PL181713B1

PL181713B1 - Oxathiolanes, method of their production and pharmaceutical compounds containing them

Info

Publication number: PL181713B1
Application number: PL95312693A
Authority: PL
Inventors: Anne-Sophie Charvet-Faury; Michel Camplo; Jean-Louis Kraus
Original assignee: Laphal Laboratoires Sa
Priority date: 1994-05-24
Filing date: 1995-05-24
Publication date: 2001-09-28
Also published as: HUT75112A; CA2167930A1; FI960316A0; BR9506244A; PL312693A1; NO960272D0; FR2720397A1; FR2720397B1; CZ21996A3; KR100242891B1; RU2142462C1; WO1995032200A1; EP0733053A1; NZ287478A; US5708000A; AU688052B2; NO960272L; CN1080264C; AP612A; NO306299B1

Abstract

1 . Nowe zwiazki 5-(1-cytozynylo)-1,3-oksatiolanowe o konfiguracji cis (2R, 5S) lub (2S, 5R) 1 o ogólnym wzorze I, w którym R oznacza pirydynylokarbonyl, dihydropirydynylokarbonyl, chinolinylokarbonyl lub dihydro- chinohnylokarbonyl ewentualnie podstawione metylem, przy czym grupa hydroksymetylowa w pozycji 2 jest w polozeniu cis w stosunku do plaszczyzny okreslonej pozycjami 2 i 5, lub ich sól addycyjna z kwasem nieorgani- cznym (I) (1 ) ( 2) ( I a ) ( I b ) (Ic) ( I d ) ( I e ) ( I f ) PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe związki 5-(l-cytozynylo)-l,3-oksatiolanowe, w szczególności 2', 3'-didezoksynukleozydy podstawione w pozycji 2 pierścieniem 1,3-oksatiolanu, znajdujące zastosowanie jako środki lecznicze.

Infekcje retrowirusowe są przyczyną ciężkich chorób w szczególności nabytego zespołu niedoboru odporności (AIDS), który jest schorzeniem często śmiertelnym, oraz w mniejszym stopniu zapalenia wątroby. Do klinicznego leczenia schorzeń retrowirusowych stosuje się obecnie kilka związków typu nukleozydów lub heteronukleozydów. Sąto związki AZT (3'-azydo-2', 3 -didezoksytymidyna) (Pro. Natl. Acad Sci. 82. 7096-7100, 1985), ddC (2', 3'-didezoksycytydyna) (Proc. Natl. Acad. Aci. 86, 1911-15, 1986), d4T (2', 3'-didehydro-3'-dezoksytymidyna (Blochem. Biophys. Res. Coom. 142. 128-34, 1987), ddl (2'. 3'-didezoksyinozyna) (Antiviral. Chem. Chemother. 2,221,1991), BCH-189 lub 3TC (2', 3'-didezoksy-3'-diacytydyna) opisane w europejskim zgłoszeniu patentowym 903013357 i następnych. Ograniczona liczba tych antyretrowirusowych związków, będących do dyspozycji praktykującego lekarza i ich ograniczona skuteczność lecznicza wymaga poszukiwania nowych związków, których skuteczność lecznicza byłaby większa, a działanie wtórne zmniejszone.

Poznano już pochodne 2-[(l-hydroksymetylo)-l,3-oksatiolan-5-ylo]cytozyny, a zwłaszcza estry z grupąhydroksymetylową(europejskie zgłoszenie patentowe 0382526) lub pochodne chlorowcowane w pozycji 5' pierścienia pirymidynowego (R.F. Schinazi i in., Antimicrob. Agents and Chemoterapy, 36. (1992) 2423-2431).

Związki według wynalazku to nowe związki 5-(l-cytozynylo)-l ,3-oksatiolanowe o konfiguracji cis (2R, 5S) lub (2S, 5R) i o ogólnym wzorze I

NH--R

(I)

HO

w którym R oznacza pirydynylokarbonyl, dihydropirydynylokarbonyl, chinolinylokarbonyl lub dihydrochinolinylokarbonyl ewentualnie podstawione metylem, przy czym grupa hydroksyme181 713 tyłowa w pozycji 2 jest w położeniu cis w stosunku do płaszczyzny określonej pozycjami 2 i 5, lub ich sól addycyjna z kwasem nieorganicznym.

Związki te można przedstawić dwoma postaciami przestrzennymi o wzorze (1) i (2)

(1)

(2) w których R ma wyżej podane znaczenie.

Szczególnie korzystne są związki, w których R oznacza - grupę nikotynową o wzorze (la)

(la) w którym grupa karbonylowa jest w pozycji 3; - grupę dihydropirydynową o wzorze (Ib)

CO — (Ib) w którym R, oznacza metyl, a grupa karbonylowa jest w pozycji 3; - czwartorzędową grupę nikotynową o wzorze (Ic)

181 713

(Ic) w którym A oznacza halogenek, R, ma wyżej podane znaczenie i grupa karbonylowa jest w pozycji 3;

- grupę chinolinową o wzorze (Id)

(Id) w którym grupa karbonylowa jest w pozycji 3;

- grupę dihydrochinolinową o wzorze (le)

O

(le) w którym Ri ma wyżej podane znaczenie;

- czwartorzędowa grupę chinolinylową o wzorze (If)

w którym Ri ma wyżej podane znaczenie, grupa karbonylowa jest w pozycji 3 i A oznacza halogenek.

Szczególnie korzystnym związkiem jest cis 2-hydroksymetylo-5-[N⁴-(3-prydylokarbonylojcytozyn-1 '-y 1 o]-1,3-oksatiolan lub jego jodek.

Związki o wzorze I mogą występować jako izomery optyczne. W ten sposób otrzymuje się izomer (+) i izomer (-).

Związki według wynalazku posiadają własności hamowania replikacji retrowirusów ludzkich w szczególności VIH i wirusa zapalenia wątroby B (VHB). Związki te, pochodne BCH-189 lub 3TC, zawierają w swej strukturze jednostkę l,4-dihydro-l-metylo-3-chinolilokarbonylową związanąz egzocykliczną grupą aminową cytydyny. Ta szczególnajednostka strukturalna w farmakologii doświadczalnej nadaje właściwość zwiększenia i ułatwienia przechodzenia przez ba181 713 rierę krew-mózg (Pharmacol. Ther. 19, 337-396, 1983; Methods Enzymol. 112, 381-396, 1985; Drug. Des. Del. 1, 51-64 (1986); J. Med. Chem. 31, 244-249 (1988); J. Med. Chem. 32, 1782-1788, 1989; J. Med. Chem. 32, 1774-1781, (1989).

Chemiczną syntezę tych związków prowadzono, wychodząc z klasycznych wzorów doświadczalnych. Opracowanie tych nowych heteronukleozydów wymaga jako związku wyjściowego pochodnej 2', 3'-didezoksy-3'-tiacytydyny, której kilka metod syntezy opisano w literaturze chemicznej (J. Org. Chem. 56,6503,1991; J. Org. Chem. 57,2217,1992; Tet. Lett. 33, 4625, 1992; Nucleosides and Nucleotides, 12, 225, 1993).

W niniejszym zgłoszeniu patentowym opisano, wychodząc z tej pochodnej, syntezę związków będących przedmiotem niniejszego wynalazku oraz syntezę produktów pośrednich odnoszących się do nich.

Sposób otrzymywania związków o ogólnym wzorze I, polega na poddaniu cis-5-(l-cytozynylo)-l,3-oksatiolanu działaniu funkcjonalnej pochodnej kwasu karboksylowego o wzorze ROH, gdzie R oznacza pirydynylokarbonyl, dihydropirydynylokarbonyl, chinolinylokarbonyl lub dihydrochinolinylokarbonyl ewentualnie podstawione metylem.

Dokładniej funkcjonalna pochodna kwasu ROH jest halogenkiem.

Związki według wynalazku znajdujązastosowanie do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych o działaniu przeciwwirusowym, zawierających jako składnik aktywny co najmniej jeden związek o ogólnym wzorze I lub jedną z jego soli addycyjnych z kwasem mineralnym, w połączeniu lub mieszaninie z podłożem lub zaróbkąobojętną, nietoksyczną, farmaceutycznie zgodną zwłaszcza do użytku zewnętrznego lub ogólnego.

W kompozycjach tych zawartość składnika aktywnego o ogólnym wzorze I wynosi 0,1-100 mg w dawce jednostkowej zależnie od drogi podawania.

Przykład I.

Izomery cis-2-(difenylotert-butylo-sililoksymetylo)-5-[N⁴-(3-prydylokarbonylo)cytozyn-l'-ylo]-l,3-oksatiolanu 1.

Do mieszaniny dichlorometanu (7 ml) i dimetyloformamidu (2 ml) dodano w temperaturze pokojowej i w atmosferze azotu 1 równoważnik kwasu nikotynowego (27 mg, 0,21 mmola), 1,1 równoważnika BOP (93 mg, 0,23 mmola), 1,1 równoważnika HOBT (31 mg, 0,23 mmola), 1 równoważnik 5'tertbutylodifenylo-sililo-2',3'-didezoksy-3'-tiacytydyny (39 mg, 0,23 mmola), 4 równoważniki DIEA (146 μΐ, 0.84 mmola). Mieszaninę miesza się przez noc w temperaturze pokojowej, przemywa 5% roztworem kwasy cytrynowego (10 ml), a potem 5% wodnym roztworem kwaśnego węglanu sodu (10 ml). Uzyskanąmieszaninę ekstrahuje się octanem etylu (3x10 ml), suszy nad Na₂SO₄ i odparowuje. Pozostałość oczyszcza się na płytce z żelem krzemionkowym. Otrzymuje się 48 mg czystego związku.

[Ή] NMR: δ (CDC1₃) = 1,1 (s, 9H, tBu); 3,1-3,6 (m, 2H, CH₂-O); 3,7-4,2 (m, 2H, C₄H₂; 5,25(t, IH, C₅-H);3,l-3,6(m,2H, CH₂-O);5,5(d, 1H,C₅'-H); 6,35 (q, 1H,C₂-H);7,4-7,8(m, IH, aromatyczny); 8,0 (d, IH, C₆'-H); 8,3 (d, 1H, nikotynyl; 8,8 (d, IH, nikotynyl); 8,8 (d, IH,nikotyny!); 9,1 (d, IH, nikotynyl).

Przyk ład II

Izomery cis-2-(hydroksymetylo)-5-[N⁴-(3'’-piiydylokaibonylo)cytozyn-r-ylo]-l ,3-oksatiolanu 2

Związek 1 (25 mg 0,05 mmola) rozpuszcza się w 3 ml bezwodnego tetrahydrofuranu. Do tego roztworu dodaje się 3 równoważniki (135 μΐ, 0,15 mmola) fluorku tetrabutyloamoniowego. Roztwór miesza się w temperaturze pokojowej w ciągu 3 godzin. Po odparowaniu rozpuszczalnika uzyskany produkt chromatografiije się na płytce z krzemionką preparatywną (eluent: toluen/CH₃OH 15%). Wyodrębnia się 13 mg żądanego związku.

[Ή]NMR: δ(CDC1₃) = 3,1 -3,6 (m, 2H, CH₂-O); 3,7-4,2 (m, 2H, C₄H₂); 5,25 (t, 1H, C₅-H); 5,5 (d, H, C₅'-H); 6,35 (q, 1H, C₂-H); 7,4-7,8 (m, 1H, aromatyczny); 8,0 (d, 1H, C₆'-H); 8,3 (d, 1H, nikotyny)); 8,8 (d, IH, nikotynyl); 9,1 (s, IH, nikotynyl).

Przykład III

Izomery cis-2-(tert-butylodifenylosililoksymetylo)-5-[N⁴-(3tosylo)cytozyn-l'-ylo]-l ,3-oksatiolanu 4

Do roztworu pochodnej 5 (56 mg 0,12 mmola) w pirydynie (3 ml) dodaje się w temperaturze 60°C i w atmosferze azotu 2 równoważniki chlorku kwasu p-toluenosulfonowego (46 mg, 0,24 mmola) Po 20 godzinach mieszania w temperaturze pokojowej mieszaninę odparowuje się

181 713 do sucha, przemywa 5% roztworem kwasu cytrynowego (10 ml) , po czym ekstrahuje się octanem etylu (13x10 ml). Połączone fazy organiczne suszy się nad Na₂SO₄ i odparowuje. Wyodrębnia się 48 mg żądanego produktu.

[‘H]NMR: δ (CDC1₃) = 1,1 (s, 9H, tbu); 2,45 (s, 3H, CH₃ tosyl); 3,15-3,55 (m, 2H, C₂-CH₂-O); 3,85-4,2 (m,2H, C₄H₂);5,25 (t, 1H,C₅-H); 6,3 (t, 1H,C₂-H); 7,3-7,7 (m, 14H,ArH); 8,05 (d, 1H, C₆'-H);

Przykład IV

Izomery cis-2-(difenylotert-butylosililoksymetylo)-5-[N⁴-(3tosylo)cytozyn-l'-ylo]-l ,3-oksatiolanu 1

Do roztworu pochodnej 4 (47 mg, 0,075 mmola) w lutydynie (2 ml) dodaje się w temperaturze 90°C i w atmosferze azotu 6 równoważników (46 μΐ, 0,45 mmola) pirydynylometyloaminy. Ogrzewanie utrzymuje się w ciągu 48 godzin przy mieszaniu. Po ochłodzeniu mieszaninę odparowuje się, przemywa 5% roztworem kwasu cytrynowego (10 ml), po czym ekstrahuje się octanem etylu (3x10 ml) i suszy nad Na₂SO₄. Po odparowaniu pozostałość oczyszcza się przez chromatografie na płytce z żelem krzemionkowym (eluent: 20 EtOAC/MeOH, 10/1).

Przykład V

Izomery cis-2-(tert-butylodifenylosililoksymetylo)-5-(cytozyn-l'-ylo)-1,3-oksatiolanu 5

Na roztwór 2', 3'-didezoksy-3'-tiacytydyny (105 mg, 0,45 mmola) w pirydynie (6 ml działa się w atmosferze azotu chlorkiem difenylotert-butylosililu (140 μΐ, 0,5 mmola). Mieszaninę reakcyjną miesza się w ciągu 24 godzin w temperaturze pokojowej. Po zatężeniu pod zmniejszonym ciśnieniem dodaje się 30 ml wody i ekstrahuje octanem etylu (3 x 20 ml). Połączone fazy organiczne suszy się wtedy nad Na₂SO₄ i zatęża do sucha, uzyskując związek 5 (210 mg, wydajność ilościowa) w postaci białego ciała stałego. Rf(AcOEt/MeOH 2/1) = 0,62

['H]NMR: δ (CDC1₃) = 1,1 (s, 9H, tbu); 3,1-3,6 (m, 2H, C₂-CH₂-O); 3,7-4,2 (m, 2H, C₄H₂); 5,25 (t, 1H, C₅-H); 5,5 (d, H, C5'-H); 6,35 (q, 1H, C₂-H); 7,4-7,8 (m, 1 OH, 2Ph); 8,0 (d, 1H, C6'-H).

Przy kład VI

Izomery jodu cis-2-(hydroksymetylo)-5-[N⁴-r-metylo-3''-pirydynylokarbonylo)cytozyn-l'-ylo]-l,3-oksatiolanu 6

Do 1 równoważnika (46 mg, 0,14 mmola) związku 2 rozpuszczonego w 4 ml bezwodnego acetonitrylu dodaje się w atmosferze azotu 9 równoważników (1,25 mmola, 77 μΐ) jodku metylu. Uzyskany roztwór ogrzewa się w temperaturze 50°C w ciągu 48 godzin. Po odparowaniu rozpuszczalników pozostałość oczyszcza się przez chromatografię rzutową, stosując jako eluent BuOH/H₂O/ kwas octowy (5:2, 5:2,5).

Otrzymuje się ciało stałe barwy żółtej (55 mg).

[’H]NMR: Ó(DMSOd₆) = 3,25 (t, 2H, CH₂-4); 3,90 (dd, 2H, C₂CH₂); 4,45 (s, 3H, N⁺-CH₃); 5,25 (t, 1H, CH-5); 6,30 (t, 1H, CH-2); 6,92 (d, 1H, CH-6'); 7,30 (d, 1H, nikotynyl); 7,85 (d, 1H, nikotyny!); 8,05 (d, 1H, CH-5'); 8,20 (d, 1H, nikotynyl); 7,85 (d, 1H, nikotynyl); 9,01 (d, 1H, nikotynyl).

Widmo masowe: (FAB⁺) 349 (M-l)⁺.

Przykład VII

Izomery cis-2-(hydroksymetylo)-5-[N⁴-(l-metylo-r, 4''-dihydro-3-pirydynylokarbonylo)cytozyn-1 '-ylo]-1,3-oksatiolanu 7 mg (0,06 mM związku 6 rozpuszcza się w 3 ml odgazowanego roztworu metanolu, zawierającego 10% wody. Do tego roztworu dodaje się 15 mg kwaśnego węglanu sodu i 60 mg podsiarczynu sodu. Mieszaninę reakcyjną miesza się w atmosferze azotu w ciągu 3 godzin i roztwór staje się pomarańczowy. Odparowuje się rozpuszczalnik, po czym zawiesza się sole w minimalnej ilości metanolu i sączy. Przesącz oczyszcza się przez chromatografię preparatywnąw cienkiej warstwie (1 mm). (Eluent: toluen/metanol, 1:1), uzyskując 6 mg biało-żółtego ciała stałego.

SM: (FAB⁺) 349(M-1)⁺.

Przykład VIII

Izomery cis-2-(hydroksymetylo)-5-[N⁴-(3'’, chinolinokarbonylo)cytozyn-1'ylo]-l,3-oksatiolanu 8

Do 2 ml bezwodnego dimetyloformamidu dodaje się 74,4 mg (0,43 mmola) kwasu

3-chinolinokarboksylowego, następnie 96 mg (0,47 mmola) 1,3-dicykloheksylokarbodiimidu oraz 63,4 mg (0,47 mmola) wodzianu hydroksybenzotriazolu. Mieszaninę miesza się w ciągu

181 713 godziny w temperaturze pokojowej w atmosferze azotu. Pojawia się biały osad dicykloheksylomocznika i dodaje się wtedy 100 mg (0,43 mmola) 2,3'-didezoksy-3'-tiacytydyny. Mieszaninę miesza się przez noc, po czym dimetyloformamid odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość hydrolizuje się nasyconym wodnym roztworem NaCl (10 ml). Pozostałość ekstrahuje się dwukrotnie octanem etylu (2x10 ml). Fazy organiczne łączy się, suszy nad siarczanem magnezu i sączy. Rozpuszczalnik odparowuje się, a produkt oczyszcza się przez chromatografię rzutową. (Eluent: octan etylu/metanol, 98:2). Otrzymuje się 78 mg białego ciała stałego (0,2 mmola) z wydajnością 46,5%.

PF=116-118°C; IR=1656 cm’¹ (karbonyl z grupą amidową).

[¹ H]NMR: δ (DMSOd₆) = 11,75 (s, 1H, NH); 9,40 (d, 1H, CH-2); 9,15 (d, 1H, CH-4); 8,65 (d, 1H, CH-5); 8,20 (m, 2H, CH-8' i -CH-5); 8,0 (m, 1H, CH-6’); 7,80 (m, 1H, CH-7’); 7,45 (d, 1H, CH-6'); 6,35 (t, 1H, CH-2); 5,55 (t, 1H, CH-5); 3,98 (t, 2H, C2-CH2-4);

[^l3C]NMR: δ (DMSOd₆) = 37,14 (C-4); 61,95 (CH₂-C2); 87,28 (C-2); 88,28 (C-5); 95,85 (C-5); 122,21 (C-3); 126,28 (C-6); 127,71 (C-5'); 129,63 (C-10'); 129, 87 (C-7’); 132,08 (C-8’); 137,65 (C-4’); 138,89 (C-6); 148,91 (C-9); 149,29 (C-2); 163,16 (C-2); 164,51 (C-4).

Widmo masowe: (FAB⁺) 385 (M+l)⁺, 7,69 (2M+1)⁺.

Przykład IX

Izomery jodku cis-2-hydroksymetylo-5-[N⁴-(l’-metylo-3, chinolinokarbonylo)cytozyn-l'-ylo]-l,3-oksatiolanu 9.

Sporządza się roztwór związku 8 (78 mg lub 0,20 mmola) w 4 ml acetonitrylu. Dodaje się 122 μΐ (1,8 mmola) jodku metylu i mieszaninę ogrzewa się w temperaturze 40°C i w atmosferze azotu w ciągu 24 godzin. Odpędza się rozpuszczalnik i surową pozostałość rozpuszcza się wówczas w minimalnej ilości acetonitrylu. Wytrąca się ja dodając eter. Otrzymuje się w ten sposób ciało stałe barwy pomarańczowej (60 mg) z wydajnością 55%.

PF= 156-159°C

[‘H]NMR: δ (CD₃OD) = 3,32 (t, 2H, CH₂-4); 3,99 (dd, 2H, CH₂CH₂); 4,80 (s, 3H, ⁺N-CH₃); 5,38 (t, 1H, CH-5); 6,0 (t, 1H, CH-6); 6,33 (t, 1H, CH-2); 8,13 (m, 1H, CH-7’); 8,39 (m, lH,CH-6'); 8,60 (m, 2H, CH-8); 8,72(d, 1H, CH-5); 9,79 (d, 1H, CH-4’); 9,95 (d, 1H, CH-2’).

Widmo masowe: (FAB⁺) 399 (M-l)⁺, 799[2(M-1)]⁺.

Przykład X

Izomery cis-2-hydroksymetylo-5-[N⁴-(l-metylo-l’, 4-dihydro-3’-chinolinylokarbonylo)cytozyn-l'-ylo]-l,3-oksatiolanu 10

Do roztworu 30 mg (0,057 mmola) związku 9 w 3 ml odgazowanego wodnego roztworu metanolu (3 ml zawierają 10% wody) dodaje się 15 mg kwaśnego węglanu sodu i 60 mg podsiarczynu sodu. Mieszaninę miesza się w ciągu jednej godziny w atmosferze azotu. Odparowuje się rozpuszczalnik i surową pozostałość oczyszcza się przez chromatografię preparaty wną (eluent: octan etylu/metanol, 1:1). Ostatecznie otrzymuje się 10 mg szklistego ciała stałego barwy żółtej z wydajnością46%.

['H]NMR: δ(D₂O) = 3,24 (m, 3 + 2H, NCH₃+CH₂-4’); 3,48 (m, 2H, CH₂-4); 3,93 (m, 2H, C₂H₂); 5,29 (t, 1H, CH-5); 6,96 (d, 1H, CH-6); 7,13 (m, 2H, CH-6' + CH-7’); 7,27 (m, 2H, CH-5’ + CH-8’); 7,45 (d, 1H, CH-2’); 8,23 (d, 1H, CH-5’)

Widmo masowe: (FAB⁺) 399 (M-l)⁺.

P r z y k ł a d XI

Izomery cis-2-hydroksymetylo-5-[N⁴-(2-(a,a,a-trifluoro-m-toluidyno)nikotynylo)cytozyn- l'-ylo]-l,3-oksatiolanu 11

Do roztworu 2', 3'-didezoksy-3'-tiacytydyny (50 mg, 0,2 mmola) w 5 ml bezwodnego DMF dodaje się 1 równoważnik BOP (93 mg 0,23 mmola), 1 równoważnik kwasu niflumowego (kwasu 2-(a,a,a-tnfluoro-m-toluidyno)nikotynowego) i równoważniki DIEA (146 μΐ, 0,84 mmola). Mieszaninę miesza się przez noc w temperaturze pokojowej, przemywa 5% roztworem kwasu cytrynowego (10 ml), a następnie 5% wodnym roztworem kwaśnego węglanu sodu (10 ml). Uzyskaną mieszaninę ekstrahuje się octanem etylu (3x10 ml), suszy nad siarczanem sodu, po czym odparowuje. Pozostałość oczyszcza się przez chromatografię na kolumnie z żelem krzemionko

181 713 wym (eluent: octan etylu/toluen, 1:9). Otrzymuje się białe ciało stałe (49 mg, wydajność 48%). Test oceny właściwości przeciwwirusowych

Testy anty-HIV

a) Dane ogólne Aparatura: stosowano ultrawirówkę typu Beckman TL 100.

Liczenie cząstek radioaktywnych prowadzono w aparacie Hawlett-Packard Tri-Carb Model 1600. Syncytia obserwowano w mikroskopie odwrotnym Labovert.

Skład buforu do lizy NTE: Trihydroksymetyloaminometan (10 mM); NaCl (100 mM); EDTA (1 mM).

b) testy oceny właściwości przeciwwirusowych w hodowli komórkowej. Ocena działania przeciwwirusowego opiera się na badaniu działania cytopagennego wirusa VIH-1 z linii komórkowej MT4. Linia MT4 pochodzi z komórek T, uzyskanych od pacjenta, przekształconych przez wirus VTLH-1. Działanie cytopatogenne wirusa VIH-1 przejawia się tworzeniem komórek olbrzymich wielojądrowych, nazwanych „syncitia”, widzialnych pod mikroskopem. Takie działanie VIH-1 obserwuje się 4-5 dni po zakażeniu; po nim następuje śmierć komórek.

Działanie cytopatogenne koreluje się bezpośrednio z zakażeniem komórek wirusem z jego replikacją wewnątrzkomórkową i z ekspresją antygenów wirusa przez komórki. Inhibicja tego działania odpowiada więc inhibicji powielania wirusa VIH-1.

Komórki MT4 utrzymuje się w ilości 3x105 komórek/ml w środowisku RPMI 1640:10% surowica z płodu cielęcego pozbawiona dopełniacza (hormony, surowicze czynniki wzrostu...) w ciągu 30 minut w temperaturze 56°C, 1 % glutamina, 1% penicylina, streptomycyna, 2 μΐ./ml środka o nazwie polyrene, który sprzyja adhezji wirusa do komórek.

Działanie lecznicze środka przeciwwirusowego jest stałe. Istotnie jest on obecny przed, w czasie i po infekcji wirusowej. Kolejne rozcieńczenia prowadzi się w 10% surowicy z płodu cielęcego, aby umożliwić hodowlę MT4 w ciągu 8 dni o obserwacje tworzenia syncytiów.

Test MT4:

Przed zakażeniem: 3 χ 10⁶ komórek/100 μΐ nanosi się na mikropłytkę o 96 otworach i odwirowuje się 3 minuty przy 2000 obrotów/minutę. Osad wtedy inkubuje się wstępnie w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C ze 100 μΐ środka przeciwwirusowego do zbadania o różnych stężeniach.

Zakażenie: zakażenie wykonuje się w mikrootworach, dodając 100 TCIU (jednostki zakaźne) wirusa V1H-1 (to miano VIH-1 określa się w celu wywołania tworzenia się syncitów w ciągu 4 do 5 dni). Środek przeciwwirusowy jest zawsze obecny podczas zakażenia i rozcieńczenia wirusa o 100 TCIU.

Po zakażeniu: po inkubacji 1 godziny w temperaturze 37°C MT4 przemywa się 3 razy RPMI 1640 i wprowadza się do hodowli w ilości 3 χ 10^s komórek/mililitr przy każdym ze stężeń związków do zbadania na płytkach o 24 otworach. Podczas pasażu prowadzonego do dnia J3 komórki MT4 rozcieńcza się o 1/3, a stężenie środka przeciwwirusowego utrzymuje się. Każdego dnia pojawienie się syncytiów obserwuje się pod mikroskopem, aby wykryć ewentualne opóźnienie w stosunku do kontrolnego VIH-1. W J8 prowadzi się oznaczenie odwrotnej transkryptazy. Jeśli komórki nie są zakażone, dzieje się to wtedy, gdy chroni je badany środek przeciwwirusowy.

Oznaczenie odwrotnej transkryptazy:

Odwrotna transkryptaza jest polimeraząDNA zależna od RNA. Enzym ten pozwala na replikację retrowirusa. Dzięki niemu RNA wirusa skopiowany na DNA włącza się do genomu komórki. DNA prowirusa transkrybuje się przez enzymy komórki do RNA wirusa. Aby oznaczyć aktywność odwrotnej transkryptazy zatęża się 100 razy 1 ml supematantu hodowli przez ultrawirowanie w ciągu 5 minut przy 95000 obrotów/minutę; osad wirusów otrzymany po ultrawirowaniu zawiesza się w 10 μΐ buforu NTE+0,1% Triton (eter polioksyetylenowy); służy to do lizy wirusa i do uwolnienia odwrotnej transkryptazy. In vitro ukazuje się właśnie aktywność odwrotnej transkryptazy. Enzym ten użytkuje syntetyczną matrycę poli A, posiadającą inicjator oligo dT, mającą inicjator oligo dT, mającą 12-18 reszt. Radioaktywnym substratem tej reakcji jest [³H] dTTP (radioaktywny tymidynotrifosforan o 1 mCi/ml; nowotworowe makrocząsteczki, zawierające tryt, wtrąca się kwasem trichlorooctowym i oddziela się od wolnego [³H]TTP przez filtrację. Aktwyność enzymatyczną odwrotnej transkryptazy mierzy się radioaktywnością nadaną

181 713 kompleksom poli-rA/poli-dT. Radioaktywność tę oznacza się w liczniku cząstek po dodaniu płynu scyntylacyjnego spełniającego funkcję wzmacniacza.

Test anti-HBV

Spośród różnych metodologii stosowanych do oceny aktywności związków wobec wirusa zapalenia wątroby B (VHB) użyto modelu wirusa zapalenia wątroby B kaczki (Duck HBV) (J. Med. Virology, 1990,31,82-89; Viral Hepatitis and Liver Disease, 1988, 506-509; Hepatology, 1989, 10, 186-191). Materiałem hodowlanym do badania „in vitro aktywności anty-VHB związków stanowią komórki wątroby kaczki, zakażone wirusem zapalenia wątroby B kaczki (DHBV), (Antimicrob. Agents Chemother. 1989,33,336-339; J. Med. Virology 40,59-64; Antivir. Res. 1993,21,155-171; Antimicrob. Agents Chemother 1993, 37, 1539-1542). Istotnie wirus zapalenia wątroby B kaczki jest znany jako bardzo bliski wirusowi zapalenia wątroby B u ludzi (Viral Hepatitis and Liver Disease, 1988, 526-529; Antiviral Research, 1987, 8 189-199). W warunkach standaryzowanych (Virology, 1989,171,564-572) hodowla komórek wątroby kaczki pozwala na całkowitą replikację DHBV. Aktywność przeciwwirusową związków badanych mierzy się jako funkcję ilości DNA wirusa wytworzonego w ciągu 10 dni hodowli zakażonych komórek wątroby.

Trzytygodniowe kaczątko zarażone DHBV służy do wytworzenia komórek wątroby. Kaczkę zabija się pod narkozą i wyodrębnia się komórki wątroby według metodologii Guillouzou (Research in isolated and cultured hepatocytes, J. Libbey Eurotex Ltd/INSERM, 1986). Komórki zawiesza się w środowisku Leibowitza i dodaje się 5 pg/ml insuliny bydlęcej, 7 x 10'⁵ mola hemibursztynianu hydrokortyzonu i 1,5% DMSO. Gęstość komórek wynosi 8 χ 10⁶ komórek naniesionych na płytki do posiewów o 100 x 2 mm. Związki badane dodaje się do hodowli po wykonaniu rozmazu komórek. Środowisko zmienia się każdego dnia w ciągu 10 dni. Wytworzenie wirusowego DNA wirusa zapalenia wątroby B kaczki w supematancie komórek ocenia się metodą krzyżowania „Dot Biot” według Fourela i in., (Viral Hepatitis and Liver Disease, 1988, 506-509; Hepatology, 1989,10,186-191). Inhibicja wyraża się wprocentach ilości DNA obecnego w supematancie komórek w stosunku do hodowli zakażonej DHBV, której nie potraktowano pochodną nukleozydu.

Wyniki wirusologiczne

Testy HIV:

Związki, których syntezę opisano w niniejszym zgłoszeniu patentowym i struktury podane w opisie według dotychczasowego stanu techniki mają działanie hamujące replikację wirusa H1V=1 BRU (BRU: doświadczalny szczep wirusów) w przypadku, gdy zakażone komórki są typu MT4.

W tabeli I opisano wyniki testów. Kolumna 1 podaje nazwę najbardziej reprezentatywnych badanych związków, a w kolumnie 2 umieszczono wartości zwane IC₅₀ (stężenie związków, powodujące 50% inhibicji replikacji wirusa HIV w zakażonych komórkach MT4 mierzonej w dniu J7 po zakażeniu). Wartość IC₅₀ określa się, obserwując i licząc ilość utworzonych syncytiów w stosunku do ilości policzonej w przypadku komórek MT4 zakażonych ale nie potraktowanych związkiem przeciwwirusowym.

Testy DBHV:

Opisane związki najbardziej reprezentatywne przetestowano pod względem ich działania na replikację wirusa Duck HBV (DHBV) według protokołu, przedstawionego w części eksperymentalnej tego dokumentu.

W tabeli II opisano wyniki testów.

Skróty:

AcOET : octan etylu

DNA : kwas dezoksyrybonukleinowy

APTS : kwas p-toluenosulfonowy

RNA : kwas rybonukleinowy

AZT . 3'-azydo-2', 3'-didezoksytymidyna lub Zidovudine

BOP : heksafluorofosforan benzotriazoliloksytridimetyloaminofosfoniowy

CCM : chromatografia cienkowarstwowa

181 713

DCC DCU DIEA DMF DHBV FAB^{+ 3}HdTTP HOBT IR PF NMR AIDS SM TBAF TBDPSC1 3-TC

N,N'-dicykloheksylokarbodiimid N,N'-dicykloheksylomocznik N,N-diizopropylo-N-etyloamina N,N-dimetyloformamid Duck hepatitis B virus „Fast positiv Atomie Bombardment” Radioaktywny tymidynotrifosforan o 1 mCi/ml 1 -hydroksybenzotriazol podczerwień temperatura topnienia jądrowy rezonans magnetyczny nabyty zespół niedoboru odporności spektrometria masowa fluorek tetrabutyloamoniowy chlorek tetrabutylodifenylosililowy (-)-(2R, 3S)-2-hydroksymetylo-5-(cytozyn-l'-ylo)-l ,3-oksatiolan lub Lamivudine

TCIU THF TPM TsCl uv VIH VHB VTLH

jednostki zakaźne tetrahydrofuran obroty na minutę chlorek tosylu ultrafiolet wirus braku odporności u ludzi wirus zapalenia wątroby B wirus komórek T limfotropowych u ludzi

Tabela I

Wpływ nukleozydów według wynalazku na inhibicję replikacji wirusa HIV-1 wyrażony jako suma IC₅₀

Związki nr	IC,₀
9	>100 μΜ
10	1-10 μΜ
8	ΙΟμΜ
2	0,1-1 μΜ
11	<100μΜ
BCH-189 produkt odniesienia	1 μΜ

Tabela II

Wpływ nukleozydów według wynalazku na inhibicję replikacji wirusa DHBV

Związki nr	ICso
BCH-189 związek odniesienia	1 ± 0,5 μΜ
2	2 ± 0,5 μΜ
8	2 μΜ
9	2 μΜ
10	2 μΜ

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1 i nową o wzorze (Id) O

(Id) w którym grupa karbonylowa jest w pozycji 3.

(1) w którym R ma wyżej podane znacznie.

1. Nowe związki 5-( 1 -cytozynylo)-1,3-oksatiolanowe o konfiguracji cis (2R, 5S) lub (2S, 5R) i o ogólnym wzorze I

HO

w którym R oznacza pirydynylokarbonyl, dihydropirydynylokarbonyl, chinolinylokarbonyl lub dihydrochinolinylokarbonyl ewentualnie podstawione metylem, przy czym grupa hydroksymetylowa w pozycji 2 jest w położeniu cis w stosunku do płaszczyzny określonej pozycjami 2 i 5, lub ich sól addycyjna z kwasem nieorganicznym.

(2) w którym R ma wyżej podane znaczenie.

181 713

2. Związki według zastrz. 1 o konfiguracji (2R, 5S) i wzorze ogólnym (1)

NH--R

3. Związki według zastrz. 1 o konfiguracji (2S, 5R) i wzorze ogólnym (2)

4. Związki o wzorze (I) według zastrz. 1, albo 2, albo 3, w których R oznacza grupę nikoty nową o wzorze (la)

(la) w którym grupa karbonyIowa jest w pozycji 3.

5. Związki o wzorze (I) według zastrz. 1, albo 2, albo 3, w których R oznacza grupę dihy- dropirydynową o wzorze (Ib)

(Ib) w którym R] oznacza metyl, a grupa karbonylowa jest w pozycji 3.

6. Związki o wzorze (I) według zastrz. 1, albo 2, albo 3, w których R oznacza czwartorzędową grupę nikotynową o wzorze (Ic)

(Ic) w którym A oznacza halogenek, R, ma wyżej podane znaczenie i grupa karbonylowa jest w pozycji 3.

7. Związki o wzorze (I) według zastrz. 1, albo 2, albo 3, w których R oznacza grupę chino-

8. Związki o wzorze (I) według zastrz. 1, albo 2, albo 3, w których R oznacza grupę dihydrochinolinową o wzorze (le)

O

(le) w którym R! ma wyżej podane znaczenie.

9. Związki o wzorze (I) według zastrz. 1, albo 2, albo 3, w których R oznacza czwartorzędową grupę chinolinową o wzorze (If)

181 713

w którym R, ma wyżej podane znaczenie, grupa karbony Iowa jest w pozycji 3 i A oznacza halogenek.

10. Związek według zastrz. 1, którym jest cis 2-hydroksymetylo-5-[N⁴-(3-pirydylokarbonylo)cytozyn- Γ-ylo]-1,3-oksatiolan lub jego jodek.

* * *