PL128529B1 - Process for preparing product of coupling of immunoglobulin - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych produktów sprzegania immuno¬ globuliny, o dzialaniu przeciwrakowym. ¦trzy zwalczaniu raka srodkami chemicznymi niekiedy trzeba stosowac srodki leczni¬ cze, których skutecznosc jest ograniczona przez ich niepozadane dzialania uboczne na pacjenta, totez stale czynione sa wysilki zmierzajace do ograniczenia t^ch dzialan do minimum. Jednym z takich leków jest windezyna, to jest zwiazek przedstawiony wzorem 1 na zalaczonych rysunkach. Windezyne ujawniono w brytyjskim opisie patentowym nr 1 463 575. w którym opisano jej wytwarzanie i aktywnosc biologiczna.Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie nowe produkty sprzegania, zawierajace im- munoglobuline lub fragment immunoglobuliny,zmodyfikowane przez jodna lub wieksza liczbe grup o wzorze 2 zwiazanych z nimi kowalencyjnie przez reakcje immunoglobuliny lub fra¬ gmentu immunoglobuliny z azydkiem kwasu dezacetylowinblastynowego.Immunoglobulina lub fragment stanowia przeciwcialo lub fragment przeciwciala o wlasnosciach rozpoznawania antygenu* Korzystny skladnik immunogiobulinowy stanowi przeciwcialo lub fragment przeciwciala przystosowanego do rozpoznawania antygenów na powierzchni zlosciwych komórek typu wystepujacego w organizmie ludzkim. Jednakze ma¬ terialy immunoglobulinowe innych typów wchodza równiez w zakres wynalazku, gdyz moga one byc uzyteczne w leczeniu zwierzat i w próbach kontrolnych oraz w innych próbach.Nowe produkty sprzegania sa stosowane do leczenia raka* Sa one skureczniejsze i daja mniejsze skutki uboczne miedzy innymi dzieki temu, ze maja zdolncsc zwiekszania stezenia cytotoksycznego leku w miejscu dzialania.Wytwarzane produkty sprzegania moga byc wykorzystane w ukladach posrednich, slu¬ zyc do rozpoznawania specyficznego przeciwciala na powierzchni komórki antygenu.Znane sa immunoglobuliny wlasciwe dla antygenów na powierzchni koz:rekf które maja byc zabite, jak równiez sposoby ich wytwarzania z surowicy szczepionych ochron¬ nie zwierzat albo przez hodowanie guzów wydzielajacych produkty monokloniczne. Korzy¬ stnym typem immunoglobuliny jest IgG. Przedstawicielami immunoglobulin sa:2 128 529 - Ig z kóz lub owiec uodpornionych antygenem zarodkowym raka, - Ig z króliczej surowicy przeciw ostrej bialaczce limfoblastycznej, - Ig z róznych przeciwsurowic hodowanych przeciw ostrej bialaczce limfoblastycznej, ostrej bialaczce szpikowej, chronicznej bialaczce limfoblastycznej i chronicznej bialaczce granulocytowej, - Ig z kóz lub owiec uodpornionych materialem raka pluc, - monokloniczna Ig z hybrydów myszy wydzielajacych przeciwciala przeciw rakowi odbytni¬ cy u ludzi, - monokloniczna Ig z hybrydów myszy wydzielajacych przeciwciala przeciw czerniakowi u ludzi, - monokloniczna Ig z hybrydów myszy wydzielajacych przeciwciala reagujace z komórkami bialaczki u ludzi, - monokloniczna Ig z hybrydów myszy wydzielajacych przeciwciala reagujace z komórkami nerwiaka niedojrzalego u ludzi, - monokloniczna Ig z hybrydów myszy wydzielajacych przeciwciala reagujace z antygenami raka piersi u ludzi, - monokloniczna Ig z hybrydów myszy wydzielajacych przeciwciala reagujace z komórkami raka jajnika u kobiet, - monokloniczna Ig z hybrydów myszy wydzielajacych przeciwciala reagujace z komórkami miesaka kostnego u ludzi* * :' ¦ . Jak podano wyzej, produkty sprzegania mozna tez wytwarzac z fragmentów przeciw¬ cial, oznaczonych jako Fabf Pab'lub F/abV2 albo z monomeru IgM wytworzonego z prze¬ ciwciala np. przez wytrawianie enzymem proteolitycznym. Substancje takie i ich wytwa¬ rzanie sa znane, przy czym mozna nadmienic, ze Korzystnymi enzymami proteolitycznymi sa pepsyna i papaina.Yindezyne o wzorze 1 mozna zwiazac z substancja immunoglobulinowa poprzez atom wegla reszty karboksylowej w pozycji 3 na drodze reakcji z odpowiednia pochodna azydko- wa. T.vedlug wynalazku sposób wytwarzania srodka przeciw rakowi polega na reakcji immuno- globuliny lub fragmentu immunoglobuliny z azydkiem o wzorze 3» Sposób ten stanowi do¬ godna droge laczenia leku,jakim jest windezyna z immunoglobulina w lagodnych warunkach z zachov;aniem integralnosci strukturalnej immunoglobuliny.Proces ten prowadzi sie korzystnie w srodowisku wodnym, w temperaturze 5°C - 25°C, np. w temperaturze pokojowej, przy wartosci pH b,5 - 9,5, korzystnie 9fO# Wyni¬ kiem tej reakcji jest zwiazanie za pomoca wiazania kowalencyjnego jednej lub wiekszej liczby reszt winka przy wolnych grupach aminowych czasteczki immunoglobuliny, na przy¬ klad grup aminowych pochodzacych od reszt lizynowych. Liczba reszt przylaczonych bedzie zalezec od stezenia skladników reakcji i od czasu trwania reakcji, ale przecietnie wy¬ nosi od 1, zwykle od 2 do 5» Proces ten prowadzi sie np. w ten sposób, ze roztwór azydku w odpowiednim roz¬ puszczalniku, takim jak dioksan, wkrapla sie powoli do buforowanego roztworu inimunoglo- buliny np. w boranowym roztworze buforowym 0,34 m przy wartosci pH 9» Produkt sprzega¬ nia wyodrebnia sie przez odsaczenie zelu i przechowuje w nasyconym roztworze siarczanu amonowego, przy czym mozna go ponownie z powrotem przeprowadzac latwo do roztworu pod¬ dajac dializie za pomoca boranowego roztworu buforowego, albo tez mozna go przechowy¬ wac w chlodni w temperaturze 4° C albo po zamrozeniu np. w temperaturze -20°C.Azydkowy skladnik reakcji o wzorze 3 mozna latwo wytwarzac z winblastyny, siar¬ czanu winblastyny lub dezacetylowinblastyny,korzystnie przez hydrazynolize estru Cr i nastepnie dwuazowanie, np. sposobem opisanym w J#f;Ied#Chem., 1978, tom 21, nr 1, strony 88-96 albo we wspomnianym wyzej brytyjskim opisie patentowym nr 1 463 575# Eydrazynoliza winblastyny przebiega korzystnie w umiarkowanych temperaturach w roz¬ tworze w metanolu i otrzymuje sie monohydrazyd. Produkt ten poddaje sie w temperaturze128 529 3 O C - 10 C reakcji z kwasem solnym i azotynem sodowym w odpowiednim rozpuszczalniku wod¬ nym i otrzymuje zadany azydek kwasu dezacetyloninblastynowego• Azydek o wzorze 3 mozna tez wytwarzac w temperaturze ponizej 5°cf jak opisano wyzej i bez wyosobniania azydku mozna doprowadzac wartosc pH mieszaniny do 9 oraz dodawac mie¬ szajacy sie z woda rozpuszczalnik, taki jak np. dioksan. Nastepnie dodaje sie immunoglo- buline w boranowym roztworze buforowym o wartosci pH 9 i pozwala sie na ogrzanie sie mie¬ szaniny do temperatury pokojowej. Nadmiar azydku niszczy sie rozcienczonym amoniakiem i produkt sprzegania oczyszcza przaz odsaczenie zelu* Ocene produktu sprzegania mozna dokonywac stosujac znane metody, takie jak metoda powinowactwa chromatograficznego. Skutecznosc sprzezonego produktu mozna oceniac okresla¬ jac liczbe komórek zdolnych tio zycia po potraktowaniu zawiesiny komórek nowotworu tym produktem albo mierzac pobór trytowanej urydyny. Stezenia proteiny i leku oznacza sie przez pomiar gestosci optycznych roztworów produktu sprzezonego przy dwóch dlugosciach fal, na przyklad 270 i 280 i odniesienie otrzymanych wartosci do wartosci wolnego leku i niesprzezonej immunoglobulihy przy tych samach dlugosciach fal.Nowe produkty sprzegania wytworzone sposobem wedlug wynalazku sa uzyteczne przy zwalczaniu raka i w tym celu przygotowuje sie je korzystnie w postaci preparatów do wstrzy¬ kiwania lub preparatów farmaceutycznych zawierajacych produkt sprzegania razem z farma¬ kologicznie dopuszczalnym nosnikiem lub rozcienczalnikiem. Korzystnie stanowia one dawke jednostkowa, zawierajaca np. od 0,01 do 2 mg czynnej substancji /okreslenie to do¬ tyczy grupy windezynowej/.Kov.e produkty sprzegania sa skuteczne w szerokim zakresie ich dawek i np. przy le¬ czeniu ludzi doroslych dawka tygodniowa wynosi zwykle 1-10 mg/kg /w przeliczeniu na gru¬ pe windezyny/, a przewaznie 3-9 mg/kg. Jednakze ilosc zwiazku podawanego jest okreslana przez lekarza w zaleznosci od danych okolicznosci, w tym tez stanu pacjenta i v.ybransj drogi podawania leku.Wynalazek zilustrowano w nastepujacych przykladach.Fr zy kladl. Wytwarzanie produktu sprzegania windezyny z owczym antygenem przeciw zarodkom raka. 6 mg hydrazydu kwasu dezacetylowinblastynowego rozpuszczono w 34-0 ul In HC1 i chlodzono roztwór do temperatury 4°C, po czym dodano 60yul wodnego roztworu azotynu sodowego o stezeniu 10 mg/ml i mieszano w temperaturze 4°C. Po uplywie 5 minut silnie mieszajac, dodano 300yul In NaOH i 120 ul dioksanu, a nastepnie 280yiil roztworu owczego anty-CEA.o stezeniu 21,3 mg/ml w boranowym roztworze buforowym majacym stezenie 0,34 m i wartosc pH 8,6. Mieszanine mieszano w pokojowej temperaturze w ciagu 2 godzin, utrzymujac wartosc pH 9 za pomoca 0,1 n NaOH. Nadmiar azydku rozlozono dodajac 60ul In HH^OK i mieszajac dalej w ciagu 1 godziny. Produkt wyosobniono droga filtracji zelu na kolumnie Bio^Gel® P-6 o wymiarach 1 x 25,5 cm /20 ml/, zrównowazonej solanka bufo¬ rowana fosforanem. Otrzymano 2,66 ml frakcji szczytowej i zawartosc proteiny okreslono metoda Lowry, a windezyne oznaczono metoda spektroskopii róznicowej. Wytworzony w ten sposób produkt sprzegania zawieral 4,6 mola windezyny na 1 mol Ig* Przyklad II. Wytwarzanie produktu sprzegania windezyny z mysim monoklo- nicznym antygenem przeciw zarodkom raka. 10 mg hydrazydu kwasu dezacetylov,inblastynowego rozpuszczono w 0,56 ml In HC1 i ochlodzono roztwór do 4°C. Dodano 100^ul roztworu azo¬ tynu sodu o stezeniu 10 mg/ml i mieszano w temperaturze 4°C. Po 5 minutach, przy energi¬ cznym mieszaniu dodano 0,5 ml In NaOH i 0,2 ml dioksanu, a nastepnie 0,5 ml roztworu my¬ siego monoklonicznego anty-CEA o stezeniu 15f6 mg/ml w boranowym roztworze buforowym ma¬ jacym stezenie 0,34 s i wartosc pH 8,6. Ilieszanine mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny utrzymujac pH na poziomie 9 za pomoca 0,1 n NaOH. Nadmiar azydku rozlo¬ zono dodajac 0,1 ml In NH^OH i mieszajac przez dalsza godzine. Produkt wyosobniono dro¬ ga filtracji zelu na kolumnie 3io-Gel™ p-6 o wymiarach 1 x 27 cm /21 ml/ zrównowazo¬ nej solanka buforowana fosforanem. Otrzymano 4,07 nil frakcji szczytowej i zawartosc128 529 proteiny i windezyny oznaczono metoda spektroskopii przy 270 i 280 nm. Wytworzony w ten sposób produkt sprzegania zawieral 2,1 mola windezyny na mol Ig.Przyklad III. VTytwarza nie produktu sprzegania windezyny z królicza prze- oiwmysia Ig. 12 mg hydrazydu kwasu- dezacetylowinblastynowego, rozpuszczono w 0,6? ml In HC1 i roztwór ten ochlodzono do 4°C. Dodano 120/il roztworu azotynu sodu o stezeniu 10 mg/ml i mieszano w temperaturze 4°C. Fo 5 minutach energicznie mieszajac dodano 0,6 ml In Na OH i 0,24 ml dioksanu, a nastepnie 1,0 nil roztworu króliczej przeciwraysiej Ig o stezeniu 11,7 mg/ml w boranowym roztworze buforowym majacym stezenie 0,-4 m i wartosc pH 8,6. Mieszanine mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny utrzymujac pH na poziomie 9 za pomoca 0,1 n fraOH. Nadmiar azydku rozlozono dodajac 0,12 ml In 12'.OH i mieszajac przez dalsza godzine. Produkt wyosobniono droga filtracji zelu na kolumnie Eio-Gel^ p-6 o wymiarach 1,5 x 26 cm /46 ml/ zrównowazonej solanka buforowana fosfo¬ ranem. Otrzymano 6,22 ml frakcji szczytowej i zawartosc proteiny i windezyny oznaczono metoda spektroskopii przy 270 i 280 nra. Wytworzony w ten sposób produkt sprzegania zawie¬ ral 3f2 mola windezyny na mol Ig.Przyklad IV. T.V gniazdach tacy do mikr omiarec z kowania kultur wytworzono zawiesine preparatu z hodowli rosnacych komórek, przy stezeniu komórek 10 na gniazdo.Po pozostawieniu komórek na '24 godziny dla przyjecia sie hodowli, replikowane gniazda traktowano szeregiem róznych stezen produktu sprzegania lub preparatem kontrolnym. Po 6-dniowym prowadzeniu hodowli szacowano ilosc komórek obecnych w gniazdach przez obli¬ czanie bezposrednie za pomoca analizatora obrazu mikroskopu inwersyjnego. V' jednym przy¬ kladzie komórke gruczolaka odbytnicy ludzkiej traktowano windezyna polaczona z przeciw¬ cialem monoklonicznego antygenu przeciw zarodkom raka w stosunku molowym 2,1 mola winde¬ zyny na mol Ig stosuje produkt sprzegania z przykladu II i oznaczono dzialanie cytosta¬ tyczne poprzez liczenie komórek jak nastepuje: i i 1 1 j i i i Stezenie spi r—~™ . zezonego leku z windezyna mg/l 0 0,08 0,40 2,00 10,00 ———— -———^ Ilosc komórek /gniazdo po 1 6 dniach/ + przecietne od¬ chylenie od normy 4 repliki f———————————————__— 1,65 1 4,8 x 104 13,8 + 2,5 x 104 12,6 + 1,9 x 104 10,8 + 5,9 x 104 1,9 + 0,6 x 104 ~"l ! * — SHMHMBW ~ V w stosunku do próby i kontrolnej J 100 ( 84,6 j 77,4 1 66,7 | 11,9 I Zastrzezeni patentowe 1. Sposób wytwarzania produktu sprzegania zawierajacego immunoglobuline lub fragment immunoglobuliny zmodyfikowane przez jedna lub wieksza liczbe grup o wzorze 2 zwiazanych z nimi kowalencyjnie, znamienny tym, ze poddaje sie reakcji immunoglobuline lub fragment immunoglobuliny z azydkiem kwasu dezacetylowinblastyno- wego o wzorze 5. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze sprzeganiu poddaje sie IgG immunoglobuline. 5. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze immunoglobu¬ line lub jej fragment modyfikuje sie Srednio za pomoca 2-5 grup o wzorze 2.128 529 CH, C-O-CH.CH,0 hzot / ,jr OH rs t-C-o-ch, H ! Ó CH3oJCCX^ctfH? C-O-CH, H CH,0 Hior 2 wzór 3 PL PL

Claims (2)

1. Zastrzezeni patentowe 1. Sposób wytwarzania produktu sprzegania zawierajacego immunoglobuline lub fragment immunoglobuliny zmodyfikowane przez jedna lub wieksza liczbe grup o wzorze 2 zwiazanych z nimi kowalencyjnie, znamienny tym, ze poddaje sie reakcji immunoglobuline lub fragment immunoglobuliny z azydkiem kwasu dezacetylowinblastyno- wego o wzorze 5. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze sprzeganiu poddaje sie IgG immunoglobuline. 5. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze immunoglobu¬ line lub jej fragment modyfikuje sie Srednio za pomoca 2-5 grup o wzorze

2.128 529 CH, C-O-CH. CH,0 hzot / ,jr OH rs t-C-o-ch, H ! Ó CH3oJCCX^ctfH? C-O-CH, H CH,0 Hior 2 wzór 3 PL PL