PL166534B1 - Sposób wytwarzania bialka PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania bialka wykazujacego jedna lub szereg decydujacych funkcji natu- ralnie wystepujacej lipazy stym ulowanej solam i kwasów zólciowych o sekwencji aminokwasów przedstawionej na fig. 7, znamienny tym, ze wstawia sie sekwencje nukleotydow a przedstaw iona na fig. 2 lub jej czesc do w ektora zawierajacego odpowiednia sekwencje nukleotydow a ukierun- kowujaca organizm gospodarza na ekspresje pozadanego bialka, wstawia sie tak otrzym any w ektor do organizm u gospodarza, wybranego z grupy obejmujacej bakterie, drozdze, hodowle kom órek zwierzecych i zwierzeta transgeniczne, hoduje sie otrzym any organizm gospodarza i wyodrebnia sie bialko. PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania białka wykazującego jedną lub szereg decydujących funkcji naturalnie występującej lipazy, stymulowanej solami kwasów żółciowych, o sekwencji aminokwasów przedstawionej na fig. 7. W sposobie tym wykorzystuje się nowe sekwencje DNA uzyskując nowe białka kodowane przez te sekwencje. Ponadto w sposobie według

166 534 wynalazku stosuje się wektory, takie jak produkty konstrukcji plazmidów, zawierające te sekwencje DNA, zdolne do ekspresji pożądanego enzymu. W sposobie według wynalazku stosuje się także organizmy-gospodarze transfekowane takimi produktami konstrukcji, np. bakterie, drożdże, komórki ssaków i zwierzęta transgeniczne. Nowe białka wytwarzane sposobem według wynalazku są spokrewnione z enzymem znanym, między innymi, jako ludzka lipaza stymulowana solami kwasów żółciowych.

Ludzki wydzielający mleko gruczoł sutkowy syntetyzuje i wydziela z mlekiem lipazę stymulowaną solami kwasów żółciowych (BSSL) [1], która po swoistej aktywacji przez pierwszorzędowe sole kwasów żółciowych [2, 57, 58] udziela niemowlęciu karmionemu piersią endogenną zdolność jelitowego trawienia tłuszczów [3-5]. Enzym ten, którego ilość wynosi około 1% całkowitego białka mleka [6] nie jest enzymem działającym wybiórczo; in vitro hydrolizuje on nie tylko tri-, di- i monoacyloglicerole, ale także estry cholesterolu i retinolu oraz lizofosfatydyloglicerole[7-10]. Poza tym, jego aktywność nie ogranicza się tylko do substratów zemulgowanych. Z podobną szybkością ulegają hydrolizie także substraty micelarne i rozpuszczalne [11].

BSSL nie ulega rozkładowi w trakcie przechodzenia z mlekiem przez żołądek, a w treści dwunastnicy chroniona jest przez sole kwasów żółciowych przed inaktywacją przez proteazy trzustkowe, takie jak trypsyna i chymotrypsyna[2,11], Enzym ten,jednakże, ulega inaktywacji w przypadku poddania mleka pasteryzacji, to znaczy ogrzewaniu do temperatury 62,5°C w ciągu 30 minut [12]. Wyniki in vitro eksperymentów modelowych sugerują, że produkty końcowe trawienia triacyloglicerolu są różne w przypadku obecności BSSL [5, 7], Dzięki niższemu stężeniu soli kwasów żółciowych wewnątrz światła przewodu w okresie noworodkowym [13,14] może to okazać się korzystne jeśli chodzi o wchłanianie produktu [5, 15].

Hydrolaza estrów karboksylowych (CEH) z ludzkiego soku trzustkowego [16] wydaje się być funkcjonalnie identyczna z BSSL, lub co najmniej bardzo do niej podobna [8]. Mają one także wspólne epitopy [8, 17], posiadają identyczne N-końcowe sekwencje aminokwasów [17] i hamowane są przez inhibitory esteraz serynowych, np. przez eserynę i fluorofosforan diizopropylu [6,8, 16]. Przypuszcza się, że te dwa enzymy są produktami tego samego genu [18,19]. Zaobserwowaną różnicę wielkości cząsteczek [8,19] można wytłumaczyć różnymi schematami glikozylacji, jak się to obecnie sugeruje [17].

Lipidy jadalne są ważnym źródłem energii. Ponad 95% tych lipidów stanowią wysokoenergetyczne triacyloglicerole. Niektóre z tych lipidów, np. pewne kwasy tłuszczowe i rozpuszczalne w tłuszczach witaminy są niezbędnymi składnikami pożywienia. Przed wchłonięciem żołądkowojelitowym, zarówno triacyloglicerole jak i składniki drobniejsze, to znaczy zestryfikowane witaminy rozpuszczalne w tłuszczach i cholesterol oraz diacylofosfatydyloglicerole, wymagają zhydrolizowania wiązań estrowych, co powoduje tworzenie mniej hydrofobowych, wchłanialnych produktów. Reakcje te katalizowane są przez specyficzną grupę enzymów zwanych lipazami.

W przypadku człowieka dorosłego, niezbędne lipazy tu zaangażowane, jak się uważa, to lipaza żołądkowa, lipaza trzustkowa kolipazozależna (hydroliza tri- i diacyloglicerolu), trzustkowa fosfolipaza A2 (diacylofosfatydyloglicerole) i hydrolaza estrów karboksylowych (estry cholesterolu i witamin rozpuszczalnych w tłuszczach). W przypadku noworodka karmionego piersią lipaza stymulowana solami kwasów żółciowych odgrywa istotną rolę w hydrolizie szeregu wyżej wspomnianych lipidów. Razem z solami kwasów tłuszczowych produkty trawienia tłuszczów tworzą mieszane micele, z których odbywa się wchłanianie (3-5).

Pospolitą przyczyną złego wchłaniania tłuszczem, a stąd niedożywienia, jest obniżony poziom trzustkowej kolipazozależnej lipazy i/lub soli kwasów żółciowych wewnątrz światła przewodu. Typowymi przykładami takiego niedoboru lipazy są pacjenci cierpiący na zwyrodnienie torbielowate, zwykłe zaburzenie genetyczne prowadzące do długotrwałego niedoboru u mniej więcej 80% pacjentów oraz cierpiący na przewlekłe zapalenie trzustki, często wynikające z alkoholizmu przewlekłego.

Funkcje trzustki i wątroby nie są w pełni rozwinięte przy urodzeniu, szczególnie u dzieci urodzonych przedwcześnie. Często się stwierdza złe wchłanianie tłuszczów, z przyczyn fizjologicznych, i sądzi się, że jest to wynikiem niskiego stężenia trzustkowej kolipazozależnej lipazy i soli kwasów żółciowych wewnątrz światła przewodu (3,4, 13-15). Jednakże, dzięki BSSL, tego rodzaju

166 534 złe wchłanianie występuje rzadziej u niemowląt karmionych piersią, aniżeli u niemowląt karmionych mlekiem kobiecym pasteryzowanym z preparatów dla niemowląt (3 - 5, 12, 59, 60, 61). Stanowi to jeden z powodów, dla których zaleca się karmienie noworodków, zwłaszcza przedwcześnie urodzonych, które nie mogą być karmione mlekiem ich własnych matek, nie pasteryzowanym mlekiem innych matek (12).

Obecny sposób leczenia pacjentów cierpiących na niedobór lipazy trzustkowej polega na doustnym podawaniu, w bardzo dużych ilościach, surowego preparatu świńskich enzymów trzustkowych. Kolipazezależna lipaza trzustkowa zostaje zinaktywowana niskim pH. Takie właśnie warunki przeważają w żołądku, czego rezultatem jest to, że doustnie podana lipaza trzustkowa zostaje w rzeczywistości całkowicie zinaktywowana w trakcie przemieszczania się przez żołądek do jelita. Stąd też, zjawiska tego nie da się całkowicie przezwyciężyć za pomocą użycia dużych dawek enzymu. Podawanie dużych dawek nie jest odpowiednie dla większości pacjentów, przy czym preparaty te są zanieczyszczone i niesmaczne. Sformułowano pewne tabletki, które przechodzą przez kwaśne partie żołądka i uwalniają enzym jedynie we względnie zasadowym otoczeniu jelita czczego. Jednakże, wielu pacjentów cierpiących na zaburzenia trzustkowe ma nienormalnie kwaśny odczyn jelita czczego i tego rodzaju tabletki nie mogą w tych warunkach uwalniać enzymu, a przez to mogą one okazać się nieskuteczne. Co więcej, ponieważ takie handlowe dostępne preparaty nie są pochodzenia ludzkiego, istnieje ryzyko zaistnienia reakcji immunologicznych, które mogą być szkodliwe dla pacjentów, względnie doprowadzić do zmniejszenia skuteczności terapii.

Dalszą wadą środków obecnie istniejących jest to, że nie ustalona jest w nich zawartość lipolitycznie aktywnych substancji innych niż kolipazozależna lipaza. W rzeczywistości, większość z nich wykazuje bardzo niski poziom aktywności CEH/BSSL. Może to stanowić jeden z powodów tego, dlaczego wielu chorych cierpiących na zwyrodnienie torbielowate, pomimo leczenia polegającego na uzupełnianiu, cierpi nadal na niedobór witamin rozpuszczalnych w tłuszczach i niezbędnych kwasów tłuszczowych.

Tak więc, istnieje wielkie zapotrzebowanie na produkty o właściwości i budowie wywodzącej się z ludzkich lipaz i o szerokim zakresie specyficzności substratowej, które to produkty mogłyby być podane doustnie pacjentom cierpiącym na niedobór jednego, lub większej ilości trzustkowych enzymów lipolitycznych. Zapotrzebowanie to pokrywają produkty wytwarzane sposobem według wynalazku, albo jako takie, albo łącznie z innymi lipozami, względnie łącznie z preparatami zawierającymi inne lipazy. Dalej, w przypadku noworodków ludzkich występuje oczywista potrzeba polepszenia wykorzystania tłuszczów z typowych preparatów dla niemowląt lub pasteryzowanego mleka ludzkiego pochodzącego z tak zwanych laktariów.

BSSL odznacza się szeregiem unikalnych właściwości, które czynią ją wprost w idealny sposób odpowiednią dla leczenia polegającego na zastępowaniu i uzupełnianiu. Z natury swej jest ona predystynowana do podawania doustnego. Tak więc, wytrzymuje ona przejście przez żołądek i jest aktywowana w treści jelita cienkiego. Jej specyficzny mechanizm aktywacji chroni przed niebezpieczną lipolizą pokarmu lub tłuszczu tkankowego w trakcie gromadzenia się i przemieszczania do miejsca działania. Dzięki szerokiemu zakresowi jej specyficzności substratowej, posiada ona potencjalną możliwość samodzielnego pośredniczenia w całkowitym strawieniu większości lipidów jadalnych, włączając w to estry witamin rozpuszczalnych w tłuszczach.

BSSL może przewyższać trzustkową kolipazozależną lipazę pod względem hydrolizowania wiązań estrowych długołańcuchowych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych.

W obecności lipazy żołądkowej i przy nieobecności, względnie przy niskim poziomie kolipazozależnej lipazy, BSSL może zapewnić całkowite in vitro strawienie triacyloglicerolu, nawet przy niskim poziomie soli kwasów żółciowych, tak jak ma to miejsce u noworodków. W obecności BSSL końcowym produktem trawienia triacyloglicerolu stają się raczej wolne kwasy tłuszczowe oraz wolny glicerol, a nie wolne kwasy tłuszczowe i monoacyloglicerol, tworzące się w przypadku dwu innych lipaz (5). Może to sprzyjać absorpcji produktu, zwłaszcza gdy poziom soli kwasów żółciowych w świetle przewodu jest niski (3, 15).

166 534

Z historycznego punktu widzenia, preparaty dla niemowląt opracowywane są i ulepszane na podstawie założenia, że ich skład powinien być tak podobny do składu mleka kobiecego, jak tylko jest to możliwe. Uzupełnienie składu tych preparatów jest rzeczą pożądaną.

Jednakże, wykorzystanie w celu uzupełnienia, zastąpienia lub leczenia stymulowanych solami kwasów żółciowych lipaz (BSSL) lub białek o zasadniczych funkcjach BSSL, wymaga dostępności produktu w dużej skali technicznej. Nie jest rzeczą możliwą w skali fabrycznej opierać się jako surowcu na źródłach naturalnych, takich jak mleko. Oprócz wspomnianych wyżej problemów dotyczących inaktywacji BSSL podczas pasteryzacji, występuje tu dodatkowo ryzyko zanieczyszczenia materiału pochodzącymi ze źródła naturalnego czynnikami zakażającymi, takimi jak wirusy, np. wirusami HIV czy CMV. W tym stanie rzeczy występuje tu potrzeba dostępu w dużej skali do produktów wykazujących właściwości BSSL. Sposób według wynalazku zapewnia takie produkty.

Odnośniki dotyczące dotychczasowego stanu techniki podano w dalszej części opisu.

Sposób według wynalazku opiera się na klonowaniu cDNA kodującego BSSL, pochodzącego z ludzkiego gruczołu sutkowego. Wyodrębniono także z ludzkiej trzustki częściowy cDNA kodujący CEH. Wyprowadzone sekwencje aminokwasów z ludzkich cDNA i porównane z CEH z innych gatunków, podtrzymują interpretację wyników, stwierdzającą identyczność BSSL i CEH.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że struktura białka wydedukowana z sekwencji cDNA jest całkowicie różna od struktury innych lipaz. Struktura ta okazała się, nieoczekiwanie, bardziej podobna do struktury typowych esteraz, takich jak chinoesteraza.

Pozwoliło to na opracowanie sposobu według wynalazku, obejmującego wytwarzanie białka wykazującego jedną lub szereg decydujących funkcji naturalnie występującej lipazy stymulowanej solami kwasów żółciowych, o sekwencji aminokwasów przedstawionej na fig. 7, polegającego na tym, że wstawia się sekwencję nukleotydową, przedstawioną na fig. 2 lub jej część do wektora zawierającego odpowiednią sekwencję nukleotydową ukierunkowującą organizm gospodarza na ekspresję pożądanego białka, wstawia się tak otrzymany wektor do organizmu gospodarza, wybranego z grupy obejmującej bakterie, drożdże, hodowle komórek zwierzęcych i zwierzęta transgeniczne, hoduje się otrzymany organizm gospodarza i wyodrębnia się białko.

Wynalazek jest wyjaśniony w rysunku, na którym fig. 1 przedstawia rozdzielanie hydrolizatu trypsynowego BSSL metodą HPLC. Oczyszczoną BSSL poddano działaniu trypsyny i przeprowadzono chromatografię metodą HPLC jak opisano w pkt. „Materiały i metody“. Wskazane piki zebrano i poddano dalszemu oczyszczaniu za pomocą rechromatografii, po czym określono ich sekwencję aminokwasów; figura 2 przedstawia sekwencję nukleotydów cDNA i wydedukowaną sekwencję aminokwasów dla ludzkiej lipazy stymulowanej solami kwasów żółciowych. Długość cDNA wynosi 2428 zasad. N-końcowa sekwencja 23-kodonu (nukleotydy 82-150) zaczynająca się od ATG uznawana jest za peptyd liderowy, ponieważ N-końcowa sekwencja aminokwasów dojrzałego białka rozpoczyna się przy kodonie 24 (nukleotyd 151, Ala). Peptyd liderowy podkreślono. Znak ^x wskazuje na punkt startowy egzonu. Znak # wskazuje na punkt startowy części powtórkowej; figura 3 przedstawia sekwencję nukleotydów C-końcowych powtórzeń o wysokiej zawartości GC w lipazie stymulowanej solami kwasów żółciowych. Podstawienia wskazane są znakiem X; figura 4 przedstawia hybrydyzację typu Northern blotting. Wykonano analizę typu Northern blotting całkowitego RNA wyizolowanego z ludzkiego, wydzielającego mleko gruczołu sutkowego, trzustki, tkanki tłuszczowej i ludzkiego wątrobiaka (linia komórkowa HepG2). Całkowity TNA (10 gg) z wydzielającego mleko gruczołu sutkowego (ścieżka A), trzustki (ścieżka B), tkanki tłuszczowej (ścieżka C) i HepG2 (ścieżka D) poddano elektroforezie w 1% żelu agarozowym w 40 mM buforze MOPS, przy pH 7,0, po zdenaturowaniu RNA w 1 M glioksalu, 50% sulfotlenu dimetylowym i 40 mM MOPS. Następnie glikozylowany RNA przeniesiono na bibułę nitrocelulozową w celu hybrydyzacji z cDNA BSSL (ABSSL) znakowanym [³²P]. Figura 5 przedstawia porównanie wydedukowanej sekwencji aminokwasów BSSL z mleka kobiecego, szczurzej trzustkowej lizofosfolipazy (Ratlp l) [40] i bydlęcej trzustkowej asterazy cholesterolowej (Bovceh) [41], Reszty seryny zaangażowane w centrum aktywnym wskazane są znakiem x, a znak # wskazuje pojedynczy możliwy sygnał N-glikozylacji białka. Bezpośrednie powtórki sekwencji aminokwasów ujęto w ramki. Dopasowane sekwencje oznaczono dużymi literami, dopasowane sekwencje między

166 534 dwoma enzymami oznaczono małymi literami, a złe dopasowane za pomocą kropki; figura 6 przedstawia porównanie pierwszorzędowej struktury BSSL ze strukturą innych esteraz, tyroglobuliny i c-AMP-zależnego enzymu z Dictyostelium discoideum. BSSL: ludzka lipaza stymulowana solami kwasów żółciowych. Cheshum: cholinoesteraza z płodowej tkanki ludzkiej [50]. Torpace: acetylochinolinoesteraza z Torpedo marmorata [51]. Drosceh: hydroliza estrów karboksylowych z Drosophila melaogaster [52], Ratlivce: karboksyloesteraza z wątroby szczura [53]. Drosace: acetylochinolinoesteraza z Drosophila melaogaster [54]. Thyrhum: tyroglobulina ludzka [49]. Diet. Di: c-AMP-zależny enzym z Dictyostelium discoideum [46]. Istnieje siedem odmiennych domen, wykazujących podobieństwa zachodzące między enzymami. Ramki obejmują identyczne reszty, a małe litery w sekwencji zawierającej wspólny charakterystyczny element struktury wskazują reszty we wszystkich enzymach z wyjątkiem jednego. Kropki wskazują złe dopasowania. Reszta seryny występująca w centrum aktywnym wskazana jest znakiem ^x. Rysunek w prawym dolnym rogu pokazuje zorientowanie domen. Figura 7 przedstawia sekwencję aminokwasów 1-722 dla całego białka (kod jednoliterowy) i wskazuje egzony a, b, c i d. Znak # wskazuje punkt startowy części powtórkowej.

W rezultacie wystąpienia pików zakłócających, w peptydzie nr 26 nie można było dokonać zidentyfikowania w sposób kategoryczny reszty w cyklach 1 i 2 sekwencjonowania. Numery peptydów odnoszą się do pików na fig. 1.

Tabela 1

Sekwencja aminokwasów peptydów BSSL

Fragmenty trypsynowe

TP 16. LysValThrGluGluAspPheT yrLys TP19' GlylleProPheAlaAlaProThrLys TP20. LeuValSerGluPheThrIleThrLys TP24 ThrTyrAlaTyrLeuPheSerHisProSerArg TP26. PheAspValT yrThrGluSerT rp AlaGln Asp

ProSerGlnGluAsnLys

Tabela 2

Identyfikacja egzonów a, b, c i d, ponumerowanych jak na figurach 2 i 7

Lokalizacja

Egzon	między nukleotydami nr	między aminokwasami nr
a	986-1172	279-341
b	1173-1376	342-409
c	1377-1574	410-474
d	1575-2415	475-722
Pełne białko	151-2316	1-722
Pełne białko	151-1755	1-535

z wyłączeniem powtórek

Produktami wytwarzanymi sposobem według wynalazku są:

a) białko zdefiniowane sekwencją aminokwasów 1-722 na fig. 7,

b) białko zdefiniowane sekwencją aminokwasów 1-535 na fig. 7,

c) białko zdefiniowane sekwencją aminokwasów 1-278 na fig. 7,

d) białko zdefiniowane sekwencją aminokwasów 1-341 na fig. 7,

e) białko zdefiniowane sekwencją aminokwasów 1-409 na fig. 7,

f) białko zdefiniowane sekwencją aminokwasów 1-474 na fig. 7, ·

g) kombinacje białek zdefiniowanych w punktach b(-f), np. zdefiniowanych sekwencją aminokwasów w pozycjach 1-278, 279-341, 279-409, 279-474, 342-409, 342-474 i 536-722,

h) kombinacje białek zdefiniowanych w punktach b(-g), łącznie z jedną, lub więcej niż jedną powtórką zgodnie z fig. 5,

i) białko jak zdefiniowano w punktach a(-h) o dodatkowym N-końcowym aminokwasie, a mianowicie metioniną, i funkcjonalnie równoważne warianty i mutanty białek zdefiniowanych w punktach a(-i) powyżej.

166 S34

Ί

Należy zauważyć, że białka wspomniane w punktach a, b, c, d, e, f, h i i wyżej nie będą identyczne pod każdym względem z naturalną BSSL, lecz będą przejmować jedną, lub większą ilość decydujących funkcji naturalnie występującej BSSL. Te decydujące funkcje podano niżej:

j) sekwencja DNA kodująca białka zdefiniowana w punktach a, b, c, d, e, f, h, oraz i,

k) sekwencja DNA według fig. 2, zdefiniowana następującymi numerami nukleotydów na fig. 2:

a) sekwencja DNA 151-2316 według fig. 2, kodująca białko zdefiniowane sekwencją aminokwasów 1-722 na fig. 7,

b) sekwencja DNA 151-1755 według fig. 2, kodująca białko zdefiniowane sekwencją aminokwasów 1-535 na fig. 7,

c) sekwencja DNA 151-985 według fig. 2, kodująca białko zdefiniowane sekwencją aminokwasów 1-278 na fig. 7,

d) sekwencja DNA 151-1172 według fig. 2, kodująca białko zdefiniowane sekwencją aminokwasów 1-341 na fig. 7,

e) sekwencja DNA 151-1376 według fig.2, kodująca białko zdefiniowane sekwencją aminokwasów 1-409 na fig. 7,

f) sekwencja DNA 151-1574 według fig.2, kodująca białko zdefiniowane sekwencją aminokwasów 1-474 na fig. 7,

g) sekwencja DNA 986-1172 według fig.2, kodująca białko zdefiniowane sekwencją aminokwasów 279-341 na fig. 7,

h) sekwencja DNA 986-1376 według fig.2, kodująca białko zdefiniowane sekwencją aminokwasów 279-409 na fig. 7,

i) sekwencja DNA 986-1574 według fig.2, kodująca białko zdefiniowane sekwencją aminokwasów 279-474 na fig. 7,

j) sekwencja DNA 1173-1376 według fig. 2, kodująca białko zdefiniowane sekwencją aminokwasów 342-409 na fig. 7,

k) sekwencja DNA 1173-1574 według fig. 2, kodująca białko zdefiniowane sekwencją aminokwasów 342-474 na fig. 7,

l) sekwencja DNA 1687-2317 według fig. 2, kodująca białko zdefiniowane sekwencją aminokwasów 536-722 na fig. 7.

Białka wytwarzane sposobem według wynalazku odznaczają się następującymi ważnymi właściwościami.

a) Nadają się do podawania doustnego.

b) Są aktywowane przez swoiste sole kwasów żółciowych.

c) Wykazują aktywność lipazy niespecyficznej w treści jelita cienkiego, co oznacza, że są zdolne do hydrolizowania lipidów względnie niezależnie od ich budowy chemiczej i stanu fizycznego (zemulgowane, micelarne, rozpuszczalne).

d) Mają zdolność hydrolizowania triacylogliceroli z kwasami tłuszczowymi o łańcuchach rozmaitej długości i o różnym stopniu nasycenia.

e) Zdolność hydrolizowania także diacyloglicerolu, monoacyloglicerolu, estrów cholesterolu, lizofosfatydyloacyloglicerolu oraz estrów retinolu i innych witamin rozpuszczalnych w tłuszczach.

i) Zdolność hydrolizowania nie tylko wiązań estrowych sn-1(3) w triacyloglicerolu, ale także wiązania estrowego sn-2.

g) Zdolność interakcji nie tylko z pierwszorzędowymi solami kwasów żółciowych, ale także z drugorzędowymi solami kwasów żółciowych.

h) Zależność od soli kwasów żółciowych jeśli chodzi o aktywność optymalną.

i) Stabilność tego rodzaju, że treść żołądka nie wpływa na wydajność katalityczną w jakimkolwiek znaczniejszym stopniu.

j) Stabilność pod względem inaktywacji przez proteazy trzustkowe, takie jak trypsyna, z tym, że są obecne sole kwasów żółciowych.

k) Zdolność do wiązania się z heparyną i pochodnymi heparyny, takimi jak siarczan heparyny.

l) Zdolność do włączania się w interfazę lipid - woda.

m) Stabilność, jeśli chodzi o możliwość liofilizacji.

166 534

n) Stabilność wykazywana po zmieszaniu ze składnikami pożywienia, jak np. w mleku kobiecym lub preparacie mleka.

Decydującymi właściwościami pod względem uzupełniania, zastępowania lub leczenia są funkcje wymienione w pkt. a), c), d), e), f), i), j) i l). Dla innych przeznaczeń, nie wszystkie decydujące funkcje mogą okazać się konieczne.

Dla ekspresji białek powyżej wskazanych, należy wstawić odpowiednią sekwencję DNA, powyżej wskazaną, do właściwego wektora, który następnie zostaje wprowadzony do odpowiedniego organizmu-gospodarza. Wspomniany wektor powinien także obejmować odpowiednią sekwencję sygnałową i inne sekwencje umożliwiające organizmowi dokonanie ekspresji pożądanego białka.

Organizmy odpowiednie do dokonywania ekspresji.

Z wykorzystaniem techniki rekombinantowego DNA jest możliwe przeprowadzanie klonowania u ekspresji białka, o które chodzi, w rozmaitych prokariotycznych i eukariotycznych organizmach-gospodarzach. Możliwymi do wykorzystania tu organizmami do dokonywania ekspresji są bakterie, proste eukarionty (drożdże), hodowle komórek zwierzęcych, hodowle komórek owadzich, hodowle komórek roślinnych, rośliny i zwierzęta transgeniczne. Wszystkie poszczególne systemy wykazują swoje konkretne korzyści i wady. Prostym wnioskiem jest to, że każdy gen, do ekspresji którego ma się doprowadzić, stanowi osobny problem i nie istnieje standardowe rozwiązanie tego problemu.

Zwykle stosowanymi systemami bakteryjnymi są E. coli, Bacillus subtilis, Streptomyces. Zwykle używanymi drożdżami są saccharomyces i Pichiapastoris. Zwykle używanymi komórkami zwierzęcymi są komórki CHO komórki COS. Zwykle używanymi hodowlami komórek owadzich są komórki pochodzące od Drosophila.

Zwykle używaną rośliną jest tytoń. Możliwymi do wykorzystania zwierzętami transgenicznymi są koza i krowa.

Możliwe do wykorzystania tu wektory bakteryjne są to, przykładowo, pUC i wektory białka A.

Przykładem możliwego do zastosowania wektora drożdżowego jest pMA 91.

Możliwe do zastosowania wektory owadzie wywodzą się z Bakulowirusa.

Możliwe do zastosowania wektory dla komórek zwierzęcych wywodzą się z SV/40.

Możliwe do zastosowania wektory roślinne wywodzą się z plazmidu Ti.

W każdym systemie użyć można zarówno naturalnych jak i syntetycznych promotorów i terminatorów'.

Jest rzeczą zrozumiałą, że w zależności od wyboru systemu ekspresji, białko utworzone w jej wyniku może zawierać dodatkowy N-końcowy aminokwas (metioninę), może zawierać kilka dodatkowych aminokwasów, albo też może być sprzężone z białkiem heterologicznym (np. białkiem A), względnie może różnić się od białka naturalnego w aspekcie glikozylacji. Dalej, wektory mogą także zawierać sekwencje sygnałowe w celu wydzielenia białka do periplazy lub do podłoża hodowli.

Sposoby oczyszczania białka, wytwarzanego sposobem według wynalazku oparte są na zastosowanym systemie ekspresji (np. białka A/IgG) i/lub na metodach używanych do oczyszczania enzymu naturalnego, jak to opisano w publikacji Blackberg, L. i Hernell, O. (1981) Eur. J. Biochem 116, 221-225 (odnośnik b).

Białko wytworzone sposobem według wynalazku można stosować w środkach farmaceutycznych, np. przeznaczonych do leczenia stanu patologicznego związanego z niewydolnością zewnątrzwydzielniczą trzustki lub do leczenia zwyrodnienia torbielowatego, bądź jako uzupełnienia preparatu odżywczego dla niemowląt, do wytworzenia leku przeznaczonego do leczenia przewlekłego zapalenia trzustki, do leczenia złego wchłaniania tłuszczów jakiejkolwiek etioogii, do leczenia złego wchłaniania witamin rozpuszczalnych w tłuszczach i do leczenia złego wchłaniania tłuszczów spowodowanego przyczynami fizjologicznymi, np. u noworodków.

Sekwencja DNA na fig. 2 od pozycji 151 do pozycji 2316 włącznie jest sekwencją kodującą całe białko. Sekwencja od pozycji 2317 do pozycji 2415 włącznie nie ulega translacji do białka, lecz jest włączona w egzen d zidentyfikowany niżej w tabeli 2.

W jednym z wariantów wynalazku, białko jak zdefiniowano wyżej w punktach a(-i) otrzymuje się w postaci izolatu i/lub w postaci zasadniczo czystej.

166 534 9

Sekwencja DNA jak zidentyfikowano wyżej w punktach a(-k) powyżej otrzymuje się, w jednym z wariantów wynalazku, w postaci izolatu i/lub w postaci zasadniczo czystej.

Skróty: aa, aminokwas; bp, para zasad; BSSL, lipaza stymulowana solami kwasów żółciowych; c-AMP, cykliczny adenozynomonofosforan; CEH, hydrolaza estrów karboksylowych; Da, dalton; c⁷GTP, 7-deaza-2-deoksyguanozyno-5'-trifosforan; EDTA, etylenodiaminotetraoctan; kb, kilozasady; MOPS, kwas 3-N-morfolinopropanosulfonowy; nt, nukleotyd; PAGE, elektroforeza w żelu poliakryloamidowym; SDS, siarczan dodecylo-sodowy; SSC, NaCl-cytrynian; xGal, 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-/3-D-galaktopiranozyd.

Enzymy. Lipaza stymulowana solami kwasów żółciowych EC 3.1.1.3. Hydrolaza estrów karboksylowych EC 3.1.1.1.

Materiały i metody.

A. Otrzymywanie enzymu i przeciwciała.

BSSL wyodrębniono z mleka kobiecego sposobem poprzednio opisanym [6]. Enzym, w przypadku użycia go do wytworzenia przeciwciała, poddano dalszemu oczyszczaniu metodą SDS-PAGE. Dokonano elektroelucji z żelu, po wybarwieniu błękitem Coomassie Brilliant, pasma białka odpowiadającego lipazie. 25 pg oczyszczonego enzymu, łącznie z taką samą objętością kompletnego adiuwanta Freund'a, użyto do pierwszego śródskórnego wstrzyknięcia i tej samej ilości enzymu, razem z niekompletnym adiuwantem, użyto do następnych comiesięcznych wstrzyknięć przypominających. Króliki skrwawiono po upływie 2 tygodni po każdym wstrzyknięciu przypominającym i wypreparowane surowice przechowywano w temperaturze -20°C.

B. Otrzymywanie fragmentów trypsynowych i analiza sekwencji aminokwasów.

mg occyszczooej BSSL rozpuszccoon w 1 ml O,1M bbforu Tris-Cl, pH 8,5, zawierająccgg 6 M chlorowodorek guanidyny i 2 mM EDTA. Dodano ditiogrytrytol do 5 mM. Po inkubacji w temperaturze 37°C w ciągu 2 godzin dodano 300^l 50 mM ąodooctwnf. Po upływie 90 minut inkubacji w temperaturze 25°C bez dostępu światła, zredukowany i karbokzymetylowany enzym odsolono na kolumnie Sephadex G-25 zrównoważonej 0,5 M wodorowęglanem amonowym. Przed prcgurowadcgeigm liofilizacji dodano 30pg trypsyny bydlęcej potraktowanej tosylo-L-fenyloalaninochloromgtanem (Worthington diagnostics system Inc., Freehold, NJ. USA). Zliofϊlicowane białko rocuusccczno w 4 ml 0,1 M wodorowęglanu amonowego i dodano ąeszccg 90 pg trypsyny. Po upływie 5 godzin inkubacji w temperaturze 37°C białko ponownie cliofϊlicowano. Hydrolizat trypsynowy rzcuuscczono w 0,1% kwasie trifluorzoctowym (2 mg/ml). 300pg trawionej trypsyną BSSL poddane chromatografii metodą HPLC przy użyciu kolumny z odwróconymi fazami C-18, z użyciem do elucji gradientu 0-50% acetonitrylu w 0,1 % kwasie trifluorooctowym. Przebieg zbierania peptydu śledzono przez stały zapis absorbancji przy 215 nm. Peptydy przeznaczone do sekwencjonowania poddano dalszemu oczyszccαniu za pomocą rechromatografii na tej samej kolumnie z ustalonymi gradientami. Próbki fragmentów peptydu przeznaczone do -ekwencjonzwαnia suszono w atmosferze azotu w celu usunięcia acetonitrylu i wprowadzono do sekwentora. Dla przeto wadzenia analizy sekwencji N-końcowej, natywną BSSL rozpuszczono w 0,1% kwasie octowym. Analizę sekwencyjną wykonano wykorzystując wyprodukowany przez Applied Biosystems Inc. sekwenator „pulse liquid phase 477A i analizator 12A PTH z bezpośrednim przetwarzaniem danych, o oprogramowaniu „regular cycle programs, przy użyciu odczynników dostarczonych przez wytwórcę. Wydajności początkowe i repetytywne, obliczone dla poddanego sekwencjonowaeiu białka wzorcowego, β-laktoglobuliny, wynosiły, odpowiednio, 47% i 97%.

C. Izolacja RNA.

Próbki ludzkiej tkanki tłuszczowej trzustki i wydzielającego mleko gruczołu sutkowego otrzymane chirurgicznie bezzwłocznie umigszcczno w tiocyjanianie guanidyny (1-5 g w 50 ml). Całkowity RNA ekstrahowano sposobem opisanym przez Chirgwina [20]. Poli(A)-RNA otrzymano za pomocą chromatografii na kolumnie oligodezksytymidylanocgluloyy (oligo/DT)celulozy [21],

D. Konstrukcja i skrining bibliotek cDNA.

Około 15 pg uoliadeeylowaeego RNA z ludzkiej trzustki ydgnaturzwano wodorotlenkiem metylortęciowym [22] i prymowano przy użyciu starterów oligo (dT)12-18 (Pharmacia, Uppsala,

166 534

Szwecja), po czym przeprowadzono odwrotną transkrypcję z zastosowaniem technik standardowych [23]. Syntezę drugiej nici przeprowadzono metodą Gublera i Hoffmana [24] z tą różnicą, że pominięto użycie ligazy DNA i β-NAD, a temperaturę reakcji ustalono na 15°C. Nadmiar RNA trawiono RNazą A (50 pg/ml) i dwuniciowy DNA poddano działaniu metylazy EcoRI [25]. Końce stępiono przy użyciu enzymu Klenowa. Po ligowaniu do łączników EcoRI i rozszczepieniu przy użyciu EcoRI, cDNA frakcjonowano na kolumnie Sepharose 4B-C1. Frakcję z objętości międzyziarnowej poddano wytrącaniu etanolem i cDNA ligowano do miejsca EcoRI fosfotazy potraktowanej wektorem gtl 1 [26]. In vitro upakowanie dało ponad 7 X 10⁵ rekombinantów.

Biblioteka cDNA z ludzkiego gruczołu sutkowego, pochodząca z tkanki uzyskanej od kobiety w ósmym miesiącu ciąży, otrzymano z firmy Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, USA.

Fagi z bibliotek cDNA wprowadzono na łytki tworząc jednostki 5 X 10⁴ łysinek na 120 mm płytkę. Surowicę odpornościową rozcieńczono w stosunku 1:3200 i przeprowadzono skrining metodą Younga i Davisa [27]. Jako drugich przeciwciał użyto kozich przeciwkróliczych przeciwciał koniugowanych fosfotazą alkaliczną (Bio-Rad, Richmond, CA. USA). W celu wyodrębnienia klonów odpowiadających końcowi 5' mRNA przeprowadzono hybrydyzację kwasu nukleinowego w warunkach standardowych [23] przy użyciu jako sondy subklonowanego fragmentu jednego z klonów immunopozyt ywnych.

E. Analiza RNA.

Elektroforezę prowadzono w 1% żelu agarozowym w 40 mM buforze MOPS, pH 7,0, po zdeponowaniu glioksalem i sulfotlenkiem dimetylowym [28]. Następnie glioksylowany całkowity RNA przeniesiono na filtry nitrocelulozowe [29]. Odciski sondowano subklonami rekombinantów BSSL i CEH znakowanych z wykorzystaniem techniki oligoznakowania [30]. Prehybrydyzację i hybrydyzację prowadzono przy użyciu 50% formamidu, w temperaturze 46°C [23]. Przemywki z posthybrydyzacji otrzymano w ostrych warunkach (0,1% SDS i 0,1 X SSC w temperaturze 60°C). (1 X SSC, 0,15 M NaCl, 0,0015 M cytrynian sodowy, pH 7,6).

F. Sekwencja nukleotydów.

Wstawki cDNA z rekombinantów BSSL i CEH albo bezpośrednio klonowane do M3mpl8 i mp 19 po nadźwiękowieniu i frakcjonowaniu pod względem wielkości, albo też niektóre z nich dalej subklonowano do pTZ19R po trawieniu PstI, BstXI, Narl, Smal i Ahall. Sekwencję nukelotydów określono metodą didezoksy terminacji łańcucha [31]. Powtórki o wysokiej zawartości GC (patrz niżej) także sekwencjonowano przy użyciu polimerazy TaqI i dc ⁷GTP. Sekwencjonowano obie nici. Informacje dotyczące sekwencji odzyskano z autoradiogramów przy wykorzystaniu oprogramowania MS-EdSeq, jak to opisali Sjoberg i in. [55].

G. Prognozy i homologie sekwencji aminowkasów.

W celu prognozowania sekwencji aminokwasów odpowiadającej wstawkom cDNA, wykorzystanie kodonu różnych ramek odczytu porównano metodą Stadena i w rezultacie otrzymano jedną otwartą ramkę odczytu [32]. Homologie badano z wykorzystaniem programów z pakietu programowego UWGCG [33],

Wyniki i dyskusja.

A. Sekwencje fragmentów trypsynowych i N-końca BSSL.

Trawienie trypsyną oczyszczonej BSSL doprowadziło do uzyskania około 50 fragmentów, jak można o tym sądzić na podstawie liczby pików otrzymanych w trakcie chromatografii HPLC (fig. 1). Piki zebrano i wskazane piki, które można było wyodrębnić w stanie wysokiej czystości i w sensownych ilościach, poddano sekwencjonowaniu. Otrzymane sekwencje pokazano w tabeli 1. Oprócz tego, sekwencjonowaniu poddano 30 najbardziej N-końcowych reszt (fig. 2). Wyniki potwierdzają sekwencję poprzednio opublikowaną przez Abouakila i in. (30 reszt) [17].

N-końcową sekwencją o długości 22 reszt, o której donieśli Wang i Johnson [34], jest glicyna w naszym doniesieniu, a lizyna w pracy Wanga i Johnsona.

B. Sekwencja nukleotydów BSSL.

W celu skonstruowania biblioteki cDNA λ gm użyto poliadenylowanego RNA z ludzkiej trzustki. Początkowo wyizolowano cztery klony immunopozytywne, po czym tę trzustkową ekspresyjną bibliotekę cDNA poddano skriningowi z surowicą odpornościową przeciw BSSL. Analiza

166 534 sekwencji nukleotydów tych czterech klonów wykazała, że są one doskonale zgodne i odpowiadają końcowi 3' mRNA. Wszystkie one rozpoczynają się segmentem poliA i różnią się między sobą jedynie długością. Najdłuższa wstawka, oznaczona ACEH, rozciąga się na 996 pz.

Bibliotekę cDNA z ludzkiego gruczołu sutkowego poddano skriningowi z surowicą odpornościową i trzustkowym klonem ACEH jako sondą. Z obu skriningów wyodrębniono klony pozytywne; wszystkie one rozpoczynają się od końca 3'. Najdłuższy klon z gruczołu sutkowego, oznaczony ABSSL rozciąga się na 2100 pz w górę. Zawiera on cztery z sekwencjonowanych fragmentów trypsynowych (fig. 2), ale nie obejmuje N-końcowej sekwencji aminokwasów. W celu rozciągnięcia sekwencji poza początek translacji, bibliotekę cDNA gruczołu sutkowego poddano reskriningowi przy użyciu sondy o długości 118 zasad, pochodzącej z najbliższej 5' części ABSSL. Wyodrębniono jeden klon rozciągający się o dalsze 328 nukleotydów w górę. Klon ten dopasowany był do N-końcowej sekwencji aminokwasów i zawierał pozostały fragment trypsynowy. Jak to przedstawiono na fig. 2, długość cDNA wynosi 2428 nukleotydów i zawiera on 81 zasad w górę od pierwszego kodonu ATG. Sygnał poliadenylacji, AATAAA, znajduje się o 13 nukleotydów w górę od segmentu poliA i kodon terminacji TAG wykryto przy nukleotydzie 2317, po którym następuje 3'-nie uległy translacji region o 112pz. Region o wysokiej zawartości GC składający się z 16 powtórek 33 zasad stwierdzono w końcu 3' sekwencji, między zasadą 1756 a 2283. Sekwencja nukleotydów powtórzenia, pokazana na fig. 3, składa się z 6 identycznych powtórzeń otocznych przez 10 powtórzeń z rozmaitymi ilościami podstawień, które prawdopodobnie zdarzyły się po szeregu duplikacji. Mała ilość podstawień sugeruje, że te powtórzenia pojawiły się późno w trakcie ewolucji.

C. Rozmieszczenie ekspresji w tkankach.

RNA z ludzkiego wydzielającego mleko gruczołu sutkowego, trzustki, tkanki tłuszczowej i z ludzkiego wątrobiaka (linia komórkowa HepG2) poddano analizie typu Northern blotting. Wielkość mRNA określono na około 2,5 kilozasady, tak w przypadku wydzielającego mleko gruczołu sutkowego, jak i trzustki. Nie udało się wykryć żadnego sygnału w ścieżkach RNA wyekstrahowanego z HepG2 lub z tkanki tłuszczowej (fig. 4).

Ponieważ mRNA użyty do biblioteki z gruczołu sutkowego uzyskano od kobiety w ósmym miesiącu ciąży, jest rzeczą oczywistą, że transkrypcja, a możliwe że i translacja, genu BSSL uruchomiona zostaje jeszcze przed porodem zgodnie z wcześniejszymi odkryciami dotyczącymi wydzielania się BSSL przed porodem [35]. Patrz figura 4.

D. Sekwencja aminokwasów BSSL.

Jak doniesiono, oceniana na podstawie SDS-PAGE masa cząsteczkowa wynosi 107-125 kDA [8, 36], a na podstawie ultrawirowania analitycznego wynosi 105 kDA [37]. Enzym, jak wydedukowano na podstawie cDNA, składa się z 722 reszt aminokwasów (fig. 2), co daje masę cząsteczkową 76,271 Da i wskazuje na to, że enzym zawiera co najmniej 15-20% węglowodanu. Długość sekwencji liderowej wynosi 23 reszty. Reszta seryny próbnego centrum aktywnego zlokalizowana jest jako seryna 217 (fig. 5). Sekwencja wokół tej seryny współgra z zawierającą wspólny charakterystyczny element struktury sekwencją centrum aktywnego hydrolaz serynowych [38]. Obecnie proponuje się, że reszty zasadowe, znajdowane blisko seryny centrum aktywnego mogą być zaangażowane w rozszczepianiu przez lipazy wiązań estrowych w acyloglicerolach [39]. Można zauważyć, i jest to ciekawe, że reszty takie nie występują w BSSL. Pojednycze próbne miejsce N-glikozylacji jest zlokalizowane w odległości jedynie siedmiu reszt od seryny. Stopień glikozylacji [6,16] sugeruje, że eznym zawiera węglowodan 0-związany. Istnieją tu dwa miejsca, gdzie mogłaby nastąpić glikozylacja. Skład aminokwasowy, w oparciu o eznym oczyszczony, wykazał wysoką zawartość reszt proliny [6]. Potwierdza to sekwencja aminokwasów uzyskana z cDNA. Ponadto, większość reszt proliny znajduje się w 16 powtórkach, każda o 11 resztach, stanowiących główną część C-końcowej połowy enzymu. ¹

E. Porównanie enzymów w gruczole sutkowym (BSSL) i w trzustce (CEH).

Jak poprzednio wykazano, że BSSL mleka kobiecego i CEH ludzkiej trzustki są do siebie podobne, jeśli nie identyczne. Dane prezentowane obecnie mocno sugerują, że oba te enzymy są produktami tego samego genu. Sekwencja nukleotydów klonów cDNA pokazuje, że trzustkowy klon ACEH jest identyczny z klonem gruczołu sutkowego ABSSL z segmentu poliA i 996 zasad

166 534 w kierunku końca 5', włączając w to sekwencję kodującą powtórki o wysokiej zawartości proliny. Analiza techniką Northern blotting dała pojedyncze pasmo 2,5 kilozasady w RNA z trzustki i wydzielającego mleko gruczołu sutkowego (fig. 4). Badanie genomu techniką Southern blotting w dalszym ciągu podtrzymuje pogląd, że tylko jeden gen koduje BSSL i CEH. Różnice w ruchliwości w trakcie SDS-PAGE występujące między BSSL a CEH można wytłumaczyć w ten sposób, że jest to konsekwencja różnic w glikozylacji względnie różnicującego cięcia i składania.

Podobieństwo BSSL do enzymów szczurzych i bydlęcych (patrz niżej) oraz do wyników badań genomu techniką blottingu podtrzymuje przypuszczenie, że różnicującym cięciem i składaniem nie można wytłumaczyć odmiennych ruchliwości. Ponieważ sekwencja C-końcowa nie została potwierdzona na poziomie białka, istnieje mniej prawdopodobna możliwość, że CEH może ulec przetworzeniu, na drodze rozszczepienia proteolitycznego, w C-końcu.

Jak dalece jest to wiadome, że enzymy trzustkowe, które w oczywisty sposób odpowiadają CEH, nazywane są często według nazwy gatunkowej i konkretnych substratów używanych do określenia ich poszczególnych aktywności: lizofosfolipaza, esteraza cholesterolowa, hydrolaza estrów sterolowych, lipaza niespecyficzna, lipaza karboksyloestrowa i hydrolaza estrów cholesterolu. Dostępne dane zgodne są z poglądem, że wszystkie te opisane aktywności mają swe źródło w jednej i tej samej jednostce funkcjonalnej [42,43]. Ilustruje to szeroką specyficzność substratową i trafność nazwania ich lipazami niespecyficznymi. Gdy sekwencję ludzkiej BSSL/CEH porówna się z sekwencją lizofosfolipazy z trzustki szczurzej [40] i esterazy cholesterolowej z trzustki bydlęcej [41], stwierdza się rozległe podobieństwa, rozciągające się przez około 530 reszt od N-końca (fig. 5). Jednakże różnią się one w części cząsteczki, w której występują powtórki. Enzym szczurzy ma tylko 4 powtórki, a bydlęcy 3. Tak więc, enzym ludzki jest peptydem znacznie dłuższym.

Co więcej, stwierdza się uderzające podobieństwo między BSSL a szeregiem typowych esteraz, takich jak acetylocholinoesterazy z rozmaitych gatunków, włączając w to człowieka i Drosophila, oraz karboksyloesterazy (fig. 6). Podobieństwa te ograniczone są do 300 reszt N-końca BSSL, co obejmuje też resztę seryny próbnego centrum aktywnego. Podobieństwo do acetylocholinoesterazy prognozowane jest w oparciu o fakt, że BSSL hamowana jest przez typowe inhibitory cholinoesterazy [6, 8]. Z ewentualnym wyjątkiem w postaci karboksyloesterazy z wątroby szczura [45], nie wykazano, żeby którykolwiek z tych enzymów odznaczał się tą samą zależnością od soli kwasów żółciowych jak w przypadku BSSL. Sugeruje to, że strukturalna podstawa tej zależności znajduje się w C-końcowej części białka. Ponadto, BSSL może w skuteczny sposób atakować substraty zemulgowane, co nie jest rozpoznaną cechą charakterystyczną podobnych esteraz. Dla tej aktywności obecność soli kwasów żółciowych jest warunkiem wstępnym.

Sekwencję prognozowaną dla ludzkiej BSSL porównano z innymi, dobrze scharakteryzowanymi lipazami ssaków. Poza zawierającą wspólny charakterystyczny element struktury sekwencją wokół seryny centrum aktywnego (G-X-S-X-G), nie znaleziono żadnych oczywistych podobieństw [44].

Oprócz podobieństwa do innych enzymów, istnieją tu także wyraźne podobieństwa do cAMP-zależnego białka Dictyostelium discoideum [46], jak również do tyroglobuliny szeregu gatunków (fig. 6) [47-49]. Podobieństwa zachodzące między BSSL i tyroglobuliną, dotyczące regionu centrum aktywnego, ale nie samego centrum aktywnego, wskazują na to, że te rozciągnięcia aminokwasów mają znacznie ogólniejsze znaczenie, aniżeli tylko podtrzymywanie enzymatycznej aktywności esteraz.

W końcu, BSSL ludzkiego mleka składa się z 722 reszt aminokwasów. Dostępne dane bardzo wyraźnie wskazują na to, że jej łańcuch peptydowy jest identyczny z łańcuchem trzustkowej CEH i że są one kodowane przez ten sam gen. Najmocniejszym dowodem jest to, że sekwencje nukleotydów ich końców 3' oraz ich N-końcowe sekwencje aminokwasów są identyczne. Uderzające homologie stwierdzone odnośnie do szczurzej trzustkowej lizofosfolipazy i bydlęcej trzustkowej esterazy cholesterolowej podtrzymują hipotezę, że także i te enzymy są funkcjonalnie identyczne. Jednakże, jak się sugeruje, różne wielkości cząsteczek stwierdzone u różnych gatunków nie wynikają jedynie z różnic w glikozylacji; stanowią one odbicie zmiennej ilości powtórek o 11 aminokwasach. Podobieństwo sekwencji centrum aktywnego sugeruje, że białka te wywodzą się od wspólnego, dziedzicznego genu.

166 534

Odnośniki

1. L. Blackberg, K. A. Angąuist i O. Hernell, FEBS Lett., 217, 37-41 (1987).

2. O. Hernell, Eur. J. Clin. Invest., 5, 267-272 (1975).

3. O. Hernell, L. Blackberg i S. Bernback w: Perinatal nutrition (rrd. B. S. Lindblad), Bristol-Myerś Nutrition symposia, tom 6, str. 259 272, Academic Press, New York, (1988).'

4. O. Hornell, L. Blackberg, B. Fredrikzon i T. Olivecrona. Bile salt-stimulated lipase in human milk and lipid digestion in the neonatal period. W: Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy. Red. E. Lebenthal, Raven Press, New York, 465-471 (1981).

5. S. Bernback, L. Blackberg i O. Hernell, J. Clin. Invest. J. Clin. Invest., 221-226 (1990).

6. L. Blackberg i O. Hernell, Eur. J. Biochem., 116, 221-225 (1981).

7. O. Hernell i L. Blackberg, Pediatr. Res., 16, 882-885 (1982).

8. L. Blackberg, D. Lombardo, O. Hernell, O. Guy i T. Olivecrona, FEBS Lett., 136,284-288 (1981).

9. B. Fredrikzon, O. Hernell, L. Blackberg i T. Olivecrona, Pediatr. Res., 12, 1048-1052 (1978).

10. C.-S. Wang, J. A. Hartsuck i D. Downs, Biochemistry 27, 4834-4840 (1988).

11. L. Blackberg i O. Hernell, FEBS Lett, 157, 337-341 (1983).

12. B. Bjórksten, L. G. Burman, P. deChateau, B. Fredrikzon, L. Gothefors i O. Hernell, Br. Med. J., 201,267-272(1980).

13. M. J. Brueton, H. M. Berger, G. A. Brown, L. Ablitt,N. Iyangkaran i B. A. Wharton, Gut, 19,95-98 (1978).

14. G. M. Murphy i E. Singer, Gut, 151-163 (1975).

15. O. Hernell, J. E. Stuggers i M. C. Carey, Birchfmistry, 29, 2041-2056 (1990).

16. D. Lombardo, O. Guy i C. Figrella, Biochim. BiopEys. Acta, 527, 142-149 (1978).

17. N. Abouakil, E. Rogalska, J. Bonicel i D. Lombardo, Biochim. biopEys. Acta, 961,299-308 (1988).

18.0. Hernell, L. Blackberg i T. Liudberg w: Textbrok of Gastrofntfsology and Nutrition in infacy (red.

Lebentbal), str. 209-217, Raven Press, New York (1988).

19. C. - S. Wang, Biochem. Biophys. Res. Com., 155, 950-955 (1988).

20. J. M. Chirgwin, A. E. Przybyla, R. J. MacDonald i W. J. Rutter, Biochemistry, 18,5294-5299(1979).

21. H. Aviv i P. Leder, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69, 5201-5205 (1979).

22. J. M. Bailey i N. Davidśrn, Anal. Biochem., 70, 75-85 (1976).

23. T. Maniatis, E. F. Fritsch i J. Sambrook, Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laborator^y, Cold Spring Harbor, New York (1982).

24. U. Gubler i B. J. Hoffman, Gene, 25, 263-269 (1983).

25. T. Maniatis, R. C. Haldison, E. Lacy, J. Lauer, C. O^onell i D. Qven, Cell, 15, 687-70i (1978).

26. R. A. Young i R. W. Davis, Science, 222, 778-782 (1983). '

27. R. A. Young i R. W. Davis, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80, 1194-1198 (1983).

28. G. K. MeMaster i G. G. Charmichael, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 48 353-48 358 (1977).

29. P. Thomas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77, 5201-5205 (1980).

30. A. P. Feinberg i B. Vogelstein, Analyt. Biochem., 132, 6-13 (1983).

31. F. Sanger, S. Nicklen i A. R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 5463-5467 (1977).

32. R. Staden, Nucl. Acids Res., 12, 551-567 (1984).

33. J. Dbvbsbux, P. ^eberli i O. Smithies, Nucl. Acids Res., 12, 387-395 (1984).

34. C.-S. Wang i K. Johnson, Anal. Biochem., 133, 457-461 (1983).

35. M. Hamosh w: Human Milk Infant Nutrition and Health (red. R. R. Howell, F. H. Morriss i L. K. Pickering), str. 66-97, Charles C. Thomas, Springfield (1986).

36. C.-S. Wang Anal. Biochem., 105, 398-402 (1980).

37. C.-S. Wang i D. M. Lee, J. Lipid. Res., 26, 824-830 (1985).

38. S. Brenner, Nature, 334, 528-530 (1988).

39. C.-Y. Yang, Z.-W. Gu, H.-H. Yang, M. F. Rohde, A. M. Gotto, jr. i H. J. Pownall, J. Biol. Chem., 265, 16822-16827 (1989).

40. J. H. Han, C. Stratowa i W. J. Rutter, dirchfmistry, 26, 1617-1625 (1987).

41. E. Kyger, R. Wiegand i L. Lange, Biochim. dirphys. Res. Com., 164, 1302-1309 (1989).

42. L. Blackberg: Fat digestion in newljorn infant. Umea Unwersity Medical Diśsfrtatirnś New Series No 71 (1981).

43. E. A. Rudd i H. L. Brockman w: Lipases (red. B. Borgstrom i H. L. Brockman), str. 184-204, Eisler, Amsterdam, (1984).

44. S. Mickel, F. Weidenbach, B. Swarovsky, S. LaForge i G. ScheUe J. Biol. Chem., 264,12895-12901 (1989).

166 534

45. E. D. Cammulli. M. J. Linke, H. L. Brockman i D. Y. Hui, Biochim. Biophys. Acta, 1005,177-182 (1989). '

46. S. K. O. Mann i R. A. Firtel, Mol. Cell. Biol., 7, 458-469 (1987).

47. L. Mercken, M. J. Simons, S. Swillens, M. Masser i G. Vassart, Nature, 316, 647-651 (1985).

48. R. Lauro, S. Obici, D. Condliffe, V. M. Ursini, A. Musti, C. Moscatelli i V. E. Avvedimento, Eur, J. Biochem., 148,7-11 (1985).

49. Y. Malthiery i S. Lissitzky, Eur. J. Biochem., 165, 491-498 (1987).

50. C. Prody, D. Zevin-Sonkin, A. Gnatt, O. Goldberg i H. Soreq, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3555-3559 (1987).

51. J-L- Sikorav, E. Krejci i J. Massoulie', EMBO J., 6, 1865-1873 (1987).

52. J. G. Oakeshett, C. Collet, R. W. Philips, K. M. Nielsen, R. J. Russel, G. K. Cambers, V. Ross i R. C. Richmond. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 84, 3359-3363 (1987).

53. R. Long, H. Satho, B. Martin, S. Kimura, F. Gonzalez i L. Pohl. Biochem. Biophys. Res. Comm, 156, 866-873 (1988).

54. L. M. C. Hall i P. Spierer, EMBO J., 5, 2949-2954 (1986).

55. S. Sjoberg, P. Carlsson, S. Enerback i G. Bjursell, CABIOS, 5, 41-46 (1989).

56. EP-A-317355.

57. O. Hernell i T. Olivocrona: Human milk lipases II. Bilosalt-stimulated lipase. Biochim. Biophys. Acta, 369, 234-244 (1974).

58. O. Hernell, L. BlackbergiT. Olivecrona: Human milk lipases, W: Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy. Red. E. Lebenthal, Raven Press New York, 347-354 (1981).

59. S. A. Atkinson, M. H. Bryan i G. H. Andersson: Human milk feeding in premature infants: protein, fat and carbohydrate balances in the first two weeks of life. J. Pediatr., 99 627-624 (1981).

60. J. E. Chappell, M. T. Clandinin, C. Kearney-Volpe, B. Reichman i P. W. Swyer: Fatty acid balance studies in premature infants fed human milk or formula: effect of calcium supplementation, J. Pediatr., 108, 438-447 (1986).

61. S. Williamson, E. Finucane, H. Ellis i H. R. Gamsu: Effect of heat treatment of human milk on absorption of nitrogen, fat, sodium, calcium and phosphorus by preterm infants. Arch. Dis. Childhood, 53, 555-563 (1978).

Fig. 2 (1/4)

AOCTTCTCTA TCACTTAACT GTCAAGATGG AAGGAACAGC ACTCTGAAGA TAATGCAAAG 60

AGHTATTCA TOCAGAGGCT G ATG CIG AOC ATG GGG OGC CIO CAA CTG GIT 111

Met Leu Ihr Met Gly Arg Leu Gin Leu Val

10

GIG TIG GGC CTC ACC TGC TGC TGG GCA GIG GGG ACT GCC GCG AAG CIG 159

Val Leu Gly Leu Ihr Cys Cys Trp Ala Val Ala Ser Ala Ala Lys Leu

20 25

GGC Gly	GCC GIG TAC	ACA GAA	GCT Gly	GGG TTC CTG GAA GGC GIC AAT AAG AAG	207
Ala	Val Tyr 30	Ihr	Glu	Gly Fhe Val 35	Glu Gly Val	Asn 40	Lys Lys
CTC	GGC	CTC CIG	GCT GAC	TCT	CTG GAC ATC	TTC AAG GGC	ATC	CCC TTC	255
Leu	Gly	Leu Leu 45	Gly Asp	Ser	Val Asp Ile 50	Fhe Lys Gly 55	Ile	Pro Phe
GCA	GCT	CCC ACC	AAG	GCC	CTG	GAA AAT CCT	CAG CCA CAT	CCT	GGC TGG	303
Ala	Ala 60	Pro Ihr	Lys	Ala	Leu 65	Glu Asn Pro	Gin Pro His 70	Pro	Gly Trp
CAA	GGG	AOC CIG	AAG	GCC	AAG	AAC TTC AAG	AAG AGA TGC	CIG	CAG GCC	351
Gin 75	Gly	Ihr Leu	Lys	Ala . 80	Lys	Asn Phe Lys	Lys Arg Cys 85	Leu	Gin Ala 90
ACC	ATC	AOC CAG	GAC	AGC	ACC	TAC GGG GAT	GAA GAC TGC	CIG	TAC CTG	399
Ihr	Ile	Ihr Gin Asp 95	Ser	Ihr	Tyr Gly Asp 100	Glu Asp Cys	Leu	Tyr Leu 105
AAC	ATT	TGG GIG	COC	CAG	GGC	AGG AAG CAA	CTG TCC CGG	GAC	CTG CCC	447
Asn	Ile	Trp Val 110	Pro	Gin	Gly	Arg Lys Gin 115	Val Ser Arg	Asp 120	Leu Pro
GIT	ATG	ATC TGG	ATC	TAT	GGA	GGC GCC TTC	CIG ATG GGG	TCC	GGC CAT	495
Val	Met	Ile Trp 125	Ile	Tyr	Gly	Gly Ala Fhe 130	leu Met Gly 135	Ser	Gly His
GGG	GCC	AAC TTC	CTC	AAC	AAC	TAC CTG TAT	GAC GGC GAG	GAG	ATC GCC	543
Gly	Ala 140	Asn Phe	Leu	Asn	Asn 145	Tyr Leu Tyr Asp Gly Glu 150	Glu	Ile Ala
ACA	OGC	GGA AAC	GIC	ATC	GIG	CTC ACC TTC	AAC TAC CCT	CTG	GGC CCC	591
Ihr 155	Arg	Gly Asn Val	Ile Val 160	Val Ihr Fhe	Asn Tyr Arg 165	Val	Gly Pro 170
CTT	GGG	TTC CTC AGC ACT GGG	GAC GCC AAT	CIG CCA GCT	AAC	TAT GGC	639
Leu	Gly	Fhe Leu Ser Ihr Gly Asp Ala Asn	Leu Pro Gly	Asn	Tyr Gly

175 180 185

Fig. 2 (2/4)

CIT OGG Leu Arg	GAT Asp	CAG CAC AIG GCC ATT GCT Gin His Met Ala Ile Ala	TCG CTG AAG Trp Val lys	AGG AAT ATC GOG	687
Arg	Asn Ile 200	Ala
190	195
GCC TTC GGG	GGG GAC COC AAC AAC ATC AOG CIG TIG GGG	GAG TCT	GCT	735
Ala Fhe Gly	Gly Asp	Pro Asn Asn Ile	Ihr Leu Phe	Gly Glu Ser Ala
	205		210		215
GGA GCT GOC AGC GTC	TCT CIG CAG ACC	CIG TCC COC	TAC AAC AAG	GGC	783
Gly Gly Ala Ser Val	Ser Leu Gin Ihr	Leu Ser Pro	lyr Asn Lys	Gly
220			225	230
CTC ATC	OGG	OGA GOC	ATC AGC CAG AGC	GGC CTG GOC	CIG	ACT CCC	1GG	831
Leu Ile	Arg Arg Ala	Ile Ser Gin Ser Gly Val Ala	Leu	Ser Pro	Trp
235			240	245			250
GTC ATC	CAG	AAA AAC	OCA CIG TTC TCG	GCC AAA AAG	CTG	GCT GAG	AAG	879
Val Ile	Gin	Lys Asn	Pro Leu Phe Trp	Ala Lys Lys	Val	Ala Glu	Lys
		255		260		265
GTC GCT	TCC	CCT GIG	GCT GAT GCC GCC	AGG ATC GOC	CAG	TCT CTG	AAG	927
Val Gly	Cys	Pro Val	Gly Asp Ala Ala	Arg Met Ala	Gin	Cys Leu	Lys
		270	275			280
GIT ACT	GAT	CCC OGA	GCC CIG AOG CTG	GCC TAT AAG	GTC	COG CIG	GCA	975
Val Ihr Asp Pro Arg Ala Leu Ihr Leu	Ala lyr Lys	Val	Pro Leu	Ala
	285	*	290		295
GGC CIG	GAG	TAC CCC	ATC CIG CAC TAT	GTC GGC TIG	GTC	OCT CTC	ATT	1023
Gly Leu	Glu	Tyr Pro	Met Leu His Tyr	Val Gly Phe Val	Pro Val	Ile
300			305	310
GAT GGA	GAC	TIG ATC	COC GCT GAC OOG	ATC AAC CIG	TAC	GCC AAC	GCC	1071
Asp Gly Asp	Fhe Ile	Pro Ala Asp Pro	Ile Asn Leu	Tyr	Ala Asn	Ala
315			320	325			330
GOC GAC ATC	GAC TAT ATA GCA GGC AOC	AAC AAC AIG	GAC	GGC CAC	ATC	1119
Ala Asp	Ile	Asp lyr Ile Ala Gly Ihr	Asn Asn Met Asp	Gly His	Ile
		335		340		345
TTC GOC	AGC ATC GAC AIG OCT GCC ATC	AAC AAG GGC AAC	AAG AAA	GTC	1167
Fhe Ala	Ser	Ile Asp Met Pro Ala Ile	Asn Lys Gly Asn	lys Lys Val
		350	355			360
kCG &G	GAG	GAC TTC TAC AAG CIG GTC	ACT GAG TTC ACA	ATC AOC AAG	1215
Ihr Glu	Glu	Asp Fhe Tyr Lys Leu Val	Ser Glu Phe Ihr	Ile Ihr lys
	365		370		375
GGG CIG AGA	GGC GOC AAG AOG AOC HT	GAT CTG TAC AOC GAG TCC TOG	1263
Gly Leu Arg	Gly Ala Lys Ihr Ihr Fhe Asp Val Tyr Ihr Glu Ser Trp
380			385	390

Fig. 2 (3/4)

GCC CAG GAC CCA TCC	CAG GAG AAT AAG AAG AAG ACT GIG GIG GAC TTT	1311
Ala 395	Gin Asp	Pro	Ser	Gin 400	Glu Asn Lys	Lys Lys Ihr Val Val Asp Phe
405	410
GAG	ACC GAT	GIC	CTC	TTC	CIG GIG COC ACC GAG	ATT GOC CEA GOC CAG	1359
Glu	Thr Asp Val	Leu 415	Fhe	Leu Val Pro	Ihr Glu 420	Ile Ala Leu Ala Gin 425
CAC AGA GCC AAT	GCC	AAG AGT GOC AAG	ACC TAC	GCC TAC CIG TTT TCC	1407
His	Arg Ala	Asn 430	Ala	Lys Ser Ala lys 435	Ihr Tyr Ala Tyr Leu Fhe Ser 440
CAT	CCC TCT	OGG	ATG	COC -GTC TAC COC	AAA TGG	GIG GGG GOC GAC CAT	1455
His	Pro Ser 445	Arg	Met	Pro	Val Tyr Pro 450	Lys Trp	Val Gly Ala Asp His 455
GCA	GAT GAC	ATT	CAG	TAC	GIT TTC GGG	AAG CCC	TTC GCC ACC COC AOG	1503
Ala	Asp Asp 460	Ile	Gin	Tyr	Val Fhe Gly 465	Lys Pro	Fhe Ala Thr Pro Thr 470
GGC	TAC CGG	COC	CAA	GAC	AGG ACA GTC	TCT AAG	GCC ATG ATC GCC TAC	1551
Gly 475	Tyr Arg	Pro	Gin	Asp 480	Arg Ihr Val *	Ser Lys 485	Ala Met Ile Ala Tyr 490
TGG	ACC AAC	TTT	GCC	AAA	ACA GGG GAC	CCC AAC	ATG GGC GAC TOG GCT	1599
Trp	Ihr Asn	Phe	Ala 495	Lys	Ihr Gly Asp	Pro Asn 500	Met Gly Asp Ser Ala 505
GIG	CCC ACA	CAC	TGG	GAA	CCC TAC ACT	AOG GAA	AAC AGC GGC TAC CIG	1647
Val	Pro Ihr	His 510	Trp	Glu	Pro Tyr Ihr. 515	Thr Glu	Asn Ser Gly Tyr Leu 520
GAG	ATC ACC	AAG	AAG	ATG	GGC AGC AGC	TCC ATG	AAG OGG AGC CTG AGA	1695
Glu	Ile Ihr 525	Lys	Lys	Met	Gly Ser Ser 530	Ser Met	Lys Arg Ser Leu Arg 535
ACC	AAC TTC	CIG	CGC	TAC	TGG ACC CTC	ACC TAT	CIG GOG CIG CCC ACA	1743
Thr	Asn Phe 540	Leu	Arg	Tyr	Trp Ihr Leu 545	Thr Tyr	Leu Ala Leu Pro Thr 550
GIG ACC GAC	CAG	GAG	GCC	ACC CCT GIG	CCC CCC	ACA GGG GAC TCC GAG	1791
Val 555	Ihr Asp	Gin	Glu	Ala 560	Ihr Pro Val	Pro Pro 565	Thr Gly Asp Ser Glu 570
GCC	ACT CCC	GIG	COC	COC	AOG GGT GAC	TCC GAG	ACC GCC COC GIG COG	1839
Ala	Ihr Pro	Val	Pro 575	Pro	Ihr Gly Asp	Ser Glu 580	Thr Ala Pro Val Pro 585
CCC AOG GGT	GAC	TCC	GGG	GCC COC CCC	GIG COG	CCC AOG GGT GAC TCC	1887
Pro Thr Gly Asp 590	Ser	Gly	Ala Pro Pro 595	Val Pro	Pro Thr Gly Asp Ser 600

Fig.2 (4/4)

GGG Gly

GOC COC COC GIG

CCG Pro

COC AOG GCT GAC TCC GGG GOC OOC COC GIG

1935

Ala

Pro 605

Pro Val

Pro

Ihr 610

Gly

Asp

Ser

Gly Ala 615

Pro Pro Val

CCG

COC

AOG

GCT GAC

TCC

GGG

GOC

OOC

COC

GIG

OOG COC

AOG GCT GAC

1983

Pro

Pro

Ihr Gly Asp

Ser

Gly Ala

Pro

Pro

Val

Pro Pro

Ihr Gly Asp

620

•625

630

TCC

GGG

GOC CCC OOC

GIG

OCG

OOC AOG

GCT

GAC

TCC GGG

GCC OOC OOC

2031

Ser

Gly Ala Pro Pro

Val

Pro

Pro Ihr

Gly Asp

Ser Gly

Ala Pro Pro

635

640

645

650

CTG

OCG

CCC AOG GCT

GAC

TCC

GGC GCC

COC

CCC

GIG OOG

CCC AOG GCT

2079

Val

Pro

Pro

Ihr Gly

Asp

Ser

Gly Ala

Pro

Pro

Val Pro

Pro Ihr Gly

655

660

665

GAC

GOC

GGG

OOC COC

OOC

GTG

OCG

CCC

AOG

GCT

GAC TCC

GGC GOC OOC

2127

Asp

Ala

Gly

Pro Pro

Pro

Val

Pro

Pro

Ihr

Gly

Asp Ser

Gly Ala Pro

670

675

680

CCC

GIG

CCG

CCC AOG

GCT

GAC

TCC

GGG

GCC

CCC

CCC GTG

ACO CCC AOG

2175

Pro

Val

Pro

Pro Ihr Gly Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Pro Val

Ihr Pro Ihr

685

690

695

GCT

GAC

TCC

GAG AOC GOC

CCC

GIG

CCG

CCC

AOG

GCT GAC

TCC GGG GOC

2223

Gly

Asp

Ser

Glu Ihr Ala

Pro

Val

Pro

Pro

Ihr Gly Asp

Ser Gly Ala

700

705

710

CCC

CCT

GIG

COC COC AOG

GCT

GAC

TCT

GAG

GCT

GCC CCT

GIG CCC OOC

2271

Pro

Pro

Val

Pro Pro Ihr Gly

Asp

Ser

Glu

Ala

Ala Pro

Val Pro Pro

715

720

725

730

ACA GAT

GAC

TCC AAG

GAA GCT

CAG

ATG

CCT

GCA GTC ATT

AGG ITT

2316

Ihr Asp Asp

Ser Lys

Glu Ala

Gin Met

Pro

Ala Val Ile

Arg Phe

735

740

745

TAGCGTCOCA TCAGCCITGG TATCAAGAGG CCACAAGACT GGGACOOCAG GGGCTCCCCT 2376

CCCATCTTCA GCTCTTCCTG AATAAAGCCT CATACCCCTA AAAAAAAAAA AA

2428

Fig. 3.

GAGGCCACCCCTGTGCCCCCCACAGGGGACTCC 1 ^{1 1} * [ * #

GAGGCCACTCCCGTGCCCCCCACGGGTGACTCC 2

J k * *

GAGACCGCCCCCGTGCCGCCCACGGGTGACTCC 3 * # #

GGGGCCCCCCCCGTGCCGCCCACGGGTGACTCC 4

GGGGCCCCCCCCGTGCCGCCCACGGGTGACTCC 5

GGGGCCCCCCCCGTGCCGCCCACGGGTGACTCC 6

GGGGCCCCCCCCGTGCCGCCCACGGGTGACTCC 7

GGGGCCCCCCCCGTGCCGCCCACGGGTGACTCC 8

GGGGCCCCCCCCGTGCCGCCCACGGGTGACTCC 9

GGCGCCCCCCCCGTGCCGCCCACGGGTGACGCC 10 « *

GGGCCCCCCCCCGTGCCGCCCACGGGTGACTCC 11 *

GGCGCCCCCCCCGTGCCGCCCACGGGTGACTCC 12 *

GGGGCCCCCCCCGTGACCCCCACGGGTGACTCC 13 * *

GAGACCGCCCCCGTGCCGCCCACGGGTGACTCC 14 * * #

GGGGCCCCCCCTGTGCCCCCCACGGGTGACTCT 15 ^{1 1} *

I I

GAGGCTGCCCCTGTGCCCCCCACAGATGACTCC 16 # ** # # # #

Liczba podstawień 6

Identyczne _Q ze wspólny» cha rak te rys tycznym elementem struktury θ o

o o

GGGGCCCCCCCC GIGCCGCCCACGGGTGACTCC

Wspólny charakterystyczny element struktury

A- B C O Kb ta

03.0 ¢2.0 ¢1.5

	Fig. 5 (1/3)
Bssl Ratlpl Bovceh	50 MLTMGRLQLWLGLTCCWAVASAAKLGAVYTEGGFVEGVNKKLGLLG. DS . . .MGRLEVLFLGLTCCLAAACAAKLGALYTEGGFVEGVNKKLSLLGGDS . . . .MLGASRLGPSPGCLAVASAAKLGSVYTEGGFVEGVNKKLSLFG.DS
Zgodność	. . . .grl....lgltcclaaaaAAKLGavYTEGGFVEGVNKKLsLlG.DS
Bssl Ratlpl Bovech	100 vdifkgipfaaptkalenpqphpgwqgtlkaknfkkrclqatitqdstyg VDIFKGIPFA.TAKTLENPQRHPGWQGTLKATQFKKRCLQATITQDDTYG VDIFKGIPFAAAPKALEKPKRHPGWQGTLKAKSFKKRCLQATLTQDSTYG
Zgodność	VDIFKGIPFAa..KaLEnPqrHPGWQGTLKAk.FKKRCLQATiTQDsTYG
Bssl Ratlpl Bovceh	150 DEDCLYLNIWVPQGRKQVSRDLPVMIWIYGGAFLMGSGBGANFLNNYLYD QEDCLYLNIWVPQGRKQVSHDLPVMVWIYGGAFLMGSGQGANFLKNYLYD NEDCLYLNIWVPQGRKEVSHDLPVMIWIYGGAFLMGASQGANFLSNYLYD
Zgodność	EDCLYLNIWVPQGRKqVShDLPVMiWIYGGAFLMGsgqGANFL.NYLYD
Bssl Ratlpl Bovech	200 GKKIATRGNVIWTFNYRVGPLGFLSTGDANLPGNYGLRDQHMAIAWVKR GKKIATRANVIWTFNYRVGPLGFLSTGDANLPGNFGLRDQHMAIAWVKR GKKIATRGNVIWTFNYRVGPLGFLSTGDSNLPGNYGLWDQHMAIAWVKR
Zgodność	GKKIATRgNVIWTFNYRVGPLGFLSTGDaNLPGNyGLrDQHMAIAWVKR
Bssl Ratlpl Bovceh	# * 250 NIAAFGGDPNNITLFGESAGGASVSLQTLSPYNKGLIRRAISQSGVALSP NIAAFGGDPNNITIFGESAGGAIVSLQTLSPYNKGLIRRAISQSGVALSP NIEAFGGDPDNITLFGESAGGASVSLQTLSPYNKGLIKRGISQSGVGLCP
Zgodność	NIaAFGCDPDNITLFGESAGGAsVSLQTLSPYNKGLIrRaISQSGVaLsP
Bssl Ratlpl Bovech	300 WVIQKNPLFWAKKVAKKVGCPVGDAARMAQCLKVTDPRALTLAYKVPLAG WAIQENPLFWAKTIAKKVGCPTEDTAKMAGCLKITDPRALTLAYRLPLKS WAIQQDPLFWAKRIAKKVGCPVDDTSKMAGCAKITDPRALTLAYKLPLGS
Zgodność	WaIQ.nPLFWAK.iAKKVGCPv.DtakMAgClKiTDPRALTLAYklPL. s
Bssl Ratlpl Bovceh	350 LEYPMLHYVGFVPVIDGDFIPADPINLYANAADIDYIAGTNNMDGHIFAS QEYPIVEYLAFIPWDGDFIPDDPINLYDNAADIDYLAGINDMDGHLFAT TEYPKLHYLSFVPVIDGDFIPDDPVNLYANAADVDYIAGTNDMDGHLFVG
Zgodność	.EYP.1HY1.FvPViDGDFIPdDPiNLYaNAADiDYiAGtNdMDGHlFa.

Fig. 5 (2/3)

Bssl

Ratlpl

Bovech

Zgodność

400

IDMPAINKGNKKVTEEDFYKLVSEFTITKGLRGAKTTFDVYTESWAQDPS VDVPAIDKAKQDVTEEDFYRLVSGHTVAKGLKGTQATFDIYTESWAQDPS MDVPAINSNKQDVTEEDFYKLVSGLTVTKGLRGANATYEVYTEPWAQDSS .DvPAInk.kqdVTEEDFYkLVSg.TvtKGLrGa.aTfdvYTEsWAQDpS

Bssl

Ratlpl

Bovceh

Zgodność

450

QENKKKTWDFETDVLFLVPTEIALAQHRANAKSAKTYAYLFSHPSRMPV QENMKKTWAFETDILFLIPTEMALAQHRAHAKSAKTYSY LFSHPSRMPI QETRKKTMVDLETDILFLIPTKIAVAQHKSHAKSANTYTYLFSQPSRMPI QEn. KKTWdf ETDiLFLiPTeiAlAQHrahAKSAkTY. YLFShPSRMPi

Bssl

Ratlpl

Bovech

Zgodność

500

YPKWVGADHADDIQYVFGKPFATPTGYRPQDRTVSKAMIAYWTNFAKTGD

YPKWMGADHADDLQYVFGKPFATPLGYRAQDRTVSKAMIAYWTNFAKSGD

YPKWMGADHADDLQYVFGKPFATPLGYRAQDRTVSKAMIAYWTNFARTGD

YPKWmGADHADDlQYVFGKPFATPlGYRaQDRTVSKAMIAYWTNFAktGD

Bssl

Ratlpl

Bovceh

Zgodność

550

PNMGDSAVPTHWEPYTTENSGYLEITKKMGSSSMKRSLRTNFLRYWTLTY PNMGNSPVPTHWYPYTMENGNYLDINKKITSTSMKEHLREKFLKFWAVTF PNTGHSTVPANWDPYTLEDDNYLEINKQMDSNSMKLRTLTNYLQFWTQTY PNnG.S.VPthW.PYT.Kn.nYlelnKkm.S.SMK.hLRtnfL.fWt.Ty

596

Bssl

Ratlpl

Bovech

Zgodność

LALPTVTDQ EMLPTV... QALPTVTSA

EATPVPPTGDS

VGDHTPPKDDS

GASLLPPEDNS

EATPVPPTGDS

EAAPVPPTDDS

QASPVPPADNS

ETAPVPPTGDS

DGGPVPPTDDS

GAPTEPSAGDS

GAPP

QTTP .aLPTVt....a...PP.ddS.eA.PVPPtddS....pvPptgDS....p

Bssl

Ratlpl

Bovceh

642

VPPTGDS VPPTDNS	GAPPVPPTGDS QA......i . .	GAPPVPPTGDS	GAPPVPPTGDS	GAPPVP

s. .a

Zgodność

Fig. 5 (3/3)

Bssl

Rarlpl

Bovech

689

PTGDS	GAPPVPPTGDS	GAPPVPPTGDS	GPPPVTPTGDS	GAPPVPPTG

Zgodność

Bssl

Ratlpl

Bovceh

Zgodność

735

DS • ·	GAPPVTPTGDS	ETAPVPPTGDS	GAPPVPPTGDS	EAAPVPPTDDS ........gds

................................................ds

Bssl KE.AQMPAVIRF Ratlpl VE.AQMPGPIGF Bovech . EVAQMPWIGF

Zaodność .e.AQMP.v!gF (76-90)

BSSL (116-130)

ChesHum (114-128)

Torpace (101-115)

Drosceh (103-117)

Ratlivce (224-238)

Drosace (2257-2270)

ThryHum (90-114)

Diet.Di

G

P

P

N

D

K •

G

Fig. 6 (1/3)

Zgodność (95-113)

BSSL (134-150)

ChesHum (132-150)

Torpace (118-136)

Drosceh (121-138)

Ratlivce (273-291)

Drosace (2270-2291)

ThryHum

Diet.Di

Zgodność (135-156)

BSSL (166-187)

ChesHum (164-185)

Torpace (150-171)

Drosceh (153-174)

Ratlivce (307-328)

Drosace (2307-2328)

ThryHum (118-136)

Diet. Di

Zgodność

S

R

D

L

P

V

M

I

w

I

Y

G

G

a|7

L

M

G

S

P

K

D

A

T

V

L

I

w

I

Y

G

G

G

F

Q

T

G

T

P

K

S

A

T

V

M

L

w

I

Y

G

G

G

F

Y

s

G

s

R

N

S

F

P

V

V

A

H

I

H

G

G

A

F

M

F

G

A

N

S

R

L

P

V

M

V

W

I

H

G

G

G

L

I

I

G

G

T

N

G

L

P

I

L

I

W

I

Y

G

G

G

F

M

T

G

S

A

P

N

A

s

V

L

V

F

F

H

N

T

M

D

R

E

E

S

•

•

•

1

P

V

V

i

y

g

g

g

f

•

•

g

s

N

V

I

V

V

T

F

N

Y

R

V

G

P

L

G

F

L

s

T

R

V

I

V

V

S

M

N

Y

R

V

G

A

L

G

F

L

A

L

E

z

v

L

V

S

L

S

Y

R

V

G

A

F

G

F

L

A

L

K

F

I

L

V

K

I

S

Y

R

L

G

P

L

G

F

V

S

T

N

V

V

V

V

T

I

Q

Y

R

L

G

F

G

G

L

F

S

T

N

V

I

V

A

s

F

Q

Y

R

V

G

A

F

G

F

L

H

L

N

L

I1

V

V

T

A

s

Y

R

V

G

V

F

G

F

L

S

S

V

I

V

V

T

I

N

Y

R

L

G

I

L

L

M

G

T

n

V

i

V

V

t

f

n

Y

R

V

g

•

•

G

f

1

S

t

G

P

H

G

G

A

G •

g

D A

G N

G S

D E

D E

P E

S G • · d .

Fig. 6 (2/3)

(157-182) BSSL

N

L

P G

N

y

G

L

R

D Q

H M

A

I A

w

V

K R

N I A A F G

(189-214)

ChesHum

E

A

P

G

N

M

G

L

F

D

Q

Q

L

A

L

Q

w

V

Q

K

N

I

A

A

F

G

(187-212)

Torpace

E

A

P

G

N

M

G

L

L

D

Q

R

M

A

L

Q

w

V

H

D

N

I

Q

F

F

G

(172-197)

Drosceh

D

L

P

G

•N

Y

G

L

K

D

Q

R

L

A

L

K

w

I

K

Q

N

I

A

S

F

G

(175-200)

Ratlivce

H

S

R

G

N

W

A

H

L

D

Q

L

A

A

L

R

w

V

Q

D

N

I

A

N

F

G

(336-361)

Drosace

E

A

P

G

N

V

G

L

W

D

Q

A

L

A

I

R

w

L

K

D

N

A

H

A

F

G

(2329-2354)

ThryHum

E

V

S

G

N

N

G

L

L

D

Q

V

A

A

L

T

w

V

0

T

H

I

R

G

F

G

Diet.Di

Zgodność

e

1

P

G

N

W

q

1

1

D

Q

A

1

•

w

V

d

n

i

a

a

F

G

(183-207)

BSSL (215-239)

ChesHum (213-237)

Torpace (198-222)

Drosceh (201-225)

Ratlivce (362-386)

Drosace (2354-2379)

ThryHum (137-149)

Diet.Di

Zgodność

1 s p

Fig.6 (3/3) (208-231)

BSSL Y N K (240-263)

ChesHum G S H (238-261)

Torpace G S R (223-246)

Drosceh D F G (226-249)

Ratlivce LAK (387-410)

Drosace V T R (2382-2402)

ThryHum T N S (150-173)

Diet. Di Y S R

Zgodność n k

salspwaig.

(285-297) BSSL

V

G

F

V

P

V

I

D

G

D

F

I

0

(316-328) ChesHum

V

N

F

G

P

T

V

D

G

D

F

L

T

(314-326) Torpace

F

S

F

V

P

V

I

D

G

E

F

F

P

(298-310) Drosceh

A

P

F

S

P

V

L

E

P

S

D

A

P

(298-306) Ratlivce

•

•

•

•

T

V

I

D

G

V

V

L

P

(466-477) Drosace

P

S

•

A

P

T

I

D

G

A

F

L

P

(2458-2468) ThryHum

•

•

w

G

P

V

I

D

G

H

F

L

R

(224-236) Diet.Di

T

I

w

S

P

V

I

D

G

D

A

F

I

Zgodność

•

•

f

•

P

V

•

d

g

d

f

•

P

Fig. 7.

30 50

AKLGAVYTEGGFVEGVNKKLGLLGDSVDIFKGIPFAAPTKALENPQPHPGWQGTLKAKNF

90 110 kkrclqatitQdstygdedclylniwvpqgrkqvsrdlpvmiwiyggaflmgsghganfl

130 150 170

NNYLYDGEEIATRGNVIWTFNYRVGPLGFLSTGDANLPGNYGLRDQHMAIAWVKRNIAA

190 210 230

FGGDPNNITLFGESAGGASVSLQTLSPYNKGLIRRAISQSGVALSPWVIQKNPLFWAKKV

250 270 290

AEKVGCPVGDAARMAQCLKVTDPRALTLAYKVPLAGLEYPMLHYVGFVPVIDGDFIPADP -exon a310 330 350

INLYANAADIDYIAGTNNMDGHIFASIDMPAINKGNKKVTEEDFYKLVSEFTITKGLRGA

370 390 410

KTTFDVYTESWAQDPSQENKKKTWDFETDVLFLVPTEIALAQHRANAKSAKTYAYLFSH ..... exon-b — 430 450 470

PSRMPVYPKWVGADHADDIQYVFGKPFATPTGYRPQDRTVSKAMIAYWTNFAKTGDPNMG -exon c-490 510 530

DSAVPTHWEPYTTENSGYLEITKKMGSSSMKRSLRTNFLRYWTLTYLALPTVTDQEATPV exon d--...... # — - '

550 570 590

PPTGDSEATPVPPTGDSETAPVPPTGDSGAPPVPPTGDSGAPPVPPTGDSGAPPVPPTGD

610 630 650

SGAPPVPPTGDSGAPPVPPTGDSGAPPVPPTGDSGAPPVPPTGDAGPPPVPPTGDSGAPP

670 690 710

VPPTGDSGAPPVTPTGDSETAPVPPTGDSGAPPVPPTGDSEAAPVPPTDDSKEAQMPAVI

RF

Acetonitryl %

Objętość elucji, ml

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 1,00 zł.

Claims (11)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania białka wykazującego jedną lub szereg decydujących funkcji naturalnie występującej lipazy stymulowanej solami kwasów żółciowych o sekwencji aminokwasów przedstawionej na fig. 7, znamienny tym, że wstawia się sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 2 lub jej część do wektora zawierającego odpowiednią sekwencję nukleotydową ukierunkowującą organizm gospodarza na ekspresję pożądanego białka, wstawia się tak otrzymany wektor do organizmu gospodarza, wybranego z grupy obejmującej bakterie, drożdże, hodowle komórek zwierzęcych i zwierzęta transgeniczne, hoduje się otrzymany organizm gospodarza i wyodrębnia się białko.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania białka o sekwencji aminokwasów przedstawionej na fig. 7, od pozycji 1 do pozycji 722, stosuje się sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 2 od pozycji 151 do pozycji 2316.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania białka o sekwencji aminokwasów przedstawionej na fig. 7, od pozycji 1 do pozycji 535, stosuje się sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 2 od pozycji do pozycji 151 do pozycji 1755.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania białka o sekwencji aminokwasów przedstawionej na fig. 7 od pozycji 1 do pozycji 278, stosuje się sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 2 od pozycji 151 do pozycji 985.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania białka o sekwencji aminokwasów przedstawionej na fig. 7 od pozycji 1 do pozycji 341, stosuje się sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 2 od pozycji 151 do pozycji 1172.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania białka o sekwencji aminokwasów jak przedstawiono na fig. 7 od pozycji 1 do pozycji 409, stosuje się sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 2 od pozycji 151 do pozycji 1376.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania białka o sekwencji aminokwasów jak przedstawiono na fig. 7 od pozycji 1 do pozycji 474, stosuje się sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 2 od pozycji 151 do pozycji 1574.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania białka o sekwencji aminokwasów jak przedstawiono na fig. 7 od pozycji 1 do pozycji 278, lub od pozycji 279 do pozycji 341, lub od pozycji 279 do pozycji 409, lub od pozycji 279 do pozycji 474, lub od pozycji 342 do pozycji 409, lub od pozycji 342 do pozycji 474, lub od pozycji 536 do pozycji 722, stosuje się odpowiednie sekwencje nukleotydowe przedstawione na fig. 2, od pozycji 151 do pozycji 985, lub od pozycji 986 do pozycji 1172, lub od pozycji 986 do pozycji 1376, lub od pozycji 986 do pozycji 1574, lub od pozycji 1173 do pozycji 1376, lub od pozycji 1173 do pozycji 1574, lub od pozycji 1687 do pozycji 2316.
9. 9. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, znamienny tym, że stosuje się sekwencje z jednym lub większą liczbą powtórzeń przedstawionych na fig. 5.
10. 10. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, znamienny tym, że stosuje się sekwencje zawierające dodatkowo metioninę jako N-końcowy aminokwas.
11. 11. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że stosuje się sekwencje zawierające dodatkowo metioninę jako N-końcowy aminokwas.