PL171150B1

PL171150B1 - Sposób rozdzielania racemicznej mieszaniny enancjomerów nukleozydu PL PL

Info

Publication number: PL171150B1
Application number: PL92310211A
Authority: PL
Inventors: Dennis C Liotta; Raymond F Schinazi; Woo-Baeg Choi
Original assignee: Univ Emory
Priority date: 1991-07-26
Filing date: 1992-02-20
Publication date: 1997-03-28

Abstract

1. Sposób rozdzielania racemicznej mieszaniny enancjomerów nukleozydu polegajacy na poddawaniu mieszaniny racemicznej dzialaniu enzymu, znamienny tym, ze jako enzym, który wybiórczo katalizuje reakcje z jednym enancjomerem, stosuje sie enzym wybrany z grupy obejmujacej esteraze, lipaze, substylizyne, a-chymotrypsyne oraz dezaminaze cyty- dynowo-dezoksycytydynowa. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób rozdzielania mieszaniny enancjomerów nukleozydu, a zwłaszcza biologicznie czynnego nukleozydu 2-hydroksymetylo-5-(5-fuorocytozynvlo-1)1,3-oksatiolanu. Nukleozyd ten znajduje zastosowanie w leczeniu zespołu nabytego braku odporności (AIDS).

W 1981 r zidentyfikowano zespół nabytego braku odporności (AIDS) jako chorobę, która upośledza ludzki układ odpornościowy i która prawie bez wyjątku prowadzi do śmierci. W 1983 r. ustalono etiologię AIDS, wykazując, że przyczyną tej choroby jest wirus niedoboru odpornościowego u ludzi (HTV). W grudniu 1990 r Światowa Organizacja Zdrowia oceniła, ze 8 do 10 milionów ludzi na święcie jest zakażonych wirusem HIV, z tej liczby 10000001400000 w Stanach Zjednoczonych Ameryki. W 1985 r. doniesiono, ze syntetyczny nukleozyd, 3'-azydo-3'-dezoksytymidyna (AZT) hamuje rozmnażanie wirusa niedoboru odpornościowego u ludzi. Od tego czasu stwierdzono, że szereg innych syntetycznych nukleozydów, w tym 2',3'-dwudezoksyinozyna (DDI), 2',3'-dwudezoksycytydyna (DDC), 3'-fluoro-3'-dezoksytymidyna (FLT) i 2',3'-dwudezoksy-2',3'-dwudehydrotymidyna (D4T), wykazuje aktywność przeciw HIV. Stwierdzono, że wiele innych 2',3'-dwudezoksynukleotydów hamuje wzrost różnych wirusów in vitro. Wydaje się, ze powyższe syntetyczne nukleozydy po fosforylacji w komórce do 5-trójfosforanu przez komórkowe kinazy są wbudowywane w rosnący łańcuch DNA wirusa i powodują zakończenie wzrostu łańcucha ze względu na brak grupy 3'-hydrokyslowej.

Skuteczne hamowanie przez różne 2',3'-dwudezoksynukleozydy replikacji HIV in vivo lub in vitro skłoniło wielu badaczy do syntetyzowania i testowania nukleozydów, w których atom węgla w pozycji 3' nukleozydu zamiemono na heteroatom. Norbeck i wsp. podają, ze (±)-1-[(2β, 4p)-2-(hydroksymetylo)-4-dioksolanyloj-tymina (określana jako (±)-dioksolano-T) wykazuje umiarkowaną aktywność wobec HIV (EC50 = 20 gm w komórkach ATHS) i nie jest toksyczna dla niezakażonych kontrolnych komórek w stężeniu 200 mM. Tetrahedron Letters, 30 (46), 6246 (1989) W opublikowanym europejskim zgłoszeniu patentowym nr 0 337 713 i opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 041 449 (iAF BioChem International, Inc ) ujawniono 2- i 4-podstawione 1,3-dioksolany wykazujące aktywność przeciwwirusową

W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 047 407 i w europejskiej publikacji zgłoszenia patentowego nr 0 382 526 (także IAF BioChem International, Inc.) ujawniono szereg nukleozydów 2- i 5-podstawionych 1,3-oksatiolanow oraz podano, że mieszanina racemiczna (w pozycji C4') izomeru CT-β 2-hydroksymetylo-5-(cytozynylo-1)1,3-oksatiolanu (nazywanego dalej (±)-BCH-189) wykazuje w przybliżeniu taką samą aktywność wobec HIV jak AZT i nie wykazuje toksyczności komórkowej przy testowanych poziomach Stwierdzono także, że (±)-BCH-189 hamuje in vitro replikowanie opornych na AZT izolatów HIV od pacjentów, którym podawano AZT dłużej niż 36 tygodni.

Innym wirusem, który stwarza poważne problemy zdrowotne jest wirus zapalenia wątroby B (określany dalej jako HBV). HBV jest drugą po tytoniu przyczyną raka u ludzi. Mechanizm wywoływania raka przez HBV nie jest znany, ale postuluje się, ze może on bezpośrednio wywoływać rozwój nowotworu albo działać pośrednio poprzez przewlekłe zapalenie, marskość wątroby oraz regenerację komórek związaną z infekcją.

Po upływie 2 do 6 miesięcznego okresu wylęgania, w którym gospodarz jest nieświadomy infekcji, zakażenie HBV może prowadzić do ostrego zapalenia wątroby i jej uszkodzenia, wynikiem czego jest ból brzuszny, żółtaczka i podwyższone poziomy we krwi pewnych enzymów. HBV może wywoływać zapalenie wątroby o gwałtownym przebiegu, szybko postępującą i często śmiertelną postać choroby, w której duże fragmenty wątroby ulegają zniszczeniu.

Pacjenci na ogół odzyskują zdrowie po ostrym zapaleniu wątroby, u niektórych jednak utrzymują się we krwi wysokie poziomy antygenu wirusa w ciągu przedłużonego lub nieokreślonego okresu czasu, wywołując przewlekłą infekcję. Chroniczne zakażenia mogą prowadzić do chronicznego zapalenia wątroby. Pacjenci zakażeni chronicznie utrzymującym się HBV występują najczęściej w rozwijających się krajach. W połowie roku 1991 było w przybliżeniu 225 _milionów chronicznych nosicieli HBV tylko w Azji, a w całym świecie prawie 300 milionów _nosic_ieli. Chroniczne zapalenie wątroby może wywoływać zmęczenie, marskość wątroby oraz raka wątrobowo-komórkowego, głównego raka wątroby.

W _zachodnich uprzemysłowionych krajach do grupy wysokiego ryzyka zakażenia HBV należą stykający się z nosicielami HBV lub próbkami ich krwi. Epidemiologia HBV jest bardzo podob_na do epidemiologii zespołu nabytego niedoboru odpornościowego, co tłumaczy dla4

171 150 czego zakażenie HBV jest pospolite wśród pacjentów z AIDS lub pokrewnym kompleksem. Jednak, HBV jest bardziej zaraźliwy niż HIV.

Dla uodporniania pacjentów wobec HBV wynaleziono szczepionkę pochodzącą z surowicy krwi ludzkiej. Chociaż stwierdzono, że jest ona skuteczna, to wytwarzanie jest kłopotliwe, gdyż ilość surowicy krwi ludzkiej od chronicznych nosicieli jest ograniczona, a oczyszczanie jest długie i kosztowne.

Ponadto, każda szarża szczepionki przyrządzona z różnych surowic musi być testowana na szympansach dla zapewnienia bezpieczeństwa. Szczepionki są także wytwarzane drogą inżynierii genetycznej. Codzienne podawanie a-interfemonu, genetycznie skonstruowanego białka, wygląda także obiecująco. Jednakże, do dzisiaj nie jest znany środek farmaceutyczny, który skutecznie hamuje rozmnażanie wirusa.

Aby nukleozyd mógł być wprowadzony na rynek do celów farmaceutycznych musi być on nie tylko skuteczny i mało toksyczny, ale także opłacalny w wytwarzaniu. Prowadzone są intensywne badania zmierzające do opracowania nowych, opłacalnych sposobów wytwarzania nukleozydu 2',3'-dwudezoksynukleozydy są obecnie wytwarzane jednym z dwóch sposobów: pierwszy to otrzymywanie pochodnych kompletnych nukleozydów, drugi - kondensacja pochodnej reszty podstawionej pochodnej cukrowej z zasadą heterocykliczną.

Chociaż z otrzymywaniem nowych nukleozydów drogą modyfikacji kompletnych nukleozydów są związane liczne niedogodności, to główną zaletą tego podejścia jest to, że utrzymuje się odpowiednią absolutną stereochemię naturalnego produktu. Jednak takie podejście nie może być stosowane w przypadku wytwarzania nukleozydów, które zawierają me występujące w naturze zasady lub reszty węglowodanowe i które tym samym nie mogą być otrzymywane z kompletnych nukleozydów, takich jak nukleozydy 1,3-oksatiolanowe i 1,3-dioksolanowe.

Gdy kondensuje się resztę węglowodanową lub węgfowodanopodobną z zasadą heterocykliczną w celu otrzymania syntetycznego nukleozydu, wytworzony nukleozyd posiada dwa chiralne centra (przy Cl' i C4') i występuje w postaci pary diastereomerów. Każdy diastereomer istnieje w postaci pary enangomerów. Produkt jest więc mieszaniną czterech enanqomerów.

Często stwierdza się, że nukleozydy o stereochemii innej niż w produktach naturalnych, w pozycji Cl' lub C4', są mniej aktywne niz takie same naturalne nukleozydy. Np. Carter i wsp. donieśli, że stężenie (-)-enancjomeru preparatu carbovir (2',3'-dwudehydro-2',3'-dwudezoksyguanozyna) w hodowli komórek wymagane dla zmniejszenia o 50% (EC₅₀) aktywność odwróconej transkryptazy wynosi 0,8 μΜ natomiast EC50 dla (+)-enancjomeru carboviru jest większe niż 60 μΜ. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 34 (6), 1297-1300 (czerwiec 1990).

W międzynarodowej publikacji PCT nr WO 91/11186 ujawniono, że nukleozydy 1,3-oksatiolanowe o wysokiej diastereoselektywności (o dużej zawartości procentowej nukleozydu o konfiguracji β wiązania węgla C1' z zasadą heterocykliczną) można wytwarzać dobierając starannie kwas Lewisa stosowany w procesie kondensacji. Odkryto, że kondensacja nukleozydu 1,3-oksatiolanowego z zasadą zachodzi z prawie całkowitą β-stereospecyficznością, gdy jako katalizator kondensacji stosuje się chlorek cynowy. Inne kwasy Lewisa dają niską (lub żadną) CT-e-selektywność albo wcale nie katalizują reakcji.

W świetle faktu, że zespół nabytego niedoboru odpornościowego, kompleks pokrewny AIDS i wirus zapalenia wątroby B osiągnęły na całym świecie poziomy epidemiczne i spowodowały tragiczne skutki dla zakażonych pacjentów, występuje silna potrzeba uzyskiwania nowy_ch skut_ecz_nych środków farmaceutycznych do leczenia powyższych chorób, charakteryzujących się niską toksycznością dla biorcy.

Istniej_e również potrzeba opracowania ekonomicznej i nadającej się do przemysłow_ego st_osowania _metody wytwarzania ważnych farmaceutycznie nukleozydów oraz uzyskani_a spe_cyfi_czn_ości ^m pozycji C4' syntetycznego nukleozydu wytwafzanego drogą kondzysacji reszty węglowodano-podobnej z zasadą.

M_et_od_{a zwc}l_czc_nlc infekcji HIV i HBV u ludzi i zwierząt polega na podawaniu skute^ nej ilośc_i 2^zCcdroksz^ceetyl_O-5-(5-fluorocctozynylo-1)il,^c-oasa1tiolanu lnb jego Zopuszcdalyzj

171 150 w farmacji pochodnej, w tym 5' lub N⁴ alkilowanej lub acylowanej pochodnej albo dopuszczalnej w farmacji soli w dopuszczalnym w farmacji nośniku.

Stwierdzono, ze 2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1)-1,3-oksatiolan (FTC) wykazuje zaskakująco wysoką aktywność wobec wirusa ludzkiego niedoboru odpornościowego, połączoną z bardzo niską toksycznością komórkową u biorcy. Stwierdzono również, że FTC wykazuje bardzo znaczną aktywność wobec HBV, może więc być stosowany do leczenia pacjentów cierpiących na różne choroby związane z zakażeniem HBV.

Badania toksykologiczne i farmakokinetyczne potwierdzają użyteczność FTC jako środka przeciwwirusowego do podawania jako farmaceutyku. FTC i jego enancjomery są nietoksyczne dla ludzkich obwodowych komórek szpiku kostnego w stężeniu do 50 μM i dla innych linii komórkowych w stężeniu do 200 uM. FTC-TP jest głównym metabolitem wewnątrzkomórkowym w komórkach PBMC i HepG2. FTC-TP kompetytywnie inhibituje odwrotną transkryptazę (RT) HIV-1 przy K = 0,2 pM, stosując poli(I)oligo(dC) marker-primer. Stosując analizę sekwencyjną można wykazać, że FTC-TP jest silnym terminatorem łańcucha DNA, gdy jest HTV-RT (w końcu C).

Przewlekłe podawanie FTC nie jest toksyczne dla gryzoni, nawet w dawkach doustnych 85 mg/kg/dzień, w ciągu co najmniej dwóch miesięcy. Farmakokinetyka FTC u małp rezusów wskazuje wysoką biodostępność (około 73 ± 6%) i okres półtrwania w plazmie wynoszący około 1,34 ± 0,18 (średnia z podawania doustnego i dożylnego).

Sposób enzymatycznego rozdzielania racemicznej mieszaniny enancjomerów nukleozydu polegający na podawaniu mieszaniny racemicznej działaniu enzymu według wynalazku polega na tym, ze jako enzym, który wybiórczo katalizuje reakcję z jednym enancjomerem, stosuje się enzym wybrany z grupy obejmującej esterazę, lipazę, substylizynę, a-chymotryp>synę oraz dezaminazę cytydynowo-dezoksycytydynową.

W sposobie według wynalazku jako esterazę stosuje się esterazę z wątroby świni, a jako lipazę stosuje się świńską lipazę trzustkową lub lipazę Amano PS-800.

W sposobie według wynalazku stosuje się mieszaninę enancjomerów nukleozydu ze zacytowaną grupą hydroksylową w pozycji C5'. Przed rozdzieleniem enancjomery poddaje się acylowaniu za pomocą związku z grupy, do której należą kwasy alkiiokarboksylowe i podstawione kwasy karboksylowe, takie jak kwas octowy, kwas propionowy, kwas masłowy, kwas walerianowy, kwas 2-chloropropionowy, kwas 2-chloromasłowy lub kwas 2-chlorowalerianowy. Enancjomery nukleozydu przepuszcza się przez kolumnę zawierającą enzym immobilizowany na nośniku. Enancjomery te miesza się z enzymem w roztworem, a reakcję enzymatyczną prowadzi się w obecności niejonowego środka powierzchniowo czynnego, korzystnie eteru glikolu polietylenowego z p-izooktylofenolem (Triton X-100). Produkt rozdzielania poddaje się działaniu drugiego enzymu, co zwiększa stopień rozdziału. Następnie produkt ten poddaje się rekrystalizacji. Produkt rozdzielania poddaje się działaniu chiralnego kwasu, takiego jak kwas jabłkowy, kwas migdałowy, kwas dwubenzoilowinowy, kwas 3-bromokamforowy, kwas kamforosulfonowy i kwas dwu-p-toluilowinowy. Rozdzielaniu poddaje się (±)-2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1)-1,3-oksatiolan lub (±)-2-hydroksymetylo-5-(cytozynylo-1) 1,3-oksatiolan.

Sposób ten może być stosowany do rozdzielania wielu różnych nukleozydów, w tym pirymidynowych i purynowych, ewentualnie podstawionych w reszcie węglowodanowej lub reszcie zasady.

Sposób powyższy może być także stosowany do rozdziału pochodnych nukleozydów zawierających dodatkowe heteroatomy w reszcie węglowodanowej, np. (±)-FTC i (±)-BCH-189. Rozdział nukleozydów może być wykonywany w dużej skali przy umiarkowanych kosztach.

Stosując opisane tu metody, FTC rozdzielano na enancjomery (+)-p-D i (-)-P-L. Enancjomer θ-β-L okazał się być bardziej aktywnym niż enancjomer (+)-βΟ wobec HIV, HBV i SIV Enancjomer (+) FTC jćst aównież aktywnywobec HTV; HBV i SIV.

Krótki opis rysunków

Na figurze 1 przedstawiono budowę chemiczną 2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-_)1_1 'k-atlonati nlann fFTCJ

Figura 2 ilustruje metodę otrzymywania 2-hydroksymctylo-5-(5-fiuorocytozynylG-1)1,3-oksatiolanu.

Figura 3 przedstawia specyficzność fosfatazy alkalicznej i fosfodwuesterazy z jadu węża dla (+) i (-) enancjomerów FTC.

Na figurze 4 przedstawiono wykres pokazujący postęp w czasie katalizowanej lipazą hydrolizy estru 5’-butyrylowego FTC przy stosowaniu enzymów Amano PS-800 (puste kwadraciki) i PLE (kółka z kropką).

Na figurze 5 przedstawiono wykres obrazujący wpływ stężenia (M) racemicznego i wzbogaconego enancjomerycznie FTC (otrzymanego metodą z przykładu IV) na procent hamowania ludzkich komórek PBM zakażonych HiV-1; (zaciemnione kółka, (±)-FTC), (puste kółka, (-)-FTC), (zaciemnione kwadraciki, (+)-FTC).

Na figurze 6 przedstawiono wykres obrazujący wpływ stężenia (M) racemicznego i wzbogaconego enancjomerycznie FTC (otrzymanego metodą z przykładu IH) na procent hamowania ludzkich komórek PBM zakażonym HIV-1; (zaciemnione kółka - (±)-FTC, puste kółka - (-)-FTC, zaciemnione kwadraciki - (+)-FTC).

Na figurze 7 przedstawiono wykres obrazujący wchłanianie trytylowanego (±)-FTC w ludzkich komórkach PBM (średnia z dwóch oznaczeń), jako stosunek czasu (w godzinach) do pmol/10⁶ komórek

Na figurze 8 przedstawiono wykres wydalania znakowanego (±)-FTC z ludzkich komórek PBM, jako stosunek czasu (w godzinach) do pmol/10⁶ komórek.

Figura 9 ilustruje obecność [³H]-(±)-(±)-FTC i jego fosforylowanych pochodnych w ludzkich komórkach HepG-2 (średnia z dwóch oznaczeń) inkubowanych w podłożu zawierającym 10 (M [³H]-(±)-FTC. Wykres obrazuje zależność pmol/106 komórek od czasu.

Na figurze 10 przedstawiono wydalanie [³H]-(±)-(±)-FTC i jego fosforylowanych pochodnych z ludzkich komórek HepG2 po przetrzymywaniu komórek w ciągu 24 godzin z 10 (M [³H]-(±)-FTC (700 DPM/pmol) i badania stężenia związku po 24 godzinach po usunięciu związku, jako zależność pmol/106 komórek od czasu.

Figura 11 ilustruje spadek połączonego stężenia 3H-(±)-FTC i jego fosforylowanych pochodnych w ludzkich komórkach HepG2 po inkubowaniu w ciągu 24 godzin z 10 (M [3H]-(±)-FTC (700 dPM/pmol) jako zależność pmol/106 komórek od czasu.

Figura 12 obrazuje na wykresie wpływ enancjomerów FTC na tworzenie kolonii komórek prekursora granulocyto-mikrofagowego, wyrażony w procentach przeżycia w zależności od stężenia w (M (-)-FTC (puste kółko), (+)-FTC (zaciemnione kółko) i AZ-T (zaciemniony kwadracik).

Szczegółowy opis wynalazku

Stosowane określenie wzbogacony enancjomerycznie nukleozyd oznacza nukleozyd, który zawiera co najmniej 95% pojedynczego enancjomeru tego nukleozydu.

Określenie FCT oznacza 2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1)-1,3-oksatiolan (mieszaninę racemiczną lub enancjomery), którą także nazywa się 2'-dezoksy-5-fluoro-3'-tiacytydyną

Określenie (±)-FCT oznacza (±)-P-D,L-2-hydroksymetylo-5-(5-fiuorocytozynylo-1)-1,3oksatiolan.

Określenie (-)-FCT oznacza (-)-|3-L-2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1)-1,3oksatiolan.

Określenie (+)-FCT oznacza (+)-P-D-2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1)-1,1oksatiolan.

Określenia FTC-MP, FTC-DP i FTC-TP oznaczają odpowiednio jednofosforan, dwufosforan i trójfosforan FTC.

Określenie BCH-189 oznacza 2-hydroksymetylo-5-(cytozynylo-1)-1,3-oksatiolan.

171 150

Określenie wybiórcza kataliza enzymatyczna oznacza katalizę enzymem, który faworyzuje jeden substrat w stosunku do drugiego.

Określenie grupa odszczepialna oznacza grupę funkcyjną, która zapoczątkowuje przyłączanie atomu węgla oddzielając się od cząsteczki, do której jest przyłączona.

Metoda zwalczania infekcji HIV i HBV oraz innymi wirusami rozmnażającymi się w podobny sposób u ludzi i zwierząt polega na podawaniu skutecznej ilości (±)-β-Ό,Ε, (-)-β-Σ lub (+)-β-ϋ enancjomeru 2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1)-1,3-oksatiolanu, jego dopuszczalnej farmaceutycznie (fizjologicznie) pochodnej, w tym 5' lub N⁴ alkilowej lub acylowej pochodnej lub dopuszczalnej farmaceutycznie (fizjologicznie) soli w dopuszczalnym w farmacji nośniku. Jak wykazano poniżej, związki wytworzone sposobem według wynalazku albo same wykazują aktywność wobec retrowirusów, taką jak aktywność anty-HIV-1, anty-HIV-2 lub wobec wirusa niedoboru odpornościowego u małp (anty-SIV) albo są metabolizowane do związków, które wykazują powyższą aktywność.

FTC i jego dopuszczalne w farmacji pochodne albo dopuszczalne w farmacji preparaty zawierające te związki są użyteczne do zapobiegania i zwalczania zakażeń HIV i innych pokrewnych stanów, takich jak związany z AIDS kompleks (ARC), trwałe uogólnione powiększenie węzłów chłonnych (PGL), związane z AIDS stany neurologiczne, stany związane z dodatnim odczynem przeciwciała anty-HTV i HIV, mięsak Kaposi’ego, plamica małopłytkowa i zakażenia zarazkiem oportunistycznym. Ponadto, powyższe związki stosuje się do zapobiegania lub opóźniania postępu choroby u osobników o dodatnim odczynie na przeciwciała anty-HIV lub antygen HIV lub tym, którzy zetknęli się z HIV.

FTC i jego dopuszczalne w farmacji pochodne lub sole albo dopuszczalne w farmacji preparaty zawierające te związki są także użyteczne w zapobieganiu i zwalczaniu infekcji HBV i innych pokrewnych stanów, takich jak stany związane z dodatnim odczynem na przeciwciała anty-HBV i HBV, przewlekłe zapalenie wątroby wywołane przez HBV, marskość wątroby, ostre zapalenie wątroby, piorunujące zapalenia wątroby, przewlekłe zapalenie wątroby i zmęczenie. Powyższe związki lub preparaty mogą być również stosowane profilaktycznie dla zapobiegania lub opóźniania postępu choroby u osobników, którzy wykazują dodatni odczyn na przeciwciała anty-HBV i antygen HBV lub którzy zetknęli się z HBV.

Sposobem według wynalazku rozdziela się:

a) (±)^D,L-2-hydroksymetylo-5-(5-fiuorocytozynylo-1)-1,3-oksatiolan i jego dopuszczalne w farmacji pochodne i sole; i otrzymuje się:

b) (-^^L^-hydroksymetyla-S-iS-fluoroigyojgyylcollH^-oksatiolan i jego dopuszczalne w farmacji pochodne lub sole;

c) (+)^D-2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1)-1,3-oksatiolan i jego dopuszczalne w farmacji pochodne i sole.

Niżej przedstawiono kilka sposobów wytwarzania nukleozydu:

a) Sposób wytwarzania 2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1)-1,3-oksatiolanu polega na tym, że (i) ewentualnie ochronioną 5-fluorocytozynę poddaje się reakcji z 1,3-oksatiolanem o wzorze A w którym R_]a oznacza atom wodoru lub grupę chroniącą grupę hydroksylową, w tym acylową, a L oznacza grupę odszczepialną, po czym ewentualnie usuwa się grupę chromącą grupę hydroksylowy

171 150 (ii) związek o wzorze B >i^HRib

w którym Ru ma wyżej podane znaczenie, a Rib oznacza grupę chroniącą grupę aminową, poddaje się reakcji z czynnikiem fluorującym w celu wprowadzenia atomu fluoru w pozycję 5 pierścienia cytozyny; lub (iii) związek o wzorze C

w którym R_u ma wyżej podane znaczenie poddaje się reakcji ze środkiem służącym do przekształcania grupy keto w pozycji 4 pierścienia uracylu w grupę aminową; po czym wszystkie grupy ochronne usuwa się i otrzymuje pożądany produkt.

W odniesieniu do procesu (i), grupami chroniącymi grupę hydroksylową mogą być grupy opisane szczegółowo poniżej, w tym.gpupa acylowa (np. acetylowa, aryloacylowa (np. benzoilowa lub podstawiona benzoilowa), trytylowa lub jednotrytylowa, benzylowa lub podstawiona benzylowa, trójpodstawiona grupa sililowa, w tym trójalkilosililowa (np. dwumetylo-III-rzęd.-butylosihlowa) lub dwufenylometylosllilcwa. Pochodna 5-fluorocytozynowa może być ewentualnie ochroniona grupami trójpodstawionymi siblowymi. Grupy ochronne można usuwać znanymi sposobami. Grupa odszczepialna L jest typową grupą znaną z chemii nukleozydów, np. atom chlorowca, taki jak chloru lub bromu, grupa alkoksylowa, taka jak metoksylowa lub etoksylowa, albo acylowa, taka jak acetylowa lub benzoilowa

Reakcje w sposobie a (i) można prowadzić w rozpuszczalniku organicznym (np w 1,2-dwuchloroetanie lub acetonitrylu) w obecności kwasu Lewisa, korzystnie chlorku cynowego lub trójfluorometylosulfonianu trójmetylosililu.

Związki o wzorze A, w którym L oznacza grupę acylową (np. acetylową), można otrzymywać w reakcji związku o wzorze D

(w którym Ru ma znaczenie podane uprzednio) z czynnikiem redukującym, np. wodorkiem litowoglinowym, a następnie reakcji z reagentem potrzebnym dla uzyskania pożądanego pół171150 produktu, np reakcji z bezwodnikiem kwasu karboksylowego, np bezwodnikiem octowym, w przypadku acylowama reakcji z czynnikiem chlorującym lub bromującym w przypadku chlorowcowania, lub z reagentami alkilującymi.

Związek o wzorze D można wytwarzać w reakcji związku o wzorze E

H.

R

ze związkiem o wzorze HSCH₂COOH, prowadzonej w podwyższonej temperaturze.

Związek o wzorze E można wytwarzać drogą ozonolizy alliiowego eteru lub estru o wzorze CH₂=CH-CH2-OR lub dwueteru albo dwuestru 2-buteno-1,3-diolu o wzorze ROCH^CH=CH-CH₂OR, gdzie R oznacza grupę ochronną, takąjak alkilowa, siliiowa lub acylowa

W odniesieniu do procesu a (ii) atom fluoru w pozycję 5 można wprowadzać znanymi metodami opisanymi przez M J. Robinsa i wsp. w Nucleic Acid Chemistry, część 2, wyd. L. B. Towsend i R. S. Tipson, J. Wiley and Sons, New York, 895-900 (1978) i w cytowanych tam odnośnikach; orazR. Duschinsky Nucleic Acid Chemistry, część 1, wyd. L. B. Towsend 1R. S Tipson, J Wiley and Sons, New York, 43-46 (1978) i w cytowanych tam czasopismach Środkiem fluorującym może być np. podfluoryn trójmetylu w fluorotrójchlorometanie.

W odniesieniu do procesu a (iii), związek o wzorze C można poddawać reakcji z 1,2,4-triazolem i dwuchlorofosforanem 4-chlorofenylu. Otrzymuje się odpowiedni związek 4-(1,2,4-triazoililowy), który przekształca się w pożądaną 4-aminocytydynę w reakcji, np. z metanolem.

Wyjściowe związki o wzorach B i C można otrzymywać np. w reakcji odpowiedniej (ewentualnie ochronionej) zasady ze związkiem o wzorze A, w sposób analogiczny do opisanego dla procesu a (i). 5-Fluuorouracyl i 5-fluorocytozyna są związkami handlowymi, sprzedawanymi przez firmę Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI 53233, Stany Zjednoczone Ameryki.

Rozdzielanie enancjomerów (±) można przeprowadzić tak, jak to szczegółowo przedstawiono w ponizszych przykładach wykonania..

FTC można przekształcać w dopuszczalny w farmacji ester w reakcji z odpowiednim środkiem estryfikującym, np. halogenkiem lub bezwodnikiem kwasowym. FTC lub jego dopuszczalną w farmacji pochodną można przekształcać w dopuszczalną w farmacji sól, stosując znany sposób, np. w reakcji z odpowiednią zasadą Ester lub sól FTC można przekształcać w FTC, np. drogą hydrolizy.

I. Aktywny związek i jego dopuszczalne fizjologicznie pochodne i sole

Przedstawiony w opisie aktywny przeciwwirusowo związek jest 2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1)-1,3-oksatiolanein (patrz figura 1) w postaci mieszaniny racemicznej lub wydzielonego enancjomeru.

Aktywny związek może być podawany w postaci pochodnej, która po podaniu biorcy jest zdolna jest bezpośrednio lub pośrednio przekształcać się w macierzysty FTC lub która sama wykazuje aktywność. Nieograniczającymi przykładami są dopuszczalne w farmacji sole (alternatywnie określane jako dopuszczalne fizjologicznie sole) oraz 5' i N⁴ acylowane lub alkilowane pochodne (alternatywnie określane jako aktywne fizjologicznie lub farmaceutycznie pochodne) W jednej odmianie, grupą acylową jest ester kwasu karboksylowego, w którym reszta niekarbonylowa grupy estrowej jest prostą, rozgałęzioną lub cykliczną grupą alkilową; grupą alkoksyalkilową, np. metoksymetylową grupą arylooksyalkilową, np. fenoksymetylową; arylową, np. fenylową ewentualnie podstawioną atomem chlorowca, grupą Ć1-4-alkilową lub Cj_4-alkoksylową; ester sulfonianowy, taki jak alkilo- lub aryloalkilosulfonylowy, np. metanosulfonylowy; ester jedno-, dwu- lub trójfosforanowy; trytylowy lub jednometoksytrytylowy·, podstawiony benzylowy, trójalkilosililowy (np. dwumetylo-III-rz -butylosililowy) lub dwufeny10 lometylosililowy Grupą arylową w estrach jest optymalnie grupa fenylowa. Grupa alkilowa może być grupą prostą, rozgałęzioną lub cykliczną, optymalnie o Cu

Specyficznymi przykładami dopuszczalnych w farmacji pochodnych FTC są, ale nie wy-

w którym Ri i R2 oznaczają niezależnie od siebie grupę alkilową lub acylową, przykładowo, ale nie wyłącznie, taką jak metylowa, etylowa, propylowa, butylowa, pentylowa, heksylowa, izopropylowa, izobutylowa, Il-rz.-butylowa, III-rz.-butylowa, izopentylowa, amylowa, III-rz.-pentylowa, 3-metylobutyrylowa, wodorobursztynianowa, 3-chlorobenzoesanowa, cyklopentylowa, cykloheksylowa, benzoilowa, acetylowa, piwaloiolowa, mezylanowa, propionylowa, butyrylowa, walerylowa, kapronowa, kaprylowa, kaprynowa, laurylowa, mirystynowa, palmitynowa, stearynowa, olemowa lub reszta aminokwasu, taka jak, ale nie wyłącznie, alkanylowa, walinylowa, leucynylowa, izoleucynylowa, prolinylowa, fenyloalanylowa, tryptofanylowa, metioninylowa, glicynylowa, serynylowa, treoninylowa, cysteinylowa, tyrozynylowa, asparaginylowa, glutaminylowa, aspratoilowa, glutaoilowa, lizynylowa, arginylowa i histydynylowa, a jeden z podstawników Ri i R2 może być atomem wodoru.

FTC lub jego pochodne mogą występować w postaci dopuszczalnych w farmacji soli. Stosowane w opisie określenie dopuszczalne w farmacji sole lub kompleksy dotyczy soli lub kompleksów FTC zachowujących pożądaną aktywność biologiczną macierzystego związku i wykazujących minimalne, jeśli w ogóle, niepożądane działanie toksyczne. Nie ograniczającymi przykładami takich soli są (a) addycyjne sole kwasowe utworzone z kwasami nieorganicznymi (np. z chlorowodorem, bromowodorem, kwasem siarkowym, kwasem fosforowym, kwasem azotowym, itp.) oraz sole z kwasami organicznymi, takimi jak kwas octowy, kwas szczawiowy, kwas winowy, kwas bursztynowy, kwas jabłkowy, kwas askorbinowy, kwas benzoesowy, kwas garbnikowy, kwas embonowy, kwas alginowy, kwas poliglutaminowy, kwasy naftalenosulfonylowe, kwasy naftalenodwusolfonowe i kwas poligalakturonowy; (b) zasadowe sole addycyjne utworzone z wielowartościowymi kationami metali, takich jak cynk, wapń, bizmut, bar, magnez, glin, miedź, kobalt, nikiel, kadm, sód, potas, itp., albo z organicznymi kationami utworzonymi z N,N-dwubenzyloetylenodwuaminy, soli amoniowej lub etylenodwuaminy; lub (c) kombinacje soli (a) i (b), np. sól cynkowo-taninowa lub podobna.

Modyfikacje aktywnego związku w pozycjach N⁴ i 5-0 mogą wpływać na biodostępność i metabolizm i tym samym pozwalają na kontrolę podawania leku. Ponadto, modyfikacje mogą wpływać na aktywność przeciwwirusową, zwiększając ją w niektórych przypadkach ponad aktywność macierzystego związku. Łatwo to można- ocenić testując otrzymaną pochodną na aktywność przeciwwirusową metodami przedstawionymi w tym opisie lub innymi, znanymi specjalistom.

U. Wytwarzanie aktywnych związków

Racemiczną mieszaninę FTC można otrzymywać metodą opisaną szczegółowo w międzynarodowej publikacji PCT nr WO 91/11186 z dnia 8 sierpnia 1991 r., zgłoszonej przez Emory University lub metodą ujawnioną w przykładzie I. Generalnie, metoda polega na tym, że poddaje się ozonowaniu eter lub ester allilowy o wzorze CH2=CH-CH2-OR lub dwueter

171 150 albo dwuester 2-buteno-1,3-didu o wzorze ROCH2-CH=CH-CH₂OR, w których to wzorach R oznacza grupę ochronną, taką jak alkilowa, siliiowa lub acylowa. Otrzymuje się aldehyd glikolowy o wzorze OHC-CH2-OR, do którego dodaje się kwas tioglikolowy i otrzymuje lakton o wzorze 2-(R-oksy) meV^4l^-5^k:^’to-1,3-oksatiolan Lakton ten redukuje się do różnych związków zawierających grupę odchodzącą w pozycji 5 pierścienia oksatiolanu i następnie sprzęga je z siliiowaną 5-fluorocytozyną w obecności SnCl₄. Otrzymuje się FTC i ewentualnie usuwa się grupy ochronne.

Przykład I. Wytwarzanie (±)-P-D,L-2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1)1.3- oksatiolanu.

Poniżej opisano szczegółowo sposób wytwarzania mieszaniny racemicznej FTC, zilustrowany na figurze 2

Ochrona 2-buteno-1,4-diolu

W suchej 2-litrowej, trójszyjnej kolbie rozpuszczono w obojętnej atmosferze 100 g (93,5 ml, 1,135 mola, 1,00 równoważnik) 2-buteno-l,4-diolu i 15 g (około 0,1 równoważnika) DMAP (4-dwumetyloaminopirydyny) w 800 ml bezwodnej pirydyny i całość mieszano i ochłodzono do temperatury 0°C. Następnie dodano powoli dla uniknięcia przegrzania 260 ml (2,2 równoważnika) chlorku butyrylu i znów mieszano w ciągu 1 godziny. Reakcję zatrzymano dodając małą ilość lodowatej wody. Ciecz zdekantowano z nad soli i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałą sól rozpuszczono w wodzie i wodny roztwór ekstrahowano dwukrotnie eterem etylowym. Połączone ekstrakty eterowe przemyto jeden raz nasyconym roztworem CuSO₄ i dwukrotnie nasyconym roztworem NaHCO₃ zawierającym Non® i przesączono pod zmniejszonym ciśnieniem przez warstwę ziemi okrzemkowej Celittt®®.

Zatężoną mieszaninę reakcyjną rozpuszczono w eterze etylowym i przemyto, stosując takie same jak powyżej postępowanie. Połączone warstwy organiczne zatężono w wyparce obrotowej i umieszczono pod zmniejszonym ciśnieniem. Wydajność reakcji zwykle jest bardzo bliska ilościowej. Skalę wytwarzania można łatwo w razie potrzeby zwiększyć. Produkt,

1.4- dwubutyrylo-2-buteno-1,4-diol jest bezbarwną do jasnożółtej, klarowną cieczą.

Ozonoliza ochronionego diolu

1,365 mola 1,4-dwubutyrylo-2-buteno-1,4-diolu rozpuszczono w 4 litrach bezwodnego CH₂C1₂ w suchej 5-litrowej kolbie trójszyjnej, wyposażonej w dużą rurkę suszącą i otwartą rurę do wprowazdania gazu. Rura jest korzystnie rurą do przepuszczania gazu nie zawierającą spieku, który może się zatykać w przypadku stężonego roztworu. Roztwór miesza się i oziębia do temperatury -78°C, przepuszczając obojętny gaz. Wlot gazu zamyka się, gdy roztwór został dostatecznie oziębiony, po czym kolbę i mieszadło przenosi się do generatora ozonu. Przez mieszany roztwór przepuszcza się w ciągu co najmniej 20 minut tlen, oziębiając przez ten czas. Urządzenie Cryoccol jest idealne do utrzymywania niskiej temperatury podczas tej długotrwałej reakcji. Ozon wprowadza się pod ciśnieniem 2,29-2,44 MPa. Po zakończeniu reakcji zatrzymuje się dopływ ozonu i przez roztwór przepuszcza się tlen w ciągu pół godziny, a następnie dodaje się 3 równoważniki Me₂S. Kolbę usuwa się z łaźni oziębiającej, przenosi pod wyciąg i miesza w ciągu około dwóch dni, do uzyskania całkowitej redukcji. Roztwór odparowuje się i pozostawia pod zmniejszonym ciśnieniem w ciągu kilku godzin.

W tej reakcji otrzymuje się typowo około 95% ochronionego aldehydu (aldehydu 2-butyrylooksycctowego) w postaci bezbarwnego do żółtego,’ przezroczystego roztworu

Cyklizacja aldehydu z kwasem merkaptooctowym równoważnik aldehydu rozpuszczono w toluenie i otrzymano 0,80-0,85 M roztwór w kolbie zaopatrzonej w nasadkę Deana-Starka. Następnie dodano 1,1 równoważnika kwasu tlogbkclowego i mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia. Wodę usuwano azeotropowo w nasadce Reakcja została zakończona po 3 godzinach. Mieszaninę pozostawiono do ochłodzenia do pokojowej temperatury, po czym przemyto dwukrotnie równymi objętościami nasyconego roztworu wodnego NaHC0₃ i jednokrotnie wodą, suszono nad MgSO., i Noritem, przesączono pod zmniejszonym ciśnieniem przez celit i odparowano pod zmniejszonym ciśni_eniem. Pierwszy roztwór NaHCO₃ z przemycia ekstrahowano eterem etylowym, ekstrakt przemyto wodą, suszono nad MgSO₄ i Noritem®, przesączono próżniowo przez ziemię krzemionkową celite® i odparowano razem z innym organicznym materiałem z roztworu toluenowego. Połączony materiał pozostawiono pod zmniejszonym ciśnieniem w ciągu . nocy.

W reakcji otrzymuje się typowo z 90% wydajnością 2-(butyrylooksy)-metylo-5-keto1,3-oksatiolan.

Redukcja laktonu i przekształcenie w octan

W trójszyjnej kolbie wyposażonej w mieszadło mechaniczne 1,00 równoważnik 2-butyrylooksymetylo-5-keto-1,3-oksatiolanu rozpuszcza się w obojętnej atmosferze w bezwodnym THF, otrzymując 0,21 M roztwór. Roztwór mieszano i ochłodzono do temperatury 0°C, po czym dodano przez rurkę 1,1 równoważnika 1,0 M roztworu Li(t-BuO)iAlH w THF. Redukcja zaszła całkowicie po upływie około trzech godzin, zgodnie z TLC, w której stosowano do rozwijania mieszaninę 2:1 eteru etylowego i heksanu, a do wywoływania aldehyd anyżowy.

Do mieszaniny dodano około 10 równoważników świeżo destylowanego AC2O i całość mieszano w ciągu 2 dni, otrzymując acetylowany produkt, Reakcję zatrzymano dodając nasycony roztwór NaHCOi i mieszano w ciągu nocy. Roztwór odparowano i mieszano w ciągu nocy z nową porcją roztworu NaHCOi, po czym ekstrahowano eterem etylowym. Ekstrakt przemyto starannie nasyconym roztworem NaHCOi (dwukrotnie) i jeden raz wodą, suszono nad MgSOd i preparatem Non®, przesączono próżniowo przez ziemię okrzemkową celite® i odparowano. Otrzymano produkt w postaci ciemnożółtego, przezroczystego płynu. Chromatografia gzowa (temperatura początkowa - 80°C, wstępny czas - 5 minut, przyrost temperatury - 10°C/min., końcowa temperatura - 240°C) wykazała czystość około 70%.

Sililowanie 5-fluorocytozyny

5-fluorocytozynę (1,05 równoważnika jak obliczono na podstawie acetylowanego laktolu otrzymanego w poprzednim etapie o czystości według chromatografii gazowej) siliiowano w temperaturze wrzenia z co najmniej 10 równoważnikami heksametylodisilazanu zawierającego katalityczną ilość czystego siarczanu amonowego (0,05 do 0,1 równoważnika). Reakcję prowadzono w ciągu dwóch godzin od momentu, gdy roztwór osiągnął klarowność. Kolbę dobrze zamknięto i rozpuszczalnik odparowano, stosując pompę próżniową i pomocniczy łapacz. Produkt, mający postać białego osadu, pozostawiono w ciągu nocy pod zmniejszonym ciśnieniem i stosowano następnie w reakcji sprzęgania.

Sprzęganie siliiowanej 5-fluorocytozyny z acetylowanym laktonem

Do roztworu 33,86 g (0,124 mola) siłiłowanej 5-fluorocytozyny w 350 ml bezwodnego chlorku metylenu dodano 135,6 ml 1 m roztworu SnCL w chlorku metylenu, w atmosferze azotu. Całość mieszano w ciągu 15 minut w pokojowej temperaturze, po czym w ciągu 30 minut podano rurką do roztworu 38 g (0,113 mola) octanu laktolu w 400 ml chlorku metylenu, utrzymywanego pod azotem.

Całość mieszano w ciągu 2 godzin i za pomocą HPLC stwierdzono zakończenie reakcji. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono chlorkiem metylenu (500 ml) i zatrzymano reakcję dodając roztwór wodorotlenku amonowego. Do roztworu dodano powoli 100 ml wodorotlenku amonowego, utrzymując temperaturę poniżej 30°C. Obserwowano wypadanie białego osadu.

Całość mieszano w ciągu dalszych 30 minut, po czym podano na kolumnę z żelem krzemionkowym (o średnicy 17,8 cm i długości 12,6 cm), eluując kolejno 2 litrami chlorku metylenu, 2 litrami octanu etylu i 4 litrami mieszaniny 9:1 octanu etylu i etanolu. Zawierające pożądany produkt eluaty octanowe oraz octanowo-etanolowe połączono i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostały lepki, stały produkt przemyto 200 ml bezwodnego eteru etylowego i otrzymano 25,35 g (71%) 5'-maślanu FTC w postaci białego, stałego produktu

Porcję 8,74 g (0,026 mola) 5'-maślanu FTC rozpuszczono w 250 ml metanolu i dodano w pokojowej temperaturze 2,85 g (0,052 mola) metoksylanu sodowego. Całość mieszano w ciągu 1 godziny, stwierdzając za pomocą TLC zakończenie reakcji. W celu zatrzymania reakcji dodano 10 ml roztworu NFLC1, po czym odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość zaabsorbowano na 5 g żelu krzemionkowego i przepuszczono przez małą kolumnę, eluując mieszaniną 9:1 octanu etylu i etanolu. Połączone frakcje zawierające

171 150 produkt odparowano i otrzymano lepki osad, który przemyto bezwodnym eterem etylowym i uzyskano 6,00 g (88%) FTC w postaci białego osadu.

Widmo 'HNMR (DMSO-d⁶): 8,18 (1H, d, He, J = 8,4 Hz), 7,81 i 7,57 (2H, szeroki sygnał, NH₂), 6,12 (1H, dd, H_;, J = 5,7 i 4,2 Hz), 5,40 (1H, t, OH, T - 5,7 Hz), 5,17 (1H, L 1H, J = 3,6 Hz), 3,74 (2H, m, 2H₅), 3,41 (1H, dd, H₂, J = 5,7 i 11,7 Hz), 3,11 (1H, dd, H₂, J = 4,2 i 11,7 Hz).

Widmo ”C NMR (DMSO-d6): 157, 85 (d, J = 13,4 Hz), 153,28, 136,12 (d, J = 24,1 Hz), 126,01 (d, J = 32,6 Hz), 86,90, 86,84, 62,48, 37,07.

Temperatura topnienia 195-196°C

Przykład II. Rozdział encncjomerów nualeozcdów.

Przedstawiony sposób rozdziału mieszanin racdmiczncch enancjomerów nualeozydów Zotyyzc, ale me wyłącznie, (+) i (-) enancjomerów FTC. Metoda ta może być także stosowana do rozdziału mieszanin racemiczncyh reszt węglowodanowych i węglowodanowo-podobnych, takich jak pochodne 1,3-oksatiolanu i 1,3-Zioksolanu W metodzie tej wykorzystuje się enzym, który wybiórczo katalizuje reakcję jednego z enancjomerów mieszaniny reckccjnej. Poddany reakcji encncjomer jest oddzielany od mezrzerdcgowanego enancjomeru z wykorzystaniem nowych różnic w strukturze fizycznej. Na podstawie powyższych danych specjalista będzie w stanie wybrać enzym selektywny w stosunku do potrzebnego enancjomeru (lub selektywny w stosunku do niepożądanego enancjomeru w celu wyeliminowania go) z omówioncyh w dalszej części opisu enzymów lub drogą baZcnic innych znanych enzymów. Specjalista będzie również wiedział, jak modyfikować substrat w celu uzyskania pożądanego rozdziału. Stosując chiralne odczynniki do NMR, polarymetrię lub chudną HPLC, można oznaczać optyczne wzbogacanie wydzielonego estru.

Poniższe przykłady ilustrują stosowanie enzymów do rozdziału mieszanin rccemiczncch encnyjomerów. Mogą tez być stosowane inne znane metody rozdziału mieszanin rccdmiyznych w kombinacji z podanymi w opisie. Wszystkie takie modyfikacje mieszczą się w zakresie wcnrlczku.

Rozdział oparty na hydrolizie C5'-estrów nukleozydu

W jednej odmianie metoda polega na poddawaniu grupy C5'-hydroksclowej w mieszaninie rayemicznej nukleozydu reakcji ze związkiem acclującym. Otrzymuje się C5'-estry, w których nukleozyd znajduje się w karbinolowym końcu estru. Mieszaninę racemiczną C5'-dstrów nukleozydu poddaje się działaniu enzymu, który wybiórczo rozszczepia lub hedrolizuje jeden z enancjomerów, pozostawiając nietknięty drugi, w określonym okresie czasu.

Zaletą powyższej metody jest możliwość jej stosowania do rozdziału wielu różnych nuk^zydów, w tym nukldozydów zircmiZcnowych i zurcnowcch, ewentualnie podstawionych w reszcie cukru lub zasady. Metoda ta może być również stosowana do rozdziału zoyhodnych nukleozcdów, które zawierają dodatkowe heteroatomy w reszcie cukrowej, np. FTC i BCH-189. Szeroka stosowalność powyższej metody wynika częściowo z faktu, że chociaż karbinolowa część estru ma znaczenie dla zdolności różnicowania przez enzym enancjomerów, to główne rozpoznawalne przez te enzymy miejsce znajduje się w reszcie kwasu karboksylowego w estrze

Ponadto, można z powodzeniem ekstrapolować wyniki z jednych badań enzcm/substrct do innych różnych układów, jeśli reszta kwasu karboksylowego w obu substratayC jest taka sama lub znacznie podobna.

Inną zaletą powyższej metody jest fakt, że jest ona regloseίektc4na. Enzymy, które hyZrolizują estry, nie katalizują zwykle innych reakcji w innych fragmentach cząsteczki Np., enzym lipaza katalizuje hydrolizę estru 2-hcZrokscmetclo-5-keto- 1,3-oksatiolanu, nie hydrolizując przy tym wewnętrznego laktonu. Odróżnia to się wyraźnie od podejść chemlyzncch do hydrolizy estrów.

Inną zaletą opisywanej metody jest fakt, ze wyodrębnianie niezhydrolizowanego dnancjomeru i zhyZrolizewanego enancjomeru jest bardzo proste NlezCcdrolizowany dncncjomer jest bardziej l^oSln. i może być wydajnie wyodrębniany drogą prostej ekstrakcji wieloma niepolamymi rozpuszczalnikami organicznymi lub mieszaninami rozpuszczalników, w tym heksanem i mieszaniną heksanu i eteru etylowego. Mniej lipofilny, bardziej polarne zhcZrolizowcnc

171 150 enancjomer można otrzymywać drogą ekstrakcji bardziej polarnym rozpuszczalnikiem organicznym, np. octanu etylu lub drogą liofilizacji i następnie ekstrakcji etanolem lub metanolem Podczas hydrolizy należy unikać stosowania alkoholu, gdyż może on. w pewnych warunkach

Enzymy i substraty

Dobierając właściwy enzym i substrat można ustalić warunki dla wyodrębniania każdego enancjomeru nukleozydu Pożądany enancjomer można izolować traktując mieszaninę racemiczną enzymem hydrolizującym pożądany enancjomer (po czym ekstrahując polarny hydrolizat polarnym rozpuszczalnikiem) lub traktując enzymem hydrolizującym niepożądany enancjomer i następnie usuwając niepożądany enancjomer niepolamym rozpuszczalnikiem.

Do enzymów, które katalizują hydrolizę estrów należą esterazy, np. esteraza z wątroby świni; lipazy, np. świńska lipaza trzustkowa i lipaza Amano PS-800; substylizyna i a-chymotrypsyna.

Na rysunku 3 przedstawiono wykres specyficzności alkalicznej fosfatazy i fosfodwuesterazy z jadu węża w stosunku do (+) i (-) enancjomerów FTC. Jak widać, fosfataza alkaliczna hydrolizuje trójfosforan obu enancjomerów FTC i nie nadaje się tym samym jako czynnik rozdzielający. Fosfodwuesteraza I wybiórczo hydrolizuje (+)-izomer FTC do jego jednoestru, który można następnie poddawać działaniu 5'-nukleotydazy i otrzymywać (+)-FTC.

Najbardziej efektywną grupę acylową do stosowania do estryfikacji w pozycji C5' nukleozydu można wybierać bez zbędnego eksperymentowania, drogą badania szeregu homologów z zastosowaniem wybranego układu enzymatycznego. Np., jeśli nukleozydy 1,3-oksatiolanowe są zestryfikowane kwasem masłowym, wówczas rozdział za pomocą zarówno esterazy z wątroby świni, jak i Amono PS-800 zachodzą z wysoką enancjoselektywnością (94-100% nadmiaru enancjomerycznego) i przeciwstawną selektywnością. Esteraza z wątroby świni wybiórczo hydrolizuje (+)-enancjomer FTC, a Amano PS-800® hydrolizuje selektywnie (-)-enancjomer FTC. Procentowy nadmiar enancjomeryczny podany w tabeli 1 jest to ilość oczyszczonego estru kwasu masłowego (-)-FTC w przypadku PLE oraz estru kwasu masłowego (+)-PLC w przypadku Amano PS-800®.

Nie ograniczającymi przykładami grup acylowych, które można badać do stosowania z poszczególną mieszaniną enancjomerów nukleozydu i poszczególnymi enzymami, są takie jak reszty kwasów alkilokarboksylowych i podstawionych kwasów alkilokarboksylowych, takich jak kwas octowy, kwas propionowy, kwas masłowy i kwas walerianowy. W przypadku niektórych enzymów może być korzystne stosowanie związku acylowego, który znacznie odciąga elektrony, dla ułatwienia hydrolizy przez osłabienie wiązania estrowego. Do odciągających elektrony grup acylowych należą α-chlorowcoestry, takie jak z kwasem 2-chloropropionowym, kwasem 2-chloromasłowym i kwasem 2-chlorowalerianowym, przy czym a-chlorowcoestry są doskonałymi substratami dla lipaz.

Warunki rozdziału

Hydroliza enzymatyczna jest zwykle prowadzona z katalityczną ilością enzymu w wodnym buforze o pH bliskim optymalnej wartości pH dla danego enzymu. W miarę jak zachodzi reakcja, spada wartość pH jako rezultat uwalniania kwasu karboksylowego. Dla utrzymania wartości pH blisko optymalnego poziomu należy dodawać wodny roztwór zasady. Postęp reakcji można łatwo śledzić obserwując zmiany pH i zużycie zasady potrzebnej do utrzymania właściwego pH Hydrofobowy ester (niezhydrolizowany enancjomer) i bardziej polarny alkohol (zhydrolizowany enancjomer) można kolejno i selektywnie ekstrahować z roztworu właściwie wybranymi rozpuszczalnikami organicznymi. Alternatywnie, rozdzielany materiał można przepuszczać przez kolumnę zawierającą enzym immobilizowany na stałym nośniku

Enzymatyczna hydroliza prowadzona w warunkach heterogenicznych może dawać słabo powtarzalne wyniki. Stąd korzystne jest prowadzania hydrolizy w warunkach homogenicznych. Rozpuszczalniki alkoholowe me są korzystne, gdyż mogą one denaturować enzymy Homogeniczność można osiągnąć stosując niejonowy środek powierzchniowo czynny, taki jak Triton Χ-100. Dodatek takich środków powierzchniowo czynnych nie tylko jednak pomaga

171 150 w rozpuszczeniu wyjściowego związku, ale także zwiększa rozpuszczalność w wodzie produktu. Chociaż więc reakcja enzymatyczna może przebiegać efektywniej, gdy dodaje się niejonowy środek powierzchniowo czynny niż w warunkach heterogenicznych, to izolacja zarówno wyjściowego materiału, jak i produktu może się stać trudniejsza. Produkt można, wyodrębniać za pomocą odpowiednich technik chromatograficznych i chemicznych (np. drogą selektywnego tworzenia soli). Można stosować dwuacylowane nukleozydy, ale są one często bardzo lipofilowe i trudne do rozpuszczenia w stosowanym środowisku.

Przykład IH. Enancjoselektywna, katalizowana lipazą hydroliza estrów FTC. Otrzymano szereg pochodnych 5'-O-acylowych FTC drogą selektywnego acylowania

N-chlorowodorku (±)-FTC (patrz tabela 1 i figura 4). Badano stopień hydrolizy pochodnych przez lipazy. Jak pokazano w tabeli 1, esteraza z wątroby świńskiej (PLE) wykazuje wysoki poziom selektywnej hydrolizy estru (+)-enancjomeru FTC, pozostawiając głównie maślan (-)-FTC w analizowanej za pomocą HPLC mieszaninie. Stwierdzono także, że stopień hydrolizy jest zależny od rodzaju grupy acylowej - pochodna acetylowa jest hydrolizowana znacznie wolniej niż pochodna butyrylowa. Stwierdzono obecnie, że szybkość hydrolizy propionianu FTC jest nawet wyzsza niż dla pochodnej kwasu masłowego. Procent odzysku i procent nadmiaru enancjomerycznego oznaczono za pomocą HPLC. Chociaż enancjoselektywność jest doskonała, gdy stosuje się PLE (zwykle 97% lub więcej), to można uzyskiwać dodatkowe wzbogacenie przez kolejne enzymatyczne reakcje hydrolizy, w których wzbogacony enancjomerycznie maślan z hydrolizy katalizowanej PLE poddaje się enzymatycznej hydrolizie za pomocą PS-800.

Tabela 1

Porównywane wpływu rodzaju estru na hydrolizę enzymatyczną

Substrat	% odzysku	% wzbogacenia enancjomerycznego
Estry FTC/PLE octan	32,68	(-)-FTC (maślan) nie oznaczono
propionian	39,87	nie oznaczono
maślan	48,00	98
maślan	45,71	98,6
Estry FTC/PS800 octan	73,17	(+)-FTC (maślan) nie oznaczono
propionian	52,67	nie oznaczono
maślan	58,34	nie oznaczono
walerian	41.50	94

Przykład IV. Sposób otrzymywania (+)- i (-)-FTC drogą enancjoselektywnej, katalizowanej lipazą hydrolizy maślanu FTC.

149 mg (0,47 mmola) 5'-0-maślanu (±)-FTC rozpuszczono w 16 ml mieszaniny 41 buforu pH 8 i CH₃CN. Klarowny roztwór mieszano i dodano 26 mg esterazy z wątroby świńskiej (PLE-A). Postęp reakcji monitorowano za pomocą HPLC (figura 4). Po upływie 20 godzin (52% konwersji) mieszaninę reakcyjną ekstrahowano 2 x 80 ml CHC1 i 80 ml octanu etylu. Połączone ekstrakty organiczne suszono nad bezwodnym M'gSO4, przesączono i zatężono w wyparce obrotowej. Pozostałość eluowano na 2 x 1000 m płytkach pTLC, stosując do elucji octan etylu (dwukrotna elucja) i otrzymano po wyizolowaniu 53 mg (36% w stosunku do wyjściowego materiału) maślanu FTC o 98% nadmiarze enancjomerycznym (e.e.) zgodnie z analizą HPLC. Wzbogacony enancjomerycznie maślan traktowano 1,6 ml metanolu i następnie 0,38 mola (20 mg) metoksylanu sodowego Otrzymaną mieszaninę mieszano w pokojowej temperaturze i postęp reakcji monitorowano za pomocą HPLC. Reakcja została zakończona po upływie 30 minut. Rozpuszczalnik odparowano w wyparce obrotowej i otrzymano 76 mg surowego białego osadu, który następnie eluowano na 1000 m płytkach pTLC, eluując mieszaninę 5:1 octanu i etylu. Izomer (-)-FTC izolowano jako biały osad (33 mg, 82%). Analiza HPLC 5'-O-octanu FTC wykazała 97% nadmiaru enancjomerycznego; [a)d = -120,5° (c = 0,88, bezwodny etanol).

Emulsji w etapie przerobu można uniknąć dodając do mieszaniny reakcyjnej HCCk po zakończeniu reakcji (służy to także denaturacji enzymu). Następnie, odparowuje się rozpuszczalniki pod zmniejszonym ciśnieniem i ekstrahuje chloroformem

Podobnie 1,2 mmola (375 mg) 5-O-maślanu (±)-FTC rozpuszczono w 40 ml mieszaniny 41 buforu o pH 8 i CH₃CN. Do klarownego roztworu dodano podczas mieszania 58 mg esterazy z wątroby świni (PLE-A). Postęp reakcji monitorowano za pomocą HPLC Po upływie 90 minut (38% konwersji) mieszaninę reakcyjną dodano do 150 ml CHC1₃, warstwy rozdzielono i wodą liofilizowano w celu usunięcia rozpuszczalnika. Biały liofilizat ekstrahowano 3 x 10 ml bezwodnego etanolu, ekstrakty przesączono, połączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymano 179 mg surowego oleistego produktu, który oczyszczano na kolumnie 45 x 30 mm z żelem krzemionkowym, stosując do elucji 3 x 75 ml octanu etylu i następnie mieszaninę 5:1 octanu etylu i etanolu. Otrzymano 109 mg (37% w stosunku do wyjściowego maślanu) (+)-FTC w postaci białego, stałego produktu. Analiza HPLC (+)-FTC w postaci 5'-0-maslanu wykazała 97,4% nadmiaru enancjomerycznego (e.e); [aj^ = +113,4° (c = 2,53, bezwodny etanol).

Podobną reakcję przeprowadzono stosując 0,12 mmola (37 mg) 5-O-maŚlanu FTC i 7 mg PS-800 w 4,0 ml mieszaniny 4:1 buforu o pH 8 i CH₃CN. Reakcja zachodziła znacznie wolniej niż dla PLE-A i wymagała 74 godzin dla osiągnięcia 59% konwersji.

Wyodrębniono 11,4 mg maślanu (31% pierwotnej ilości) wykazującego 94% e.e. (HPLC).

Przykład V. Rozdział enancjomerów nukleozydu za pomocą deaminazy cytydynowo-dezoksycytydynowej.

W alternatywnym sposobie, stosowano deaminazę cytydynowo-dezoksycytydynową do rozdziału mieszanin racemicznych 2-hydroksymetylo-5-(cytozynylo-1)-1,3-oksatiolanu i jego pochodnych, w tym 2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1)-1,3-oksatiolanu. Enzym katalizuje dezaminację reszty cytozyny do uracylu. Stwierdzono, że jeden z enancjomerów nukleozydów 1,3-oksatiolanowych jest korzystnym substratem dla deaminazy cytydynowo-dezoksycytydynowej. Enancjomer, który nie jest przekształcany w pochodną uracylową (i tym samym pozostaje zasadowy) jest ekstrahowany z roztworu kwaśnym roztworem. Należy unikać stosowania roztworów silnych kwasów (o pH poniżej 3,0), które mogą rozszczepiać pierścień oksatiolanu.

Deaminazę cytydynowo-dezoksycytydynową można izolować z wątroby szczura lub wątroby ludzkiej, lub otrzymywać drogą ekspresji z sekwencji rekombinanta w prokariotycznym układzie, takim jak w E. coli.

Rozdział enancjomerów nukleozydu cytydynowego za pomocą deaminazy cytydynowo-dezoksycytydynowej może być stosowany jako samodzielna metoda rozdziału lub może być stosowany w kombinacji z innymi metodami rozdziału, w tym enzymatyczną hydrolizą estrów 5'-0-nukleozydu, opisaną uprzednio.

P_rzykład VI. Kombinacja rozdziału enzymatycznego z klasycznymi metodami rozdziału.

Opisany powyżej proces rozdziału mieszanin racemicznych enancjomerów nukleozydów _może być łączony z innymi klasycznymi metodami rozdziału enancjomerów dla zwiększenia czystości optycznej produktu końcowego.

D_o kl_asyc_znych metod rozdziału należą różne techniki fizyczne i chemiczne. Często najb_ard_ziej prostą i _naj_sk_uteczmejszą techniką jest rekrystalizacja wykorzystująca zasadę, że rac_ematy są czę_st_o lep_iej _rozpuszczalne niż ich indywidualne enancjomery. Rekrystalizację moż_na p_rowadzić w dowolnym etapie, w tym na etapie acylowanych związków lub końcowych enancjomerycznych produktów. Jeśli jest skuteczna, to proste podejście może być metodą z wyboru.

Jeśli drogą rekrystalizacji nie udaje się otrzymywanie materiału o dopuszczalnej czystości optycznej, wówczas trzeba sprawdzać inne metody. Jeśli nukleozyd ma charakter zasadowy (np. cytydyna) można stosować chiralne kwasy tworzące mieszaniny diastereomeryczne, które mogą wykazywać znacznie różne rozpuszczalności. Nie ograniczającymi przykładami chiralnych kwasów są kwas jabłkowy, kwas migdałowy, kwas dwubenzoilowinowy, kwas 3-bromokamforo-8-sulfonowy, kwas 10-kamforosulfonowy i kwas dwu-p-toluilowinowy. Podobnie, acylowanie wolnej grupy hydroksylowej także prowadzi w przypadku stosowania pochodnej chiralnego kwasu do tworzenia mieszanin diastereomerycznych, których właściwości fizyczne mogą się różnić dostatecznie, by umożliwić rozdział.

Małe ilości wzbogaconych enancjomerycznie nukleozydów można otrzymywać lub oczyszczać drogą przepuszczania mieszaniny racemicznej przez kolumnę HPLC przeznaczoną do rozdziałów chiralnych, taką np. jak kolumna zawierająca cyklodekstrynę, sprzedawana przez Rainin Corporation

Przykład VII. Rozdział mieszanin racemicznych nukleozydów za pomocą HPLC.

Rozdział C4'-enancjomerów (±)-FTC prowadzono stosując zawierającą chiralną cyklodekstrynę (cyclobond AC-I) kolumnę firmy Rainin Corporation (Woburn, MA). Stosowano następujące warunki: izokratyczny 0,5% roztwór metanolu w wodzie; szybkość przepływu 1 ml/min.; detekcja UV przy 262 nm. Metanol do HPLC otrzymano z firmy J. T. Baker (Phillisburg, NJ). Wstrzykiwano racemiczne mieszaniny i zbierano frakcje. Frakcje zawierające każdy z enancjomerów zbierano, zamrożono i następnie zliofilizowano. Związki charakteryzowano za pomocą spektroskopii w UV i ich czasów retencji w HPLC. Zwykle (-)-enancjomery miały niższe czasy retencji niż (+)-enancjomery (patrz J. Liquid Chromatography, 7, 353-376, 1984). Stężenie związków oznaczano za pomocą spektroskopii UV, stosując standardowy roztwór o znanym stężeniu (15 |iM), sporządzony w wodzie do badania biologicznego. Czasy retencji dla rozdzielonych enancjomerów podano w tabeli 2.

Tabela 2

Czasy retencji enancjomerów FTC

Związek	RXmin.)
(-)-FTC	8,3
(+)-FTC	8,7

Przykład VIII. Alternatywne metody rozdziału enancjomerów FTC przy zastosowaniu chiralnej kolumny.

Przy zastosowaniu kolumny Cyclobond I-Ac (5 mm,2 5cm x 4,6 mn-pRainin Corporation, Wobum, MA, nr katalogowy AST-41049), szybkości przepływu 0,6 ml/minutę izokratycznego metanolu (Fisher Scientific, Inc., czystość do HPLC, nr katalogowy A-452-4, w wodzie) i detekcji w UV przy 262 nm, enancjomery FTC wykazywały czasy retencji odpowiednio 12,68 minut ((-)-FTC) i 13,20 minut ((+)-FTC).

Przy zastosowaniu kolumny Chiralpak AS (10 pm, 25 cm x 4,6 mm, J. T. Baker Inc., Phillisburg, NJ, nr katalogowy 7406-00, nr seryjny 09-29-10320), szybkości przepływu 0,8 ml/minutę alkoholu izopropylowego (czystość do HPLC, Fisher Scientific, Inc., nr katalogowy A-451-4) i detekcji w UV przy 262 nm, enancjomery FTC wykazywały czasy retencji odpowiednio 5,9 minut ((-)-FTC) i 9,8 minut ((+)-FTC).

Aktywność biologiczną nowego nukleozydu i jego poszczególnych enancjomerów przedstawiono w poniższych testach.

Tt 1. Zdolność 2-hydroksymetylo-2-(2-fluorocytozynylo-1)-1,3-oksatlolanu (FTC) do hamowania replikacji HIV.

171 150

Często jest pożądane przeprowadzenie skriningu wielu racemicznych mieszanin nukleozydów, jako wstępnego etapu oceny, na podstawie której można dokonywać dalszego rozdziału na wzbogacone enancjomerycznie składniki i prowadzić dalsze badania aktywności przeciwwirusowej. Zdolność nukłeozydów do hamowania HIV można oceniać różnymi technikami doświadczalnymi. W stosowanej tutaj i opisanej szczegółowo poniżej technice mierzy się hamowanie replikacji wirusa z pobudzonych fitohemoglutyniną (PHA) jednojądrzastych komórkach (PBM) z obwodowej krwi ludzkiej zakażonej HIV-1 (szczep LAV). Dość wytwarzanego wirusa oznacza się drogą pomiaru kodowanego wirusem enzymu, odwrotnej transkryptazy. Ilość wytwarzanego enzymu jest proporcjonalna do ilości wytwarzanego wirusa W tabeli 3 podano wartości EC50 (stężenie nukleozydu hamujące o 50% replikację wirusa w komórkach PBM z uwzględnieniem błędu ocenianego na 10 %) oraz wartości IC50 (stężenie nukleozydu hamujące o 50% wzrost pobudzanych nitrogenem niezakazonych ludzkich komórek PBM), dla szeregu nukleozydów (±)-oksatiolanowych.

Test 2. Aktywność anty-HIV nukleozydów (±)-1,3-oksatiolanowych.

A. Trzydniowe, pobudzane fitohemoglutyniną komórki PBM (10⁶ komórek/ml) od surowiczo-ujemnych w stosunku do HBV i HIV-1 zdrowych dawców zakażono wirusem HIV-1 (szczep LAV) w stężeniu na ml wynoszącym około 100 razy więcej niż 50% dawka zakażająca hodowlę komórkową (TICD 50) i następnie hodowano bez dodatku lub z dodatkiem różnych stężeń związków przeciwwirusowych.

B. Po upływie około 1 godziny od zakażenia, podłoże z testowanym związkiem (dwukrotne stężenie końcowe w podłożu) lub bez tego związku, przeniesiono do kolb (5 ml, końcowa objętość 10 ml). Jako pozytywną kontrolę stosowano AZT.

C. Komórki poddano działaniu wirusa (około 2 x 105 dpm/ml, zgodnie z oznaczeniem za pomocą transkryptazy) i następnie umieszczono w inkubatorze w C02. HIV-1 (szczep LAV) otrzymano z Disease Control, Atlanta, Georgia. Do hodowania komórek PBM, zbierania wirusa i oznaczania aktywności odwrotnej transkryptazy stosowano metody opisane przez McDougal'a i wsp. w J. Immun. Meth., 76, 171-183 (1985) oraz Spira i wsp. w Clin. Meth., 25, 97-99 (1987), z tym tylko, że do podłoża nie dodawano fungizonu (patrz: Schinazi i wsp., Antimicrob. Agents Chemother., 32, 1784-1787 (1988); oraz ibidem, 34, 1061-1067 (1990)).

D. W szóstym dniu komórki i supernatant przeniesiono do 15 ml probówki i wirowano przy około 900 g w ciągu 10 minut. Usunięto 5 ml supematantu i wirus zatężono drogą wirowania przy 40000 obrotach/minutę w ciągu 30 minut (Beckman 70.1 Ti roztor). Rozpuszczalne pastylki wirusa przygotowano do oznaczenia poziomów odwrotnej transkryptazy. Wyniki wyrażono w dpm/ml pobranego supematantu. Wirus z mniejszej objętości supematantu (1 ml) można także zatężać drogą wirowania przed rozpuszczeniem i oznaczeniem poziomów odwrotnej transkryptazy.

Średnie skuteczne stężenie (EC50) oznaczono metodą średniego' działania (Antimicrob Agents Chemother., 30, 491-498 (1986)). Sporządza się wykres zależności procentowego hamowania wirusa, oznaczanego z pomiarów odwrotnej transkryptazy, od mikromolamego stężenia związku. EC₅o jest to stężenie związku, przy którym zachodzi 50% hamowania wzrostu wirusa

E. Pobudzane mitogenem niezakażone ludzkie komórki PBM (3,8 x 105 komórek/ml) hodowano bez i w obecności leku, w warunkaęh podobnych do opisanych uprzednio badaniach przeciwwirusowych Komórki zliczano po 6 dniach za pomocą hemocytometru i metodą eliminacji błękitu trypanowego, opisaną przez SchinazTego i wsp. w Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 22(3), 499 (1982). IC 50 jest to stężenie z^viązku ha^nujące o 50/Ό nor^malny wzrost komórek.

Tabela 3

EC^ i IC50 dla różnych analogów nukleozydów 1,3-oksatięlanowych w ludzkich komórkach PBM

Kod	X lub Y	R	Aktywność przeciwwirusowa EC50, pM	Cytotoksyczność IC50 μΜ
DLS-009	x = o	H	> 100	> 100
DLS-010	x = o	Me	64,4	> 100
DLS-027	x = o	F	> 100	> 100
DLS-028	X = 0	Cl	60,8	> 100
DLS-044	x = o	Br	> 100	> 100
DLS-029	x = 0	J	> 100	> 100
DLS-020	Y = nh₂	H	0,02	> 100
DLS-011	y = nh₂	Me	> 10	> 100
DLS-022	y = nh₂	F	0,01	>100
DLS-023	Y = NH2	Cl	38,7	> 100
DLS-021	Y = NH2	Br	77,4	> 100
DLS-026	Y = NH2	J	0,72	> 100
DLS-058 (-)	Y = NH2	F	0,008	> 100
DLS-059 (+)	Y = nh₂	F	0,84	> 100
DLS-053	y = nh₂	cf₃	60,7	> 100

Jak podano w tabeli 3, generalnie, podstawione nukleozydy cytozyno-1,3-oksatiolanowe są bardziej aktywne niż odpowiednie nukleozydy uracylowe. Błąd w pomiarach EC₅0 i IC₅o oceniany jest na ± 10%.

Jeden ze związków, (±)-FTC (określony jako DLS-022, związek 8) nie tylko wykazuje wyjątkową aktywność (około 10 nM w komórkach PBM), ale także zupełnie niską toksyczność (> 100 w komórkach PBM, Vero i CEM).

IC50 dla (±)-FTC wynosi powyżej 100 pM, co wskazuje, że związek nie jest toksyczny dla niezakażonych komórek PBM w badaniach do 100 pM.

Test 3. Aktywność przeciwwirusowa enancjomerów FTC rozdzielanych za pomocą HPLC.

Enancjomery FTC wyodrębniano metodą opisaną w przykładzie VII i aktywność przeciwwirusową oznaczano metodą podaną w teście 2. Wyniki przedstawiono w tabeli 4 i zilustrowano na figurze 5.

Tabela 4

Aktywność przedwwirusowa (+)- i (-)-enancjomerów FTC

Podawane stężenie (gM)	DPM/ml	% hamowania (niekorygowany)	EC50 (gM)
FTC (±)	0,0001	73,755	26,6	0,018
	0,005	83,005	16,3
	0,01	60,465	41,3
	0,05	34,120	70,4
	0,1	14,160	92,4
	0,5	18,095	88,1
	1	7,555	99,7
	5	7,940	99,3
	10	5,810	101,7
FTC (-)	0,001	76,275	23,8	0,02
	0,005	58,590	43,3
	0,01	75,350	24,8
	0,05	28,890	76,2
	0,1	13,175	93,5
	0,5	9,485	97,6
FTC (+)	0,001	94,340	3,8	0,28
	0,005	107,430	-10,6
	0,01	99,465	-1,8
	0,05	87,120	11,8
	0,1	86,340	12,7
	0,5	33,225	71,4

Jak wynika z danych z tabeli 4, w tym doświadczeniu enancjomer (-)-FTC jest o około jeden rząd wielkości bardziej aktywny niż enanqomer (+)-FTC i wykazuje w przybliżeniu taką samą aktywność anty-HIV jak mieszanina racemiczna. Ani enancjomery ani mieszanina racemiczna nie jest toksyczna do 100 gM, co oznaczono metodą eliminacji błękitu trypanowego w ludzkich komórkach PBM.

Test 4. Aktywność przeciwwirusowa enancjomerów FTC rozdzielanych metodą z przykładu IV.

Enancjomery (±)-FTC były także rozdzielane metodą z przykładu IV, a aktywność przeciwwirusową badano metodą z testu 2. Wyniki zilustrowano na figurze 6. Jak pokazano na figurze 6, EC50 racemicznej mieszaniny FTC wynosiło 0,017 gM, EC₅0 dla (-)-FTC 0,0077 gM oraz EC50 dla (+)-FTC 0,84 gM.

Test 5. Wchłanianie (±)-FTC przez ludzkie komórki PBM.

Przeprowadzono badania, stosując znakowany FTC, mające na celu ustalenie poziomów wewnątrzkomórkowych macierzystego leku i jego metabolitów. Wszystkie badania powtarzano dwukrotnie. Ludzkie jednojądrzaste komórki (PBM) z obwodowej krwi zawieszono w podłożu RPMI 1640 zawierającym 10% surowicy płodu cielęcia i antybiotyki (2 x 10⁶ komórek/ml, dla każdego przedziału czasu) i inkubowano z dodatkiem 10 gM FTC (o aktywności właściwej około 700 dpm/pmol) Komórki poddawano działaniu leku w ciągu 2, 6, 12 i 24 godzin. Po upływie kolejnych przedziałów czasu komórki przemywano dwukrotnie zimnym roztworem zrównoważonej soli Hanka. Ekstrakcję prowadzono z dodatkiem 0,2 ml 60% zimnego roztworu metanolu w wodzie, przechowywano w ciągu nocy w temperaturze -70°C. Następnego dnia zawiesiny wirowano i ekstrakcję powtórzono dwukrotnie w ciągu 0,5 godziny, w temperaturze -70°C. Wszystkie supematanty (0,6 ml) zliofillzowano. Pozostałości zawieszono w 250 gl wody i próbki po 50 do 100 gl analizowano za pomocą HPLC. Ocenę ilościową zawartości wewnątrzkomórkowej macierzystego leku i jego metabolitów prowadzono za pomocą HPLC. Ze względu na potencjalną nietrwałość niektórych związków w kwasie, w procesie rozdziału metabolitów stosowano układ buforujący bliski fizjologicznego pH.

Na figurze 7 przedstawiono wykres zależności obecności (wchłonięcia) trytylowanego (±)-FTC w ludzkich komórkach PBM (średnia z dwóch oznaczeń) w czasie (godziny) od pmol/10⁶ komórek. Badania wchłaniania wykazują, że znakowany FTC jest łatwo wychwytywany przez ludzkie limfocyty, w których powstają bardzo duże ilości pochodnej 5^,-trójfosforanowej FTC.

Test 6. Aktywność przeciwretrowirusowa FTC w różnych liniach komórkowych.

Aktywność przeciwretrowirusową FTC oznaczano w wielu liniach komórkowych stosując postępowanie podobne, ale nie identyczne, do przedstawionego w teście 2. Linie komórkowe otrzymano od dawców ludzkich z AIDS Research and Reference Reagent Program, NIH, Rockville, Maryland, ATCC lub z Czerwonego Krzyża. Komórki CEM z niedoborem kinazy tymidynowej preparowano drogą kolejnych pasaży komórek CEM w obecności 5-bromo-2'-dezoksyurydyny. Wyniki przedstawiono w tabeli 5.

Tabela 5

Aktywność przeciwretrowirusowa FTC w różnych układach komórkowych

Układ komórkowy (szczep wirusa)	EC_5t) (pM) (±)-FTC
HIV-1
PMBC (LAV-1)	0,027
MT2 (HTLV_niB	0,89
CEM (LAV-1)	0,08
CEM-TK (LAV-1)	0,026
CEM (HTLV„ib)NIH	0,09
HlV-2
PBMC (ROD2)	0,0038 (±>FTC 0,0007 (-)-FTC 0,0260 (+) FTC
SIV
AA-2 (SIV251)	4,6
C-8166 (SIV251)	<8,0
FTV
CrFK (61E)

Test 7. Wydalanie (±)-FTC z ludzkich komórek PBM

Przeprowadzono badania z zastosowaniem znakowanego FTC w celu ustalenia poziomów macierzystego leku i jego metabolitów wewnątrz komórek po inkubowaniu w pożywkach z lekiem w ciągu 24 godzin i następnie usunięciu leku. W tym badaniu dokonywano pomiaru czasu niezbędnego do obniżenia poziomów wewnątrzkomórkowych trójfosforanów. Każde doświadczenie prowadzono dwukrotnie. Niezakażone komórki (2 x 106 _ml) zawieszano w odpowiednim podłożu uzupełnionym o surowicę (10 ml dla każdego przedziału czasu) i inkubowano w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2. Stężenie znakowanego FTC wynosiło 10 pM. Po przetrzymaniu komórek ze znakowanym związkiem w ciągu 24 godzin przemyto je starannie i dodano świeżego podłoża bez związku przeciwwirusowego (godzina 0). Po upływie 0, 2, 4, 6, 12 i 48 godzin (drugi okres inkubacji) komórki usuwano i natychmiast eks22

171 150 trahowano zimnym 60% roztworem metanolu w wodzie. Ekstrakty, otrzymane drogą wirowania i usunięcia pastylek zawierających komórki, zliofilizowano i przechowywano w temperaturze -70°C. Przed poddaniem analizie powyższy materiał zawieszono w 250 mikrolitrach buforu do HPLC i natychmiast analizowano. Oznaczenia ilościowe obecnego wewnątrz komórki macierzystego leku i metabolitów wykonywano za pomocą HPLC, stosując do tego celu albo aparat Micromeritios albo aparat Hewlett-Packard model 1090 HLPC, z anionowymienną kolumną Partisil 10 SAX (Whatman, Inc.), szybkość przepływu 1 ml/minutę, ciśnienie 287 MPa i detekcję w UV przy 262 nm. Faza ruchoma składała się z dejonizowanej wody (A), 2 mM NaH₂PC>4/16mM NaOAC, pH6,6 (B) 15 mM NaH₂P120,2 mM NaOAC, pH6,6 (C) i 100 mM NaH₂P04/800 mM NaOAC, pH 6,6 (D).

Sposób rozdziału: w ciągu 5 minut zokratycznie A, następnie 15 minut w liniowym gradiencie do 100% B, następnie 20 minut w liniowym gradiencie do 100% C, następnie 10 minut w liniowym gradiencie do 100% D i w końcu 30 minut izokratycznie 100% D.

Czasy retencji (w minutach) w komórkach ludzkich

Związek	Niezmieniony	Jednofosforan	Dwufosforan	Trójfosforan
(±)-FTC	5,0	39,0	55,0	68,0

Na figurze 8 przedstawiono wykres wydalania znakowanego (±)-FTC z ludzkich komórek PBM, podany jako zależność stężenia leku (pmoli/10⁶ komórek) od czasu po usunięciu leku. Jak wynika z figury 8, czas wewnątrzkomórkowego półtrwania dla trójfosforanu FTC wynosi około 12 godzin i związek ten można z łatwością wykryć wewnątrz komórki w stężeniach 1-5 μΜ po 48 godzinach od usunięcia z zewnątrz komórek leku. Jest to znacznie powyżej wartości EC50 dla tego związku. Ponadto, powinowactwo (K¹) trójfosforanu (±)-FTC przy stosowaniu HIV RT wynosi 0,2 pM, czyli poniżej poziomu stężenia po 48 godzinach.

Test 8. Aktywność anty-HIV dopuszczalnych w farmacji pochodnych (±)-FTC.

a Badano szereg dopuszczalnych w farmacji pochodnych (±)-FTC, otrzymanych przez podstawienie w pozycjach 5' i N⁴, na aktywność anty-HIV, w komórkach PBM. Stosowano postępowame podobne do opisanego w teście 2. Uzyskano następujące wyniki. 5'-0-maślan (±)-FTC wykazywał ECo = 0,0017; pochodna N4-acetylowa miała EC50 = 0,0028, a 5'-0-maślan N4-estru (±)-FTC wykazywał EC50 = 0,0058

b. Aktywność anty-HIV 5'-O-maślanu (±)-FTC w układzie MT4 (EC50) wynosiła 0,04 pM. W tym samym badaniu, nieacylowany (±)-FTC miał IC50 = 0,52 pM. IC50 dla AZT w tym układzie wynosił 0,09 pM.

Zdolność FTC do hamowania replikacji HBV Test 9. Badanie aktywności enancjomerów (+) i (-) FTC w hodowlach komórek 2.2.15.

Zdolność enancjomerów FTC do hamowania wzrostu wirusa w hodowlach komórek 2.2.15 (komórki HepG2 transformowane virionem zapalenia wątroby) opisano poniżej.

Opis badania działania przeciwwirusowego w tej hodowli i analizę HBV DNA opisali Korba i Milman, 1991, Antiviral Res., 15, 217. Badania aktywności przeciwwirusowej wykonywano na dwóch oddzielnych pasażach komórek. Wszystkie studzienki na wszystkich płytkach zaszczepiano materiałem o takiej samej gęstości, w tym samym czasie.

Parametry badań

Ze względu na naturalne różnice w poziomach zarówno wewnątrzkomórkowego, jak i zewnątrzkomórkowego DNA wirusa HBV, tylko obniżenie więcej niż 3,5-krotne (dla DNA wiriona HBV) lub 3,0-krotne (dla produktów przejściowych replikacji DNA wirusa HBV) w stosunku do średnich poziomów dla tych form wirusa HBV w nietraktowanych komórkach przyjmuje się statystycznie znaczące (P < 0,05). Poziomy zintegrowanego DNA wirusa HBV w każdym komórkowym preparacie DNA (które pozostają stałe dla jednej komórki w tych do171150 świadczeniach), wykorzystano do obliczania poziomów wewnątrzkomórkowych form DNA wirusa HBV, zapewniając w ten sposób porównywanie równych ilości komórkowego DNA między oddzielnymi próbkami.

Typowe wartości dla pozakomórkowego DNA wiriona HBV w metraktowcnych komórkach wynosiły 50 do 150 pg/ml pożywki hodowlanej (średnio około 76 pg/ml). Wewnątrzkomórkowe przejściowe produkty replikacji DNA wirusa HBV w nietraktewatych komórkach znajdowały się w ilości 50 do 100 pg/gg komórkowego DNA (średnio około 74 pg/gg komórkowego DNA). Generalnie, obniżenie poziomów wewnątrzkomórkowego DNA wirusa HBV wywołane traktowaniem związkiem przeciwwlrusewym jest słabiej wyrażone i zcyhoZzi wolniej niz obniżanie poziomów DNA wirionu HBV (Korba i Milman, 1991, Antivird Res., 15, 217).

Sposób, w jaki przeprowadzono analizę hybrydyzacją w tych ZoświaZyzeniayh dawał w rezultacie równoważnik około 1,0 pg wewnątrzkomórkowego DNA HBV na 2-3 kopie genomu/komórkę oraz 1,0 pg/ml pozakomórkowdgo DNA HBV na 3 r 10⁵ cząstek wirusa/ml.

Badanie toksyczności

Przeprowadzono badania toksccznośyi w celu stwierdzenia czy obserwowane działanie przeciwwirusowe jest wynikiem ogólnego oddziaływania na żywotność komórek. Stosowana metoda polega na pomiarach wchłaniania czerwieni obojętnej i jest standardową i szeroko stosowaną metodą badania żywotności komórek w różnych układach wirus-gospodarz, w tym HSV i HIV. Badania toksykologiczne prowadzono na płytkach do hodowli tkankowej, zawierającycC 96 studzienek o płaskich dnach. Komórki przeznaczone do baZcnia toksyczności hodowano i traktowano testowanymi związkami stosując taki sam schemat postępowania, jaki opisano uprzednio dla badania działania przeciw-wirusowego. Każdy związek testowano w 4 stężenicyC. Dla każdego stężenia test powtarzano trzy razy (studzienki A, B i C). Wchłanianie czerwieni obojętnej stosowano do oznaczania względnego poziomu toksyczności. Absorbancję wchłoniętego barwnika przy 510 nm (Asm) wykorzystywano do analizę lłościewej. Uzyskane wyniki przedstawiono jako procent przeciętnych wartości Am z 9 oddzielnych hodowii nietraktowanęch komórek, prowaZzonyyC na tej samej płytce o 96 studzienkach, na której badano testowane związki. Wchłanianie barwnika w 9 kontrolnych hodowla-C na płytce 5 wynosiło od 91,6% do 110,4%, a na płytce 6 od 96,6% do 109%. Wyniki badania przedstawiono w tabeli 6.

Tabela 6

Badanie toksyczności testowanych związków w komórkach 2.2.15

Płytka	Związek	Stężenie gM	Wchłanianie barwnika (% kontroli) Studzienka
A	B	C
5	DMSO	10*	0,7	1,6	0,9
		3,3	55,9	68,7	61,7
		1,0	91,2	96,4	106,8
		0,3	98,7	102,9	93,5
6	(-)-FTC	300	53,0	51,1	51,5
		100	64,1	66,6	77,6
		30	98,7	94,3	96,4
		10	94,3	94,9	92,2
6	(+)-FTC	300	43,4	56,7	58,5
		100	77,7	66,3	72,1
		30	81,1	88,3	88,1
		10	90,9	99,4	90,5

‘ Dla DMSO stężenia są podane w proydntcyC w stosunku do wy|śyle4dgo roztworu

171 150

Ocena toksyczności

Jak wynika z tabeli 6, nie obserwowano znaczącej toksyczności (większej niż zmniejszenie o 50% poziomów wchłaniania barwnika obserwowanych dla komórek kontrolnych) testoOba

Λ/Ίΐι mnn ιργϊιχζωι • W W11 UOV VT wanych związków w stężeniach stosowanych w badaniach aktywności przeci testowane związki, (-)-FTC i (+)-FTC, okazały się toksyczne w najwyższych stężeniach stosowanych w testach na toksyczność (330 pM).

Ocena aktywności przeciwwirusowej

Kontrola

Poza naturalnymi wahaniami, poziomy DNA wirusa HBV i wewnątrzkomórkowych przejściowych produktów replikacji wirusa HBV (HBV RI) pozostawały stałe w nietraktowanej komórce w okresie zakażenia. DMSO w stężeniu 1%o nie wpływał na poziomy replikacji HBV w hodowlach komórek 2.2.15.

Jak pokazano w tabeli 7, zarówno (-)-FTC jak i (+)-FTC znacząco hamują replikację HBV w testowanych poziomach. Jak pokazano w tabeli 8, (-)-FTC hamuje jeszcze znaczącą syntezę DNA wirionu HBV i wewnątrzkomórkowego DNA wirusa HBV w stężeniach 4, 1 i 0,25 pM).

Tabela 7

Oddziaływanie testowanych związków na rozwój HBV w hodowlach komórek 2.2.15

Studzienka	Traktowanie	DNA wiriona HBV (pg/ml podłoża hodowlanego)	Wewnątrzkomórkowy DNA HBV (pg/pg DNA w komórkach)
Dzień 0	Dzień 4	Dzień 9	MONO	RI
7A	nietraktowane komórki	59	75	94	2,7	93
7B	nietraktowane komórki	47	64	88	2,5	93
8A	nietraktowane komórki	65	100	71	2,2	97
8B	nietraktowane komórki	77	65	110	2,4	62
7K	DMSO 1,00%	100	50	48	1,9	95
7L	DMSO 1,00%	48	96	54	2,8	98
8K	DMSO 1,00%	93	63	68	2,2	86
8L	DMSO 1,00%	66	57	59	1,6	97
9U	(-)-FTC” 10 pM	120	36	1	1,1	14
9V	(-)-FTC 10 pM	89	48	1	1,5	19
10U	(-)-FTC 10 pM	58	41	0,1	1,9	13
10V	(-)-FTC 10 pM	110	32	0,1	1,2	16
9W	(+)-FTC** 10 pM	88	42	0,1	0,8	14
9X	(+)-FTC 10 pM	58	57	0,2	0,4	19
10W	(+)-FTC 10 pM	69	55	0,1	0,7	17
10X	(+)-FTC 10 pM	45	39	0,1	0,4	15

‘ Granica czułości dla DNA winona HBV wynosiła 0,1 pg/ml ** Wewnątrzkomórkowy DNA wirusa HBV analizowano po upływie 24 godzin po 9 dniu traktowania. Poziomy zintegrowanego DNA HBV w każdym preparacie komórkowego DNA wykorzystywano do obliczania poziomów epizomalnyeh genomów 3,2 Kb HBV (MONO) i przejściowych produktów replikacji (RI) DNA wirusa HBV

Tabela 8

Oddziaływanie testowanych związków na rozwój HBV w hodowlach komórek 2 2.15

Studzienka	Traktowanie	DNA wiriona HBV (pg/ml podłoża hodowlanego)	Wewnątrzkomórkowy DNA HBV (pg/(g DNA w komórkach)
Dzień 0	Dzień 4	Dzień 9	MONO	RI
31A	nietraktowane komórki	64	54	65	2,8	65
3 1B	tt	51	54	77	2,0	53
32A	«	100	76	56	3,5	81
32B	''	53	97	83	3,1	68
35A	,(-)-FTC** 4 (M	74	27	>0,1	1,4	1
35B		87	28	>0,1	0,5	1
36A	11	120	20	1	0,9	1
36B	tt	59	16	0,2	0,2	2
35C	(-)-FTC** 1 (M	70	13	>0,1	1,7	2
35D	''	62	15	>0,1	1,2	3
36C	«	60	22	1	1,4	2
36D	H	89	28	0,3	1,5	4
35E	(-)-FTC 0,25 (M	84	15	>0,1	1,5	4
35F -	''	89	16	4	2,2	4
36E	tt	66	13	1	1,8	8
36F	II	49	19	0,1	0,3	9

* Granica czułości dla DNA wiriona HBV wynosiła 0, i pg/ml.

Wewnątrzkomórkowy DNA wirusa HBV analizowano po upływie 24 godzin po 9 dniu traktowania. Poziomy zintegrowanego DNA HBV w każdym preparacie komórkowego DNA wykorzystywano do obliczania poziomów epizomalnych genomów 3,2 Kb HBV (MONO) i przejściowych produktów replikacji (RI) DNA wirusa HBV

Test 10. Wchłanianie (±)-FTC w komórkach ludzkiej wątroby; aktywność FTC wobec HBV. Powtórzono postępowanie z testu 5 stosując komórki ludzkiej wątroby (komórki HepG2, dostępne w ATCC) do oznaczenia wchłaniania i metabolizmu FTC w tych komórkach. Jak pokazano na figurze 9, (±)-FTC jest wchłaniany przez komórki HepG2 w dużych ilościach. Powyższe komórki ludzkiej wątroby metabolizują duzy procent (±)-FTC do trójfosforanu (±)-FTC.

Powyższe dane, w połączeniu z innymi danymi podanymi w opisie wskazują, że (±)-FTC, jak też jego (-) i (+) enancjomery, są fosforylowane w komórkach wątroby. Powyższe komórki mogą być transformowane wirusem zapalenia wątroby B.

Test 11. Wydalanie FTC z ludzkich komórek HepG2.

Figura 10 ilustruje wydalanie /³H/-(±)-FTC i jego fosforylowanych pochodnych z ludzkich komórek HepG2 wyrażane jako pmol/106 komórek w czasie, po 24 godzinach przetrzymywania komórek z 10 (M /³H/-(±)-FTC (700 DPM/pmol) i oznaczaniu stężenia związku po 24 godzinach od usunięcia leku.

Figura 11 ilustruje obniżenie połączonego stężenia /³H/-(±)-FTC i jego fosforylowanych pochodnych w ludzkich komórkach HepG2 po inkubowaniu z 10 (M /³H/-(±)-FTC (700 DPM/pmol) w ciągu 24 godzin, wyrażone jako ilość pmoli/106 komórek w czasie.

171 150

Jak z tego wynika, nawet po 48 godzinach, ciągle jeszcze ponad 1 gM aktywnego związku jest obecne w komórkach, co jest znacznie większe niż EC% związku.

Toksyczność w granuiocyto-makrofagowych prekursorowych komórkach Test 12. Wpływ FTC na tworzenie kolonii granuiocyto-makrofagowych prekursorowych komórek.

Figura 12 obrazuje na wykresie wpływ (-) i (+) enancjomerów FTC na tworzenie kolonii granuiocyto-makrofagowych prekursorowych komórek, wyrażony w procentach przezycia w zależności od stężenia w gM [(-)-FTC (puste kółko), (+)-FTC (zaciemnione kółko) i AZT (zaciemniony kwadracik)]. Jak widać, enancjomer (-)-FTC jest mniej toksyczny, to znaczy wykazuje wyższą wartość IC₅₀ niż enancjomer (+) lub AZT, dla tej linii komórek.

Farmakokinetyka FTC

Test 13. Metabolizm FTC po podaniu szczurom.

(±)-FTC podawano dożylnie szczurom w dawkach 10, 50 i 100 mg/kg i określano pole powierzchni pod krzywą stężenia leku w czasie (AUC), całkowity klirens (CL), objętość dystrybucji w ustalonym stanie (Vss), średni czas przebywania (MRT) i okres półtrwania (Εο). Wyniki doświadczeń przedstawiono w tabeli 9.

Tabela 9

Parametry farmakokinetyczne FTC po podaniu dożylnym szczurom w dawkach 10, 50 i 100 mg/kg*

Dawka mg/kg	AUC mg h/L	CL L/h/kg	Vss L/kg	MRT godz.	t_ie godz.
10	9,65	0,988	0,758	0,768	0,757
50	57,11	0,874	0,699	0,800	0,815
100	120,72	0,830	0,663	0,798	0,969

' AUC - pols powierzchni pod krzywą stężenia leku w osoczu w czasie, CL - całkowity klirens; V_S5 - objętość dystrybucji w ustalonym stanie, MRT - Średni czas przebywania, tu - okres półtrwania.

Test 14. Parametry farmakokinetyczne FTC po podaniu dożylnym i doustnym

Niezależnie od modelu parametry farmakokinetyczne wyznaczano podając małpom rezusom dożylnie (IV) i doustnie (P.O.) 33,3 mg/kg (±)-FTC. Wyniki przedstawiono w tabeli 10. Co jest ważne, średnia biodostępność związku u małp wynosiła 73% (± 6%).

Tabela 10

Niezależne parametry farmakokinetyczne dla FTC pod dożylnym (I.V.) lub doustnym podaniu 33,3 mg/kg rezusom*

Małpa	AUC mg h/L	CL L/h/kg	Vss L/kg	MRT h	tl/2 h	Kit	F %
1	2	3	4	5	6	7	8
LV.
RUh	19,14	1,74	2,71	1,56	1,28
RMi	26,31	1,26	1,97	1,56	1,22
RJd	22,51	1,48	2,00	1,36	1,47
Średnia	22,65	1,49	2,23	1,49	1,32
Standardowe odchylenie	3,59	0,24	0,42	0,12	0,13

1	2	3	4	5	6	7	8
P.O.
RUh	13,21			2,07	1 co 1,UO	Λ A O 0,40	71
RMi	21,11			2,32	1,08	0,43	80
RJd	15,29			3,23	1,47	0,31	68
Średnia	16,54			2,54	1,38	0,41	73( ±6)
Standardowe odchylenie	4,09			0,61	0,26	0,09	6,24

‘ AUC - pole powierzchni pod krzywą stężenia Icku w osoczu w czasie, CL - całkowity klirens; Vss - objętość dystrybugi w ustalonym stanie, MRT - średni czas przebywania, t,„ - okres półtrwania.

Tabela 11

Stosunek zawartości w CSF i surowicy krwi FTC i jego dezaminowego metabolitu po 1 godzinie po podaniu

Małpa	Droga podawania	FTC	Metabolit (FTU)
RUh	dożylnie	0,076	0,024
RMi	dożylnie	0,062	0,032
RJd	dożylnie	0,162	0,052
Średnia	0,100	0,036
± standardowe odchylenie	0,054	0,014
RUh	doustnie	0,048	0,026
RMi	doustnie	0,039	0,037
RJd	doustnie	0,117	0,055
Średnia	0,068	0,039
± standardowe odchylenie	0,043	0,015

Test 15. Stosunek zawartości w CSF i surowicy krwi FTC i jego metabolitów u małp rezusów.

Zdolność (±)-FTC do przekraczania bariery krew-mózg badano podając 33,3 mg/kg aktywnego związku małpom rezusom i oznaczając ilość (±)-FTC w płynie mózgowo-rdzeniowym i w surowicy krwi po upływie 1 godziny po podaniu. Wyniki zestawiono w tabeli 11. Dane wykazują, że znaczna ilość aktywnego związku przekracza barierę krew-mózg u tych ssaków.

Wytwarzanie kompozycji farmaceutycznych

Ludzie cierpiący na choroby wywoływane przez HIV lub HBV mogą być leczeni drogą podawania skutecznej ilości (±)-FTC lub jego (-) albo (+) enancjomeru lub dopuszczalnej w farmacji pochodnej albo soli powyższego związku; razem z dopuszczalnym w farmacji nośnikiem lub rozcieńczalnikiem. Aktywne związki można podawać w dowolny odpowiedni sposób, np. doustnie, pozajelitowo, dożylnie, śródskórnie, podskórnie lub miejscowo, w postaci preparatów ciekłych lub stałych.

Aktywny związek jest zawarty w dopuszczalnym w farmacji nośniku lub rozpuszczalniku w ilości dostatecznej do dostarczenia pacjentowi do skutecznego hamowania in vivo replikacji wirusa, w szczególności HIV i HBV, bez powodowania poważnych działań toksycznych u leczonych pacjentów. Określenie ilość hamująca oznacza ilość aktywnej substancji wystarczającej do wywoływania działania hamującego, oznaczonego np. jedną z opisanych tutaj metod.

171 150

Korzystna dawka (-), (+) lub (±)-FTC dla wszystkich wspomnianych powyżej chorób wynosi od około 1 do 50 mg/kg, korzystnie 1-20 mg/kg ciężaru ciała na dzień, bardziej ogólnie od 0,1 do około 100 mg kg ciężaru ciała biorcy dziennie. Skuteczną dawkę dopuszczalnych w farmacji pochodnych można obliczyć na podstawie ilości wagowej macierzystego nukleozydu, jaką należy podawać. Jeśli sama pochodna wykazuje aktywność, wówczas właściwe dawkowanie można ustalić jak powyżej, na podstawie ciężaru pochodnej albo innymi sposobami znanymi specjalistom.

Związek dogodnie podaje się w dawkach jednostkowych w odpowiedniej postaci, w tym, ale nie wyłącznie, w ilości 7-3000 mg, korzystnie 70-1400 mg aktywnej substancji w dawce jednostkowej. Dawki ustne wynoszące 50-1000 mg są zwykle odpowiednie.

W idealnym- przypadku, substancja aktywna powinna być podawana tak, by osiągnąć szczytowe stężenie w surowicy aktywnego związku wynoszące od około 0,2 do 70 pM, korzystnie około 1,0 do 10 pM. Można to uzyskać, np. przez podawanie drogą iniekcji dożylnej 0,1 do 5% roztworu substancji aktywnej w roztworze soli fizjologicznej lub jednej dużej dawki aktywnej substancji.

Stężenie aktywnego związku w kompozycji zależy od absorpcji, inaktywacji i szybkości wydzielania leku oraz od innych czynników znanych specjalistom. Należy także zauważyć, że wartości dawkowania mogą być różne w zależności od przebiegu leczonej choroby. Jest również zrozumiałe, że dla każdego indywidualnego pacjenta należy ustalić specyficzny reżim dawkowania w czasie, zgodny z indywidualną potrzebą i oceną osoby leczącej lub nadzorującej podawanie leku. Dlatego, podane stężenia są tylko przykładowymi i nie mają na celu ograniczenia zakresu podawania zastrzeżonych kompozycji. Aktywny składnik może być podawany jednorazowo lub może być dzielony na wiele mniejszych dawek podawanych w różnych odstępach czasu.

Korzystnym sposobem podawania aktywnego związku jest podawanie doustne. Preparaty doustne zawierają generalnie obojętny rozcieńczalnik lub jadalny nośnik. Mogą one mieć postać żelatynowych kapsułek lub tabletek. Do terapeutycznego podawania doustnego, aktywny związek może być mieszany z wypełniaczami i stosowany w postaci tabletek, kołaczyków lub kapsułek. W skład preparatu mogą wchodzić odpowiednie środki wiążące i/lub adjuwanty.

Tabletki, pigułki, kapsułki, kołaczyki i podobne mogą zawierać któreś z następujących substancji lub związków o podobnym charakterze: środek wiążący, taki jak celuloza mikrokrystaliczna, guma tragakant lub żelatyna; wypełniacz, taki jak skrobia lub laktoza, środek rozpraszający, taki jak kwas alginowy, Primogel lub skrobia kukurydziana środek poślizgowy, taki jak stearynian magnezu lub Sterostes; albo koloidalny dwutlenek krzemu; środek słodzący, taki jak sacharoza lub sacharyna; albo środek aromatyzujący, taki jak olejek miętowy, salicylan metylu lub olejek pomarańczowy. W przypadku kapsułek, to poza wymienionymi wyżej materiałami mogą one zawierać ciekły nośnik, taki jak olej tłuszczowy. Ponadto, preparaty mogą zawierać różne inne materiały modyfikujące ich fizyczną postać, np. powłoczki cukrowe, szelakowe lub inne środki do podawania do jelit.

(±)-FTC lub jego (-) albo (+) enancjomery lub dopuszczalne w farmacji pochodne albo sole powyższych związków mogą być podawane jako składniki eliksiru, zawiesiny, syropu, opłatka, gumy do żucia, itp. Syrop, poza związkiem aktywnym, może zawierać środek słodzący oraz środki konserwujące, barwiące i aromatyzujące.

(±)-FTC lub jego (-) albo (+) enancjomery lub dopuszczalne w farmacji pochodne albo sole powyższych związków mogą również być mieszane z innymi aktywnymi substancjami nie przeszkadzającymi w pożądanym działaniu, albo z substancjami, które wspomagają pożądane działanie, takimi jak antybiotyki, środki przeciwgrzybicze, przeciwzapalne lub inne środki przeciwwwirusowe, w tym także inne nukleozydy anty-HIV.

Roztwory lub zawiesiny do stosowania pozajelitowego, śródskórnego lub miejscowego mogą zawierać następujące składniki' jałowy rozcieńczalnik, taki jak woda do iniekcji, roztwór soli fizjologicznej, oleje, glikole pobetylenowe,,gbceryna, glikol propylenowy lub inne syntetyczne rozpuszczalniki, czynniki przeciwbakteryjne, takie jak alkohol benzylowy lub metyloparaben, przeciwutleniacze, takie jak kwas askorbinowy lub wodorosiarczyn sodowy czynniki

171 150 chelatujące, takie jak kwas etylenodwuaminoczterooctowy; środki buforujące, takie jak octany, cytryniany lub fosforany; oraz środki tonizujące, takie jak chlorek sodowy lub dekstroza Preparaty do podawania pozajelitowego mogą być zamknięte w ampułkach, jednorazowych strzykawkach lub fiolkach do wielokrotnego stosowania, wykonanych ze szkła lub tworzywa sztucznego.

Korzystnymi do podawania dożylnego nośnikami są fizjologiczny roztwór soli lub buforowany fosforanem fizjologiczny roztwór soli (PBS).

W korzystnym wykonaniu, związki aktywne są sporządzane w postaci preparatów zawierających nośniki chroniące je przed szybkim wydalaniem z organizmu, takich jak preparaty o kontrolowanym uwalnianiu, np. wszczepy lub mikrokapsułki. Można stosować rozkładane biologicznie, odpowiednie biologicznie polimery, takie jak octan etylenowinylu, polibezwodniki, kwas poliglikolowy, kollagen, poliortoestry i kwas polimlekowy. Metody wytwarzania takich preparatów są dobrze znane specjalistom. Materiały takie są również dostarczane przez firmy Alza Corporation i Nova Pharmaceuticals, Inc.

Zawiesiny lipozomalne (w tym lipozomy działające na zakażone komórki z monoklonalnymi przeciwciałami wirusowych antygenów) są także korzystne jako dopuszczalne w farmacji nośniki. Można je otrzymywać znanymi specjalistom metodami, np. opisanymi w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 522 811 (włączonym tutaj w całości jako odnośnik). Np., preparat lipozomowy można otrzymywać rozpuszczając odpowiedni lipid (lipidy) (np. stearoilo-fosfatydyloetanolaminę stearoilo-fosfatydylocholinę arachodoilo-fosfatydylocholinę lub cholesterol) w nieorganicznym rozpuszczalniku, który następnie odparowuje się. Pozostaje cienka filmowa warstwa suchego lipidu na powierzchni pojemnika. Do pojemnika wprowadza się następnie wodny roztwór aktywnego związku lub jego jednofosforanu, dwufosforanu albo trójfosforanu. Pojemnik wstrząsa się w ręku w celu uwolnienia materiału lipidowego ze ścianek i zawieszenia agregatów lipidu. Otrzymuje się lipozomalną zawiesinę.

Wytwarzanie fosforanów FTC

Jedno-, dwu- i trójfosforanowe pochodne FTC można otrzymywać w sposób opisany poniżej.

Jednofosforan można wytwarzać metodą opisaną przez Imai i wsp. w J. Org. Chem., 34 (6), 1547-1550 (czerwiec 1989). Np., około 100 mg FTC poddaje się reakcji z około 280 pl chlorku fosforylu, mieszając w około 8 ml bezwodnego octanu etylu, w temperaturze około 0°C, w ciągu około czterech godzin. Reakcję zatrzymuje się oziębiając lodem. Fazę wodną oczyszcza się węglem aktywnym na kolumnie, eluując 5% roztworem wodorotlenku amonowego w mieszaninie 1: 1 etanolu i wody. Po odparowaniu eluatu otrzymuje się sól amonową 5'-jednofosforanu FTC.

Dwufosforan można otrzymywać metodą opisaną przez Davissona i wsp. w J. Org. Chem., 52 (9), 1794-1801 (1987). Dwufosforan FTC można otrzymywać z odpowiedniego tozylanu, który wytwarza się np. poddając nukleozyd reakcji z chlorkiem tozylu w pirydynie, w pokojowej temperaturze, w ciągu około 24 godzin. Mieszaninę reakcyjną przerabia się w zwykły sposób, np. przemywa, suszy i krystalizuje produkt.

Trójfosforan można otrzymywać metodą opisaną przez Hoarda i wsp w J. Am. Chem. Soc., 87 (8), 1785-1788 (1965). FTC poddaje się aktywowaniu (np. przekształcając w imidazolid znanymi specjalistom metodami) i następnie reakcji z pirofosforanem trójbutyloamoniowym w DMF. W reakcji otrzymuje się głównie trójfosforan nukleozydu, zawierający nieco nieprzereagowanego jednofosforanu i dwufosforanu Mieszaninę oczyszcza się drogą chromatografii anionowymiennej na kolumnie z DEAE i izoluje trójfosforan, np. w postaci soli czterosodowej.

Wynalazek został opisany w odniesieniu do korzystnych jego odmian. Wariacje i modyfikacje sposobu według wynalazku powinny być oczywiste dla specjalistów z przedstawionego szczegółowego opisu. Wszystkie powyższe wariacje i modyfikacje wchodzą w zakres wynalazku i załączonych zastrzeżeń.

FtGURK 3

(+)-FTC =25% =75%

N

-► W-PTC

AP

AP ap

PD

Fosfotaza alkaliczna

Fosfodwudwuesteraza I

5'-Nukleotydaza (-)-PTC-TP IPTC (+) - FTC

Wzbogacanie enancjomeru (-)

Proporcja 4:1 na korzyść enancjomeru (4

17^1150

Hamowania Ϊ Hamowania

FIGURK 5

FIGURK 6

□ FTC □ FTC-MP □ FTC-DP □ FTC-TP

FIGURK 7

Czas (godzina) po wydaleniu leku

FIGURK 8

Moment czasu, godziny

FIGURK 9

Czas, godziny

FIGURK 10

FIGURK 11

FIGURK 12

171 150

FIGURK 2

RO —' +-OR

RO

1. Środek redukujący

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz. Cena 6,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób rozdzielania racemicznej mieszaniny enancjomerów nukleozydu polegający na poddawaniu mieszaniny racemicznej działaniu enzymu, znamienny tym, ze jako enzym, który wybiórczo katalizuje reakcję z jednym enancjomerem, stosuje się enzym wybrany z grupy obejmującej esterazę, lipazę, substylizynę, a-chymotrypsynę oraz dezaminazę cytydynowo-dezoksycytydynową.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze jako esterazę stosuje się esterazę z wątroby świni.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako lipazę stosuje się świńską lipazę trzustkową lub lipazę Amano PS-800.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się mieszaninę enancjomerów nukleozydu ze zacylowaną grupą hydroksylową w pozycji C5'.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się mieszaninę enancjomerów poddaną acylowaniu za pomocą związku wybranego z grupy obejmującej kwasy alkilokarboksylowe i podstawione kwasy karboksylowe.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako kwas alkilokarboksylowy stosuje się kwas octowy, kwas propionowy, kwas masłowy, kwas walerianowy, kwas 2-chloropropionowy, kwas 2-chloromasłowy lub 2-chlorowalerianowy.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że enancjomery nukleozydu przepuszcza się przez kolumnę zawierającą enzym immobUizowany na nośniku.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że enancjomery miesza się z enzymem w roztworze.
9 Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcję enzymatyczną prowadzi się w obecności niejonowego środka powierzchniowo czynnego.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że jako środek powierzchniowo czynny stosuje się eter glikolu polietylenowego z p-izooktylofenolem.
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że produkt rozdzielania poddaje się działaniu drugiego enzymu.
12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że produkt rozdzielania poddaje się rekrystalizacji.
13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że produkt rozdzielania poddaje się działaniu chiralnego kwasu.
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że jako chiralny kwas stosuje się kwas wybrany z grupy obejmującej kwas jabłkowy, kwas migdałowy, kwas dwubenzoilowinowy, kwas 3-bromokamforc-8-sulfonowy, kwas 10-kamforosulfonowy i kwas dwu-p-toluilowinowy.
15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze rozdzielaniu poddaje się mieszaninę racemiczną(±)-2-hydroksymetylo-5-(5-fluorocytozynylo-1.)-1,3-oksatiolanu.
16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze rozdzielaniu poddaje się mieszaninę racerniczną(±)-2-hydroksymetylo-5-(cytozynylo-1)-1,3-oksatiolanu.