JP2002167336A - 免疫反応生ｃ型肝炎ウイルスのポリペプチド組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 診断およびワクチンに有用な、多数のＨＣＶ
単離体（特にこのウイルスの異質性ドメインに関して）
と免疫学的に交差反応性であるポリペプチド組成物を提
供すること。 【解決手段】 少なくとも２つのＣ型肝炎ウイルス（Ｈ
ＣＶ）アミノ酸配列を含む免疫反応性ポリペプチド組成
物であって、各アミノ酸配列が、ＨＣＶエンベロープポ
リペプチドの可変ドメイン中に存在する少なくとも１つ
のエピトープを含有し、ここで、該可変ドメインのアミ
ノ酸配列が互いに異質性であり、別個のＨＣＶ単離体由
来であり、そして各アミノ酸配列は全長のエンベロープ
タンパク質より長くない、組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、一般的に、免疫反
応性ポリペプチド組成物、この組成物を免疫学的な適用
において用いる方法、ならびにこの組成物を製造するた
めの物質および方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｃ型肝炎ウイルスは、最近では、輸血後
の非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）の原因となる主な因
子、および集団獲得（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ａｃｑｕｉ
ｒｅｄ）ＮＡＮＢＨの重大な原因として同定されてい
る。このウイルスのゲノム配列を得るための物質および
方法は、公知である。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ８９／
０４６６９号、第ＷＯ９０／１１０８９号、および第Ｗ
Ｏ９０／１４４３６号を参照のこと。

【０００３】ＨＣＶゲノムの分子的特徴は、約３０１１
個のアミノ酸からなるポリタンパク質をコードする約１
０,０００個のヌクレオチドを含有する正の極性のＲＮ
Ａ分子であるということを示す。その証拠となる数種の
系は、ＨＣＶがフラビウイルスおよびペスチウイルスを
包含するフラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）
科のウイルスと同様の遺伝子構成を有することを示唆す
る。そのペスチウイルスおよびフラビウイルスの系統と
同様に、ＨＣＶは、個々のウイルスのタンパク質（構造
および非構造の両者）がプロセッシングによって生じ
る、大きなポリタンパク質前駆体をコードすると考えら
れる。

【０００４】ＲＮＡ含有ウイルスは、比較的高い割合の
自然変異、すなわち報告によると、組み込まれているヌ
クレオチドあたりおよそ１０^-3から１０^-4の割合で自然
変異を有する。従って、異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅ
ｉｔｙ）および遺伝子型の流動率はＲＮＡウイルスでは
共通であるので、多様なウイルスの単離体が存在し得
る。その単離体は、ＨＣＶ種においてビルレントまたは
非ビルレントであり得る。

【０００５】ＨＣＶの異なる単離体の多くが、現在同定
されている。これらの単離体の配列は、ＲＮＡウイルス
の限定された異質性の特徴を示す。

【０００６】単離体ＨＣＶ Ｊ１．１は、以下の刊行物
に記載されている：Ｋｕｂｏ、Ｙ．ら（１９８９）Ｊａ
ｐａｎ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：１０３
６７−１０３７２；Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｋ．ら（１９９
０）Ｇｅｎｅ ９１：２８７−２９１；Ｔａｋｅｕｃｈ
ｉら（１９９０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３０
２７−３０３３；Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：４６２６。

【０００７】２つの独立した単離体（「ＨＣＶ−Ｊ」お
よび「ＢＫ」）の５’−および３’−末端の配列を加え
た完全コード配列は、それぞれ、ＫａｔｏらおよびＴａ
ｋａｍｉｚａｗａらによって記載されている（Ｋａｔｏ
ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８７：９５２４−９５２８；Ｔａｋａｍｉ
ｚａｗａら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１１０
５−１１１３）。

【０００８】ＨＣＶ単離体について記載されている他の
刊行物は、以下のとおりである：「ＨＣＶ−１」：Ｃｈ
ｏｏら（１９９０）Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４
６：４２３−４４１；Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４
５１−２４５５；Ｈａｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔl．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１７１１−１
７１５；Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉ
ｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．３１８,２１６。

【０００９】「ＨＣ−Ｊ１」および「ＨＣ−Ｊ４」：Ｏ
ｋａｍｏｔｏら（１９９１）Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．６０：１６７−１７７。

【００１０】「ＨＣ−１８」、「ＨＣ−２３」、「Ｔ
ｈ」、「ＨＣ−２７」、「ＥＣ１」および「ＥＣ１
０」：Ｗｅｉｎｅｒら（１９９１）Ｖｉｒｏｌ．１８
０：８４２−８４８。

【００１１】「Ｐｔ−１」、「ＨＣＶ−Ｋ１」および
「ＨＣＶ−Ｋ２」：Ｅｎｏｍｏｔｏら、日本において
は、２つの主要なタイプのＣ型肝炎がある。Ｄｉｖｉｓ
ｉｏｎｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、Ｄｅ
ｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Iｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉ
ｃｉｎｅ、Ｋａｎａｚａｗａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ、Ｊａｐａｎ。

【００１２】クローン「Ａ」、「Ｃ」、「Ｄ」および
「Ｅ」：Ｔｓｕｋｉｙａｍａ Ｋｏｈａｒａら、肝炎ウ
イルスの第２群、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ。

【００１３】診断およびワクチンの戦略に対する典型的
なアプローチは、保存されたウイルスのドメインに注目
することである。しかし、このアプローチは、可変ドメ
インにおいて存在し得る重要なエピトープを無視すると
いう不利益を生む難点がある。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】診断およびワクチンに
有用なポリペプチド組成物を提供する。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明の目的は、多数の
ＨＣＶ単離体（特にこのウイルスの異質性（ｈｅｔｅｒ
ｏｇｅｎｅｏｕｓ）ドメインに関して）と免疫学的に交
差反応性であるポリペプチド組成物を提供することであ
る。

【００１６】多くの重要なＨＣＶエピトープは、ウイル
スの単離体の間では変化し、そしてこれらのエピトープ
は、特定のドメインに位置づけられ得ることが発見され
た。この発見は、（保存されたドメインよりもむしろ）
可変ドメインに注目する免疫学的に交差反応性のポリペ
プチド組成物を製造するという戦略を可能にする。

【００１７】従って、本発明の１実施態様は、ポリペプ
チドを含む免疫反応性組成物である。ここで、このポリ
ペプチドは、ＨＣＶの第一の可変ドメイン中のエピトー
プのアミノ酸配列を含有し、そして別個のＨＣＶ単離体
の第一の可変ドメイン由来の少なくとも２種の異質性ア
ミノ酸配列が、この組成物中に存在する。

【００１８】本発明の別の実施態様は、複数の抗原セッ
トを含有する免疫反応性組成物である。ここで、（ａ）
各抗原セットは、ＨＣＶ単離体の第一の可変ドメイン中
に存在するエピトープのアミノ酸配列を含む複数の実質
的に同一のポリペプチドからなり、そして（ｂ）１つの
セットのエピトープのアミノ酸配列は、類似の配列を有
する少なくとも１つの他のセットのアミノ酸配列に関し
て異質性である。

【００１９】本発明の別の実施態様は、複数のポリペプ
チドを含有する免疫反応性組成物であって、ここで各ポ
リペプチドは次式を有する： Ｒ_r−（ＳＶ_n）_X−Ｒ’_r' ここで、ＲおよびＲ’は、約１−２０００個のアミノ酸
からなるアミノ酸配列であり、そしてそれらは同一であ
るかまたは異なり；ｒおよびｒ’は、０または１であ
り、そしてそれらは同一であるかまたは異なり；Ｖは、
ＨＣＶ可変ドメインの配列を含有するアミノ酸配列であ
って、ここで、該可変ドメインは、少なくとも１個のエ
ピトープを含有し；Ｓは、１以上の整数であり、選択さ
れた可変ドメインを表し；そしてｎは、１以上の整数で
あり、異なるｎの値を有する少なくとも１種の他の単離
体に関して、所定のＳＶで選択された異質性ＨＣＶ単離
体を表し、そしてｎは各ｘに対して独立して選択され；
ｘは、１以上の整数であり；そしてただし、アミノ酸配
列は、（ｉ）１Ｖ₁および１Ｖ₂、（ｉｉ）１Ｖ₁および
２Ｖ₂、および（ｉｉｉ）１Ｖ_lおよび２Ｖ_lからなる群
から選択される組合せを表す組成物中に存在する。

【００２０】本発明のさらに別の実施態様は、以下の
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を包含する、ＨＣＶの処置
のための免疫原性の薬剤組成物を調製する方法である： （ａ）上記免疫反応性組成物を提供すること； （ｂ）適切な賦形剤を提供すること；および （ｃ）哺乳動物へ投与することにより免疫原性の応答を
提供する割合で、（ａ）の免疫反応性組成物と（ｂ）の
賦形剤とを混合すること。

【００２１】本発明のさらに別の実施態様は、上記免疫
反応性組成物の有効量を哺乳動物に投与することを包含
する、抗ＨＣＶ抗体を産生する方法である。

【００２２】本発明のさらに別の実施態様は、以下の
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を包含する、生物
学的試料中でＨＣＶに対する抗体を検出する方法であ
る： （ａ）ＨＣＶに対する抗体を含有すると推測される生物
学的試料を提供すること； （ｂ）上記免疫反応性組成物を提供すること； （ｃ）抗原−抗体複合体が形成されるような条件下で、
（ａ）の生物学的試料と（ｂ）の免疫反応性組成物とを
反応させること；および （ｄ）必要に応じて、（ａ）の免疫反応性組成物と
（ｂ）の生物学的試料の抗体との間で形成される抗原−
抗体複合体の形成を検出すること。

【００２３】本発明の別の実施態様は、適切な容器中に
入れられた上記免疫反応性組成物を含有する生物学的試
料中で、ＨＣＶに対する抗体を検出するためのキットで
ある。

【００２４】

【発明の実施の形態】発明の実施においては、指示され
ない限り、当該分野の技術範囲内にある分子生物学、微
生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学における従来の手
法が採用される。このような手法は、文献中に詳しく説
明されている。例えば、次の文献を参照のこと：Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ，ＦｉｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｍ
ＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡ
ＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（第２版，１９８９）；ＤＮＡ
ＣＬＯＮＩＮＧ，Ｉ巻およびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ Ｇｌｏ
ｖｅｒ編，１９８５）；ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤ
Ｅ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８
４）；ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＨＹＢＲＩＤＩＺＡ
ＴＩＯＮ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇ
ｉｎｓ編，１９８４）；ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ
ＡＮＤ ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ
およびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４）；ＡＮＩ
ＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓ
ｈｎｅｙ編，１９８６）；ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ Ｃ
ＥＬＬＳ ＡＮＤ ＥＮＺＹＭＥＳ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓ
ｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ＰＲＡＣＴＩ
ＣＡＬ ＧＵＩＤＥ ＴＯＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯ
ＮＩＮＧ（１９８４）；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺ
ＹＭＯＬＯＧＹのシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＶＥ
ＣＴＯＲＳ ＦＯＲ ＭＡＭＭＡＬＩＡＮＣＥＬＬＳ
（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編，
１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１５４およびＶｏ１．１５５
（それぞれ、ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ、およびＷｕ
編）、ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８７）；
ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ
ＣＥＬＬ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧ
Ｙ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）、Ｓ
ｃｏｐｅｓ（１９８７）；ＰＲＯＴＥＩＮＰＵＲＩＦＩ
ＣＡＴＩＯＮ： ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲ
ＡＣＴＩＣＥ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．）、およびＨＡＮ
ＤＢＯＯＫ ＯＦ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭ
ＵＮＯＬＯＧＹ，Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒおよび
Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，１９８６）；ＩＭＭＵ
ＮＯＡＳＳＡＹ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＧＵＩＤＥ
（Ｄ．Ｗ．Ｃｈａｎ編，１９８７）。本明細書中で述べ
られる前述および後述の全ての特許、特許出願および刊
行物は、本明細書中に参考として援用されている。

【００２５】ＨＣＶは、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖ
ｉｒｉｄａｅ）科の新しいメンバーである。フラビウイ
ルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）科には、ペスチウイ
ルス（ブタコレラウイルスおよびウシウイルス性下痢性
ウイルス）およびフラビウイルスが包含される。フラビ
ウイルスの例には、デング熱ウイルスおよび黄熱病ウイ
ルスがある。ＨＣＶの遺伝学的構成の図を図１に示す。
フラビウイルスおよびペスチウイルスと同様に、ＨＣＶ
は、ウイルスのポリタンパク質のＮ末端の基本的なポリ
ペプチドドメイン（「Ｃ」）、続いて２種の糖タンパク
質ドメイン（「Ｅ１」，「Ｅ２／ＮＳ１」）を、コード
すると考えられ、これらは非構造遺伝子ＮＳ２からＮＳ
５の上流にある。この推定タンパク質ドメインのアミノ
酸座標を表１に示す。

【００２６】

【表１】 上記のように、多数のＨＣＶ単離体が同定されている。
完全および部分ＨＣＶ配列の比較配列分析により、ヌク
レオチドおよびアミノ酸レベルでの相同性に基づいて、
ＨＣＶ単離体が、少なくとも３つの基本群に広く細分さ
れ得ることが分かる（表２）。Ｈｏｕｇｈｔｏｎら（１
９９１）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １４：３８１−３８８
を参照のこと。しかし、ＩＩＩ群における単離体では、
部分配列しか得られない。それゆえ、これらの単離体の
配列がより明らかになると、これらの１つまたはそれ以
上の単離体は、４番目となり得る群を含む別の群に分離
されるべきである。表３は、ヌクレオチド配列から推定
される種々のＨＣＶ単離体の個々のウイルスタンパク質
の間での配列相同性を示す。同じウイルス群のタンパク
質は、種々のウイルス群によりコードされる同じタンパ
ク質よりも高い配列類似性を示すと考えられ得る（表
３）。これに対する１つの例外は、現在まで全てのＩお
よびＩＩ群のウイルス単離体配列の間で高度に保存され
ているヌクレオキャプシドタンパク質である。（表３で
は、記号Ｎ／Ａは、比較により得られなかった配列を示
す。）従って、本発明のためには、Ｉ群の単離体は、本
明細書中でＩ群として分類される単離体に対して、アミ
ノ酸レベルで約９０％またはそれ以上の相同性であるそ
れらのウイルスタンパク質、特に、Ｅ１およびＥ２／Ｎ
Ｓ１タンパク質を有する単離体として定義され得る。Ｉ
Ｉ群は類似の方法で定義される。それ以上の群について
は、同様に、始原型単離体に対してウイルスタンパク質
の相同性によって定義され得る。下位群はまた、所定の
タンパク質、例えば、Ｅ１、Ｅ２／ＮＳ１またはＮＳ２
タンパク質における相同性により、または単により高い
相同性レベルにより定義され得る。

【００２７】

【表２】

【００２８】

【表３】 Ｅ１およびＥ２／ＮＳ１遺伝子によりコードされた推定
ウイルスエンベロープタンパク質は、Ｉ群およびＩＩ群
の間で実質的なアミノ酸配列の変異を示すことを注目す
べきである。Ｃ、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５タンパク
質が全て、両群の間でより高い配列保存性を示している
のに対し、ＮＳ２だけがかなりの割合の異質性を示す。
Ｉ群およびＩＩ群の間での推定ビリオンエンベロープタ
ンパク質で見られる配列変異により、２つの群間でのア
ミノ酸の特徴的な区別が可能になる。この例を図２およ
び３に示す。この図２および３では、Ｅ１遺伝子産物の
配列がＩ群およびＩＩ群のウイルス間で比較される。Ｈ
ＣＶのＩＩ群およびＩＩ群のヌクレオチド配列から推定
されたＥ１アミノ酸配列が示される。これらの図では、
横線はＨＣＶ−１と配列が同一であることを示す。星印
は、アミノ酸の群特異的な区別を示す；群特異的残基
は、明確に定義され得る。Ｉ群の配列は、ＨＣＶ−１、
ＨＣＴ１８、ＨＣＴ２３、ＨＣＴ２７、およびＨＣ−Ｊ
１である。ＩＩ群の配列は、ＨＣ−Ｊ４、ＨＣＶ−Ｊ、
ＨＣＶ Ｊ１．１、およびＢＫである。このようなアミ
ノ酸の群特異的な区別はまた、Ｅ２／ＮＳ１遺伝子によ
りコードされたｇｐ７２を含む他の遺伝子産物中にも存
在する。図４〜６は、Ｉ群とＩＩ群とを区別するＨＣＶ
単離体の推定Ｅ２／ＮＳ１領域の比較アミノ酸配列を示
す。後者のタンパク質はまた、ほとんどすべての単離体
の間の大きな変異を示す約３０個のアミノ酸からなるＮ
−末端超可変領域（「ＨＶ」）を含む。Ｗｅｉｎｅｒら
（１９９１）上記を参照のこと。この領域は、ＨＣＶ−
１のアミノ酸番号付けシステムを用いて、アミノ酸３８
４位から４１４位までに生じる。

【００２９】推定ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質Ｅ２
／ＮＳ１は、ペスチウイルス属のｇｐ５３（ＢＶＤＶ）
／ｇｐ５５（ブタコレラウイルス）エンベロープポリペ
プチドおよびフラビウイルス属のＮＳ１に相当し得る。
この両ポリペプチドは、これらのポリペプチドでワクチ
ン接種した宿主に防御免疫を与える。

【００３０】超可変領域（「ＨＶ」）とＨＩＶ−１ ｇ
ｐ１２０ Ｖ３ドメインとの間での配列変異度に関して
著しい類似性、限定された二次構造の欠如、および推定
抗体結合に関するアミノ酸変化の予期された効果によ
り、ＨＶドメインが中和抗体をコードしていることが示
唆される。

【００３１】ドメインの免疫原性は、実施例に記載の抗
体エピトープマッピング実験により示される。これらの
研究の結果により、ＨＣＶの３つの主要群に加え、さら
にＨＶ特異的部分群が存在することが示唆される。

【００３２】ＨＣＶ誘導ＮＡＮＢＨの個体から得た生物
学的試料を分析することより、個体は同時に２つまたは
それ以上のＨＣＶ変異体を保有し得ることが示される。
２つの共在ＨＶ変異体は、１つの個体Ｊ１の血漿中で見
い出された。さらに、肝炎の間欠性発赤になっている慢
性ＮＡＮＢＨの個体の遺伝子の部分配列決定により、個
体Ｑが２つのＨＣＶ変異体（Ｑ１またはＱ３）に感染し
ていることが示された。各々の変異体は、この疾患の１
つのエピソード（ｅｐｉｓｏｄｅ）にのみ関連してい
た。Ｑ１またはＱ３特異的ペプチド（アミノ酸３９６−
４０７位）を用いるＥＬＩＳＡにより、Ｑは、Ｑ１ペプ
チドに反応する抗体を発生するが、対応するＱ３ペプチ
ドに反応する抗体を発生しないことが示されたので、Ｑ
の疾患の再発は、ＨＶ変異体の出現のために起こること
が示唆された。疾患の第２のエピソードの間、Ｑ１ペプ
チドに対する抗体は存在するが、Ｑ３ペプチドに対する
体液性免疫応答が欠如していることにより、ＨＶドメイ
ンの変異が免疫選択の圧力から生じ得ることが示唆され
る。アミノ酸３９６〜４０７位は、ＨＶドメインにおけ
る最も高い選択圧にかけられて得られたと思われる。こ
れらの発見は、疾患に関連した高レベルの慢性度が、Ｈ
ＣＶ感染に対する不適当な免疫宿主応答および／または
免疫回避の有効なウイルス機構に依存し得るという説を
支持する。さらに、それらは、Ｅ２／ＮＳｌ ＨＶ領域
がウイルスエスケープ機構および／または不適当な免疫
応答機構に含まれる遺伝子領域であることを示してい
る。

【００３３】上記のように、ＨＣＶゲノム内にはいくつ
かの変異領域が存在する。これらの１つまたはそれ以上
の領域は、おそらく、ウイルスエスケープ機構および／
または不適当な免疫応答機構に含まれる。それゆえ、こ
れらの変異体に対する免疫応答を誘導し得るＨＣＶポリ
ペプチドを処置するための組成物中に含まれることが望
ましい。

【００３４】ゲノムのＥ１およびＥ２／ＮＳ１領域が推
定エンベロープ型ポリペプチドをコードしているので、
これらの領域は、免疫原性に関して特に重要である。こ
のため、これらの領域は、ＨＣＶ感染に対して個体を防
御する免疫応答を誘導および／または増強し、そして感
染個体の疾患の慢性的な再発の予防を助けることが特に
望ましい領域の中にある。さらに、これらの領域は、感
染、さらに重複感染または２つまたはそれ以上の変異体
による共感染の経過中に生じるＨＣＶ変異体を検出する
ことが望ましい領域の中にある。

【００３５】本発明は、ＨＣＶ感染、特に慢性ＨＣＶ感
染の予防のために、個体を処置するための組成物および
方法を記載している。さらに、本発明は、生物学的試料
中の抗ＨＣＶ抗体の存在を検出するための組成物および
方法を記載している。この後者の方法は、免疫学的に異
なるＨＣＶエピトープに対する応答で生じる抗ＨＣＶ抗
体を同定するのに特に有用である。この方法はまた、感
染個体内のＨＣＶの多様な変異体の進化を研究するのに
用いられ得る。本発明の考察において、以下の定義が適
用される。

【００３６】「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸
の重合体を意味し、特定の長さの生産物を意味しない。
従って、ポリペプチドの定義には、ペプチド、オリゴペ
プチド、およびタンパク質が包含される。この用語はま
た、ポリペプチドの発現後修飾物、例えば、グリコシル
化物、アセチル化物、リン酸化物などを意味しないか、
あるいは除外する。この定義に包含されるものは、例え
ば、アミノ酸（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）
の１つかまたはそれ以上の類似体を含むポリペプチド、
置換された結合ならびに当該技術分野で公知の天然に存
在するおよび天然に存在しない他の改変を有するポリペ
プチドである。

【００３７】本明細書中で用いられるように、Ａの重量
が、ＡとＢとを合わせた重量の少なくとも約７０％、よ
り好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましく
は少なくとも約９０％であるとき、ＡはＢから「実質的
に単離される」とする。本発明のポリペプチド組成物
は、好ましくは、ヒトまたは他の霊長類の組織（これに
は血液、血清、細胞溶解物、細胞小器官、細胞のタンパ
ク質などが包含される）および細胞培養培地を実質的に
含まない。

【００３８】「組換え体ポリヌクレオチド」とは、ゲノ
ム、ｃＤＮＡ、半合成、もしくは合成起源のポリヌクレ
オチドを意味し、その起源もしくは操作によって、
（１）このポリヌクレオチドが天然で関連しているポリ
ヌクレオチドの全体もしくは一部分と関連していないも
の、（２）このポリヌクレオチドが天然で連結している
ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結されて
いるもの、または（３）天然に存在しないものを意味す
る。

【００３９】「ポリヌクレオチド」とは、任意の長さを
持ったポリマー形態のヌクレオチド（リボヌクレオチド
またはデオキシリボヌクレオチド）である。この用語
は、分子の一次構造のみを意味する。従って、この用語
には、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本
鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡが含まれる。この用語には
また、既知の型の改変、例えば当該分野において既知の
標識、メチル化、「キャップ」、類似体による１つまた
はそれ以上の天然に存在するヌクレオチドの置換、ヌク
レオチド間の改変、例えば非荷電結合を有するもの（例
えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートな
ど）、例えばタンパク質（例えば，ヌクレアーゼ、トキ
シン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンな
ど）のようなペンダント部分を含むもの、インターカレ
ーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を有する
もの、キレート化剤（例えば、金属、放射性金属など）
を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾された結合
（例えば、アルファアノマー核酸など）を有するもの、
ならびに未修飾形態のポリヌクレオチドが含まれる。

【００４０】単細胞因子として培養される微生物もしく
は高等真核細胞系を示す「組換え体宿主細胞」、「宿主
細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」などの
用語は、組換え体ベクターもしくは他の転移ポリヌクレ
オチドの受容体として使用可能か、または使用されてき
た細胞を意味し、トランスフェクトされた元の細胞の後
代が含まれる。単一の親細胞の後代は、自然の、偶発的
または故意の変異によって、形態、またはゲノムもしく
は全ＤＮＡの相補性が元の親細胞と、必らずしも完全に
同一でなくてもよい。

【００４１】「レプリコン」には、例えばプラスミド、
染色体、ウイルス、コスミッドなどのあらゆる遺伝的要
素であり、それらは細胞内でポリヌクレオチドの複製の
自律的な単位として挙動し、すなわち自ら制御しながら
複製を行うことができる。

【００４２】「ベクター」は、オープンリーディングフ
レームの複製および／または発現を提供する配列をさら
に含むレプリコンである。

【００４３】「制御配列」は、ある種のポリヌクレオチ
ド配列を意味し、この配列が連結しているコード配列を
発現させるのに必要なものである。このような制御配列
の性質は、宿主の生物によって異なる。このような制御
配列としては、原核細胞内では、一般に、プロモータ
ー、リボソーム結合部位、およびターミネーターが含ま
れ、真核細胞内では、一般に、プロモーター、ターミネ
ーター、および場合によってはエンハンサーが含まれ
る。「制御配列」という用語は、最小限発現に必要なす
べての要素を包含し、さらに発現に有利な追加の要素、
例えば分泌を制御するリーダー配列を包含し得る。

【００４４】「プロモーター」は、ＤＮＡテンプレート
にＲＮＡポリメラーゼを結合させるコンセンサス配列を
含むヌクレオチド配列であり、その結合は、ｍＲＮＡの
製造が、隣接する構造遺伝子の通常の転写開始部位で開
始するような方法で行われる。

【００４５】「作動可能に連結された」と用語は、上記
のような要素が、意図した方式で機能し得るような関係
に並置されていることを意味する。コード配列に「作動
可能に連結された」制御配列は、制御配列に適合した条
件下でこのコード配列の発現が達成されるように、連結
される。

【００４６】「オープンリーディングフレーム」（ＯＲ
Ｆ）は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配
列の領域であり、この領域は、コード配列の一部または
コード配列全体を意味する。

【００４７】「コード配列」は、適切な調節配列の制御
下に置かれた場合に、ｍＲＮＡに転写され、および／ま
たはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列で
ある。コード配列の境界は、５’末端の翻訳開始コドン
と、３’末端の翻訳停止コドンとによって決定される。
コード配列は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ（これにはｃＤＮＡが
包含される）、および組換え体ポリヌクレオチド配列を
包含し得るが、これらに限定されるものではない。

【００４８】本明細書中で用いられるように、「エピト
ープ」または「抗原決定基」とは、免疫反応性のアミノ
酸配列を意味する。一般的に、エピトープは、少なくと
も３〜５個のアミノ酸で構成され、そしてより一般的に
は少なくとも約８個、またはさらには約１０個のアミノ
酸で構成されている。本明細書中で用いられるように、
所定のポリペプチドのエピトープは、その所定のポリペ
プチドにおけるエピトープと同様のアミノ酸配列を有す
るエピトープ、およびその免疫学的な等価物を意味す
る。

【００４９】「抗原」は、１個またはそれ以上のエピト
ープを含有するポリペプチドである。

【００５０】「免疫原性」とは、細胞性免疫応答および
／または体液性免疫応答を誘導する能力を意味する。免
疫原性応答は、単独で免疫反応性のポリペプチドによっ
て誘導され得るか、またはアジュバントの存在下または
非存在下での担体の存在を必要とし得る。

【００５１】「免疫反応性」は、（１）抗体および／ま
たはリンパ球抗原リセプターに免疫学的に結合する能
力、または（２）免疫原性である能力を意味する。

【００５２】「抗体」は、特定のエピトープと結合する
任意の免疫グロプリンであり、これには免疫グロブリン
の抗体およびフラグメントが包含される。この用語は、
とりわけ、ポリクローナル、モノクローナル、およびキ
メラ抗体を包含する。キメラ抗体の例は、米国特許第
４,８１６,３９７号および第４,８１６,５６７号で論じ
られている。

【００５３】「抗原セット」は、複数の実質的に同一の
ポリペプチドからなる組成物として定義され、ここでこ
のポリペプチドは、定義されたエピトープのアミノ酸配
列を含む。

【００５４】「実質的に同一のポリペプチド」とは、ポ
リペプチドの製造方法（例えば、組換え体発現、化学合
成、組織培養など）が原因となる、配列またはサイズの
変化の典型的な範囲に限定される変化以外は同一である
ポリペプチドを意味する。この変化は、実質的に同一の
ポリペプチドの組成物（例えば、この組成物は同一のポ
リペプチドの組成物として免疫学的に作用する）の所望
の機能的な性質を改変しない。この変化は、例えば、こ
のポリペプチドの移送の間の分泌過程から、化学合成な
どにおいて１００％未満の効力を生じる改変によるもの
であり得る。

【００５５】本明細書中で用いられるように、ウイルス
のタンパク質の「可変ドメイン」または「ＶＤ」は、少
なくとも２種のＨＣＶ単離体または亜集団（ｓｕｂｐｏ
ｐｕｌａｔｉｏｎ）の間で矛盾がないパターンのアミノ
酸の変化を示すドメインである。好ましくは、このドメ
インは、少なくとも１個のエピトープを含有する。可変
ドメインは、１個だけのアミノ酸変化により単離体から
単離体へ変化し得る。これらの単離体は、同じまたは異
なったＨＣＶ群または亜群に由来し得る。可変ドメイン
は、単離体中の配列の組成から容易に同定され得、そし
てこれらの技法は下記のとおりである。本発明を説明す
るために、可変ドメインは、図１５〜３２に示されるよ
うにＨＣＶ−１のゲノムによってコードされるポリタン
パク質のアミノ酸番号に関して、１位で示されるイニシ
エーターのメチオニンと共に定義される。別のＨＣＶ単
離体における対応の可変ドメインは、任意の可変ドメイ
ン以外の保存ドメインを最大限に整列させる方法で２種
の単離体の配列を整列させることにより決定される。こ
れは、いかなる多くのコンピューターのソフトウエアパ
ッケージ（例えば、ＡＬＩＧＮ１．０、これはＵｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ ｏｆＶｉｒｇｉｎｉａ，Ｄｅｐａｒｔｍ
ｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙから入手可能
である（註：Ｄｒ．Ｗｉｌｌｉａｍ Ｒ．Ｐｅａｒｓｏ
ｎ））でなされ得る。Ｐｅａｒｓｏｎらの（１９８８）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
５：２４４４−２４４８を参照のこと。特定の可変ドメ
インによって定められるアミノ酸番号は、幾分主観的で
あり、かつ選択の問題であることが理解されるべきであ
る。従って、可変ドメインの開始および終止は、他に指
示がない限り、近似であり、および、ドメインまたはサ
ブドメインと部分的に重複することを包含することが理
解されるべきである。

【００５６】エピトープは、所定のポリペプチドにおけ
る別のエピトープに免疫学的に結合する抗体と交差反応
するとき、その所定のポリペプチドにおけるそのエピト
ープの「免疫学的等価物」である。

【００５７】典型的に、エピトープは、位置づけられ、
少なくとも約５個のアミノ酸、時折少なくとも約８個の
アミノ酸、およびさらに、約１０個またはそれ以上のア
ミノ酸を含む。

【００５８】ＨＣＶエピトープを含むアミノ酸配列は、
別のポリペプチド（例えば、担体タンパク質）と、共有
結合によってまたは融合ポリヌクレオチドを発現させて
融合タンパク質を形成させることによって、そのいずれ
かにより、連結され得る。所望ならば、アミノ酸配列
は、エピトープの多数の繰り返しを挿入し得るかまたは
結合し得、および／または種々のエピトープを組み入れ
得る。担体タンパク質は、いかなる源からでも誘導され
得るが、一般に比較的大きい免疫原性タンパク質、例え
ば、ＢＳＡ、ＫＬＨなどである。所望ならば、担体タン
パク質は、実質的に完全な長さのＨＣＶタンパク質を担
体として使用し得、免疫原性エピトープの数を増やす。
あるいは、ＨＣＶエピトープ由来のアミノ酸配列は、ア
ミノ末端および／またはカルボキシ末端にて、非ＨＣＶ
アミノ酸配列と連結し得、従って、このポリペプチド
は、「融合ポリペプチド」となる。類似型のポリペプチ
ドは、他の所定のウイルスのタンパク質由来のエピトー
プを用いて、構築され得る。

【００５９】所定のポリペプチドの「変異体」とは、そ
の所定のポリペプチドのアミノ酸配列が、その配列にお
いて１個またはそれ以上のアミノ酸の欠失、置換、付加
または転位によって改変されたポリペプチドを意味す
る。変異体が生じる（例えば、組換えによって）または
変異体が作られる（例えば、部位特異性変異誘発）方法
は、当該分野において周知である。

【００６０】「形質転換」とは、外因性ポリヌクレオチ
ドを宿主細胞に挿入することを意味する。なお、挿入法
は、どんな方法でもよく、例えば、直接取込み法、形質
導入法（これにはウイルス感染が包含される）、ｆ−交
配法，またはエレクトロポレーション法がある。外因性
ポリヌクレオチドは、組込まれていないベクター、例え
ば、プラスミドまたはウイルスのゲノムとして保持され
ていても、あるいは宿主ゲノムに組込まれていてもよ
い。

【００６１】「個体」とは、脊椎動物、特に哺乳動物種
のメンバーを意味し、げっ歯動物（例えば、マウス、ラ
ット、ハムスター、モルモット）、ウサギ、ヤギ、ブ
タ、ウシ、ヒツジ、および霊長類（チンパンジー、アフ
リカミドリザル、ヒヒ、オランウータン、およびヒト）
を包含するが、これに限定されるものではない。

【００６２】本明細書中で用いられるように、「処置」
とは、（ｉ）伝統的なワクチンのような、感染または再
感染の予防、（ｉｉ）症状の低減または排除、および
（ｉｉｉ）ウイルスの実質的な排除または完全な排除、
のいずれをも意味する。処置は、（感染前に）予防とし
て、または（感染後に）治療として行われ得る。

【００６３】「有効量」という用語は、投与される個体
において免疫原性応答を誘導するか、または意図するシ
ステム（例えば、イムノアッセイ）において別な方法で
検出可能に免疫反応を起こすのに充分なエピトープを有
するポリペプチドの量を意味する。好ましくは、この有
効量は、上記のように処置をするのに充分である。必要
な正確な量は、接種により変化する。ワクチン接種のた
めに、またはポリクローナル抗血清／抗体の発生におい
て、例えば、その有効量は、種、年齢、および個体の一
般的な症状、処置される症状の重症度、選択される特定
のポリペプチドおよび投与様式などに依存して変化す
る。有効量は、比較的広く、非臨界的な範囲にあること
もまた、知られている。適切な有効量は、定型の実験だ
けを用いて容易に決定され得る。

【００６４】本明細書中で用いられるように、「生物学
的試料」とは、個体から単離された組織または液体の試
料をいう。これには、例えば、血漿、血清、脊髄液、リ
ンパ液、皮膚と呼吸器官と腸管と尿生殖器管の外側部
分、涙、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、器官、バイオプシ
ー、およびさらに、インビトロでの細胞培養構成物（こ
れには細胞培養培地で細胞を増殖させて得られる馴化培
地、例えば、Ｍａｂ産生ミエローマ細胞、組換え細胞、
および細胞成分を包含するが、それに限定されない）の
試料を包含するが、それに限定されない。

【００６５】本発明の免疫反応性ポリペプチド組成物
は、少なくとも１種のＨＣＶ ＶＤ由来の単離体特異性
エピトープと群特異性エピトープとの混合物を含有す
る。従って、少なくとも２種の異質性アミノ酸配列がＨ
ＣＶタンパク質中に存在する。この異質性アミノ酸配列
は、各々、同一かまたは実質的に同一の物理的な場所に
位置する別個のＨＣＶ単離体において見い出されるエピ
トープを定義する。すなわち、各配列は、ＨＣＶゲノム
／ポリペプチド内の同一の場所に位置づけられる。これ
らの配列は異質性であるので、その場所は可変ドメイン
（ＶＤ）として言及される。

【００６６】本発明をより良く理解するために、第一
に、本発明の組成物を作り出す個別のアミノ酸配列を説
明する。次いで、本発明の組成物において見い出される
複数のこのような配列について論じる。

【００６７】本発明のポリペプチドを特徴付けるアミノ
酸配列は、以下のような基本的な構造を有する： Ｌ_y−Ｚ−Ｌ’_y' （Ｉ） Ｚは、選択されたＨＣＶ単離体由来のタンパク質の領域
由来のアミノ酸配列を表す。ここで、この領域は、少な
くとも１個の可変ドメインを含み、そしてこの可変ドメ
インは、少なくとも１個のエピトープを含む。Ｌおよび
Ｌ’は、非ＨＣＶアミノ酸配列であるかまたは可変ドメ
インを含まないＨＣＶアミノ酸配列であり、ここで、Ｌ
およびＬ’は、同一または異なり得る。ｙおよびｙ’
は、０または１であり、これらは同一または異なり得
る。従って、式１は、ＨＣＶ ＶＤの配列を含むアミノ
酸配列を表し、ここで、ＶＤは、エピトープを含む。

【００６８】上記のように、Ｚにおけるエピトープは、
通常、最小約５個のアミノ酸、より典型的には最小約８
個のアミノ酸、およびさらに典型的には最小約１０個の
アミノ酸を含む。

【００６９】Ｚの可変ドメインは、１個より多いエピト
ープを含み得る。Ｚの可変ドメインは、存在するエピト
ープの配列を組み合わせたサイズと少なくとも同程度の
サイズである。従って、このドメインに、ただ１つのエ
ピトープが存在するならば、このドメインは、典型的に
は最小約５個のアミノ酸で作られる。エピトープが部分
的に重複するとき、この可変ドメインにおける組み合わ
されたエピトープの最小アミノ酸配列は、その個々のエ
ピトープの配列の合計より小さい。

【００７０】Ｚは、上記ＶＤを含むＨＣＶ単離体のアミ
ノ酸配列である。従って、Ｚの最小のサイズはＶＤの最
小のサイズである。Ｚは、ＶＤだけに比べて多くのＨＣ
Ｖのアミノ酸配列を含み、そして１個より多くのＶＤを
さらに含み得る。Ｚの最大のサイズは、臨界的ではない
が、完全なＨＣＶのポリタンパク質の長さを上回ること
は明らかに不可能である。しかし、典型的には、Ｚは、
完全なＨＣＶタンパク質（特に、Ｅ１、Ｅ２／ＮＳ１、
ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５）の配列であり、
そしてより典型的にはこのようなＨＣＶタンパク質のフ
ラグメントである。従って、Ｚは、好ましくは、最小約
５個のアミノ酸（より好ましくは最小約８個または約１
０個のアミノ酸）から最大約１１００個のアミノ酸（よ
り好ましくは最大約５００個、さらに好ましくは最大約
４００個、またはさらに好ましくは最大約２００個のア
ミノ酸）の範囲である。より一般的には、式Ｉおよび／
またはＺのポリペプチドは、それらが例えば、化学合成
により調製されるとき、最大約５０個のアミノ酸、より
典型的には最大約４０個のアミノ酸、そしてさらに典型
的には最大約３０個のアミノ酸である。

【００７１】非ＨＣＶアミノ酸配列、ＬおよびＬ’は、
それらがもし存在するならば、多くのタイプのこのよう
な配列のいずれをも構成する。例えば、ＬおよびＬ’
は、下記のように、Ｚが組換え体発現を促進するために
融合される非ＨＣＶ配列（例えば、β−ガラクトシダー
ゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、インベルターゼ、
α−因子、ＴＰＡリーダーなど）を表し得る。あるい
は、ＬおよびＬ’は、他の病原体（例えば、Ｂ型肝炎ウ
イルス、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕ
ｓｓｉｓ）、テタヌストキソイド、ジフテリアなど）の
エピトープを表して、多くのこれらの他の病原体に免疫
反応的に関連する組成物を提供し得る。ＬおよびＬ’
は、ペプチド合成の際の固体支持体、イムノアッセイの
支持体、ワクチン担体のタンパク質などへの結合を促進
するアミノ酸配列であり得る。実際、ＬおよびＬ’は、
機能的な利点のない１種またはそれ以上の不必要なアミ
ノ酸をさらに含み得る。ＬまたはＬ’に対する臨界的な
最大のサイズはなく、その長さは、一般的に所望の機能
によって決定される。典型的に、ＬおよびＬ’は、各
々、最大約２０００個のアミノ酸、さらに典型的には最
大約１０００個のアミノ酸である。有用な性質を有する
ＬおよびＬ’配列の多くは、最大約５００個のアミノ酸
である。Ｚの免疫反応性をブロックしないようにＬおよ
びＬ’を選択することは、もちろん望ましい。

【００７２】本発明に従って提供されるポリペプチドの
組成物は、それぞれ以下の式ＩＩおよびＩＩＩよって定
義される少なくとも２種のアミノ酸配列の組成物中に、
（免疫反応的に有効量で）存在することによって特徴付
けらる： Ｌ_y−Ｚ₁−Ｌ’_{y '} （ＩＩ） Ｌ_y−Ｚ₂−Ｌ’_{y '} （ＩＩＩ） Ｌ、Ｌ’、ｙおよびｙ’は上記のように定義され、そし
てそれらは独立して式ＩＩおよびＩＩＩの各々に対して
もまた定義される。Ｚ_lおよびＺ₂は、各々、上記でＺに
ついて定義されたようなＨＣＶアミノ酸配列であり、同
一の可変ドメイン（すなわち、物理的な場所）を含む
が、Ｚ₁およびＺ₂の共通の可変ドメインにおいて少なく
とも１種の異質性エピトープをそれらの間に有する異な
るＨＣＶ単離体から誘導される。例示的な実施例とし
て、式ＩＩに従ったアミノ酸配列は、Ｚ _lとして、単離
体ＨＣＶ−１のアミノ酸３８４−４１４位（またはさら
に特定すると３９６−４０７位または３９６−４０８位
のアミノ酸）にわたる超可変ドメインのフラグメントを
有し、一方、Ｚ₂は、単離体ＨＣＶ−Ｊ１．１由来の類
似のフラグメントである。これらの２種の単離体は、こ
のドメインにおいて異質性であり、これらのエピトープ
のアミノ酸配列は、有意に変化する。

【００７３】本発明の組成物は、式１に従って丁度２個
より多い別個のアミノ酸配列を含み得、そしてＺの配列
は異なる可変ドメインを含む群に分割され得ることが理
解されるべきである。例えば、本発明に従う組成物は、
（式Ｉに従うアミノ酸配列と共に）ＨＣＶ配列の群を含
み得る。この配列は、単離体ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−Ｊ
１．１、ＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４などに由来するアミノ
酸３８４−４１１位のところで超可変ドメインを含む。
この組成物はまた、（式１に従うアミノ酸と共に）ＨＣ
Ｖ配列のさらなる群を含み得る。この配列は、単離体Ｈ
ＣＶ−１、ＨＣＶ−Ｊ１．１、ＨＣ−Ｊ１、ＨＣ−Ｊ４
などにさらに由来するアミノ酸２１５−２５５位のとこ
ろで可変ドメインを含む。従って、本発明の組成物の関
係においては、式１の配列は以下のようにさらに定義さ
れ得る： ＳＶ_n （ＩＶ） Ｖは、ＨＣＶ可変ドメインの配列を含むアミノ酸配列を
表し、ここで、この可変ドメインは、少なくとも１種の
エピトープ；すなわち、式１を含む。Ｓおよびｎは、１
またはそれ以上の整数である。Ｓは特定の可変ドメイン
を表し、そしてｎは特定の単離体を表す。例えば、Ｓ＝
１はアミノ酸３８４−４１１位における可変ドメインを
表し得；Ｓ＝２はアミノ酸２１５−２５５位における可
変ドメインを表し得；そしてｎ＝１、２、３および４
は、それぞれ、単離体ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−Ｊ１．１、
ＨＣ−Ｊ１およびＨＣ−Ｊ４を表し得る。従って、上記
の２つの群の配列は以下のように表され得る： 群１：１Ｖ₁、１Ｖ₂、１Ｖ₃および１Ｖ₄ 群２：２Ｖ₁、２Ｖ₂、２Ｖ₃および２Ｖ₄ 本発明に記載の組成物には、式ＩＶの少なくとも２種の
別個の配列がある。すなわち、この組成物は、式ＩＶに
従う２種の異なる配列を含有し、ここでＳおよびまたは
ｎの値は異なる。例えば、少なくとも１Ｖ₁および１Ｖ₂
が存在し、または少なくとも１Ｖ_lおよび２Ｖ₂が存在
し、または少なくとも１Ｖ_lおよび２Ｖ₁が存在する。

【００７４】式ＩＶ中に含まれる別個の配列は、同一ま
たは異なるポリペプチド分子のいずれかにおける組成物
中に存在する。１Ｖ₁および１Ｖ₂の最小の組み合わせを
用いて、これらの２種の配列は、同一のポリペプチド分
子（例えば、１Ｖ_l−１Ｖ₂）または分離した分子中に存
在し得る。本発明の組成物のこの特徴は、以下のような
ポリペプチドの組成物として記載され得る： Ｒｒ−（ＳＶ_n）_x−Ｒ’_{r '} （Ｖ） ここで、Ｓ、Ｖおよびｎは、上記で定義のとおりであ
り；ＲおよびＲ’は、約１−２０００個のアミノ酸のア
ミノ酸配列であり、そして同一または異なり；ｒおよび
ｒ’は、０または１であり、そして同一または異なり；
ｘは、１以上の整数であり；ｎは、各ｘに対して独立し
て選択され；ただし、これらのアミノ酸配列は、（ｉ）
１Ｖ₁および１Ｖ₂、（ｉｉ）１ｖ₁および２Ｖ₂、および
（ｉｉｉ）１Ｖ₁および２Ｖ₁からなる群より選択される
組み合わせを表す組成物中に存在する。式ＩＶの別個の
配列が異なるポリペプチド内にある実施態様において
は、ｘは１であり得るが、所望であるなら１をさらに越
え得る；例えば、ポリペプチド１Ｖ₁−１Ｖ₂と１Ｖ_l−
２Ｖ₂との混合物。ｘが１であるとき、ｒおよびｒ’は
好ましくは共に０であり、ＬｙおよびＬ’_y'の重複を避
ける。これは、Ｖが式Ｉによる好ましい実施態様によっ
て記載され得るからである。ｘが１より大きいとき、Ｒ
とその隣接するＬとを組み合わせた長さ、およびＲ’と
その隣接するＬ’とを組み合わせた長さは、好ましく
は、ＬおよびＬ’に関して上記の典型的な最大長より長
くはない。

【００７５】この組成物の別個のＶ配列中に含まれるＨ
ＣＶのアミノ酸配列の選択は、この配列の意図する適用
に依存し、そして本発明の開示による当業者の範囲内で
ある。第一に、本発明に関するＨＣＶエピトープは、２
種のタイプに分かれ得ることが認められるべきである。
エピトープの第一のタイプは、「群特異性」であるもの
であり、すなわち、ＨＣＶ単離体の群中の全てのまたは
実質的に全ての単離体における対応のエピトープは、互
いに免疫学的に交差反応性であるが、他の群の実質的に
全ての単離体の対応するエピトープを有しない。好まし
くは、群特異性のクラスにおけるエピトープは、この群
内に実質的に保存されるが、この群間またはこの群中に
は保存されない。エピトープの第二のタイプは、「単離
体特異性」であるものであり、すなわち、このエピトー
プは、実質的に同一の単離体と免疫学的に交差反応し、
そして全てのまたは実質的に全ての別個の単離体とは交
差反応しない。

【００７６】これらの群特異性エピトープおよび単離体
特異性エピトープは、本発明の開示によって容易に同定
され得る。第一に、数種のＨＣＶ単離体の配列が、本明
細書中に記載されているように、比較され、そして配列
異質性の領域が同定される。通常、異質性のパターン
は、群特異性または単離体特異性を示す。同定された領
域が１個またはそれ以上のエピトープを含むことが周知
であるならば、次いで、所望のエピトープを含むのに充
分なサイズの配列は、本発明の組成物に含まれ得る可変
ドメインとして選択される。所定の異質性領域の免疫反
応性が周知でないならば、種々のＨＣＶ単離体のその領
域内に見い出される配列を表すペプチドは、調製され
得、そしてスクリーニングされ得る。スクリーニングは
含まれ得るが、抗ＨＣＶ抗体の種々の源（例えば、患者
の血清、中和化Ｍａｂなど）によるイムノアッセイまた
は抗体の発生、およびインビトロでウィルスを中和する
ためのそのような抗体の能力、に限定されない。あるい
は、下記のようなスクリーニングのプロトコールで同定
されるエピトープの遺伝子座は、種々の単離体の異質性
およびスクローニングされた対応の異質性配列の免疫学
的な性質について試験され得る。

【００７７】ワクチンの適用には、Ｅ１および／または
Ｅ２／ＮＳ１ドメイン由来の可変ドメインが、特に重要
であると考えられる。特に、アミノ酸２１５−２５５内
のＥ１可変ドメイン（図２および３参照）、およびアミ
ノ酸３８４−４１４内のＥ２／ＮＳ１可変ドメイン（図
４〜６参照）は、重要な免疫反応性ドメインであるとし
て同定されている。予備的な証拠により、これらのドメ
インの片方または両方が、慢性ＨＣＶ感染に通じるエス
ケープ変異体に反応し得る異質性の遺伝子座であり得る
ことが示唆される。従って、Ｖの可変ドメインがこれら
の可変ドメインの片方または両方であるような、上記の
ようなポリペプチド組成物は、特に好ましい。さらに、
本発明のポリペプチド組成物は、特に可変ドメイン中の
一般的な線形エピトープに関連するが、配座エピトープ
もまた含有し得る。例えば、この組成物は、組換え体系
（例えば、昆虫または哺乳動物細胞）で発現される、
（異なる単離体の可変ドメインを示す）組換え体Ｅｌお
よび／またはＥ２／ＮＳ１タンパク質の混合物を含み得
る。この組換え体系は、可変ドメインの内側または外側
のいずれかに配座エピトープを維持している。あるい
は、配座エピトープを維持する単一の単離体由来のＥ１
および／またはＥ２／ＮＳ１サブユニット抗原が、本発
明に従って、ポリペプチド組成物と組み合わされ得る
（例えば、合成ペプチドまたは変性させた組換え体ポリ
ペプチドの混合物）。ワクチンに対する別の好ましい適
用では、本明細書中に記載のポリペプチド組成物を他の
ＨＣＶサブユニット抗原と組み合わせ得る。例えば、同
一人の所有する米国特許出願第号に記載の抗原である。
この出願のタイトルは、Ｒｏｂｅｒｔ Ｏ．Ｒａｌｓｔ
ｏｎ，Ｆｒａｎｋ Ｍａｒｃｕｓ，Ｋｅｎｔ Ｂ．Ｔｈ
ｕｄｉｕｍ，Ｂａｒｂａｒａ ＧｅｒｖａｓｅおよびＪ
ｏｈｎ Ｈａｌｌにより、「Ｃ型肝炎ウイルスアシアロ
糖タンパク質」（アトーニィドケット番号０１５４．０
０２）であって、本願と共に同日で出願しており、本明
細書中に参考として援用されている。

【００７８】診断の適用には、抗原として本発明の組成
物を用い、それにより、別個のＨＣＶ単離体に対する抗
体を検出する能力を改善するのに有用であり得る。典型
的には、このポリペプチド混合物は、均質なまたは不均
質なイムノアッセイ形式において直接用いられ得、後者
では、好ましくは、ポリペプチドを固体基質（例えば、
マイクロタイタープレートウェル、プラスチックビー
ズ、ニトロセルロースなど）上に固定することを包含す
る。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１１０８９；欧州
公開公報第３６０,０８８号；ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡ
Ｙ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＧＵＩＤＥ、上記を参照
のこと。あるいは、本発明のポリペプチド組成物を作り
出す実質的に同一の各ポリペプチドを別個の遺伝子座で
同一の支持体上に固定し得、それにより抗体が産生され
る単離体または群についての情報が提供される。このこ
とは、種々の単離体が、肝炎、癌、または種々の臨床予
後を必要とする他の疾患を引き起こすならば、診断に特
に重要である。好ましい形式は、Ｃｈｉｒｏｎ ＲＩＢ
Ａ^TMストリップイムノアッセイ形式であり、これは、同
一人の所有する米国特許出願第０７／１３８,８９４号
および米国特許出願第０７／４５６,６３７号に記載さ
れており、その開示内容は本明細書中に参考として援用
されている。

【００７９】本発明の組成物の製造に有用なポリペプチ
ドは、組換えによって、合成によって、または組織培養
中で、製造され得る。切形型ＨＣＶ配列または全長ＨＣ
Ｖタンパク質を含む組換え体ポリペプチドは、ＨＣＶ配
列（１個またはそれ以上のエピトープ、隣接しているか
または隣接していないかのいずれかである）、または融
合タンパク質中の配列から完全に製造され得る。融合タ
ンパク質では、有用な異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕ
ｓ）配列は、組換え宿主からの分泌を提供するか、ＨＣ
Ｖエピトープの免疫反応性を高めるか、またはポリペプ
チドの支持体またはワクチン担体への結合を促進する配
列を包含する。例えば、欧州公開公報第１１６,２０１
号；米国特許第４,７２２８４０号；欧州公開公報第２
５９,１４９号；米国特許第４,６２９,７８３号を参照
のこと。これらの開示内容は、本明細書中に参考として
援用されている。

【００８０】全長ポリペプチド、および切形型ＨＣＶ配
列を含むポリペプチド、およびそれらの変異体は、化学
合成によって調製され得る。化学合成によってポリペプ
チドを調製する方法は、当該分野において周知である。
それらはまた、組換え技術によっても調製され得る。Ｈ
ＣＶ−１をコードするＤＮＡ配列、および他のＨＣＶ単
離体由来の可変領域のＤＮＡ配列が、本明細書中に記載
および／または参照されている。これらの配列の入手に
より、ＨＣＶポリペプチドの免疫反応性領域をコードす
るポリヌクレオチドの構築が可能である。

【００８１】ＨＣＶの可変ドメイン由来の１個またはそ
れ以上の免疫反応性ＨＣＶエピトープを含む所望のポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、化学的に合
成されるか、または単離され、そして発現ベクター中に
挿入され得る。このベクターは、β−ガラクトシダーゼ
またはスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）のよう
な融合配列の部分を含み得るか、または含み得ない。Ｓ
ＯＤの融合配列を含むポリペプチドの産生に有用な方法
およびベクターは、１９８６年１０月１日に公開された
欧州公開公報第０１９６０５６号に記載されている。

【００８２】所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ
は、融合または成熟形態のどちらであっても、そして分
泌を可能にするシグナル配列を含有するかまたは含有し
なくても、任意の都合のよい宿主に対して適切な発現ベ
クター内に連結され得る。次いで、宿主は、発現ベクタ
ーで形質転換される。原核宿主細胞系および真核宿主細
胞系の両方が、現在、組換え体ポリペプチドを形成する
のに用いられており、そしてより一般的な制御系および
宿主細胞系の要約を以下に示す。宿主細胞は、所望のポ
リペプチドを発現させる条件下でインキュベートされ
る。次いで、このポリペプチドは、溶解細胞または培地
から単離され、その意図された用途に必要な程度まで精
製する。

【００８３】ウイルス由来のＨＣＶゲノムの抽出、ＤＮ
Ａライブラリーの調製および探索、クローンの配列決
定、発現ベクターの構築、細胞の形質転換、免疫学的ア
ッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイおよびＥＬＩＳ
Ａアッセイ）の実施、培養中の増殖細胞において用いら
れる一般的な方法は、当該分野において周知である（例
えば、上記「背景」の部に引用された文献、および上記
のこの「発明の実施態様」の部の初めに引用された文献
を参照のこと）。

【００８４】所望の配列を含むベクターの適切な宿主内
への形質転換は、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入す
る周知のいずれの方法によっても行われ得、この導入方
法には、ウイルス中のポリヌクレオチドのパッケージン
グ、および、ウイルスによる、またはポリヌクレオチド
の直接取り込みによる宿主細胞の形質導入が包含され
る。用いられる形質転換の方法は、形質転換される宿主
に依存する。直接取り込みによる細菌の形質転換は、一
般に、塩化カルシウムまたは塩化ルビジウムによる処理
を使用し得る（Ｃｏｈｅｎ（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２１１０）。
直接取り込みによる酵母の形質転換は、Ｈｉｎｎｅｎ
ら、（１９７８）Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．
７：１９２９の方法を用いて行われ得る。直接取り込み
による哺乳動物の形質転換は、ＧｒａｈａｍおよびＶａ
ｎ ｄｅｒ Ｅｂ（１９７８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５
２：５４６のリン酸カルシウム沈澱法、またはその種々
の周知の改変法を用いて行われ得る。細胞（特に、哺乳
動物細胞）内への組換え体ポリヌクレオチドの導入に対
して、当該分野において周知である他の方法は、デキス
トラン仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム仲
介トランスフェクション、ポリブレン仲介トランスフェ
クション、プロトプラスト融合、エレクトロポーレーシ
ョン、リポソーム中のポリヌクレオチドの被包化、およ
び核内へのポリヌクレオチドの直接マイクロインジェク
ションを包含する。

【００８５】所望のコード配列の発現を得るために、宿
主細胞は（発現ベクターであり得る）ポリヌクレオチド
で形質転換される。このポリヌクレオチドは、所望のコ
ード配列に作動可能に連結された制御配列からなる。こ
の制御配列は、所定の宿主に適合し得る。原核宿主の間
では、Ｅ．ｃｏｌｉが最もよく用いられる。原核生物の
発現制御配列は、プロモーター、必要に応じて含有され
るオペレーター部位、およびリボソーム結合部位を含
む。原核宿主に適合し得る転移ベクターは、一般に、例
えば、ｐＢＲ３２２（アンピシリンおよびテトラサイク
リン耐性を付与するオペロンを含むプラスミド）、およ
び種々のｐＵＣベクター（抗生物質耐性マーカーを付与
する配列をまた含む）から得られる。プロモーター配列
は、天然に存在する、例えば、β−ラクタマーゼ（ペニ
シリナーゼ）（Ｗｅｉｓｓｍａｎ（１９８１）Ｉｎｔｅ
ｒｆｅｒｏｎ ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編）中の「Ｔｈ
ｅｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎ
ｄ ｏｔｈｅｒ ｍｉｓｔａｋｅｓ」）、ラクトース
（ｌａｃ）（Ｃｈａｎｇら、（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ
１９８：１０５６）およびトリプトファン（ｔｒｐ）
（Ｇｏｅｄｄｅｌら、（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．８：４０５７）、およびλ由来Ｐ _Lプロモ
ーター系およびＮ遺伝子リボゾーム結合部位（Ｓｈｉｍ
ａｔａｋｅら、（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１
２８）であり得る。さらに、天然に存在しない合成プロ
モーターもまた、細菌プロモーターとして機能する。例
えば、１つのプロモーターの転写活性化配列は、他のプ
ロモーターのオペロン配列に結合して、合成ハイブリッ
ドプロモーターを形成し得る（例えば、ｔａｃプロモー
ター（これは、ｔｒｐおよびｌａｃプロモーターの配列
由来である）（Ｄｅ Ｂｏｅｒら、（１９８３）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２
１）。上記の系は、特にＥ．ｃｏｌｉに適合し得る；所
望であれば、他の原核宿主（例えば、バチリス属（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ）またはシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ）の株が、対応する制御配列で用いられ得
る。

【００８６】真核宿主は、培養系における酵母および哺
乳動物細胞を包含する。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓは、最も一般的に用い
られる酵母宿主であり、そして好都合な菌類宿主であ
る。酵母適合性ベクターは、一般に、栄養要求性突然変
異体に原栄養性（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｙ）を、または野
生株に重金属耐性を付与することにより、生育した形質
転換体の選別を可能にするマーカーを有する。酵母適合
性ベクターは、２ミクロンの複製起点（Ｂｒｏａｃｈら
（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：３０７）、Ｃ
ＥＮ３およびＡＲＳ１の組合せ、または複製を確実に行
うような他の手段（例えば、宿主細胞ゲノムに適切なフ
ラグメントを取り込ませ得る配列）を用い得る。酵母ベ
クターの制御配列は、当該分野において周知であり、解
糖系酵素の合成のプロモーターを含む（Ｈｅｓｓら（１
９６８）Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．７：１４
９）；例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）
（欧州公開公報第２８４０４４号）、エノラーゼ、グル
コキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グ
リセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡ
ＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルク
トキナーゼ、３−グリセロリン酸ムターゼ、およびピル
ビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（欧州公開公報第３２９３０
３号）。酵母ＰＨ０５遺伝子（これは酸ホスファターゼ
をコードする）もまた、有用なプロモーター配列を提供
する。さらに、天然に存在しない合成プロモーターもま
た、酵母プロモーターとして機能する。例えば、１つの
酵母プロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）は、他の
酵母プロモーターの転写活性化領域に連結され得、合成
ハイブリッドプロモーターを創製する。このようなハイ
ブリッドプロモーターの例は、ＧＡＰ転写活性化領域に
連結したＡＤＨ調節配列（米国特許第４,８７６,１９７
号および第４,８８０,７３４号）を包含する。ハイブリ
ッドプロモーターの他の例は、ＧＡＰまたはＰｙＫのよ
うな解糖系酵素の転写活性化領域と結合したＡＤＨ２、
ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、またはＰＨ０５遺伝子のいずれ
かの制御配列からなるプロモーターであって、プロモー
ターを包含する（欧州公開公報第１６４５５６号）。さ
らに、酵母プロモーターは、適当な転写開始のための酵
母ＲＮＡポリメラーゼに結合する能力を有する、酵母以
外の起源の天然に存在するプロモーターを包含する。

【００８７】酵母発現ベクターに含まれ得る他の制御要
素には、ターミネーター（例えば、ＧＡＰＤＨ由来、お
よびエノラーゼ遺伝子由来（Ｈｏｌｌａｎｄ（１９８
１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１３８５）、お
よびリーダー配列がある。リーダー配列フラグメント
は、典型的には、細胞からタンパク質を分泌させる疎水
性アミノ酸からなるシグナルペプチドをコードする。適
切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌酵母タン
パク質に対する遺伝子（例えば、酵母インベルターゼ遺
伝子（欧州公開公報第１２,８７３号）およびα−因子
遺伝子（米国特許第４,５８８,６８４号））に由来し得
る。あるいは、非酵母起源のリーダー（例えば、インタ
ーフェロンリーダー）もまた、酵母における分泌を提供
する（欧州公開公報第６００５７号）。分泌リーダーの
好ましいクラスは、酵母α−因子遺伝子のフラグメント
を使用し、このフラグメントは、「プレ」シグナル配列
と「プロ」領域との両方を含んでいる。用いられ得るα
−因子フラグメントのタイプは、完全長プレ−プロα−
因子リーダー、および不完全α−因子リーダー（米国特
許第４,５４６,０８３号および第４,８７０,００８号；
欧州公開公報第３２４２７４号）を包含する。分泌を提
供するα−因子リーダーフラグメントを用いる別のリー
ダーは、第２の酵母α−因子由来のプロ−領域ではな
く、第１の酵母のプレ配列で作られたハイブリッドα−
因子リーダーを包含する（例えば、ＰＣＴＷＯ８９／０
２４６３を参照のこと）。

【００８８】染色体外レプリコンまたは組込みベクター
である発現ベクターが、多種の酵母中への形質転換用に
開発されている。例えば、発現ベクターは、以下の種に
用いるために開発されている；Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂ
ｉｃａｎｓ（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌ．６：１４２）、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌ
ｔｏｓａ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）、Ｈａｎｚｅｎｕ
ｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９
８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４
５９）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉ
ｓ（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１
５８：１１６５）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａ
ｃｔｉｓ（Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８
３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：７３７）、Ｐｉ
ｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ（Ｋｕｎｚｅ
ら（１９８５）上記）、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉ
ｓ（Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｌ．５：３３７６；米国特許第４,８３７,１４８号お
よび第４,９２９,５５５号））、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（ＢｅａｃｈおよびＮｕ
ｒｓｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ３００：７０６）、
およびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｄａ
ｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１
０：３９）。

【００８９】発現用宿主として利用可能な哺乳動物細胞
系は、当該分野で周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ
ｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣ
Ｃ）から入手可能な多種の不死化された細胞系、例えば
ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）
細胞、シリアンハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ＣＯＳサ
ル細胞、および多数の他の細胞系を含む。当該分野にお
いて、哺乳動物細胞に対して適切なプロモーターが周知
であり、それらは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４
０）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス
（ＡＤＶ）およびウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）に由来
するようなウイルスプロモーターを含む（適切なプロモ
ーターの例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）を参照の
こと）。哺乳動物細胞は、ターミネーター配列およびポ
リＡ付加配列を必要とし得；発現を増大するエンハンサ
ー配列をもまた含まれ得、そして、遺伝子の増幅を引き
起こす配列もまた望ましくあり得る。これらの配列は、
当該分野で周知である。

【００９０】哺乳動物細胞で複製に適するベクターが、
当該分野で周知であり、そして、それらは、ウイルスの
レプリコン、または所望のポリペプチドをコードする適
切な配列の宿主ゲノム中への組込みを確実にする配列を
含み得る。

【００９１】外来ＤＮＡの発現に使用され、ワクチン調
製において使用され得るベクターは、ワクシニアウイル
スである。この場合、異種ＤＮＡがワクシニアゲノム中
へ挿入される。ワクシニアウイルスゲノム中へ外来ＤＮ
Ａを挿入する技術は、当該分野で周知であり、例えば相
同的組換えを利用する。異種ＤＮＡは、一般的に、選択
マーカーの提供も行うチミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）
のような、天然には非必須の遺伝子中に挿入される。組
換えウイルスの構築を非常に容易にするプラスミドベク
ターが、記載されている（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔら
（１９８４）「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｖｏｌ．Ｉ
Ｉ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９１頁中、Ｃｈａｋａｒａ
ｂａｒｔｉら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．５：３４０３；Ｍｏｓｓ（１９８７）「Ｇｅｎｅ
Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍ
ａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌ
ｏｓ編、１０頁）を参照のこと）。次いで、免疫反応性
領域を含む所望のポリペプチドの発現が、生存している
組換えワクシニアウイルスで感染しおよび／または免疫
化された細胞または個体で起こる。

【００９２】ポリペプチドの発現のための他のシステム
は、昆虫細胞およびこれらの細胞中での使用に適切なベ
クターを含む。これらのシステムは、当該分野で周知で
あり、例えば、バキュロウイルス Ａｕｔｏｇｒａｐｈ
ａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核ポリヘドロシスウイルス
（ＡｃＮＰＶ）由来の昆虫発現転移ベクターを含む。こ
のベクターは、ヘルパー非依存ウイルス発現ベクターで
ある。このシステムから得られる発現ベクターは、通
常、強力なウイルスポリヘドロン遺伝子プロモーターを
用いて、異種遺伝子の発現を起こす。現在、ＡｃＮＰＶ
中へ外来遺伝子を導入するために最も一般的に使用され
る転移ベクターは、ｐＡｃ３７３である。当業者に周知
の多種の他のベクターもまた、発現を増進するために設
計されている。これらは、例えば、ｐＶＬ９８５（これ
は、ポリヘドロン開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに変更
し、そして、ＡＴＴから３２塩基対の下流にＢａｍＨＩ
クローニング部位を導入する；ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕ
ｍｍｅｒｓ（１９８９）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７：３
１を参照のこと）を含む。非融合外来タンパク質の良好
な発現は、通常、理想的にはＡＴＧ開始シグナルの前方
に適切な翻訳開始シグナルを含む短いリーダー配列を有
する外来遺伝子を必要とする。プラスミドは、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ中での選択および増殖のために、ポリヘドロンポリ
アデニル化シグナルおよびアンピリシン抵抗性（ａｍ
ｐ）遺伝子および複製起点をも含む。

【００９３】異種ＤＮＡをバキュロウイルスの所望の部
位に導入する方法は、当該分野で周知である（以下を参
照のこと：ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａ
ｓＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５；
Ｊｕら（１９８７）「Ｇｅｎｅ ＴｒａｎｓｆｅｒＶｅ
ｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ
ｓ」（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編）中に記載；Ｓ
ｍｉｔｈら（１９８３）、Ｍｏｌ．＆Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．３：２１５６；および、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍ
ｍｅｒｓ（１９８９）上記）。例えば、この挿入は、相
同的組換えにより、ポリヘドロン遺伝子のような遺伝子
中に行われ得；所望のバキュロウイルス遺伝子中に作ら
れた制限酵素部位中にもまた行われ得る。挿入される配
列は、可変ドメイン由来の少なくとも１つのエピトープ
を含む所望のＨＣＶポリペプチドのすべてのまたは様々
のセグメントをコードするものであり得る。

【００９４】シグナルペプチド切断、タンパク質分解性
切断、およびリン酸化のような、翻訳後改変のためのシ
グナルは、昆虫細胞により認識されると考えられる。ま
た、分泌および核での蓄積（ｎｕｃｌｅａｒ ａｃｃｕ
ｍｕｌａｔｉｏｎ）に必要なシグナルは、無脊椎動物と
脊椎動物細胞との間で保存されていると考えられてい
る。無脊椎動物の細胞中で有効な脊椎動物細胞由来のシ
グナル配列の例は、当該分野で周知である。例えば、昆
虫細胞中では、ヒトインターロイキン２シグナル（ＩＬ
２）は、細胞が認識されると外部へ輸送するシグナルと
なり、完全に除去される。

【００９５】上記宿主細胞およびベクターを用いて調製
されたポリペプチドは、しばしば、融合ポリペプチドで
あることが望ましい。非融合ポリペプチドと同様に、融
合ポリペプチドは発現後に細胞内に留まり得る。あるい
は、融合ポリペプチドが、リーダー配列フラグメントを
含む場合、この融合ポリペプチドはまた、細胞から増殖
培地中に分泌され得る。好適には、外来遺伝子のリーダ
ーフラグメントと残りの部分との間に、インビボまたは
インビトロで切断され得るプロセシング部位がある。

【００９６】ＨＣＶの処置に組成物が使用される場合、
その組成物は免疫原性であることが望ましい。合成ポリ
ペプチドは、正しいエピトープを提供するために正しく
構造化されるが、免疫原性になるには小さすぎる場合、
ポリペプチドは適切な担体に結合され得る。このような
結合を得るための多数の技術が、当該分野で周知であ
り、これらには、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピ
リジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスクシ
ンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキ
サン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）（ペプチドに
スルフヒドリル基がなければ、システイン残基の付加に
より提供され得る）を用いるジスルフィド結合の形成が
含まれる。これらの試薬は、その試薬自身とあるタンパ
ク質中のペプチドシステイン残基との間にジスルフィド
結合を形成し、そして、リジンのε−アミノ基または他
のアミノ酸の他の遊離アミノ基によるアミド結合を形成
する。このような種々のジスルフィド／アミド−形成剤
が知られている。例えば、Ｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．（１９
８２）６２：１８５を参照のこと。他の二官能カップリ
ング剤は、ジスルフィド結合よりもむしろチオエーテル
結合のためである。これらのチオエーテル形成試薬の多
くは、市販で入手可能であり、６−マレイミドヘキサン
酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレ
イミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸などの
反応性エステルを含む。これらのカルボキシル基は、そ
のカルボキシル基をコハク酸イミドまたは１−ヒドロキ
シル−２−ニトロ−４−スルホン酸のナトリウム塩と組
み合わせることで、活性化され得る。抗原をカップリン
グするためのさらなる方法には、欧州公開公報第２５
９,１４９号に記載のロタウイルス／「結合ペプチド」
システムが用いられる。上記の列挙は、それがすべてで
あるわけではなく、列挙された化合物の改変物もまた、
明らかに使用され得る。

【００９７】担体としては、宿主に対して有害な抗体の
産生をそれ自体が引き起こさなければ、どのような担体
でも使用され得る。適切な担体は、典型的には、タンパ
ク質のような大きくて徐々に代謝される高分子；ラテッ
クス機能付与セファロース、アガロース、セルロース、
セルロースビーズなどのような多糖類；ポリグルタミン
酸、ポリリジンなどのような重合アミノ酸；アミノ酸共
重合体；および不活性ウイルス粒子（以下を参照のこ
と）である。特に有用なタンパク質基質は、血清アルブ
ミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブ
リン分子、サイログロブリン、卵白アルブミン、テタヌ
ストキシン、および当業者に良く知られた他のタンパク
質である。

【００９８】ＨＣＶ可変ドメイン（特にＥ１およびＥ２
／ＮＳ１）のエピトープの免疫原性は、粒子形成タンパ
ク質（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原に関連するタンパク
質）と融合されたまたは組み立てられた真核細胞系にお
いて、それらを調製することによっても増強され得る。
例えば、米国特許第４,７２２,８４０号を参照のこと。
可変ドメイン由来のＨＣＶエピトープを含有するポリペ
プチドが粒子形成タンパク質コード配列に直接結合する
構築物は、ＨＣＶエピトープに関して免疫原性であるハ
イブリッドを生成する。さらに、調製したすべてのベク
ターは、例えば、プレ−Ｓペプチドのような種々の程度
の免疫原性を有し、ＨＢＶに特異的なエピトープを含
む。このように、粒子形成タンパク質から構築され、Ｈ
ＣＶ配列を含む粒子は、ＨＣＶおよびＨＢＶに関して免
疫原性である。

【００９９】肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ）が、Ｓ．ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら（１９８
２）Ｎａｔｕｒｅ ２９８：３４４）、および、例えば
哺乳動物細胞（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら（１９８４）
「Ｂ型肝炎」Ｍｉｌｌｍａｎ Ｉ．ら編に記載）中で形
成され、そして粒子に組み立てられることが示されてい
る。このような粒子の形成は、モノマーサブユニットの
免疫原性を増強することが示された。構築物はまた、プ
レ表面（プレ−Ｓ）領域の５５のアミノ酸を含むＨＢＳ
Ａｇの免疫優性エピトープを含み得る。Ｎｅｕｒａｔｈ
ら（１９８４）。酵母中で発現され得るプレ−Ｓ−ＨＢ
ＳＡｇ粒子の構築物は、欧州公開公報第１７４,４４４
号に開示されている；酵母での発現のための異種ウイル
ス配列を含むハイブリッドは、欧州公開公報第１７５,
２６１号に開示されている。これらの構築物は、ＳＶ４
０−ジヒドロ葉酸還元酵素ベクターを用いて、ＣＨＯ細
胞のような哺乳動物細胞中でも発現され得る（Ｍｉｃｈ
ｅｌｌｅら（１９８４））。

【０１００】さらに、粒子形成タンパク質コード配列の
一部は、ＨＣＶ可変ドメイン由来のエピトープをコード
するコドンで置換され得る。この置換において、酵母ま
たは哺乳動物で免疫原性粒子を形成する単位の集合を媒
介するのに必要とされない領域が削除され得、このよう
にして、ＨＣＶエピトープと競合する部分から余分なＨ
ＢＶ抗原部位を除去する。

【０１０１】活性成分として免疫原性ポリペプチドを含
むワクチンの調製は、当業者に公知である。典型的に
は、このようなワクチンは、液体溶液または懸濁液のい
ずれかとして、注射可能なように調製される；注射前
に、液体に溶解または懸濁させるのに適当な固形物の形
態としても調製され得る。この調製物はまた、乳化する
ことも可能であり、すなわち、リポソーム中でカプセル
化されたポリペプチドであってもよい。この活性免疫原
性成分は、薬学的に受容され得る賦形剤であって、この
活性成分と適合し得る賦形剤と混合されることが多い。
適当な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、
グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せ
である。さらに、必要であれば、このワクチンには、少
量の補助物質が含まれ得る。この補助物質としては、保
湿剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および／またはワクチ
ンの効果を増強するアジュバントが挙げられる。効果的
なアジュバントの例は、以下を含むが、それだけには限
定されない：水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラ
ミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−
ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニ
ル−Ｄ−イソグルタミン（（ＣＧＰ １１６３７）、ノ
ル−ＭＤＰと呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−
アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−
（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒ
ドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ
１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）、およびＲＩ
ＢＩ。ここで、ＲＩＢＩは、２％スクアレン／Ｔｗｅｅ
ｎ８０乳濁液中に、細菌から抽出される３成分、すなわ
ちモノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレート
および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含んで
いる。アジュバントの効力は、可変ドメイン由来のＨＣ
Ｖエピトープを含む免疫原性ポリペプチドに対する抗体
の量を測定することにより決定され得る。この抗体は、
種々のアジュバントもまた含むワクチン中でこのポリペ
プチドを投与することによって生じる。

【０１０２】タンパク質は、中性または塩の形態でワク
チンに処方され得る。薬学的に受容され得る塩には、酸
付加塩（ペプチドの遊離アミノ基と共に形成される）が
含まれ、この塩は、無機酸（例えば、塩酸、リン酸）、
または有機酸（酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸な
ど）を用いて形成される。遊離カルボキシル基と共に形
成される塩は、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、水酸化アンモニア、水酸化カルシウ
ム、または水酸化第二鉄）および有機塩基（イソプロピ
ルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノ
ール、ヒスチジン、プロカインなど）からも誘導され得
る。

【０１０３】ワクチンは、従来、非経口的に投与され、
その形態は、例えば、皮下または筋肉注射である。他の
投与形態に適したさらなる処方物には、坐剤があり、場
合によっては経口処方物を含む。坐剤には、従来のバイ
ンダーおよび担体は、例えば、ポリアルキレングリコー
ルまたはトリグリセリドを含み得る；このような坐剤
は、活性成分を含む混合物から０.５％〜１０％、好適
には１％〜２％の範囲で形成され得る。経口処方物に
は、通常用いられる賦形剤が含まれており、この賦形剤
には、例えば、薬学的なグレードのマンニトール、ラク
トース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカ
リンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどが
ある。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カ
プセル、徐放性処方物または粉末の形態をとり、そして
１０％〜９５％の、好適には２５％〜７０％の活性成分
を含む。

【０１０４】上記に加えて、ＨＣＶ抗原セットの組換え
ポリペプチドを発現する弱毒化微生物の生ワクチンを調
製することも可能である。適切な弱毒化微生物が、当該
分野で周知であり、例えばウイルス（例えば、ワクシニ
アウイルス）および細菌を含む。

【０１０５】ワクチンは、投薬処方と適合する様式で、
そして予防効果および／または治療効果が得られる量で
投与される。投与されるべき量は、一般的に１回の投与
当り抗原５μｇ〜２５０μｇの範囲であるが、処置され
る個体、この個体の免疫系が抗体を合成する能力、およ
び望まれる保護の程度に依存する。投与に必要とされる
活性成分の正確な量は、医師の判断によるものであり、
各個体に特有であり得る。

【０１０６】ワクチンは、１回の投与スケジュールで与
えられるか、または好適には複数回の投与スケジュール
で与えられ得る。複数投与スケジュールでは、最初のワ
クチン投与は、１〜１０回に分けて行われ、以後の投与
は引続き免疫応答を維持および／または増強するために
必要とされる時間間隔で行われ得る。例えば、２回目の
投与では１〜４ヵ月で行われ、そして必要であれば数カ
月後に引続き投与が行われ得る。投与法は、少なくとも
部分的には、個体の必要量よっても決定され、医師の判
断による。

【０１０７】さらに、上述のＨＣＶポリペプチドを含む
抗原セットを含むワクチンは、他の免疫制御剤、例えば
免疫グロブリンと共に投与され得る。

【０１０８】本発明の組成物は、個体に投与されて、多
数の用途に使用され得る（従来技術を用いて、血清から
精製または単離された）ポリクローナル抗体を生成し得
る。例えば、ポリクローナル抗体は、個体を受動免疫化
することに、または免疫化学試薬として用いられ得る。

【０１０９】本発明の他の実施態様では、複数のＨＣＶ
抗原セットを含む上記の免疫反応性組成物が、例えば血
液または血清試料を含む生物学的試料中の抗−ＨＣＶ抗
体を検出するために用いられる。イムノアッセイの設計
は、変化に富み、多様なものが当該分野で周知である。
しかしながら、イムノアッセイは抗原セットを用い、こ
こで各抗原セットは、ＨＣＶ単離体の第１可変ドメイン
中にエピトープのアミノ酸配列を含む複数の実質的に同
一のポリペプチドからなり、１セットのアミノ酸配列
は、少なくとも１つの他のセットのアミノ酸配列につい
て異質性である。イムノアッセイのプロトコルは、例え
ば、競合、または直接反応、またはサンドイッチ型アッ
セイに基づき得る。このプロトコルはまた、例えば、固
体支持体を使用し得、または免疫沈降法によるものであ
り得る。ほとんどのアッセイは、標識化抗体またはポリ
ペプチドの使用を含む；この標識は、例えば、蛍光性、
化学発光性、放射性、または染料分子であり得る。プロ
ーブからのシグナルを増幅するアッセイもまた知られて
いる；それらの例は、ビオチンおよびアビジンを利用す
るアッセイ、およびＥＬＩＳＡアッセイのような、酵素
標識されそして酵素に介されるイムノアッセイである。

【０１１０】免疫学的診断に適し、そして適切な標識試
薬を含むキットが、可変ドメイン由来のＨＣＶエピトー
プを含有する本発明の組成物を含む適切な材料を、アッ
セイの実施に必要とされる残りの試薬および材料（例え
ば、適当な緩衝液、塩類溶液など）および適当なアッセ
イの説明書のセットと共に、適当な容器中にパッケージ
することで構成される。

【０１１１】

【実施例】以下の記載は本発明の実施例であり、説明の
目的のためにだけ提供するもので、本発明の範囲を限定
するものではない。本開示を考えると、特許請求の範囲
内で非常に多数の実施例が当業者に明らかである。

【０１１２】実施例において、以下の材料および方法を
用いた。

【０１１３】（被験体試料およびＲＮＡの抽出）無症候
性のＨＣＶ保菌者であるＨＣＴ１８およびＨＣＶＪ１、
および慢性的に感染しているＨＣＶ被験体のＴｈは、Ｗ
ｅｉｎｅｒら（１９９１）Ｖｉｒｏｌ．１８０：８４２
−８４８中に、以前に記載されている。被験体Ｑは、肝
臓バイオプシーに基づいて、慢性活性肝炎であると診断
され、６ヶ月間、アルファ−２ｂインターフェロン治療
を施された（毎週３回、３百万単位）。製造者により示
されるように１０μｇ／ｍｌのＭＳ２保菌者ＲＮＡ（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，１６５−９４
８）を含むＲＮＡｚｏｌ^TMＢ試薬（Ｃｉｎｎａ／Ｂｉｏ
ｔｅｃｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてＣｈｏ
ｍｃｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（１９８７）Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９の方法に
従い、ＲＮＡを血漿０.２ｍｌから抽出した。ＲＮＡ
を、蒸留水で処理したジエチルピロカーボネート２００
μｌ中に再懸濁し、そして、最終濃度０.２Ｍの酢酸ナ
トリウムおよび２.５倍容量の１００％エタノール（−
２０℃）中で再沈澱させた。

【０１１４】（ｃＤＮＡおよびポリメラーゼー連鎖反
応）すべての反応を、Ｗｅｉｎｅｒら（１９９０）Ｌａ
ｎｃｅｔ ３３５：１−５に従い実施した。Ｍ１３配列
決定は、Ｍｅｓｓｉｎｇら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：２０−３７に
従い実施した。少なくとも４つのクローン化挿入フラグ
メントの共通配列が、２つのクローン由来のＨＣＶ Ｊ
１．２ Ｅ２／ＮＳ１配列を除いて与えられた。

【０１１５】ＨＣＴ１８およびＴｈのクローニングおよ
び配列決定を、上記のＷｅｉｎｅｒら（１９９１）の報
告の通りに行った。被験体ＱのＥ２／ＮＳ１のアミノ末
端セグメントおよびカルボキシ近位セグメントをクロー
ニングするために用いた組み込まれたＰＣＲプライマー
は以下であった：

【０１１６】

【化１】 ＨＣＶ Ｊｌ Ｅ２／ＮＳ１遺伝子をクローニングする
ために用いたＰＣＲプライマーは以下であった：

【０１１７】

【化２】 ＊は、Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：４６２６からのｎｔ配列であ
る；＊＊は、Ｋａｔｏら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｊｐ
ｎ．Ａｃａｄ．６５Ｂ：２１９−２２３からのｎｔ配列
である。センス（Ｓ）またはアンチセンス（Ａ）ＰＣＲ
プライマーを、参考文献中のヌクレオチド番号に従い、
５’から３’の向きに示した。

【０１１８】（ビオチン化ペプチドの合成）ＨＣＶの３
つの株の超可変領域に対する重複オクタペプチド（８ペ
プチド）を、切断可能なリンカー上で合成し、誘導し、
ポリエチレンのピンを、本質的にＭａｅｊｉら（１９９
０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １３４：２
３−３３による記載のように、各ペプチドのＮ−末端に
カップリングした。最後に、４０ｍＭのビオチン、４０
ｍＭの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢ
ｔ）、４０ｍＭのべンゾトリアゾール−１−イル−オキ
シ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロ
ホスフェート（ＰｙＢＯＰ，ＮＯＶＡＢＩＯＣＨＥＭ）
および６０ｍＭのＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）を含
む１５０μｌのジメチルホルムアミド溶液を用いて一晩
２０℃で反応させ、ビオチンをＮ−末端にカップリング
した。

【０１１９】ビオチン化の後、ペプチドの側鎖を脱保護
し、洗浄し、そして各ピンから得られるペプチドを、２
００μｌの０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.２）中で切断
した。切断ペプチド溶液を含むマイクロタイタープレー
トを、必要とされるまで−２０℃で貯蔵した。

【０１２０】（ビオチン化ペプチドのＥＬＩＳＡ試験）
ポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ ｉｍｍｕｎｏ ｐｌ
ａｔｅ ｍａｘｉｓｏｒｂ Ｆ９６）を、一晩４℃で、
０.１ｍｌ／ウェルの５μｇ／ｍ１ストレプトアビジン
（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｓ４７６２）溶液と共に、
ｐＨ９.６の０.１Ｍ炭酸緩衝液中でインキュベートする
ことにより、ストレプトアビジンでコートした。ストレ
プトアビジン溶液除去の後、ウェルを、ＰＢＳ中のＴｗ
ｅｅｎ２０の０.１％溶液で４回洗浄した。ＰＢＳ中
で、０.２ｍｌの２％ＢＳＡと共に１時間２０℃で、各
ウェルをインキュベートすることにより、非特異的結合
を遮断した。ウェルを、再びＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で
４回洗浄した。プレートを風乾し、要求されるまで、４
℃で貯蔵した。各ウェル中のストレプトアビジンを、
０.１％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中に０.１％の
ＢＳＡを伴う切断ペプチド溶液の１：１００希釈液１０
０μｌと、２０℃で１時間のインキュベートすることに
より、切断されたペプチドにカップリングした。インキ
ュベーションの後、プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２
０で４回洗浄した。各ウェルを、血清の適切な希釈液
（０.１％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中の２％Ｂ
ＳＡで希釈）１００μｌと共に、２０℃で１時間または
４℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ
２０で４回洗浄した。結合した抗体を、コンジュゲー
ト０.１ｍｌ中で、２０℃で１時間反応させることによ
り検出した。これは、ＣＡＳＳ（０.１ＭのＰＢＳ中に
希釈した０.１％ヒツジ血清、０.１％Ｔｗｅｅｎ ２
０、０.１％ナトリウムカゼイネート、ｐＨ７.２）中の
西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ
（Ｈ＋Ｌ）（Ｋｉｒｋｅ ｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒ
ｒｙ Ｌａｂｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）
０.２５ｍｌ／ｌ（飽和レベル）から構成されていた。
ウェルを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０で２回洗浄し、引
続きＰＢＳだけで２回洗浄した。酵素の存在は、１００
ｍｌの０.１Ｍリン酸／０.０８Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ
４.０中に５０ｍｇのアンモニウム２,２’−アジノ−ビ
ス［３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホネート
（ＡＢＴＳ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ
カタログ番号１２２６６１）および０.０３ｍｌの３
５％（ｗ／ｗ）過酸化水素溶液を含む０.１ｍｌの新た
に調製された溶液と、２０℃で４５分間反応させること
により検出した。発色を、Ｔｉｔｅｒｔｅｋ Ｍｕｌｔ
ｉｓｃａｎ ＭＣプレートリーダー中で、４９２ｎｍの
対照波長に対して４０５ｎｍのデュアル波長モードで測
定した。

【０１２１】（コンピューターで生成された抗原性プロ
フィール）ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１タンパク質およびＨＩ
Ｖ−１ ｇｐ１２０超可変領域Ｖ３（ａａ３０３−３３
８）に対する抗原性プロフィールを、Ｋａｂａｔ［免疫
学的に重要なタンパク質の配列、米国厚生省（Ｕ．Ｓ．
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ
Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、公共保健サービス
（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ）、国
立衛生研究所（１９８３）］により最初に提案されたよ
うにして、配列変異の程度に基づいて、コンピューター
プログラムから誘導した。この抗原性プロフィールを用
いて、各々の可能な対をなすアミノ酸に対して抗体結合
が保持される個々の確率の平均を乗じて免疫グロブリン
の超可変ループを同定した。与えられたアミノ酸の変化
に関連する抗体結合の保持の確率は、１０３個の特徴化
された線形エピトープに対するすべての可能なアミノ酸
置換基の抗体結合における効果を評価することにより、
実験的に決定される値であった。Ｇｅｙｓｅｎら（１９
８８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃ．１：３２−４１。このよう
にして、このアルゴリズムは、変異指数に加重価を与
え、抗体の結合に大きな影響があると考えられるアミノ
酸の変化により重みを与えた。すなわち、保存的なアミ
ノ酸の変化に対して補正を行った。１５のＨＣＶ配列
［ＨＣＶ−１，Ｑ３．２，ＨＣＴ２３，ＥＣ１０，ＨＣ
−Ｊ１，ＨＣＶＥ１，ＴＨ，ＨＣＴ２７，Ｑ１．２，Ｈ
ＣＴ１８，ＨＣ−Ｊ４，ＨＣＶ Ｊ１．２／ＨＣＶ Ｊ
１．１，ＨＣＶ Ｊ，ＨＣＶ ＢＫ］をＨＣＶに対する
抗原性プロフィールの測定に用いた。ＨＩＶ−１ Ｖ３
プロフィールを、ユニークＨＩＶ−１配列のより多数の
データベースからランダムに選択した１５配列の２４２
の個プロフィールを平均することで得た。ＬａＲｏｓａ
ら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：９３２−９３
５およびＣｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ
（１９９１）８１１頁。これらの単離体のいくつかのａ
ａ３８４と４２０との間のアミノ酸配列を図４〜６に示
す。

【０１２２】（コンピューターで生成される２次構造予
測）アミノ末端領域（３８４−４２０）がαヘリック
ス、βシート、βターン２次構造を含む確率は、３つの
上記２次構造特徴のそれぞれに対する確率を、各残基に
割り当てるアルゴリズムを用いて決定し得る。アルゴリ
ズムに用いられる係数は、構造データベースの残基のす
べての対合様式の組合せに対して得られた。Ｌｅｖｉｔ
ｔおよびＧｒｅｅｒ（１９７７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．１１４：１８１−２９３。これらの係数から得られ
た予想パラメーターは、与えられた残基が３つの定義さ
れた２次構造特徴の１つに見出される確率を得るために
アルゴリズムをデータベースに適応し直して、観察結果
と合致させた。

【０１２３】（実施例１） （ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１ ＨＶおよびＨＩＶ−１ ｇｐ
１２０ドメインの２次構造およびアミノ酸配列変異の比
較）１５のＨＣＶおよびＨＩＶ−１単離体由来のアミノ
酸配列を、ＨＣＶ Ｅ２ＨＶドメインまたはＨＩＶ−１
ｇｐ１２０ Ｖ３ドメイン中でアミノ酸配列の異質性
が観察された位置の数について比較した（それぞれ、図
７、ＡおよびＢ）。アミノ酸の異質性は、Ｅ２ ＨＶ領
域では３０のアミノ酸位置のうち２５の位置、そして、
ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０ Ｖ３ドメインでは３５のアミ
ノ酸位置のうち２３の位置で生じていた。図７Ａおよび
Ｂのｘ軸上のダッシュは、可変アミノ酸残基が生じるア
ミノ酸位置を表し、そして、非変異アミノ酸は１文字の
アミノ酸コードで示している。図７中に示された抗原性
プロフィールにより、ＨＩＶ−１ ＧＰ１２０タンパク
質のＶ３ループ（図７Ｂ）と同様に、ＨＣＶ Ｅ２中の
１ブロックのアミノ酸残基（図７Ａ中のアミノ酸３８４
−４１４）において、その変異は抗体結合における予想
通りの逆の効果を有することが認められたことが示され
る。図７中のデータにより、ＨＣＶ Ｅ２ドメインは、
ウイルス中和エピトープをコードすることで知られるＨ
ＩＶ−１ ｇｐ１２０ Ｖ３ドメインと、観察されたア
ミノ酸変異の程度および期待重みの両方において類似す
ることが示され、Ｅ２ ＨＶドメインは、ｇｐ１２０
Ｖ３ドメインと同様の機能を有し得ることが示唆され
る。

【０１２４】線形エピトープは、タンパク質（特にタン
パク質の末端）のあまり構造化されていない領域に、ま
たは伸長した表面ループに、より関連していると思われ
る。コンピューター分析を用いて、個々の残基が残基３
８４〜４２０間の１５のＥ２ＨＶアミノ酸配列について
の定義された２次構造特徴に関連する確率を予測した。
図７から、Ｅ２アミノ末端残基３８４と、非常に期待さ
れ顕著に保存されたβターン（残基４１５−４１８）と
の間の領域は、αヘリックス、βシート、βターンの確
率が５０％以下であることから示されるように、比較的
構造化されていないことが示される。Ｅ２ ＨＶドメイ
ン中の期待構造の欠如は、単離体間でみられる広範囲の
配列変異に対する許容性と一致し、タンパク質の３次元
的折り畳みに寄与する顕著に構造化された領域と対照的
である。Ｖ３は、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０の主要中和ドメ
インであり、β鎖−ＩＩ型βターン−β鎖−αヘリック
ス特徴を含むことが報告されており、アミノ酸の変異に
おいて、ＨＣＶ Ｅ２ＨＶドメインよりも強い構造的制
限を有し得る。ＨＣＶ Ｅ２ ＨＶドメインは、このＶ
３よりも構造化されていないようにさえ見える。まとめ
ると、この事実は、Ｅ２ ＨＶドメインが、線形中和エ
ピトープと考えられる部位を含むタンパク質ドメインに
特徴的な特性を有するように思われることを示唆する。

【０１２５】（実施例２） （ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１ ＨＶドメインのエピトープマ
ッピング）ＨＣＴ１８（Ａ，Ｄ）、Ｔｈ（Ｂ，Ｅ）およ
びＨＣＶ Ｊ１（Ｃ，Ｆ）のＥ２／ＮＳ１ ＨＶドメイ
ン（アミノ酸３８４〜４１６位）に対応し、そしてそれ
を越えて伸長する重複ビオチン化８量体ペプチドを、ス
トレプトアビジンでコートしたプレートに結合し、ＨＣ
Ｔ １８（Ａ−Ｃ）またはＴｈ（Ｄ−Ｆ）のいずれかに
由来の血漿と反応させた。ＨＣＶ単離体ＨＣＴ １８
（図９）、Ｔｈ（図１０）、およびＨＣＶＪ１（図１
１）についての結果を図９〜１１に示す。ＨＣＴ１８血
漿を１：２００に希釈し、Ｔｈ血漿を１：５００に希釈
した。ＨＶＥ−１、−２、−３、−４、および−５は単
離体に特異的なエピトープを示す。

【０１２６】図９〜１１から分かるように、ＨＣＴ １
８配列（図９Ａ中のＨＶＥ−Ｉ）から誘導されたペプチ
ドで試験すると、ＨＣＴ１８血漿は線形エピトープ（
⁴⁰⁷ＰＫＱＮＶ⁴¹¹）を同定したが、２つの異なる株Ｔｈ
およびＨＣＶＪ１のＨＶドメインに対応するペプチドと
は反応しなかった（図１０および１１）。対照的に、Ｔ
ｈ血漿は、ＴｈのＨＶドメイン中の線形エピトープＨＶ
Ｅ−ＩＶ（⁴⁰⁹ＱＮＩＱＬＩ⁴¹⁴、図１０）を同定し、そ
して株ＨＣＴ １８（³⁹⁹ＩＶＲＦＦＡＰ⁴⁰⁵、図９）お
よびＨＣＶ Ｊ１中のエピトープをもまた同定した。Ｉ
Ｖの薬剤の使用者であるＴｈは、ＨＣＶの複数の株に対
して感染可能状態に置かれ得た。

【０１２７】Ｔｈ血漿およびＨＣＴ １８血漿は両方と
も、ＥＬＩＳＡにおいて各単離体由来のピン合成された
重複８量体ペプチドと共に使用された場合、３つの単離
体すべてに共通なエピトープ（アミノ酸４１３−４１９
位）とそれぞれ反応した（データを示していない）。

【０１２８】抗体結合の特異性を確認するために、アミ
ノ酸４０３−４０７位を含むビオテン化ペプチドに結合
している抗体を評価し、これを用いて、ＨＣＴ １８血
漿の反応性を、ＨＣＴ １８ＨＶドメインに対する重複
８量体を含むピンで遮断した。これらのデータにより、
以下のことが示される：１）Ｅ２／ＮＳ１ ＨＶドメイ
ンが免疫原性であること、２）この領域をマップする複
数のエピトープがあること、そして、３）ＨＶドメイン
中のエピトープのサブセット（図９〜１１中のＨＶＥ−
１、−２、−３、−４または−５）が単離体特異的であ
ること。

【０１２９】（実施例３） （可変Ｅ２／ＮＳ１ ＨＶドメインが、肝炎の発赤と関
連し得ることの決定）慢性ＨＣＶ感染にしばしば見出さ
れる肝炎の間欠性発赤に関連するＨＣＶ変異体を発見す
る可能性を調べるために、慢性肝炎の被験体Ｑから、約
２年間隔の肝炎の２つの別個のエピソード（それぞれ、
Ｑ１およびＱ３）の際に得たＥ２／ＮＳ１遺伝子を部分
的に配列決定した。肝炎の第２のエピソードは、インタ
ーフェロン治療を終了して１年半後に起こった。

【０１３０】Ｑ１およびＱ３のＥ２／ＮＳ１領域の推定
アミノ酸配列の差異は、３９１−４０８の間でだけ著し
く異なっており、８つの変化のうち７つをアミノ酸３９
８と４０７との間に生じていた（図１２）。図１２は、
Ｑ１およびＱ３単離体のＥ２／ＮＳ１ポリペプチドの２
つの領域、つまりアミノ酸３８４−４１４および５４７
−６４７の推定アミノ酸配列を示す。Ｑ１配列上のアミ
ノ酸（Ｅ）が、４つのＱ１クローンのうちの１つに見出
された。ボックスで囲まれたアミノ酸は、ＱｌＨＶＥま
たはＱ３ ＨＶＥの１２量体ペプチドの位置を表す。Ｑ
１とＱ３との間に見出されるアミノ酸配列の相違は、太
字で示した。

【０１３１】Ｑ１およびＱ３のＥ２／ＮＳ１ポリペプチ
ドのアミノ酸５４７と６４７との間では、アミノ酸異質
性が１カ所でだけ観察された（図１２）。

【０１３２】Ｑ１およびＱ３のＥ２ ＨＶドメイン中に
観察されるアミノ酸置換の抗体結合における効果を調べ
るため、アミノ酸３９６から４０７（図１２のＨＶＥＱ
１またはＱ３）をもとにＱ１およびＱ３に特異的な１２
量体ペプチドを合成し、ＥＬＩＳＡにおいてＱ１および
Ｑ３の血漿と各ペプチドとを別々に反応させた。図７か
ら、Ｑ１およびＱ３の両血漿中の抗体は、Ｑ１ペプチド
と反応したが、Ｑ３ペプチドとは反応しないことが示さ
れる。統計解析（スチューデントの検定）により、Ｑ１
／Ｑ３血漿のＱ１ペプチドヘの結合は、これらの血漿の
ランダムに選択された１区画の１２の対照ペプチドに対
するバックグラウンド結合を有意に越えている（Ｐ＜
０.００１）ことが示されたが、一方Ｑ１またはＱ３の
血漿のＱ３ペプチドヘの結合は、統計上有意ではなかっ
た。このデータは、被験体Ｑは、ＨＣＶ Ｑｌ ＨＶド
メインに対する抗体を発生し、この抗体は、２年後のＱ
３時点でもまだ検出し得たが、検出し得る体液性応答
は、肝炎の第２のエピソードの間に優性であるＱ３ Ｅ
２ ＨＶ変異体に対して全く発生されなかったことを示
している。

【０１３３】

【表４】 （実施例４） （ＨＣＶ感染固体における異なるＥ２／ＮＳ１ ＨＶド
メインを伴う共存Ｅ２／ＮＳ１遺伝子の検出）図１３
は、日本人のボランティアの供血者ＨＣＶ Ｊ１の１つ
の漿試料からクローンニングしたＨＣＶ Ｊ１の２つの
単離体（Ｊ１．１およびＪ１．２）から推定されたアミ
ノ酸配列を示す。Ｋｕｂｏら（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓＲｅｓ．１７：１０３６７−１０３７２。ＨＣ
Ｖ Ｊ１．１とＨＣＶ Ｊ１．２との間の全部で２３の
アミノ酸の変化のうち、太字で示した９つの相違が、３
０のアミノ酸のＥ２／ＮＳ１ＨＶドメインに集中してい
る。Ｅ２／ＮＳ１ ＨＶドメイン中の９つのアミノ酸の
置換のうち５つは、非保存的アミノ酸変化を表す。ＨＣ
Ｖ Ｊ１は、本発明者らの実験室でクローニングされた
唯一のＩＩ群ＨＣＶゲノムであるため、これらの相違が
ＨＣＶ Ｊ１血漿の交叉汚染によるものではないと考え
られる。２つの別個のＰＣＲ反応から作製した７つのク
ローン化配列から、２つのＥ２／ＮＳｌＨＶ変異体配列
だけが同定されたので、ＨＣＶＪ１．２配列は、ＨＣＶ
Ｊ１の血液中の少数配列（ｍｉｎｏｒｉｔｙ ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ）を表す。

【０１３４】興味深いことに、ＨＣＴ２７単離体および
ＨＣＶ Ｅ１単離体は、これらは異なる実験室で配列決
定され、おそらく無関係な個体から得られたが、両者を
比較することにより、これらの単離体中のＥ２／ＮＳｌ
ＨＶドメイン中のアミノ酸の相違の数が、同一個体由来
の単離体の間で観察された相違の数より少ないことが示
された（図１４）。

【０１３５】上記の結果により、個体および個体群中で
ＨＣＶゲノムが急速に進化しているという示唆が導かれ
る。

【０１３６】（実施例５） （ワクチンの製剤と調製） （ジフテリアトキソイド担体タンパク質のＭＣＳへのカ
ップリング） （必要な材料） エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ Ｎａ₂・２Ｈ₂Ｏ）
（ＭＷ ３７２） ６−マレイミドヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（ＭＣＳ）（Ｓｉｇｍａ）−純度９５％ リン酸二水素一ナトリウム（ＮａＨ₂Ｐ０₄） 窒素 ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ） Ｍｉｌｌｉ Ｑ水 ５ｍＭ ＥＤＴＡ含有０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６.６
６） ０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８.０） ０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.０） コハク酸ナトリウム［（ＣＨ₂ＣＯＯＮａ）₂・６Ｈ
₂Ｏ］ システイン 塩酸（２％溶液） ０.１Ｍコハク酸ナトリウム／０.１ ＥＤＴＡ、ｐＨ
５.６ 精製されたジフテリアトキソイド（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａ
ｌｔｈ ＳｅｒｕｍＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｖｉｃ
ｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を、以下に記載の方
法によりＭＣＳにカップリングした：Ｌｅｅら（１９８
０）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏ１．１７：７４９；Ｐａｒｔ
ｉｓら（１９８３）Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．２：２６３；
Ｐｅｅｔｅｒｓら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ １２０：１３３；Ｊｏｎｅｓら（１９８
９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２３：２
１１。１００ｍｌのジフテリアトキソイドをＧ２５セフ
ァデックスカラム（１７ｃｍ×４ｃｍ）に通し、チオメ
ルサールを除去した。トキソイドを、０.１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７.０）で溶出し、溶出液のタンパク質容量
をＢＣＡタンパク質測定法（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてア
ッセイした。得られた溶液を、Ａｍｉｃｏｎ限外濾過ユ
ニットを用いて、最終濃度１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。

【０１３７】１ｍ１のトキソイド溶液を、０.１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ８.０）で透析し、次いで２００μｌＤ
ＭＦ中の１.５ｍｇ ＭＣＳの溶液と混合した。得られ
た溶液を、暗所において室温で１時間時々撹拝しながら
インキュベートした。ＭＣＳトキソイドからカップリン
グされていないＭＣＳを分離するため、溶液を、０.１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６.６６）で平衡化されたセファ
デックスＰＤ１０カラムに通過させ、タンパク質画分を
採集した。

【０１３８】カップリングされたマレイミド基の担体分
子当りの数を、そこにＨＣＶペプチドがカップリングす
る前に測定した。３０ｍｌのコハク酸／ＥＤＴＡ緩衝液
に窒素を２分間吹き込んだ。５ｍｇのシステインを、２
５ｍｌメスフラスコ中に移し、最終体積が２５ｍｌであ
る吹き込まれた緩衝液中に溶解した。表５中に示した溶
液の分量を、２連で、２５ｍｌスクリューキャップボト
ルに移した。別々のピペットを用いて、各分量中へ窒素
を通気した。次いで各ボトルを密封し、暗所において室
温で４０分間時々かきまぜながらインキュベートした。

【０１３９】

【表５】 ＊：３溶液のそれぞれの０.１ｍｌ分量を、エルマンの
測定法に用いるために採取した。

【０１４０】（スルフヒドリルの定量測定のためのエル
マン試験） （必要な材料） リン酸緩衝液、ｐＨ８.０ １５.６ｇのＮａＨ₂ＰＯ₄または１２.０ｇのＮａＨ₂Ｐ
Ｏ₄無水物を、約７００ｍｌのＭｉｌｌｉ Ｑ水に溶解
する。５０％ＮａＯＨを用いてｐＨを８.０に調節す
る。Ｍｉｌｌｉ Ｑ水を最終体積が１０００ｍｌになる
ように加え、次いで必要に応じてｐＨを調整する。 エルマン試薬 １０.０ｍｇの５,５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香
酸（ＤＴＮＢ）を、２.５ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ８.
０）中に溶解する。

【０１４１】０.１ｍｌのエルマン試薬を、上記のよう
に調製した溶液、すなわち試料、標準溶液、およびブラ
ンク溶液の０.１ｍｌ分量のそれぞれに加えた。次い
で、５ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ８.０）を、各分量に
加えてよく混合し、１５分間そのままおいた。各分量の
吸光度を１ｃｍ路長のセル中で４１２ｎｍで測定した。

【０１４２】担体タンパク質上に存在するマレイミド基
の数を、次の方法によって測定した。ｍｌ当り０.０１
μモルの−ＳＨの溶液は、１ｃｍ光路において４１２ｎ
ｍで０.１３６の吸光度を生じた。標準または試料
（Ａ）の吸光度は、活性化担体タンパク質上のカップリ
ングされたマレイミド基と反応したシステインの量と等
しかった。１モルの有効な−ＳＨが、１モルのマレイミ
ドと反応するので、試験された分量中に存在するマレイ
ミド基のμモルにおける濃度は、Ａ（０.０１）／０.１
３６μモル／ｍｌである。溶液の全体積は、５.２ｍｌ
であった。そのため、存在する総μモル数は、Ａ（０.
０１）（５.２）／０.１３６であった。試料溶液は、全
体積が１.３ｍｌであり、その内０.３ｍｌが活性化担体
タンパク質から構成された。試料溶液中に存在するマレ
イミド基の量は、Ａ（０.０１）（５.２）（１.３）／
（０.１３６）（０.１）（０.３）＝Ａ（１６.５７）μ
モル／ｍ１であると計算された。ＭＣＳ活性化担体タン
パク質は、−２０℃で貯蔵した。

【０１４３】（ＨＣＶペプチドの還元）ＨＣＶペプチド
をＭＣＳ活性化担体タンパク質にカップリングする前
に、ペプチドを還元し、ペプチド上に存在するチオール
基が完全に還元された−ＳＨ形であることを確実にし
た。

【０１４４】（必要な材料） ジチオトレイトール（ＤＴＴ） 炭酸水素アンモニウム（ＮＨ₄ＨＣＯ₃） メタノール ＳＥＰ−ＰＡＫｓ（Ｃ１８カートリッジ、水）、各８ｍ
ｇのペプチドに１カートリッジ ０.1Ｍ炭酸水素アンモニウム緩衝液 １Ｌ Ｍｉｌｌｉ Ｑ水中に７.９ｇのＮＨ₄ＨＣ０₃を
溶解 緩衝液Ａ、Ｍｉ１１ｉ Ｑ水中、０.１％Ｖ／Ｖトリフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ） 緩衝液Ｂ、Ｍｉｌｌｉ Ｑ水中、６０％Ｖ／Ｖアセトニ
トリル、０.１％Ｖ／ＶＴＦＡ ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４−４１１および
２２５−２６０にそれぞれ対応する２つの各ＨＣＶペプ
チド１５ｍｇを、１０倍過剰量のＤＴＴを含む２.５ｍ
１の０.１Ｍ炭酸水素アンモニウムに加えた。生成した
溶液をペプチドが溶解するまで撹拝し、次いで室温で１
時間そのままおいた。２対のＳＥＰ−ＰＡＫｓを連結
し、約２０ｍｌのメタノール、次いで２０ｍｌの緩衝液
Ａを各対のＳＥＰ−ＰＡＫｓに通すことにより活性化し
た。各ペプチド／ＤＴＴ試料を、ゆっくりと１対のＳＥ
Ｐ−ＰＡＫｓに通した。ＤＴＴを２０ｍｌの緩衝液Ａで
溶出した。還元されたペプチドを、７ｍｌの緩衝液Ｂで
事前に重さを量ったボトル中に溶出し、次いで一晩凍結
乾燥した。次いでこのボトルの重さを量り、回収された
ポリペプチドの量を測定した。次いで、還元されたペプ
チドを、ＭＣＳ活性化担体タンパク質に即座にカップリ
ングした。

【０１４５】（ＨＣＶペプチドのＭＣＳ活生ヒタンパク
ヘのカップリング）５ｍＭのＥＤＴＡを伴う約１００ｍ
１の０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６.６６）を、真空下で
脱気し、次いで１０分間窒素を吹き込んだ。ＭＣＳ活性
化担体タンパク質の１０ｍｇ／ｍｌ溶液２伽１に、過剰
の発泡を防ぐために窒素を注意深く吹き込んだ。各５ｍ
ｇの還元ペプチドを、約０.２ｍｌの脱気され吹き込ま
れたリン酸／ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ６.６６）中に溶解
し、次いでＭＣＳ活性化担体タンパク質溶液と混合し
た。得られた混合物を、スクリューキャップボトル中に
移し、次いで窒素を充満させ密封した。この溶液を、Ｂ
ｒａｎｓｏｎ ２０００ ^R音波処理バス中に２分間おい
てさらに脱気した。このボトルを、アルミホイルで被
い、振とうテーブル上で緩やかに撹拝しながら室温で一
晩インキュベートした。

【０１４６】得られたコンジュゲートは可溶性であり、
カップリングされなかったペプチドは、この混合物をリ
ン酸／ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ６.６６）で平衡化したセ
ファデックスＰＤ１０カラムに通すことにより除去し
た。タンパク質画分を採集した。担体タンパク質に結合
したペプチドの量を、アミノ酸分析により測定した。

【０１４７】コンジュゲートおよび担体タンパク質の両
方の１５０μ１分量のアミノ酸分析を行った。担体タン
パク質だけの寄与によるアミノ酸のレベルの平均割合を
測定し、生成した結合ペプチドの量を計算した。セリ
ン、スレオニン、トリプトファン、メチオニン、チロシ
ンおよびシステインは、標準加水分解条件下で改変され
るので、これらのアミノ酸のレベルは、測定されなかっ
た。これらの計算で得られた典型的な結果を、表６中に
示す。

【０１４８】

【表６】 コンジュゲートの太字の値は、ペプチド中にも存在して
いたアミノ酸である。アラニンおよびプロリンを含むコ
ンジュゲートについては、結果を標準化するために、因
子（１９３＋１７９＋１８０＋５６）／（２１２）＋１
９４＋１５３＋６０＝０.８６５９に、アミノ酸レベル
の量を掛けてある。

【０１４９】（ワクチン組成物の調製）注射組成物は、
上記のように調製されたＭＣＳ活性化ジフテリアトキソ
イド担体タンパク質に結合したＨＣＶペプチド、および
本明細書中に参考として援用された１９９０年１２月１
３日に公開されたＰＣＴ国際公開番号第Ｗ０９０４８３
７号に記載のサブミクロンの水中油乳化型アジュバント
を構成成分とした。さらに、ＨＣＶ結合ペプチドおよび
アジュバントに加え、免疫賦活剤である親油性ムラミル
ペプチド（ＭＴＰ−ＰＥ、ＣＩＢＡ−ＧＥＩＧＹ、Ｂａ
ｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含む注射組成物を
調製した。ワクチン組成物は、一般的に５０％のタンパ
ク質および５％の免疫賦活剤から構成された。

【０１５０】（ＭＴＰ−ＰＥを含むワクチン組成物の処
方） 注射ワクチン組成物１０ｍｌの調製： ２.５ｍｌのスクアレン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．） ０.２５ｍｌ Ｔｗｅｅｎ ８０（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｃｏ．） ０.２５ｍｌ ＳＰＡＮ ８５（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏ．） １０００μｇ ＭＴＰ−ＰＥ １０００μｇ ＭＣＳ−活性化ジフテリアトキソイド担
体タンパク質に結合したＨＣＶペプチド （ＭＴＰ−ＰＥを含まないワクチン組成物の処方箋） 注射ワクチン組成物１０ｍｌの調製： ２.５ｍｌのスクアレン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．） ０.２５ｍｌ Ｔｅｅｎ ８０（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏ．） ０.２５ｍｌ ＳＰＡＮ ８５（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏ．） １０００μｇ ＭＣＳ−活性化ジフテリアトキソイド担
体タンパク質に結合したＨＣＶペプチド （実施例６） （ワクチン調製物の毒性についての試験方法）実施例５
の方法により調製したワクチンを、毒性について小動物
で試験した。１ｋｇ当り５０μｇのワクチンを、モルモ
ット、マウスおよびウサギに腹腔内注射して投与した。
アカゲザルおよび霊長類にも、腹腔内注射によりワクチ
ンを投与した。アカゲザルおよび霊長類の試験個体群の
半数には、５μｇ／ｋｇで投与したが、一方他の半数に
は、５０μｇ／ｋｇで投与した。各研究で用いた対照動
物には、ウイルスペプチドを含まないワクチン調製物の
成分からなる同等量の組成物を注射した。

【０１５１】実施例５の方法により調製したワクチン
を、毒性について小動物で試験した。１ｋｇ当り５０μ
ｇのワクチンを、モルモット、マウスおよびウサギに腹
腔内注射して投与した。アカゲザルおよび霊長類にも、
腹腔内注射によりワクチンを投与した。アカゲザルおよ
び霊長類の試験個体群の半数には、５μｇ／ｋｇで投与
したが、一方他の半数には、５０μｇ／ｋｇで投与し
た。各研究で用いた対照動物には、ウイルスペプチドを
含まないワクチン調製物の成分からなる同等量の組成物
を注射した。

【０１５２】（実施例７） （ワクチンにおける投与動物における中和抗体の産生の
証明）実施例５の方法により調製したワクチンを、ワク
チン投与した被験体におけるウイルス中和抗体の産生を
誘起するワクチンの効果を測定するために、チンパンジ
ーで試験した。チンパンジーに、実施例５の方法により
調製したワクチンを５μｇ／ｋｇの投与量で、６ヵ月の
期間にわたり０、１、３、および６カ月の間隔をおいて
投与した。対照のチンパンジーには、ウイルスペプチド
を含まないワクチンの成分からなる同等量の組成物を注
射した。最後のワクチン投与を行ってから２週間後、試
験および対照の各チンパンジーに、１０ ＣＩＵ₅₀（チ
ンパンジー感染単位）の投与量のＣＤＣ／９１０血漿接
種材料で刺激した。ウイルス刺激の１週間後から始め
て、各チンパンジーを、ウイルス血症について毎週ベー
スでモニターした。

【０１５３】ウイルス血症を検出するために、血液試料
および肝臓バイオプシー標本を、数ヵ月間毎週ベース
で、対照および試験動物から採取した。肝臓バイオプシ
ーにより採取された組織を、壊死および／または炎症の
徴候について組織学的に検査した。さらに、バイオプシ
ー材料由来の肝細胞を、ＨＣＶ感染に特有の細管の存在
について電子顕微鏡で検査した。血液試料はまた、ワク
チンの調製に使用されなかったウイルスポリペプチドの
セグメントに対する抗体の存在について、上記のＥＬＩ
ＳＡアッセイによっても分析された。特に、各血液試料
を、ＮＳ₃、ＮＳ₄、およびＮＳ₅ペプチドに対する抗体
の存在について、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングし
た。チンパンジーの血清中におけるこれらのペプチドに
対する抗体の存在は、ＨＣＶ感染を示した。

【０１５４】以下の方法を用いて、チンパンジーから採
取した血漿中に循環するまたは肝臓バイオプシー組織中
に存在するウイルスＲＮＡを検出した。

【０１５５】（肝臓および血清中のＨＣＶ ＲＮＡを検
出するｃＰＣＲ法）ｃＰＣＲアッセイにおいて、試料中
の推定ウイルスＲＮＡを、逆転写酵素でｃＤＮＡに逆転
写し、次いで、得られたｃＤＮＡのセグメントを、Ｓａ
ｉｋｉら（１９８６）により記載のＰＣＲ技術の改変法
を用いて増幅する。ｃＰＣＲ法に用いるプライマーは、
ＨＣＶ ＲＮＡから誘導する。これは本明細書で提供さ
れるＨＣＶ ｃＤＮＡのファミリーにより同定され得
る。ＨＣＶ−ＲＮＡに対応する増幅生成物を、本明細書
で提供されるＨＣＶ ｃＤＮＡのファミリーから誘導さ
れるプローブを使用して検出する。

【０１５６】これらの研究に用いたｃＰＣＲ／ＨＣＶア
ッセイは、ＲＮＡの調製、ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転
写、ＰＣＲによるｃＤＮＡの特異的セグメントの増幅、
およびＰＣＲ生成物の分析のための以下の方法を使用し
て実施した。

【０１５７】全ＲＮＡを調製するために、Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら（１９８２）に記載のグアニジウムイソチオシア
ネート法を使用して、ＲＮＡを肝臓から抽出した。

【０１５８】全ＲＮＡを血漿から単離するために、血漿
をＴＥＮＢ（０.１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃ１（ｐＨ８.０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で５〜１０倍
に希釈し、そして、プロティナーゼＫ／ＳＤＳ溶液
（０.５％ＳＤＳ、１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、２
０マイクログラム／ｍｌポリＡ担体）中で６０〜９０分
間３７℃でインキュベートした。試料を、フェノール
（ｐＨ６.５）で１回抽出し、得られた有機相を０.１％
ＳＤＳ含有ＴＥＮＢで再び１回抽出し、そして、両抽出
の水相をプールして、同体積のフェノール／ＣＨＣｌ₃
／イソアミルアルコール［１：１（９９：１）］で２回
抽出した。得られた水相を、同体積のＣＨＣｌ₃／イソ
アミルアルコール（９９：１）で２回抽出し、そして、
０.２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６.５）、および２.５倍
容量の１００％エタノールを用いてエタノール沈澱し
た；沈澱は、−２０℃で一晩行った。

【０１５９】ＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した
ｃＤＮＡは、対応するｃＤＮＡの調製のために選抜され
た試料を使用して調製した。各ＲＮＡ試料（２マイクロ
グラムのチンパンジー肝臓の熱変性全ＲＮＡまたは２マ
イクロリットルの血漿から得たＲＮＡを含む）を、１マ
イクロモルの各プライマー、１ミリリットルの各デオキ
シリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、５０ミリモ
ルのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.３）、５ミリモルのＭｇ
Ｃｌ₂、５ミリモルのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、
７３ミリモルのＫＣｌ、４０単位のＲＮアーゼインヒビ
ター（ＲＮＡＳＩＮ）、および５単位のＡＭＶ逆転写酵
素を含む２５マイクロリットル反応物中でインキュベー
トした。このインキュベーションは、３７℃で６０分間
行った。ｃＤＮＡ合成に続いて、反応物を５０マイクロ
リットルの脱イオン水（ＤＩＷ）で希釈し、１０分間沸
騰し、氷上で冷却した。

【０１６０】ＨＣＶ ｃＤＮＡのセグメントの増幅は、
それらの配列がＨＣＶ ｃＤＮＡクローン３６（アンチ
−センス）および３７ｂ（センス）から誘導される２つ
の合成オリゴマー１６量体プライマーを使用して実施し
た。クローン３６由来のプライマーの配列は以下であっ
た：

【０１６１】

【化３】 クローン３７ｂ由来のプライマーの配列は以下であっ
た：

【０１６２】

【化４】 各プライマーは、最終濃度１マイクロモルで用いた。プ
ライマーに隣接するＨＣＶ ｃＤＮＡのセグメントを増
幅するために、ｃＤＮＡ試料を、０.１マイクログラム
のＲＮアーゼＡおよびＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅ
ｔｕｓ ＰＣＲキット（Ｎ８０１−００４３またはＮ８
０１−００５５）のＰＣＲ反応物を用いて、製造者の指
示に従ってインキュベートした。ＰＣＲ反応は、Ｐｅｒ
ｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ ＤＮＡ熱サイクラー
で、３０サイクルまたは６０サイクルいずれかで実施し
た。各サイクルは、９４℃１分での変性段階、３７℃２
分でのアニーリング段階、および７２℃３分での伸長段
階で構成された。しかしながら、最終サイクル（３０ま
たは６０）における伸長段階は、３分ではなく７分であ
った。増幅後、試料を同体積のフェノール：クロロホル
ム（１：１）で抽出し、次いで同体積のクロロホルムで
抽出し、次いで試料を０.２Ｍの酢酸ナトリウム含有エ
タノールで沈澱させた。

【０１６３】ｃＰＣＲ生成物を、次のようにして分析し
た。生成物を、Ｍｕｒａｋａｗａら（１９８８）に従っ
て１.８％アルカリ性アガロースゲル電気泳動にかけ、
そして、０.４ＭのＮａＯＨ中でゲルを一晩ブロッティ
ングすることにより、ＺＥＴＡ^TMＰｒｏｂｅ紙（Ｂｉｏ
Ｒａｄ Ｃｏｒｐ．）上に移した。ブロットを、２×Ｓ
ＳＣ（１×ＳＳＣは、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、０.０１５
Ｍのクエン酸ナトリウム）中で中和し、０.３ＭのＮａ
Ｃｌ、１５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.
８、１５ｍＭのＥＤＴＡ、１.０％のＳＤＳ、０.５％の
脱脂乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ Ｃｏ．）、および０.５
ｍｇ／ｍｌの超音波処理され変性されたサケ精子ＤＮＡ
中でプレハイブリダイズした。ＨＣＶｃＤＮＡフラグメ
ントについて分析すべきブロットを、米国出願番号０７
／４５６,６３７に記載のクローン３５のＨＣＶ ｃＤ
ＮＡ挿入配列のニックトランスレーションにより生成さ
れた ³²標識化プローブに、ハイブリダイズした。ハイブ
リダイゼーションの後、ブロットを１×ＳＳＣ（１×Ｓ
ＳＣは、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、０.０１Ｍのクエン酸ナ
トリウム）中で６５℃で洗浄し、乾燥し、そしてオート
ラジオグラフを記録した。生成物の期待サイズは、５８
６ヌクレオチド長である；プローブとハイブリダイズさ
れて、このサイズの範囲でゲル中を移動した生成物は、
ウイルスＲＮＡについて陽性であると評価された。

【０１６４】分析される各試料中のＲＮＡの存在を立証
するために、対照として、アルファ−１抗トリプシンｍ
ＲＮＡを増幅するために設計されたｃＰＣＲプライマー
を用いるｃＰＣＲを実施した。アルファ−１抗トリプシ
ン遺伝子のコード領域は、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９
８４）中に記載されている。アルファ−抗トリプシン遺
伝子のコード領域の３６５ヌクレオチドのフラグメント
を増幅するために設計された合成オリゴマー１６量体プ
ライマーを、ヌクレオチド２２−３７位（センス）およ
びヌクレオチド３７２−３８７位（アンチセンス）から
誘導した。ｃＤＮＡ／ＰＣＲプライマー配列の間にある
がそれを含まない³²Ｐニックトランスレーションプロー
ブを用いて、ＰＣＲ生成物を検出した。

【０１６５】ＰＣＲ反応の極感受性のため、すべての試
料を少なくとも３回試みた。次の予防措置を取ってあら
ゆる偽陽性シグナルを取り除いた：１）Ｏ−リングゴム
栓を有するスクリューキャップ管を用いてエアロゾルを
除去；２）ディスポーザブルピストン／キャピラリーを
有するＲａｎｉｎ ＭＩＣＲＯＭＡＮ^Rの陽圧ピペッタ
ー（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｐ
ｉｐｅｔｔｅｒｓ）でピペッティング；および３）２つ
の非連続的ｃＤＮＡクローンからのｃＤＮＡおよびＰＣ
Ｒプライマーに対するオリゴヌクレオチド配列の選択。

【０１６６】（産業上の利用可能性）本発明の免疫反応
性組成物は、例えば、ＨＣＶ感染、特に慢性ＨＣＶ感染
に対する個体の処置にも使用し得るワクチンのような材
料の調製において有用である。さらに、この組成物は、
生物学的試料におけるＨＣＶの多数の変異体の検出に用
いる材料を調製するために使用し得る。例えば、本発明
の免疫反応性組成物は、１つ以上のＨＣＶ単離体を認識
するポリクローナル抗体組成物を生成するために使用さ
れ得、または抗ＨＣＶ抗体イムノアッセイの抗原として
使用され得る。後者の方法は、血液生成物をＨＣＶ汚染
の可能性についてスクリーニングするために使用され得
る。ポリクローナル抗血清または抗体は、個体の受動免
疫のために使用され得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＨＣＶゲノムの遺伝学的な構築を模式
図的に示す。

【図２】図２は、Ｉ群およびＩＩ群のＨＣＶ単離体によ
ってコードされるＥ１タンパク質の推定アミノ酸配列の
比較を示す。

【図３】図３は図２の続きである。

【図４】図４は、ＨＣＶ単離体の推定Ｅ２／ＮＳ１領域
のアミノ酸配列の比較を示す。

【図５】図５は図４の続きである。

【図６】図６は図５の続きである。

【図７】図７は、推定ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１タンパク質
（アミノ酸３８４−４２０位）のアミノ末端領域、およ
びＨＩＶ−１のｇｐ１２０ Ｖ３超可変領域に関する抗
原性プロフィールを示すグラフである。

【図８】図８は、ＨＣＶ Ｅ２／ＮＳ１タンパク質（ア
ミノ酸３８４−４２０位）のアミノ末端領域由来の所定
の残基が、α−ヘリックス、β−シートまたはβ−ター
ンのいずれかの二次構造的特徴において見い出される確
率の百分率を表す一連のグラフを示す。

【図９】図９は、ＨＣＶ １８（パネルＡ）またはＴｈ
（パネルＤ）由来の血漿中の抗体と、ＨＣＶ単離体ＨＣ
Ｔ １８の３８４から４１５または４１６までのアミノ
酸から誘導される部分的に重複するビオチニル化８量体
ペプチドとの反応性を表す棒グラフである。

【図１０】図１０は、ＨＣＶ １８（パネルＢ）または
Ｔｈ（パネルＥ）由来の血漿中の抗体と、ＨＣＶ単離体
Ｔｈの３８４から４１５または４１６までのアミノ酸か
ら誘導される部分的に重複するビオチニル化８量体ペプ
チドとの反応性を表す棒グラフである。

【図１１】図１１は、ＨＣＶ １８（パネルＣ）または
Ｔｈ（パネルＦ）由来の血漿中の抗体と、ＨＣＶ単離体
ＨＣＶ Ｊ１の３８４から４１５または４１６までのア
ミノ酸から誘導される部分的に重複するビオチニル化８
量体ペプチドとの反応性を表す棒グラフである。

【図１２】図１２は、Ｑ１およびＱ３の単離体に対して
与えられたＥ２／ＮＳ１ポリペプチドの２つの領域の推
定アミノ酸配列、すなわち３８４−４１４位のアミノ酸
および５４７−６４７位のアミノ酸を示す。

【図１３】図１３は、単離体ＨＣＶ Ｊ１．１およびＪ
１．２の推定アミノ酸配列の３８４位から６４７位のア
ミノ酸を示す。

【図１４】図１４は、単離体ＨＣＴ２７およびＨＣＶＥ
１の推定アミノ酸配列の３８４位から６５１位のアミノ
酸を示す。

【図１５】図１５は、単離体ＨＣＶ−１の完全ポリタン
パク質配列を示す。

【図１６】図１６は図１５の続きである。

【図１７】図１７は図１６の続きである。

【図１８】図１８は図１７の続きである。

【図１９】図１９は図１８の続きである。

【図２０】図２０は図１９の続きである。

【図２１】図２１は図２０の続きである。

【図２２】図２２は図２１の続きである。

【図２３】図２３は図２２の続きである。

【図２４】図２４は図２３の続きである。

【図２５】図２５は図２４の続きである。

【図２６】図２６は図２５の続きである。

【図２７】図２７は図２６の続きである。

【図２８】図２８は図２７の続きである。

【図２９】図２９は図２８の続きである。

【図３０】図３０は図２９の続きである。

【図３１】図３１は図３０の続きである。

【図３２】図３２は図３１の続きである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/09 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/576 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/576 5/00 Ａ (72)発明者 マイケル ヒュートン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94526, ダンヴィル，ローズミード コート 53 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA14 BA33 BA80 CA03 DA01 DA02 DA05 DA11 EA04 GA11 HA01 4B064 AG33 CA19 CC24 4B065 AA01X AA57X AA87X AA96Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA45 CA46 4C085 AA03 BA92 CC08 CC21 DD88 EE03 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA02 DA86 EA31 EA50 FA72 FA74

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも２つのＣ型肝炎ウイルス（Ｈ
   ＣＶ）アミノ酸配列を含む免疫反応性ポリペプチド組成
   物であって、各アミノ酸配列が、ＨＣＶエンベロープポ
   リペプチドの可変ドメイン中に存在する少なくとも１つ
   のエピトープを含有し、ここで、該可変ドメインのアミ
   ノ酸配列が互いに異質性であり、別個のＨＣＶ単離体由
   来であり、そして各アミノ酸配列は全長のエンベロープ
   タンパク質より長くない、組成物。
2. 【請求項２】 複数の抗原のセットを含有する請求項１
   に記載の免疫反応性組成物であって、ここで、（ａ）各
   抗原のセットが、ＨＣＶエンベロープポリペプチドの可
   変ドメイン中に存在する少なくとも１つのエピトープを
   含有する複数の同一配列からなり、そして（ｂ）１つの
   セットの該エピトープのアミノ酸配列が、少なくとも１
   つの他のセットのアミノ酸配列に関して異質性である、
   免疫反応性組成物。
3. 【請求項３】 前記別個のHCV単離体が、ＨＣＶ Ｉ群
   単離体およびＨＣＶＩＩ群単離体を含む、請求項１に記
   載の免疫反応性組成物。
4. 【請求項４】 前記可変ドメインが、Ｅ２／ＮＳ１タン
   パク質中に存在する、請求項１に記載の免疫反応性組成
   物。
5. 【請求項５】 前記可変ドメインが、Ｅ１タンパク質中
   に存在する、請求項１に記載の免疫反応性組成物。
6. 【請求項６】 各アミノ酸配列が、ＨＣＶエンベロープ
   ポリペプチドの第二の可変ドメイン中に存在するエピト
   ープをさらに含有し、ここで、アミノ酸配列の第二の可
   変ドメインが互いに異質性であり、そして別個のＨＣＶ
   単離体由来である、請求項１に記載の免疫反応性組成
   物。
7. 【請求項７】 前記第一の可変ドメインが、Ｅ２／ＮＳ
   １タンパク質中に存在し、そして前記第二の可変ドメイ
   ンが、Ｅ１タンパク質中に存在する、請求項６に記載の
   免疫反応性組成物。
8. 【請求項８】 免疫反応性組成物を調製する方法であっ
   て： （ａ）請求項１から７のいずれかに記載の免疫反応性ポ
   リペプチド組成物を形成する工程； （ｂ）適切な賦形剤を提供する工程；および （ｃ）(ａ)の免疫反応性組成物と(ｂ)の賦形剤とを混合
   する工程を包含する、方法。
9. 【請求項９】 請求項１から７のいずれかに記載の免疫
   反応性ポリペプチド組成物の有効量を非ヒト哺乳動物に
   投与する工程を包含する、抗ＨＣＶ抗体を産生する方
   法。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載の方法によって製造さ
    れる、ポリクローナル抗体組成物。
11. 【請求項１１】 ＨＣＶに対するヒト抗体の存在または
    非存在を検出するためのインビトロ検出方法であって：
    HCVに対する抗体を含有すると推測される生物学的試料
    と、請求項１に記載の免疫反応性ポリペプチド組成物と
    を、該ポリペプチド組成物と該生物学的試料中の抗体と
    が抗原−抗体複合体を形成するに十分な時間および条件
    下で接触させる工程；および該免疫反応性ポリペプチド
    を含有する抗原−抗体複合体の形成を検出する工程を包
    含する、方法。
12. 【請求項１２】 前記免疫反応性ポリペプチド組成物
    が、請求項２に規定された組成物である、請求項１１に
    記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記免疫反応性ポリペプチド組成物
    が、請求項３に規定された組成物である、請求項１１ま
    たは１２のいずれかに記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記可変ドメインが、ＨＣＶゲノムの
    Ｅ１およびＥ２／ＮＳ１ドメインからなる群より選択さ
    れる、請求項１１または１２のいずれかに記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記可変ドメインが、ＨＣＶゲノムの
    Ｅ１ドメイン由来である、請求項１４に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記可変ドメインが、ＨＣＶゲノムの
    Ｅ２／ＮＳ１ドメイン由来である、請求項１４に記載の
    方法。
17. 【請求項１７】 請求項１に記載の免疫反応性ポリペプ
    チド組成物を含有する、生物学的試料中のＨＣＶに対す
    る複数の抗体を検出するためのキットであって、ここ
    で、該組成物が適切な容器中にパッケージされている、
    キット。
18. 【請求項１８】 少なくとも２つのＨＣＶアミノ酸配列
    を含む免疫反応性ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子
    であって、各アミノ酸配列が、ＨＣＶエンベロープポリ
    ペプチドの可変ドメイン中に存在する少なくとも１つの
    エピトープを含有し、ここで、該可変ドメインのアミノ
    酸配列が互いに異質性であり、別個のHCV単離体由来で
    ある、ＤＮＡ分子。
19. 【請求項１９】 請求項１８に記載のDNA分子を含む、
    宿主細胞。
20. 【請求項２０】 前記ＤＮＡ分子が、前記ポリペプチド
    の発現を引き起こし得る制御配列を含む、請求項１９に
    記載の宿主細胞。
21. 【請求項２１】 前記ポリペプチドの発現を提供する条
    件下で、請求項２０に記載の宿主細胞群を増殖させる工
    程を包含する、組換えタンパク質を製造する方法。