PL171972B1

PL171972B1 - Sposób wytwarzania polipeptydu HCV PL

Info

Publication number: PL171972B1
Application number: PL92313797A
Authority: PL
Inventors: Amy J Weiner; Michael Houghton
Original assignee: Chiron Corp
Priority date: 1991-09-13
Filing date: 1992-09-11
Publication date: 1997-07-31
Also published as: AU2643692A; HUT67342A; FI112438B; RU2212899C2; JP2004073207A; JP2005176853A; ATE228564T1; ES2182822T3; RO116199B1; CA2116764A1; DK0608261T3; US5756312A; PL171489B1; JP2002167336A; US5670152A; HU227510B1; DE69232859D1; US5670153A; FI941199L; CA2116764C

Abstract

1. Sposób wytwarzania polipeptydu HCV obejmujacy transformowanie komórki gospodarza ekspresyjnym ukladem kodujacym i hodowle stransformowanej komórki gospodarza, znamienny tym, ze komórke gospodarza stanowiaca komórke E. coli, drozdzy, owadów lub ssaka transformuje sie za pomoca ekspresyjnego ukladu koduja- cego co najmniej dwie heterogeniczne sekwencje aminokwasowe z domeny zmiennej poliproteiny HCV, przy czym kazda sekwencja zawiera epitop z tej domeny zmiennej, i elementy kontrolujace ekspresje obejmujace promotor, który jest kompatybilny z ko- mórka gospodarza, a nastepnie inkubuje sie komórke gospodarza prowadzac ekspresje polipeptydu, w którym co najmniej dwie sekwencje aminokwasowe sa heterogeniczne i pochodza z róznych izolatów HCV. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania polipeptydu.

Wirus zapalenia wątroby typu C (wirus HCV) uznaje się ostatnio za główny czynnik powodujący po-transfuzyjne zapalenia wątroby Nie-A, Nie-B (NANHB) a ponadto, jako ważną przyczynę nabywanej w społeczeństwie żółtaczki Nie-A, Nie-B. Znane są materiały i sposoby uzyskiwania wirusowych sekwencji genomowych, na przykład z publikacji zgłoszeń PCT, nr WO89/04669, W090/T1089 i W090/14436.

Badania molekularne genomu HCV wykazują, że jest to cząsteczka RNA o dodatniej polarności, złożona z około 10.000 nukleolydów kodujących poliproteinę zawierającą około 3011 aminokwasów. Wiele dowodów wskazuje na to, że HCV posiada organizację genetyczną podobną do wirusów z rodziny Flaviviridae, do której należą Flaviwirusy i Pestiwirusy. Przypuszcza się, że podobnie jak pokrewne mu Pestiwirusy i Flaviwirusy, HCV koduje duży prekursor poliproteinowy, z którego wytwarzane są poszczególne białka wirusowe, zarówno strukturalne jak i niestrukturalne.

Wirusy zawierające RNA charakteryzują się stosunkowo wysokim stopniem mutacji spontanicznych. Według danych z piśmiennictwa jest to rząd 1..0'³ do 10'⁴ na wbudowany nukleotyd. Ponieważ heterogeniczność i płynność genotypu są u RNA-wirusów cechami powszechnymi to w obrębie tego samego gatunku HCV może występować wiele izolatów wirusowych, zakaźnych lub niezakaźnych.

Dotychczas zidentyfikowano wiele różnych izolatów HCV. Sekwencje tych izolatów wykazują ograniczony stopień heterogeniczności charakterystyczny dla wirusów RNA.

Wyizolowany wirus HCV J1.1 jest opisany przez Kubo Y. i wsp. w publikacji Japan Nuci. Acids Res. 17: 10367-10372 (1989); przez Takeuchi K. i wsp. w publikacji Gene 91: 287-291 (1990); przez Takeuchi i wsp. w publikacji J. Gen. Virol. ΊΕ 3027-3033 (1990) i przez tego samego autora w publikacji Nuci. Acids Res. 18: 4626 (1990).

Całkowite sekwencje kodujące oraz sekwencje końcowe 5'- i 3'- dwu niezależnych izolatów, HCV-J i BK opisali odpowiednio Kato i wsp. w publikacji Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 9524-9528 (1991) i Takamizawa i wsp. w publikacji J. Virology 65: 1105-1113.

Izolaty HCV są również opisane w następujących publikacjach:

wirus HCV-1 - w publikacjach: Choo i wsp., Brit. Med. BuU. 46: 423-441, (1990);

Choo i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 2451-2455 (1991); Han i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 1711-1715; publikacja zgłoszeniowa patentu europejskiego nr 318216.

wirus HC-J1 i HC-J4 - w publikacji: Okamoto i wsp., Japan J. Exp. Med. 60: 167-177 (1991).

Izolaty HCT 18, HCT 23, TH, HCT 27, EC1 i EC10 - w publikacji: Weiner i wsp. Virol. 180: 842-848 (1991).

Izolaty Pt-1, HCV-K1 i HCV-K2 - Enomoto i wsp. Są to dwa główne wirusy zapalenia wątroby typu C w Japonii. Oddział Gastroenterologii Wydziału Medycyny Wewnętrznej, Kanazawa Medical University, Japonia.

Klony A, C, D i Έ: Tsukiyama-Kohara i wsp., rozdział A second group of hepatitis wirus w książce Virus Genes.

W typowym podejściu do poszukiwań diagnostycznych i szczepionek zainteresowanie badaczy koncentruje się na konserwatywnych domenach wirusowych. Wadą tego podejścia jest jednak ignorowanie ważnych epitopów, które mogą leżeć w domenach zmiennych. Celem wynalazku jest opracowanie sposobu wytwarzania polipeptydu zawierającego duże heterogeniczne sekwencje aminokwasu z tej samej domeny zmiennej innych izolatów HCV.

Opracowanie takiego sposobu pozwala na utworzenie kompozycji polipeptydowych reagujących immunologicznie krzyżowo z wieloma izolatami HcV, zwłaszcza z heterogenicznymi domenami tego wirusa.

Wykryto, że wiele ważnych epitopów HCV pochodz.ących z różnych izolatów wirusowych różni się między sobą i że epitopy te można mapować, przypisując je do poszczególnych domen. To odkrycie pozwoliło na opracowanie strategii wytwarzania immunologicznie reaktywnych, reagujących krzyżowo kompozycji polipeptydowych opartych na wykorzystaniu domen zmiennych (a nie konserwatywnych).

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania polipeptydu HCV obejmujący transformowanie komórki gospodarza ekspresyjnym układem kodującym i hodowlę stransformowanej komórki gospodarza, charakteryzujący się tym, że komórkę gospodarza stanowiącą komórkę E. coli, drożdży, owadów lub ssaka transformuje się za pomocą ekspresyjnego układu kodującego co najmniej dwie heterogeniczne sekwencje aminokwasowe z domeny zmiennej poliproteiny HCV, przy czym każda sekwencja zawiera epitop z tej domeny zmiennej i elementy kontrolujące ekspresję obejmujące promotor, który jest kompatybilny z komórką gospodarza, a następnie inkubuje się komórkę gospodarza prowadząc ekspresję polipeptydu, w którym co najmniej dwie sekwencje aminokwasowe są heterogeniczne i pochodzą z różnych izolatów HCV.

Alternatywny sposób wytwarzania polipeptydu HCV obejmujący polimeryzację substratu przy udziale środka polimeryzującego, charakteryzuje się tym, że polimeryzuje się substraty aminokwasowe ze środkiem polimeryzującym, wytworzony polipeptyd zawierający co najmniej dwie heterogeniczne sekwencje aminokwasowe z domeny zmiennej poliproteiny HCV, i izoluje się ten polipeptyd, w którym co najmniej dwie sekwencje aminokwasowe są różnymi izolatami HCV.

Korzystnie stosuje się co najmniej dwie sekwencje aminokwasowe pochodzące z tej samej domeny zmiennej różnych izolatów HCV, korzystnie z domeny znajdującej się w regionie E2/NS1 poliproteiny HCV lub pochodzącej z białka El poliproteiny hCv.

Również jako domenę zmienną korzystnie stosuje się domenę kodowaną przez poliproteinę HCV od około aminokwasu 384 do około aminokwasu 414.

Przy czym stosowana domena zmienna pochodząca z białka El poliproteiny HCV jest korzystnie kodowana przez poliproteinę HCV od około aminokwasu 215 do około aminokwasu 255.

W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się co najmniej dwie sekwencje aminokwasowe pochodzące z różnych domen, znajdujących się w regionie E2/NS1, różnych izolatów HCV. Korzystnie stosuje się co najmniej jedną domenę z domen zmiennych będących w regionie El.

Kompozycja immunoreaktywna w skład której wchodzą polipeptydy wytwarzane sposobem według wynalazku może zawierać wiele zespołów antygenowych, gdzie (a) każdy zespół antygenowy składa się z wielu w zasadzie identycznych polipeptydów zawierających sekwencję aminokwasową epitopu z pierwszej zmiennej domeny izolatu HCV i (b) sekwencja aminokwasowa epitopu jednego zespołu jest heterogeniczna w stosunku do sekwencji aminokwasowej analogicznej sekwencji z co najmniej jednego innego zespołu.

Kompozycja immunoreaktywna może zawierać też wiele polipeptydów, w której to kompozycji każdy polipeptyd ma wzór:

Rr - (SV_n)x - R'_r' gdzie R i R' oznaczają sekwencje aminokwasowe złożone z 1 do 2000 aminokwasów i są takie same lub różne;

r i r' oznaczają 0 lub 1 i są takie same lub różne;

V oznacza sekwencję aminokwasową zawierającą. sekwencję z domeny zmiennej HCV, przy czym ta domena zmienna posiada przynajmniej jeden epitop;

S oznacza liczbę całkowitą >1, reprezentującą wy^^^^^mą domenę zmienną; n oznacza liczbę całkowitą >1, reprezentującą wybrany izolat HCV heterogeniczny przy danym SV w odniesieniu do co najmniej jednego innego izolatu posiadającego inną wartość na n dobiera się indywidualnie dla każdego x;

x oznacza liczbę całkowitą > 1, z zastrzeżeniem, że znajdujące się w kompozycji sekwencje aminokwasowe reprezentują kombinację wybraną z grup (i) 1Vt i 1V2, (ii) 1V i 2V2 oraz (iii) 1V i 2Vj.

W oparciu o wyżej opisane kompozycje immunoreaktywne można wytworzyć immunogeniczną kompozycję farmaceutyczną HCV. Metoda ta polega na:

(a) przygotowaniu opisanej powyżej kompozycji immunoreaktywnej;

(b) przygotowaniu odpowiedniego środka pomocniczego;

(c) zmieszaniu kompozycji immunoreaktywnej (a) ze środkiem pomocniczym (b) w takiej proporcji, aby uzyskać odpowiedź immunologiczną u ssaków po podaniu.

W następstwie podawania ssakom skutecznej ilości opisanej powyżej kompozycji immunoreaktywnej wytwarz.ane są przeciwciała anty-HCV.

Przeciwciała przeciw HCV w próbce biologicznej można wykrywać metodą polegającą na:

(a) przygotowaniu próbki biologicznej, w której podejrzewa się obecność przeciwciał przeciw HCV;

(b) przygotowaniu opisanej powyżej kompozycji immunoreaktywnej;

(c) poddaniu reakcji próbki biologicznej (a) z kompozycją immunoreaktywną (b) w warunkach umożliwiających powstawanie kompleksów antygen-przeciwciało;

(d) wykryciu powstałych kompleksów antygen-przeciwciało utworzonych między kompozycją immunoreaktywną (a) i ewentualnie obecnymi przeciwciałami z próbki biologicznej (b).

Możliwe jest także wytworzenie zestawu do wykrywania przeciwciał przeciw HCV w próbce biologicznej który to zestaw zawiera kompozycję immunoreaktywną opisaną powyżej w odpowiednim pojemniku.

Wynalazek został zilustrowany na rysunku na którym fig. 1 przedstawia genetyczną organizację genomu HCV, fig. 2 - porównanie wyprowadzonych sekwencji aminokwasowych białka El kodowanych przez grupę I i grupę II izolatów HCV, fig. 3 - porównanie sekwencji aminokwasowych przypuszczalnego regionu E2/NS1 izolatów HCV, fig. 4 wykresy krzywych antygeniczności dla N-końcowego regionu przypuszczalnego białka E2/NS1 HCV (aminokwasy 384 - 420) i białka gp120 będącego hyper-zmiennym regionem HIV-1, fig. 5 - serię wykresów dających procentowe prawdopodobieństwo, że dana reszta z regionu N-końcowego białka E2/NS1 z HCV (aminokwasy 384 do 420) będzie znaleziona w strukturach drugorzędowych alfa-heliksie, beta-płacie albo w beta-skręcie, fig. 6 jest wykresem słupkowym przedstawiającym reaktywność przeciwciał w osoczu pochodzącym od chorych zakażonych przez HCV 18 (wykresy A-C) lub Th (wykresy D - F) z częściowo pokrywającymi się biotynylowanymi peptydami 8-merowymi pochodzącymi z aminokwasów 384 do 415 lub 416, odpowiednio izolatów HCT 18 (A,D), Th (B,E) i HCV J1 (C,F), fig. 7 - wyprowadzone sekwencje aminokwasowe dwu regionów polipeptydu E2/NSi, aminokwasów 384 - 414 i 547 - 647, dla izolatów Q1 i Q3, fig. 8A - wyprowadzone sekwencje aminokwasowe izolatów HCV J1.1 i J1.2 z aminokwasów 384 do 647, fig. 8B - wyprowadzone sekwencje aminokwasowe izolatów HCT27 i HCVE1 z aminokwasów 384 do 651, fig. 9 - całkowitą sekwencję poliproteinową izolatu HCV-1.

W przykładach wykonania wynalazku, o ile nie podano inaczej, są stosowane konwencjonalne, ogólnie znane techniki biologii molekularnej, mikrobiologii, rekombinacji DNA i immunologii. Techniki te są szczegółowo opisane w piśmiennictwie. Jako przy6

171 972 kładowe pozycje literaturowe można wymienić: Maniatis, Fitsch i Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual (II wydanie, 1989); DNA Cloning, tomy I i II (wydawca: D. N. Glover, 1985 r); Oligonucleotide Synthesis (wyd. M. J. Gait, 1984); Nucleic Acid Hybridization (wyd. B. D. Hames i S. J. Higgins, 1984); Transcription and Translation (wyd. B. D. Hames i S. J. Higgins, 1984); Animal Cell Culture (wyd. R. I. Freshney, 1986), Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, 'A Practical Guide to Melocular Cloning (1984); seria Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (wyd. J. H. Miller i M. P. Calos, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), 'Methods in Enzymology, tom 154 i tom 155 (wyd. Wu, Grossman i Wu), wyd. Mayer i Walker (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, Londyn), Scopes (1987), Protein Purification: Principles and Practice, II wydanie (Springer-Verlag, N. Y), oraz Handbook of Experimental Immunology, tomy I-IV (wyd. D. M. Weir i C. C. Blackwell, 1986); Immunoassay: A Practical Guide (wyd. D. W. Chan, 1987). Wszystkie wymienione poniżej opisy patentowe, zgłoszenia patentowe i publikacje są włączone do niniejszego opisu jako odnośniki literaturowe.

HCV jest nowym członkiem rodziny Flaviviridae obejmującej pestywirusy (wirusa pomoru świń i wirusa biegunki bydląd) oraz Flaviwirusy, przykładami których są wirus Dengue i wirus żółtej gorączki. Schemat organizacji genetycznej HCV jest przedstawiony na fig. 1. Podobnie do pestywirusów i flaviwirusów, HCV koduje podstawową domenę polipeptydową (C) przy N-końcu wirusowej poliproteiny, po której następują dwie domeny glikoproteinowe ('El, E2/NS1), w górę od niestrukturalnych genów NS2 do NS5. Współrzędne aminokwasowe przypuszczalnych domen białkowych są przedstawione w tabeli 1.

Tabela 1

Przypuszczalne domeny białkowe w HCV

a. a. przybliżone współrzędne	białko
1-191	c
192 - 383	El
384 - 750	E2/NS1
751 -1006	NS2
1007 -1488	NS3
1489 -1959	NS4
1960 - 3011	NS5

Jak podano powyżej, dotychczas zidentyfikowano wiele izolatów HCV. Porównawcza analiza sekwencji całkowitej i częściowych sekwencji HCV wykazuje, że w oparciu o homologię na poziomach nukleotydu i aminokwasów, izolaty HCV można z grubsza podzielić na co najmniej trzy podstawowe grupy (tabela 2); patrz Houghton i wsp., Hepatology 14: 381-388 (1991). Jednakże dla izolatów z grupy III dostępna jest tylko sekwencja częściowa. Tak więc, jeśli sekwencje tych izolatów będą dokładniej określone to być może, jeden lub więcej z tych izolatów będzie wymagał oddzielenia w odrębną grupę, potencjalnie grupę czwartą. Tabela 3 przedstawia homologię sekwencji pomiędzy poszczególnymi białkami wirusowymi pochodzącymi z różnych izolatów HCV jak to wyprowadzono z ich sekwencji nukleotydowych. Jest widoczne, że białka z tej samej grupy wirusów wykazują większe podobieństwo sekwencji niż te same białka kodowane przez różne grupy wirusów (tabela 3). Jedynym wyątkiem od tego jest białko nukleokapsydu, które jest wysoce konserwatywne we wszystkich dotychczas znanych sekwencjach izo171972 latów wirusowych grupy I i II. (W tabeli 3 symbole N/A oznaczają, że sekwencje nie były dostępne do porównania). Tak więc, dla celów niniejszego wynalazku izolaty grupy I można zdefiniować jako izolaty posiadające swe wirusowe białka, zwłaszcza białka El i E2/NS1 w stopniu 90% lub wyższym homologiczne na poziomie aminokwasów z izolatami sklasyfikowanymi jako grupa I. Grupa II jest zdefiniowana w sposób analogiczny. Przyszłe grupy mogą być definiowane podobnie w kategoriach homologii białka wirusowego do prototypowego izolatu. Podgrupy można również definiować w oparciu o homologię do wybranych białek, takich jak białka El, E2/NS1 lub NS2 albo po prostu, na podstawie wyższego stopnia homologii.

Tabela 2

Klasyfikacja sekwencji RNA genomu wirusa zapalenia wątroby C na trzy podstawowe grupy

HCVI	HCVII	HCV III
HCV-1	HCV-J1.1	Klony A, B, C, D i E
HC-J1	HC-J4	HCV-K2 (a i b)
1 HCT18	HCV-J
HCT23	BK
Th	HCV-K1
HCT 27
EC1
Pt-1

Tabela 3

Homologia aminokwasowa (w procentach) w białkach wirusowych kodowanych przez różne izolaty HCV

PCT	C	El	E2/NS1	NS2	NS3	NS4	NS5
1	2	3	4	5	6	7	⁸
Grupa I w porównaniu do \|
I	98 -1000	94-100	N/A	N/A	N/A	N/A	99 -100
II	97-98	77-79	78 -89	75-77	91-93	90-93	84-88
III	N/A	N/A	N/A	N/A	86	76-80	71-74

171 972 cd. tabeli 3

1	2	3	4	5	6	7	8
Grupa II w	porównaniu do
II	98 -100	92-100	89-100	93-100	94-100	97 -100	95 -100
III	N/A	N/A	N/A	N/A	84	76	74-75
Grupa III w porównaniu do
¹¹¹	N/A	N/A	N/A	N/A	N/A	91-100	89-100 ----- I

Godny uwagi jest fakt, że przypuszczalne wirusowe białka otoczkowe kodowane przez geny El i E2/NS1 wykazują znaczną zmienność sekwencji aminokwasowych pomiędzy grupami I i II. Jedynie NS2 wykazuje wyższy stopień heterogeniczności, podczas gdy wszystkie białka: C, NS3, NS4 i NS5 wykazują większą konserwatywność sekwencji pomiędzy grupami. Zmienność sekwencji obserwowana w przypuszczalnych białkach otoczkowych wirionu między grupami I i II jest odbiciem charakterystycznego podziału aminokwasów na te dwie grupy. Przykład tej zmienności jest przedstawiony na fig. 2, gdzie jest porównana sekwencja produktu genu El u wirusów z grupy I i II. Pokazane są sekwencje aminokwasowe El wyprowadzone z sekwencji nukleotydowych HCV z grup I i II. Poziom kreski na tej figurze wskazują na identyczność sekwencji z HCV-1. Gwiazdki oznaczają grupowo specyficzną segregację aminokwasów; reszty grupowo-specyficzne są łatwe do zidentyfikowania. Sekwencje grupy I to HCV-1, HCT18, HCT23, HCT27 i HC-J1. Sekwencje grupy II to HC-J4, HCV-J, HCV J1.1 i BK. Taki grupowo-specyficzny podział aminokwasów występuje również w innych produktach genowych, w tym w białku gp72 kodowanym przez gen E2/NS1. Figura 3 przedstawia porównawczy obraz sekwencji aminokwasowych przypuszczalnego regionu E2/NS1 izolatów HCV posegregowanych na grupę I i grupę II. To ostatnie białko zawiera również N-końcowy hyper-zmienny region (HV) składający się z około 30 aminokwasów, wykazujący ogromną zmienność wśród prawie wszystkich izolatów. Stwierdza to Weiner i wsp. (1991), cytowany powyżej. Ten region występuje pomiędzy aminokwasami 384 a 414 według systemu numeracji przyjętego dla HCV-1.

Przypuszczalna glikoproteina otoczki HCV, E/NS1, może odpowiadać białku gp53(BVDV)/gp55 z wirusa pomoru świń będącego polipeptydem otoczkowym pestywirusów i NS1 z flawiwirusów. Obydwa te rodzaje wirusów nadają ochronną odporność u gospodarzy szczepionych tymi polipeptydami.

Uderzające podobieństwa pomiędzy regionem hyper-zmiennym (HV) i domenami V3 białka gp-120 z wirusa HIV-1 pod względem stopnia zmienności sekwencji, przewidywanego wpływu sekwencji aminokwasowych na wiązanie przypuszczalnego przeciwciała a ponadto, pod względem braku zdecydowanej struktury drugorzędowej, wskazują na to, że domena HV koduje przeciwciała neutralizujące.

Immunogenność tej domeny jest wykazana w opisanych przykładach w doświadczeniach z mapowaniem epitopu dla przeciwciała. Wyniki tych badań sugerują, że poza trzema głównymi grupami HCV istnieją również specyficzne podgrupy HV.

Analiza próbek biologicznych od osobników z NANBH wywołanym wirusem HCV wskazuje, że osobnicy ci mogą być nosicielami dwóch lub więcej wariantów HCV jednocześnie. W osoczu jednego pacjenta, oznaczonego symbolem J1, wykryto dwa współistniejące jednocześnie warianty HCV. Ponadto, częściowe sekwencjonowanie genu od osobnika z przewlekłym NANBH, u którego występowały okresowe rzuty zapalenia wątroby ujawniło, że osobnik ten oznaczony symbolem Q, był zakażony dwoma wariantami HCV (Q1 lub Q3). Każdy wariant był związany z tylko jednym atakiem choroby. Te171972 chnika ELISA z zastosowaniem peptydu swoistego względem Q1 albo Q3 (aminokwasy 396 - 407) wykazała, że u pacjenta Q rozwinęły się przeciwciała przeciw peptydowi Q1 ale nie przeciw odpowiadającemu mu peptydowi Q3, co sugeruje, że zaostrzenie choroby u osobnika Q było wynikiem pojawienia się wariantu NH. Obecność przeciwciał przeciw peptydowi Q1 przy braku odpowiedzi immunologicznej na peptyd Q3 podczas drugiego rzutu choroby świadczyć o tym, że zmienność w domenie HV może wynikać z immunologicznej presji selekcyjnej. Celem największej presji selekcyjnej w domenie HV wydają się aminokwasy 396-407. Te spostrzeżenia potwierdzają tezę, że znaczna chroniczność związana z tą chorobą może wynikać z nieodpowiedniej immunologicznej odpowiedzi gospodarza na zakażenie HCV i/lub ze skutecznych mechanizmów obejścia immunologicznego wirusów. Co więcej, wskazują one na region E2/NS1 HV jako region genetyczny zaangażowany w mechanizmy ucieczki wirusów (przed reakcją immunologiczną) i/lub na nieodpowiednie mechanizmy odpowiedzi immunologicznej.

Jak opisano powyżej, w genomie HCV istnieje wiele zmiennych regionów. Jeden lub więcej z tych regionów jest najprawdopodobniej zaangażowanych w mechanizm ucieczki immunologicznej i/lub w mechanizmy nieodpowiedniej odpowiedzi immunologicznej. Tak więc, byłoby pożądane aby do kompozycji przeznaczonych do leczenia HCV włączyć polipeptydy, które mogłyby wywoływać odpowiedź immunologiczną na te warianty.

Ponieważ regiony El i E2/NS1 genomu kodują przypuszczalne polipeptydy otoczkowe, regiony te mogłyby mieć szczególne znaczenie jako czynniki immunogenne. Tak więc, regiony te należy zaliczyć do takich, które byłyby szczególnie pożądane do wywoływania i/lub zwiększania odpowiedzi immunologicznej, chroniąc przed zakażeniem HCV i zapobiegając chronicznym nawrotem choroby u chorych zakażonych. Ponadto, regiony te mogłyby należeć do takich, które służyłyby do wykrywania wariantów HCV rozwijających się podczas trwania zakażenia jak również super-infekcji lub ko-infekcji przez dwa lub więcej warianty.

W opisie wynalazku mają zastosowanie następujące definicje.

Termin polipeptyd odnosi się do polimeru aminokwasów natomiast nie odnosi się do określonej długości produktu; tak więc w definicji polipeptydu mieszczą się peptydy, oligopeptydy i białka. Termin ten nie obejmuje post-ekspresyjnych modyfikacji polipeptydów, na przykład glikozylacji, acetylacji, fosforylacji i podobnych procesów. W definicji mieszczą się natomiast przykładowo polipeptydy zawierające jeden lub więcej analogów aminokwasów (w tym np. aminokwasy nie występujące w stanie naturalnym), polipeptydy z podstawionymi wiązaniami, jak również inne znane modyfikacje, zarówno występujące jak i nie występujące w stanie naturalnym.

Według terminologii stosowanej w opisie, A jest zasadniczo wyizolowany z B jeśli waga A stanowi co najmniej około 70%, bardziej korzystnie co najmniej około 80% a najbardziej korzystnie co najmniej około 90% połączonych mas A i B. W korzystnym wykonaniu, kompozycje polipeptydowe według wynalazku są w zasadzie wolne od tkanki ludzkiej lub innych naczelnych (np. krwi, surowicy, lizatu komórkowego, organelli komórkowych, białek komórkowych i podobnych substancji) i od pożywki hodowli komórkowych.

Polinukleotyd rekombinantowy oznacza polinukleotyd pochodzenia genomowego, cDNA, półsyntetyczny lub syntetyczny który z racji swego pochodzenia lub przetworzenia: (1) nie jest związany z całym lub z częścią polinukleotydu, z którym jest on związany w stanie naturalnym, (2) jest związany z polinukleotydem innym od tego, z którym jest związany w stanie naturalnym lub (3) nie występuje w stanie naturalnym.

Polinukleotyd jest polimeryczną formą nukleotydów o dowolnej długości, rybonukleotydów albo dezoksyrybonukleotydów. Termin ten odnosi się jedynie do struktury pierwszorzędowej cząsteczki. Tak więc, termin ten obejmuje dwu- i jedno-niciowe DNA i RNA. Obejmuje on również znane typy modyfikacji, np. znane w technice znaczniki, formy metylowane, formy w postaci czapeczki powstałe w procesie redystrybucji typu capping, podstawienia jednego lub więcej występujących w stanie naturalnym nukleoty10 dów analogiem, modyfikacje wewnątrznukleotydowe, takie jak np. wiązania bez ładunku elektrycznego (np. tiolofosforowe, ditiofosforany i podobne), takie, które zawierają wolne reszty, na przykład białka (w tym np. nukleazy, toksyny, przeciwciała, peptydy sygnalne, poli-L-lizyna i podobne), takie, które zawierają ugrupowania interkalujące (np. akrydyna, psoralen), takie, które zawierają grupy chelatujące (przykładowo metale, metale radioaktywne), takie, które zawierają ugrupowania alkilujące, zawierające wiązania zmodyfikowane (na przykład α-anomeryczne kwasy nukleinowe i podobne) jak również niemodyfikowane formy polinukleotydów.

Terminy typu rekombinantowe komórki gospodarza, komórki gospodarza, komórki, linie komórkowe, hodowle komórkowe i inne podobne terminy oznaczające linie komórkowe pochodzące z mikroorganizmów lub wyższych organizmów eukariotycznych hodowane jako zbiory komórek jednorodnych odnoszą się do komórek, które mogą być lub są stosowane jako biorcy wektora rekombinantowego lub innego przenoszonego polinukleotydu i obejmują komórki potomne komórki pierwotnej, do której dokonano transfekcji. Jest zrozumiałe, że potomstwo pojedynczej komórki macierzystej niekoniecznie musi być całkowicie identyczne pod względem morfologii lub składu genomowego lub całkowitego DNA z oryginalną komórką macierzystą, w wyniku naturalnej, przypadkowej lub zamierzonej mutacji.

Termin replikon oznacza każdy element genetyczny, na przykład plazmid, chromosom, wirus, kosmid i podobne, zachowujący się jako autonomiczna jednostka polinukleotydowa replikująca się w obrębie komórki, to znaczy, zdolna do replikacji pod swą własną kontrolą.

Wektor jest replikonem posiadającym ponadto sekwencje zapewniające replikację i/lub ekspresję z otwartej ramki odczytu.

Termin sekwencja kontrolna odnosi się do sekwencji polinukleotydowych, które są niezbędne do wywołania ekspresji sekwencji kodujących, z którymi są połączone. Właściwości takich sekwencji kontrolnych różnią się w zależności od organizmu gospodarza; w organizmach prokariotycznych do sekwencji kontrolnych należą w zasadzie promotor, miejsce wiązania z rybosomem i sekwencje terminatorowe; w organizmach eukariotycznych, do takich sekwencji kontrolnych na ogół zalicza się promotory, terminatory i w niektórych przypadkach, sekwencje wzmacniające. Pod terminem sekwencje kontrolne należy rozumieć przynajmniej wszystkie te składniki, których obecność jest niezbędna do ekspresji; termin ten może również obejmować dodatkowe komponenty, których obecność jest korzystna, na przykład sekwencje liderowe rządzące sekrecją.

Terminem promotor określona jest sekwencja nukleotydowa zawarta w sekwencjach consensus, pozwalająca na wiązanie polimerazy RNA do matrycy DNA w taki sposób, że synteza mRNA rozpoczyna się w normalnym miejscu początku transkrypcji dla przyległego genu strukturalnego.

Termin operacyjnie związany odnosi się do pozycji, w której opisane tym terminem komponenty znajdują się we wzajemnym stosunku umożliwiającym im funkcjonowanie w zamierzony sposób. Sekwencja kontrolna operacyjnie związana z sekwencją kodującą jest połączona z nią w taki sposób, że ekspresja sekwencji kosującej zachodzi w warunkach zgodnych z sekwencjami kontrolnymi.

Otwarta ramka odczytu (ORF) jest regionem sekwencji polinukleotydowej kodującej polipeptyd; ten region może reprezentować część sekwencji kodującej albo całą sekwencję kodującą.

Sekwencją kodującą jest sekwencja polinukleotydowa podlegająca transkrypcji do mRNA i/lub translacji do polipeptydu jeśli znajduje się pod kontrolą odpowiednich sekwencji regulacyjnych. Miejsca wiązań sekwencji kodującej są zdeterminowane kodonem początku translacji na końcu 5' i kodonem końca translacji na końcu 3'. Sekwencją kodującą może być między innymi mRNA, DNA (w tym cDNA) i rekombinantowe sekwencje polinukleotydowe.

Stosowany w opisie termin epitop albo determinanta antygenowa oznacza immunoreaktywną sekwencję aminokwasową. Na ogół, epitop składa się z co najmniej 3 do 5 aminokwasów, częściej z co najmniej 8 a nawet około 10 aminokwasów. Według terminologii stosowanej w opisie, epitop określonego polipeptydu oznacza epitopy o tej samej sekwencji aminokwasowej jak epitop w tym określonym polipeptydzie i jego immunologicznych równoważnikach.

Antygenem jest polipeptyd zawierający jeden lub więcej epitopów.

Określenie immunogeniczny oznacza zdolność do wywoływania komórkowej i/lub humoralnej odpowiedzi immunologicznej. Odpowiedź immunologiczna może być wywołana przez same immunoreaktywne polipeptydy albo może wymagać obecności nośnika z dodatkiem lub bez dodatku adiuwanta.

Określenie immunoreaktywny oznacza (1) zdolność immunologicznego wiązania z przeciwciałem i/lub z receptorem antygenu limfocytarnego albo (2) zdolność do wykazywania immunogenności.

'Przeciwciało jest immunoglobuliną, zarówno całym przeciwciałem jak jego fragmentem, wiążącym swoisty epitop. Termin ten obejmuje między innymi przeciwciała poliklonalne, monoklonalne i chimerowe. Przykłady przeciwciał chimerowych są podane w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych, nr 4.816.397 i 4.816.567.

Zbiór antygenów definiuje się jako kompozycję składającą się z wielu w zasadzie identycznych polipeptydów, przy czym te polipeptydy zawierają sekwencję aminokwasową jednego określonego epitopu.

Określenie polipeptydy w zasadzie identyczne oznacza polipeptydy identyczne za wy‘ątkiem różnic ograniczonych do typowego zakresu sekwencji lub różnic w rozmiarach wynikających ze sposobu wytwarzania danego polipeptydu, na przykład ekspresji rekombinantu, syntezy chemicznej, hodowli tkankowej i podobnych czynników. Różnice te nie zmieniają żądanej właściwości funkcyjnej kompozycji w zasadzie identycznych polipeptydów, co oznacza, że kompozycja ta zachowuje się pod względem immunologicznym jak kompozycja polipeptydów identycznych. Różnice mogą wypływać przykładowo z różnic w procesie wydzielania podczas transportu danego polipeptydu, wydajności poniżej 100% w syntezie chemicznej i podobnych czynników.

W niniejszym opisie pod terminem domena zmienna albo VD białka wirusowego rozumie się domenę wykazującą znaczny stopień zmian w składzie aminokwasowym pomiędzy co najmniej dwoma izolatami lub subpopulacjami wirusa HCV. Korzystnie, domena taka zawiera co najmniej jeden epitop. Różnice w domenach zmiennych między poszczególnymi izolatami mogą dotyczyć zmiany w tylko jednym aminokwasie. Izolaty te mogą pochodzić z tej samej grupy lub podgrupy HCV. Domeny zmienne można łatwo zidentyfikować przez oznaczenie składu sekwencji w poszczególnych izolatach; przykłady tych technik są opisane poniżej. Do celów opisu mniejszego wynalazku domeny zmienne można zdefiniować pod względem ilości aminokwasów w poliproteinie kodowanej przez genom HCV-1, co jest pokazane na fig. 9, wyznaczając inicjującą metioninę jako pozycję 1. Odpowiadającą domenę zmienną w innym izolacie HCV oznacza się przez wzajemne ustawienie sekwencji tych dwu izolatów w taki sposób, że orientuje się domeny konserwatywne na zewnątrz domeny zmiennej doprowadzając do maksymalnego dostrojenia. Można to przeprowadzić przy pomocy jednego z wielu pakietów programów komputerowych, takich jak ALIGN 1.0, udostępniany przez University of Virginia, Department of Biochemistry od dr Williama R. Pearsona (patrz Pearson i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448, 1988). Jest zrozumiałe, że numeracja aminokwasów dla konkretnej domeny zmiennej jest nieco subiektywna i jest sprawą wyboru. Tak więc, należy mieć na uwadze, że o ile nie jest wyraźnie zaznaczone inaczej, początki i końce domen zmiennych są przybliżone i zawierają domeny częściowo się nakładające albo subdomeny.

171 972

Epitop może być immunologicznym równoważnikiem innego epitopu w wyznaczonym polipeptydzie jeśli reaguje on krzyżowo z przeciwciałami wiążącymi się immunologicznie z epitopem w tym wyznaczonym polipeptydzie.

Na ogół epitopy mapuje się; zawierają one co najmniej około 5 aminokwasów, czasem co najmniej około 8 aminokwasów a nawet około 10 a nawet więcej aminokwasów.

Sekwencja aminokwasowa zawierająca epitop HCV może być połączona z innym polipeptydem (na przykład z białkiem nośnikowym) albo wiązaniami kowalencyjnymi albo w wyniku ekspresji polinukleotydu fuzyjnego z utworzeniem białka fuzyjnego. O ile to potrzebne, można dokonać insercji lub przyłączenia wielokrotnych jednostek epitopu i/lub wbudować wiele różnych epitopów. Białko nośnika może pochodzić z dowolnego źródła ale na ogół będzie nim stosunkowo duże immunogenne białko takie jak BSA, KLH i podobne. Jeśli to wskazane, jako białko nośnikowe można zastosować białko HCV w zasadzie pełnej długości, zwielokratniając ilość immunogennych epitopów. Alternatywnie, sekwencję aminokwasową z epitopu HCV można łączyć jej końcem aminowym i/lub karboksylowym z sekwencją aminokwasową nie-HCV w taki sposób, że utworzony polipeptyd będzie polipeptydem fuzyjnym. Stosując epitopy z innych wyznaczonych białek wirusowych można konstruować analogiczne typy polipeptydów.

Termin wariant określonego polipeptydu odnosi się do polipeptydu, w którym została zmieniona sekwencja aminokwasowa w stosunku do tego określonego polipeptydu przez delecję, podstawienie, dodanie lub przegrupowanie jednego lub więcej aminokwasów w tej sekwencji. Metody, za pomocą których takie warianty pojawiają się (na przykład przez rekombinację) lub są konstruowane (na przykład przez ukierunkowaną mutagenezę) są znane.

Termin transformowanie określa insercję egzogennego polinukleotydu do komórki gospodarza, niezależnie od metody stosowanej do tej insercji, na przykład przez bezpośrednie wprowadzenie do komórki, transdukcję (łącznie z zakażeniem wirusowym), f-kojarzenie lub elektroporację. Ten egzogenny polinukleotyd może być utrzymywany w komórce jako wektor nie-zintegrowany, na przykład jako plazmid lub genom wirusowy albo alternatywnie, może być zintegrowany z genomem gospodarza.

Określenie osobnik oznacza kręgowce, zwłaszcza osobnika z gatunku ssaków i obejmuje ale nie ogranicza się do gryzoni (np. myszy, szczury, chomiki, świnki morskie), królików, kóz, świń, krów, owiec i naczelnych (np. szympansów, afrykańskich małp zielonych, pawianów, orangutanów i ludzi).

Stosowane tu określenie leczenie odnosi się do dowolnego typu (i) zapobiegania zakażeniu lub zakażeniu wtórnemu, tak jak w tradycyjnym szczepieniu, (ii) zmniejszania lub eliminacji objawów i (iii) znacznego lub całkowitego wyeliminowania wirusa. Leczenie można prowadzić profilaktycznie (przed zakażeniem) lub leczniczo (po zakażeniu).

Termin skuteczna ilość oznacza ilość polipeptydu zawierającego epitop wystarczającą do wywołania odpowiedzi immunologicznej u osobnika, któremu się go podaje albo do reakcji immunologicznej w stopniu wykrywalnym w żądanym układzie (np. w próbie immunologicznej). Korzystnie, taka skuteczna ilość wystarcza do skutecznego leczenia według powyższej definicji. Dokładna potrzebna ilość zależy od zastosowania. Do zastosowań jako szczepionki albo do wywoływania powstawania poliklonalnej antysurowicy/przeciwciał skuteczna ilość może się zmieniać i zależy od gatunku, wieku i ogólnego stanu osobnika, stanu zaawansowania choroby, która ma być leczona, konkretnego wybranego polipeptydu i drogi jego podania. Przyjmuje się, że skuteczne ilości będzie się oznaczać spośród stosunkowo dużego nie-krytycznego zakresu. Odpowiednią skuteczną ilość można łatwo oznaczyć w rutynowych doświadczeniach.

Stosowany w opisie termin próbka biologiczna odnosi się do próbki tkanki lub cieczy wyizolowanej od osobnika, takiej jak próbka osocza, surowicy, płynu rdzeniowego, płynu liińfatycznego, zewnętrznych wycinków skóry, próbek z układu oddechowego, pokarmowego, moczowo-płciowego, łez, śliny, mleka, komórek krwi, nowotworów, narządów, skrawków z biopsji oraz próbek składników hodowli komórkowych in vitro (włączając w to, lecz nie ograniczając do czynników kondycjonowanych otrzymanych ze wzrostu komórek na pożywce do hodowli komórkowych, np. komórek szpiczaka, komórek rekombinantowych i składników komórkowych wytwarzających przeciwciała monoklonalne).

Immunoreaklywne kompozycje polipeptydowe zawierają mieszaninę swoistych dla izolatu lub swoistych grupowo epitopów z co najmniej jednej domeny zmiennej HCV. Tak więc, w kompozycjach tych będą obecne przynajmniej dwie heterogeniczne sekwencje aminokwasowe, z których każda określa epitop znajdujący się w innych izolatach HCV zlokalizowany w tym samym albo prawie tym samym miejscu fizycznym w białku HCV, co oznacza, że każda sekwencja dopasowuje się do tego samego miejsca w obrębie genomu/polipeptydu HCV. Ponieważ sekwencje są heterogeniczne, ten obszar uznaje się jako domenę zmienną (VD).

Dla lepszego zrozumienia wynalazku, na początku będą opisane poszczególne sekwencje aminokwasowe składające się na immunoreaktywne kompozycje polipeptydowe. Następnie będzie opisana liczność takich sekwencji znajdujących się w tych kompozycjach.

Sekwencja aminokwasowa charakteryzująca polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku posiada następującą podstawową strukturę:

Ly - Z - L'y' (I) gdzie Z oznacza sekwencję aminokwasową z regionu białka z określonego izolatu, przy czym region ten zawiera co najmniej jedną domenę zmienną a ta domena zmienna zawiera co najmniej jeden epitop. L i L' są sekwencjami aminokwasowymi nie-HCV albo takimi sekwencjami aminokwasowymi HCV, które nie zawierają domeny zmiennej; mogą one być takie same lub różne. Symbole y i y' oznaczają liczby 0 lub 1 i mogą być takie same lub różne. Wzór I przedstawia sekwencję aminokwasową zawierającą sekwencję z domeny zmiennej HCV, przy czym ta domena zmienna posiada epitop.

Jak podano powyżej, epitop (epitopy) na sekwencji Z będzie na ogół zawierać co najmniej około 5 aminokwasów, częściej co najmniej około 8 aminokwasów a najczęściej co najmniej około 10 aminokwasów.

Domena zmienna sekwencji Z może zawierać więcej niż jeden epitop. Domena zmienna Z jest co najmniej tak duża jak połączone sekwencje zawartych w niej epitopów, co oznacza, że przy obecności pojedynczego epitopu składa się ona w zasadzie z co najmniej około 5 aminokwasów. Ponieważ epitopy mogą się na siebie częściowo nakładać, minimalna sekwencja aminokwasowa dla połączonych epitopów w domenie zmiennej może być mniejsza niż suma poszczególnych sekwencji epitopowych.

Z jest sekwencją aminokwasową izolatu HCV zawierającą opisaną powyżej domenę zmienną. Tak więc, minimalną wielkością Z jest minimalna wielkość domeny zmiennej. Z może zawierać więcej sekwencji aminokwasowych niż tylko domena zmienna (VD) a ponadto może zawierać więcej niż jedną domenę zmienną. Maksymalne wymiary Z nie są wielkością krytyczną lecz oczywiście, nie mogą przekraczać długości całej poliproteiny HCV. Na ogół jednak, Z będzie sekwencją całkowitego białka HCV (zwłaszcza El, E2/NS1, NS2, NS3, NS4 i NS5) albo nawet częściej, fragmentem takiego białka HCV. Tak więc, korzystnie, wielkość Z będzie się zawierać w granicach od minimum około 5 aminokwasów (bardziej korzystnie od około 8 do około 10 aminokwasów) do maksimum około i 100 aminokwasów (korzystniej do około 500, bardziej korzystnie do co najmniej około 400 a najkorzystniej do maksimum 200 aminokwasów). Na ogół, polipeptyd o wzorze I i/lub Z jeśli jest wytworzony metodą np. syntezy chemicznej, będzie się składał z maksymalnej ilości około 50 aminokwasów, częściej z około 40 aminokwasów a najczęściej z maksymalnej ilości około 30 aminokwasów.

Sekwencje aminokwasowe L i L' nie należące do HCV, o ile są obecne, mogą się składać z wielu różnych typów takich sekwencji. Przykładowo, L i L' mogą być se14 kwencjami nie-HCV, do których została dołączona sekwencja Z dla ułatwienia ekspresji tego rekombinantu (np. może to być β-galaktozydaza, dysmutaza nadtlenkowa, inwertaza, czynnik a, lider TPA i podobne), opisane poniżej. Alternatywnie, L i L' mogą oznaczać epitopy innych patogenów, takich jak wirusa zapalenia wątroby typu B, pałeczki krztuśca (Bordetella pertussis), toksyna laseczki tężca, błonica i podobne. Uzyskuje się wówczas kompozycje, które są immunoreaktywne wobec wielu tych innych organizmów chorobotwórczych, L i L' mogą być sekwencjami aminokwasowymi, które ułatwiają przyłączenie do stałego podłoża podczas syntezy peptydów, do podłoża podczas prób immunologicznych, mogą to być białka - nośniki szczepionki i podobne. W rzeczywistości, L i L' mogą nawet zawierać jeden lub więcej aminokwasów zbędnych, bez jakiegokolwiek znaczenia funkcyjnego. Nie ma krytycznej wielkości maksymalnej dla L i L'. Ich długość będzie na ogół zależała od spełnianej funkcji. Na ogół, każda z sekwencji L i L' będzie zawierała najwyżej około 2000 aminokwasów, częściej najwyżej około 1000 aminokwasów. Większość sekwencji L i L' o użytecznych właściwościach będzie zawierała maksymalnie około 500 aminokwasów. Zaleca się oczywiście takie dobranie sekwencji L i L' aby nie blokowały one immunoreaktywności sekwencji Z.

Kompozycja polipeptydowa która zawiera polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku charakteryzuje się obecnością (w ilości skutecznej pod względem immunoreaktywności) w swym składzie co najmniej dwóch sekwencji aminokwasowych zdefiniowanych poniżej wzorami II i III:

Ly - Zl - L'y' II))

Ly - Z2 - L'y' (III) gdzie L, L', y i y' mają wyżej podane znaczenie jak również znaczenie niezależnie określone dla każdego ze wzorów II i III oddzielnie. Każdy z symboli Zi i Z2 oznacza sekwencje aminokwasowe HCV zdefiniowane dla Z obejmujące tę samą domenę zmienną. (to znaczy w tym samym położeniu) ale pochodzące z różnych izolatów HCV, posiadające między nimi przynajmniej jeden heterogeniczny epitop we wspólnej dla Zi i Z2 domenie zmiennej. Przykładem takiego rozwiązania może być sekwencja aminokwasowa według wzoru II posiadająca jako Zi, fragment hiper-zmiennej domeny rozciągający się od aminokwasu 384 do 414 z izolatu HCV-1 (albo dokładniej, od 396 do 407 lub 396 do 408), a Z2 oznacza analogiczny fragment z izolatu HCV-J1.1. Te dwa izolaty są w tej domenie heterogeniczne, sekwencje aminokwasowe epitopów znacznie się różnią.

Jest zrozumiałe, że tak tworzone kompozycje mogą zawierać więcej niż akurat dwie oddzielone od siebie sekwencje aminokwasowe o wzorze I i że sekwencje Z mogą być podzielone na grupy obejmujące różne domeny zmienne. Przykładowo, kompozycja taka może zawierać grupę sekwencji HCV (o sekwencjach aminokwasowych odpowiadających wzorowi I) obejmujących hiper-zmienną domenę aminokwasów 384-411 z izolatów HCV-1, HCV-J1.1, HC-J1, HC-J4 i podobnych. Kompozycja ta może również zawierać dodatkową grupę sekwencji HCV (o sekwencjach aminokwasowych odpowiadających wzorowi I) obejmujących domenę zmienną aminokwasów 215-255, również z izolatów HCV-1, HCV-J1.1, HC-J1, HC-J4 i podobnych. Tak więc, w ramach wyżej opisanych kompozycji sekwencję o wzorze I można dalej zdefiniować wzorem:

SV_n (IV) gdzie V oznacza sekwencję aminokwasową zawierającą sekwencję domeny zmiennej HCV, przy czym ta domena zmienna zawiera przynajmniej jeden epitop, np. o wzorze I. Symbole S i n oznaczają liczby całkowite 1 lub większą. S oznacza konkretną domenę zmienną a n oznacza konkretny izolat. Przykładowo, S = 1 może oznaczać domenę zmienną w obrębie aminokwasów 384 - 411; S = 2 może oznaczać domenę zmienną w obrębie aminokwasów 215-255, n = 1, 2, 3 i 4 może oznaczać odpowiednio izolaty HCV-1, HCV-J1.1, HC-J1, HC-J4. Tak więc, opisane powyżej te dwie grupy sekwencji można przedstawić następująco:

grupa 1: 1Vt, 1V2, 1V3 i 1Vą. grupa 2: 2Vr, 2V2, 2V3 i 2V₄.

W kompozycjach takich istnieją co najmniej dwie różne sekwencje o wzorze IV, co oznacza, że kompozycja zawiera dwie różne sekwencje o wzorze IV, gdzie wartości dla S i/lub n są różne. Przykładowo, kompozycja zawiera co najmniej 1Vr i 1V2 albo co najmniej 1Vj i 2V2 albo co najmniej 1Vr i 2V1.

Odrębne sekwencje Oi^^p^r^iiadrają^ci wzorowi IV występują w kompozycji alb o w tej samej albo w różnych cząsteczkach poiipeptydowy/ch. to minimalną bombinacją 1V1 i 1V 2, można powiedzieć, że te dwie sekwencje występują w tej samej cząsteczce polipeptydu (np. 1V1 - 2V2) albo w oddzielnych cząsteczkach. Tę cechę kompozycji można przedstawić jako kompozycję polipeptydów o wzorze:

Rr - (SVn)x - RV (V) gdzie S, V i n mają wyżej podane znaczenie; R i R' są sekwencjami aminokwasowymi o długości około 1 - 2000 aminokwasów i mogą być takie same lub różne; r i r' oznaczają 0 albo 1 i mogą być takie same lub różne; x oznacza liczbę całkowitą > 1; n dobiera się niezależnie dla każdego x; z zastrzeżeniem, że sekwencje aminokwasowe występujące w kompozycji reprezentują kombinację wybraną z grupy (i) 1V1 i 1V2, (ii) 1V1 i 2V2 oraz (iii) 1V1 i 2V1. W tych rozwiązaniach, gdzie różne sekwencje o wzorze IV są rozmieszczone w różnych polipeptydach x może mieć wartość 1, aczkolwiek, o ile to wskazane, może on mieć również wartość powyżej 1, to jest, może być mieszaniną polipeptydów 1Vi - 1V2 i 1V1 - 2V2. Jeśli x oznacza 1, obydwa r i r' oznaczają korzystnie 0 w celu uniknięcia powielania z Ly i L'y, podczas gdy V można przedstawić w korzystnym rozwiązaniu wzorem I. Jeśli x jest >1 wówczas połączone długości R i sąsiadującej sekwencji L oraz R' i sąsiedniej sekwencji L' korzystnie nie mogą być większe od typowych maksymalnych długości podanych powyżej dla L i L'.

Wybór sekwencji aminokwasowych HCV zawartych w odmiennych sekwencjach V w kompozycjach będzie zależał od zamierzonego zastosowania tych sekwencji i leży w zakresie stanu techniki. Po pierwsze, należy zaznaczyć, że interesujące z punktu widzenia wynalazku epitopy HCV można podzielić na dwa typy. Do pierwszego typu epitopów zalicza się te, które są grupowo swoiste, to znaczy, że odpowiednie epitopy we wszystkich albo w zasadzie wszystkich izolatach w obrębie tej grupy izolatów wchodzą ze sobą wzajemnie w krzyżowe reakcje immunologiczne ale nie wchodzą w reakcje z odpowiednimi epitopami znajdującymi się w zasadniczo wszystkich izolatach należących do innej grupy. Korzystnie, epitopy w klasie grupowo-swoistej są w zasadzie konserwatywne w obrębie grupy ale nie pomiędzy grupami. Drugim typem epitopów są te, które są swoiste- dla izolatu, co oznacza, że epitop reaguje krzyżowo immunologicznie z zasadniczo identycznymi izolatami a nie reaguje krzyżowo ze wszystkimi lub w zasadzie wszystkimi odległymi izolatami.

Te swoiste grupowo i swoiste dla izolatu epitopy można łatwo zidentyfikować poniżej opisanymi metodami. Po pierwsze, w sposób podany w opisie porównuje się sekwencje kilku izolatów HCV i identyfikuje się obszary heterogeniczności sekwencji. Wzór heterogemczności zazwyczaj wykazuje swoistość grupową lub swoistość dla izolatu. Jeśli wiadomo, że zidentyfikowany obszar zawiera jeden lub więcej epitopów to wybiera się sekwencję o wielkości wystarczającej do objęcia danego epitopu (epitopów) jako domenę zmienną, którą można włączyć do wytwarzanej kompozycji. Jeśli immunoreaktywność danego heterogenicznego obszaru nie jest znana to można otrzymać i przeprowadzić skrining peptydów reprezentujących sekwencje znalezione w tym ob16

171 972 szarze w różnych izolatach HCV. Taki skrining może obejmować ale nie ogranicza się do prób immunologicznych z różnymi źródłami przeciwciał anty-HCV (np. z surowicą pacjenta, z przeciwciałami monoklonalnymi neutralizującymi i podobnymi czynnikami) albo do wytwOrzenia przeciwciała i oznaczania zdolności tego przeciwciała do neutralizacji wirusa in vitro. Alternatywnie, bada się miejsca epitopów zidentyfikowanych w skaningu, w sposób opisany poniżej na heterogeniczność między różnymi izolatami i oznacza się metodą skriningu właściwości immunologicznie odpowiednich sekwencji heterogenicznych.

Przypuszcza się, że do stosowania w szczepionkach duże znaczenie mają domeny zmienne z domen El i E2/NS1. Zidentyfikowano zwłaszcza domenę zmienną El w obrębie aminokwasów 215-255 (fig. 2) i domenę zmienną E2/NS1 w obrębie aminokwasów 384-414 (fig. 3) jako ważne domeny reaktywne immunologicznie. Wstępne dowody wskazują, że jedna lub obydwie te domeny mogą być miejscami heterogeniczności odpowiedzialnej za ucieczkę mutantów prowadzącą do infekcji przewlekłych HCV. Tak więc, szczególnie korzystne są opisane powyżej kompozycje, w których domena (domeny) zmienna w V są jedną lub obydwiema tymi domenami zmiennymi. Ponadto, kompozycje polipeptydowe, szczególnie jeśli są związane z zasadniczo liniowymi epitopami w domenach zmiennych, mogą również zawierać epitopy konformacyjne. Przykładowo, kompozycja może się składać z mieszaniny rekombinantowych białek El i/lub E2/NS1 (wykazujących domeny zmienne różnych izolatów) wydzielanych w układzie rekombinantowym (np. w komórkach owada lub ssaka) utrzymującym epitopy konformacyjne albo wewnątrz albo na zewnątrz tej domeny zmiennej. Alternatywnie, można łączyć antygen podjednostki El i/lub E2/NS1 z pojedynczego izolatu, zawierający epitopy konformacyjne, z inną kompozycją polipeptydową (np. z mieszaniną syntetycznych polipeptydów albo denaturowanych polipeptydów rekombinantowych). W innych korzystnych zastosowaniach do szczepionek, opisane powyżej kompozycje polipeptydowe łączy się z innymi antygenami podjednostki HCV, takimi jak w te, które są opisane w powszechnie dostępnym opisie zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych, o tytule: Hepatitis C Virus Asialoglycoproteina (numer rzecznika 0154.002) należącym do Roberta O. Ralston'a, Franka Marcus'a, Kenta B. Thudium'a, Barbary Gervase i Johna Hall'a, zgłoszonego w tej samej dacie co niniejsze zgłoszenie i wprowadzone do niniejszego opisu jako odnośnik.

Do zastosowań diagnostycznych przydatne jest użycie takich kompozycji jako antygenów, przez co polepsza się ich zdolność do wykrywania przeciwciała przeciw odmiennym izolatom HCV. Na ogół, takie mieszaniny polipeptydów można stosować bezpośrednio w próbie immunologicznej homogenicznej lub heterogenicznej; w tej ostatniej korzystna jest immobilizacja polipeptydu na stałym substracie (na przykład w studzienkach płytek do mikromianowania, na perełkach plastikowych, na nitrocelulozie). Sposoby te są ujawnione w publikacji zgłoszenia PCT, W090/11089; publikacji zgłoszenia europejskiego EPO nr 360.088; oraz w wydawnictwie Immunoassay: Practical Guide. Ponadto, można również każdy, w zasadzie identyczny polipeptyd otrzymywany sposobem według wynalazku, który składa się na kompozycję immunogeniczną immobilizować na tym samym nośniku w oddzielnych miejscach, przez co uzyskuje się informację, w stosunku do którego izolatu lub grupy jest swoiste powstałe przeciwciało. Może to mieć szczególne znaczenie w diagnostyce jeśli zapalenie wątroby, raka lub inne choroby o odmiennych rokowaniach klinicznych powodują różne izolaty. Korzystną techniką analizy immunologicznej jest analiza RIBA™ firmy Chiron wykonywana na paskach, opisana w powszechnie dostępnych zgłoszeniach patentowych Stanów Zjednoczonych 07/138.894 i 07/465.637, których ujawnienia są włączone do niniejszego opisu jako odnośnik.

Wytworzone sposobem według wynalazku polipeptydy używane są do wytwarzania kompozycji immunogenicznych. Można je wytwarzać także syntetycznie albo w hodowli tkankowej. Polipeptydy rekombinantowe występujące w postaci skróconych sekwencji

HCV lub białek HCV o pełnej długości mogą się składać wyłącznie z sekwencji HCV (jeden lub więcej epitopów, łączących się ze sobą lub oddzielonych) albo z sekwencji w białku fuzyjnym. W białkach fuzyjnych, do użytecznych sekwencji heterologicznych należą sekwencje potrzebne do wydzielania z gospodarza rekombinantowego, wzmocnienia reaktywności immunologicznej epitopu (epitopów) HCV albo do sprzęgania tego polipetydu z nośnikiem lub z nośnikiem szczepionki. Odpowiednie ujawnienia są zawarte są zawarte w publikacji patentu europejskiego EPO nr 116.201; w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 4.722.840; w publikacji patentu europejskiego EPO nr 259.149 i w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 4.629.783, włączonych do niniejszego opisu jako odnośniki.

Białka o pełnej długości, jak również polipeptydy złożone ze skróconych sekwencji HCV i ich mutanty można wytwarzać na drodze syntezy chemicznej. Sposoby wytwarzania polipeptydów na drodze chemicznej są znane. Można je również wytwarzać techniką rekombinacyjną. W niniejszym opisie została podana sekwencja DNA kodująca HCV-1 oraz sekwencje DNA z różnych regionów zmiennych innych izolatów HCV. Dostępność tych sekwencji umożliwia konstruowanie polinukleotydów kodujących immunoreaktywne regiony polipeptydów HCV.

Polinukleotydy kodujące żądany polipeptyd zawierający jeden lub więcej immunoreaktywnych epitopów HCV z domeny zmiennej HCV można syntetyzować chemicznie lub izolować i wprowadzać do wektora ekspresyjnego. Wektory mogą ale nie muszą zawierać części sekwencji fuzyjnych, takich jak gen β-galaktozydazy lub dysmutazy nadtlenkowej (SOD). Sposoby i wektory użyteczne do wywarzania polipeptydów zawierające sekwencje fuzyjne SOD są opisane w publikacji patentu europejskiego nr 0196056 opublikowanej 1 października 1986 r.

DNA kodujący żądany polipeptyd w postaci białka fuzyjnego lub dojrzałego, zawierający sekwencję sygnalną umożliwiającą sekrecję lub nie zawierający tej sekwencji, poddaje się ligacji z wektorami ekspresyjnymi odpowiednimi dla danego wybranego gospodarza. Następnie transformuje się organizmy gospodarza tym wektorem ekspresyjnym. Obecnie do wywarzania polipeptydów rekombinantowych stosuje się zarówno układy gospodarza eukariotycznych jak i prokariotycznych; przegląd niektórych częściej stosowanych układów kontrolnych i linii komórkowych gospodarzy jest podany w cytowanym powyżej odnośniku literaturowym. Komórki gospodarzy inkubuje się w warunkach pozwalających na ekspresję żądanego polipeptydu. Polipeptyd ten izoluje się z poddanych lizie komórek albo z pożywki hodowlanej i oczyszcza do poziomu wymaganego do zamierzonego użycia.

Ogólne techniki stosowane do ekstrakcji genomu HCV z wirusa, preparowania i sondowania banków DNA, sekwencjonowania klonów, konstruowania wektorów ekspresyjnych, transformowania komórek, prowadzenia prób immunologicznych takich jak próby radioimmunologiczne i ELISA dla komórek rosnących w hodowli są ogólnie znane (odpowiednie pozycje literaturowe zostały podane w innych częściach opisu.

Transformowanie wektora zawierającego żądaną sekwencję do odpowiedniego gospodarza wykonuje się dowolną znaną techniką wprowadzania polinukleotydów do komórki gospodarza, przykładowo techniką upakowania polinukleotydu w wirusie i zakażenia komórki gospodarza tym wirusem lub przez bezpośrednie wprowadzenie polinukleotydu. Użyta procedura transformacji zależy od gospodarza. Transformowanie bakterii przez bezpośrednie wprowadzenie do komórki bakteryjnej wymaga traktowania chlorkiem wapnia lub rubidu (Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. 69: 2110, 1972). Bezpośrednie transformowanie drożdży wykonuje się metodą Hinnen'a i wsp. (J. Adv. Enzyme Reg., 7: 1929, 1978). Transformowanie komórek ssaków przez bezpośredni pobór można prowadzić metodą Graham'a i Van der Eb'a z zastosowaniem strącania fosforanem wapniowym (Virology 52: 546, 1978) albo znanymi modyfikacjami tej metody. Inne znane metody wprowadzania rekombinantowych polinukleotydów do komórek, zwłaszcza do komórek ssaków polegają na transfekcji za pośrednictwem dekstranu, transfekcji z udziałem fosforanu wapniowego, transfekcji z udziałem polibrenu, fuzji protoplastów, elektroporacji, kapsułkowaniu polinukleotydu (polinukleotydów) w liposomach i na bezpośredniej mikroiniekcji tych polinukleotydów do jąder.

W celu uzyskania ekspersji żądanych sekwencji kodujących, transformuje się komórki gospodarza polinukleotydami (mogącymi stanowić wektory ekspresyjne), zawierającymi sekwencje kontrolne związane operacyjnie z żądanymi sekwencjami kodującymi. Sekwencje kontrolne są zgodne z wyznaczonym gospodarzem. Spośród gospodarzy prokariotycznych najczęściej stosuje się E. coli. Do sekwencji kontrolujących ekspresję u prokariotów należą promotory, ewentualnie zawierające części operatorowe i miejsca wiązania z rybosomem. Wektory przeniesienia zgodne z gospodarzami prokariotycznymi na ogół pochodzą np. z pBR322, zawierających plazmid operonów nadających oporność na ampicylinę i tetracyklinę oraz z różnych wektorów pUC, które również zawierają sekwencje będące markerami oporności na antybiotyk. Można stosować sekwencje promotora występujące w stanie naturalnym, na przykład, układy promotorowe /Maktamazy (penicylinazy) (Weissman, The cloning of interferon and other mistakes, Interferon 3 (wydawca I. Grosser, 1981), laktozy (1ac) (Chang i wsp., Naturę, 198: 1056, 1977) i tryptofanu (trp) (Goeddel i wsp., Nuci. Acids. Res., 8: 4057, 1980) i promotory lambda Pl oraz miejsce wiązania z rybosomem N genu (Shimatake i wsp. Naturę, 292: 128, 1981). Ponadto, promotory syntetyczne nie występujące w stanie naturalnym również funkcjonują jako promotory bakteryjne. Przykładowo, sekwencje aktywujące transkrypcję jednego promotora można łączyć z sekwencjami operonowymi innego promotora, uzyskując syntetyczny promotor hybrydowy (na przykład promotor tac, który pochodzi z sekwencji promotorów trp i 1ac (De Boer i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21, 1983). Powyższe układy są szczególnie zgodne z E. coli; jeśli zachodzi potrzeba, można użyć innych prokariotycznych gospodarzy, takich jak szczepy Bacillus lub Pseudomonas z odpowiednimi sekwencjami kontrolnymi.

Do gospodarzy eukariotycznych należą drożdże i komórki ssaków w układach hodowli. Najpowszechniej stosowanymi gospodarzami drożdżowymi są Saccharomyces cereyisiae i Saccharomyces carlsbergensis: są one wygodnymi gospodarzami grzybowymi. Wektory zgodne z drożdżami na ogół mają markery pozwalające na selekcję transformantów przez nadanie cechy prototroficzności mutantom auksotroficznym albo oporności na metale ciężkie szczepom typu dzikiego. W wektorach zgodnych z drożdżami można stosować jako źródło replikacji plazmid 2 mikrony (Broach i wsp., Meth. Enz. 101: 307, 1983), kombinację CEN3 i ARS1 lub inne środki zapewniające replikację, takie jak sekwencje zapewniające wprowadzenie odpowiedniego fragmentu do genomu komórki gospodarza. Sekwencje kontrolne dla gospodarzy drożdżowych są znane; obejmują one promotory do syntezy enzymów glikolitycznych (Hess i wsp., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968); przykładowo dehydrogenazy alkoholowej, ADH (publikacja patentu europejskiego nr 284.044), enolazy, glukokinazy, izomerazy glukozo-6-fosforanu, dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanu (GAP lub GAPDH), heksokinazy, fosfofruktokinazy, mutazy 3-glicerofosforanu i kinazy pirogronianowej, PyK (publikacja patentu europejskiego EPO nr 329203). Drożdżowy gen PH05, kodujący kwaśną fosfotazę, również dostarcza użyteczne sekwencje promotorowe. Ponadto, promotory syntetyczne, nie występujące w przyrodzie również funkcjonują jako promotory drożdżowe. Przykładowo, można łączyć idące w górę sekwencje aktywujące (UAS) jednego promotora drożdżowego z regionem aktywacji transkrypcji drugiego promotora drożdżowego uzyskując syntetyczny promotor hybrydowy. Przykłady takich promotorów hybrydowych obejmują sekwencję regulatorową ADH połączoną z regionem aktywacji transkrypcji GAP (opisy patentowe Stanów Zjednoczonych nr 4.876.197 i 4.880.734). Inne przykłady promotorów hybrydowych obejmują promotory składające się z sekwencji regulatorowych jednego z genów ADH2, GAL4, GALIO albo PH05, połączonych z regionem aktywacji transkrypcji genu enzymu glikolitycznego takiego jak GAP albo PyK (publikacja patentu europejskiego nr 164.556). Ponadto, promotor drożdżowy może zawierać występujące w stanie naturalnym promotory pochodzenia niedrożdżowego, posiadające zdolność wiązania drożdżowej polimerazy RNA do odpowiedniego inicjowania transkiypcji.

Innymi elementami kontrolnymi, które można włączać do drożdżowego wektora ekspresyjnego są terminatory (na przykład z GAPDH i z genu enolazy; Holland, J. Biol. Chem. 256: 1385) i sekwencje hderowe. Fragment sekwencji liderowej na ogół koduje peptyd sygnalny złożony z aminokwasów hydrofobowych kierujących sekrecją białka z komórki. DNA kodujący odpowiednie sekwencje sygnalne może pochodzić z genów dla wydzielanych białek drożdżowych, takich jak gen inwertazy drożdżowej (publikacja patentu europejskiego EPO nr 12.873) i gen czynnika a (publikacja patentu Stanów Zjednoczonych nr 4.588.684). Alternatywnie, sekrecję w drożdżach umożliwiają również lidery pochodzenia nie-drożdżowego, takie jak lider interferonu (publikacja patentu europejskiego EPO nr 60.057). Korzystną klasą liderów sekrecji jest ta, w której stosuje się fragment drożdżowego genu czynnika-α, zawierający zarówno sekwencję pre sygnalną jak i region pro. Do fragmentów czynnika-α, które można zastosować należą: lider pre-pro-czynnika-α o pełnej długości oraz skrócone lidery czynnika-α (opisy patentowe Stanów Zjednoczonych nr 4.546.083 i 4.870.007 oraz publikacja patentu europejskiego EPO nr 324.274). Do innych, zapewniających sekrecję liderów, w których zastosowany jest fragment lidera czynnika-α należą lidery hybrydowego czynnika-α wytworzone z pre-sekwencji pierwszych drożdży i z pro-regionu pochodzącego z czynnika-α z drugich drożdży (publikacja patentu światowego WO 89/02463).

Opracowano wektory ekspresyjne, replikony poza chromosomalne lub wektory integrujące się do transformowania do wielu gospodarzy drożdżowych. Przykładowo, opracowano wektory ekspresyjne dla Candida albicans (Kurtz i wsp., Mol. Celi. Biol. 6: 142, 1986), Candida maltosa (Kunze i wsp., J. Basic Microbiol. 25: 141, 1985), Hansenula polymorpha (Gleeson i wsp., J. Gen. Microbiol. 132: 3459, 1986), Kluyvermyces fragilis (Das i wsp., J. Bacteriol. 158: 1165, 1984), Kluyveromyces lactis (de Louvencourt i wsp., J. Bacteriol. 154: 737, 1983), Pichia quillerimondii (Kunze i wsp., (1985, jak wyżej)), Pichia pastoris (Cregg i wsp., Mol. Celi. Biol. 5: 3376, 1985; opisy patentowe Stanów Zjednoczonych, nr 4.837.148 i 4.929.555), Schizosaccharomyces pombe (Beach i Nurse, Nature, 300: 706, 1981) i Yarrowia lipolytica (Davidow i wsp., Curr. Genet. 10: 39, 1985).

Znane są linie komórkowe ssaków w charakterze gospodarzy ekspresyjnych. Obejmują one między innymi nieuśmiercone linie komórkowe dostępne w Amerykańskim Muzeum Szczepów, American Type Culture Collection (ATCC), przykładowo komórki HeLa, komórki jajników chomika chińskiego (CHO), komórki nerek młodych chomików (BHK), małpie komórki COS i wiele innych linii komórkowych. Promotory dla komórek ssaków są również znane i obejmują promotory wirusowe, takie jak promotor z wirusa SV40, z wirusa mięsaka Rous'a (RsV), z adenowirusa (ADV) i z wirusa brodawczaka bydląd (BPV). Przykłady odpowiednich promotorów podane są w książce Sambrook'a (1989). Komórki ssaków wymagają również sekwencji terminatorowych i sekwencji addycji poli A. Można również włączać sekwencje wzmacniające, które zwiększają ekspresję. Korzystne jest również włączenie sekwencji powodujących amplifikację genu. Sekwencje te są znane.

Wektory odpowiednie do replikacji w komórkach ssaków są znane i mogą zawierać replikony wirusowe albo sekwencje zapewniające integrację odpowiednich sekwencji kodujących żądane polipeptydy z genomem gospodarza.

Wektorem, który stosuje się do ekspresji obcego DNA, takim, który stosuje się w preparatach szczepionek jest wirus krowianki. W tym przypadku, dokonuje się insercji heterologicznego DNA do genomu wirusa krowianki. Techniki insercji obcego DNA do genomu wirusa krowianki są znane. Taką techniką jest na przykład rekombinacja homologiczna. Insercji heterologicznego DNA dokonuje się zwykle do genu nie mającego zasadniczego znaczenia, na przykład do genu kinazy tymidynowej (tk), który zapewnia ponadto marker selekcyjny. Wektory plazmidowe znacznie ułatwiające konstruowanie wirusów rekombinantowych są opisane. Przykładowe publikacje na ten temat to: Mackett i wsp.: DNA cloning, tom II, (1984), IRL Press, str. 191; Chakrabarti i wsp., Mol. Cell Biol., 5: 3403, 1985; Moss, Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987, wyd. Miller i Calos, str. 10. Ekspresja żądanych polipeptydów w tym otrzymywanego sposobem według wynalazku zawierających regiony immunoreaktywne zachodzi następnie w komórkach i w osobnikach zakażonych i/lub immunizowanych żywym rekombinantowym wirusem krowianki.

Do innych układów ekspresji polipeptydów należą komórki owadów i wektory odpowiednie do użycia w tych komórkach. Układy te są znane i przykładowo obejmują wektory transferowe do ekspresji w owadach pochodzące z wirusa jądrowej polihedrozy baculowirusa Autographa californica (AcNPV) będące wirusowymi wektorami ekspresyjnymi helper-niezależnymi. Wektory ekspresyjne pochodzące z tego układu zwykle zawierają promotor silnego wirusowego genu polihedronu w celu pobudzenia ekspresji genów heterologicznych. Ostatnio, najpowszechniej stosowanym wektorem transferowym do wprowadzania obcych genów do AcNPV jest pAc373. W celach zwiększenia ekspresji opracowano wiele innych wektorów znanych specjalistom z tej dziedziny. Należą do nich na przykład pVL985 (zmieniający kodon startu polihedronu z ATG na ATT i wprowadzający miejsce klonowania Bam HI w odległości 32 pary zasad od ATT w kierunku 3' (Lucków i Summers, Virology 17: 31, 1989). Do dobrej ekspresji nie-fuzyjnych obcych białek na ogół potrzebne są obce geny, które najkorzystniej posiadają krótką sekwencję liderową zawierającą odpowiednie sygnały początku translacji poprzedzające sygnał startu ATG. Plazmid ten zawiera również sygnał poliadenylacji polihedronu i gen oporności na ampicylinę (amp) oraz źródło replikacji do selekcji i namnażania w E. coli.

Sposoby wprowadzania heterologicznego DNA do żądanego miejsca w baculowirusie są znane (Summers i Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin nr 1555; Ju i wsp., Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, wyd. Miller i Calos, 1987; Smith i wsp., Mol. Cell Biol. 3: 2156, 1983 oraz Lucków i Summers, jak wyżej, 1989). Przykładowo, metodą homologicznej rekombinacji dokonuje się insercji do genu takiego jak gen polihedronu; miejscem insercji może być również miejsce enzymu restrykcyjnego sztucznie wbudowane do żądanego genu baculowirusa. Włączanymi sekwencjami mogą być również te, które kodują wszystkie lub różne segmenty żądanych polipeptydów HCV łącznie z co najmniej jednym epitopem z domeny zmiennej.

Okazuje się, że sygnały dla modyfikacji post translacyjnych, takie jak sygnał rozszczepienia peptydu, rozszczepienia proteolitycznego i fosforylacji jest rozpoznawany przez komórki owada. Sygnały wymagane do sekrecji i akumulacji jądrowej wydają się również jednakowe dla komórek bezkręgowców i kręgowców. Przykłady sekwencji sygnalnych z komórek kręgowców, które są efektywne w komórkach bezkręgowców są znane; jako przykład może służyć sygnał dla ludzkiej interleukiny 2 (IL2), który jest sygnałem transportu na zewnątrz o ile tylko komórka ta zostanie rozpoznana i właściwie usunięta w komórkach owadzich.

Często jest pożądane aby polipeptydy wytwarzane z użyciem wyżej opisanych komórek gospodarzy i wektorów były polipeptydami fuzyjnymi. Tak jak polipeptydy niefuzyjne, polipeptydy fuzyjne mogą po ekspresji pozostawać wewnątrz komórki. Alternatywnie, białka fuzyjne mogą być również wydzielane z komórki do środowiska wzrostu jeśli posiadają fragment sekwencji liderowej. Korzystnie, między fragmentem lidera a pozostałą częścią obcego genu znajdują się miejsca przetwarzania, które można rozszczepiać in vivo lub in vitro.

W przypadkach, gdy kompozycja ma być stosowana do leczenia HCV, pożądane jest aby była ona immunogenna. W przypadkach, gdy syntetyzowany polipeptyd ma prawidłową konfigurację zapewniającą istnienie prawidłowego epitopu ale jest za mały aby był immunogenny, można go związać z odpowiednim nośnikiem. Znanych jest wiele technik uzyskiwania takich połączeń, między innymi tworzenie wiązań dwusiarczkowych za pomocą N-sukcynimidylo-3-(2-pirydylo-tio) propionianu (SPDP) i sukcynimidylo-4(N-maleimidometylo) cykloheksano-1-karboksylanu (SMCC); jeśli peptyd nie ma grupy sulfhydrylowej to można ją wprowadzić dodając resztę cysteiny. Reagenty te budują wiązania dwusiarczkowe pomiędzy grupami sulfhydrylowymi oraz pomiędzy resztami cysteiny na jednym białku a wiązaniem amidowym poprzez grupę -aminową w lizynie albo inną wolną grupę aminową w innych aminokwasach. Znanych jest wiele takich środków tworzących wiązania dwusiarczkowo-amidowe. (Immun. Rev. 62: 185, 1982). Inne dwufunkcyjne reagenty sprzęgające dają wiązania tioeterowe a nie dwusiarczkowe. Wiele takich środków dających tioetery jest dostępnych w handlu; należą do nich reaktywne estry kwasu 6-maleimidokapronowego, 2-bromooctowego, 2-jodooctowego, 4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylowego i podobne. Grupy karboksylowe można aktywować przez łączenie ich z sukcynimidem albo z solą sodową kwasu 1 -hydroksy2-nitro-4-sulfonowego. W innych metodach sprzęgania antygenów stosuje się układ: rotawirus/peptyd wiążący opisany w publikacji patentu europejskiego, nr 259.149. Powyższa lista nie jest wyczerpująca i mogą być wykonywane modyfikacje wymienionych związków.

Można stosować dowolny nośnik, który sam nie wywołuje wytwarzania przeciwciał szkodliwych dla gospodarza. Odpowiednimi nośnikami są tu duże, wolno metabolizujące się makrocząsteczki, takie jak białka; polisacharydy takie jak sepharoza funkcjonalizowana lateksem, agaroza, celuloza, perełki celulozowe i podobne; polimeryczne aminokwasy, takie jak kwas poliglutaminowy, polilizyna i podobne; kopolimery aminokwasowe; nieaktywne cząsteczki wirusa (patrz wyżej). Szczególnie użytecznymi substratami białkowymi są: albuminy surowicy, hemocy'anina z mięczaków, cząsteczki immunoglobulin, tyroglobulina, owalbumina, anatoksyna laseczki tężca i inne dobrze znane białka.

Immunogenność epitopów na domenach zmiennych HCV, zwłaszcza E1 i E2/NS1 można również wzmocnić poprzez wytwarzanie ich w układach eukariotycznych sprzężonych z lub wbudowanych do białek tworzących cząstki, takich jak na przykład białka związanego z antygenem powierzchniowym wirusa zapalenia wątroby B (Opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4.722.840). Konstrukcje, w których polipeptyd zawierający epitop HCV z domeny zmiennej jest przyłączony bezpośrednio do sekwencji kodującej białko tworzące cząsteczkę daje hybrydy immunogenne w odniesieniu do epitopu HCV. Ponadto, wszystkie wytworzone wektory zawierają epitopy swoiste w stosunku do HBV, o różnych stopniach immugenności, takie jak na przykład peptyd pre-S. Tak więc, cząsteczki skonstruowane z białka tworzącego cząsteczkę, zawierające sekwencje HCV są immunogenne w odniesieniu do HCV i HBV.

Antygen powierzchniowy zapalenia wątroby (HBSAg) został utworzony i wbudowany do cząsteczek w S. cerevisiae (Valenzuele i wsp., Nature 298: 344, 1982) jak również w komórkach ssaków (Valenzuela i wsp.: Hepatitis B, wyd. Millman i wsp., 1984). Okazało się, że tworzenie takich cząsteczek wzmacnia immunogenność podjednostki monomerycznej. Takie konstrukcje mogą również zawierać epitop immunodominantowy HBSAg zawierający 55 aminokwasów regionu pre-powierzchni (Pre-S) (Neurath i wsp. (1984). Konstrukcje cząsteczki pre-S-HBSAg, których ekspresja zachodzi w drożdżach są ujawnione w publikacji patentu europejskiego EPO nr 174.444; hybrydy zawierające heterologiczne sekwencje wirusowe do ekspresji w drożdżach są ujawnione w publikacji patentu europejskiego EPO nr 175.261. Ekspresja tych konstrukcji może również zachodzić w komórkach ssaków takich jak komórki CHO jeśli zastosuje się wektor SV40 - reduktazy dihydrofolianowej (Michelle i wsp. (1984)).

Ponadto, części sekwencji kodujące białka tworzące cząsteczki mogą być zastąpione kodonami kodującymi epitop z domeny zmiennej HCV. W tej zamianie, można wyciąć regiony, które nie są konieczne do agregacji tych jednostek z utworzeniem immunogennych cząsteczek w drożdżach lub ssakach, przez co eliminuje się dodatkowe miejsca antygenowe HBV z konkurowania z epitopem (epitopami) HCV.

Znane są preparaty szczepionek zawierających immunogenne polipeptydy jako składniki aktywne. Na ogół, takie szczepionki wytwarza! się w postaci form iniekcyjnych, jako roztwory albo zawiesiny; form stałych nadających się do przygotowania roztworu

171 972 lub zawiesiny bezpośrednio przed iniekcją. Preparaty te można również emulgować lub polipeptydy te można zamykać w mikrokapsułkach liposomowych. Aktywne składniki immunogenne często miesza się ze środkami pomocniczymi dopuszczalnymi farmaceutycznie i zgodnymi ze składnikiem aktywnym. Odpowiednimi środkami pomocniczymi są tu na przykład woda, sól fizjologiczna, glukoza, glicerol, etanol i podobne oraz ich kombinacje. O ile to wskazane, szczepionka może również zawierać niewielkie ilości substancji dodatkowych takich jak środki zwilżające lub emulgatory, bufory, utrzymujące żądane pH i/lub adiuwanty zwiększające skuteczność szczepionki. Nieograniczającymi przykładami adiuwantów, które mogą się okazać efektywne są: wodorotlenek glinowy, N-acetylo-muramylo-L-treonylo-D-izoglutamina (thr-MPD), N-acetylo-normuramylo-Lalanylo-D-izoglutamina (CGP 11637) nazywana skrótowo nor-MDP, N-acetylo-muramylo-L- alanylo-D-izo glutaminylo -L-alanino-2- (1'-2'-dipalmitoilo-sn- glicero-3-hydroksyfos:^t^i^l(^]^^^)^'ty^<^i^^ina (CGp 19835A, nazywana skrótowo MPT-PE oraz RIBI, która zawiera trzy składniki ekstrahowane z bakterii, monofosforylo-lipid A, dimykolam trehalozy i szkielet ściany komórkowej (MPL+TDM+CWS) w emulsji 2% skwalenu i Tweenu 80. Efektywność adiuwanta można oznaczyć przez pomiar ilości przeciwciał przeciw immunogenicznemu polipeptydowi zawierającemu epitop HCV z domeny zmiennej, które to przeciwciała tworzą się po podaniu tego polipeptydu w szczepionkach zawierających ponadto te różne adiuwanty.

Białka mogą występować w szczepionce w formie związków obojętnych lub soli. Sole dopuszczalne farmaceutycznie obejmują sole addycyjne z kwasami (z wolnymi grupami aminowymi peptydu) i sole powstające z kwasami nieorganicznymi, takimi jak kwas chlorowodorowy lub fosforowy albo z organicznymi, takimi jak kwas octowy, szczawiowy, winowy, maleinowy i podobne. Sole utworzone z wolnymi grupami karboksylowymi mogą również pochodzić z nieorganicznych zasad, takich jak na przykład wodorotlenek sodowy, potasowy, amonowy, wapniowy lub żelazowy i takich zasad organicznych jak izopropyloamina, trójmetyloamina, 2-etyloaminoetanol, histydyna, prokaina i podobne.

Szczepionki dogodnie podaje się pozajelitowo przez iniekcję, np. podskórną lub domięśniową. Dodatkowe formy, dostosowane do innych dróg podawania obejmują czopki i w pewnych przypadkach, formy doustne. Do form czopkowych stosuje się tradycyjne środki wiążące i nośniki, na przykład, glikole polialkilenowe lub trójgliceiydy; takie jak czopki można formować z mieszanin zawierających składnik aktywny w ilości od 0,5% do 10%, korzystnie 1% do 2%. Do form doustnych stosuje się powszechnie używane środki pomocnicze, na przykład mannitol, laktozę, skrobię, stearynian magnezowy, sól sodową sacharyny, celulozę, węglan magnezowy i podobne, wszystkie o czystości do celów farmaceutycznych. Kompozycje te sporządza się w postaci roztworów, zawiesin, tabletek, pigułek, kapsułek, form o przedłużonym działaniu lub proszków; zawierają one 10% do 95% składnika aktywnego, korzystnie 25% do 70%.

Ponadto, jest również możliwe wytworzenie żywych szczepionek atenuowanych mikroorganizmów, w których zachodzi ekspresja rekombinantowych polipeptydów z układu antygenowego HCV. Odpowiednie atenuowane mikroorganizmy są znane; należą do nich na przykład wirusy (np. wirus krowianki) i bakterie.

Szczepionki podaje się w sposób zgodny z daną postacią farmaceutyczną i w takiej ilości aby były skuteczne profilaktycznie i terapeutycznie. Dawka przeznaczona do podania mieści się w zakresie od 5 fig do 250 fig antygenu/dawkę i zależy od osobnika, zdolności układu immunologicznego tego osobnika do syntetyzowania przeciwciał i żądanego stopnia ochrony. Konkretne dawki składnika aktywnego zalecone do podania będą zależeć od oceny lekarza prowadzącego i mogą być dostosowane indywidualnie dla każdego pacjenta.

Szczepionkę można podawać w postaci jednej dawki albo korzystnie, według schematu wielodawkowego. W schemacie wielodawkowym pierwszy etap szczepienia składa się z 1 do 10 oddzielnych dawek i następnych kolejnych dawek podawanych w odstępach

171 972 czasu, potrzebnych do utrzymania i/lub wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej. Przykładowo, następną dawkę podaje się po upływie 1-4 miesięcy i o ile to potrzebne, kolejną dawkę podaje się po kilku miesiącach. Schemat dawkowania, przynajmniej częściowo będzie określany potrzebą danego osobnika i będzie zależał od oceny lekarza prowadzącego.

Szczepionka zawierająca opisany powyżej zespół antygenów znajdujących się w polipeptydach HCV może być również podawana łącznie z innymi środkami immunoregulującymi, np. z immunoglobulinami.

Kompozycje immunoreaktywne można podawać w celu wywołania u osobników wytwarzania przeciwciał poliklonalnych (oczyszczanych lub izolowanych z surowicy znanymi technikami), które z kolei mają szereg różnych zastosowań, na przykład do immunizacji biernej albo jako reagenty immunochemiczne.

Opisane powyżej kompozycje immunoreaktywne zawierające wiele układów antygenowych HCV stosuje się do wykrywania przeciwciał przeciw HCV z próbkach biologicznych, w tym we krwi i w surowicy. Istnieje duży wybór różnych możliwości opracowania prób immunologicznych i wiele z nich jest znanych. Jednak w tej próbie immunologicznej będzie się stosować zespoły antygenów, przy czym każdy taki zespół będzie zawierał wiele w zasadzie identycznych polipeptydów posiadających sekwencję aminokwasów z epitopu na pierwszej domenie zmiennej izolatu HCV a sekwencja aminokwasowa jednego zespołu będzie heterogeniczna w odniesieniu do sekwencji aminokwasowej co najmniej jednego innego zespołu. Zasada tej próby immunologicznej może być oparta na przykład na konkurencji lub bezpośredniej reakcji albo na technice kanapkowej. W próbach tych można również stosować stałe nośniki lub immunoprecypitację. W większości prób wykorzystuje się znakowane przeciwciało albo polipeptyd; znacznikiem może być przykładowo związek fluoroscencyjny, chemiluminescencyjny, radioaktywny lub cząsteczka barwnika. Znane są również próby, w których amplifikuje się sygnały z sondy; ich przykładami są próby z zastosowaniem biotyny i awidyny oraz próby immunologiczne ze znakowanym enzymem i zachodzące za pośrednictwem enzymu, takie jak próby ELISA.

Zestawy do diagnozy immunologicznej, zawierające odpowiednie znakowane reagenty przygotowuje się przez pakowanie odpowiednich materiałów, w tym kompozycji zawierających epitopy HCV z domen zmiennych w odpowiednich pojemnikach razem z pozostałymi reagentami i materiałami (np. odpowiednimi buforami, roztworami soli itp.) potrzebnymi do przeprowadzenia próby jak również z kompletem instrukcji prowadzenia próby.

Poniżej opisane są przykłady realizacji niniejszego wynalazku, załączone w celu jego ilustracji i nie ograniczającymi zakresu wynalazku. W świetle niniejszego ujawnienia, wiele rozwiązań objętych zakresem zastrzeżeń będzie oczywistych dla specjalistów z tej dziedziny.

W przykładach stosuje się następujące materiały i sposoby.

Próbki pobrane od pacjentów i ekstrakcja RNA.

Bezobjawowi nosiciele HCV, HCT 18 i HCV J1 oraz pacjent Th z przewlekłym zakażeniem HCV są opisani przez Weiner'a i wsp. (Virol. 180: 842-848, 1991). U pacjenta Q zdiagnozowano przewlekłą aktywną postać zapalenia wątroby na podstawie biopsji wątroby; pacjent ten był leczony interferonem α-2b (3 miliony jednostek, trzy razy w tygodniu) przez 6 miesięcy. RNA z ilości 0,2 ml osocza ekstrahowano metodą Chomcynskiego i Sacchi (Anal. Biochem. 162: 156-159, 1987) stosując odczynnik RNAzol™ B (Cinna/Biotecx Laboratories) zawierający 10 /zg/ml nośnikowego RNA z MS2 (Boehringer Mannheim, 165-948) i postępując według przepisu podanego przez producenta. RNA zawieszano w 200 μl pirowęglanu dwuetylowego, traktowano wodą destylowaną i strącano w roztworze o końcowym stężeniu 0.2 M octanu sodowego i 2,5 objętości 100% etanolu, w temperaturze -20°C.

cDNA i enzymatyczna reakcja amplifikacji PCR

171 972

Wszystkie reakcje prowadzono według Weinera i wsp. (Lancet 235: 1-5, 1990). Sekwencjonowanie M13 prowadzono według Messinga i wsp. (Methods in Enzymology, 1983,101: 20-37). Wykazano sekwencję zgodną (consensus) w co najmniej czterech sklonowanych insertach za wyjątkiem sekwencji HCV J1.2 E2/NS1, która pochodziła z dwu klonów.

Klonowanie i sekwencjonowanie materiału od HCT 18 i Th prowadzono według Weinera i wsp. (1991, jak wyżej). Komplet hierarchicznych primerów do reakcji PCR użytych do klonowania amino-terminalnych i karboksy-początkowych segmentów E2/NS1 od pacjenta Q był następujący:

PCR I

X(E2)14 GGTGCTCACTGGGGAGTCCT (1367-1386)S

X(E2) 18J CATTGCAGTTCAGGGCCGTGCTA (1608-1588)A

PCR II

X(E2)4 TCCATGGTGGGGAACTGGGC (1406-1425)S

X(E2) 19J TGCCAACTGCCATTGGTGTT (1582-1562)A

PCR I

X(E2) 14 (jak wyżej) S

Jirci2 TAACGGGCTGAGCTCGGA (2313-2296)A

PCR II

US(E2)5 CAATTGGTTCGGTTGTACC (1960-1978)S

Jirci3 CGTCCAGTTGCAGGCAGCTTC (2260-2240)A

Primery reakcji PCR stosowane do klonowania genu E2/NS1 HCV J1 były następujące:

PCR I

J1(E2)14 (jak wyżej)S

Ji(E2)rc30** CAGGGCAGTATCTGCCACTC (2394-2330)A

JiIZ-2* TGAGACGGACGTGCTGCTCCT (1960-1978)S

Ji (E2)ec32** TTTGATGTACCAGGCGGCGCA (2658-2636) A

PCR II-E2384.5*

GGATCCGCTAGCCATACCCGCGTGACGGGGGGGGTGCAA (1469-1495)S

DSCONiJBX*

GGATCCTCTAGATTACTCTTCTGACCTATCCCTGTCCTCCAAGTCACA (2272-2301)A

JiIZ-1* CAACTGGTTCGGCTGTACA (1915-1935)S

Ji(E2)rc31** (2566-2546)A * - sekwencja nt według Takeuchi i wsp. (Nuci. Acids. Res. 18: 4626, 1990);

** - sekwencja nt według Kato i wsp. (Proc. Jpn. Acad. 65B: 219-223, 1989).

Primery sensowne (S) i antysensowne (A) są podane w orientacji 5' do 3' zgodnie z podanymi numerami nukleotydów. Synteza biotynylowanych pepetydów.

Częściowo nakładające się oktapeptydy dla hyperzmiennych regionów trzech szczepów HCV syntetyzuje się na rozszczepialnym łączniku, derywatyzuje się je i N-końce każdego peptydu sprzęga się ze szpilkami polietylenowymi, w zasadzie takimi samymi jak są opisane przez Maeji i wsp. (J. Immunol. Methods 134: 23-33, 1990). Na końcu, do N-końca sprzęga się biotynę stosując 150 μl roztworu dimetyloformamidu zawierającego 40 mM biotyny, 40 mM 1-hydroksybenzotriazblu (HOBt), 40 mM heksafluorofosforanu benzotnazol-1-ilo-oksy-tns-pirydyno-fosfonidwego (PyBOP, firmy Novabiochem) i 60 mM N-metylomorfoliny (NMM). Reakcję prowadzi się przez dobę w temperaturze 20°C.

Po biotynylowaniu, w peptydach odblokowuje się łańcuchy boczne, przemywa się i odszczepia się peptydy od szpilek polietylenowych w 200 μΐ 0.1M buforu fosforanowego (pH = 7,2). Płytki do mikromiareczkowania zawierające roztwory rozszczepionego peptydu przechowuje się w temperaturze -20°C.

Badanie biotynylowanych peptydów w próbie ELISA

171 972

Płytki polistyrenowe (Nunc immuno maxisorb F96) powleka się streptawidyną przez dobową inkubację w temperaturze 4°C z roztworem 5 μ g/ml streptawidyny (Sigma, numer katalogowy S4762) w ilości 0,1 ml/studzienkę, w 0.1 M buforze węglanowym (pH = 9,6). Po usunięciu roztworu streptawidyny, studzienki przemywa się cztery razy 0.1% roztworem T\«^ien'u 20 w PBS. Wiązanie nieswoiste blokuje się przez inkubację każdej studzienki z 0.2 ml 2% roztworu BSA w PBS przez godzinę w temperaturze 20°C. Studzienki powtórnie przemywa się cztery razy roztworem Tween 20/PBS. Płytki suszy się na powietrzu i przechowuje w temperaturze 4°C aż do użycia. Streptawidynę w każdej studzience sprzęga się z rozszczepionymi peptydami przez inkubację z ilością 100 μl rozcieńczalnika 1:100 roztworu rozszczepionego peptydu z 0.1% BSA w PBS, z dodatkiem 0,1% azydku sodowego w czasie godziny, w temperaturze 20°C. Po inkubacji, płytkę przemywa się cztery razy roztworem PBS/Tween 20. Następnie, każdą studzienkę inkubuje się z ilością 100 μΐ odpowiedniego rozcieńczenia surowicy (rozcieńczonej w 2% BSA w PBS z dodatkiem 0.1% azydku sodowego) w czasie godziny w temperaturze 20°C albo przez dobę w temperaturze 4°C, po czym przemywa się cztery razy w roztworze PBS/Tween 20. Wiązanie przeciwciała wykrywa się w reakcji w 0,1 ml koniugatu w czasie godziny w temperaturze 20°C. Koniugat zawiera 0,25 ml/litr (poziom nasycenia) znakowanej peroksydazą chrzanu koziej IgG przeciw-króliczej (H+L) (Kirkegaard and Perry Labs., Gaithersburg, MD) w CASS (0,1% syrowicy owczej, 0,1% Tween'u 20, 0,1% kazeinianu sodowego rozcieńczonego w 0,1 M PBS (pH = 7,2). Studzienki przemywa się 2 razy roztworem PBS/Tween 20 a następnie 2 razy samym PBS. Obecność enzymu wykrywa się w reakcji prowadzonej w czasie 45 minut w temperaturze 20°C z ilością 0,1 ml świeżo sporządzonego roztworu zawierającego 50 mg soli amoniowej kwasu 2,2'-azyno-bis-[3-etylo benzotiazolino-6-sulfonowego (ABTS, Boehringer Mannheim, numer katalogowy 122661) i 0,03 ml 35% (wagowo) roztworu nadtlenku wodoru w 100 ml buforu 0.1 M fosforanu/0,08 M cytrynianu (pH = 4,0). Pomiary zabarwienia wykonywano w czytniku do płytek Titertek Multiscan MC techniką przy podwójnej długości fali: przy 405 nm, wobec odnośnej długości 492 nm.

Generowany komputerowo profil antygeniczności.

Profile antygeniczności dla białka HCV E2/NS1 i hiper-zmiennego regionu białka gp-120 HIV-1 (aa 303-338) wyprowadzono za pomocą programu komputerowego opartego na stopniu zmienności sekwencji, opracowanego po raz pierwszy przez Kabata (Sequences of proteina of immunological interest Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej Stanów Zjednoczonych, Powszechna Służba Zdrowia, Narodowy Instytut Zdrowia (1983) do celów identyfikacji hiper-zmiennych pętli immunoglobulin; ten stopień zmienności mnożono przez średnią indywidualnego prawdopodobieństwa, że cecha wiązania przeciwciała jest utrzymana dla każdej możliwej pary aminokwasów. Prawdopodobieństwa utrzymania wiązania przeciwciała związane ze zmianą każdego aminokwasu były wartościami oznaczonymi eksperymentalnie przez oszacowanie wszystkich możliwych podstawień aminokwasowych na wiązanie przeciwciała dla 103 scharakteryzowanych liniowych epitopów (Geysen i wsp., J. Mol. Rec. 1: 32-41, 1988). Ten algorytm daje wartości ważone dla współczynnika zmienności, przez co uzyskuje się większe znaczenie wiązania przeciwciała, co oznacza, że równoważy się zmiany w aminokwasach konserwatywnych. Dla oznaczenia profilu antygenetyczności dla HCV zastosowano piętnaście następujących sekwencji HCV: HCV-1, Q3.2, HCT 23, EC10, HC-J1, HCVE1, TH, HCT 27, Q1.2, HCT18, HC-J4, HCV J1.2/HCV J1.1, HCV J, HCV Bk. Profil dla domeny V3 HIV-1 uzyskano przez uśrednienie 242 poszczególnych profili z 15 sekwencji wybranych losowo z ilościowo większej bazy danych unikalnych sekwencji HIV-1 (LaRosa i wsp., Science 249: 932-935, 1990 i korekta w Science, 1991, str. 811). Sekwencje aminokwasowe niektórych izolatów w odcinku 384-420 są przedstawione na fig. 3.

171 972

Generowane komputerowo struktury drugorzędowe.

Prawdopodobieństwa drugorzędowej struktury α-helisy, /J-płatu i /J-skrętu dla rejonu N-końcowego (384-420) oznaczano stosując algorytm, który wyznacza prawdopodobieństwa dla każdego z trzech powyższych miejsc w strukturze drugorzędowej dla każdej reszty. Współczynniki użyte w tym algorytmie otrzymano dla wszystkich kombinacji par reszt bazy struktur (Levitt i Greer, J. Mol. Biol., 114: 181-293, 1977). Parametry prognozy uzyskane na podstawie tych współczynników były zgodne z wynikami eksperymentalnymi jeśli algorytm ten zastosowano z powrotem do tej bazy danych do otrzymania prawdopodobieństwa, że dana reszta mogłaby występować w jednym z tych trzech zdefiniowanych miejsc w strukturze drugorzędowej.

Przykład 1. Porównanie zmian w drugorzędowej strukturze sekwencji aminokwasowych w domenie HV E2/NS1 HCV z domeną gp-120 z HIV-1.

Porównano sekwencje aminokwasowe z piętnastu izolatów HCV i HIV-1 pod względem ilości pozycji, w których zaobserwowano heterogeniczności w sekwencjach aminokwasowych z domeny HV E2 z HCV i domeny V3 z gp-120 HIV-1 (odpowiednio figury 4A i B). Heterogeniczności występują w 25 na 30 pozycji aminokwasowych w rejonie E2 HV i w 23 na 35 pozycji aminokwasowych w domenie gp-120 V3 z HIV-1. Kreski na osi x na fig. 4A i 4B oznaczają pozycje aminokwasowe, gdzie występują zmienne reszty aminokwasowe a niezmienne aminokwasy oznaczone są jednoliterowym kodem stosowanym dla aminokwasów. Profile antygeniczności przedstawione na fig. 4 wskazują na to, iż podobnie do pętli V3 w białku gp-120 HIV-1 (fig. 4B), również w HCV E2 (aminokwasy 384-414 na fig. 4A) zidentyfikowano blok reszt aminokwasowych, którego zmienność ma przewidywany niepożądany wpływ na wiązanie z przeciwciałem. Dane przedstawione na fig. 4 wykazują, że domena HCV E2 przypomina domenę V3 gp-120 z HIV-1, o której wiadomo, że koduje wirusowe epitopy neutralizujące o podobnym znaczeniu pod względem stopnia i przewidywanego znaczenia zmienności aminokwasów i sugeruje, że domena E2 HV może mieć podobną funkcję jak domena V3 gp-120.

Przypuszcza się, że liniowe epitopy są związane z mniej złożonymi strukturalnie rejonami białek, zwłaszcza z końcami białek albo z rozciągniętymi powierzchniami pętli. W celu określenia prawdopodobieństwa, że konkretna reszta jest związana z określoną strukturą drugorzędową, dla 15 aminokwasowych sekwencji E2 HV pomiędzy resztami 384 do 420 przeprowadzono analizę komputerową. Na fig. 4 jest widoczne, że region pomiędzy N-końcową resztą 384 z E2 a łatwym do przewidzenia, wysoce konserwatywnym beta-skrętem (reszty 415-418) ma stosunkowo słabo rozbudowaną strukturę drugorzędową, co wynika z poniżej 50 procentowego prawdopodobieństwa występowania alfa-helisy, beta-płatu i beta-skrętu. Brak wyraźnie przewidywalnej struktury w domenie E2 HV jest zgodny z cechą tolerancji dla dużej zmienności sekwencji wykrywanej w izolatach i w przeciwieństwie do regionów o wysokim stopniu złożoności struktury występującym w białkach sfałdowanych trzeciorzędowo. Domena E2 HV z HCV wydaje się być nawet mniej złożona niż domena V3, będąca główną neutralizującą domeną gp-120 HIV-1, o której wiadomo, że zawiera motyw: beta nić typu II- beta skręt, beta nić- alfa helisę i może mieć większy ograniczający wpływ na zmienność aminokwasów niż domena E2 HV z HCV. Reasumując, powyższy dowód wykazuje, że domena E2 HV posiada cechy charakterystyczne dla domen białkowych posiadających miejsca liniowych neutralizujących epitopów.

Przykład 2. Mapowanie epitopów w domenie HV E2/NS1 wirusa HCV

Częściowo nakładające się biotynylowane peptydy 8-merowe odpowiadające i rozciągające się poza domenę HV E2/NS1 (aminokwasy 384 do 416) z HCT 18 (A,D), Th (B,E) i HCV J1 (C,F) wiąże się z powierzchnią płytek powleczonych streptawidyną i poddaje reakcji z osoczem albo od osobnika HCT 18 (A-C) albo od osobnika Th (DF). Wyniki są przedstawione na fig. 6: dla izolatów HCV z HCT 18 na fig. 6A i 6D; dla Th na fig. 6B i 6E; dla HCV J1 na fig. 6C i 6F. Osocze od HCT 18 rozcieńcza

171 972 się w stosunku 1:200 a osocze od Th rozcieńcza się w stosunku 1:500. HVE-1, -2, -3, -4 i -5 reprezentują epitopy specyficzne dla izolatu.

Jak to jest uwidocznione na fig. 6, osocze HCT 18 identyfikuje liniowy epitop (⁴⁰⁷PKQNV⁴¹ ) w testach z peptydami pochodzącymi z sekwencji HCT18 (HVE-I na fig. 6A) ale nie reaguje z peptydami korespondującymi z domeną HV dwu różnych szczepów Th i HCV J1 (fig. 6B i 6C). W przeciwieństwie do tego, osocze Th identyfikuje liniowy epitop HVE-IV w domenie HV od Th (⁴⁰⁹QLIQLI⁴⁰⁵, fig. 6E) i również epitopy w szczepie HCT 18 (³IVRFFAP4°5), fig. 6D) i w HCV J1. Th, biorca leków IV, może być narażony na wiele szczepów HCV.

Osocze zarówno od Th jak i HCT 18 reaguje z epitopem (aminokwasy 413-419) wspólnym dla wszystkich trzech izolatów (dane nie są przytoczone) w próbach ELISA, gdzie stosowano syntetyzowane na stałym nośniku, częściowo nakładające się peptydy 8-merowe z każdego izolatu.

W celu oceny swoistości wiązania przeciwciał, eluuje się przeciwciała związane z biotynylowanymi peptydami zawierającymi aminokwasy 403-407 i stosuje się je do blokowania reaktywności osocza HCT 18 ze szpilkami (peptydami osadzonymi na stałym nośniku poprzez szpilki polietylenowe) zawierającymi częściowo się nakładające 8-mery dla domeny HV HCT 18. Dane te wskazują że 1) domena HV HCT 18 jest immunogenna, 2) istnieje wiele epitopów, które plasują się w tym rejonie i 3) podzbiór epitopów (HVE-1, -2, -3, -4 lub -5 na fig. 6) w domenie HV jest swoisty dla izolatu.

Przykład 3. Wykazanie, że różne domeny HV z E2/NS1 mogą być zw.iązane z rzutami zapalenia wątroby.

W celu zbadania możliwości znalezienia wariantów HCV związanych z okresowymi rzutami zapalenia wątroby często występującymi u pacjentów z przewlekłymi infekcjami HCV, wykonano częściowe sekwencjonowanie genu E2/NS1 od pacjenta Q z przewlekłym zapaleniem wątroby podczas dwu ataków żółtaczki, które wystąpiły w odstępie około dwóch lat (odpowiednio Q1 i Q3). Drugi atak żółtaczki wystąpił po upływie 1,5 roku życia od zakończenia leczenia interferonem. Różnice w wyprowadzonej sekwencji aminokwasowej w rejonie HV E2/NS1 pacjentów Q1 i Q3 były uderzające tylko w aminokwasach 391-408, przy czym 7 na 8 zmian pojawiło się między aminokwasami 398 a 407 (fig. 7). Na fig. 7 przedstawione są wyprowadzone sekwencje aminokwasowe, dwu rejonów polipeptydu E2/NS1; są to aminokwasy 384-414 i 547-647 dla izolatów Q1 i Q3. Aminokwas (E), powyżej sekwencji Q1 znaleziono w jednym z czterech klonów Q1. Aminokwasy wzięte w ramkę reprezentują lokalizację 12-merowego peptydu HVE od pacjenta Q1 lub Q3. Różnice w sekwencji aminokwasowej pomiędzy Q1 a Q3 są oznaczone tłustym drukiem.

Zaobserowano tylko jedną heterogeniczność pomiędzy aminokwasami 547 i 647 polipeptydów E2/NS1 od pacjentów Q1 i Q3 (fig. 7).

Dla oznaczenia wpływu podstawień aminokwasowych zaobserwowanych w domenach zmiennych E2 pacjentów Q1 i Q3 na wiązanie przeciwciał, /.syntetyzowano swoisty dla Q1 i Q2 peptyd 12-merowy od aminokwasu 396 do 407 (HVE Q1 albo Q3 na fig. 7B) i przeprowadzono oddzielne reakcje osocza Q1 i Q2 z każdym z tych peptydów w próbie ELISA. Na tabeli 4 jest widoczne, że przeciwciała obecne zarówno w osoczu Q1 jak i Q3 reagują z peptydem Q1 ale nie z peptydem Q3. Analiza statystyczna (test Studenta) wykazuje, że wiązanie osocza Q1/Q3 do peptydu Q1 było znacząco powyżej poziomu wiązania tego osocza z panelem 12 losowo wybranych peptydów kontrolnych (P< 0.001), podczas gdy wiązanie osocza Q1 ani Q3 z peptydem Q3 nie było statystycznie znamienne. Dane te wykazują, że jakkolwiek u pacjenta Q rozwinęły się przeciwciała przeciw domenie HV HCV Q1, które były ciągle wykrywalne po dwu latach od punktu czasowego Q3, to nie rozwinęła się wykrywalna odpowiedź humoralna przeciw wariantowi Q3 domeny zmiennej E2, który dominował podczas drugiego ataku zapalenia wątroby.

171 972

Tabela 4

Wyniki prby ELISA z peptydami 12-merowymi

Osocze	TARFAGFFQSGA	TAGFVRLFETGP
	sekwencja	Q1	sekwencja	Q3
^Q1	średnia	sd*	średnia	sd
1,158	0,134	0,691	0,123
Q2	1,022	0,123	0,693	0,036

(sd = odchylenie standardowe)

Przykład 4. Wykrywanie współistniejących genów E2/NS1 z różnymi domenami HV E2/NS1 u pacjentów zakażonych przez HCV.

Figura 8A przedstawia sekwencje aminokwasowe wyprowadzone z dwu izolatów HCV J1 (Jl.l i J1.2), klonowanych z jednej próbki osocza japońskiego ochotnika dawcy krwi HCV J1 (Kubo i wsp., Nuci. Acids Res., 17: 10367-10372,1989). Spośród całkowitej liczby 23 różnic w aminokwasach między HCV J1.1 a HCV J1.2, 9 różnic (uwidocznionych grubym pismem) było skupionych w 30 - aminokwasowej hiperzmiennej domenie E2/NS1 HV. Pięć z tych 9 podstawień aminokwasowych w domenie E2/NS1 HV to zmiany w aminokwasach nie-konserwatywnych. Ponieważ HCV J1 jest jednym genomem HCV z grupy II, który był klonowany w naszym laboratorium, jest nieprawdopodobne, aby te różnice pochodziły z zanieczyszczeń krzyżowych osocza HCV J1. Sekwencja HCV J1.2 jest sekwencją wy^t^tępującą w mniejszości we krwi osobnika HCV J1 gdyż z 7 sklonowanych sekwencji, które pochodziły z dwu niezależnych reakcji PCR zidentyfikowano jedynie dwie sekwencje wariantu E2/NS1 HV.

Jest godne uwagi, że porównanie izolatów HCT 27 i HCV El (fig. 8B), które sekwencjonowano w różnych laboratoriach i które prawdopodobnie pochodzą od niespokrewnionych osobników wykazało, że ilość różnic aminokwasowych w domenie E2/NS1 HV tych izolatów była mniejsza niż ilość różnic obserwowanych między izolatami od tego samego osobnika.

Opisane powyżej wyniki prowadzą do wniosku, że genom HCV ulega szybkim zmianom u poszczególnych osobników i w populacji.

CO uo co

CO <

Ci <

(SI

Ci

Q

O •N ca <

N CU co

CM

LO co co z

s< < 03 03 < <

W

J ca ca e» o

a.

Cl d

Lk

CM

CO

LŁI

LU

CM r-.

CL

O

CO

CO.

CX

o.

ca > ul 2 < H n ca o ε*

N O cn ci h □ cu ca cu o > ca N H CC· J CL O

O

O e-t o

Ci

UO	Ό ca
	<· ca aj < t-ł n H o·
	<λ	W
	o	U
Cm	X	ca
g	a	2
u	ca	O
H	Cu
	2

D Q >1 cn Ou < ca o ca a ca o 2 ca · o o <ca .03 pO << t-ł !-4 s a • III α·

I l··

I

E-<

t <S σι rH

ι i i «

Η Η Η K

I I ł I co en en en

III» ' * · X

III»

W W W M

I I I I

I I I I » ι i

III»

2 2 2

I I I I

2 > J

I I t I 1(11 III»

I I I I I I I I I I I I I I I co co co cn

I ł I I

O 1 1 .
o		1 1
>		1 I
	1	1 1
Ł,		1 1
>		H H
en		1 1
o		1 1
o		1 1
j		1 1
Q		1 1
0 ź	1	t 1 1 1 1 1
3 07		ł I 1 1 i 1
0		1 1
J		1 1
E-		1 i
		1 1
W		1 1
0		I 1
>		1 1
J		1 1
J		1 1
Q		1 1
H		1 1
X		1 1
Oi		1 1
Oi		1 1
j		1 1 I 1
e«	I « Η E» 1
&
j		1 1
*		oi ♦

ι i t i co en en co • i h ·

I I I I

* *

* ł

* *

I t t I

2 2 2

I I I <

I I t I I I I I b i h b < < < <

I I I I

Η Η ι H ε« e* e-< eI I I I h E-< E- E

I I I ł > W > H < 05 < >

ΖΖΖΖ

I I I ł < < < <

I I I I

4 4 4

I I I I

CO Ob co CO

I I I I

Q co X '

I I I I

> >

CO CO > >

co co > >

co en co co 4 > > >

□ Q

I I > > I ł

W W I >

i Q i

> 4

I >

r4

Figura. 2 -

o	O
n	σ\
CS	CS

r-l CO n f· rl	rH * b3 bj	H aa n r- r-i	Η	γΗ 00	en C	r4
ι H CS CS 1-3	0 ¹	• H CS CS 1-3	’Ό '	• γ4	es es	>3
δ δ js δ 6 Ó	ó δ δ bd	δ δ χ δ δ ύ	ύ δ δ bd	δδχ	δδ	ι 0
X X &1 X X x	x x x ta	ΧΧΗΧΧΧ	X X X ο	X X Ε-	X X	X

·* hj pj *3 ¹ ó δ δ bd

IZZffl

HCV-1 350

HCT18

Th

HCT23

HCT27

HC-J1

HC-J4

HCV-J

HCV J1 BK

GA11WGVLAGIAYPSMVGNWAKVLWLLLFAGVDA * * * * *

.........L--Y........I-A..........

.........L- -Y........I-M ....

.........L--Y........I-M..........

.........L--Y--A.....I-M..........

Figura 2-2

171 972 >

ο

Ό 4J ίβ ι—I Ο Ν >·

Ι I I I I

I I I I ι a a a a

I I 1 I

Η Η Η Μ Η Η Η

I I I I I

Οι 1 Oi 1

I I

I I «

I I I

0

I f I

I I I w

<Ν

Μ

C •ΓΛ tu

Cl

Ο σ· α) c »—ι ιΰ Ν Ο Ν 01 3 Λ >1 Ν Cl CU <α

Ο

X

Ο

C •Η ε

ιύ r-ι

Ο

C <ϋ

X

0)

03 03

03 2 Oi

Q ca Q ι

Οι Οι CU 03 μ 2 cxa

Η Q ι ι ϊ I S I I e* ε« e* ε*

1-1

U} I I I I ł

2 2 2 2 2

Η Η Η Η Η ι Οί « « %

I I I I I ι 03 03 03 03 > Οι ι Οι ι > ι ι ι ι ι ι σ ι w ξι 03 03 Οί I

Ł Ł ' Ł Λ • » · 2

I I I I I < e« · j3 jq j ' Ε· 03 Γ»

I I < < ι ' ι ι ι ι

W a a Q Q Q Q W C-Ι Η H o! I I 03 E-I ι i i

Q M ω 03 u <

* —

2 2 i:

Oi 1 < '

O >

2 2 Oi bi a Q 2 2 · > I I I a a a

I I I

Ε3ά3:3 • · > οσ o< ca > 4

I I f I I tlili cn cn ι ι i i £·< ι i »

I I I I I • <222

I I I I I ι Η Η Η Η

cg £ * cn

I I I I o? < e-> ε-.

I I

Η i

Oi oi

I I

1

I I

I 1 I ł ooow cn cn cn cn

I I I I

I t I I

I t I I t I I £<4

I I I I • ' 00 οέ οέ 04

I I I I < < < ' cn

Figura

ai			*
	O	0	*	0
3	Γ-	cn	*	σ\
N	tn	s	*	s·

Ο

C

Ό

Ci

Ο

Οrl b- rl i—I (-3 • CS M >3 ' «-Ι sssssbssadoJ

S> H »3 ' 2

-------„ ύ δ i a

S3S3 3MSKCjdi

C* 2 cs a > 2 1 CS W

S< 1-3 bO bO

5Ł(j>Sx:óóuxa

ΚΚΧΧΚ HKKKbOffl

550 FGCTWMNSTGFTKVCGAPPCVIGGAGNNTLHCPTDCFRKHPDATYSRCGSGPWITPRCLV

W Cd ω σ>< j ot w co « X « f H

I >

I I

Cd Cd Cd

E-> L· Erl Γ· r( H S·

I CS Cd O h ' H

KKKKKE^KKShJffl t CO CO CO CO ►4 i <

►4 i

J J <

Λ oi >

SC 2 co co

CU

CS

I o

H

UJ

H c* h i cs Cd cC

ISSE

O σι J5 > > > I I >

I

Bu Ou Cu ł I I > > >

I-J Fł · H ύ ύ δ i «

SKShffl

Figura

171 972

670 TQWQVLPCSFTTLPALSTGLIHIHQNIVDVQYLYGVGSSIASWAIKWEYVVLLFLLLADA

E- P· r-ł r- H • d W

P·

o m

Ρ»

O <Ti

X X .....

Η Γ» H r-ł <3· ·“□ ·“□ > d W Ó Ó ' ' H

ΧΧΧΧΧΕ-ΧΧΧΧ^α

H C- rł <# b Ó > d >-3 >-J i I r-f χ ύ ύ δ δ χ « X = ćhXSSXÓO

WSPÓŁCZYNNIK ANTYGENOWOSCI WSPÓŁCZYNNIK ANTYGENOWOSCI

FIG. 4A

390 400 410 420

NUMER AMINOKWASU

FIG. 4B

20 30

NUMER AMINOKWASU

PROCENT PRAWDOPODOBIEŃSTWA WYSTĘPOWANIA PODANEJ STRUKTURY

FIG. 5

NUMERY AMINOKWASÓW £Z

H

Μ <

co ω Ο W CS >4 CU W <

N υ

><

h

CS o

O

CM cn u · en *o

E-i

O o

171 972

<

cn o

o τΗ

O

I

I-I X X o > r;-2 o X ca 0 OL. < X X o (A §->

I-I e

Σ

X <

o Z O o <Z3 E ω £

T- &M j— ω o

I

H X X XX X οω

X X X > > > HI HI HI HI

O O O O

ΣΣΣΣΣΧΣ

EEEEEEEE χχχχχχχχ

0000O00O zzzzzzzz 0000000 ooooou en co ω cn en E E E E > > >

E Eω

X 54 X X X xx x

ΝΠΗΔΝ0Χ z oo Z X z CL CL O-ι CL £2.0 0 0 0 0 0 0

X X X X X X < < < < <

X X X X Σ Cu fc X X >

<

<£>

O

E

<

Ο ο» ο w

Η

ε-· 2		Ε« 2 Ζ
Η 2	2	Η Μ Η 2 2 2
Ο	Ο Ο	ασσ
Μ	ΗΗΗ	Η Η Η
2	2 2 2 2	22 2
Ο	00000*1	ο’ό·σ

O4O4O4O4O4O4O4O4 <<<<<<<<

οοοοοοου 00000*0 0*0 222222222

LL1 >

X ο

φ.

η

Ο <

<

ω ο

ο ε>

Ε<

ε<

w cncncncncnwcncncn <<<<<<<<<

ΗΗΗΗΚΜΗΗΗ οοοοοοοοϋ <<<<<<<<<

ουουοοοου

222222222 <<<<<<<<<

<<<<<<<<< cncncncncnc/iwcn ο ο ο ο ο ο ο οοοϋϋϋ ε-< ε- ε< ε· > > > > ε* ε* ε* ε-· ε* ω (Ο

Ó

Ε m

χ:

Η ω

IS3 οι

Ο ο

«Λ rtj j—'

C

Ν

Ο

Χο

4J 03 '

Oj Μ Ο J w

Ό u, χη φ · 0-6° 4J J0 Μ Ό Φ* ΜΟ Ο Ojo

Ο

Ν\ nnrrrrw?

rtj ·>~

C Ν _ £«<=> ο ο.2”

Τ' 0 1-3 w Ό χη Φο Ο ·η -Ρ X 01 XD_ αζ ι-ιΗ Ο OUO <30

Ζ >

ο ο Η Χ-Χ α σι <

ϋ

X

Ο 01 Ο— ρ_, ε

ε >

X ο

ο» g-o ϋ

ε >

ν—

-5 ε > X Ο X σ

>> ο ο ο ο ε ε >> X X ε ε χ

X ο ο σσ >> ο ο ο ο ε ε >> χ £-t 9-1 > > > XXX ϋ ϋ Ο ασα >>> οου ο ο ε ε ε j j j ε- e- ε-^ eX 01 01 01 ε ε ε ε > > > > X X X X ϋϋϋ οα >

ζ >> t-Ι J J σσσσ

ΗΗΗΗΗ X X « οοοοσ

X X 01 X X ril rtj ο ο ο X X X ο

(Ο ό

Ε

E2/NS1AA384 414 547 647 750

Jl.l 384 HTR\rTGGVQGHVTSTLTSLFRPGASQKIQLVNTNGSWHINRTALNCNDSLQTGFLAALFY tt

O

Cu ¹ <

I

X Oi 2

Oi

oi

ID

UJ oi u

CU

H

1* <33 <tf

Ul σι id

Cu £

s·	s	s·	s·
s·	o	UJ	CS
s·	in	tn	co

CS H CS r-l CS • · · · · rd Η Η Η H b hj hj hj e s

XX XX XX

I-I CS * ·	Η CS • ·
rd rd hł b	rd rd
δ δ X X	δ δ X X

Ε2 HV

>4	ł	o	1	> ·	2j	I	Ol	ł
Ca	1		1	OT ·	5	(	aj	1
J	1	2ζ	E-*	e-« '	E	1		1
0	1	a	1	ot >	(j	1	OT	1
«3	ł	<	t	0	Oi	1	OT	1
>	1	a<	1	OT ·	Cm	1	OT	(
2	1	>	i	OT ·	SJ	t	O	1
0	1	H	<	2 i	5	t	Ol	1	2
H	1	0	t	i >	a	»	aj	1	a *
Q	1	U	«		Ce!	1	>	ł	a <
□	1	0<	ł	f-4 1	Cm	(	o	t	W '
OT	1	ca	<	O ¹	Oi	ł	2	1	u
0	w	04	ł	o ·	Cm	1		1	H >
2	1	04	1	OT >	2	0		1	OT ·
O	1	Cm	ł	ł 1	>	1	μ	1	3 >
2	1	X	1	2 '	a	I	OT	1	2 Q
pj	1	2	1	0 '	0	1	aj	I
<*	1	o	ł	a ·	oi	ł	aj	1	3 >
F;	1	Cm	1	Oi <	Oi	1	aj	1	a <
OT	ł	04	1	0i <		ł	a	04	ai >
2	1	Ot	1	Ot	H	1	a	co	OT i
H	1	X	1		2	1	aj	1	a >
2	1	OT	1	2 i	Oi	1	OT	1	ai >
2	1	0i	1	5 <		1	OT	1	H >

P w e« o ot, s

OT •Ί· m

<a

H 0«

1 1	OT < OT · ł	Ω A	1 t
Ω	£ ^:	►4 p	1 2
1	«< '	u	1
u	a u	OT	1
1	Oi ·	W	1
1	X ·	0	1
1	OT i		1
1	OT <	E	1
1	OT i		1
t	U ·	2	1
1	Q ·	U	1
1	r '	S	1
ł	u ·	w	o
( 1	S¹:	aj	1 1
1 1	£ *	e	OT
1	o :	o	1
1 1	> < 0	0	1 1
1 «	0 ' H i	1	1 1
1	δ >	H	1 >
I	Οι I	O	OT
1	Οι 1	>	OT
1	a! ·	H	a
l	0 ·	£m	1
1	u '	5*	ł
		S*
	OT	CS
	OT	OT

H £

OT >

K

OT

O >

O >4 a

>4 o

>

) as

Figura.

Ρ» r-l CS M	t* H CS OT	> H CS OT	C* H CS M	r* h CS OT
δ X X	δδ X X	δ δ X X	δδ X X	& δ X X

> H

Met 1

Ser Thr

Aan

Pro Lya 5

Pro

Gin Lya Lya Aan Lya Arg Aan Thr Aan

10

15

Arg

Pro

Gin

Aep

Val

Lya

Phe

Pro

Gly

Gin

Ile

Val

Gly

20

25

30

Gly

Val

Tyr

Leu

Pro

Arg

Gly

Pro

Arg

Leu

Gly

Val

Arg

Ala

35

40

45

Thr

Arg

Lya

Thr

Ser

Glu

Arg

Ser

Gin

Pro

Arg

Oly

Arg

Gin

Pro

50

55

60

Ile

Pro

Lye

Ala

Arg

Pro

Glu

Gly

Arg

Thr

Trp

Ala

Gin

Pro

Gly

65

70

75

60

Tyr

Pro

Trp

Pro

Leu

Tyr

Gly

Aan

Glu

Gly

Cya

Gly

Trp

Ala

Oly

Trp

85

90

95

Leu

Ser

Pro

Arg

Gly

Ser

Arg

Pro

Ser

Trp

Gly

Pro

Thr

Aap

Pro

100

105

110

Arg

Ser

Arg

Aen

Leu

Gly

Lya

Val

Ile

Aep

Thr

Leu

Thr

Cya

115

120

125

Gly

Phe

Ala

Aep

Leu

Met

Gly

Tyr

Ile

Pro

Leu

Val

Gly

Ala

Pro

Leu

130

135

140

Gly

Ala

Arg

Ala

Leu

Ala

Hla

Oly

Val

Arg

Val

Leu

Glu

Aap

145

150

155

160

Gly

Val

Asn

Tyr

Ala

Thr

Gly

Aan

Leu

Pro

Gly

Cya

Ser

Phe

Ser

Ile

165

170

175

FIGURA 9-1

Phe

Leu

Ala 160

Leu

Ser

Cye Leu Thr Val 105

Pro Ala Ser Ala Tyr 190

Gin

Val

Arg

Aen

Ser

Thr

Gly

Leu

Tyr

Hle

Val

Thr

Aen

Aep

Cye

Pro

195

200

205

Aen

Ser

Ile

Val

Tyr

Glu

Ala

Aep

Ala

Ile

Leu

Hle

Thr

Pro

210

215

220

Gly

Cye

Val

Pro

Cye

Val

Arg

Glu

Gly

Aen

Ala

Ser

Arg

Cye

Trp

Val

225

230

235

240

Ala

Met

Thr

Pro

Thr

Val

Ala

Thr

Arg

Aep

Gly

Lye

Leu

Pro

Ala

Thr

245

250

255

Gin

Leu

Arg

Hle

Ile

Aep

Leu

Val

Gly

Ser

Ala

Thr

Leu

Cye

260

265

270

Ser

Ala

Leu

Tyr

Val

Gly

Aep

Leu

Cye

Gly

Ser

Val

Phe

Leu

Val

Gly

275

200

205

Gin

Leu

Phe

Thr

Phe

Ser

Pro

Arg

Hle

Trp

Thr

Gin

Gly

Cye

290

295

300

Aen

Cye

Ser

Ile

Tyr

Pro

Gly

Hle

Ile

Thr

Gly

Hle

Arg

Met

Ala

Trp

305

310

315

320

Aep

Met

Aen

Trp

Ser

Pro

Thr

Ala

Leu

Val

Met

Ala

Gin

325

330

335

Leu

Arg

Ile

Pro

Gin

Ala

Ile

Leu

Aep

Met

Ile

Ala

Gly

Ala

Hle

340

345

350

FIGURA 9-2

171 972

Trp Gly Val

Leu

Ala

Gly

Ile

Ala Tyr 360

Phe

Ser

Met

Val 365

Gly

Aen

Trp

355

Ala

Lye

Val

Leu

Val

Leu

Phe

Ala

Gly

Val

Aep

Ala

Glu

370

375

380

Thr

His

Val

Thr

Gly

Ser

Ala

Gly

Hle

Thr

Val

Ser

Gly

Phe

Val

385

390

395

400

Ser

Leu

Ala

Pro

Gly

Ala

Lye

Gin

Aen

Val

Gin

Leu

Ile

Aen

Thr

405

410

415

Aen

Gly

Ser

Trp

His

Leu

Aen

Ser

Thr

Ala

Leu

Aen

Cye

Aen

Aep

Ser

420

425

430

Leu

Aen

Thr

Gly

Trp

Leu

Ala

Gly

Leu

Phe

Tyr

Hle

Lye

Phe

Aen

435

440

445

Ser

Gly

Cye

Pro

Glu

Arg

Leu

Ala

Ser

Cye

Arg

Pro

Leu

Thr

Aep

450

455

460

Phe

Aep

Gin

Gly

Trp

Gly

Pro

Ile

Ser

Tyr

Ala

Aen

Gly

Ser

Gly

Pro

465

470

475

480

Aep

Gin

Arg

Pro

Tyr

Cye

Trp

Hle

Tyr

Pro

Lye

Pro

Cye

Gly

Ile

485

490

495

Val

Pro

Ala

Lya

Ser

Val

Cye

Gly

Pro

Val

Tyr

Cye

Phe

Thr

Pro

Ser

500

505

510

Pro

Val

Gly

Thr

Aep

Arg

Ser

Gly

Ala

Pro

Thr

Tyr

Ser

515

520

525

FIGURA 9-3

Trp Gly Glu

Aan

Aep

Thr Aap Val 535

Phe Val

Leu

Aan 540

Aan

Thr

Arg

Pro

530

Pro

Leu

Gly

Aan

Trp

Phe

Gly

Cya

Thr

Trp

Met

Aan

Ser

Thr

Gly

Phe

545

550

555

560

Thr

Lye

Val

Cys

Gly

Ala

Pro

Cya

Val

Ile

Gly

Ala

Gly

Aan

565

570

575

Aon

Thr

Leu

His

Cye

Pro

Thr

Aap

Cya

Phe

Arg

Lye

Hla

Pro

Aep

Ala

580

585

590

Thr

Tyr

Ser

Arg

Cya

Gly

Ser

Gly

Pro

Trp

Ile

Thr

Pro

Arg

Cya

Leu

595

600

605

Val

Aep

Tyr

Pro

Tyr

Arg

Leu

Trp

Hla

Tyr

Pro

Cya

Thr

Ile

Aan

Tyr

610

615

620

Thr

Ile

Phe

Lye

Ile

Arg

Met

Tyr

Val

Gly

Val

Glu

Hle

Arg

Leu

625

630

635

640

Glu

Ala

Cye

Aen

Trp

Thr

Arg

Gly

Glu

Arg

Cya

Aap

Leu

Glu

Aap

645

650

655

Arg

Aep

Arg

Ser

Glu

Leu

Ser

Pro

Leu

Thr

Gin

Trp

660

665

670

Gin

Val

Leu

Pro

Cya

Ser

Phe

Thr

Leu

Pro

Ala

Leu

Ser

Thr

Gly

675

680

685

Leu

Ile

Hla

Leu

Hla

Gin

Aen

Ile

Val

Aap

Val

Gin

Tyr

Leu

Tyr

Gly

690

695

700

FIGURA 9-4

171 972

Val 705

Gly

Ser

Ile

Ala 710

Ser

Trp

Ala

Ile

Lye 715

Trp

Glu

Tyr

Val

Val 720

Leu

Phe

Leu

Ala

Aep

Ala

Arg

Val

Cye

Ser

Cye

Leu

Trp

725

730

735

Met

Leu

Ile

Ser

Gin

Ala

Glu

Ala

Leu

Glu

Aen

Leu

Val

740

745

750

Ile

Leu

Aen

Ala

Ser

Leu

Ala

Gly

Thr

Hle

Gly

Leu

Val

Ser

Phe

755

760

765

Leu

Val

Phe

Cye

Phe

Ala

Trp

Tyr

Leu

Lye

Gly

Lye

Trp

Val

Pro

770

775

780

Gly

Ala

Val

Tyr

Thr

Phe

Tyr

Gly

Met

Trp

Pro

Leu

785

790

795

800

Leu

Ala

Leu

Pro

Gin

Arg

Ala

Tyr

Ala

Leu

Aep

Thr

Glu

Val

Ala

805

810

815

Ser

Cye

Gly

Val

Leu

Val

Gly

Leu

Met

Ala

Leu

Thr

Leu

Ser

820

825

830

Pro

Tyr

Lye

Arg

Tyr

Ile

Ser

Trp

Cye

Leu

Trp

Leu

Gin

Tyr

835

840

845

Phe

Leu

Thr

Arg

Val

Glu

Ala

Gin

Leu

Hle

Val

Trp

Ile

Pro

Leu

850

855

860

Aen

Val

Arg

Gly

Arg

Aep

Ala

Val

Ile

Leu

Met

Cye

Ala

Val

865

870

875

880

FIGURA 9-5

His	Pro Thr	Leu	Val 885	Phe	Aap	Ile	Thr Lya 890	Leu	Leu Leu Ala Val 895	Phe
Gly	Pro Leu	Trp 900	Ile	Leu	Gin	Ala	Ser Leu 905	Leu	Lya Val Pro Tyr 910	Phe
Val	Arg Val 915	Gin	Gly	Leu	Leu	Arg 920	Phe Cya	Ala	Leu Ala Arg Lya 925	Met
Ile	Gly Gly 930	His	Tyr	Val	Gin 935	Met	Val Ile	Ile	Lya Leu Gly Ala 940	Leu
Thr 945	Gly Thr	Tyr	Val	Tyr 950	Aan	Hla	Leu Thr	Pro 955	Leu Arg Aap Trp	Ala 960
Hla	Asn Gly	Leu	Arg 965	Aap	Leu	Ala	Val Ala 970	Val	Glu Pro Val Val 975	Phe
Ser	Gin Met	Glu 980	Thr	Lya	Leu	Ile	Thr Trp 985	Gly	Ala Aap Thr Ala 990	Ala
Cye	Gly Aap 995	Ile	Ile	Aan	Gly	Leu Pro Val 1000	Ser	Ala Arg Arg Gly 1005	Arg
Glu	Ile Leu 1010	Leu	Gly	Pro	Ala Aap 1015	Gly Met	Val	Ser Lya Gly Trp 1020	Arg
Leu Leu Ala 1025	Pro	Ile	Thr Ala 1030	Tyr	Ala Gin	Gin Thr Arg Gly Leu 1035	Leu 1040
Gly	Cya Ile	Ile	Thr Ser 1045	Leu	Thr	Gly Arg Aap 1050	Lya Aan Gin Val Olu 1055

FIGURA 9-6

171 972

Gly	Glu	Val	Gin Ile 1060	Val	Ser	Thr	Ala Ala Gin Thr 1065	Phe Leu Ala 1070	Thr
Cye	Ile	Aen Gly Val 1075	Cya	Trp	Thr Val Tyr Hla Oly 1080	Ala Oly Thr 1085	Arg
Thr	Ile Ala 1090	Ser Pro	Lya	Gly Pro 1095	Val Ile Gin Met Tyr Thr Aan 1100	Val
Aap Gin 1105	Aap	Leu Val	Gly Trp 1110	Pro	Ala Pro Gin Gly 1115	Ser Arg Ser	Leu 1120
Thr	Pro	Cya	Thr Cya Gly 1125	Ser	Ser	Aap Leu Tyr Leu 1130	Val Thr Arg Hla 1135
Ala	Aap	Val	Ile Pro 1140	Val	Arg	Arg	Arg Gly Aap Ser 1145	Arg Gly Ser 1150	Leu
Leu	Ser	Pro Arg Pro 1155	Ile	Ser	Tyr Leu Lya Gly Ser 1160	Ser Gly Gly 1165	Pro
Leu	Leu Cya 1170	Pro Ala	Gly	Hla Ala 1175	Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala 1180	Val
Cya 1185	Thr 1	Arg	Gly Val	Ala Lya 1190	Ala	Val Aap Phe Ile 1195	Pro Val Glu	Aan 1200
Leu	Glu	Thr	Thr Met 1205	Arg »	Ser	Pro	Val Phe Thr Aap 1210	Aan Ser Ser 1215	Pro
Pro	Val	Val	Pro Gin 1220	Ser	Phe	Gin	Val Ala Hla Leu 1225	Hla Ala Pro 1230	Thr

FIGURA 9-7

Gly Ser Gly Lye	Ser	Thr	Lye	Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gin Gly
	1235	1240	1245
Tyr	Lye Val Leu 1250	Val	Leu	Aen Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe 1255 1260
Gly Ala Tyr Met 1265	Ser	Lye Ala 1270	Hie Gly Ile Aep Pro 1275	Aen Ile Arg Thr 1280
Gly	Val Arg Thr	Ile Thr 1285	Thr	Gly Ser Pro Ile Thr 1290	Tyr Ser Thr Tyr 1295
Gly	Lye Phe Leu Ala 1300	Aap	Gly	Gly Cye Ser Gly Gly 1305	Ala Tyr Aap Ile 1310
Ile	Ile Cye Aep 1315	Glu	Cye	His	Ser Thr Aep Ala Thr 1320	Ser Ile Leu Gly 1325
Ile	Gly Thr Val 1330	Leu	Aep	Gin Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val 1335 1340
Val 1345	Leu Ala Thr	Ala	Thr Pro 1350	Pro Gly Ser Val Thr 1355	Val Pro Hle Pro 1360
Aen	Ile Glu Glu	Val Ala 1365	Leu	Ser Thr Thr Gly Glu 1370	Ile Pro Phe Tyr 1375
Gly	Lye Ala Ile Pro 1380	Leu	Glu	Val Ile Lye Gly Gly 1385	Arg Hle Leu Ile 1390
Phe	Cye Hia Ser 1395	Lya	Lye	Lye	Cye Aep Glu Leu Ala 1400	Ala Lye Leu Val 1405

FIGURA 9-8

Ala Leu Gly	Ile	Aen Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Aep Val	Ser
	1410	1415	1420
Val Ile Pro 1425	Thr	Ser Gly Aep Val Val 1430	Val Val Ala Thr Aep Ala 1435	Leu 1440
Met	Thr Gly	Tyr	Thr Gly Aep Phe Aep 1445	Ser Val Ile Asp Cys Aen Thr 1450 1455
Cye	Val Thr	Gin Thr Val Aep Phe Ser Leu Aep Pro Thr Phe Thr 1460 1465 1470	Ile
Glu	Thr Ile Thr 1475	Leu Pro Gin Aep Ala 1480	Val Ser Arg Thr Gin Arg 1485	Arg
Gly	Arg Thr 1490	Gly	Arg Gly Lye Pro Gly 1495	Ile Tyr Arg Phe Val Ala 1500	Pro
Gly Glu Arg 1505	Pro	Ser Gly Met Phe Aep 1510	Ser Ser Val Leu Cye Glu 1515	Cye 1520
Tyr	Aep Ala	Gly	Cye Ala Trp Tyr Glu 1525	Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr 1530 1535
Val	Arg Leu	Arg Ala Tyr Met Aen Thr Pro Gly Leu Pro Val Cye 1540 1545 1550	Gin
Aep	Hle Leu 1555	Glu	Phe Trp Glu Gly Val 1560	Phe Thr Gly Leu Thr Hle 1565	He
Aep	Ala Hle 1570	Phe	Leu Ser Gin Thr Lye 1575	Gin Ser Gly Glu Aen Leu 1580	Pro

FIGURA 9-9

Tyr Leu Val 1585	Ala Tyr	Gin Ala Thr 1590	Val	Cye	Ala Arg Ala Gin Ala Pro
1595	1600
Pro Pro Ser	Trp Aep Gin Met Trp 1605	Lye	Cye Leu Ile 1610	Arg Leu Lya Pro 1615
Thr Leu HLb	Gly Pro 1620	Thr Pro Leu	Leu Tyr 1625	Arg Leu	Gly Ala Val Gin 1630
Aen Glu Ile Thr Leu 1635	Thr Hle Pro Val 1640	Thr	Lye Tyr	Ile Met Thr Cye 1645
Met Ser Ala 1650	Aep Leu	Glu Val Val 1655	Thr	Ser	Thr Trp Val Leu Val Gly 1660
Gly Val Leu 1665	Ala Ala	Leu Ala Ala 1670	Tyr	Cye	Leu Ser 1675	Thr Gly Cye Val 1680
Val Ile Val	Gly Arg Val Val Leu 1685	Ser	Gly Lye Pro 1690	Ala Ile Ile Pro 1695
Aep Arg Glu	Val Leu 1700	Tyr Arg Glu	Phe Aep 1705	Glu Met	Glu Glu Cye Ser 1710
Gin Hle Leu 1715	Pro Tyr	Ile Glu Gin Gly 1720	Met	Met Leu	Ala Glu Gin Phe 1725
Lye Gin Lye 1730	Ala Leu	Gly Leu Leu 1735	Gin	Thr	Ala Ser Arg Gin Ala Glu 1740
Val Ile Ala 1745	Pro Ala	Val Gin Thr 1750	Aen	Trp	Gin Lye 1755	Leu Glu Thr Phe 1760

FIGURA 9-10

Trp	Ala	Lya Hia	Met Trp Aen Phe Ile Ser Gly	Ile	Gin	Tyr Leu Ala 1775
1765	1770
Gly	Leu	Ser Thr Leu Pro Gly Aen 1780	Pro Ala Ile 1785	Ala	Ser	Leu Met Ala 1790
Phe	Thr	Ala Ala 1795	Val Thr Ser Pro Leu Thr Thr 1800	Ser	Gin Thr Leu Leu 1805
Phe	Aen Ile Leu 1610	Gly Gly Trp Val 1815	Ala Ala Gin	Leu Ala 1820	Ala Pro Gly
Ala Ala 1625	Thr Ala	Phe Val Gly Ala 1830	Gly Leu Ala Gly 1835	Ala	Ala Ile Gly 1840
Ser	Val	Gly Leu	Gly Lye Val Leu 1845	Ile Aap Ile 1850	Leu	Ala	Gly Tyr Gly 1855
Ala	Gly	Val Ala Gly Ala Leu Val 1860	Ala Phe Lya 1865	Ile	Met	Ser Gly Glu 1870
Val	Pro	Ser Thr 1875	Glu Asp Leu Val Aan Leu Leu 1880	Pro	Ala Ile Leu Ser 1885
Pro	Gly Ala Leu 1890	Val Val Gly Val 1895	Val Cya Ala	Ala Ile 1900	Leu Arg Arg
Hle 1905	Val k	Gly Pro	Gly Glu Gly Ala 1910	Val Gin Trp Met 1915	Aan	Arg Leu Ile 1920
Ala	Phe	Ala Ser	Arg Gly Aan His 1925	Val Ser Pro 1930	Thr	Hle	Tyr Val Pro 1935

FIGURA- 9-11

171 972

Glu	Ser Aep	Ala Ala Ala Arg Val Thr Ala	Ile Leu Ser	Ser Leu Thr 1950
1940	1945
Val	Thr Gin Leu Leu 1955	Arg Arg Leu Hle Gin 1960	Trp Ile Ser Ser Glu Cye 1965
Thr	Thr Pro 1970	Cye Ser	Gly Ser Trp Leu Arg 1975	Aep Ile Trp 1980	Aep Trp Ile
Cya Glu Val 1985	Leu Ser	Aep Phe Lye Thr Trp 1990	Leu Lye Ala 1995	Lye Leu Met 2000
Pro	Gin Leu	Pro Gly Ile Pro Phe Val Ser Cye Gin Arg 2005 2010	Gly Tyr Lye 2015
Gly	Val Trp	Arg Val 2020	Aep Gly Ile Met Hle 2025	Thr Arg Cye	Hle Cye Gly 2030
Ala	Glu Ile Thr Gly 2035	His Val Lye Aen Gly 2040	Thr Met Arg Ile Val Gly 2045
Pro	Arg Thr 2050	Cye Arg	Aen Met Trp Ser Gly 2055	Thr Phe Pro 2060	Ile Aen Ala
Tyr Thr Thr 2065	Gly Pro	Cye Thr Pro Leu Pro 2070	Ala Pro Aen 2075	Tyr Thr Phe 2080
Ala	Leu Trp	Arg Val Ser Ala Glu Glu Tyr Val Olu Ile 2085 2090	Arg Gin Val 2095
Gly	Aep Phe	Hle Tyr 2100	Val Thr Gly Met Thr 2105	Thr Aep Aen	Leu Lye Cye 2110

FIGURA 9-12

Pro Cya Gin Val 2115	Pro	Ser	Pro Glu Phe 2120	Phe	Thr	Glu	Leu Aap Gly Val 2125
Arg Leu Hla Arg 2130	Phe	Ala	Pro Pro Cya 2135	Lya	Pro	Leu Leu Arg Glu Glu 2140
Val Ser Phe Arg 2145	Val	Gly Leu Hla Glu 2150	Tyr	Pro Val 2155	Gly Ser Gin Leu 2160
Pro Cya Glu Pro	Glu Pro 2165	Asp Val Ala	Val Leu 2170	Thr	Ser Met Leu Thr 2175
Aap Pro Ser Hie Ile 2180	Thr	Ala Glu Ala Ala 2185	Gly	Arg	Arg Leu Ala Arg 2190
Gly Ser Pro Pro 2195	Ser	Val	Ala Ser Ser 2200	Ser	Ala	Ser	Gin Leu Ser Ala 2205
Pro Ser Leu Lye 2210	Ala	Thr	Cya Thr Ala 2215	Aan	Hla	Aap Ser Pro Aap Ala 2220
Glu Leu Ile Glu 2225	Ala	Aan Leu Leu Trp 2230	Arg	Gin Glu 2235	Met Gly Gly Aan 2240
Ile Thr Arg Val	Glu Ser 2245	Glu Aan Lya	Val Val 2250	Ile	Leu Aap Ser Phe 2255
Aap Pro Leu Val Ala 2260	Glu	Glu Aap Glu Arg 226S	Glu	Ile	Ser Val Pro Ala 2270
Glu Ile Leu Arg 2275	Lya	Ser	Arg Arg Phe 2280	Ala	Gin	Ala	Leu Pro Val Trp 2285

FIGURA 9-13

Ala Arg Pro Aap Tyr Aan Pro Pro	Leu	Val	Glu	Thr Trp Lya 2300	Lya	Pro
2290	2295
Aap Tyr Glu Pro Pro 2305	Val Val Hla 2310	Gly	Cya	Pro Leu Pro Pro 2315	Pro	Lya 2320
Ser Pro Pro Val Pro Pro Pro Arg 2325	Lya	Lya Arg 2330	Thr Val Val	Leu Thr 2335
Glu Ser Thr Leu Ser 2340	Thr Ala Leu	Ala Glu 2345	Leu	Ala Thr Arg Ser 2350	Phe
Gly Ser Ser Ser Thr 2355	Ser Gly Ile Thr 2360	Gly	Aap	Aan Thr Thr 2365	Thr	Ser
Ser Glu Pro Ala Pro 2370	Ser Gly Cya 2375	Pro	Pro	Aap	Ser Aap Ala 2380	Glu	Ser
Tyr Ser Ser Met Pro 2385	Pro Leu Glu 2390	Gly	Glu	Pro Gly Aap Pro 2395	Aap	Leu 2400
Ser Aap Gly Ser Trp Ser Thr Val 2405	Ser	Ser Olu 2410	Ala Aan Ala	Glu Aap 2415
Val Val Cya Cya Ser 2420	Met Ser Tyr	Ser Trp 2425	Thr	Gly Ala Leu Val 2430	Thr
Pro Cya Ala Ala Glu 2435	Glu Gin Lya Leu 2440	Pro	Ile	Aan Ala Leu 2445	Ser	Aan
Ser Leu Leu Arg His 2450	Hle Asn Leu 2455	Val	Tyr	Ser	Thr Thr Ser 2460	Arg	Sar

FIGURA 9-14

Ala Cye Gin Arg Gin Lye Lye Val Thr	Phe Aep Arg 2475	Leu	Gin	Val	Leu 2480
2465	2470
Aep Ser	Hle Tyr Gin Aep Val Leu Lye 2485	Glu Val Lye 2490	Ala	Ala	Ala Ser 2495
Lye Val	Lye Ala Aen Leu Leu Ser Val Glu Glu Ala 2500 2505	Cye	Ser Leu 2510	Thr
Pro Pro	Hle Ser Ala Lye Ser Lye Phe 2515 2520	Gly Tyr Gly	Ala Lye 2525	Aep	Val
Arg Cye Hle Ala Arg Lye Ala Val Thr 2530 2535	Hle Ile Aen Ser 2540	Val	Trp	Lye
Aep Leu 2545	Leu Glu Aep Aen Val Thr Pro 2550	Ile Aep Thr 2555	Thr	Ile	Met	Ala 2560
Lye Aen	Glu Val Phe Cye Val Gin Pro 2565	Glu Lye Gly 2570	Gly	Arg	Lye Pro 2575
Ala Arg	Leu Ile Val Phe Pro Aep Leu Gly Val Arg 2580 2585	Val	Cye Glu 2590	Lye
Met Ala	Leu Tyr Aep Val Val Thr Lye 2595 2600	Leu Pro Leu	Ala Val 2605	Met	Gly
Ser Ser Tyr Gly Phe Gin Tyr Ser Pro 2610 2615	Gly Gin Arg Val 2620	Glu	Phe	Leu
Val Gin 2625	Ala Trp Lye Ser Lye Lye Thr 2630	Pro Met Gly 2635	Phe	Ser	Tyr	Aep 2640

FIGURA 9-15

171 972

Thr Arg	Cye	Phe	Aep Ser 2645	Thr	Val	Thr	Olu Ser 2650	Aep	Ile	Arg Thr Glu 2655
Glu Ala	Ile	Tyr Gin Cye 2660	Cye	Aep	Leu Aep Pro 2665	Gin	Ala	Arg Val Ala 2670
Ile Lye	Ser Leu 2675	Thr Glu	Arg	Leu Tyr 2680	Val Gly	Gly	Pro Leu Thr Aen 2685
Ser Arg Gly 2690	Glu	Aen Cye	Gly Tyr 2695	Arg	Arg Cya	Arg Ala 2700	Ser Gly Val
Leu Thr 2705	Thr	Ser	Cye Gly Aen 2710	Thr	Leu	Thr Cye Tyr 2715	Ile	Lye Ala Arg 2720
Ala Ala	Cye	Arg	Ala Ala 2725	Gly	Leu	Gin	Aep Cya 2730	Thr	Met	Leu Val Cye 2735
Gly Aep	Asp	Leu Val Val 2740	Ile	Cye	Glu Ser Ala 2745	Gly	Val	Gin Glu Aep 2750
Ala Ala	Ser 2755	Leu	Arg Ala	Phe	Thr Olu 2760	Ala Met	Thr	Arg Tyr Ser Ala 2765
Pro Pro Gly 2770	Aep	Pro Pro	Gin Pro 2775	Glu	Tyr Aep	Leu Glu 2780	Leu Ile Thr
Ser Cye 2785	Ser	Ser	Aen Val Ser 2790	Val	Ala	Hle Aep Gly 2795	Ala	Gly Lye Arg 2800
Val Tyr	Tyr	Leu	Thr Arg 2805	Aep	Pro	Thr	Thr Pro 2810	Leu	Ala	Arg Ala Ala 2815

FIGURA 9-16

Trp Glu Thr Ala Arg Hle	Thr	Pro Val Aen Ser Trp Leu Gly Aen	Ile
	2820	2825	2830
Ile Met Phe Ala Pro Thr 2835	Leu	Trp Ala Arg Met 2840	Ile Leu Met Thr 2845	Hle
Phe Phe Ser 2850	Val Leu Ile	Ala Arg Aep Gin Leu 2855	Glu Gin Ala Leu 2860	Aep
Cye Glu Ile 2865	Tyr Gly Ala Cye 2870	Tyr Ser Ile Olu Pro Leu Aep Leu 2875	Pro 2880
Pro Ile Ile	Gin Arg Leu 2885	Hle	Gly Leu Ser Ala 2890	Phe Ser Leu Hle Ser 2895
Tyr Ser Pro	Gly Glu Ile 2900	Aen	Arg Val Ala Ala 2905	Cye Leu Arg Lye 2910	Leu
Gly Val Pro Pro Leu Arg 2915	Ala	Trp Arg Hle Arg 2920	Ala Arg Ser Val 2925	Arg
Ala Arg Leu 2930	Leu Ala Arg	Gly Gly Arg Ala Ala 2935	Ile Cye Gly Lye 2940	Tyr
Leu Phe Aen 2945	Trp Ala Val Arg 2950	Thr Lye Leu Lye Leu Thr Pro Ile 2955	Ala 2960
Ala Ala Gly	Gin Leu Aep 2965	Leu	Ser Gly Trp Phe 2970	Thr Ala Gly Tyr Ser 2975
Gly Gly Aep	Ile Tyr Hle 2980	Ser	Val Ser Hie Ala 2985	Arg Pro Arg Trp 2990	Ile

FIGURA 9-17

Trp Phe Cya Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gly Val Gly Ile Tyr Leu Leu 2995 3000 3005

Pro Aan Arg 3010

FIGURA 9-18

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 6,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania polipeptydu HCV obejmujący transformowanie komórki gospodarza ekspresyjnym układem kodującym i hodowlę stransformowanej komórki gospodarza, znamienny tym, że komórkę gospodarza stanowiącą komórkę E. coli, drożdży, owadów lub ssaka transformuje się za pomocą ekspresyjnego układu kodującego co najmniej dwie heterogeniczne sekwencje aminokwasowe z domeny zmiennej poliproteiny HCV, przy czym każda sekwencja zawiera epitop z tej domeny zmiennej, i elementy kontrolujące ekspresję obejmujące promotor, który jest kompatybilny z komórką gospodarza, a następnie inkubuje się komórkę gospodarza prowadząc ekspresję polipeptydu, w którym co najmniej dwie sekwencje aminokwasowe są heterogeniczne i pochodzą z różnych izolatów HCV.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się co najmniej dwie sekwencje aminokwasowe pochodzące z tej samej domeny zmiennej różnych izolatów HCV.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako domenę zmienną stosuje się domenę znajdującą się w regionie E2/NS1 poliproteiny HCV.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako domenę zmienną stosuje się domenę kodowaną przez poliproteinę HCV od około aminokwasu 384 do około aminokwasu 414.
5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako domenę zmienną stosuje się domenę pochodzącą z białka El poliproteiny HCV.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się domenę zmienną kodowaną przez poliproteinę HCV od około aminokwasu 215 do około aminokwasu 255.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się co najmniej dwie sekwencje aminokwasowe pochodzące z różnych domen różnych izolatów HCV.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się domeny zmienne znajdujące się w regionie E2/NS1.
9. Sposób według zastrz. 7 albo 8, znamienny tym, że stosuje się co najmniej jedną domenę spośród domen zmiennych będącą w regionie El.
10. Sposób wytwarzania polipeptydu HCV obejmujący polimeryzację substratu przy udziale środka polimeryzującego, znamienny tym, że polimeryzuje się substraty aminokwasowe ze środkiem polimeryzującym, wytworzony polipeptyd zawierający co najmniej dwie heterogeniczne sekwencje aminokwasowe z domeny zmiennej poliproteiny HCV, i izoluje się ten polipeptyd, w którym co najmniej dwie sekwencje aminokwasowe są różnymi izolatami HCV.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że stosuje się co najmniej dwie sekwencje aminokwasowe pochodzące z tej samej domeny zmiennej różnych izolatów HCV.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że jako domenę zmienną stosuje się domenę znajdującą się w regionie E2/NS1 poliproteiny HCV.
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że jako domenę zmienną stosuje się domenę kodowaną przez poliproteinę HCV od około aminokwasu 384 do około aminokwasu 414.
14. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że jako domenę zmienną stosuje się domenę pochodzącą z białka El poliproteiny HCV.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że stosuje się domenę zmienną kodowaną przez poliproteinę HCV od około aminokwasu 215 do około aminokwasu 255.
16. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że stosuje się co najmniej dwie sekwencje aminokwasowe pochodzące z różnych domen różnych izolatów HCV.
17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że stosuje się domeny zmienne znajdujące się w regionie E2/NS1.
18. Sposób według zastrz. 16 albo 17, znamienny tym, że stosuje się co najmniej jedną domenę spośród domen zmiennych będącą w regionie El.