DD201447A5

DD201447A5 - Verfahren zur herstellung von als antikrebsmittel wirksamen immunoglobulin-konjugaten

Info

Publication number: DD201447A5
Application number: DD82236636A
Authority: DD
Inventors: George F Rowland; Robin G Simmonds
Original assignee: Lilly Industries Ltd
Priority date: 1981-01-12
Filing date: 1982-01-08
Publication date: 1983-07-20
Also published as: PT74252A; DK5982A; CA1180660A; EG15599A; PL234695A1; BG40318A3; IL64722A0; JPS57136529A; ATE16603T1; PH18031A; IE52239B1; RO82758B; PL128529B1; AU7927482A; EP0056322A1; FI820020L; KR860001149B1; ZA82122B; PT74252B; IE820023L

Abstract

Verfahren zur Herstellung eines Immunoglobulin-Konjugats mit einem Immunoglobulin oder Immunoglobulin-Fragment, das durch eine oder mehr Gruppen der nachfolgend angegebenen Formel modifiziert ist, die kovalent daran gebunden sind (siehe Rueckseite). Die Konjugate eignen sich fuer dieBehandlung von Krebs.

Description

23 6 63 6

T 53 103

Titel der Erfindung:

Verfahren zur Herstellung von als Antikrebsmittel wirksamen Immunoglobulin-Konjugaten

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen Immunoglobulin-Konjugaten, die als Antikrebsmittel verwendet werden können.

Charakteristik der bekannten Lösungen:

Bei der chemotherapeutischen Behandlung von Krebs ist es manchmal erforderlich, Arzneimittel zu verwenden, die hinsichtlich ihrer Wirksamkeit durch unerwünschte Nebenwirkungen auf den Patienten beschränkt sind und man ist ständig bemüht/ diese Nebenwirkungen minimal zu halten. Ein solches Arzneimittel ist Vindesin, eine Verbindung der folgenden Formel

23 6 63 6 8

r β'

\\l Γ

10

(I)

'⁸\

⁵I

^H3 j

Vindesin ist beispielsweise in der britischen Patentschrift 1 463 575 angegeben, in der seine Herstellung und seine biologische Aktivität beschrieben sind.

Ziel der Erfindung:

Der vorliegenden Erfindung liegt nun das Ziel zugrunde, ein neues Antikrebsmittel zu schaffen, das frei von unerwünschten Nebenwirkungen ist.

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Konjugats mit einem Immunoglobulin oder Immunoglobulin-Fragment, das durch eine oder mehr Gruppen der nachfolgend angegebenen Formel modifiziert ist, die kovalent daran gebunden sind:

* O ""

23 663 6 8

¹³'

10 \ / N^

r,

f:

•C-H

2ⁿ5

(II)

10

OH

durch Umsetzung des Immunoglobulins oder Immunoglobulin-Fragments mit Desacetylvinblastinsäureazid.

Bei dem Immunoglobulin oder Immunoglohulin-Fragment handelt es sich um einen Antikörper oder ein Fragment eines Antikörpers mit Antigen-Erkennungseigenschaften. Bei dem bevorzugten Immunoglobulin-Material handelt es sich um einen Antikörper oder ein Fragment eines Antikörpers, das für die Erkennung von Antigenen auf der Oberfläche von malignen Zellen des im menschlichen Körper vorkommenden Typs geeignet ist. Die vorliegende Erfindung umfaßt aber auch Immunoglobulin-Materialien anderer Arten, da diese für die Behandlung von Tieren und für Kontroll- und Nachweisversuche brauchbar sein können.

23 6 63 6 8

Die erfindungsgemäßen neuen Kon jugate sind brauchbar für die Behandlung von Krebs. Sie sind viel stärker wirksam und weisen weniger Nebenwirkungen auf, weil sie unter anderem die Fähigkeit haben, die Konzentration des zytotoxischen Arzneimittels an dem Wirkungszentrum zu erhöhen ο

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Kon jugate für die Verwendung in einem indirekten System, in dem sie zur Erkennung eines Antikörpers verwendet werden, der für das Zellen-Oberflächenantigen spezifisch ist.

Immunoglobuline, die für Antigene auf der Oberfläche von Zellen, die abgetötet werden sollen, spezifisch sind, und Verfahren zu ihrer Herstellung aus dem Serum von immunisierten Tieren oder durch Kultivieren von Hybridomas, die monoclonale Produkte absondern, sind an sich bekannt. Der bevorzugte Antikörper-Typ ist ein Immunoglobulin der IgG-Klasse. Einige repräsentative Immunoglobuline sind folgende:

i) Ig aus Ziegen oder Schafen, die mit dem Carcinoembryo-Antigen immunisiert worden sind;

.ii) Ig aus einem anti-akuten lymphoblastischen Leukämie-Kaninchenserum;

iii) Ig aus verschiedenen Primat-Antiseren, hergestellt gegenüber akuter lymphoblastischer Leukämie, akuter myeloblastischer Leukämie, chronischer iymphoblastischer Leukämie und chronischer granulozytischer Leukämie;

iv) Ig aus Ziegen oder Schafen, die mit einem Lungencarcinommaterial immunisiert worden sind; v) monoclonaleslg aus Mäusehybridomas, die Antihuman-colorektal

236636 8

Carcinom-Antikörper absondern;

vi) monoclonales Ig aus Mäuse-Hybridomas, die Antihuman-Melanom-Antikörper absondern;

vii) monoclonales Ig aus Mäuse-Hybridomas, die Antikörper absondern, die mit Human-Leukämiezellen reagieren; viii) monoclonales Ig aus Mäuse-Hybridomas, die Antikörper absondern, die mit Human-Neuroblastom-Zellen reagieren; ix) monoclonales Ig aus Mäuse-Hybridomas, die Antikörper absondern, die mit Human-Brustkrebsantigenen reagieren;

x) monoclonales Ig aus Mäuse-Hybridomas, die Antikörper absondern, die mit Human-Ovariencarcinom-Zellen reagieren; xi) monoclonales Ig aus Mäuse-Hybridomas, die Antikörper absondern, die mit Human-Osteosarcom-Zellen reagieren.

Wie oben angegeben, kann das Konjugat auch mit Immunoglobulin-Fragmenten hergestellt werden, die hier als Fab, Fab¹ oder F(ab^f)o oder IgM-Monomeres, abgeleitet von einem Antikörper durch beispielsweise proteolytische Enzymverdauung, bezeichnet werden. Solche Materialien und Herstellungsverfahren sind an sich bekannt und es sei darauf hingewiesen, daß bevorzugte proteolytische Enzmye Pepsin und Papain sind.

Das Vindesin der Formel (i) kann über das Kohlenstoffatom des Carboxylrestes in der 3-Position an das Immunoglobulin-Material gebunden werden durch Umsetzung mit dem geeigneten Azidderivat, und die vorliegende Erfindung umfaßt daher gemäß einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Herstellung eines Antikrebs-Mittels, das darin besteht, daß man ein Immunoglobulin oder ein Immunoglobulin-Fragment mit einer Azidverbindung der Formel umsetzt

23 6 63 6 8

OH

12' 13'

|10

•J 1

Γ ΐ

ίο Il

CH₃

(IU)

Dieses Verfahren stellt eine bequeme Art der Verbindung des Arzneimittels Vindesin mit Immunoglobulin unter milden Bedingungen unter Aufrechterhaltung der Strukturintegrität des Immunoglobulins dar.

Das Verfahren wird vorzugsweise in einem wäßrigen Mscjium und bei einer Temperatur von 5 bis 25 C₇ beispielsweise bei Raumtemperatur, und bei einem pH-Wert von 8,5 bis 9,5, vorzugsweise 9,0, durchgeführt und es führt zu einer kovalenten Bindung eines oder mehrerer Vinca-Reste an die freien Aminogruppen des Immunoglobulinmoleküls, beispielsweise an die Aminogruppen, die von Lysinresten abgeleitet sind. Die Anzahl der gebundenen Reste hängt von de* Konzentration der Reaktanten und de^r Dauer der Reaktion, ab, die durchschnittliche Anzahl beträgt jedoch in der Regel mindestens 1, bei·

236636 8

spielsweise 2 bis 5.

Bei de* Durchführung der Reaktion wi*d beispielsweise eine Lösung des Azids in einem geeigneten Lösungsmittel, z.B. in Dioxan, langsam in eine gepufferte Lösung von Immunoglobulin in beispielsweise einem 0,34 M Boratpuffer bei einem pH-Wert von 9 eingetropft. Das Konjugat wird durch Gelfiltration isoliert und in einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung aufbewahrt, in der es durch Dialyse mit einem Boratpuffer leicht wieder in Lösung gebracht werden kann, oder es kann alternativ in einem Kühlschrank bei 4 C oder tiefgefroren werden bei beispielsweise -20 C. .

Der Azid-Reaktant de* Formel (III) kann aus Vinblastin, Vinblastinsulfat oder Desacetylvinblastin, vorzugsweise durch Hydrazinolyse

3 des C -Esters und anschließende Diazotierung, wie beispielsweise in "J. Med. Chem.", 1978, Band 21, Nr. 1, $. 88 - 96, und in der obengenannten britischen Patentschrift 1 463 575 beschrieben, leicht hergestellt werden. Die Hydrazinolyse von Vinblastin bei mäßigen Temperaturen in einer Methanollösung läuft ab unter überwiegender Bildung des Monohydrazids und bei der Umsetzung dieses Produkts bei Temperaturen von 0 bis TO C mit Chlorwasserstoffsäure und Natriumnitrit in einem geeigneten wäßrigen Lösungsmittel erhält man das gewünschte Azid der Formel (III) (Desacetylvinblastinsäureazid).

Alternativ kann das Azid der Formel (Hl) bei einer Temperatur unter 5 C, wie vorstehend angegeben, hergestellt werden und der ' pH-Wert wird ohne Isolierung des Azids auf 9 eingestellt und es wird ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel, wie z.B. Dioxan, zugegeben. Dann wird das Immunoglobulin in einem Boratpuffer von

23 6 83 6 8

pH 9 zugegeben und die Reaktionsmischung wi*d sich auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Das überschüssige Azid wird mit verdünntem Ammoniak zerstört und das Konjugat wird durch Gelfiltration gereinigt. ' .;...

Die Bewertung (Beurteilung) des Konjugats kann unter Anwendung bekannter Methoden, beispielsweise der Affinitätschromatographie, durchgeführt werden. Die Wirksamkeit des Konjugats kann ermittelt werden durch Auszählen der Anzahl der lebensfähigen Zellen nach der Behandlung einer Suspension von Tumorzellen mit dem Konjugat oder durch Messung der Aufnahme von tritiiertem Uridin. Die Protein- und Arzneimittelkonzentrationen werden bestimmt durch Messen der optischen Dichten der Konjugatlösungen bei zwei Wellenlängen, wie z.B. 270 und 280 nm, und in Beziehungsetzen der dabei erhaltenen Werte mit denjenigen für das freie Arzneimittel und das nicht-konjugierte Immunoglobulin bei den beiden gleichen Wellenlängen.

Die erfindungsgemäßen neuen Konjugate sind wertvoll für die Behandlung von Krebs und als solche werden sie vorzugsweise formuliert für die Verwendung in für die Injektion geeigneten Präparaten. Die vorliegende Erfindung umfaßt daher auch ein pharmazeutisches Präparat, beispielsweise ein injizierbares Präparat, das ein erfindungsgemäßes Konjugat zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel, wie sie auf diesem Gebiet an sich bekannt sind, enthält. Vorzugsweise liegt es in der Einheitsdosierungsform vor, wobei jede Dosis beispielsweise 0,01 bis 2 mg des aktiven Bestandteils (Wirkstoffes) (ausgedrückt durch den Vindesin-Rest) enthält.

236635 8

Die e^pfindungsgemäßen neuen Kon jugate sind über einen breiten Dosierungsbereich wirksam und die Dosen beispielsweise für die Behandlung von erwachsenen Menschen pro Woche liegen normalerweise innerhalb des Bereiches von 1 bis 10 mg/kg (Vindesin-Rest), insbesondere innerhalb des Bereiches von 3 bis 9 mg/kg. Es ist jedoch klar, daß die Menge der jeweils verabreichten Verbindung von einem Arzt unter Berücksichtigung der relevanten Umstände einschließlich des zu behandelnden Zustands und des gewählten Verabreichungsweges bestimmt wird»

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1 Herstellung eines yindesin-Schaf-Anticarcinoembryo-Antig.en-Koniua.ats

6 mg Desacetylvinblastinsäurehydrazid wurden in 340 μΐ 1 η HCl gelöst und die Lösung wurde auf 4 C abgekühlt. Es wurden 60 μΐ einer mg/ml wäßrigen Natriumnitritlösung zugegeben und die Reaktionsmischung wu^rde bei 4 C gerührt. Nach 5 Minuten wurden 300 μΐ 1 η NaOH und 120 μΐ Dioxan unter starkem Rühren zugegeben, anschließend wurden 280 μΐ einer 2,13 mg/ml Lösung von Schaf-Anti-CEA in einem 0,34 M Boratpuffer von pH 8,6 zugegeben. Die Mischung wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, wobei sie unter Verwendung von n/10 NaOH bei pH 9 gehalten wurde. Das überschüssige Azid wurde durch Zugabe von 60 μΐ 1 η NH^OH zerstört und es wurde eine weitere Stunde lang gerührt. Das Produkt wurde durch Gelfiltration

23 5 63 5 8

auf einer 1 cm χ 25,5 cm (20 ml)-Säule Bio-Gef P-6, äquilib*iert mit einer Kochsalzlösung mit Phosphatpuffer, isoliert. Das eluierte Maximum wurde gesammelt (2,66 ml) und unter Anwendung des Lowry-Verfahrens auf seinen Proteingehalt hin untersucht und durch Differenzspektroskopie wurde sein Vindesingehalt bestimmt. Das so hergestellte Präparat enthielt 4,6 Mol Vindesin pro Mol Ig.

Beispiel 2

Herstellung des Vindesin-Mäuse-Monoclonal- Anticarcinoemryo-

An ti gen -Ko η j υgat s .

10 mg Desacetylvinylblastinsäurehydrazids wurden in 0,56 ml 1 η HCl gelöst und die Lösung wurde auf 4 C abgekühlt. 100 μΐ einer 10 mg/ml Natriumnitritlösung wurden zugegeben und die Reaktionsmischung wu^rde bei 4 C gerührt. Nach 5 Minuten wurden 0,5 ml 1 η NaOH und 0,2 ml Dioxan unter starkem Rühren zugegeben, danach wurden 0 5 ml einer 15,6 mg/ml Lösung von MSuse-Monoclonal-Anti-. CEA in einem 0,34 M Boratpuffer von pH 8,6 zugegeben. Die Mischung wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, wobei unter Verwendung von n/10 NaOH ein pH-Wert von 9 aufrechterhalten wurde. Das überschüssige Azid wurde durch Zugabe von 0,1 ml .1 η ΝΗ,ΟΗ zerstört und eine weitere Stunde lang gerührt. Das Produkt wurde durch Gelfiltration über eine 1 cm χ 27 cm (21 ml)~Säule von Bio-GeX"^P-6, die mit eine^r mit einem Phosphat abgepufferten Kochsalzlösung äquilibriert worden war, isoliert. Das eluierte Maximum wurde gesammelt (4,07 ml) und durch Spektroskopie bei 270 nm und 280 nm wurden der Protein- und Vindesin-Gehalt bestimmt. Das so hergestellte Konjugat enthielt 2,1 Mol Vindesin pro

23 6 63 6 8

M₀IIg. .

"j . ν

Beispiel 3

Herstellung eines Vindesin-Kαninchen-Antimαus- _ι Iq-^Kon _ι }ugαts

12 mg Desacetylvinblastinsäurehydrazid wurden in 0,67 ml 1 η HCl gelöst und die Lösung wurde auf 4 C abgekühlt. Es wurden 120 μΐ einer 10 mg/ml-Natriumnitritlösung zugegeben und die Reaktionsmischung wu*de bei 4 C gerührt. Nach 5 Minuten wurden 0,6 ml 1 η NaOH und 0,24 ml Dioxan unter starkem Rühren zugegeben, danach wurden 1,0 ml einer 11,7 mg/ml Lösung von Kaninchen-Antimaus-Ig in einem 0,34 M Boratpuffer von pH 8,6 zugegeben. Die Mischung wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, wobei unter Verwendung von n/10 NaOH ein pH-Wert von 9 aufrechterhalten wurde. Das überschüssige Azid wurde durch Zugabe von 0,12 ml 1 η NH.OH zerstört und es wurde eine weitere Stunde lang gerührt. Das Produkt wurde durch Gelfiltration über eine 1,5 cm χ 26 cm (46 ml)-

(R)

Säule von Bio-Gerr-6, die mit eine^r mit einem Phosphat abgepufferten Kochsalzlösung äquilibriert worden war, isoliert. Das eluierte Maximum wurde gesammelt (6,22 ml) und durch Spektroskopie bei 270 nm und 280 nm wurde sein Gehalt an Protein und Vindesin bestimmt. Das,so hergestellte Kon jugat enthielt 3,2 Mol Vindesin pro Mol Ig.

Beispiel 4

Ein Präparat von Zellen, die in einer Kultur wuchsen, wurde in einer Menge von 10 Zellen pro Probe in Mikrotiter-Kulturschalen verteilt. Nachdem die Zellen 24 Stunden lang stehengelassen wurden zur Einstellung eines Gleichgewichts wurden Replikat-P*oben mit

23 6 63 5 8

einem Bereich von Konzentrationen eines Konjugats oder eines Kontrollpräparats behandelt. Nach 6-tägiger Kultivierung wurde die Anzahl der in den Proben vorhandenen Zellen durch direktes Auszählen bestimmt unter Verwendung eines Bildanalysators/ der mit einem Umkehrmikroskop verbunden war.

Bei einem Beispiel wurde ein Humancolonadenocarcinom-Zellenausstrich behandelt mit Vindesin, das mit einem monoclonalen Anticarcinomembryo-Antigen-Antikörper in einem Molverhältnis von 2,1 Mol Vindesin pro Mol Ig verbunden war (dabei handelte es sich um das Konjugat des Beispiels 2), und der cytostatische Effekt wurde durch Auszählen der Zellen wie folgt bestimmt:

Konjugat-Arzneimittelkonzen- Anzahl der Zellen/ % des Kontration (Vindesin, μg/ml) Probe nach 6 Tagen t^Pollwerts

(Mittelwert + Standardabweichung) 4 Replikate

0	16,	.3	+ 4.	.8	χ 10⁴	100	6 .
0.08	13	.8	+ 2	.5	χ ΙΟ*	84.	4
0.40	12	.6	+ 1	.9	χ 10⁴	77.	7
2.00 - . .	10	.8	+ 3	.9	XlO⁴	66.	9
10.00	1.	9	+ 0.	6	χ 10⁴	11.

Claims

. Erfindungsanspruch

1. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats aus einem Immunoglobulin oder Immunoglobulin-Fragment, das mit einer oder mehr Gruppen der nachfolgend angegebenen Formel modifiziert worden ist, die kovalent daran gebunden ist (sind):

u'

12

13

.ι

OH

, ,I

CH,

OH

(ID

gekennzeichnet dadurch, daß ein Immunoglobulin oder Immunoglobulin-Fragment mit Desacetylvinblastinsäureazid umgesetzt wird.
2. Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung eines Konjugats mit einem IgG-Immunoglobulin.

23 6 63 6 8
3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, bei dem das Immunoglobulin oder Immunoglobulin-Fragment mit durchschnittlich 2 bis 5
Gruppen der unter Punkt 1 angegebenen Formel (II) modifiziert ist.