PL166199B1 - Sposób wytwarzania nowych plazmidów dla stosowania ich do otrzymywania aktywatoraplazminogenu PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania nowych plazmidów dla stosowania ich do otrzymywania aktywa- tora plazminogenu, znamienny tym, ze do plazmidu pBR 322, z którego usunieto region nic/bom i/lub przynajmniej czesc genu odpornosci na dzialanie tetracykliny, wstawia sie miedzy miejsca ciec EcoRI oraz H indIII miejsce wielokrotnego klonowania o podanej na fig. 2 sekwencji nukleotydowej, która miedzy miejscami ciec X baI oraz N de I zawiera sekwencje Shine'a- Delgarno i w odleglosci 6 - 12, zwlaszcza w odleglosci 8-10 nukleotydów, kodon startowy ATG i za pomoca której w znany sposób wbudowuje sie jeden lub dwa terminatory transkrypcji, syntetyczne sekwencje czesciowe genu strukturalnego scu-PA, korzystnie rozpoczynajac od terminalnej-3' czesci tego genu strukturalnego oraz dajacy sie regulowac promotor, i ewentual- nie fragment Eco RI x Hind III z otrzymanego plazmidu albo wstawia sie znana metoda jako kasete ekspresyjna w inny plazmid zdolny do autonomicznego rozmnazania sie w bakteriach jelitowych (Enterobacteriaceae), korzystnie w E. coli, albo w tym otrzymanym plazmidzie przedluza sie odleglosc miedzy sekwencja Shine'a-Delgarno a kodonem startowym poprzez ciecie za pomoca Nde I, uzupelnienie wynikowych miejsc przeciecia i nastepna ligacje powstaja- cych konców-blunt. PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych plazmidów dla stosowania ich do otrzymywania aktywatora plazminogenu.

Aktywatory plazminogenu grają dużą rolę w leczeniu zamknięć naczyń spowodowanych przez włóknik, jak np. zawałów serca, zatorów płuc, chorób wywołanych zamknięciem światła naczyń tętniczych w kończynach itp. Mniej więcej od początku lat 50 wiadomo, że w moczu ludzkim jest zawarty enzym proteolityczny, który powoduje przekształcenie plzzminogenu w plzzminę, to znaczy w enzym, wywołujący rozszczepianie wlóknika na rozpuszczalne polipeptydy a tym samym rozpuszczanie zamknięć naczyń spowodowanych włóknikiem. Ten aktywator plazminogenu został nazwany urokina^ i okazało się, że w rzeczywistości istnieją różne postacie urokinazy. Te wszystkie postacie wywodzą się jednak z takiej samej cząsteczki wyjściowej, znanego od około połowy lat 70 zymogenu, proutokiezry. Gdy okazało się, że ta prourokinaza posiada budowę jednołańcuchową, nadano jej oznaczenie scu-PA (Single Chain Urinary Plzsminogen Activator). Tz scu-PA składa się z 411 aminokwasów i w postaci występującej w stanie naturalnym jest glikozylowana w aminokwasie 302.

Z różnych prac jest μζιζ wytwarzanie metodami technologii genowej nieglikozylowanego składnika bizłka scu-PA, oznaczonego symbolem „rscu-PA (rekombinantowa scu-PA) lub noszącego także nazwę potoczną „saruplaza¹¹. W wyniku stosowania rscu-PA do celów leczniczych

16199 3 okazało się, że pod względem skuteczności działania i tolerancji przewyższa ona tradycyjne fibrynolityki (porównaj Lancet 1989, strony 863 - 868).

Do wytwarzania nieglikozylowanego aktywatora plazminogenu rscu-PA stosuje się prokarionty, na temat czego podano już w literaturze szereg informacji. Znane dotychczas metody wytwarzania rscu-PA polegają na ekspresji genu strukturalnego scu-PA wyodrębnionego z tkanek ludzkich. Osiąga się jednak przy tym małe stopnie ekspresji, co nie daje możliwości ekonomicznego wytwarzania produktu docelowego w większej ilości. Tak np. Hibino i in. podają w Agric. Biol. Chem. 52,329 - 336 (1988) dla produkcji rscu-PA w E. coli wielkość ekspresji tylko 2%, mierzoną w stosunku do białka całkowitego bakterii. Natomiast w europejskim zgłoszeniu, patentowym 92182A2 oraz w pracy Holmesa i in. nie podano dokładnie osiągniętych stopni ekspresji. W wyniku wykonania prób sprawdzających te dane uzyskano jednak w różnych szczepach mniej niż 2% rscu-PA w białku bakterii.

Należy zwrócić uwagę na to, że tak jak w wielu przypadkach ekspresji eukariotycznych białek w bakteriach, także rscu-PA powstaje najpierw w komórce jako zdenaturowane ciało wtrącone, zwane dalej „białkiem wstępnym, które po przejściowym wyodrębnieniu należy metodami chemii białek przekształcić we właściwą rscu-PA o budowie trzeciorzędowej. Otrzymany w ten sposób produkt można następnie w celu oznaczenia ilości powstałego rscu-PA przekształcić przez dodanie plazminy w dwułańcuchową nieglikozylowaną urokinazę („rscu-PA), której aktywność enzymatyczna może służyć po jej oznaczeniu jako miara ilości otrzymanej rscu-PA. Wydajność białka wstępnego lub rscu-PA można oczywiście oznaczyć także np. na drodze oceny densytometrycznej produktu rozdzielania białka całkowitego przez elektroforezę żelową.

Stwierdzono niespodziewanie, że bakterie transformowane plazmidami otrzymanymi sposobem według wynalazku dawały wielokrotnie większe stopnie ekspresji niż identyczne szczepy gospodarzy transformowane plazmidami znanymi ze stanu techniki. Plazmidy otrzymane _ sposobem według wynalazku nadają się więc lepiej do otrzymywania rscu-PA lub jej białka wstępnego niż wszystkie dotychczas znane plazmidy. W uzupełnieniu należy jeszcze podkreślić, że z chwilą gdy rscu-PA stała się łatwo dostępna dzięki niniejszemu wynalazkowi, można wytwarzać także rtcu-PA na skalę techniczną w znany sposób przez wymienione wyżej dla celów analitycznych rozszczepianie rscu-PA, np. za pomocą plazminy.

Plazmidy wytwarzane sposobem według wynalazku odznaczają się także tym, że ich operon posiada dający się regulować, ewentualnie syntetyczny promotor, działającą jako miejsce wiązania rybosomu sekwencję Shine'a-Delgarno, kodon startowy, syntetyczny gen strukturalny dla scu-PA i w kierunku z prądem od genu strukturalnego co najmniej jeden terminator. Przeważnie jednak występują kolejno jeden za drugim dwa terminatory, przy czym chodzi tu zwłaszcza o terminator trp A i/lub terminator A/orfL z Tn 10, porównaj Schollmeier i in. (6).

W przypadku dającego się regulować promotora chodzi zwłaszcza o promotor Trp lub o promotor Tac.

W regionie kontrolnym plazmidów wytwarzanych sposobem według wynalazku odległość między sekwencją Shine'a-Delgarno a kodonem startowym wynosi 6-12, a zwłaszcza 8-10 nukleotydów.

Podczas konstruowania genu strukturalnego stosowanego w nowych plazmidach wbudowuje się sekwencje zasad kodujące poszczególne aminokwasy podane w poniższym zestawieniu. Przy tym w genie strukturalnym nie muszą być równocześnie spełnione te wszystkie wymagania.

Aminokwas:	Tryplet:
arginina	CGT
leucyna	CTG
walina	GTC
prolina	CCG
glicyna	GGT

Natomiast przy budowaniu genu strukturalnego korzystne jest unikanie w miarę możliwości następujących kodonów dla odpowiednich aminokwasów (przy tym także te wymagania nie muszą być równocześnie spełnione dla wszystkich aminokwasów):

199

Kodon, którego należy unikać:

Aminokwas:

ATA

GTC

CCC

AAG izoleucyna waiina proiina iizyna

AGG, AGA, CGG, CGA arginina GGA GGG giicyna

Przez dobranie przewidzianych według wynalazku odpowiednich kodonów aminokwasów w genie strukturalnym oraz nadanie wymienionych poprzednio cech regionowi kontrolnemu zapobiega się w dużym stopniu powstawaniu stabilnych struktur wtórnych między genem strukturalnym a regionem kontrolnym.

W celu otrzymania syntetycznego genu strukturalnego syntetyzuje się najpierw jednoniciowe oligonukleotydy w odcinkach zawierających po 40 - 80 zasad. Korzystnie wytwarza się je w ilości 1 μ/mola. metodą stałofazową Adamsa i in. (7) za pomocą syntezatora DNA (Modeli Biosearch 8600 firmy New Brunswick Scientific. Co.). Jako syntony monomerowe stosuje się przy tym występujące w handlu zabezpieczone grupami cyjanoetylowymi diizopropyloamino-fosforoamidity potrzebnych w danym wypadku dezoksyrybonukleozydów. Po odszczepieniu nośnika nici zabezpieczone jeszcze na końcu grupą trójfenylometylową odsala się w jałowych warunkach przez filtrację żelową i oczyszcza wstępnie a następnie poddaje w dwóch etapach rozdzielaniu metodą „reversed phase HPLC“. Z każdorazowego produktu głównego usuwa się grupy trójfenylometylowe i po wykonaniu dalszych dwóch operacji oczyszcza się na drodze cieczowej chromatografii ciśnieniowej o odwróconych fazach „reversed phase - HPLC“ otrzymuje żądany oligonukleotyd o dużej czystości, co wykazuje analiza metodą elektroforezy żelowej (PAGE).

Z grup liczących po 4-9 tych pojedynczych nici otrzymuje się następnie dwuniciowe fragmenty o długości około 200 nukleotydów w ten sposób, że nie stojące na końcu jednoniciowe oligonukleotydy fosforyluje się na końcu 5' i każdorazowe nici komplementarne wraz ze stojącymi na końcu oligonukleotydami poddaje anneacji i ligacji. Po ligacji otrzymane zdolne do klonowania dwuniciowe fragmenty wstawia się w odpowiednie wektory liniowe. Dalszy sposób postępowania wynika z podanych niżej przykładów.

Skróty stosowane w niniejszym zgłoszeniu mają następujące znaczenia: pz: pary zasad

DE 52: wymieniacz jonowy firmy Whatman EDTA: kwas etylenodwuaminoczterooctowy IPTG: izopropylo-e-D-tiogalaktopiranozyd

PAGE: elektroforeza w żelu poliakryloamidowym PU: ploug units - podłoże

SDS: dodecylosulfonian sodowy sekwencja S. D.: sekwencja Shine'a-Delgarno tris HCL: chlorowodorek trójhydroksymetyloaminoetanu

Tween-80: jednooleinain polietoksylowanego (20) anhydrosorbitu.

Jako materiał wyjściowy do konstruowania nowych plazmidów stosuje się zwłaszcza występujący w handlu plazmid pBR 322 (4363 pz). Przede wszystkim eliminuje się z niego region nic/bom i/lub gen odporności na działanie tetracykliny. Nie jest przy tym konieczne całkowite usuwanie genu odporności na działanie tetracykliny, lecz wystarcza dokonanie tego w takim stopniu, aby plazmid nie nadawał transformowanym nim szczepom bakterii cechy tej odporności. Dzięki wykonaniu tych operacji (usunięcie regionu nic/bom i co najmniej części genu odporności na działanie tetracykliny) otrzymuje się tak zwany „plazmid wysoce bezpieczny“.

Korzystna strategia konstruowania nowego plazmidu sposobem według wynalazku, wychodząc ze zmodyfikowanego tak jak wyżej podano plazmidu pBR 322 (lub z innego znanego wymienionego tu także plazmidu) przewiduje jako następną operację wbudowanie syntetycznego miejsca wielokrotnego klonowania - „Multi cloning site“, między miejsca cięcia Eco RI oraz Hind III. Ten Multi cloning site (porównaj fig. 2) posiada umieszczone w określonej kolejności miejsca cięć, przy czym leżące między nimi zasady są wybrane dowolnie z wyjątkiem sekwencji między Xba I oraz

166 199

Ndel, która zawiera miejsce wiązania rybosomów (sekwencję Shine'a-Delgarno z operonu 5' -AAGGAG - 3'B. subtilisXyl (4) oraz posiada określoną odległość między sekwencją S. D. i kodonem startowym ATG. Zasady GAAAT następujące po sekwencji S. D. są przyjęte z (4) i połączone z CATATG, miejscem cięcia Nde I. Odległość między sekwencją S. D. i ATG wynosi więc 8 par zasad. Odległości między poszczególnymi miejscami cięć Multi cloning site powinny ze względu na technikę klonowania mieć długość co najmniej około 20 nukleotydów, co ułatwia usuwanie fragmentów pośrednich.

Za pomocą tego Multi cloning site wprowadza się do plazmidu miejsca cięć, które - korzystnie po wbudowaniu terminatora transkrypcji - umożliwiają wykonywane kolejne wbudowywania częściowych sekwencji genu strukturalnego scu PA, zwłaszcza rozpoczynając od części terminalnej C białka docelowego, a więc od części terminalnej 3' nici DNA wytwarzanego genu strukturalnego, jak również wbudowanie np. syntetycznego lub wyodrębnionego z innego plazmidu albo występującego w handlu promotora Trp. Kompletna sekwencja nukleotydowa otrzymanego w ten sposób genu strukturalnego scu-PA jest przedstawiona na fig. 15 z równoczesnym wyszczególnieniem aminokwasów odpowiadających poszczególnym kodonom.

Inne spośród nowych plazmidów otrzymuje się według wynalazku ze skonstruowanego jak wyżej plazmidu np. w ten sposób, że przez cięcia w miejscach Eco RI oraz HindIII otrzymuje się syntetyczny gen strukturalny scu PA z wszystkimi jednostkami regulacyjnymi, a następnie wbudowuje go w inny mogący się niezależnie rozmnażać w bakteriach jelitowych, zwłaszcza E. coli, plazmid, który w tym celu przez cięcia za pomocą Eco RI oraz Hind III został zlinearyzowany i skrócony. W taki sam w zasadzie sposób, ale korzystając z miejsc cięcia Eco RI oraz Xba I można w jednym z plazmidów otrzymanych sposobem według wynalazku, także wymienić np. promotor Trp na promotor Tac (i odwrotnie).

W podobny sposób można także wychodzić z innych znanych plazmidów, które zawierają pojedyncze miejsca cięcia Eco RI oraz Hind III, jak np. z pUC 9, pUC 12,pUC 13,pUC 18,pUC 19 i z innych.

Nowe plazmidy o przedłużonej odległości między sekwencją Shine'a-Delgarno a kodonem startowym ATG otrzymuje się według wynalazku w ten sposób, że skonstruowany jak wyżej plazmid, w którym wymieniona odległość wynosi np. 8 nukleotydów, tnie się w miejscu Nde I, uzupełnia wynikowe miejsca cięcia a następnie poddaje powstałe końce blunt ligacji, przez co tworzy się żądany nowy plazmid, w którym odległość między sekwencją S. D. a kodonem startowym wynosi np. 10 nukleotydów.

Jak już wspomniano, bakterie transformowane plazmidami otrzymanymi sposobem według wynalazku wykazują stopnie ekspresji wielokrotnie większe od tych jakie można osiągać w przypadku transformacji plazmidami znanymi ze stanu techniki. Transformowanie odpowiednich organizmów żywicielskich wykonuje się w znany sposób. Do przeprowadzania ekspresji plazmidów otrzymywanych sposobem według wynalazku szczególnie przydatnymi organizmami żywicielskimi są szczepy gatunku E. coli i pokrewnych bakterii jelitowych (Enterobacteriaceae), jak np. szczepy Pseudomonas, Salmonella, Enterobacter, Klebsiella lub Serratia.

Znakomitymi organizmami żywicielskimi są szczepy gatunku E. coli, jak np. E. coli GRT-1, a zwłaszcza szczepy E. coli podgrupy K 12, jak np. E. coliK12 JM101 (ATCC 33876), E. coli K12 JM103 (ATCC 39403), E. coliK12 JM105 (DSM4162) lub szczep E. coli K12 ATCC 31446 albo także E. coli K12 DH1 (ATCC 33849).

Rozpoczęcie ekspresji w systemach ekspresyjnych E. coli, które zawierają promotor Tac, można spowodować np. przez dodanie laktozy lub odebranie glukozy a zwłaszcza przez dodanie izopropylo-e-D-tiogalaktopiranozydu. Jednak gdy w plazmidzie występuje promotor Trp, wówczas indukcja zachodzi zwłaszcza z kwasem indoloakrylowym, octowym lub propionowym. Tak samo mogą być oczywiście używane inne znane induktory.

Po indukcji i osiągnięciu określonej ustalonej gęstości komórek odwirowuje się je a pozostałość z odwirowywania po wyszlamowaniu roztworem wodnym soli przenosi np. do homogenizatora, w którym powoduje się ich pękanie wskutek różnicy ciśnień. Po ponownym odwirowaniu otrzymuje się w pozostałości białko wstępne dla rscu-PA obok nierozpuszczalnych w wodzie szczątków komórek itp. Przez działanie roztworem chlorowodorku guanidyny przeprowadza się

166 199 białko wstępne do roztworu a po ponownym odwirowaniu poddaje przechodzący roztwór działaniu układu redoks (np. zawierającego zredukowany i utleniony glutation), co powoduje powstawanie naturalnej konfiguracji a więc wytwarzanie żądanej rscu-PA. Jest ona rozpuszczona w mieszaninie reakcyjnej i za pomocą zwykłych operacji oczyszczania (np. chromatografii i odparowania ze stanu zamrożenia) wyodrębnia się ją w czystej postaci.

Dla celów analitycznych szczepy E. coli transformowane badanym plazmidem poddaje się fermentacji a po osiągnięciu ustalonej gęstości optycznej zawiesiny komórek indukuje za pomocą odpowiedniego induktora ekspresję białka wstępnego rscu-PA. Po odpowiednim czasie trwania fermentacji odwirowuje się z badanej próbki komórki i rozpuszcza je za pomocą lizozymu (1 mg lizozymu na ml 50 m molowego buforu tris - HCl o wartości pH 8,0, 50 m moliEDTA i 15% sacharozy). Homogenat komórek, które uległy lizie, solublizuje się w 4-5 molowym roztworze chlorowodorku guanidyny i po rozcieńczeniu do 1,2 moli chlorowodorku guanidyny przez dodanie środka redukującego (glutationu, merkaptoetanolu, lub cysteiny) poddaje w ciągu 2-5 godzin reakcji przekształcania [porównaj także np. Winkle i in. (11)]. Otrzymaną w ten sposób rscu-PA przekształca się przez dodanie plazminy w dwułańcuchową rtcu-PA, której aktywność oznacza się następnie za pomocą substratu S2444 (pyroGlu-Gly- Arg-p-nitroanilid; Kabi Diagnostika, Szwecja) rozszczepiającego się tylko za pomocą dwułańcuchowych aktywnych urokinaz. Tę aktywację rscu-PA za pomocą plazminy wykonuje się w mieszaninie 50 m molowego buforu tris, 12 m molowego chlorku sodowego, 0,02% Tween 80 przy wartości pH 7,4 i w temperaturze 37°C. Stosunek rscu-PA do plazminy powinien wyno sić około 1(00- 1500:1, w odniesieniu do stężeń molowych, lub około 8000- 36000:1, w odniesieniu do jednostek enzymowych. Inkubację testową wykonuje się w mieszaninie 50 m molowego buforu tris, 38 m molowego chlorku sodowego przy wartości pH 8,8 w obecności 0,36 μ mola aprotyniny (do hamowania plazminy) i 0,27 m moli S 2444 w temperaturze 37°C. Zależnie od zawartości rscu-PA w próbce reakcję zatrzymuje się po upływie

5-60 minut inkubacji przez dodanie 90% kwasu octowego i mierzy ekstynkcję przy 405 nm. Według danych producenta substratu S 2444 przy tym sposobie postępowania zmiana ekstynkcji o 0,05 jednostek na minutę przy 405 nm odpowiada aktywności 25 jednostek Ploug na ml roztworu testowego.

Wydajności rsu-PA, którą wytworzono z białka wstępnego otrzymanego w różnych bakteriach przy użyciu rozmaitych plazmitów wykonanych sposobem według wynalazku, są podane na fig. 10, 12 i 14.

Jak wynika z fig. 11 oraz z danych zawartych w niżej podanych przykładach - zwłaszcza z tabeli w przykładzie II - plazmidy wytwarzane sposobem według wynalazku powodują zwłaszcza w szczepach E. coli wytwarzanie białka wstępnego rscu-PA przy stopniu ekspresji 10-25% wagowych, zwłaszcza 14-20% wagowych całkowitej ilości wytworzonego białka. Stopień ekspresji jest więc przy użyciu nowych plazmidów co najmniej 10-15 razy większy od osiągalnego za pomocą znanych plazmidów, jak np. pUK 54 trp 207 - 1.

Na figurze la - 15b na rysunkach przedstawiono niżej omówione konstrukcje, sekwencje i wykresy.

Figura 1a i 1b: konstruowanie plazmidu pBF 158 na bazie występującego w handlu plazmidu pBR 322. Usuwa się przy tym kolejno region nic/bom i dużą część genu odporności na działanie tetracykliny.

Figura 2: sekwencję nukleotydową syntetycznego „Multi cloning site“.

Figura 3: konstruowanie plazmidu pBF 158 - 01. Pokazane jest wbudowywanie syntetycznego Multi cloning site w plazmid pBF 158 między miejsca cięć Eco RI oraz HindIII.

Figura 4: konstruowanie plazmidu pBF158-01. Fragment ClaIXHindIII zastępuje się odpowiednim fragmentem „T“ z plazmidu pRT 61 (5), na którym znajduje się terminator A/orf L z Tn 10 (6).

Figura 5a-5g: sekwencje nukleotydowe syntetycznych fragmentów dla genu kodującego ludzką scu-PA (których wbudowywanie z wytworzeniem genu strukturalnego dla scu-PA w plazmidzie otrzymanym sposobem według wynalazku, wychodząc z plazmidu pBF 158-01T, opisano w przykładach Id - If i pokazano na fig. 6, 7 oraz 9).

Figura 6a - 6c: konstruowanie plazmidów pBF 158 - 02T do pBF 158 - 06T przez wbudowanie fragmentów nukleotydowych M4- M8, od części terminalnej C białka docelowego (odpowiadającego części terminalnej 3' nici DNA), wychodząc z plazmidu pBF 158-01T.

166 199 7

Figura 7a - 7c: konstruowanie plazmidu pBF 158 - 08 T przez wykonanie konstrukcji pomocniczej w plazmidzie pUC 19 (porównaj przykład Ie).

Figura 8: sekwencję nukleotydową syntetycznego promotora Trp.

Figura 9: konstruowanie plazmidu ekspresyjnego dla proteiny wstępnej ludzkiej rscu-PA, pBF 160. Gen strukturalny dla scu-PA jest pokazany w postaci czarnego paska między miejscami cięć Nde I oraz Cla I.

Figura 10: stopnie ekspresji białka wstępnego ludzkiej rscu-PA (oznaczone jako aktywność rtcu-PA po przekształceniu i aktywacji) w różnych szczepach E. coli transformowanych plazmidem pBF 160 ( ) lub plazmidem pUK54 trp 207- 1 (10) ( ) pod kontrolą promotora Trp w zależności od czasu upływającego od rozpoczęcia indukcji kwasem indoloakrylowym w punkcie czasowym O. Podane są oznaczone za pomocą substratu S 2444 aktywności rtcu-PA w jednostkach Ploug na ml medium fermentacyjnego o gęstości optycznej równej 1 przy 578 nm.

Figura 11: wykres gęstości SDS-PAGE białek z komórek E. coli K12 JM103 transformowanych przez pBF 161 po fermentacji przed (A) i w 6 godzin po (B) dodaniu kwasu indoloakrylowego jako induktora.

Figura 12: stopnie ekspresji białka wstępnego ludzkiej rscu-PA (oznaczone jako aktywność rtcu-PA po przekształceniu i aktywacji) w E. coli K12 JM103 transformowanej przez pBF 171, to znaczy pod kontrolą promotora Tac. Indukcję spowodowano w punkcie czasowym 0 za pomocą IPTG. Podana jest oznaczona w stosunku do substratu S 2444 aktywność rtcu-PA w jednostkach Ploug na ml medium fermentacyjnego o gęstości optycznej równej 1 przy 578 nm.

Figura 13: wydłużanie odległości między sekwencją Shine'a-Delgarno(SD) a kodonem startowym z 8 do 10 zasad przez uzupełnienie miejsc cięcia Nde I, a następnie ligację powstałych końców blunt.

Figura 14: stopnie ekspresji białka wstępnego ludzkiej rscu-PA (oznaczone jako aktywność rtcu-PA po przekształceniu i aktywacji) w E. coli -1 transformowanej plazmidem pBF 161 (o o) lub pBF 163 (Δ Δ) pod kontrolą promotora Trp. Indukcję spowodowano w punkcie czasowym 0 za pomocą kwasu indoloakrylowego. Podane są oznaczone za pomocą substratu S 2444 aktywności rtcu-PA w jednostkach Ploung na ml medium fermentacyjnego o gęstości optycznej równej 1 przy 578 nm.

Figura 15a i 15b: kompletna sekwencja nukleotydowa genu strukturalnego scu-PA z wyszczególnieniem aminokwasów odpowiadających poszczególnym kodonom.

Enzymy restrykcyjne, stosowane w przykładach wykonania, są dostępne w handlu (porównaj np. Nachr. Chem. Techn. Lab. 35, 939, 1987).

Pożywka hodowlana, stosowana w przykładach do selekcji klonów, zawiera w 1 litrze: 7,8 g peptonu z mięsa, 7,8 g peptonu z kazeiny, 10 g wyciągu z drożdży, 5,6g chlorku sodowego i 10g glukozy. Do tej pożywki dodaje się na ciepło 10 g agaru na litr i wylewa na płytki.

Przykład I. Konstruowanie plazmidu ekspresyjnego pBF 160 dla białka wstępnego dla rscu-PA z syntetycznym genem scu-PA pod kontrolą promotora Trp.

a) Konstruowanie plazmidu pBF 158.

i) Z plazmidu pBR (Pharmacia, nr 27 - 4902,4363 bp) usuwa się następująco region nic/bom, który znajduje się między zasadami 2207 i 2263 (1) (porównaj także fig. 1): pBR 322 tnie się przy zasadzie 2298 za pomocą Nde I i w ten sposób przekształca w postać liniową. Powstałe końce uzupełnia się na drodze reakcji „fili in“ otrzymując końce blunt. Potem tnie się przy zasadzie 2068 za pomocą Pvu II i obydwa końce blunt pozostałej części pBR 322 poddaje znowu znaną techniką ligacji za pomocą ligazy T4. Następnie transformuje się zestaw ligacyjny do właściwych komórek E. coli K12 JM103 (ATCC 39403) (3). Transformowane komórki hoduje się na pożywce z dodatkiem ampicyliny w ilości 150 /ig/ml. Spośród otrzymanych klonów wybiera się te, które zawierają plazmid pBF 157, odróżniający się od plazmidu pBR 322 mniejszymi o 228 nukleotydów fragmentami a) Pst IX BspM II, b) Pst IX Bal I, c) Pst IX Ava I. Obydwa pojedyncze miejsca cięcia Pvu II oraz Nde I z pBR 322 nie występują już w plazmidzie pBF 157.

ii) Z pBF 157 usuwa się dużą część genu odporności na działanie tetracykliny przez cięcia za pomocą EcoRVXNruI, a następnie ligację powstałych końców blunt. Po transformacji do E. coli K12 JM 103 i hodowli na pożywce zawierającej 150 rg ampicyliny (ml otrzymuje się klony,

166 199 spośród których wybiera się te, które zawierają plazmid pBF 158. Jest on mniejszy o 787 nukleotydów od pBF157 i ponadto różni się brakiem w nim miejsca cięcia BamHI. Transformacja szczepów bakterii za pomocą pBF 158 nie nadaje im cechy odporności na działanie tetracykliny.

b) Konstruowanie pBF 158-01, wbudowywanie syntetycznego multi cloning site.

Z pBF158 usuwa się przez cięcie za pomocą Eco RIX Hind III fragment obejmujący 31 nukleotydów i w powstałą lukę wprowadza przez ligację syntetyczny multi cloning site, którego sekwencja jest pokazana na fig. 2. Po transformacji zestawu ligacyjnego do E.coli K12JM103 i hodowli na pożywce zawierającej 150 pg ampicyliny/ml wybiera się te klony, które zawierają plazmid pBF 158 - 01. Różni się on od pBF 158 tym, że posiada dodatkowo pojedyncze miejsca cięć Xba I, Nde I, Sac I, Eag I, Kpn I, Spe I oraz drugie miejsce cięcia Pst I (fig. 3).

c) Konstruowanie pBF 158 -01T, wbudowywanie terminatora transkrypcji.

Z pBF 158-01 usuwa się fragment Cla IX Hind III stanowiący część Multi cloning site i zastępuje go fragmentem Cla IX Hind III z pRT61 (5), na którym znajduje się terminator tet A/orf L z Tn 10 (6).

Po transformacji do szczepu E.coli K12JM103 i hodowli na pożywce zawierającej 150 pg ampicyliny/ml wybiera się te klony, które zawierają plazmid pBF 158 -01.T. Różni się on od pBF 158- 01 obecnością fragmentu Cla IX Hind III o długości 297 nukleotydów.

d) Wbudowywanie syntetycznych fragmentów M4-M8 do genu scu-PA, konstruowanie plazmidów pBF 158 - 02 T - pBF 158 - 06 T.

Wszystkie syntetyczne fragmenty są opisane w fig. 5a-5g. Są one wstawiane w odpowiednie wektory jako dwuniciowe fragmenty o długości około 200 nukleotydów. W tym celu wektory tnie się w wymienionych w każdym przypadku miejscach za pomocą odpowiednich enzymów restrykcyjnych i oddziela od usuwanych fragmentów przez elektroforezę w żelu agarowym, elektroelucję i oczyszczanie za pomocą DE 52. Następnie poddaje się ligacji z przynależnym dwuniciowym syntetycznym fragmentem za pomocą ligazy T4, transformacji do E. coli K12 JM103 (fig. 6a- 6c) i selekcji na pożywce zawierającej ampicylinę.

i) Ligacja fragmentu M8 między BamHI oraz Clal w plazmidzie pBF 158-01T. Powstaje plazmid pBF 158-02 T.

Oligonukleotyd 019 koduje sekwencję terminalną C w scu-PA. Za kodonem hamującym TAA znajduje się miejsce cięcia Nhe I, a następnie dodatkowe sekwencje terminacji transkrypcji terminatora trpa (8) do Clal.

ii) Ligacja fragmentu M7 między Spel oraz BamHI w plazmidzie pBF 158-02T. Powstaje plazmid pBF 158 -03 T.

iii) Ligacja fragmentu M6 między Kpn I oraz Spe I w plazmidzie pBF-03-Τ. Powstaje plazmid pBF 158-04 T.

iv) Ligacja fragmentu M5 między EagI oraz KpnI w plazmidzie pBF 158-04T. Powstaje plazmid pBF 158-05 T.

v) Ligacja fragmentu M4 między SacI oraz EagI w plazmidzie pBF 158-05T. Powstaje plazmid pBF 158-06 T.

Z otrzymanych klonów i - v wybiera się zawsze te, które różnią się od każdorazowo swojego poprzednika obecnością wbudowanego nowego fragmentu w zbadanej właściwej sekwencji.

e) Wbudowywanie syntetycznych fragmentów M2 i M3 do genu scu-PA, konstruowanie plazmidu pBF 158-08 T.

Ponieważ do wbudowywania fragmentów M2 i M3 jest wymagane cięcie Pst I a w stosowanym aż dotąd plazmidzie pBf 158 znajduje się jeszcze jedno miejsce cięcia Pst I (w genie odporności na działanie ampicyliny), które przeszkadzałoby w późniejszym klonowaniu, więc postępuje się następująco (fig. 7a - 7c):

i) Z występującego w handlu (np. Pharmacia) plazmidu pUC 19 usuwa się Multi cloning site i dodatkowo 212 nukleotydów w kierunku pod prąd jako fragment Nde IX Hind III. W powstałą lukę włącza się następnie przez ligację syntetyczny Multi cloning site z plazmidu pBF 158-04-3 T jako fragment Nde IX Hind III. Ten plazmid pBF 158-04-3 T otrzymuje się z plazmidu pBF 158-02 T (porównaj przykład I di) przez wbudowanie fragmentu oligonukleotydowego M6 i odpowiada plazmidowi pBF bez fragmentu M7. Po transformacji w komórkach E.coli

166 199

K12 JM 103 i hodowli na pożywce zawierającej 150 pg ampicyiiny/ml wybiera się te klony, które zawierają plazmid pUC 19-04-3. Różni się on od pUC 19 obecnością fragmentu Nde IX Hind III o długości 712 nukleotydów.

ii) Z pUC 19-04-3 usuwa się fragment Pst IX Sac I, wyodrębnia liniowy wektor i poddaje ligacji z fragmentem oligonukleotydowym M3. Po transformacji do E. coli K12 JM103 i hodowli na pożywce zawierającej 150 μg ampicyliny/ml wybiera się te klony, które zawierają plazmid pUC 19-07. Różni się on od pUC 19-04-3 obecnością fragmentu Pst IX Sac I o długości 189 nukleotydów, który zawiera fragment M3 o właściwej sekwencji.

iii) Z opisanego powyżej plazmidu pUC 19-07 usuwa się fragment Mde IX Pst I i w powstałą lukę wstawia przez ligację fragment M2. Po transformacji do E. coli K12 JM103 i hodowli na pożywce zawierającej 150 μg ampicyliny/ml wybiera się te klony, które zawierają plazmid pUC 19-08. Różni się on od pUC 19-07 obecnością fragmentu Nde IX Pst I o długości 246 par zasad czyli fragmentu M2 o właściwej zbadanej sekwencji.

iv) Z plazmidu pUC 19-08 usuwa się fragmenty M2 i M3 jako fragment Nde IX Sad i pozostałość poddaje ligacji z większą częścią pBF 158-06 T, otrzymaną po cięciu przez NdeIXSacI. Po transformacji do E. coli K12JM103 i hodowli na pożywce zawierającej 150μg ampicyliny/ml wybiera się te klony, które zawierają plazmid pBF 159-08 T. Różni się on od pBF 158-06T obecnością fragmentu NdeIXSacI o długości 435 nukleotydów.

f) Konstruowanie plazmidu pBF 160, wbudowywanie syntetycznego promotora Trp bierze się do miejsca cięcia Xba I na końcu 5' przedłużają sekwencją 5'-AATTCTGAAAT-3'. W ten sposób konstruuje się miejsce cięcia Eco RI (fig. 8, fragment M1). Pojedyncze nici 021 i 021A poddaje się anneacji i włącza przez ligację do ciętego w miejscach EcoRIXXbaI plazmidu pBF 158-08 T (fig. 9). Po transformacji do E. coli K12 JM103 i hodowli na pożywce zawierającej 150 /2g ampicyliny/ml wybiera się te klony, które zawierają pBF 160. Plazmid pBF 160 różni się od wszystkich wyżej opisanych poprzedników tym, że po transformacji do szczepów bakterii E. coli i dodaniu kwasu indoloakrylowego wywołują one ekspresję białka wstępnego dla rscu-PA.

g) Test ekspresji.

i) Fermentacja.

Różne, transformowane plazmidem pBF 160 szczepy E. coli, np. E. coli GRT-1, E. coHK12JM103 oraz E.coli K12ATCC31446, poddaje się fermentacji zawsze w takich samych warunkach w pożywce składającej -się z 38 mmoli siarczanu amonowego, 56 m moli buforu fosforanowego o wartości pH 7,0,1 m mola siarczanu magnezowego, 1% wyciągu z drożdży, 1% glukozy i zawierający 150 mg ampicyliny na litr i przez dodanie 62 mg kwasu indoloakrylowego na litr indukuje ekspresję białka wstępnego dla rscu-PA. Dla porównania transformuje się do wyżej wymienionych szczepów opisany poprzednio plazmid, który zawiera gen dla prourokinazy ludzkiej z banku cDNA, otrzymanego z mRNA komórek Detroit 562, i nosi oznaczenie pUK 54 trp 207 -1, a następnie poddaje fermentacji i indukcji w takich samych warunkach.

Przed indukcją i co godzinę w ciągu 6 godzin po rozpoczęciu indukcji odwirowuje się komórki odpowiadające 1 ml zawiesiny komórek o gęstości optycznej (OD) równej 1 przy 578 nm i stosuje się do testowania stopni ekspresji.

ii) Przekształcanie białka wstępnego w rscu-PA, rozszczepianie jej do rtcu-PA i pomiar aktywności.

Odwirowane komórki rozpuszcza się, tak jak to opisano wyżej za pomocą lizozymu a następnie stosuje homogenat zlizowanych komórek do oznaczenia aktywności w wyżej opisany sposób.

Stopnie ekspresji ustalone w wyniku zmierzenia aktywności rtcu-PA wytworzonego z rscu-PA (otrzymanego z białka wstępnego) są przedstawione na fig. 10. Wynika z tego, że szczepy E. coli, które były transformowane plazmidem pBF 160, posiadały 10- 15 razy większą wydajność ekspresji niż takie same szczepy E. coli transformowane znanym z literatury plazmidem pUK 54 trp 207-1 (10). Ponadto okazało się, że wydajność ekspresji wszystkich szczepów w zależności od plazmidu użytego do transformacji ma w przybliżeniu tę samą wartość, to znaczy, że szczepy transformowane plazmidem pBF160 (niezależnie od poszczególnych szczepów E. coli) zawsze posiadały wielokrotnie większe stopnie ekspresji niż identyczne szczepy transformowane znanym plazmidem pUK 54 trp 207 - 1.

166 199

Przykładl I.

a) Konstraowanie plazmidu ekspresyjnego pBF 161 dla białka wstępnego dla rscu-PA z syntetycznym genem scu-PA pod kontrolą protora Trp.

Plazmid pBR 322 tnie się za pomocą EcoRI oraz HindlII. Powstały fragment o długości 31 nukleotydów oddziela się na drodze preparatywnej elektroforezy w żelu agarowym. Pozostałą część pBR 322 eluuje się z żelu przez elektroelucję i oczyszcza przez chromatografię za pomocą DE 52.

Plazmid pBF 160 (przykładIf) także tnie się za pomocą EcoRI oraz Hindlil a fragment Eco RI X Hind III o długości 1684 nukleotydów, który zawiera syntetyczny gen scu-PA ze wszystkimi jednostkami regulacyjnymi (promotor Trp) oddziela się przez elektroforezę w żelu agarowym oraz eluuje i oczyszcza jak wyżej.

Otrzymane fragmenty poddaje się ligacji ze pomocą ligazy T4, a następnie transformuje do E. coli K12JM 103. Po hodowli na pożywce zawierającej 150p.g ampicyliny/ml wybiera się te klony, które zawierają fragment Eco RI X Hind III o długości 1684 nukleotydów i które po dodaniu kwasu indoloakrylowego produkują białko wstępne dla rscu-PA. Te klony zawierają plazmid pBF 161.

b) Test ekspresji.

E. coli GRT-1, E. coli K12 JM 103 oraz E. coli K12 ATCC 31446 transformuje się plazmidem pBF161, a następnie poddaje fermentacji tak jak opisano w przykładzie Ig) i testuje wyniki ekspresji. Wydajności białka wstępnego dla rscu-PA oznaczone jako aktywność rtcu-PA w ciągu 1-6 godzin od rozpoczęcia indukcji są porównywalne z wielkościami wydajności przedstawionymi na fig. 10 dla zastosowania plazmidu pBF 160 do transformacji.

Grudki komórek otrzymane przez odwirowanie analogicznie (jak w przykładzie Igi) można rozpuścić przez ogrzewanie w temperaturze wrzenia w 0,25 mola buforu tris HCl o wartości pH 8,0 z zawartością 4% SDS, 1% merkaptoetanolu i 20% gliceryny. Rozpuszczone w ten sposób białka oddziela się przez SDS-PAGE i czyni je widocznymi przez zabarwienie za pomocą Coomassieblue (12). Zabarwione żele ocenia się densytometrycznie i całkuje powierzchnię poniżej pików. Zawartość białka wstępnego dla escu-PA wytworzonego po indukcji kwasem indoloakrylowym ustala się przez odjęcie powierzchni pasm zidentyfikowanych jako białko wstępne przed indukcją od otrzymanych po indukcji. Na fig. 11 jest przedstawiony wykres gęstości dla białka otrzymanego z komórek E. coli K12 JM 103. W niniejszym przykładzie zawartość białka wstępnego dla rscu-Pa wynosi po indukcji 17,9% wagowych w całkowitej ilości białka bakteryjnego. Dalsze przykłady są podane w tabeli.

Tabela

Zawartość białka wstępnego dla rscu-PA w białku całkowitym (w procentach)

Szczep E. coli	Transformowany przez
pBF 161	pUK54 trp 207-1 (10)
K12 ATCC 31446	14	1,5
K12 JM 103	17,9	1,9
GRT-1	17,8	1,7

Przykład III. Konstruowanie plazmidu ekspresyjnego dla białka wstępnego dla rscu-PA z syntetycznym genem scu-PA pod kontrolą promotora Trp w pBR 322 z delecją w genie odporności na działanie tetracykliny.

a) Konstruowanie plazmidu pBR 322 del.

Plazmid pBR 322 tnie się za pomocą Eco RV oraz Nru I. Powstały fragment o wielkości 787 nukleotydów usuwa się przez elektroforezę w żelu agarozowym. Pozostałą część pBR 322 eluuje się z żelu przez elektroelucję i oczyszcza za pomocą DE 52. Końce blunt pozostałej części Eco RV X Nrul z pBR poddaje się ligacji za pomocą ligazy T4. Po transformacji do E. coli K12 JM 103 i hodowli w pożywce zawierającej 150iug ampicylinv/ml wybiera się te klony, których próbka po

166 199 przeniesieniu na pożywkę zawierającą 25 gg tetracykliny/ml nie rośnie na niej, to znaczy nie posiada odporności na działanie tetracykliny. Klony zawierają plazmid pBR 322 del, który różni się tym od pBR 322, że jest mniejszy o 787 nukleotydów i nie daje się ciąć za pomocą Eco RV oraz Nrul.

b) Konstruowanie plazmidu pBF 162.

pBR322del tnie się za pomocą EcoRI oraz Hind III. Powstały fragment o długości 31 nukleotydów oddziela się na drodze preparatywnej elektroforezy w żelu agarowym, pozostałą część pBR 322 del eluuje z żelu przez elektroelucję i oczyszcza za pomocą DE 52.

Z pBF160 otrzymuje się w taki sam sposób fragment Eco RIX Hind III o długości 1684 nukleotydów, który zawiera syntetyczny gen scu-PA ze wszystkimi jednostkami regulacyjnymi (promotor Trp).

Obydwa fragmenty poddaje się w znany sposób ligacji za pomocą ligazy T4, a następnie transformuje do komórekE. coli K12 JM 103. Po hodowli na pożywce zawierającej 150 gg ampicyliny/ml wybiera się klony, które zawierają fragment Eco RI X Hind III o długości 1684 par zasad i które po dodaniu 62gg kwasu indoloakrylowego/ml produkują białko wstępne dla rscu-PA. Te klony zawierają plazmid pBF 162.

c) Test ekspresji.

E. coli GRT-1 transformuje się za pomocą pBF 162, a następnie poddaje fermentacji tak jak opisano w przykładzie Ig) i testuje wynik ekspresji. Wydajność białka wstępnego dla rscu-Pa oznaczona jako aktywność rtcu-PA w ciągu 6 godzin od rozpoczęcia indukcji wynosi 1300 PU/ml zawiesiny komórek o gęstości optycznej równej 11 jest porównywalna z wielkościami wydajności przedstawionymi na fig. 10 dla ekspresji po transformacji E. coli GRT-1 plazmidem pBF 160.

Przykład IV.

a) Konstruowanie plazmidu ekspresyjnego pBF 171 dla białka wstępnego dla rscu-PA z syntetycznym genem scu-PA pod kontrolą promotora Tac.

Plazmid pBF tnie się za pomocą Eco RI oraz Xba I. Powstały fragment o długości 74 nukleotydów oddziela się na drodze preparatywnej elektroforezy w żelu agarowym, pozostałą część plazmidu eluuje z żelu przez elektroeluację, a następnie oczyszcza za pomocą DE 52.

Z plazmidu ptac SDT (DSM5018) wyodrębnia się fragment EcoRIXXbaI, który zawiera promotor Tac. W tym celu tnie się ptac SDT za pomocą EcoRIXXbaI i oddziela fragment za pomocą preparatywnej PAGE. Fragment eluuje się z rozdrobnionego mechanicznie poliakryloamidu przez ogrzewanie do temperatury 65°C w buforze octan amonowy/SDS o wartości pH 8,0 i oczyszcza przez kilkakrotną ekstrakcję fenolem nasyconym 1 molowym buforem tris o wartości pH8.

Obydwa otrzymane w ten sposób fragmenty poddaje się w zwykły sposób ligacji za pomocą ligazy T4, a następnie transformuje do E. coli K12 JM 103. Po hodowli na pożywce zawierającej 150 gg ampicyliny/ml wybiera się klony, które po dodaniu IPTG produkują białko wstępne dla rscu-PA. Te klony zawierają plazmid pBF 171.

b) Test ekspresji.

E. coli K12 JM 103 transformuje się za pomocą pBF 171, a następnie poddaje fermentacji tak jak opisano w przykładzie Ig) i testuje wynik ekspresji. Indukcję wykonuje się jednak za pomocą ITTG (stężenie końcowe 0,5 m mola).

Wydajność białka wstępnego dla rscu-PA oznaczone jako aktywność rtcu-Pa w ciągu 1-6 godzin od rozpoczęcia indukcji są pokazane na fig. 12. Są one porównywalne z wielkościami wydajności przedstawionymi na fig. 10 dla zastosowania plazmidu pBF 160 w takim samym szczepie E. coli.

Przykład V.

a) Konstruowanie plazmidu ekspresyjnego pBF 172 dla białka wstępnego dla rscu-PA z syntetycznym genem scu-PA pod kontrolą promotora TAC w pBR 322 z delecją w genie odporności na działanie tetracykliny.

Plazmid pBR 322 del (patrz przykład IIIa) tnie się za pomocą Eco RI X Hind III. Powstały fragment o długości 31 nukleotydów oddziela się na drodze preparatywnej elektroforezy w żelu agarowym, pozostałą część pBR 322 del eluuje z żelu przez elektroelucję, a następnie oczyszcza za pomocą DE 52.

166 199

Z pBF 171 (przykład IVa) otrzymuje się w taki sam sposób fragment Eco RI X Hind III, który zawiera syntetyczny gen scu-PA ze wszystkimi jednostkami regulacyjnymi (promotor Tac).

Obydwa tak otrzymane fragmenty poddaje się w znany sposób ligacji za pomocą ligazy T4, a następnie transformuje do komórek E. coli K12JM103. Po hodowli na pożywce zawierającej 150rg ampicyliny/mol wybiera się klony, które w obecności 0,5 m mola IPTG produkują białko wstępne dla rscu-PA. Te klony zawierają plazmid pBF 172.

b) Test ekspresji.

E. coli K12 JM 103 transformuje się za pomocą pBF 172, a następnie poddaje fermentacji tak jak opisano w przykładzie Ig) i testuje wynik ekspresji. Wydajności białka wstępnego dla rscu-Pa oznaczone jako aktywność rtcu-Pa w ciągu 1-6 godzin od rozpoczęcia indukcji wynoszą około 1100PU/ml zawiesiny komórek o gęstości optycznej równej 1 i są porównywalne z wielkościami przedstawionymi na fig. 10 dla zastosowania plazmidu pBF 160 w takim samym szczepie E. coli.

Przykład VI. Zmiana odległości między sekwencją Shine'a-Delgarno a kodonem startowym w plazmidzie ekspresyjnym dla białka wstępnego dla rscu-PA.

Kodon startowy ATG stanowi we wszystkich konstrukcjach opisanych w przykładach I-V część składową miejsca cięcia Nde I - CATATG-. Nde I tnie za pierwszym A sekwencji sześcionukleotydowej i dostarcza końce 5', które powstają na dwóch zasadach. Gdy uzupełni się końce 3', to znaczy skonstruuje w ten sposób końcu blunt, a następnie podda ligacji, wówczas odnośna sekwencja zostaje przedłużona o 2 pary zasad. Równocześnie zostaje usunięte miejsce Nde I. Jak pokazano na fig. 13, w przedstawionym tam przykładzie wydłuża się w ten sposób odległość od sekwencji S. D. do kodonu startowego z 8 do 10 par zasad. Wykonanie doświadczalne zostanie poniżej objaśnione w podanym przykładzie:

a) Konstruowanie plazmidu pBF 163

Plazmid pBF tnie się za pomocą Ndel, po czym uzupełnia powstałe końce fragmentem Klenowa polimerazy DNA (2). Następnie jak zwykle poddaje się DNA ligacji za pomocą ligazy T4 po czym transformuje do E. coli K12 JM 103. Po hodowli na pożywce zawierającej ampicylinę wybiera się te klony, które zawierają plazmid pBF 163. Odróżnia się on od pBF 161 brakiem miejsca Ndel i obecnością dodatkowych zasad -TA- w obszarze poprzedniego miejsca Ndel (porównaj fig. 13).

b) Test ekspresji

E. coli GRT-1 transformuje się plazmidem pBF 163, a następnie poddaje fermentacji tak jak opisano w przykładzie Ig) i testuje wynik ekspresji. Wydajności białka wstępnego dla rscu-PA oznaczone po przekształceniu i aktywizacji jako aktywność rtcu-PA na ml zawiesiny komórek o gęstości optycznej równej 1 w ciągu 1-6 godzin od rozpoczęcia indukcji za pomocą 62 mg kwasu indoloakrylowego na litr są podane na fig. 14. Są one porównywalne z wielkościami wydajności przedstawionymi na fig. 10 dla zastosowania plazmidu pBF 160 w takim samym szczepie E. coli.

Niżej podano odsyłacze literaturowe (1)-(12).

(1) Winnacker, E. L. „Gene und Klone“ (Geny i klony), VCH Verlagtgetellschaft, Weinheim, 1985, str. 298.

(2) Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J.: „Molecular cloning“ (Klonowanie molekularne), A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.

(3) Hanahan, I.: „DNA cloning“ (Klonowanie DNA), Vol. I, ed. D. M. Glover, IRL Press, Oxford 1985, str. 109-135.

(4) Wilhelm, M., Hollenberg, C. O.: Nucl. Acid Res. 13, 5717 - 5722 (1985).

(5) Jorgensen, R. A., Reznikoff, W. S.: J. Bacteriol. 138, 705 - 714 (1979).

(6) Scholmeier, K., Gartner, D.,Hiilen, W.: Nucl. Acid Res. 13, 4227-4237 (1985).

(7) Adams, S. P., Kavka, K. S., Wykes, E. I., Holder, S. B. Gallupi, G. R.: J. Am. Chem. Soc. 105,661-663 (1983).

(8) Christie, G.E., Franham, P.J., Platt, T.: Proc. Natl.Acad.Sci. USA80, 4180-4181 (1981).

(9) De Boer, H. A., Comstock, L. J., Vatser, M.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80,21 - 25 (1983).

(10) Holmes, W. E., Pennica, D., Blaber, M., Rey, M. W., Gunzler, W. A., Steffens, G. J., Heynecker, H. L.: Biotechnol. 3, 923-929 (1985).

(11) Winktei·, M. E., Blabo·, M._: Bi_och_em. 25, 404H4045 (1986).

(12) Blakesl_ey, R.W ., B_oezi, J. A._: Anal. Biochon. 82, 550-582 (1977).

2298 20β8

Nrul

974

Ndel, fili in, x Pvu ll(228pz) wyodrębnianie fragmentu z4135pz ligacja

Fig. 1a

16(6199 pBF157

EcoRV x Nrul (787pz) wyodrębnianie fragmentu z 3348 pz i ligać ja

Fig. 1 b

Syntetyczny multi cloning site

EcoRI <---------------------------------_B1-----------------------AATTCATTCTGGTCTGCGATGCTAGTCTAGATAAGGAGGAAATCATATGAGCAATGAACT

GTAAGACCAGACGCTACGATCAGATCTATTCCTCCTTTAGTATACTCGTTACTTGA <-----------------------------B1A---------------------------------><-------------------------------_B2-------------TCATCTGCAGCAAGTTCCATCGAACGAGCTCAAATTCCAGTGCGGTCAGCGGCCGTTCTC AGTAGACGTCGTTCAAGGTAGCTTGCTCGAGTTTAAGGTCACGCCAGTCGCCGGCAAGAG -------------------><-----------------------B2A-------------------------------><--------------------————-----------GTCTCAACTCTGGTACCTCTTGCGATTTCACAGGTACTAGTTTGCTCTCGCCAGCGTGGA CAGAGTTGAGACCATGGAGAACGCTAAAGTGTCCATGATCAAACGAGAGCGGTCGCACCT -------------------_-----fc---><------------.----------------_B3—-------------------------------------->

TCCGTTCTCACACCAAAGAAATCGATGACCTTCAAGTTCTGCA Htndlll

AGGCAAGAGTGTGGTTTCTTTAGCTACTGGAAGTTCAAGACGTTCGA

B3A------------------------------------------->

EcoRI x HindlU(31pz) wyodrębniani® fragmentu z 3315 pz ligacja z syntetycznym multi cloning sit®

EcoRI Nd@l Scscl Kpnl BamHI |Xbal|Pftl |Eqgt |Sp@llCląłl ₇ 25 19 2& 21 2025 2022 24 21 (223pz)

Hind Ul

Fig. 3

Τ66199

Sekwencje gssad ©Itgoaukleetydw

01-019; O1A-O19A

Fig. 5

M2 (01-04; 01A-04A):

Nde!

<--------------------------oi---------------------------><—

TATGAGCAATGAACTTCATCAAGTTCCATCGAACTGTGACTGTCTAAATGGCGGAACCTG

ACTCGTTACTTGAAGTAGTTCAAGGTAGCTTGACACTGACAGATTTACCGCCTTGGAC <----------------------oiA------------------------><------------------------------02-----------------------------><—

CGTTTCTAACAAATATTTCTCTAACATCCACTGGTGTAACTGCCCGAAAAAATTCGGTGG GCAAAGATTGTTTATAAAGAGATTGTAGGTGACCACATTGACGGGCTTTTTTAAGCCACC ------------------------------02A-----------------------------------------------------------03------------------------TCAGCACTGCGAAATCGACAAATCTAAAACCTGCTACGAAGGTAACGGTCACTTCTACCG AGTCGTGACGCTTTAGCTGTTTAGATTTTGGACGATGCTTCCATTGCCAGTGAAGATGGC -----------><----------------03A-------------------><-----------------><------------------------04--------------------TGGTAAGGCTTCTACCGACACCATGGGTCGTCCGTGCCTGCCGTGGAACTCTGCTACCGT ACCATTCCGAAGATGGCTGTGGTACCCAGCAGGCACGGACGGCACCTTGAGACGATGGCA ------------------------04A--------------------------------TCTGCA

AG

->

Pst I

Fig. 5a

M3 (05-07: 05A-07A):

<---------------------------05----------------p_sii GCAGACCTACCACGCTCACCGTTCTGATGCATTGCAGCTGGGTCTGG

ACGTCGTCTGGATGGTGCGAGTGGCAAGACTACGTAACGTCGACCCAGACC <----------------------05A-----------------------><

-----------><-------------------------------06-------------GTAAACACAACTACTGCCGTAACCCGGACAACCGTCGTCGTCCGTGGTGCTACGTTCAGG CATTTGTGTTGATGACGGCATTGGGCCTGTTGGCAGCAGCAGGCACCACGATGCAAGTCC -------------------------O6A---------------------------><----------------------><----------------------------07--------TTGGTCTGAAACCGCTAGTTCAGGAATGCATGGTTCACGACTGCGCTGACGGTAAAAAAC AACCAGACTTTGGCGATCAAGTCCTTACGTACCAAGTGCTGACGCGACTGCCATTTTTTG ----------------------------------O7A--------------------------------------------CGTCTTCTCCGCCGGAAGAGCT GCAGAAGAGGCGGCCTTC -----------------SacI

Fig. 5b

16(6199

Μ4 (08-010: 08Α-010Α):

<----------------------------------08—

Sad CAAATTCCAGTGCGGTCAAAAAACCCTACGTCCGCGTT

TCGAGTTTAAGGTCACGCCAGTTTTTTGGGATGCAGGCGCAA <----------------------08A—------------------------------------------,——><------------------------TTAAAATCATCGGTGGTGAGTTCACCACCATCGAAAACCAGCCGTGGTTCGCTGCTATCT AATTTTAGTAGCCACCACfCAAGTGGTGGTAGCTTTTGGTCGGCACCAAGCGACGATAGA --------><--------------------------------O8B--------------------------09--------------------------------------><-----ACCGTCGTCACCGTGGTGGTTCTGTTACCTACGTTTGCGGTGGTTCTCTGATCTCTCCGT TGGCAGCAGTGGCACCACCAAGACAATGGATGCAAACGCCACCAAGAGACTAGAGAGGCA ------------------><----------------------09A------------------------------------------010----------------------------GCTGGGTTATCTCTGCTACCCACTGCTTCATCGACTACCCGAAAAAAGAAGACTACATCG CGACCCAATAGAGACGATGGGTGACGAAGTAGCTGATGGGCTTTTTTCTTCTGATGTAGC ---------X---------------------------oiOA-----------------TTTACCTC AAATGGAGCCGG ----------->

Fig. 5c

M5 (011-013; 011A-013A):

<---------------------------011--------------------GGCCGTTCTCGTTTAAACTCTAACACCCAGGGTGAAATGAAATTCGAAGTTG

Eagl CAAGAGCAAATTTGAGATTGTGGGTCCCACTTTACTTTAAGCTTCAAC

---------------------------------oilA------------------x-------------------------------------012---------AAAACCTGATCCTGCACAAAGACTACTCTGCTGACACCCTGGCTCACCACAACGACATCG

TTTTGGACTAGGACGTGTTTCTGATGAGACGACTGTGGGACCGAGTGGTGTTGCTGTAGC

-----------------------X--------------------------------------------------------------X----------------——---------CTCTGCTAAAAATCCGTTCTAAAGAAGGTCGTTGCGCTCAGCCGTCTCGTACCATCCAGA GAGACGATTTTTAGGCAAGATTTCTTCCAGCAACGCGAGTCGGCAGAGCATGGTAGGTCT ---012A---------------------------------------X---------------013----------------------------------->

CCATCTGCCTGCCGTCTATGTACAACGACCCGCAGTTCGGTAC

GGTAGACGGACGGCAGATACATGTTGCTGGGCGTCAAGC Kpnl

----------013A------------------------>

Fig. 5d

Μ6 (014-016; Ο14Α-Ο16Α.Β):

<———---------Kpn! CTCTTGCGAAATCACCG

CATGGAGAACGCTTTAGTGGC <-----—— ----------0141------------------><-----------01411------------------GTTTCGGTAAAGAAAACTCTACCGACTACCTGTACCCGGAACAGCTGAAAATGACCGTTG CAAAGCCATTTCTTTTGAGATGGCTGATGGACATGGGCCTTGTCGACTTTTACTGGCAAC ------014A----------------------------><------------------------------------015------------------------><-------------TTAAACTGATCTCTCACCGTGAATGCCAGCAGCCGCACTACTACGGTTCTGAAGTTACCA AATTTGACTAGAGAGTGGCACTTACGGTCGTCGGCGTGATGATGCCAAGACTTCAATGGT -015A------------------x-------------------016A------------0161----------------x-------------------01611------------CCAAAATGCTGTGCGCTGCTGACCCGCAGTGGAAAACCGACTCTTGCCAAGGTGACTCTG GGTTTTACGACACGCGACGACTGGGCGTCACCTTTTGGCTGAGAACGGTTCCACTGAGAC --------><----------------------------016B------------------------>

GTGGTCCA CACCAGGTGATC ----------->

Spel

Fig. 5e

M7 (017/018; O17A/O18A);

Spei

----------------------------------017--------------CTAGTTTGCTCTCTCCAGGGTCGTATGACCCTGACCGGTATTGTTTCTTGGG

AAACGAGAGAGGTCCCAGCATACTGGGACTGGCCATAACAAAGAACCC <-------------------------oi7A-------------------------------------χ------------------₀₁₈----------------GTCGTGGTTGCGCTCTGAAAGACAAACCGGGTGTTTACACCCGTGTTTCTCACTTCCTGC CAGCACCAACGCGAGACTTTCTGTTTGGCCCACAAATGTGGGCACAAAGAGTGAAGGACG --------X--------------------------018A---------------------->

CGTG RtamHI

GCACCTAG

Fi g· 5f

Μ8 (019: 019Α):

BamHS

1619 <-----------------------------------019----------------GATCCGTTCTCACACCAAAGAAGAAAACGGTCTGGCTCTGTAAGCTAGCCCGCCTA

GCAAGAGTGTGGTTTCTTCTTTTGCCAGACCGAGACATTCGATCGGGCGGAT <----------------------------------O19A-------------ATGAGCGGGCTTTTTTTTAT

TACTCGCCCGAAAAAAAATAGC

Fig.

PBF158-O2T

PstI

HindIII

Spel. x BamHI wyodrębnianie fragmentu z 3867pz ^ligacja z M17 (116 pz)

Kpnl

Spel

BamHI

Nhel Clal

ΚρηI x Spel wyodrębnianie fragmentu z 3962 pz ^ligacja zM6(2O5pz)

PstI

Kpnl

BamHI Nhel Clal

Fig. 6b

HindlU ρΒΠ58~04Τ

Eagl x Kpnl wyodrębniane fragmentu z 4142 pz ligacja z M5 (215pz)

EcoRI

Pstl

HindIII

BamHI Nb© I

ClaI

Sad x Eagl wyodrębnianie fragmentu z 4337pz ligacja z M4 (226pz)

Pstl

ClaI

Fig.6c

HindIII

EcoRI pst i

Hind Ul

Clal

Spel BamHI Nhel

Nde I x Hind III \ wyodrębnianie \ fragmentu z2M7pz,

Ndel x Hind III wyodrębnianie fragmentu z 712 pz ligacja obydwóch fragmentów

Ndel

BamHI Nhel

Clal

Fig. 7a

Hind III pUC 19 “CM*» 3

Ndel

Hi mdlii

Clal

Spel BamHI Nheł

Pstl x SacI wyodrębniani© fragmentu z 3108 pz ligacja z M3 (189 pz)

Nctel x Pst l wyodrębnianie fragmentu z 3273 pz ^ligacja z M2(24-6pz)

Ndsl

Clal

HindJll

Spel BamHI Nhel

|.7b

16(6199

P8F158-06T pUC 19-08 (p. Fig.6e) (p. Fig.7b)

Ndel x Sad wyodrębnianie fragmentu 4518 pz

Ndel x Sad wyodrębnianie fragmentu z 435 pz ligacja· obydwóch fragmentów

EeoR I Ndel

Fig. 7c pBF 158-08 Τ ip. Fig. 7c)

EcoRIn Kbol wyodrębnianie fragrnmtuz4927pz ligacja z Ml(74pz)

Fig. 9

Ml (021; 021A);

EcoRI <----------------------------------021--------------AATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGC

GACTTTACTCGACAACTGTTAATTAGTAGCTTGATCAATTGATCATGCG <--------------------------------021A-------------------------------AAGTTCACGTAAAAAGGGTAT X5>Sll

TTCAAGTGCATTTTTCCCATAGATC ------------------------166199 aktywność rtcu - PA (PU/ml GO=1)

16199

Fig. 11

Fig.12 takcje fili in po restrykcji Wde 1

Xb®t ___SD Ndel

5⁹ TCT AGAT AAGGAGGAAATCAT ATG.... 3* 3^B AGATCTATTCCTCCTT TAGTATAC.... 5’ ^asad Het=Si@rt x Nd@l

T

5’ TCT AGATAAGGAGGAAATC A [_TATG.. 3^B 3° AGATCTATTCCTCCTTTAGTAfl AC.. 5* ra@kq@ fili tsgog®

Xb@l SD

5*

3*

TCT AGATAAGGAGGAAATC A AGATCTATTCCTCCTTTAGT

I_______

TA

AT

Fig. 13

1©20sgd

TATG.. 3® AT AC.. 5* _jl-----ί

Het=St@rt

16619 promotor Trp

Fig. U

16(6199

Ser Asn Glu Leu His 5

AGTTCACGTAAAAAGGGTATCTAGATAAGGAGGAAATCATATG AGC AAT GAA CTT CAT 5B

Gin

Val

Pro

Ser

Asn

Cys

Asp

Cys

Leu

Asn

Gly

Gly

Thr

Cys

Val

Ser

21

CAA

GTT

CCA

TCG

AAC

TGT

GAC

TGT

CTA

AAT

GGC

GGA

ACC

TGC

GTT

TCT

106

Asn

Lys

Tyr

Phe

Ser

Asn

Ile

His

Trp

Cys

Asn

Cys

Pro

Lys

Lys

Phe

37

AAC

AAA

TAT

TTC

TCJ

AAC

ATC

CAC

TGG

TGT

AAC

TGC

CCG

AAA

AAA

TTC

154

Gly

Gly

Gin

His

Cys

Glu

Ile

Asp

Lys

Ser

Lys

Thr

Cys

Tyr

Glu

Gly

53

GGT

GGT

CAG

CAC

TGC

GAA

ATC

GAC

AAA

TCT

AAA

ACC

TGC

TAC

GAA

GGT

202

Asn

Gly

His

Phe

Tyr

Arg

Gly

Lys

Ala

Ser

Thr

Asp

Thr

Met

Gly

Arg

69

AAC

GGT

CAC

TTC

TAC

CGT

GGT

AAG

GCT

TCT

ACC

GAC

ACC

ATG

GGT

CGT

250

Pro

Cys

Leu

Pro

Trp

Asn

Ser

Ala

Thr

Val

Leu

Gin

Gin

Thr

Tyr

His

85

CCG

TGC

CTG

CCG

TGG

AAC

TCT

GCT

ACC

GTT

CTG

CAG

CAG

ACC

TAC

CAC

298

Ala

His

Arg

Ser

Asp

Ala

Leu

Gin

Leu

Gly

Leu

Gly

Lys

His

Asn

Tyr

101

GCT

CAC

CGT

TCT

GAT

GCA

TTG

CAG

CTG

GGT

CTG

GGT

AAA

CAC

AAC

TAC

346

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn

Arg

Arg

Arg

Pro

Trp

Cys

Tyr

Val

Gin

Val

117

TGC

CGT

AAC

CCG

GAC

AAC

CGT

CGT

CGT

CCG

TGG

TGC

TAC

GTT

CAG

GTT

394

Gly

Leu

Lys

Pro

Leu

Val

Gin

Glu

Cys

Met

Val

His

Asp

Cys

Ala

Asp

133

GGT

CTG

AAA

CCG

CTA

GTT

CAG

GAA

TGC

ATG

GTT

CAC

GAC

TGC

GCT

GAC

442

Gly

Lys

Lys

Pro

Ser

Ser

Pro

Pro

Glu

Glu

Leu

Lys

Phe

Gin

Cys

Gly

149

GGT

AAA

AAA

CCG

TCT

TCT

CCG

CCG

GAA

GAG

CTC

AAA

TTC

CAG

TGC

GGT

490

Gin

Lys

Thr

Leu

Arg

Pro

Arg

Phe

Lys

Ile

Ile

Gly

Gly

Glu

Phe

Thr

165

CAA

AAA

ACC

CTA

CGT

CCG

CGT

TTT

AAA

ATC

ATC

GGT

GGT

GAĆ

TTC

ACC

538

Thr

Ile

Glu

Asn

Gin

Pro

Trp

Phe

Ala

Ala

He

Tyr

Arg

Arg

His

Arg

181

ACC

ATC

GAA

AAC

CAG

CCG

TGG

TTC

GCT

GCT

ATC

TAC

CGT

CGT

CAC

CGT

586

Gly

Gly

Ser

Val

Thr

Tyr

Val

Cys

Gly

Gly

Ser

Leu

Ile

Ser

Pro

Cys

197

GGT

GGT

TCT

GTT

ACC

TAC

GTT

TGC

GGT

GGT

TCT

CTG

ATC

TCT

CCG

T6C

634

Trp

Val

Ile

Ser

Ala

Thr

His

Cys

Phe

Ile

Asp

Tyr

Pro

Lys

Lys

Glu

213

TGG

GTT

ATC

TCT

GCT

ACC

CAC

TGC

TTC

ATC

GAC

TAC

CCG

AAA

AAA

GAA

682

Fig.

Asp

Tyr

Ile

Val

Tyr

Leu

Gly

Arg

Ser

Arg CGT

Leu

Asn

Ser

Asn

Thr

Gin

229

GAC

TAC

ATC

GTT

TAC

CTC

GGC

CGT

TCT

TTA

AAC

TCT

AAC

ACC

CAG

730

Gly

Glu

Met

Lys

Phe

Glu

Val

Glu

Asn

Leu

Ile

Leu

His

Lys

Asp

Tyr

245

GGT

GAA

ATG

AAA

TTC

GAA

GTT

GAA

AAC

CTG

ATC

CTG

CAC

AAA

GAC

TAC

778

Ser

Ala

Asp

Thr

Leu

Ala

His

His

Asn

Asp

Ile

Ala

Leu

Leu

Lys

Ile

261

TCT

GCT

GAC

ACC

CTG

GCT

CAC

CAC

AAC

GAC

ATC

GCT

CTG

CTA

AAA

ATC

826

Arg

Ser

Lys

Glu

Gly

Arg

Cys

Ala

Gin

Pro

Ser

Arg

Thr

Ile

Gin

Thr

277

CGT

TCT

AAA

GAA

GGT

CGT

TGC

GCT

CAG

CCG

TCT

CGT

ACC

ATC

CAG

ACC

874

Ile

Cys

Leu

Pro

Ser

Met

Tyr

Asn

Asp

Pro

Gin

Phe

Gly

Thr

Ser

Cys

293

ATC

TGC

CTG

CCG

TCT

ATG

TAC

AAC

GAC

CCG

CAG

TTC

GGT

ACC

TCT

TGC

922

Glu

Ile

Thr

Gly

Phe

Gly GGT

Lys

Glu

Asn

Ser

Thr

Asp

Tyr

Leu

Tyr

Pro

309

GAA

ATC

ACC

GGT

TTC

AAA

GAA

AAC

TCT

ACC

GAC

TAC

CTG

TAC

CCG

970

Glu

Gin

Leu

Lys

Met

Thr

Val

Val

Lys

Leu

Ile

Ser

His

Arg

Glu

Cys

325

GAA

CAG

CTG

AAA

ATG

ACC

GTT

GTT

AAA

CTG

ATC

TCT

CAC

CGT

GAA

TGC

1018

Gin

Gin

Pro

His

Tyr

Tyr

Gly

Ser

Glu

Val

Thr

Thr

Lys

Met

Leu

Cys

341

CAG

CAG

CCG

CAC

TAC

TAC

GGT

TCT

GAA

GTT

ACC

ACC

AAA

ATG

CTG

TGC

1066

Ala

Ala

Asp

Pro

Gin

Trp

Lys

Thr

Asp

Ser

Cys

Gin

Gly

Asp

Ser

Gly

357

GCT

GCT

GAC

CCG

CAG

TGG

AAA

ACC

GAC

TCT

TGC

CAA

GGT

GAC

TCT

GGT

1114

Gly

Pro

Leu

Val

Cys

Ser

Leu

Gin

Gly

Arg

Met

Thr

Leu

Thr

Gly

Ile

373

GGT

CCA

CTA

GTT

TGC

TCT

CTC

CAG

GGT

CGT

ATG

ACC

CTG

ACC

GGT

ATT

1162

Val

Ser

Trp

Gly

Arg

Gly

Cys

Ala

Leu

Lys

Asp

Lys

Pro

Gly

Val

Tyr

389

GTT

TCT

TGG

GGT

CGT

GGT

TGC

GCT

CTG

AAA

GAC

AAA

CCG

GGT

GTT

TAC

1210

Thr

Arg

Val

Ser

His

Phe

Leu

Pro

Trp

Ile

Arg

Ser

His

Thr

Lys

Glu

405

ACC

CGT

GTT

TCT

CAC

TTC

CTG

CCG

TGG

ATC

CGT

TCT

CAC

ACC

AAA

GAA

1258

Glu

Asn

Gly

Leu

Ala

Leu

411

GAA

AAC

GGT

CTG

GCT

CTG

TAAGCTAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTATCGAT

1316

Departament Wydawnictw UP RP. Nzałze 90 egz. Cena 1,00 zł.

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania nowych plazmidów dla stosowania ich do orzyrmywania aktywatora plazminogenu, znamienny tym, że do plazmidu pBR 322, z którego usunięto region nic/bom i/lub przynajmniej część genu odporności na działanie tetracykliny, wstawia się między miejsca cięć Eco RI oraz Hind III miejsce wielokrotnego klonowania o podanej na fig. 2 sekwencji nukleotydowej, która między miejscami cięć XbaI oraz Ndel zawiera sekwencję Shine'a-Delgarno i w odległości 6-12, zwłaszcza w odległości 8-10 nukleotydów, kodon startowy ATG i za pomocą której w znany sposób wbudowuje się jeden lub dwa terminatory transkrypcji, syntetyczne sekwencje częściowe genu strukturalnego scu-PA, korzystnie rozpoczynając od terminalnej-3' części tego genu strukturalnego oraz dający się regulować promotor, i ewentualnie fragment Eco RI x Hind III z otrzymanego plazmidu albo wstawia się znaną metodą jako kasetę ekspresyjną w inny plazmid zdolny do autonomicznego rozmnażania się w bakteriach jelitowych (Enterobacteriaceae), korzystnie w E. coli, albo w tym otrzymanym plazmidzie przedłuża się odległość między sekwencją Shine'a-Delgarno a kodonem startowym poprzez cięcie za pomocą Nde I, uzupełnienie wynikowych miejsc przecięcia i następną ligację powstających końców-blunt.
2. 2. S posób według zastrz . 1, rnamtesmy ym», że jako dający się regutować promotor wbudowuje się za pomocą miejsca wielokrotnego klonowania promotor Trp lub Tac.
3. 3. Sposób według aatUz . 1 albo 2, zBmneenyy yym, ee jkko daj^jący sęę eegub^wać promotor wbudowuje się syntetyczny promotor Trp o sekwencji nukleotydowej według fig. 8.
4. 4.Spoóób według zstLz. 1 aboo 2 , ιμιώϊιιμ, yyEn, że jkko dującę żegutowaę promotor wbudowuje się promotor Tac z plazmidu ptac SDT (DSM 5018).
5. 5. Sposób według zastoz. 1 , z!layijesnty ym®, żejako i^^s^^p^uą^^e po soWe jerminatocy LankA typcji wbudowuje się w operony nowych plazmidów terminator trp A i/lub terminator tet A/orf L z Tn 10.
6. 6. Sposób według zastoz . 1 , ζη^ίβη^ tyy», że za j^om^o^ą wielokrotnego klonowania wbudowuje się na drodze operacji częściowych gen strukturalny o sekwencji nualeotceowej według fig. 15.