin	Leu	Gin	Trp	Leu	Asn	Arg
		20		25					30
Arg	Ala	Asn Ala Leu Leu	Ala Asn	Gly	Val	Glu	Leu	Arg	Asp	Asn	Gin
		35	40					45
Leu	Val	Val Pro Ser Glu	Gly Leu	Tyr	Leu	Ile	Tyr	Ser	Gin	Val	Leu
	50		55				60
Phe	Lys	Gly Gin Gly Cys	Prc Ser	Thr	His	Val	Leu	Gin	Tyr	Ile	Lys
65		70				75					80
Ala	Asn	Ser Lys Phe Ile	Gly Ile	Thr	Glu	Leu	Val	Asn	Leu	Leu	Ser
		85			90					95

PL 194 221 B1

Ala

Ile

Lys

Ser 100

Pro

Cys

Gin

Arg

Glu 105

Thr

Pro

Glu

Gly

Ala 110

Glu

Ala

Lys

Pro

Trp 115

Tyr

Glu

Pro

I le

Tyr 120

Leu

Gly

Gly

Val

Phe 125

Gin

Leu

Glu

Lys

Gly 130

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala 135

Glu

Ile

Asn

Arg

Pro 140

Asp

Tyr

Leu

Asp

Phe

Ala

Glu

Ser

Gly

Gin

Val

Tyr

Phe

Gly

Ile

Ile

Ala

Leu

-a

145 150 155 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR:11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)	DŁUGOŚĆ;	477 par zasad
	(B)	TYP: kwas	nukleinowy
	(C)	LINIOWOŚĆ	: podwójna
	(D)	TOPOLOGIA	: liniowa
(ii)	TYP	CZĄSTECZKI	: DNA Igenomowe)
(iii)	HIPOTETYCZNA:	NIE
;iv)	ANTY	-SENSOWNA:	NIE
(vi)	ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo sapiens (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) UMIEJSCOWIENIE:1..477 (D) INNE INFORMACJE:/kodon_startu= 1 /funkcja= Antygen /produkt= Analog TNF-alfa /gen= tnfP30-l /nazwa standardowa= TNF30-1

ATG 48 Met 160

(xi! GTC Val

1 OPIS SEKWENCJI

: SEQ ID NR:

11:

AAC Asn

AAT Asn

TTT Phe

ACC Thr

GTA Val 175

AGA TCA

TCT Ser

TCT Ser 165

CGA ACC

CCG Pro

AGT Ser

TTC Phe 170

Arg

Ser

Arg

Thr

AGC

TTT

TGG

CTC

CGT

GTA

CCT

AAG

GTG

TCG

GCC

TCG

CAC

CTG

GAG

CGC

96

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

Pro

Lys

Val

Ser

Ala

Ser

His

Leu

Glu

Arg

180

185

190

CGG

GCC

AAT

GCC

CTC

CTG

GCC

AAT

GGC

GTG

GAG

CTG

AGA

GAT

AAC

CAG

144

Arg

Ala

Asn

Ala

Leu

Leu

Ala

Asn

Gly

Val

Glu

Leu

Arg

Asp

Asn

Gin

195

200

205

CTG

GTG

GTG

CCA

TCA

GAG

GGC

CTG

TAC

CTC

ATC

TAC

TCC

CAG

GTC

CTC

192

Leu

Val

Val

Pro

Ser

Glu

Gly

Leu

Tyr

Leu

Ile

Tyr

Ser

Gin

Val

Leu

210

215

220

PL 194 221 B1

TTC 240

AAG

GGC

CAA

GGC

TGC

CCC

TCC

ACC

CAT

GTG

CTC

CTC

ACC

CAC

ACC

Phe

Lys 225

dy

Gin

Gly

Cys

Pro 230

Ser

Thr

His

Val

Leu 235

Leu

Thr

His

Thr

ATC 288

AGC

CGC

ATC

GCC

GTC

TCC

TAC

CAG

ACC

AAG

GTC

AAC

CTC

CTC

TCT

Ile 240

Ser

Arg

Ile

Ala

Val 245

Ser

Tyr

Gin

Thr

Lys 250

Val

Asn

Leu

Leu

Ser 255

GCC 336

ATC

AAG

AGC

CCC

TGC

CAG

AGG

GAG

ACC

CCA

GAG

GGG

GCT

GAG

GCC

Ala

Ile

Lys

Ser

Pro 260

Cys

Gin

Arg

Glu

Thr 265

Pro

Glu

Gly

Ala

Glu 270

Ala

AAG 384

CCC

TGG

TAT

GAG

CCC

ATC

TAT

CTG

GGA

GGG

GTC

TTC

CAG

CTG

GAG

Lys

Pro

Trp

Tyr 275

Glu

Pro

Ile

Tyr

Leu 280

Gly

Gly

Val

Phe

Gin 285

Leu

Glu

ALG 432

GGT

GAC

CGA

CTC

AGC

GCT

GAG

ATC

AAT

CGG

CCC

GAC

TAT

CTC

GAC

Lys

Gly

Asp 2 90

Arg

Leu

Ser

Ala

Glu 295

Ile

Asn

Arg

Pro

Asp 300

Tyr

Leu

Asp

TTT 477

GCC

GAG

TCT

GGG

CAG

GTC

TAC

TTT

GGG

ATC

ATT

GCC

CTC

TAG

Phe

Ala 305

Glu

Ser

Gly

Gin

Val 310

Tyr

Phe

Gly

Ile

Ile 315

Ala

Leu

(2)	INFORMACJE	DOTYCZĄCE SEQ ID	NR:12:
	(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
	(A) DŁUGOŚĆ: 159 aminokwasów
	(B) TYP: aminokwas
	(D) TOPOLOGIA: liniowa
	(ii) TYP CZĄSTECZKI: białko
	(xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID	NR: 12:
Met	Val Arg Ser	Ser Ser Arg Thr	Pro Ser Phe Asn Asn Phe Thr Val
1		5	10 15
Ser	Phe Trp Leu	Arg Val Pro Lys	Val Ser Ala Ser His Leu Glu Arg
	20		25 30
Arg	Ala Asn Ala	Leu Leu Ala Asn	Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin
	35	40	45
Leu	Val Val Pro	Ser Glu Gly Leu	Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Val Leu
	50	55	60
Phe	Lys Gly Gin	Gly Cys Pro Ser	Thr His Val Leu Leu Thr His Thr
65		70	75 80
Ile	Ser Arg Ile	Ala Val Ser Tyr	Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser
		85	90 95
Ala	Ile Lys Ser	Pro Cys Gin Arg	Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala

PL 194 221 B1

100

105

110

Lys

Pro

Trp

Tyr

Glu

Pro

Ile

Tyr

Leu

Gly

Gly

Val

Phe

Gin

Leu

Glu

115

120

125

Lys

Gly

ASP

Arg

Leu

Ser

Ala

Glu

Ile

Asn

Arg

Pro

Asp

Tyr

Leu

Asp

130

135

140

Phe

Ala

Glu

Ser

Gly

Gin

Val

Tyr

Phe

Gly

Ile

Ile

Ala

Leu

dtr

145 150 155 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR: 13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(ii )	(A) (S) CC) (Dl TYP	DŁUGOŚĆ: 477 par zasad TYP: kwas nukleinowy
LINIOWOŚĆ TOPOLOGIA CZĄSTECZKI	: podwójna : liniowa : DNA (genomowe)
(iii >	HIPOTETYCZNA:	NIE
(IV)	ANTY	-SENSOWNA:	NIE
(vi )	ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo sapiens (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) UMIEJSCOWIENIE:1..477

CD) INNE INFORMACJE:/kodon_startu= 1 /funkcja= Antygen /produkt= Analog TNF-alfa” /gen= rnfP30-2 /nazwa standardowa= TNF30-2

(xi)

i OPIS SEKWENCJI:

; SEQ ID

NR:

13:

ATG

GTC

AGA

TCA

TCT

TCT

CGA

ACC

CCG

AGT

GAC

AAG

CCT

GTA

GCC

CAT

48

Met

Val

Arg

Ser

Ser

Ser

Arg

Thr

Pro

Ser

Asp

Lys

Pro

Val

Ala

His

160

165

170

175

GTT

GTA

GCA

AAC

CCT

CAA

GCT

GAG

GGG

CAG

CTC

CAG

TGG

CTG

AAC

CGC

96

Val

Val

Ala

Asn

Pro

Gin

Ala

Glu

Gly

Gin

Leu

Gin

Trp

Leu

Asn

Arg

180

185

190

CGG

GCC

AAT

GCC

CTC

CTG

GCC

AAT

TTC

AAC

AAC

TTC

ACA

GTT

AGC

TTC

144

Arg

Ala

Asn

Ala

Leu

Leu

Ala

Asn.

Phe

Asn

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

195

200

205

TGG

TTG

AGG

GTA

CCA

AAG

GTC

TCG

GCC

AGC

CAC

CTC

GAG

CAG

GTC

CTC

192

Trp

Leu

Arg

Val

Pro

Lys

Val

Ser

Ala

Ser

His

Leu

Glu

Gin

Val

Leu

210

215

220

TTC

AAG

GGC

CAA

GGC

TGC

CCC

TCC

ACC

CAT

GTG

CTC

CTC

ACC

CAC

ACC

240

PL 194 221 B1

Phe

Lys 225

Gly

Gin

Gly

Cy3

Pro 230

Ser

Thr

His

Val

Leu 235

Leu

Thr

His

Thr

ATC

AGC

CGC

ATC

GCC

GTC

TCC

TAC

CAG

ACC

AAG

GTC

AAC

CTC

CTC

TCT

28S

Ile

Ser

Arg

Ile

Ala

Val

Ser

Tyr

Gin

Thr

Lys

Val

Asn

Leu

Leu

Ser

240

245

250

255

GCC

ATC

AAG

AGC

CCC

TGC

CAG

AGG

GAG

ACC

CCA

GAG

GGG

GCT

GAG

GCC

336

Ala

Ile

Lys

Ser

Pro

Cys

Gin

Arg

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly

Ala

Glu

Ala

260

2 65

270

AAG

CCC

TGG

TAT

GAG

CCC

ATC

TAT

CTG

GGA

GGG

GTC

TTC

CAG

CTG

GAG

384

Lys

Pro

Trp

Tyr

Glu

Pro

Ile

Tyr

Leu

Gly

Gly

Val

Phe

Gin

Leu

Glu

275

280

285

AAG

GGT

GAC

CGA

CTC

AGC

GCT

GAG

ATC

AAT

CGG

CCC

GAC

TAT

CTC

GAC

432

Lys

Gly

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala

Glu

Ile

Asn

Arg

Pro

Asp

Tyr

Leu

Asp

2 90

295

300

TTT Λ 7 7

GCC

GAG

TCT

GGG

CAG

GTC

TAC

TTT

GGG

ATC

ATT

GCC

CTC

TAG

4 t i Phe

Ala

Glu

Ser

Gly

Gin

Val

Tyr

Phe

Gly

Ile

Ile

Ala

Leu

*

305

310

315

12)

INFORMACJE 1

DOTYCZĄCE SEQ ID

NR:'

14 :

(i)

CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ:

159 ,

aminokwasów

(B) TYP: aminokwas

	(D) TOPOLOGIA;	; liniowa
	(ii) TYP CZĄSTECZKI; (xi) OPIS SEKWENCJI;	: białko ; SEQ ID NR: 14:
Met 1	Val Arg Ser Ser Ser 5	Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His 10 15
Val	Val Ala Asn Pro Gin 20	Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg 25 30
Arg	Ala Asn Ala Leu Leu 35	Ala Asn Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe 40 45
Trp	Leu Arg Val Pro Lys 50	Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gin Val Leu 55 60
Phe 65	Lys Gly Gin Gly Cys 70	Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr 75 80
Ile	Ser Arg Ile Ala Val 85	Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser 90 95
Ala	Ile Lys Ser Pro Cys 100	Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala 105 110

PL 194 221 B1

Lys

Pro

Trp 115

Tyr

Glu

Pro

Ile

Tyr 120

Leu

Gly

Gly

Val

Phe 125

Gin

Leu Glu

Lys

Gly

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala

Glu

Ile

Asn

Arg

Pro

Asp

Tyr

Leu Asp

130

135

140

Phe

Ala

Glu

Ser

Gly

Gin

Val

Tyr

Phe

Gly

Ile

Ile

Ala

Leu

*

145 150 155 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR:15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

[A! DŁUGOŚĆ: 477 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C! LINIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo sapiens (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) UMIEJSCOWIENIE:1..477 (D) INNE INFORMACJE:/kodon_startu= 1 /funkcja= Antygen /produkt= Analog TNF-alfa /gen= tnfP30-3 /nazwa standardowa= TNF30-3

	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	: SEQ ID	NR:	15:
ATG 48	GTC.	AGA TCA TCT TCT	CGA ACC	CCG	AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT
Met 160	Val	Arg Ser Ser Ser 165	Arg Thr	Pro	Ser Asp Lys Pro Val Ala His 170 175
GTT 96	GTA	GCA AAC CCT CAA	GCT GAG	GGG	CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC
Val	Val	Ala Asn Pro Gin 180	Ala Glu	Gly	Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg 185 190
CGG 144	GCC	AAT GCC CTC CTG	GCC AAT	GGC	GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG
Arg	Ala	Asn Ala Leu Leu 195	Ala Asn	Gly 200	Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin 205
CTG 192	GTG	GTG CCA TCA GAG	GGC CTG	TAC	CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC
Leu	Val	Val Pro Ser Glu 210	Gly Leu 215	Tyr	Leu Ile Tyr Ser Gin Val Leu 220
TTC 240	AAC	AAC TTT ACC GTC	TCC TTC	TGG	CTT CGG GTA CCC AAG GTC AGC
Phe	Asn	Asn Phe Thr Val	Ser Phe	Trp	Leu Arg Val Pro Lys Val Ser

PL 194 221 B1

225

230

235

GCT

AGC

CAC

CTC

GAG

GTC

TCC

TAC

CAG

ACC

AAG

GTC

AAC

CTC

CTC

TCT

288

Ala

Ser

His

Leu

Glu

Val

Ser

Tyr

Gin

Thr

Lys

Val

Asn

Leu

Leu

Ser

240

245

250

255

GCC

ATC

AAG

AGC

CCC

TGC

CAG

AGG

GAG

ACC

CCA

GAG

GGG

GCT

GAG

GCC

336

Ala

Ile

Lys

Ser

Pro

Cys

Gin

Arg

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly

Ala

Glu

Ala

260

265

270

AAG

CCC

TGG

TAT

GAG

CCC

ATC

TAT

CTG

GGA

GGG

GTC

TTC

CAG

CTG

GAG

384

Lys

Pro

Trp

Tyr

Glu

Pro

Ile

Tyr

Leu

Gly

Gly

Val

Phe

Gin

Leu

Glu

275

280

285

AAG

GGT

GAC

CGA

CTC

AGC

GCT

GAG

ATC

AAT

CGG

CCC

GAC

TAT

CTC

GAC

432

Lys

Gly

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala

Glu

Ile

Asn

Arg

Pro

Asp

Tyr

Leu

Asp

290

295

300

TTT

GCC

GAG

TCT

GGG

CAG

GTC

TAC

TTT

GGG

ATC

ATT

GCC

CTC

TAG

477

Phe

Ala

Glu

Ser

Gly

Gin

Val

Tyr

Phe

Gly

Ile

Ile

Ala

Leu

-fc

305

310

315

(2)

INFORMACJE :

dotycząc:

Ξ SEQ ID

NR:16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 159 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa

	(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	białko
	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	SEQ ID NR: 16:
Met	Val	Arg Ser Ser Ser	Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His
1		5	10 15
Val	Val	Ala Asn Pro Gin	Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg
		20	25 30
Arg	Ala	Asn Ala Leu Leu	Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin
		35	40 45
Leu	Val	Val Pro Ser Glu	Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Val Leu
	50		55 60
Phe	Asn	Asn Phe Thr Val	Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser
65		70	75 80
Ala	Ser	His Leu Glu Val	Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser
		85	90 95
Ala	Ile	Lys Ser Pro Cys	Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala
		100	105 110
Lys	Pro	Trp Tyr Glu Pro	Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu Giu

PL 194 221 B1

115	120	125
Lys Gly Asp Arg Leu	Ser Ala Glu Ile Asn	Arg Pro Asp Tyr Leu Asp
130	135	140
Phe Ala Glu Ser Gly	Gin Val Tyr Phe Gly	Ile Ile Ala Leu *
145	150	155

(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR:17:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 477 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LINIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo sapiens (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) UMIEJSCOWIENIE:!..477 (D) INNE INFORMACJE:/funkcja^ Antygen /produkt^ Analog TNF-alfa /gen= tnfP30-4 /nazwa standardowa= TNF30-4

	(xi)	OPIS SEKWENCJI:	SEC	) ID	NR:	17 :
ATG	GTC	AGA TCA TCT TCT	CGA	ACC	CCG	AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT
48
Met	Val	Arg Ser Ser Ser	Arg	Thr	Pro	Ser Asp Lys Pro Val Ala His
160		165				170 175
GTT	GTA	GCA AAC CCT CAA	GCT	GAG	GGG	CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC
96
Val	Val	Ala Asn Pro Gin	Ala	Glu	Gly	Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg
		180				185 190
CGG	GCC	AAT GCC CTC CTG	GCC	AAT	GGC	GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG
144
Arg	Ala	Asn Ala Leu Leu	Ala	Asn	Gly	Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin
		195			200	205
CTG	GTG	GTG CCA TCA GAG	GGC	CTG	TAC	CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC
192
Leu	Val	Val Pro Ser Glu	Gly	Leu	Tyr	Leu Ile Tyr Ser Gin Val Leu
		210		215		220
TTC	AAG	GGC CAA GGC TGC	CCC	TCC	ACC	CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC
240
Phe	Lys	Gly Gin Gly Cys	Pro	Ser	Thr	His Val Leu Leu Thr His Thr
	225		230			235

PL 194 221 B1

ATC 288 Ile 240

AGC Ser

CGC Arg

ATC Ile

GCC Ala

GTC Val 245

TCC Ser

TAC Tyr

CAG Gin

ACC Thr

AAG Lys 250

GTC Val

AAC Asn

CTC Leu

CTC Leu

TCT Ser 255

GCC

ATC

AAG

AGC

CCC

TGC

CAG

AGG

GAG

ACC

CCA

TTT

AAT

AAT

TTC

ACC

336

Ala

Ile

Lys

Ser

Pro

Cys

Gin

Arg

Glu

Thr

Pro

Phe

Asn

Asn

Phe

Thr

260

265

270

GTG

TCC

TTC

TGG

TTG

CGC

GTC

CCT

AAG

GTA

AGC

GCT

TCC

CAC

CTG

GAG

384

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

Pro

Lys

Val

Ser

Ala

Ser

His

Leu

Glu

275

280

285

AAG

GGT

GAC

CGA

CTC

AGC

GCT

GAG

ATC

AAT

CGG

CCC

GAC

TAT

CTC

GAC

432

Lys

Gly

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala

Glu

Ile

Asn

Arg

Pro

Asp

Tyr

Leu

Asp

290

295

300

TTT

GCC

GAG

TCT

GGG

CAG

C-TC

TAC

TTT

GGG

ATC

ATT

GCC

CTC

TAG

477

Phe

Ala

Glu

Ser

Gly

Gin

Val

Tyr

Phe

Gly

Ile

Ile

Ala

Leu

305

310

315

(2)

INFORMACJE !

DOTYCZĄCE SEQ ID

NR: :

18 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 159 aminokwasów (B) TYP: aminokwas

	(D) TOPOLOGIA	: liniowa
	(ii) TYP CZĄSTECZKI;	: białko
	(xi) OPIS SEKWENCJI:	; SEQ ID NR: 18:
Met	Val Arg Ser Ser Ser	Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His
1	5	10 15
Val	Val Ala Asn Pro Gin	Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg
	20	25 30
Arg	Ala Asn Ala Leu Leu	Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin
	35	40 45
Leu	Val Val Pro Ser Glu	Gly Lsu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Val Leu
	50	55 60
Phe	Lys Gly Gin Gly Cys	Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr
65	70	75 80
Ile	Ser Arg Ile Ala Val	Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser
	85	90 95
Ala	Ile Lys Ser Pro Cys	Gin Arg Glu Thr Pro Phe Asn Asn Phe Thr
	100	105 110
Val	Ser Phe Trp Leu Arg	Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu
	115	120 125

PL 194 221 B1

Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp 130 135 140

Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu *

145 150 155 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR:19 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 477 par zasad

	(B) TYP: kwas nukleinowy
(C) LINIOWOŚĆ: (D) TOPOLOGIA:	: podwójna : liniowa
(ii)	TYP CZĄSTECZKI:	: DNA (genomowe
(iii)	HIPOTETYCZNA: NIE
(iv)	ANTY-SENSOWNA:	NIE
(vi)	ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo sapiens (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) UMIEJSCOWIENIE:!..477 <D) INNE INFORMACJE:/kodon_startu= 1 /funkcja= Antygen /produkt= Analog TNF-alfa /gen= tnfP30-5 /nazwa standardowa^ TNF30-5

(xi;	1 OPIS SEKWENCJI	: SEQ ID	NR:	19:
ATG 48	GTC AGA TCA TCT	TCT CGA	ACC	CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT
Met 160	Val Arg Ser Ser	Ser Arg 165	Thr	Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His 170 175
GTT 96	GTA GCA AAC CCT	CAA GCT	GAG	GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC
Val	Val Ala Asn Pro 180	Gin Ala	Glu	Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg 185 190
CGG 144	GCC AAT GCC CTC	CTG GCC	AAT	GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG
Arg	Ala Asn Ala Leu 195	Leu Ala	Asn	Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin 200 205
CTG 192	GTG GTG CCA TCA	GAG GGC	CTG	TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC
Leu	Val Vai Pro Ser 210	Glu Gly	Leu 215	Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Val Leu 220
TTC 240	AAG GGC CAA GGC	TGC CCC	TCC	ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC
Phe	Lys Gly Gin Gly 225	Cys Pro 230	Ser	Thr His Val Leu Leu Thr His Thr 235
ATC	AGC CGC ATC GCC	GTC TGC	TAC	CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT

288

PL 194 221 B1

Ile 240

Ser

Arg

I le

Ala

Val 245

Ser

Tyr

Gin

Thr

Lys 250

Val

Asn

Leu

Leu

Ser 255

GCC

ATC

AAG

AGC

CCC

TGC

CAG

AGG

GAG

ACC

CCA

GAG

GGG

GCT

GAG

GCC

336

Ala

Ile

Lys

Ser

Pro

Cys

Gin

Arg

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly

Ala

Glu

Ala

260

265

270

AAG

CCC

TGG

TAT

GAG

CCC

ATC

TAT

CTG

GGA

GGG

GTC

TTC

CAG

CTG

GAG

394

Lys

Pro

Trp

Tyr

Glu

Pro

Ile

Tyr

Leu

dy

Gly

Val

Phe

Gin

Leu

Glu

275

280

285

AAG

GGT

GAC

CGA

TTC

AAC

AAT

TTC

ACC

GTA

AGC

TTC

TGG

CTT

CGC

GTC

432

Lys

Gly

Asp

Arg

Phe

Asn

Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

2 90

295

300

CCT

AAG

GTG

TCT

GCG

TCG

CAC

CTC

GAA

GGG

ATC

ATT

GCC

CTC

TAG

477

Pro

Lys

Val

Ser

Ala

Ser

His

Leu

Glu

Gly

Ile

Ile

Ala

Leu

dr

305

3.10

315

(2)

INFORMACJE DOTYCZĄCE

: 3FQ ID

NR:20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 159 aminokwasów (B) TYP: aminokwas

(

D) TOPOLOGIA:

: liniowa

(ii;

) TYP CZĄSTECZKI:

: bi«

alko

(xi;

! OPIS SEKWENCJI:

: SEQ ID

NR:

20:

Met

Val

Arg

Ser

Ser

Ser

Arg

Thr

Pro

Ser

Asp

Lys

Pro

Val

Ala

His

1

5

10

15

Val

val

Ala

Asn

Pro

Gin

Ala

Glu

Gly

Gin

Leu

Gin

Trp

Leu

Asn

Arg

20

25

30

Arg

Ala

Asn

Ala

Leu

Leu

Ala

Asn

Gly

Val

Glu

Leu

Arg

Asp

Asn

Gin

35

40

45

Leu

Val

Val

Pro

Ser

Glu

dy

Leu

Tyr

Leu

Ile

Tyr

Ser

Gin

Val

Leu

50

55

60

Phe

Lys

Gly

Gin

Gly

Cys

Pro

Ser

Thr

His

Val

Leu

Leu

Thr

His

Thr

65

70

75

80

Ile

Ser

Arg

Ile

Ala

Val

Ser

Tyr

Gin

Thr

Lys

Val

Asn

Leu

Leu

Ser

85

90

95

Ala

Ile

Lys

Ser

Pro

Cys

Gin

Arg

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly

Ala

Glu

Ala

100

105

110

Lys

Pro

Trp

Tyr

Glu

Pro

Ile

Tyr

Leu

Gly

Gly

Val

Phe

Gin

Leu

Glu

115

120

125

Lys

Gly

Asp

Arg

Phe

Asn

Asn

Phe

Thr

val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

130

135

140

PL 194 221 B1

Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gly Ile Ile Ala Leu * 145 150 155 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR:21:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

	(A)	DŁUGOŚĆ:	24 par zasad
	(B)	TYP: kwas	nukleinowy
	(C)	LINIOWOŚĆ	: pojedyncza
	(D)	TOPOLOGIA	: liniowa
(ii)	TYP	CZĄSTECZKI	: DNA (genomowe
(iii)	HIPOTETYCZNA:	NIE
(iv)	ANTY	-SENSOWNA:	NIE
(ix)	CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_CECHY (B) UMIEJSCOWIENIE:1..24 (C) METODA IDENTYFIKACJI: eksperymentalna (D) INNE INFORMACJE:/funkcja= Starter do klonowania PCR

DNA kodującego TNF-alfa /produkt= Starter wiążący się do genu TNF-alfa /dowód= eksperymentalny /nazwastandardowa- TNF-alfa Starter I /oznaczenie= Starterl <xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR: 21:

GACAAGCCCA TGGTCAGATC ATCT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR:22:

ii) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LINIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: niscCECHY (B) UMIEJSCOWIENIE:!. .30 (C) METODA IDENTYFIKACJI: eksperymentalna (D) INNE INFORMACJE:/funkcja= Starter do klonowania PCR

DNA kodującego TNF-alfa /produkt= Starter wiążący się do genu TNF-alfa /dowód= eksperymentalny /nazwa_standardowa= TNF-alfa Starter II /oznaczenie= Starter2

PL 194 221 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR: 22

TCTCTAGAGG GCAATGATCC CAAAGTAGAO 30 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR:23:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LINIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: misc_CECHY (B) UMIEJSCOWIENIE:1..21 (C) METODA IDENTYFIKACJI: eksperymentalna (D) INNE INFORMACJE:/funkcja= Starter do klonowania PCR

DNA kodującego TNF-alfa /produkt= Starter wiążący się do genu TNF-alfa /dowód= eksperymentalny /nazwa_standardowa= TNF-alfa Starter III /oznaczenie^ Starter3 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR: 23:

CCCAAAGTAG ACCTGCCCAG A (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR:24:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 69 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LINIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA; NIE (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo sapiens (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inserticnseg (B) UMIEJSCOWIENIE:7..51 (C) METODA IDENTYFIKACJI: eksperymentalna (D) INNE INFORMACJE:/funkcja= Starter do klonowania PCR

DNA kodującego analog TNF-alfa /dowód= eksperymentalny

PL 194 221 B1 /ORGANIZM- Homo sapiens /nazwa_standardowa= Starter ^,Tmut2-l· /oznaczenie^ mut2-l /Uwaga= Starter mut2-l jest to sztucznie syntetyzowany

69-merowy oligonukleotyd zawierający DNA kodujące ludzki Epitop P2 komórek T między odcinkami DNA homologicznymi do odcinków ludzkiego genu TNF-alfa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR: 24:

ACCCCGAGTC AGTACATTAA AGCCAATTCT AAATTCATCG GTATAACTGA GCTGCAGCTC 60

CAGTGGCTG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR:25:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 73 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LINIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo sapiens (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: insertion seq (B) UMIEJSCOWIENIE:15..59 ~ (C) METODA IDENTYFIKACJI: eksperymentalna (D) INNE INFORMACJE:/funkcja= Starter do klonowania PCR

DNA kodującego analog TNF-alfa /dcwóc- eksperymentalny /ORGAN!ZM= Homo sapiens /nazwa_standardowa= Starter mut2-3 /oznaczenie= mut2-3 /Uwaga= Starter mut2-3 jest to sztucznie syntetyzowany 73-merowy oligonukleotyd zawierający DNA kodujące ludzki Epitop P2 komórek T między odcinkami DNA homologicznymi do odcinków ludzkiego genu TNF-alfa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR: 25:

CCCAGGTCCT CTTCCAGTAC ATAAAGGCCA ACTCCAAGTT TATCGGCATC ACCGAGCTCA 60

TCAGCCGCAT CGC

3 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR:26:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

PL 194 221 B1 (A) DŁUGOŚĆ: 75 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LINIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo sapiens (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: insertion_seq (B) UMIEJSCOWIENIE:12..56 (C) METODA IDENTYFIKACJI: eksperymentalna (D) INNE INFORMACJE:/funkcja= Starter do klonowania PCR

DNA kodującego analog TNF-alfa /dowód— eksperymentalny /ORGANIZM= Homo sapiens /nazwa_standardowa= Starter mut2-4 /oznaczenie= mut2-4 /Uwaga= Starter ”mut2-4 jest to sztucznie syntetyzowany 75-merowy oligonukleotyd zawierający DNA kodujące ludzki

Epitop P2 komórek T między odcinkami DNA homologicznymi do odcinków ludzkiego genu TNF-alfa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR: 26:

AGTCGGTCAC CGAGCTCCGT GATGCCGATG AATTTCGAAT TGGCCTTGAT ATACTGGGGC 60

TTGGCCTCAG CCCCC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR: 27 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)	DŁUGOŚĆ:	75 par zasad
(B)	TYP: kwas	nukleinowy
(C)	LINIOWOŚĆ	: pojedyncza
(D)	TOPOLOGIA	: liniowa
TYP	CZĄSTECZKI	: DNA (genomowe)

(iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo sapiens (lx) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: insertion_seq (B) UMIEJSCOWIENIE:8..52 (C) METODA IDENTYFIKACJI: eksperymentalna (D) INNE INFORMACJE:/funkcja= Starter do klonowania PCR

DNA kodującego analog TNF-alfa /dowód= eksperymentalny

PL 194 221 B1 /ORGANIZM= Homo sapiens /nazwa_standardowa= Starter mut2-5 /oznaczenie= mut2-5 /Uwaga- Starter mu.t2-5 jest to sztucznie syntetyzowany 75-m.erowy oligonukleotyd zawierający DNA kodujące ludzki

Epitop P2 komórek T między odcinkami DNA homologicznymi do odcinków ludzkiego genu TNF-alfa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR: 27:

GAAGGGTGAC CGACAGTACA TTAAGGCCAA TTCGAAGTTC ATTGGCATCA CTGAGCTGTC 60

TGGGCAGGTC TACTT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR:28 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 80 par zasad

	(B) TYP: kwas nukleinowy
(C) LINIOWOŚĆ: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii)	TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe
(iii)	HIPOTETYCZNA: NIE
(iw)	ANTY-SENSOWNA: NIE
(vi)	ŹRÓDŁO POCHODZENIA: (A) ORGANIZM: Homo sapiens
(ix)	CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: inser tion_j3eq (B) UMIEJSCOWIENIE:14..58

.. (C) METODA IDENTYFIKACJI: eksperymentalna (D) INNE INFORMACJE:/funkcja= Starter do klonowania PCR

DNA kodującego analog TNF-alfa /dowód= eksperymentalny /ORGANIZM= Homo sapiens /nazwa_standardowa= Starter mut2-7 /oznaczenie= mut2-7 /Uwaga= Starter mut2-7 jest to sztucznie syntetyzowany 80-merowy oligonukleotyd zawierający DNA kodujące ludzki

Epitop P2 komórek T między odcinkami DNA homologicznymi do odcinków ludzkiego genu TNF-alfa” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR: 28:

CACCCATGTG CTCCAGTACA TCAAAGCTAA CTCCAAATTC ATCGGCATCA CCGAACTGGT 60

TAACCTCCTC TCTGCCATCA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR:29

PL 194 221 B1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 96 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LINIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo sapiens (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: insertionseg (B) UMIEJSCOWIENIE:10..72 (C) METODA IDENTYFIKACJI: eksperymentalna (D) INNE INFORMACJE:/funkcja= Starter do klonowania PGR

DNA kodującego analog TNF-alfa /dowód= eksperymentalny /ORGANIZM- Homo sapiens /nazwa_standardowa= Starter mut30-l·” /oznaczenie^ mut30-l /Uwaga= Starter ⁿmut30-l jest to sztucznie syntetyzowany 96-merowy oligonukleotyd zawierający DNA kodujące ludzki

Epitop P30 komórek T między odcinkami DNA. homologicznymi do odcinków ludzkiego genu TNF-alfa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEC ID NR: 29:

ACCCCGAGTT TCAACAATTT TACCGTAAGC TTTTGGCTCC GTGTACCTAA GGTGTCGGCC 60

TCGCACCTGG AGCGCCGGGC CAATGCCCTC CTGC-CC '

(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR:30 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)	DŁUGOŚĆ:	100 par zasad
(B)	TYP: kwas	nukleinowy
(C)	LINIOWOŚĆ	: pojedyncza
(D)	TOPOLOGIA	: liniowa
(ii) TYP	CZĄSTECZKI	: DNA (genomowe
(iii) HIPOTETYCZNA:	NIE
(iv) ANTY	-SENSOWNA:	NIE
(vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:
(A)	ORGANIZM:	Homo sapiens
(ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: insertion_seq (Bj UMIEJSCOWIENIE:12..74 !C) METODA IDENTYFIKACJI; eksperymentalna (D) INNE INFORMACJE:/funkcja- Starter do klonowania PCR DNA kodującego analog TNF-alfa

PL 194 221 B1 /dowód= eksperymentalny /ORGANIZM- Homo sapiens /nazwa__standardowa= Starter mut30-2 /oznaczenie= mut30-2 /Uwaga= Starter mut30-2 jest to sztucznie syntetyzowany

100-merowy oligonukleotyd zawierający DNA kodujące ludzki epitop P30 komórek T między Odcinkami DNA homologicznymi do odcinków ludzkiego genu TNF-alfa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR: 30:

TCCTGGCCAA TTTCAACAAC TTCACAGTTA GCTTCTGGTT GAGGGTACCA AAGGTCTCGG 60

CCAGCCACCT CGAGCAGGTC CTCTTCAAGG GCCAAGGCTG

100 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR:31:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 100 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LINIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA; NIE (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo sapiens (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: insertion_seq (B) UMIEJSCOWIENIE:12..74 (C) METODA IDENTYFIKACJI: eksperymentalna (D) INNE INFORMACJE:/funkcja= Starter do klonowania PCR , DNA kodującego analog TNF-alfa /dowód= eksperymentalny ' /ORGANIZM= Homo sapiens /nazwa_standardowa= Starter mut30-3 /oznaczenie= mut30-3 /Uwaga= Starter mut30-3 jest to sztucznie syntetyzowany 100-merowy oligonukleotyd zawierający DNA kodujące ludzki epitop P30 komórek T między odcinkami DNA homologicznymi do odcinków ludzkiego genu TNF-alfa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR; 31:

CCCAGGTCCT CTTCAACAAC TTTACCGTCT CCTTCTGGCT TCGGGTACCC AAGGTCAGCG 60

CTAGCCACCT CGAGGTCTCC TACCAGACCA AGGTCAACCT

100 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR:32

PL 194 221 B1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 100 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LINIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

[ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo sapiens (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: insertion_seq (3) UMIEJSCOWIENIE:15..77 “ (C) METODA IDENTYFIKACJI: eksperymentalna (D) INNE INFORMACJE:/funkcja= Starter do klonowania PCR

DNA kodującego analog TNF-alfa /dowód= eksperymentalny /ORGANIZM= Homo sapiens /nazwa_standardowa^ Starter mut30-4 ' /oznaczenie= mut30-4 /Uwaga= Starter mut30-4 jest to sztucznie syntetyzowany

100-merowy oligonukleotyd zawierający DNA kodujące ludzki epitop P30 komórek T między odcinkami DNA homologicznymi do odcinków ludzkiego genu TNF-alfa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR: 32:

AGTCGGTCAC CCTTCTCCAG GTGGGAAGCG CTTACCTTAG GGACGCGCAA CCAGAAGGAC 60

ACGGTGAAAT TATTAAATGG GGTCTCCCTC TGGCAGGGGC

100 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR:33:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 100 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LINIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowe) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTY-SENSOWNA: NIE (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA;

(A) ORGANIZM; Homo sapiens (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: insertion_seq (B) UMIEJSCOWIENIE;14..76 (C) METODA IDENTYFIKACJI: eksperymentalna

PL 194 221 B1 (D) INNE INFORMACJE:/funkcja= Starter do klonowania PCR DNA kodującego analog TNF-alfa /dowód= eksperymentalny /ORGANIZM= Homo sapiens /nazwa_standardowa= Starter mut30-5 /oznaczenie^ mut3G-5 /Uwaga= Starter mut30~5 jest to sztucznie syntetyzowany 100-merowy oligonukleotyd zawierający DNA kodujące ludzki epitop P30 komórek T między odcinkami DNA homologicznymi do odcinków ludzkiego genu TNF-alfa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR; 33:

AAGGGTGAC CGATTCAACA ATTTCACCGT AAGCTTCTGG CTTCGCGTCC CTAAGGTGTC •5Ί 61

TGCGTCGCAC CTCGAAGGGA TCATTGCCCT CTAGAGTCGA 100 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR:34:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 25 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) LINIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (v) FRAGMENT TYP: wewnętrzny (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo sapiens (ix) CECHY:

. (A) NAZWA/KLUCZ: Peptyd (B) UMIEJSCOWIENIE:1..25 (D) INNE INFORMACJE:/oznaczenie= Pep2-1 /Uwaga= Pep2-1 jest syntetycznie przygotowaną, okrojoną formą analogu TNF-alfa zawierającą ludzki epitop P2 komórek T i flankujące fragmenty z ludzkiego TNF-alfa

(xi)	OPIS SEKWENCJI:	SEQ ID NR: 34:
Ser	Arg Thr Pro Ser	Glrt Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly
1	5	10 15
Ile	Thr Glu Leu Gin	Leu Gin Trp Leu
	20	25
INFORMACJE DOTYCZĄCE	SEQ ID NR:35:
(i)	CHARAKTERYSTYKA	SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 25 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) LINIOWOŚĆ:

PL 194 221 B1 (D) TOPOLOGIA: liniowa

(ii)	TYP CZĄSTECZKI	: peptyd
(iii)	HIPOTETYCZNA:	NIE
(V)	FRAGMENT TYP:	wewnętrzny
(vi)	ŹRÓDŁO POCHODZENIA:
	(A) ORGANIZM:	Homo sapi·
(ix)	CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Peptyd (B) UMIEJSCOWIENIE:1..25 (D) INNE INFORMACJE:/oznaczenie» Pep2-3 /Uwaga» Pep2-3 jest syntetycznie przygotowaną, okrojoną formą analogu TNF-alfa zawierającą ludzki epitop P2 komórek T i flankujące fragmenty ludzkiej TNF-alfa

ίχί)	OPIS SEKWENCJI:	SEQ ID NR: 35:
Ser 1	Gin Val Leu Phe 5	Gin Tyr Ile Lys	Ala Asn Ser Lys Phe 10	Ile Gly 15
Ile	Thr Glu Leu Ile 20	Ser Arg Ile Ala 25
INFORMACJE DOTYCZĄCE	SEQ ID NR:36:
(i)	CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 25 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) LINIOWOŚĆ: (D) TOPOLOGIA: liniowa

(ii)	TYP CZĄSTECZKI	: peptyd
(iii)	HIPOTETYCZNA:	NIE
(v)	FRAGMENT TYP:	wewnętrzny
(vi)	ŹRÓDŁO POCHODZENIA: (A) ORGANIZM: Homo sapiens
(ix)	CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Peptyd (B) UMIEJSCOWIENIE:1..25 (D) INNE INFORMACJE:/oznaczenie- Pep2-4 /Uwaga» Pep2-4 jest syntetycznie przygotowaną, okrojoną formą analogu TNF-alfa zawierającą ludzki epitop P2 komórek T i flankujące fragmenty ludzkiej TNF-alfa” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR: 36: .

Ala Glu Ala Lys Pro Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly 15 10 15

Ile Thr Glu Leu Gly Asp Arg Leu Ser 20 25

PL 194 221 B1 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR:37:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 25 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) LINIOWOŚĆ:

CD) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (v) FRAGMENT TYP: wewnętrzny (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo sapiens <ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Peptyd (B) UMIEJSCOWIENIE:1..25 (D) INNE INFORMACJE:/oznaczenie= Pep2-5 /Uwaga= Pep2-5 jest syntetycznie przygotowaną, okrojoną formą analogu TNF-alfa zawierającą ludzki epitop P2 komórek T i flankujące fragmenty ludzkiej TNF-alfa (xi) OPIS SEKWENCJI; SEQ ID NR: 37:

Glu Lys Gly Asp Arg Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly 15 10 15

Ile Thr Glu Leu Ser Gly Gin Val Tyr

25 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR:38:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) LINIOWOŚĆ:

CD) TOPOLOGIA: liniowa

(ii)	TYP CZĄSTECZKI	: peptyd
(iii )	HIPOTETYCZNA:	NIE
(v)	FRAGMENT TYP:	wewnętrzny
(vi)	ŹRÓDŁO POCHODZENIA: (A) ORGANIZM: Homo sapii
(ix)	CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Peptyd (B) UMIEJSCOWIENIE:!. .31 (D) INNE INFORMACJE:/oznaczenie= Pep30-i /Uwaga= Pep30-l jest syntetycznie przygotowaną, okrojoną formą analogu TNF-alfa zawierającą ludzki epitop P30 komórek T i flankujące fragmenty ludzkiej TNF-alfa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR; 38:

PL 194 221 B1

Ser 1

Arg

Thr

Pro

Ser 5

Phe

Asn

Asn

Phe

Thr 10

Val

Ser

Phe

Trp

Leu Arg 15

Vai

Pro

Lys

Val

Ser

Ala

Ser

His

Leu

Glu

Arg

Arg

Ala

Asn

Ala

20

25

30

(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR:39 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 aminokwasów (3) TYP: aminokwas

CC) LINIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa

Iii)	TYP CZĄSTECZKI	: peptyd
iii)	HIPOTETYCZNA:	NIE
lv)	FRAGMENT TYP:	wewnętrzny
tvi)	ŹRÓDŁO POCHODZENIA: (A) ORGANIZM: Homo sapiens
(ix)	CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Peptyd (B) UMIEJSCOWIENIE:!. .31

CD) INNE INFORMACJE:/oznaczenie- Pep30-2 /Uwaga- Pep30-2 jest syntetycznie przygotowaną, okrojoną formą analogu TNF-alfa zawierającą ludzki epitop P30 komórek T i flankujące fragmenty ludzkiej TNF-alfa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR: 39:

Ala Leu Leu Ala Asn Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arq

5 10 15

Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gin Val Leu Phe Lys

25 30 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR: 4 0 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) LINIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa

(ii)	TYP CZĄSTECZKI	: peptyd
(iii)	HIPOTETYCZNA:	NIE
(v)	FRAGMENT TYP:	wewnętrzny
(vi)	ŹRÓDŁO POCHODZENIA: (A) ORGANIZM: Homo sapii
(ix)	CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Peptyd (B) UMIEJSCOWIENIE;1. . 31

PL 194 221 B1 (Dl INNE INFORMACJE:/oznaczenie Pep30-3 /Uwaga™ Pep30-3 jest syntetycznie przygotowaną, okrojoną formą analogu TNF-alfa zawierającą ludzki epitop P30 komórek T i flankujące fragmenty ludzkiej TNF-alfa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR: 40:

Tyr Ser Gin Val Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg 15 10 15

Val Pro Lys Vąl Ser Ala Ser His Leu Glu Val Ser Tyr Gin Thr 20 25 30 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NR:41 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) LINIOWOŚĆ:

CD) TOPOLOGIA: liniowa

iii)	TYP CZĄSTECZKI	: peptyd
(iii)	HIPOTETYCZNA:	NIE
(v)	FRAGMENT TYP:	wewnętrzny
(vi)	ŹRÓDŁO POCHODZENIA: (A) ORGANIZM: Homo sapii
(ix)	CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Peptyd (B) UMIEJSCOWIENIE;1..31 (D) INNE INFORMACJE:/oznaczenie™ Pep30-4 /Uwaga= Pep30-4 jest syntetycznie przygotowaną, okrojoną formą analogu TNF-alfa zawierającą ludzki epitop P30 komórek T i flankujące fragmenty ludzkiej TNF-alfa

(xij OPIS SEKWENCJI:	SEQ ID NR: 41:
Gin Arg Glu Thr Pro 1 5	Phe Asn Asn Phe	Thr 10	Vai	Ser Phe Trp	Leu Arg 15
Val Pro Lys Val Ser 20	Ala Ser His Leu 25	Glu	Lys	Gly Asp Arg 30	Leu
(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE	SEG ID NR:42:
(i) CHARAKTERYSTYKA (A) DŁUGOŚĆ: 31	SEKWENCJI: aminokwasów

(B) TYP: aminokwas (C) LINIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (v) FRAGMENT TYP: wewnętrzny

PL 194 221 B1 (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo sapiens (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: Peptyd (B) UMIEJSCOWIENIE:1..31 (D) INNE INFORMACJE:/oznaczenie= Pep30-5 /Uwaga= Pep30-5 jest syntetycznie przygotowaną, formą analogu TNF-alfa zawierającą ludzki epitop i flankujące fragmenty ludzkiej TNF-alfa okrojoną P30 komórek T

(xi)	OPIS	SEKWENCJI:	SEQ	ID NR: 42:
Glu	Lys	Gly Asp Arg	Phe	Asn Asn Phe	Thr	Val	Ser	Phe	Trp	Leu Arg
1		5			10					15
Val	Pro	Lys Val Ser	Ala	Ser His Leu	Glu	Gly	Ile	Ile	Ala	Leu
		20		25					30

Zastrzeżenia patentowe

Claims (42)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFa zdolna do indukowania przeciwciał neutralizujących przeciwko ludzkiemu TNFa typu dzikiego po podaniu tej zmodyfikowanej cząsteczki TNFa ludzkiemu gospodarzowi, przy czym przynajmniej jeden segment cząsteczki ludzkiego TNFa został zastąpiony przynajmniej jednym peptydem zawierający immunodominujący epitop komórek T lub skróconą postacią takiej cząsteczki zawierającą immunodominujący epitop komórek T, i jeden lub obydwa regiony flankujące cząsteczkę ludzkiego TNFa z przynajmniej jednym epitopem TNFa dla komórek B, przy czym substytucja jest wprowadzana w dowolnej z nici należącej do przedniej harmonijki β, w dowolnej z pętli łączących i/lub w dowolnej z nici B', l lub D należących do tylnej harmonijki β, przy czym substytucja została dokonana w regionach cząsteczki TNFa tak, żeby zachować strukturę harmonijki β nici B i G, i przy czym substytucja prowadzi do inaktywacji aktywności biologicznej ludzkiego TNFatestowanej w oznaczeniu biologicznym L929.
2. 2. Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFa, według zastrz. 1, znamienna tym, że substytucja nie obejmuje dowolnej całkowitej nici tylnej harmonijki β.
3. 3. Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFa według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że substytucja obejmuje przynajmniej segment nici H należącej do przedniej harmonijki β i pętli łączącej z nicią I należącą do tylnej harmonijki β, segment nici H i I i całą pętlę łączącą, segment nici D należącej do tylnej harmonijki β, i przynajmniej segment nici E należącej do przedniej harmonijki β i całą pętlę łączącą, całe nici C' i C należące do przedniej harmonijki β oraz segment nici D należącej do tylnej harmonijki β, albo przynajmniej segment nici E należącej do przedniej harmonijki β i jedną lub obie pętle łączące.
4. 4. Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFa według zastrz. 1, znamienna tym, że substytucja została dokonana w regionach cząsteczki TNFa które obejmują nici należące do przednich harmonijek β i/lub pętli łączących żeby zasadniczo zachować strukturę harmonijki β dowolnej z nici należącej do tylnej harmonijki β.
5. 5. Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFa według zastrz. 3, znamienna tym, że substytucja została dokonana w regionach cząsteczki TNFa, które obejmują segment z nici D należącej do tylnej harmonijki β.
6. 6. Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFa według zastrz, 3, znamienna tym, że substytucja obejmuje przynajmniej segment nici H należącej do przedniej harmonijki β i pętli łączącej z nicią I, korzystnie aminokwasy 132 do 146.
7. 7. Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFa według zastrz. 3, znamienna tym, że substytucja obejmuje segmenty nici H i I oraz całą pętlę łączącą, korzystnie aminokwasy 132 do 152.

   PL 194 221 B1
8. 8. Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFα według zastrz. 3, znamienna tym, że substytucja obejmuje segment nici D, przynajmniej segment nici E oraz całą pętlę łączącą, korzystnie aminokwasy 65 do 79lub 64 do 84.
9. 9. Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFα według zastrz. 3, znamienna tym, że substytucja obejmuje całą nić C' i C oraz segment nici D, korzystnie aminokwasy 40 do 60.
10. 10. Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFα według zastrz. 3, znamienna tym, że substytucja obejmuje przynajmniej segment nici E należącej do przedniej harmonijki β i jedną lub obie pętle łączące, korzystnie aminokwasy 76 do 90.
11. 11. Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFα według zastrz. 1, znamienna tym, że przeciwciała neutralizujące wzbudzone przeciwko tej zmodyfikowanej cząsteczce w odpowiednim gospodarzu są zdolne do zasadniczego hamowania aktywności natywnego TNFα w oznaczeniu biologicznym L929, i/lub przy czym przeciwciała te znacząco hamują wiązanie ludzkiego TNFα dzikiego typu z receptorem 1 TNFα o masie cząsteczkowej 55 kDa (TNFα-55 kDa) lub receptorem 2 TNFα o masie cząsteczkowej 75 kDa (TNFα-75 kDa).
12. 12. Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFα według zastrz. 1, znamienna tym, że wstawiony epitop komórki T jest słabo specyficzny i immunogenny dla większości typów ludzkich HLA klasy II.
13. 13. Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFα według zastrz. 12, znamienna tym, że epitop pochodzi z anatoksyny tężcowej, korzystnie epitopu P2 i/lub P30.
14. 14. Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFα według zastrz. 13, znamienna tym, że posiada sekwencję aminokwasową pokazaną na SEQ ID NR:8.
15. 15. Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFα według zastrz. 13, znamienna tym, że posiada sekwencję aminokwasową pokazaną na SEQ ID NR:10.
16. 16. Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFα według zastrz. 13, znamienna tym, że posiada sekwencję aminokwasowąpokazaną na SEQ ID NR:4 lub SEQ ID NR:16.
17. 17. Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFα według zastrz. 13, znamienna tym, że posiada sekwencję aminokwasową pokazaną na SEQ ID NR:20.
18. 18. Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFα według zastrz. 13, znamienna tym, że posiada sekwencję aminokwasową pokazaną na SEQ ID NR:14.
19. 19. Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFα określona w zastrz. 1, znamienna tym, że ma postać białka fuzyjnego z cząsteczką adiuwanta.
20. 20. Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFα według zastrz. 19, znamienna tym, że cząsteczkę adiuwanta stanowi adiuwant immunologicznie aktywny.
21. 21. Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFα według zastrz. 19, znamienna tym, że cząsteczkę adiuwanta stanowi GM-CSF, HSP70 lub interleukina.
22. 22. Dimery, oligomery lub multimery zmodyfikowanej cząsteczki ludzkiego TNFα określonej wzastrz. 1.
23. 23. Wyizolowana cząsteczka DNA, znamienna tym, że koduje zmodyfikowaną cząsteczkę TNFα określoną w zastrz. 1.
24. 24. Wektor, znamienny tym, że zawiera wyizolowaną cząsteczkę DNA określoną w zastrz. 23.
25. 25. Wektor ekspresyjny, znamienny tym, że zawiera wyizolowaną cząsteczkę DNA określoną w zastrz. 23 operacyjnie związaną z sekwencją kontrolującą ekspresję.
26. 26. Komórka gospodarza, znamienna tym, że jest transformowana wektorem ekspresyjnym określonym w zastrz. 25.
27. 27. Komórka według zastrz. 26, znamienna tym, że wybrana jest ze szczepów bakterii, drożdży lub innych grzybów i linii komórkowych owadzich, ssaczych lub ptasich.
28. 28. Sposób wytwarzania zmodyfikowanej cząsteczki ludzkiego TNFα określonej w zastrz. 1, znamienny tym, że hoduje się komórki gospodarza określone w zastrz. 26 albo 27 w odpowiednich warunkach pozwalających na produkcję zmodyfikowanego TNFα i odzyskuje się tak wyprodukowany zmodyfikowany TNFα.
29. 29. Szczepionka przeciwko TNFα, znamienna tym, że zawiera jedną lub więcej zmodyfikowanych cząsteczek ludzkiego TNFα określonych w zastrz. 1 i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny adiuwant.
30. 30. Szczepionka według zastrz. 29, znamienna tym, że farmaceutycznie dopuszczalny adiuwant stanowi fosforan glinu, wodorotlenek glinu, fosforan wapnia, dipeptyd muramylowy lub iscom.
31. 31. Szczepionka określona w zastrz. 29 albo 30, do profilaktyki lub leczenia chorób promowanych przez uwalnianie lub działanie TNFα, takich jak przewlekłe choroby zapalne.

    PL 194 221 B1
32. 32. Szczepionka według zastrz. 31, znamienna tym, że przewlekłe choroby zapalne stanowią reumatoidalne zapalenie stawów i choroby zapalne jelit.
33. 33. Szczepionka według zastrz. 32, znamienna tym, że choroby zapalne jelit stanowią choroba Crohna i wrzodziejące zapalenie jelita grubego.
34. 34. Szczepionka według zastrz. 29, znamienna tym, że przeznaczona jest do podawania pozajelitowego.
35. 35. Szczepionka według zastrz. 34, znamienna tym, że przeznaczona jest do podawania podskórnego, domięśniowego lub śródskórnego.
36. 36. Szczepionka przeciwko TNFa, znamienna tym, że zawiera kodującą zmodyfikowaną cząsteczkę ludzkiego TNFa określoną w zastrz. 1 wyizolowany DNA zawarty w odpowiednim wektorze ekspresyjnym.
37. 37. Szczepionka według zastrz. 36, znamienna tym, że zawiera konstrukt zawierający niezakaźną, nieintegrującą sekwencję DNA kodującą zmodyfikowaną cząsteczkę TNFa jak określono w zastrz. 1 operacyjnie związaną z sekwencją promotorową, która może kontrolować ekspresję tej sekwencji DNA u ludzi, w ilości wystarczającej aby nastąpiło pobranie wspomnianego konstruktu i nastąpiła ekspresja wystarczająca do wygenerowania przeciwciał neutralizujących przeciwko TNFa.
38. 38. Szczepionka według zastrz. 36, znamienna tym, że zawiera wirusowy wektor ekspresyjny.
39. 39. Szczepionka według zastrz. 38, znamienna tym, że jako wirusowy wektor ekspresyjny zawiera retrowirusowy wektor ekspresyjny.
40. 40. Szczepionka według zastrz. 36, znamienna tym, że przeznaczona jest do podawania pozajelitowego.
41. 41. Szczepionka według zastrz. 40, znamienna tym, że przeznaczona jest do podawania podskórnego, domięśniowego lub śródskórnego.
42. 42. Zastosowanie przynajmniej jednej zmodyfikowanej cząsteczki TNFajak określono w zastrz. 1, ewentualnie w kombinacji z odpowiednim adiuwantem lub cząsteczką nośnika, do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki przewlekłego zapalenia, nowotworu, kacheksji, stwardnienia rozsianego, cukrzycy, łuszczycy, osteoporozy lub astmy.