CZ287470B6 - Léčivo k ošetřování patologického stavu, souvisejícího s exokrinní pankreatickou nedostatečností - Google Patents

Abstract

Použití rekombinantního proteinu, jak je uveden na obrázku VII od polohy 1 do polohy 722, nebo jeho funkční varianty, která projevuje schopnosti a stabilitu, jaké jsou blíže specifikovány v popise, pro výrobu léčiva k ošetřování patologického stavu, souvisejícího s exokrinní pankreatickou nedostatečností.ŕ

Description

Léčivo k ošetřování patologického stavu, souvisejícího s exokrinní pankreatickou nedostatečností

Oblast techniky

Předložený vynález se týká použití rekombinantního proteinu, jak je uveden na obrázku VII od polohy 1 do polohy 722, nebo jeho funkční varianty, která projevuje dále specifikované schopnosti a stabilitu, pro výrobu léčiva k ošetřování patologického stavu, souvisejícího s exokrinní pankreatickou nedostatečností.

Dosavadní stav techniky

Lidská laktující mléčná žláza syntetizuje a seceruje s mlékem žlučovou solí stimulovanou lipázou (BSSL - bile salt stimulated lipase) (Blackberg L. Ángquist K.A. a Hemell O. /1987/ FEST Lett. 217, 37-41/, po specifické aktivaci primárními žlučovými solemi (Hemell O. /1975/ Eur. J. Clin. Invest. 5,267-272; Hemell O. a Olivecrona T. /1974/ Human milk lipases II. Bile salt-stimulated lipase, Biochem. Biophys. Acta, 369, 234-244; Hemell O., Blackberg L. a Olivecrona T. /1981/ Human milk lipase v Textbook of gastrenterology and nutrition in infancy, E. Lebenthal, vyd., Raven Press, New York, 347-354), která přispává u kojených dětí k endogenní kapacitě intestinálního štěpení tuku (Hemell O., Blackberg L. a Bembáck S. /1988/ v Perinetal nutrition /Lindblad B. S., vyd./ Bristol-Myers Nutrition Symposia, sv. 6, str. 259-272, Academie Press, New York; (Hemell O., Blackberg L. a Fredrikzon B. a T. Olivecrona. 1981. Bile salt-stimulated lipase in human milk and lipid digestion in the neanatal period. V Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy. E. Lebenthal, vyd. Raven Press, New York, 465D71; Bembáck S., Blackberg L. a hemell O. /1990/ J. Clin. Invest. J. Clin. Invest. 221-226 /1990//. Tento enzym, který činí přibližně 1 % celkového mléčného proteinu /Blackberg L. a Hemell O. /1981/ Eur. J. Biochem 116, 221-225/, je nespecifickou lipázou; in vitro hydrolyzuje nejen tri-, di- a monoacylglyceroly, ale také cholesteryl- a retinylestery a lysofosfatidylglyceroly /Hemell O. a Blackberg L. /1982/ Pediatr. Res. 16, 882-885; Blackberg L., Lombardo D., Hemell O., Guy O. a Olivecrona T. /1981/ FEBS Lett. 136, 284-288; Fredrikzon B., Hemell O., Blackberg L. a Olivecrona T. /1978/ Pediatr. Res. 12,1048-1052; Wang C.-S., Hartsuck J.A. a Downs D. /1988/ Biochemistry 27, 4834D840/. Navíc její aktivita není omezena na emulgované substráty, ale stejnými rychlostmi jsou hydrolyzovány micelámí a rozpustné substráty (Blackberg L. a Hemell O. /1983/FEBS Lett. 157, 337-341/.

BSSL není degradována během průchodu mléka žaludkem a v duodenálním obsahu je chráněna žlučovými solemi před inaktivací pankreatickými proteázami, jako je trypsin a chymotrypsin /Hemell O. /1975/ Eur. J. Clin. Invest. 5, 267-272; Blackberg L. a Hemell O. /1983/ FEBS Lett. 157, 337-341/. Nicméně je inaktivována při pasteuraci mléka, např. zahřátím na 62,5 °C, 30 min /Bjorksten B., Burman L. G., DeChateau P., Fredrikzon B. Gothefors L. a Hemell O. /1980/ Br. Med. J. 201, 267-272/. Modelové pokusy in vitro potvrzují, že konečné produkty štěpení triacylglycerolu se za přítomnosti BSSL /Bembáck S., Blackberg L. a Hemell O. /1990/, J. Clin. Invest. J. Clin. Invest. 221-226 /1990/; Hemell O. a Bláckberg L. /1982/ Pediatr. Res. 16, 882— 885/ liší. Vzhledem k větším intraluminálním koncentracím žlučové soli během neonatálního období /Brueton M.J., Berger H.M., Brown G.A., Ablitt L., Iyangkaran N. a Wharton B.A. /1978/ Gut 19, 95-98; Murphy G.M. a Singer E. /1975/ Gut 15, 151-163/ může být zlepšena absorpce produktů /Bembáck S., Bláckberg L. a Hemell O. /1990/ J. Clin. Invest. J. Clin. Invest. 221-226 /1990//.

Karboxyester-hydrolýza /CEH/ lidské pankreatické šťávy /Lombardo D., Guy O. Figarella C. /1978/ Biochem. Biophys. Acta 527, 142-149/ se funkčně jeví jako identická nebo alespoň velmi podobná BSSL /Bláckberg L., Lombardo D., Hemell O., Guy O. a Olivecrona T. /1981/ FEBS Lett. 136, 284—288/. Obsahuje také obvyklé epitopy /Bláckberg L., Lombardo D., Hemell O.,

-1 CZ 287470 B6

Guy O. a Olivecrona T. /1981/ FEBS Lett. 136, 284-288; Abouakil N., Rogalska E., Bonicel J. a Lombardo D. /1988/ Biochem. Biophys. Acta 961, 299-308/, mají identické N-terminální aminokyselinové sekvence /Abouakil N., Rogalska E., Bonicel J. a Lombardo D. /1988/ Biochim. Biophys. Acta 961, 299-308/ a jsou inhibovány inhibitory serin-esteráz, např. eserinem a 5 diizopropylfluorefosfátem /Bláckberg. L. a Hemell O. /1981/ Eur. J. Biochem 116, 221-225;

Bláckberg L., Lombardo D., Hemell O., Guy O. a Olivecrona T. /1981/ FEBS Lett. 136, 284288; Lombardo D., Guy O. a Figarella C. /1978/ Biochem. Biophys. Acta 527, 142-149/. Bylo předpokládáno, že dva enzymy jsou produkty stejného genu /Hemell O., Blackberg L. a Lindberg T. /1988/ v Textbook of Gastroenterology and Nutrition in infancy /Lebenthal E., ed/ str. 209ío 217, Raven Press, New York/. Pozorovaný rozdíl v molekulové velikosti /Blackberg L.,

Lombardo D., Hemell O., Guy O. a Olivecrona T. /1981/ FEBS Lett. 136, 284-288; Fredrikzon B., Hemell O., Bláckberg. L. a Olivecrona T. /1978P Pediatr. Res. 12, 1048-1052/ by mohl být vysvětlen rozdílnými různými stupni glykosylace, jak bylo v poslední době potvrzeno /Abouakil N., Rogelska E., Bonicel J. a Lomberdo D. /1988/ Biochim. Biophys. Acta 961, 299-308/.

Dietní lipidy jsou důležitým zdrojem energie. Energeticky bohaté triacylglyceroly tvoří více než 95 % těchto lipidů. Některé z těchto lipidů, např. určité mastné kyseliny a vitaminy, rozpustné v tucích, jsou podstatnými dietními složkami. Před gastrointestinální absorpcí triacylglyceroly, jakož i minoritní složky, tj. esterifikované v tucích rozpustné vitaminy a cholesterol a 20 diacylfosfatidylglyceroly, vyžadují hydrolýzu esterových vazeb pro získání hydrofobnějších absorbovatelných produktů. Tyto reakce jsou katalyzovány specifickou skupinou enzymů, nazývaných lipázy.

U dospělého člověka jsou za podstatné lipázy považovány gastrická lipáza, pankreatická 25 colipáza-dependentní lipáza /hydrolýza tri- a diacylglycerolu/, pankreatická fosfolipáza AZ /diacylfosfatidylglyceroly/ a karboxyesterhydroláza /cholesterylestery a estery v tucích rozpustných vitaminů/. U kojených novorozenců hraje žlučovou solí stimulovaná lipáza důležitou úlohu při hydrolýze některých výše uvedených lipidů. Spolu se žlučovými solemi produktu štěpení lipidu tvoří směsné micely, ze kterých dochází k absorpci /Hemell O., Bláckberg L. a 30 Bembáck S. /1988/ v Perinatal nutrition /Lindblad B.S., ed. /Bristol-Myerst Nutrition symposia sv. 6, str. 259272, Academie Press, New York; Hemell O., L. Bláckberg, B. Frederikzon a T. Olivecrona. 1981. Bíle salt-stimulated lipase in human milk and lipid digestion in the neonatal period. V Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy. E. Lebenthal, editor. Raven Press, New York. 465-471; Bembáck S., Bláckberg L. a Hemell O. /1990/ J. Clin. Invest. J.

Clin. Invest. 221-226/1990/Obvyklé případy lipidové malabsorpce a tudíž podvýživy jsou snížené intraluminální hladiny pankreatická colipáza-dependentní lipázy a/nebo žlučových solí. Typickými příklady takové defícience lipázy jsou pacienti, trpící cystickou fibrózou, běžnými genetickými poruchami, 40 vedoucími u asi 80 % pacientů ke zkrácení délky života, a chronickou pankreatitidou, často způsobenou chronickým alkoholismem.

Funkce pankreatu a jater nejsou plně při narození vyvinuty, zejména ne u předčasně narozených dětí. Obvykle je zjištěna tuková malabsorpce z fyziologických příčin a předpokládá se, že vzniká 45 z nízkých intraluminálních koncentrací pankreatické colipáza-dependentní lipázy a žlučové soli /Hemell O., Bláckberg L. a Bembáck S. /1988/ v Perinatal nutrition /Lindblad B.S. ed/, Bristol Myers Nutrition Symposia sv. 6., str. 259272, Academie Press, New York; Hemall O., Bláckberg L., Frederikzon B. a Olivecrona T. 1981. Bíle salt-stimulated lipase in human milk and lipid digestion in the neonatal period. V Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy. E.

Lebenthal, vyd. Raven Press, New York; Brueton M.J., Berger H.M., Brown G.A., Ablitt L., Iyangkaran N. a Wharton B.A. /1978/ Gut 19, 95-98; Murphy G.M. a Signer E. /1975/ Gut 15, 151-163; Hemell O., Staggers J.E. a Carey M.C. Biochemistry /1990/, 29:2041-2056/. Nicméně kvůli BSSL je taková malabsorpce méně častá u kojených dětí než u dětí, krmených pasteurovaným lidským mlékem, vhodným pro děti /Hemell O., Bláckberg L. a Bembáck S.

/1988/ v Perinatal nutrition /Lindblad B.S. ed/ Bristol-Myers Nutrition symposia sv. 6, str.

-2CZ 287470 B6

259272, Academie Press, New York; Hernell O., Blackberg L., Frederikzon B. a Olivecrona T. 1981. Bile salt-stimulated lipasein human milk and lipid degestion in the neonatal period. V Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy. E. Lebenthal, vyd. Raven Press, New York; 465-471; Bembáck S., Blackberg L. a Hernell O. /1990/ J. Clin. Invest. J. Clin. Invest. 221-226 /1990/; Bjorksten B., Burman L.G., deChateau P., Frekrikzon B., Gothefors L. a Hernell

O. /1980/ Br. Med.J. 201, 267-272; Atkinson S.A., M.H. Bryan a G.H.Andersson. 1981. Human milk feeding in premature infents: protein, fat and carbohydrate balance in the first two weeks of lige. J. Pediatr. 99:617—624; Chappell J.E., M.T.Clandinin, C.Keamey-Volpe, B.Reichman a

P. W.Swyer. 1986. Fatty acid balance studies in premature infents fed human milk or formula: effect of calcium supplementation. J. Pediatr. 108:438-447; Williamson S., E. Finucane, H. Ellis a H.R. Gamsu. 1978. Effect of heat treatment of human milk on absorption of ntirogen, fat, sodium, calcium and phosphorus by preterm infents. Arch. Dis. Chíldhood 53:555-563/. Toto je jedna z příčin, proč je předkládána teorie, že novorozenci, zejména předčasně narozené děti, které nemohou být krmeny mateřským mlékem svých matek, by měly být krmeny nepasterovaným mlékem jiných matek /Bjorksten B., Burman L.G., deChateu, P. Fredrikzon B., Gothefors L. a Hernell O. /1980/ Br. med. J. 201, 267-272/.

Léčení pacientů, postižených deficitem pankreatické lipázy, zahrnuje podání velmi velkých dávek surového přípravku vepřových pankreatických enzymů. Colipáza-dependentní pankreatická lipáza je při nízkém pH inaktivována. Takové podmínky převládají v žaludku, což způsobuje, že orálně podávaná pankreatická lipáza je skutečně zcela inaktivována průchodem žaludkem do střeva. Tento efekt nemůže být úplně překonán použitím velkých dávek enzymu. Velké podávané dávky jsou neadekvátní u mnoha pacientů a přípravky nejsou čisté a chutné. Některé tablety byly formulovány tak, že procházejí kyselými oblastmi žaludku a uvolňují enzym pouze v relativně alkalickém prostředí jejuna. Nicméně mnoho pacientů, postižených pankreatickými poruchami, má abnormálně kyselé jejunum a takové tablety pak neuvolňují a mohou být proto neúčinné. Navíc jelikož dostupné přípravky jsou z nehumánního zdroje, je zde nebezpečí imunoreakcí, které mohou mít nebezpečný vliv na pacienta nebo vedou ke sníženému účinku léčby. Další nevýhodou existujících přípravků je, že jejich obsah dalších lipolytických aktivit než colipáza-dependentní lipáza není stanoven. Ve skutečnosti většina z nich obsahuje velmi nízké hladiny CEH/BSSL aktivity. Toto může být jedna z příčin, proč mnoho pacientů, trpících cystickou fibrózou, přes doplňkovou léčbu trpí deficitem vitaminů rozpustných v tucích a esenciálních mastných kyselin.

Existuje značná potřeba produktů s vlastnostmi a strukturou, odvozenou od lidských lipáz, a se širokou substrátovou specifitou, které by mohly být orálně podávány pacientům, trpícím nedostatkem jednoho nebo několika pankreatických lipolytických enzymů. Produkty podle předloženého vynálezu splňují tuto potřebu jako takové nebo v kombinaci s dalšími lipázami nebo v kombinaci s přípravky, obsahujícími další lipázy. Dále pro některé děti je zde potřeba zlepšení využití tuku z běžných dětských přípravků nebo pasterovaného lidského mléka z tak zvaných mléčných bank.

BSSL má některé jedinečné vlastnosti, pro které je ideálně vhodná pro substituční a doplňkovou terapii. Svým charakterem je určena pro orální podání. Je rezistentní při průchodu žaludkem a je aktivována v obsahu tenkého střeva. Její specifický aktiva ční mechanismus by měl bránit nebezpečné lipolýze potravy nebo tkáňových lipidů během zdržení a průchodu na místo jejího působení. Vzhledem ke své široké substrátové specifitě je schopna kompletního štěpení většiny dietních lipidů včetně esterů v tucích rozpustných vitaminů.

BSSL může být vynikající s pankreatickou colipázadependentní lipázou pro hydrolýzu esterových vazeb, obsahujících polynenasycené mastné kyseliny s dlouhým řetězcem.

Za přítomnosti gastrické lipázy a za nepřítomnosti nebo při nízkých hladinách colipázadependentní lipázy BSSL je možno zjistit úplné in vitro štěpení triacylglycerolu, i když hladiny žlučových solí jsou tak nízké jako u novorozenců. Za přítomnosti BSSL konečné produkty

-3CZ 287470 B6 štěpení triacylglycerolu tvoří volné mastné kyseliny a volný glycerol spíše než volné mastné kyseliny a monoacylglycerol, získané jinými dvěma lipázami /Bemback S., Blackberg L. a Hemell O. /1990/ J. Clin. Invest. 221-226 /1990//. Mohou podporovat absorpci produktu zejména, když jsou intraluminální hladiny žlučových solí nízko /Hemell O., Blackberg L. a Bemback S. /1988/ vPerinatal nutrition /Lindblad B.S., ed./ Bristol-Myers Nutrition symposia sv. 6, str. 259271, Academie Press; Hemell O., Staggers J.E. a Carey M.C. Biochemistry /1990/, 29:2041-2056/.

Podle dřívějšího přístupu byl dětská výživa vyvíjena a zlepšována tak, aby její sloužení bylo co nejpodobnější lidskému mléku. Takovou potravu je žádoucí doplnit.

Použití žlučovou solí stimulovaných lipáz /BSSL/ nebo proteinů s podstatnými funkcemi BSSL pro doplnění, substituci nebo terapii nicméně vyžaduje přístup ke značně velkým množstvím produktu. V průmyslovém měřítku není možno využívat přirozených zdrojů, jako je mléko, jako výchozí surovina. Mimo problému, uvedeného výše s inaktivací BSSL během pasterizace, je zde další nebezpečí kontaminace materiálu z přirozeného zdroje infekčními činidly, např. viry, jako je EÍIV virus a CMV. Proto existuje potřeba dostupnosti produktů, majících BSSL vlastnosti ve velkém měřítku. Předložený vynález poskytuje takové produkty a způsoby jejich přípravy.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je použití rekombinantního proteinu, jak je uveden na obrázku VII od polohy 1 do polohy 722, nebo jeho funkční varianty, která projevuje

- schopnost být aktivována zvláštními solemi žlučové kyseliny,

- schopnost působit jako nespecifická lipáza v tenkém střevě, kde se projevuje schopnost hydrolýzy lipidů relativně nezávisle na jejich chemické struktuře a fyzikálním stavu, jako je emulgace, micelámí stav nebo solubilizace,

- schopnost hydrolýzy triacylglycerolů mastnými kyselinami o rozdílné délce řetězce a rozdílném stupni nenasycenosti,

- schopnost hydrolýzy dalších látek, jako jsou diacylglyceroly, monoacylglyceroly, cholesterylestery, lysofosfatidylacylglyceroly a retinyl- a jiné estery vitaminů, rozpustné v tucích,

- schopnost hydrolýzy nejen pouze sn—1 (3) esterových vazeb v triacylglycerolu, ale také sn-2 esterové vazby,

- schopnost reagovat nejen s primárními, ale také se sekundárními solemi kyseliny žlučové,

- závislost na solích kyseliny žlučové pro optimální aktivitu,

- stabilita, takže obsah žaludku není nepříznivě ovlivněn katalytickými účinky v jakémkoli podstatném stupni,

- stabilita vůči inaktivaci proteázami slinivky břišní, například tiypsinem, za předpokladu, že jsou přítomny soli kyseliny žlučové,

- schopnost vázat deriváty heparinu, například heparinsulfát,

- schopnost vázat se na fázovém rozhraní lipid - voda, a

- stabilita při smísení s některými složkami potravy, jako je mateřské mléko nebo mléčné přípravky, pro výrobu léčiva k ošetřování patologického stavu, souvisejícího s exokrinní pankreatickou nedostatečností.

Výhodné použití podle tohoto vynálezu je určeno pro výrobu léčiva k ošetřování cystické fibrózy, chronické pankreatidy, tukové malabsorpce, malabsorpce vitaminů, rozpustných v tucích, a k ošetřování tukové malabsorpce, způsobené fyziologickými příčinami.

-4CZ 287470 B6

Všechna použití podle tohoto vynálezu jsou výhodně určena pro výrobu léčiva pro souběžné, oddělené nebo postupné podávání v kombinaci s lipázou nebo lipázami.

Dále se uvádí detailní popis tohoto vynálezu v širších souvislostech.

Předložený vynález je založen na klonování cDNA kódující BSSL, odvozenou z lidské mléčné žlázy. Byla také izolována z lidského pankreatu parciální cDNA, kódující CEH. Odvozené aminokyselinové sekvence od lidských cDNA a srovnání s CEH jiných druhů podporují výklad, že BSS1 a CEH jsou identické.

Jak bude dále detailně popsáno, bylo s překvapením zjištěno, že struktura proteinu, odvozeného do cDNA sekvence, je zcela rozdílná od struktury jiných lipáz. Struktura se neočekávaně jeví být podobnější struktuře typických esteráz, jako je cholinesteráza.

S odkazem na obr. II a obr. VII, produkty podle vynálezu jsou:

a/ protein, definovaný aminokyselinovou sekvencí 1-722 na obr. VII, b/ protein, definovaný aminokyselinovou sekvencí 1-535 na obr. VII, c/ protein, definovaný aminokyselinovou sekvencí 1-278 na obr. VII, d/ protein, definovaný aminokyselinovou sekvencí 1-341 na obr. VII, e/ protein, definovaný aminokyselinovou sekvencí 1-409 na obr. VII, f/ protein, definovaný aminokyselinovou sekvencí 1—474 na obr. VII, g/ kombinace proteinů, definovaných pod b/ - f/, např. definovaných aminokyselinovou sekvencí v polohách 1-278, 279-341, 279-409,279-474, 342-474 a 536-722, h/ kombinace proteinů, definovaných pod b/ až g/, v kombinaci s jedním nebo více opakováními podle obr. V, i/ protein, definovaný pod a/ až h/, mající další N-terminální aminokyselinu, zejména methionin, a funkčně ekvivalentní varianty a mutanty proteinů, definovaných pod a/ až i/ výše.

Je třeba uvést, že proteiny pod a, b, c, d, e, f, h a i výše nebudou ve všech hlediscích identické s přirozeně se vyskytující BSSL, ale budou vykazovat jednu nebo více podstatných funkcí přirozeně se vyskytující BSSL. Podstatné funkce jsou uvedeny dále.

j/ DNA sekvence kódující proteiny, definované pod a, b, c, d, e, f, h a i výše, k/ DNA sekvence podle obr. II, definovaná následujícími nukleotidy na obr. II:

a/ DNA sekvence 151-2316 podle obr. II, kódující protein, definovaný sekvencí aminokyselin 1-722 na obr. VII, b/ DNA sekvence 151-1755 podle obr. II, kódující protein, definovaný sekvencí aminokyselin 1-535 na obr. VII, c/ DNA sekvence 151-985 podle obr. II, kódující protein, definovaný sekvencí aminokyselin 1278 na obr. VII, d/ DNA sekvence 151-1172 podle obr. II, kódující protein, definovaný sekvencí aminokyselin 1-341 na obr. VII, e/ DNA sekvence 151-1376 podle obr. VII, kódující protein, definovaný sekvencí aminokyselin 1-409 na obr. VII, f/ DNA sekvence 151-1574 podle obr. II, kódující protein, definovaný sekvencí aminokyselin 1-474 na obr. VII, g/ DNA sekvence 986-1172 podle obr. II, kódující protein, definovaný sekvencí aminokyselin 279-341 na obr. VII, h/ DNA sekvence 986-1376 podle obr. II, kódující protein, definovaný sekvencí aminokyselin 279-409 na obr. VII, i/ DNA sekvence 986-1574 podle obr. II, kódující protein, definovaný sekvencí aminokyselin 279-474 na obr. VII,

-5CZ 287470 B6 j/ DNA sekvence 1173-1376 podle obr. II, kódující protein, definovaný sekvencí aminokyselin 342-409 na obr. VII, k/ DNA sekvence 1173-1574 podle obr. II, kódující protein, definovaný sekvencí aminokyselin 342—474 na obr. VII.

Významné funkce proteinů podle vynálezu jsou a/ vhodnost pro orální podání, b/ jsou aktivovány specifickými žlučovými solemi, c/ působí jako nespecifická lipáza v obsahu tenkého střeva a jsou tak schopny hydrolyzovat lipidy relativně nezávisle na jejich chemické struktuře a fyzikální stavu /emulgované, micelámí, rozpouštěné/, d/ schopnost hydrolyzovat triacylglyceroly mastných kyselin o různé délce řetězce a různém stupni nenasycení, e/ schopnost hydrolyzovat také diacelglycerol, cholesterylestery, monoacylglycerol, lysofosfatidylacylglycerol a retinyl a jiné estery vitaminů, rozpustných v tucích, f/ schopnost hydrolyzovat nejen sn—1/3/ esterové vazby v triacylglycerolu, ale také sn-2 esterovou vazbu, g/ schopnost být ovlivňovány nejen primárními, ale také sekundárními žlučovými solemi, h/ závislost optimální aktivity na žlučových solích, i/ taková stabilita, že obsah žaludku neovlivňuje katalytickou účinnost v žádném podstatném stupni, j/ stabilita vůči inaktivaci pankreatickými proteázami, např. trypsinem za podmínky, že jsou přítomny žlučové soli, k/ schopnost vázat heparin a jeho deriváty, např. heparansulfát,

1/ schopnost vazby na rozhraní lipid-voda, m/ stabilita při lyofílizaci, n/ stabilita při snímání se složkami potravy, jako je mléko nebo mléčné přípravky.

Kritické funkce pro doplňky, náhrady nebo léčbu jsou uvedeny pod a, c, d, e, f, i, j a 1. Pro jiné účely nejsou nezbytné všechny kritické funkce.

Pro expresi výše uvedených proteinů budou příslušné DNA sekvence uvedené výše inzerovány do vhodného vektoru, který je pak zaveden do vhodného hostitelského organismu. Uvedený vektor bude obsahovat příslušné signální a další sekvence, umožňující organismu exprimovat požadovaný protein.

Vhodné organismy pro expresi:

Technika rekombinace DNA je možné klonovat a exprimovat požadovaný protein v různých prokaryotických a eukaiyotických hostitelských organismech. Možnými organismy pro expresi jsou bakterie, jednoduché eukaiyoty /kvasinky/, kultuiy živočišných buněk, kultury hmyzích buněk, kultury rostlinných buněk, rostliny a transgenní živočichové. Každý jednotlivý systém má sám o sobě určité výhody a nevýhody. Je možno učinit jednoduchý závěr, že každý gen, který má být exprimován, je zvláštním případem a je vhodné nestandardní řešení.

Obvykle užívanými bakteriálními systémy jsou E. coli, Bacillus sublitis, Streptomyces. Obvykle používanými kvasinkami jsou Saccharomyces a Pichia pastoris. Obvykle používanými živočišnými buňkami jsou CHO buňky a COS buňky. Obvykle používanými kulturami hmyzích buněk jsou buňky, získané z Drosophila.

Obvykle užívanou rostlinou je tabáková rostlina. Možnými transgenními živočichy jsou koza a kráva.

Příklady možných bakteriálních vektorů jsou pUC a protein A-vektory.

-6CZ 287470 B6

Příkladem možného kvasinkového vektoru je pMA91.

Možné hmyzí vektory jsou odvozeny od Baculoviru.

Možné vektory živočišných buněk jsou odvozeny od SV/40.

Možné rostlinné vektory jsou odvozeny od Ti-plazmidu.

V každém systému mohou být použity přirozené a syntetické promotory a terminátory.

V závislosti na výběru expresního systému může exprimovaný protein obsahovat další Nterminální aminokyselinu /methionin/, obsahovat málo zvláštních aminokyselin, nebo být fixován s heterologním proteinem /např. proteinem A/, nebo se lišit od proteinu z přirozeného zdroje glykosylací. Dále, vektory mohou také obsahovat signální sekvence za účelem přemístění proteinu do periplazmy nebo do kultivačního média.

Dalšími aspekty vynálezu tak jsou a/ vektor, obsahující DNA sekvenci, kódující výše specifikovaný protein, b/ hostitelský organismus, obsahující DNA sekvenci, specifikovanou výše, c/ způsob přípravy proteinu, specifikovaného výše, kultivací hostitelského organismu, obsahujícího vektor specifikovaný výše pod a/ a izolací proteinu.

Způsoby čištění jsou závislé na použitém expresním systému /např. protein A/IgG/ a/nebo na metodách, použitých při čištění enzymu přirozeného původu, jak je popsáno v práci Bláckerg L. a Hemell O. /1981/ Eur. J. Biochem. 116, 221-225.

Dalšími aspekty vynálezu jsou:

- farmaceutická kompozice, obsahující výše specifikovaný protein,

- použití výše specifikovaného proteinu pro výrobu léčiva pro léčení patologických stavů, spojených s exokrinní pankreatickou insulficiencí,

- použití proteinu specifikovaného výše pro výrobu léčiva pro léčení cystické fibrózy,

- použití proteinu specifikovaného výše jako doplňku přípravků dětské výživy,

- použití proteinu specifikovaného výše pro výrobu léčiva pro léčení chronické pankreatitidy,

- použití proteinu specifikovaného výše pro výrobu léčiva pro léčení tukové malabsorpce jakékoliv etiologie,

- použití proteinu specifikovaného výše pro výrobu léčiva pro léčení malabsorpce vitaminů, rozpustných v tucích,

- použití proteinu specifikovaného výše pro výrobu léčiva pro léčení tukové malabsorpce, vyvolané fyziologickými příčinami, např. novorozenců.

DNA sekvence na obr. II od polohy 151 až do a včetně polohy 2316 je sekvencí, kódující celý protein. Sekvence od polohy 2317 až do a včetně polohy 2415 není translatována do proteinu, ale zahrnuje v exonu d, identifikovaném v tabulce 2 dále.

V jednom provedení vynálezu protein, definovaný v odstavcích a/ - i/, je poskytnut v izolované formě a/nebo v podstatě čisté formě.

DNA sekvence, definované v odstavcích a/ - k/, jsou v jednom provedení vynálezu poskytnuty v izolované formě a/nebo v podstatě čisté formě.

Příklady provedení vynálezu

Zkratky:

aa - aminokyselina, bp - pár bází, BSSL - žlučovou solí stimulovaná lipáza, c-AMP - cyklický adenosinmonofosfát, CEH-karboxyester-hydroláza, Da - dalton, c⁷ GTP - 7-deaza-2deoxyguanosin-5'-trifosfát, EDTA - ethylendiamintetraacetát, kb - kilobáze, MOPS - 3-Nmorfolinopropansulfonová kyselina nt - nukleotid, PAGE - elektroforéza na polyakrylamidovém gelu, SDS - dodecysulfát sodný, SSC - NaCl citrát, xGal, 5-brom^l-chlor-3-indolyl-(3-Dgalaktopyranosid.

Enzymy žlučovou solí stimulovaná lipáza EC 3.1.1.3 karboxyester-hydrolýza EC 3.1.1.1

Materiály a metody

A. Příprava enzymu a protilátek

BSSL byla čištěna z lidského mléka, jak bylo dříve popsáno /Blackberg L. a Hemell O. /1981/ Eur. J. Biochem 116, 221-225/. Při použití pro přípravu protilátky byl enzym dále čištěn pomocí SDS-PAGE. Proteinový pruh odpovídající lipáze byl po vybarvení pomocí Coomassie Briliant modři z gelu elektroeluován. Dvacet pět pg čištěného enzymu, spolu se stejným objemem Freudova kompletního adjuvans, bylo použito pro první s.c. injekci a stejné množství enzymu s nekompletním adjuvans pro následující měsíční booster injekce.Králíci byli vykrváceni asi dva týdny po každém boosteru a byla připravena séra a uchovávána při -20 °C.

B. Příprava tryptických fragmentů a analýza aminokyselinové sekvence

Tři mg čištěné BSS1 byly rozpuštěny v 1 ml 0,lM Tris-Cl pufru, pH 8,5, obsahujícím 6M guanidinium hydrochlorid a 2 mM EDTA. Dithioeiythritol byl přidán do koncentrace 5mM. Po inkubaci při 37 °C po dobu 2 hodin bylo přidáno 300 μΐ 50 mM jodacetátu. Po 90 minutové inkubaci při 25 °C za nepřístupu světla byl redukovaný a karboxymethylovaný enzym odsolen na koloně sephadexu G-25, ekvilibrované 0,5M hydrogenuhličitanem amonným. Před lyofilizací bylo přidáno třicet pg tosyl-Lfenylalanin chlormethanem opracovaného hovězího trypsinu /Worthington diagnistic systém lne., Freehol, NJ, USA/. Lyofilizovaný protein byl rozpuštěn ve 4 ml 0,lm hydrogenuhličitanu amonného a dále bylo přidáno 90 pg trypsinu. Po 5 hodinové inkubaci při 37 °C byl protein opět lyofilizován. Tryptický digest byl rozpuštěn v 0,1% trifluoroctové kyselině /2 mg/ml/. Třista pg trypsinem zpracované BSS1 bylo chromatografováno na HPLC za použití C-18 kolony s reverzní fází a eluováno gradientem 0-50 % acetonitrilu v 0,1% trifluoroctové kyselině. Odebírání peptidů bylo sledováno kontinuálně měřením absorbance při 215 nm. Peptidy, které mají být sekvenovány, byly dále čištěny rechromatografií za použití téže kolony s upravenými gradienty. Vzorky peptidových fragmentů pro sekvenování byly sušeny pod dusíkem pro odstranění acetonitrilu a aplikovány na sekvenátor. Pro N-terminálnr sekvenční analýzu byla nativní BSSL rozpuštěna v 0,1% kyselině octové. Sekvenční analýza byla provedena na Applied Biosystems lne. 477A pulzním sekvenátoru v kapalné fázi a on-line PTH 120A analyzátoru s regulovanými programy cyklů a chemikáliemi od výrobce. Počáteční a opakované výsledky, počítáno ze sekvenovaného standardního proteinu, β-laktoglobulinu, byly 47 a 97 %.

-8CZ 287470 B6

C. Izolace RNA

Vzorky lidské pankreatické adipózy a tkáně taktující mléčné žlázy byly získány chirurgicky a ihned ponořeny do guanidiumthiokyanátu /1-5 g v 50 ml/. Celková RNA byla extrahována, jak je popsáno v práci Chirwina J.M., Przybyla, A.E., MacDonalda R.J. a Ruttera W.J. /1979/ Biochemistry 18, 5294-5299. Poly/A/-RNA byla připravena chromatografií na oligodeoxythymidilát/oligo/DT//-celulózové koloně /Aviv H. a Leder P. /1979/ Proc.Natl. Acad. Sci USA 69, 5201-5205/.

D. Konstrukce a ascreening cDNA knihoven

Přibližně 15 pg polyadenylované RNA z lidského pankreatu bylo denatudováno methylmerkurihydroxidem /Bailey J.M. a Davidson N. /1976/ Anal. Biochem. 70, 75-85/ a primovány s oligo /dT/12-18 primery /Pharmacia, Uppsala, Švédsko/ a reverzně transkribovány za použití standardních postupů /Maniatis T., Fritsch E.F. a Sambrook J. /1982/: Molecular Cloning. A. Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York/. Syntéza druhého řetězce byla provedena podle práce Gublera U. a Hoffmana B.J. /1983/ Gene 25, 263269, s tím rozdílem, že DNA ligáza a β-NAD byly vynechány a reakční teplota byla 15 °C. Přebytek RNA byl štěpen RNAzou A /50 pg/ml/ a dvojřetězcová cDNA byla zpracována s EcoRI methylázou /Maniatis T., Haldison R.C a Lacy E., Lauer J. O'Conell C. a Qvon D. /1978/ Cell 15, 687-701/. Konce byly zarovnány pomocí Klenow enzymu. Po ligaci k EcoRI linkerům a štěpení s EcoRI, cDNA byla frakcionována na koloně Sepharose 4B-C1. Frakce byly vysráženy ethanolem a cDNA ligovány do ECORI místa fosfatázou zpracovaného gtll vektoru /Young R.A. a Davis R.W /1983/ Proč. Nati. Acad. Sci, USA 80, 1194-1198/. In vitro provedení poskytlo více než 7 x 10⁵ rekombinantů.

cDNA knihovna z lidské mléčné žlázy, získaná z tkáně ženy v osmém měsíci těhotenství, byla získána od Clontech Laboratories, lne., Palo Alto, CA. USA.

Fágy z cDNA knihoven byly umístěny na plotnu v koncentraci 5 x 10⁴ plakotvomých jednotek na 120mm misku. Antisérum bylo zředěno v poměru 1:3200 a screening byl proveden podle Younga R.A. a Davise R.W. /1983/ Proč. Nati. Acad. Sci, USA 80, 1194-1198/. Alkalickou fosfatázou konjugované kozí-anti-králičí protilátky byly použity jako druhé protilátky /Bio-Rad, Richmond, CA USA/. Pro izolaci klonů, odpovídajících 5' konci mRNA, byla hybridizace nukleových kyselin provedena za standardních podmínek /Maniatis T., Fritsch E.F. a Sambrook J. /1982/: Molecular Cloning. A. Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York/ za použití subklonovaných fragmentů z jednoho z imunopozitivních klonů jako sondy.

E. RNA analýza

Elektroforéza byla provedena na 1% agarozovém gelu v 40mM MOPS pufru o pH 7,0 po denaturaci glyaoxalem a dimethylsulfoxidem /McMaster G.K. a Charmichael G.G. /1977/ Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74, 48 352-48 358/. Glyoxalátovaná celková RNA pak byla transferována na nitrocelulózové filtry /Thomas P. /1980/ Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77, 5201-5205/. Bloty bylo sondovány subklony rekombinantů BSSL a CEH, které byly radioaktivně značeny oligoradioaktivní technikou /Feinberg A.P. a Vogelstein B. /1983/ Analyt. Biochem. 132,6-13/. Prehybridizace a hybridizace byly provedeny s 50% formamidem při 46 °C /Maniatis T., Fritsch E.F. a Sambrook J. /1982/: Molecular Cloning. A. Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York/. Posthybridizační promytí byla prováděna s velkou přesností /0,1% SDS a 0,lxSSC při 60 °CP. /lxSSC, 0,15M NaCl., O,OO15MNa₃citrát, pH 7,6/.

-9CZ 287470 B6

F. Nukleotidová sekvence cDNA inzerty s BSS1 a CEH rekombinantů byly buď přímo klonovány do M3mpl8 a mpl9 po sonifikaci a frakcionaci podle velikosti, nebo některé z nich byly dále subklonovány do pTZ19R po štěpeních pomocí Pstl, BstXI, Narl, Smál a Ahall. Nukleotidová sekvence byla stanovena dideoxy terminační metodou /Sanger F., Nicklen S. a Coulson A.R. /1977/ Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467/. GC-bohaté podíly /viz dále/ byly také sekvenovány s Taql polymerázou a dc ⁷GTP. Oba řetězce byly sekvenovány. Sekvenční informace byly získány z autoradiogramů za použití softwaru MS-EdSeq, jak je popsáno v práci Sjoberga S., Carlssona P., Enerbácka S., a Bjursella G. /1989/ CABIOS 5, 41^16.

G. Předpovědi aminokyselinových sekvencí a homologií

K předpovědi odpovídající aminokyselinové sekvence cDNA inzertů, kodon použitý v různých čtecích rámečcích byl porovnán podle Stadena a poskytl jeden otevřený čtecí rámeček /Staden R., /1984/Nucl. Acids Res. 12, 551-567/. Homologie byly zkoušeny s programy UWGCG softwaru /Devereux J., Haeberli P. a Smithies O. /1984/Nucl. Acids. Res. 12, 387-395/.

Výsledky a diskuse

A. Sekvence tryptických fragmentů a N-konce BSSL

Trypsinové štěpení čištěné BSS1 poskytlo přibližně 50 fragmentů podle píků, získaných HPLC chromatografií /obr. 1/. Píky byly odděleny a označené píky, které by mohly být izolovány ve vysoce čistém stavu a v přiměřených množstvích, byly sekvenovány. Výsledné sekvence jsou uvedeny v tabulce I. Dále bylo sekvenováno 30 N-koncových zbytků /obr. 2/ a potvrzují dříve uvedenou sekvenci podle Abouaila N., Rogalske E., Bonicela J. a Lombarda D. /1988/ Biochim. Biophys. Acta 961, 299-308, /30 zbytků/.

zbytků dlouhá N-terminální sekvence, uváděná v práci Wanga C.-S. a Johnsona K. /1983/ Anal. Biochem. 133, 457-461, je glycin v této práci a lysin podle uvedených autorů.

B. Nukleotidová sekvence BSSL

Pro konstrukci λ gtll cDNA knihovny byla použita polyadenylovaná RNA z lidského pankreatu. Nejprve byly izolovány čtyři imunopozitivní klony a pak tato pankreatická cDNA knihovna byla prohledána antisérem proti BSSL. Nukleotidová sekvenční analýza čtyř klonů ukázala, že jsou v dokonalém souladu a odpovídají 3'-konci mRNA. Všechny začínají póly A koncem a liší se pouze v délce; nejdelší inzert, označený ACEH, měří 996 bp.

cDNA knihovna z lidské mléčné žlázy byla prohledána antisérem a pankreatickým klonem ACEH jako sondou. Pozitivní klony byly izolovány z obou screeningů, všechny z nich začínají od 3'-konce. Nejdelší klon lidské mléčné žlázy, označený ABSSL, měří 2100 bp v protisměru. Obsahuje čtyři sekvenované tryptické fragmenty /obr. II/, ale nezahrnuje N-terminální aminokyselinovou sekvenci. K prodloužení sekvence dále od počátku translace byla cDNA knihovna lidské mléčné žlázy rescreenována sondou o délce 118 bází, získanou z nejčastějších 5'proximálních částí ABSSL. Byl izolován jeden klon, který pokračuje dále 328 nukleotidy protisměru. Tvoří N-terminální aminokyselinovou sekvenci a obsahuje zbývající tryptický fragment. Jak je uvedeno na obr. II, cDNA je 2428 nukleotidů dlouhá a obsahuje 81 bází v protisměru od prvního ATG kodonu. Polyadenylační signál, AATAAA je umístěn 13 nukleotidů v protisměru od póly A „chvostu“ a jako terminační kodon TAG byl nalezen nukleotid 2317, následovaný 3'-netranslatovanou oblastí 112 bp. GC bohatá oblast, obsahující 16 opakování 33 bází, byla nalezena na 3'-konci sekvence mezí bází 1756 a 2283. Nukleotidová sekvence opakování, uvedená na obr. III, obsahuj šest identických opakování, obklopených deseti

-10CZ 287470 B6 opakováními s různým počtem substitucí, které pravděpodobně vznikly po několika duplikacích. Nízký počet substitucí potvrzuje, že tato opakování se objevila později během vývoje.

C. Tkáňová distribuce exprese

RNA z lidské laktující mléčné žlázy, pakreatu, adipozové tkáně a z lidské hepatomové buněčné linie /HepG2/, byla analyzována Norhem blottingem. Velikost messengeru byla stanovena přibližně 2,5 kb jak v laktující mléčné žláze, tak v pankreatu. Žádný signál nebyl detekován v drahách s RNA, extrahovanou z HepG2 nebo adipozové tkáně /obr. IV/.

Vzhledem ktomu, že mRNA, použitá pro knihovnu mléčné žlázy, byla získána od ženy v 8. měsíci těhotenství, je evidentní, že transkripce a pravděpodobně translace BSS1 genu je provedena před porodem, v souladu s předcházejícími nálezy BSSL sekvence před porodem /Hamosh M. /1986/ vHamun Milk Infant Nutrition and Health /Howell, R.R., Morriss F.H. a Pickering L.K. eds./ str. 66-97, Charles C. Thomas, Springfield/ /viz obr. IV/.

D. Aminokyselinová sekvence BSSL

Podle SDS-PAGE byla uvedena molekulová hmotnost 107-125 kDa /Bláckberg L., Lombardo D., Hemell O., Guy O. a Olivecrona T. /1981/ FEBS Lett. 136, 284-288; Wang C.-S./1980/ Anal. Biochem. 105, 398^102/ a podle analytické ultracentrifugace 105 kDa /Wang C.-S. a lee

D. M. /1985/ J. Lipid. Res. 26, 824-830/. Enzym, jak je předpovězeno z cDNA, obsahuje 722 aminokyselinových zbytků /obr. II/, které, při molekulové hmotnosti 76,271 Da, indikují, že enzym obsahuje nejméně 15-20 % karbohydrátu. Leader sekvence je 23 zbytků dlouhá. Zkusmé aktivní místo serinového zbytku je lokalizováno k serinu-217 /obr. V/. Sekvence okolo tohoto šeřinu jsou v souladu se sekvencí aktivního místa serin-hydrolýz /Brenner S. /1988/ Nátuře 334, 528-530/. V poslední době se předpokládá, že zbytky bází, nalezené těsně u serinového aktivního místa, mohou být zahrnuty ve štěpení esterových vazeb v acylglycerolech lipázami /Yang C.Y., Gu Z.-W., Yang H.-H., Rohde M.F., Gotto Jr. A.M. a Pownall H.J. /1988/ J. Biol. Chem. 265, 16822-16827/. Je zajímavé, že takové zbytky nejsou v BSS1 přítomny. Jediné zkušební Nglykosylační místo je lokalizováno pouze sedm zbytků od šeřinu. Stupeň glykosylace /Bláckberg L. a Hemell O. /1981/ Eur. J. Biochem 116,221-225; Lombardo D., Guy O. a Figarella C. /1978/ biochim. Biophys. Acta 527, 142-149/ potvrzuje, že enzym obsahuje O-vázané karbohydráty. Existuje mnoho míst, kde by se mohla taková glykosylace objevit. Aminokyselinové složení čištěného enzymu prokázalo vysoký obsah prolinových zbytků /Bláckberg L. a Hemell O. /1981/ Eur. J. Biochem 116, 221-225/. Aminokyselinová sekvence, získaná z cDNA, toto potvrzuje. Nejvíce prolinových zbytků je lokalizováno v 16 opakováních 11 zbytků, tvořících hlavní část Cterminální poloviny enzymu.

E. Porovnání enzymů v mléčné žláze /BSSL/ a pankreatu /CEH/

BSSL lidského mléka a lidská pankreatická CEH se projevuje jako podobné, ačkoliv identické nejsou. Prodloužené údaje potvrzují, že dva enzymy jsou produkty téhož genu. Nukleotidová sekvence cDNA klonů ukazuje, že pankreatický klon ACEH je identický s klonem ABSS1 lidské mléčné žlázy od póly A „chvostu“ a 996 bází směrem k 5'-konci, včetně sekvence, kódující opakování bohatá na prolin. Northen blot prokazuje jediný pruh 2,5 kb v RNA z pankreatu a laktující mléčné žlázy /obr. IV/. Genomický Southem blot dále podporuje myšlenku, že pouze jeden gen kóduje BSSL a CEH. Rozdíly v mobilitě na SDS-PAGE mezi BSSL a CEH mohou být vyloženy jako následek různé glykosylace nebo rozdílného spojení.

Podobnost BSSL krysím a hovězím enzymům /viz dále/ a výsledky z genomických blotů podporují možnost, že rozdílné spojení nemůže objasnit rozdíl v mobilitě. Jelikož C-terminální sekvence nebyla v proteinu potvrzena, je méně pravděpodobná možnost, že CEH může být získávána proteolytickým štěpením na C-terminálním konci.

-11CZ 287470 B6

Tak dlouho, že jsou známy pankreatické enzymy, které zřejmě odpovídají CEH, jsou tyto často pojmenovávány po druzích a zejména substrátech, používaných pro stanovení jejich aktivit: lysofosfolipáza, cholesterylesteráza, sterolester-hydroláza, nespecifická lipáza, karboxyesterlipáza a cholesterylester-hydroláza. Dostupné údaje jsou kompatibilní s názorem, že všechny tyto aktivity, které jsou popsány, vycházejí z jedné a té samé funkční entity /Bláckberg L. /1981/ Fat digestion in newbom infant. Umea University Medical Dissertations New Series No 71; Rudd E.A. a brockman H.L. /1984P v Lipases /Borgstóm B. a Brockman H.L. eds/ str. 184-204, Elsevier, Amsterodam/. Ilustruje to širokou substrátovou specifitu a relevantnost jejich označení jako nespecifické lipázy. Jestliže se sekvence lidské BSSL/CEH porovná se sekvencí lysofosfolipázy z tuku pankreatu /Han J.H., Stratowa C, a Rutter W.J. /1987/ Biochemistry 26, 1617-1625/ a cholesterolesterázy z hovězího pankreatu /Kyger E., Wiegand R., a lange L. /1989/ Biochim. Biophys. Res. Com 164, 1302-1309/, byly nalezeny intenzivní podobnosti v prodloužení asi 530 zbytků od N-konce /obr. V/, ale liší se v části molekuly, kde se vyskytují opakování. Krysí enzym má pouze čtyři opakování a hovězí tři. Proto je lidský enzym značně delší peptid.

Navíc byly nalezeny neobyčejné podobnosti mezi BSSL a množstvím typických esteráz, např. acetylcholinesterázami různých druhů včetně lidí a Drosophila a karboxyl-esterázami /obr. VI/. Tyto podobnosti byly omezeny na N- koncových 300 zbytků BSSL, které zahrnují hypotetické aktivní místo serinového zbytku. Podobnost s acetylcholinesterázou byla předpovězena ze skutečnosti, že BSS1 je inhibována typickými inhibitory cholin-esterázy /Bláckberg L. a Hemell O., Guy O. a Olivecrona T. /1981/ FEBS Let. 136, 284-288; Lombardo D., Guy O. a Figarella C. /1978/ Biochim Biophys. Acta 527, 142-149/. S možnou výjimkou karboxyl-esterázy krysích jater /Cammulli E.D., Linka M.J., Brockman H.L a Hui D.Y. /1989/ Biochim. Biophys. Acta 1005, 177-182/, žádný z těchto enzymů nevykazoval stejnou závislost na žlučové soli jako BSSL; to potvrzuje, že strukturní báze těchto vlastností jsou umístěny v C-terminální část proteinu. Navíc BSSL může účinně atakovat emulgované substráty, což není charakteristické pro podobné esterázy. Pro tuto aktivitu je žlučová sůl základním předpokladem.

Předpovězená sekvence lidské BSSL byla porovnána s jinými dobře charakterizovanými savčími lipázami. Nehledě na shodnou sekvenci poblíž aktivního místa šeřinu /G-X-S-X-G/, nebyly nalezeny žádné zřejmé podobnosti /Mickel S., Weidenbach F., Swarovsky B., LaForge S. a Scheele G. /1989/ J. Biol. Chem. 264, 12895-12901P.

Navíc k podobnostem s jinými enzymy zde jsou také výrazné podobnosti s jedním c-AMP závislým proteinem z Dyctyostellium discoideum /Mann S.K.O. a Firtel R.A. /1987/ Mol. Cell. Biol. 7, 458-469/, jakož i s thyroglobulinem z některých druhů /obr. VIP /Mercken L., Simons M.J., Swillens S., Masser M. a Vassart G. /1985/ Nátuře 316, 647—651; Lauro R., Obici S., Condliffe D., Ursini V.M., Musti A., Moscatelli C. a Awedimento V.E. /1985/ Eur. J. Biochem. 148,7-11; Malthiery Y. a Lissitzky S. /1987/ Eur. J. Biochem. 165, 491-498/. Podobnosti mezi BSSL a thyroglobulinem, které zahrnují oblast aktivního místa, ale ne aktivní místo samotné, indikují, že tyto vysocekonzervované řetězce aminokyselin jsou důležitější, než pouze při podpoře enzymatické aktivity esteráz.

Jako závěr- lidská mléčná BSS1 obsahuje 722 zbytků aminokyselin. Dostupné údaje jasně ukazují, že její peptidový řetězec je identický s tímtéž řetězcem pankreatické CEH a že jsou kódovány tímtéž genem. Nejzřejmější je, že nukleotidové sekvence na jejich 3-koncích a jejich N-terminálních aminokyselinových sekvencí jsou identické. Neobyčejné homologie, nalezené u krysí pankreatické lysofosfolipázy a hovězí pankreatické cholesterol-esterázy, podporují hypotézu, že tyto enzymy jsou funkčně identické. Nicméně, jak bylo potvrzeno, rozdílné molekulové velikosti, zjištěné mezi druhy, nejsou způsobeny rozdíly pouze v glykosylaci; odrážejí různý počet opakování jedenácti aminokyselin. Podobnost sekvence aktivního místa mezi těmito esterázami potvrzuje, že tyto proteiny jsou získány z běžného zděděného genu.

Na obr. I - VII jsou uvedeny následující údaje.

-12CZ 287470 B6

Obr. I: Separace tryptického digestu BSSL pomocí HPLC

Čištěná BSSL byla zpracována s trypsinem a chromatografována HPLC, jak je popsáno v části Materiály a metody. Označené píky byly odebrány a čištěny dále rechromatograficky a byla stanovena jejich aminokyselinová sekvence.

Obr. II: cDNA nukleotidová sekvence a předpovězená aminokyselinová sekvence pro lidskou žlučovou solí stimulovanou lipázu cDNA je 2428 bází dlouhá. N-terminální 23-kodonová sekvence /nt82-150/, vycházející z ATG, je interpretována jako leader peptid, jelikož N-terminální aminokyselinová sekvence maturovaného proteinu začíná u kodonu 24 /nt 151, Ala/. Leader peptid je podtržen. Onačení * označuje počáteční bod exonu. Označení # znamená počáteční bod opakující se části.

Obr. III: Nukleotidová sekvence C-terminálních GC-bohatých opakování v lipáze stimulované žlučovou solí

Substituce jsou označeny *.

Obr. IV: Northem blot hybridizace

Analýza Northert blot celkové RNA, izolované z lidské laktující mléčné žlázy, pankreatu, adipozové tkáně a lidské hepatomové buněčné linie /HepG2/. Celková TNA /10 pg/ z laktující mléčné žlázy /dráha A/, pankreatu /dráha B/, adipozové tkáně /dráha C/ a HepG2 /dráha D/, byly zpracovány elektroforézou na 1% agarosovém gelu ve 40 mM MOPS pufru při pH 7,0 po denaturaci RNA v 1M glyoxalu, 50% dimethylsulfoxidu a 40 mM MOPS. Glyoxalátovaná RNA byla pak přenesena na nitrocelulózový papír pro hybridizaci s /³²P/ značenou BSS1 cDNA /ABSSL/.

Obr. V: Porovnání předpovězené aminokyselinové sekvence z BSSL z lidského mléka, krysí pankreatické lysofosfolipázy /Ratlpl/ /Han J.H., Stratowa C. a Rutter W.J. /1987/ Biochemistry 26, 1617-1625/, a hovězí pankreatické cholesterol-esterázy /Bovceh/ /Kyger E., Wiegand R. a Lange L. /1989/ Biochim. Biophys. Res. Com. 164, 1302-1309/:

Serinové zbytky, obsažené v aktivním místě, jsou označeny * a # označuje jednotlivý možný Nglykosylační signál proteinu. Přímá opakování sekvencí aminokyselin jsou v rámečcích. Protější sekvence jsou označeny velkými písmeny, protější sekvence mezi dvěma enzymy jsou označeny malými písmeny a nesrovnalosti tečkou.

Obr. VI: Porovnání primární struktury BSSL s jinými esterázami, thyroglobulinem a jedním cAMP dependentním enzymem z Dictyostelium discoideum:

BSSL: lidská žlučovou solí stimulovaná lipáza, Cheshum: cholinesteráza z fetální lidské tkáně /Prody C., Zevin-Sonkin D., Gnatt A., Goldberg O., a Soreg H. /1987/ Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84, 355-3559/, Torpace: acetylcholinesteráza z Torpédo marmora /Sikorav J-L., Krejci E. a Massoulie'J. /1987/ EMBO J. 6, 1865-1873/, Drosceh: karboxyesterhydroláza zDrosophila melaogaster /Oakeshott J. G., Collet C., Phillis R.W., Nielsen K.M., Russel R.J., Cambers G.K., Ross V. a Richmond R.C. /1987/ Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84, 3359-3363/, Ratlivce: karboxylesteráza z krysích jater /Long R., Satho H., Martin B., Kimura S., Gonzales F. a Pohl L. /1988/ Biochem. Biophys. Res. Comm, 156, 866-873/, Drosace: acetyl cholinesteráza z Drosophila melaogester /Halí L.M. C. a Spierer P. /1986/ EMBO J. 5, 2949-2954P, Thyrhum: thyroglobulin lidský /Malthiery Y. a Lissitzky S. /1987/ Eur. J. Biochem. 165, 491—498/ a Diet. Di: c-AMP dependentní enzym z Dictyostelium discoideum /Mann, S.K.O. a Firtel R.A. /1987/ Mol. Cell Biol. 7, 458-469/. Existuje zde 7 různých domén, které ukazují podobnosti mezi

-13CZ 287470 B6 enzymy. Rámečky uzavírající zbytky, které jsou identické a malá písmena ve shodné /consensus/ sekvenci označují identické zbytky ve všech enzymech s výjimkou jednoho. Tečky označují nesrovnalosti. Serinový zbytek, obsažený v aktivním místě, je označen *. Obrázek v pravém rohu ukazuje, jak jsou domény orientovány.

Obr. Vil:

poskytuje aminokyselinovou sekvenci 1-722 pro celý protein /jednopísmenový kod/ a indikuje exony a, b, c a d. Označení # indikuje výchozí bod opakující se části.

Tabulka 1

Aminokyselinová sekvence BSSL peptidů

Z důvodů interferujících píků nemohla být u peptidu č. 26 provedena pozitivní identifikace zbytku v cyklech sekvenování 1 a 2. Čísla peptidů odpovídají pikům na obr. I.

Tryptické fragmenty

TP16:LysValThrGluGluAspPheTyrLys

TP19:GlyIleProPheAlaAlaProThrLys

TP20:LeuValSerGluPheThrIleThrLys

TP24:ThrTysAlaTyrLeuPheSerHisProSerArg TP26:PheAspValTyrThrGluSerTrpAlaGlnAsp

ProSerGlnGluAsnLys

Tabulka 2

Identifikace exonů a, b, c, a d, číslovaných jako na obr. II a VII

exon	umístění
	mezi nukleotidy číslo	mezi aminokyselinami číslo
a	986-1172	279-341
b	1173-1376	342-409
c	1377-1574	410-474
d	1575-2415	475-722
celý protein	151-2316	1-722
celý protein s výjimkou opakování	151-175	1-535

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (7)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití rekombinantního proteinu, jak je uveden na obrázku VII od polohy 1 do polohy 722, nebo jeho funkční varianty, která projevuje

   - schopnost být aktivována zvláštními solemi žlučové kyseliny,

   - schopnost působit jako nespecifická lipáza v tenkém střevě, kde se projevuje schopnost hydrolýzy lipidů relativně nezávisle na jejich chemické struktuře a fyzikálním stavu, jako je emulgace, micelámí stav nebo solubilizace,

   -14CZ 287470 B6

   - schopnost hydrolýzy triacylglycerolů mastnými kyselinami o rozdílné délce řetězce a rozdílném stupni nenasycenosti,

   - schopnost hydrolýzy dalších látek, jako jsou diacylglyceroly, monoacylglyceroly, cholesterylestery, lysofosfatidylacylglyceroly a retinyl- a jiné estery vitaminů, rozpustné v tucích,

   5 - schopnost hydrolýzy nejen pouze sn-l(3) esterových vazeb v triacylglycerolů, ale také sn-2 esterové vazby,

   - schopnost reagovat nejen s primárními, ale také se sekundárními solemi kyseliny žlučové,

   - závislost na solích kyseliny žlučové pro optimální aktivitu,

   - stabilitu, takže obsah žaludku není nepříznivě ovlivněn katalytickými účinky v jakémkoli

   10 podstatném stupni,

   - stabilitu vůči inaktivaci proteázami slinivky břišní, například trypsinem, za předpokladu, že jsou přítomny soli kyseliny žlučové,

   - schopnost vázat deriváty heparinu, například heparinsulfát,

   - schopnost vázat se na fázovém rozhraní lipid - voda, a

   15 - stabilitu při smísení s některými složkami potravy, jako je mateřské mléko nebo mléčné přípravky, pro výrobu léčiva k ošetřování patologického stavu, souvisejícího s exokrinní pankreatickou nedostatečností.
2. 2. Použití podle nároku 1 pro výrobu léčiva k ošetřování cystické fibrózy.
3. 3. Použití podle nároku 1 pro výrobu léčiva k ošetřování chronické pankreatidy.
4. 4. Použití podle nároku 1 pro výrobu léčiva k ošetřování tukové malabsorpce.
5. 5. Použití podle nároku 1 pro výrobu léčiva k ošetřování malabsorpce vitaminů, rozpustných v tucích.
6. 6. Použití podle nároku 1 pro výrobu léčiva k ošetřování tukové malabsorpce, způsobené fyziologickými příčinami.
7. 7. Použití podle některého z nároků 1 až 6, pro výrobu léčiva pro souběžné, oddělené nebo 35 postupné podávání v kombinaci s lipázou nebo lipázami.